ES2946513T3 - Microorganismo que tiene actividad de aciltransferasa y uso del mismo - Google Patents

Microorganismo que tiene actividad de aciltransferasa y uso del mismo Download PDF

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Abstract

La presente invención se relaciona con un nuevo polipéptido de aciltransferasa o un microorganismo que comprende el mismo; una composición para preparar N-acetil-L-metionina que comprende el polipéptido o microorganismo; y un método para preparar N-acetil-L-metionina usando el polipéptido o microorganismo. Además, la presente invención se refiere a un polinucleótido que codifica el polipéptido ya un vector de expresión que comprende el polinucleótido. Dado que el microorganismo que comprende la nueva aciltransferasa de la presente invención potencia la actividad de la aciltransferasa, el microorganismo de la presente invención se puede usar eficazmente para producir N-acetil-L-metionina acetilando L-metionina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Microorganismo que tiene actividad de aciltransferasa y uso del mismo
Campo técnico
La presente descripción se refiere a un polipéptido que tiene una actividad aciltransferasa o a un microorganismo que lo incluye; a una composición para preparar N-acetil-L-metionina, incluyendo la composición el polipéptido o microorganismo; y a un método para preparar W-acetil-L-metionina usando el polipéptido o microorganismo. Además, la presente descripción se refiere a un polinucleótido que codifica el polipéptido y a un vector de expresión que incluye el polinucleótido.
Técnica anterior
La N-acetilmetionina, que es un derivado de la metionina, tiene una eficacia similar a la de la metionina, pero puede reducir los aromas específicos de la metionina y puede añadirse en una gran cantidad en comparación con la metionina cuando se añade a los alimentos. En el caso de los animales que tienen rumen, cuando se usa metionina como aditivo para piensos, en primer lugar la usan los microorganismos del rumen y, por lo tanto, los animales no la absorben, mientras que la W-acetilmetionina es un aminoácido protegido por el rumen que se absorbe después de pasar a través del rumen y llegar al intestino. Se conoce la resistencia a la degradación de la W-acetil-DL-metionina en el rumen (Amos y col., Journal of Animal Science, 1974, 39(3), págs. 612-617). En consecuencia, la producción de la W-acetilmetionina tiene valor industrial y, en particular, es preferible proporcionar un aminoácido de tipo L que tenga una alta tasa de absorción y alta biodisponibilidad cuando se usa como aditivo para piensos y, por lo tanto, se requiere la investigación y el desarrollo de la W-acetil-L-metionina. En el caso de las enzimas que se ha publicado que convierten la metionina en W-acetilmetionina, YncA de Escherichia coli es única (documento US-8.143.031 B2). En el presente documento, se encontró que se usó acetil-CoA indirectamente a través de un método de análisis por DTNB para medir la inactividad de YncA, y no se encontró que se produjera N-acetilmetionina. Además, no se ha encontrado que la N-acetilmetionina sea realmente producida por el transformante transformado por YncA.
Divulgación
Problema técnico
Los presentes inventores han realizado esfuerzos continuos para producir N-acetil-L-metionina a través de una fermentación microbiana o una reacción enzimática y, por lo tanto, han buscado microorganismos capaces de producir W-acetil-L-metionina y descubrieron seis aciltransferasas novedosas. Además, han encontrado que se puede producir W-acetil-L-metionina económicamente a una concentración alta usando la aciltransferasa novedosa de la presente descripción o un microorganismo que expresa la aciltransferasa novedosa, en comparación con una aciltransferasa conocida. Basándose en este hallazgo, se ha completado la presente descripción.
Solución técnica
Un objeto de la presente descripción es proporcionar un microorganismo que tenga una actividad aciltransferasa, incluyendo el microorganismo un polipéptido representado por una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO. 1 a 6 o una secuencia de aminoácidos que tiene un 90 % o más de homología con la secuencia de aminoácidos.
Otro objeto de la presente descripción es proporcionar un polipéptido que tenga una actividad acetiltransferasa, estando representado el polipéptido por una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO. 1 a 6 o una secuencia de aminoácidos que tiene un 90 % o más de homología con la secuencia de aminoácidos.
Otro objeto más de la presente descripción es proporcionar un polinucleótido que codifica el polipéptido.
Otro objeto más de la presente descripción es proporcionar un vector de expresión que incluya el polinucleótido.
Otro objeto más de la presente descripción es proporcionar una composición para preparar N-acetil-L-metionina a partir de L-metionina, incluyendo la composición, como ingrediente activo: (i) el microorganismo o un cultivo del mismo; (ii) el polipéptido; o una combinación de los mismos.
Otro objeto más de la presente descripción es proporcionar un método para preparar W-acetil-L-metionina, que incluye: acetilar L-metionina usando (i) el microorganismo o un cultivo del mismo; (ii) el polipéptido; o una combinación de los mismos.
Efectos ventajosos
Puesto que el microorganismo que incluye una aciltransferasa novedosa según la presente descripción tiene actividad aciltransferasa potenciada, este microorganismo se puede usar eficientemente para producir N-acetil-L-metionina por acetilación de L-metionina.
Mejor modo para la invención
Para lograr los objetivos anteriores, un aspecto de la presente descripción proporciona un microorganismo que tiene actividad aciltransferasa, incluyendo el microorganismo un polipéptido representado por una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO. 1 a 6 o una secuencia de aminoácidos que tiene un 90 % o más de homología con la misma.
El término “ aciltransferasa” utilizado en la presente descripción se refiere a una enzima que tiene una actividad de transferencia de un grupo acilo de un donante a un receptor. En la presente descripción, el donante no se limita siempre que pueda proporcionar un grupo acilo a un receptor, pero puede ser específicamente acetil coenzima A (acetil-CoA). Además, como se usa en la presente descripción, el receptor no se limita siempre que pueda recibir un grupo acilo de un donante, pero puede ser específicamente L-metionina.
Específicamente, la aciltransferasa puede derivar del género Pseudomonas, el género Bacillus, el género Enterobacter, el género Pseudovibrio, el género Yarrowia o el género Corynebacterium. Más específicamente, la aciltransferasa puede derivar de Pseudomonas putida, Bacillus subtilis, Enterobacter sp. 638, Pseudovibrio sp. FO-BEG1, Yarrowia lipolytica o Corynebacterium glutamicum.
Específicamente, la aciltransferasa puede ser un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO. 1 a 6. Además, la aciltransferasa puede ser un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos que tenga un 70 % o más, un 80 % o más, o un 90 % o más de homología con una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO. 1 a 6 y que tenga una actividad aciltransferasa sustancialmente igual o correspondiente a la de la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO. 1 a 6. Además, la secuencia de aminoácidos que tiene dicha homología y que tiene una actividad aciltransferasa sustancialmente igual o correspondiente a la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO. 1 a 6 puede ser una secuencia de aminoácidos, una parte de la cual está suprimida, transformada, sustituida o añadida. Es obvio que este caso también puede estar incluido en el alcance de la presente descripción.
El término “ homología” utilizado en la presente descripción se refiere al grado de identidad de los residuos de bases o aminoácidos entre secuencias después de alinear ambas secuencias de aminoácidos o secuencias de bases de un gen que codifica un polipéptido en una región de comparación específica para que coincidan entre sí tanto como sea posible. Cuando la homología es suficientemente alta, los productos de expresión del gen correspondiente pueden tener una actividad igual o similar. El porcentaje de identidad de secuencia puede determinarse usando un programa de comparación de secuencias conocido, por ejemplo, BLAST (NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlign (DNASTAR Inc) o similar.
La expresión “ microorganismo que tiene una actividad aciltransferasa” utilizada en la presente descripción se refiere a un microorganismo que produce una aciltransferasa in vivo o in vitro. Específicamente, puesto que el microorganismo de la presente descripción incluye un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO. 1 a 6 y, por lo tanto, tiene una actividad aciltransferasa, puede transferir un grupo acilo a un receptor. Más específicamente, el microorganismo de la presente descripción tiene actividad acetiltransferasa para L-metionina y, por lo tanto, puede producir N-acetil-L-metionina. En la presente descripción, se usan N-acetil-L-metionina y N-acetilmetionina indistintamente.
Adicionalmente, el microorganismo de la presente descripción incluye no solo microorganismos que contienen inherentemente un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO. 1 a 6, sino también microorganismos en los que la actividad del polipéptido está potenciada en comparación con una actividad intrínseca. Es decir, la capacidad de producción de la aciltransferasa se puede transmitir o potenciar mediante mutagénesis natural o antropogénica o modificación de especies. El término “potenciación” de la actividad del polipéptido, como se usa en la presente descripción, se refiere a mejorar el estado activo del polipéptido incluido en el microorganismo. La potenciación de la actividad del polipéptido no se limita siempre que pueda potenciar la actividad de cada polipéptido, tal como la potenciación de la actividad del polipéptido diana, en comparación con un estado natural o un estado de no variación del polipéptido. Por ejemplo, la potenciación de la actividad del polipéptido se puede realizar mediante un método seleccionado de i) aumentar el número de copias de un polinucleótido que codifica cada polipéptido, ii) modificar una secuencia de expresión para aumentar la expresión del polinucleótido, iii) modificar la secuencia del polinucleótido en el cromosoma para potenciar la actividad de cada polipéptido y iv) una combinación de los mismos. Específicamente, la potenciación de la actividad del polipéptido se puede realizar mediante un método seleccionado de un método para insertar un polinucleótido que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica cada polipéptido en un cromosoma, un método para introducir el polinucleótido en un microorganismo a través de un sistema de vector, un método para introducir un promotor que presenta una actividad mejorada en dirección 5' de una secuencia de bases que codifica cada polipéptido o introducir cada uno de los polipéptidos mutados en un promotor, un método para modificar la secuencia de nucleótidos en la región 5'-UTR y un método para introducir un mutante de la secuencia de bases que codifica cada polipéptido, pero la presente descripción no se limita a ello.
Además, en la presente descripción, el microorganismo que tiene actividad aciltransferasa se puede usar independientemente del origen del microorganismo siempre que tenga actividad aciltransferasa. Por ejemplo, el microorganismo puede ser Escherichia sp., Corynebacterium sp., Saccharomyces sp. o Yarrowia sp. Más específicamente, el microorganismo puede ser Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Saccharomyces cerevisiae o Yarrowia lipolytica, pero no se limita a ello.
Además, en la presente descripción, el microorganismo que tiene una actividad aciltransferasa puede ser un microorganismo que tenga una permeabilidad de la membrana celular potenciada de un donante y/o un receptor. Como método para aumentar la permeabilidad de la membrana celular, se puede usar un método conocido. Específicamente, pueden repetirse procesos de congelación y descongelación del microorganismo, pero la presente descripción no se limita a ello.
Además, en la presente descripción, el microorganismo que tiene una actividad aciltransferasa puede biosintetizar un receptor al que se transfiere un grupo acilo desde un donante, pero la presente descripción no se limita a ello. Específicamente, el microorganismo de la presente descripción puede producir W-acetil-L-metionina incluso cuando se cultiva en un medio al que no se le añade L-metionina porque tiene la capacidad de producir L-metionina que es un aceptor de un grupo acilo.
Además, en la presente descripción, el microorganismo que tiene una actividad aciltransferasa puede ser un microorganismo mutante en el que se introduce una mutación conocida con respecto a un mecanismo relacionado, tal como una ruta relacionada con la biosíntesis o un mecanismo relacionado con la capacidad de liberación de sustrato para potenciar la capacidad de producción de N-acetil-L-metionina por separado de la aciltransferasa.
Un aspecto de la presente descripción proporciona un polipéptido que tiene una actividad acetiltransferasa, estando representado el polipéptido por una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO. 1 a 6 o una secuencia de aminoácidos que tiene un 90 % o más de homología con la secuencia de aminoácidos. Específicamente, la actividad acetiltransferasa puede ser una actividad de acetiltransferasa para la L-metionina.
El polipéptido es como se ha descrito anteriormente.
Otro aspecto de la presente descripción proporciona un polinucleótido que codifica el polipéptido que tiene una actividad acetiltransferasa, estando representado el polipéptido por una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO. 1 a 6 o una secuencia de aminoácidos que tiene un 90 % o más de homología con la secuencia de aminoácidos. El polipéptido es como se ha descrito anteriormente.
Por ejemplo, el polinucleótido puede ser una secuencia de bases de una cualquiera de las SEQ ID NO. 7 a 12, pero no se limita a ello. Además, el polinucleótido puede incluir una secuencia de bases que codifique la misma secuencia de aminoácidos debido a la degeneración del código genético y un mutante de la misma. Por ejemplo, el polinucleótido puede modificarse para que tenga un codón óptimo dependiendo del microorganismo utilizado.
Específicamente, el polinucleótido puede ser una secuencia de bases que codifique una secuencia de aminoácidos que tenga un 70 % o más, un 80 % o más o un 90 % o más de homología con la secuencia de bases anterior y que tenga una actividad aciltransferasa sustancialmente igual o correspondiente a la de la secuencia de bases anterior. Además, el polinucleótido puede ser una sonda que se puede preparar a partir de una secuencia génica conocida, por ejemplo, puede ser una secuencia que codifica un polipéptido que tiene actividad aciltransferasa por hibridación con una secuencia complementaria con toda o parte de la secuencia de bases en condiciones estrictas. En el presente documento, las “condiciones estrictas” se refieren a condiciones en las que se forma un híbrido específico y no se forma un híbrido no específico. Por ejemplo, las condiciones estrictas pueden incluir una condición en la que los genes que tienen una alta homología, por ejemplo, los genes que tienen un 80 % o más, específicamente un 90 % o más, más específicamente un 95 % o más, más específicamente un 97 % o más, o particularmente específicamente un 99 % o más de homología se hibridan y los genes que tienen una homología inferior no se hibridan, y una condición en la que la limpieza se realiza una vez, específicamente dos o tres veces con una concentración de sal y una temperatura correspondientes a 60 0C, 1 xSs C, SDS al 0,1 %, específicamente 60 0C, 0,1 xSSC, SDS al 0,1 %, y más específicamente 68 0C, 0,1xSSC, SDS al 0,1 %, que son condiciones de limpieza para la hibridación convencional (Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)).
La sonda utilizada en la hibridación puede ser parte de una secuencia complementaria de la secuencia de bases. Esta sonda se puede preparar mediante PCR usando un fragmento génico que incluye una secuencia de bases de este tipo como molde mediante el uso de un oligonucleótido preparado basándose en una secuencia conocida como cebador. Por ejemplo, como sonda, se puede usar un fragmento génico que tenga una longitud de aproximadamente 300 pb. Más específicamente, cuando se usa como sonda un fragmento génico que tiene una longitud de aproximadamente 300 pb, como condiciones de limpieza para la hibridación, se ejemplifican 50 °C, 2xSSC y SDS al 0,1 %.
Los genes, las secuencias polipeptídicas codificadas por los genes y las secuencias promotoras, que se usan en la presente descripción, pueden obtenerse de bases de datos conocidas, por ejemplo, GenBank de NCBI. Sin embargo, la presente invención no se limita a ello.
Otro aspecto más de la presente descripción proporciona un vector de expresión que incluye el polinucleótido.
El vector de expresión que incluye el polinucleótido según la presente descripción es un vector de expresión capaz de expresar una proteína diana en una célula huésped adecuada y se refiere a un producto de polinucleótido que incluye un elemento de control esencial unido operativamente para expresar un inserto de polinucleótido. Las proteínas diana se pueden obtener transformando o transfectando el vector de recombinación preparado en la célula huésped.
El vector de expresión que incluye el polinucleótido según la presente descripción no se limita particularmente, pero incluye plásmidos derivados de Escherichia coli (pYG601BR322, pBR325, pUC118 y pUC119), plásmidos derivados de Bacillus subtilis (pUB110 y pTP5), plásmidos derivados de levadura (YEp13, YEp24 y YCp50) y plásmidos de Ti que se pueden usar para la transformación mediada por Agrobacterium. Los ejemplos específicos de ADN fágico incluyen fagos A (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, lambda gt10, lambda gt11 y lambda ZAP). Además, también se pueden usar vectores víricos derivados de virus animales tales como retrovirus, adenovirus y virus vaccinia, virus de insectos tales como baculovirus, virus de plantas bicatenarios (por ejemplo, CaMV), virus monocatenarios o Geminivirus.
Además, como vector de la presente descripción, se puede usar un plásmido de fusión (por ejemplo, pJG4-5) al que se une la proteína activadora de la expresión de ácido nucleico (por ejemplo, B42). Además, para facilitar la purificación de una proteína diana recuperada en la presente descripción, el vector de plásmido puede incluir además otras secuencias según sea necesario. Un plásmido de fusión de este tipo puede incluir GST, g Fp , marcador His o marcador Myc como marcador, pero el plásmido de fusión de la presente descripción no se limita a los ejemplos anteriores.
Además, en la producción de la proteína de fusión, se puede usar un proceso de cromatografía y, en particular, la proteína de fusión se puede purificar mediante cromatografía de afinidad. Por ejemplo, cuando se fusiona glutatión-S-transferasa, se puede usar glutatión, que es un sustrato de esta enzima. Cuando se usa hexahistidina, la proteína diana deseada se puede recuperar fácilmente usando una columna de resina conjugada con Ni-NTA His (Novagen, EE. UU.).
Para insertar el polinucleótido de la presente descripción como vector, se puede usar un método parar escindir ADN purificado con una enzima de restricción adecuada e insertar el ADN escindido en un sitio de restricción o un sitio de clonación de un vector de ADN apropiado.
El polinucleótido que codifica el polipéptido de la presente descripción se puede unir operativamente a un vector. El vector de la presente descripción puede incluir adicionalmente un elemento cis tal como un potenciador, una señal de corte y empalme, una señal de adición de poli A, un marcador de selección y una secuencia de unión al ribosoma (secuencia SD), además del promotor y el ácido nucleico. de la presente descripción. Los ejemplos del marcador de selección pueden incluir la resistencia al cloranfenicol, la resistencia a la ampicilina, la dihidrofolato reductasa y la resistencia a la neomicina, pero los componentes adicionales unidos operativamente por los ejemplos anteriores no se limitan. El término “transformación” , como se usa en la presente descripción, se refiere a un fenómeno de introducción de ADN en la célula huésped para permitir que el ADN sirva como un factor de un cromosoma o para que se replique mediante la finalización de la integración cromosómica y la introducción de ADN externo en una célula para provocar un cambio genético artificial.
Un vector de expresión que incluye un polinucleótido que codifica el polipéptido de la presente descripción o una parte del vector de expresión puede introducirse en una célula huésped. En el presente documento, una parte del vector de expresión se refiere a una porción del vector de expresión, incluyendo la porción una porción del polinucleótido que codifica el polipéptido de la presente descripción para transmitir la actividad aciltransferasa a la célula huésped. Por ejemplo, se puede ejemplificar el ADN-T del plásmido de Ti transferido a la célula huésped en la transformación mediada por Agrobacterium, pero la presente descripción no se limita a ello.
Se puede usar cualquier método de transformación para el método de transformación de la presente descripción, y se puede realizar fácilmente según un método conocido en la técnica. Generalmente, el método de transformación puede incluir un método de precipitación de CaCl2, un método de Hanahan en el que se usa dimetilsulfóxido (DMSO) como material de reducción en el método de precipitación de CaCl2 para aumentar la eficiencia, un método de electroporación, un método de precipitación de CaPO4, un método de fusión de protoplasma, un método de agitación que usa fibra de carburo de silicio, un método de transformación mediado por Agrobacterium, un método de transformación usando PEG, un método de transformación mediado por sulfato de dextrano, un método de transformación mediado por lipofectamina y un método de transformación mediado por secado/inhibición. El método para transformar un vector que incluye un polinucleótido que codifica el polipéptido de la presente descripción no se limita a los ejemplos anteriores, y se pueden usar sin limitación métodos de transformación o transfección comúnmente utilizados en la técnica.
El tipo de células huésped utilizadas en la preparación de un transformante en la presente descripción no se limita particularmente siempre que se exprese el polinucleótido de la presente descripción. Los ejemplos específicos de las células huésped utilizadas en la presente descripción pueden incluir bacterias del género Escherichia tales como E. coli; bacterias del género Bacillus tales como Bacillus subtilis; bacterias del género Pseudomonas tales como Pseudomonas putida; levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae y Schizosaccharomyces pombe; células animales; células vegetales; y células de insecto. Los ejemplos específicos de cepas de Escherichia coli que se pueden usar en la presente descripción pueden incluir CL41(DE3), BL21 y HB101, y los ejemplos específicos de cepas de Bacillus subtilis que se pueden usar en la presente descripción pueden incluir WB700 y LKS87.
El transformante en el que se introduce un vector de expresión que incluye el polinucleótido de la presente descripción puede estar en forma de una célula transformada o un organismo.
Como promotor en la presente descripción, se puede usar cualquier promotor siempre que sea capaz de expresar el polinucleótido de la presente descripción en la célula huésped. Por ejemplo, se puede usar Escherichia coli o promotores derivados de fagos tales como el promotor trp, el promotor lac, el promotor PL y el promotor PR; promotores infectados con Escherichia coli o derivados de fagos tales como el promotor T7; CaMV35S, MAS o el promotor de histonas; y el promotor cj7 (Publicación de solicitud de patente coreana N.° 10-2004-0107215). Además, también se pueden usar promotores modificados artificialmente tales como el promotor tac.
Otro aspecto más de la presente descripción proporciona un método para preparar N-acetil-L-metionina, que incluye: acetilar L-metionina usando (i) el microorganismo de la presente descripción o un cultivo del mismo; (ii) el polipéptido de la presente descripción; o una combinación de los mismos.
Específicamente, el método incluye: preparar N-acetil-L-metionina, que incluye: acetilar L-metionina usando (i) el microorganismo de la presente descripción o un cultivo del mismo; (ii) el polipéptido de la presente descripción; o una combinación de los mismos; y recuperar W-acetil-L-metionina, que es la L-metionina acetilada.
En la presente descripción, el “cultivo” se refiere al crecimiento del microorganismo en condiciones ambientales adecuadamente controladas.
El proceso de cultivo de la presente invención se puede realizar según un medio y condiciones de cultivo adecuados, que se conocen en la técnica. Un proceso de cultivo de este tipo puede ajustarse fácilmente por los expertos en la técnica dependiendo de la cepa que se va a seleccionar. En el método anterior, el proceso de cultivo del microorganismo no se limita particularmente, pero se puede realizar mediante un método de cultivo discontinuo, un método de cultivo continuo o un método de cultivo discontinuo alimentado, que se conoce en la técnica. El medio utilizado para cultivar el microorganismo de la presente descripción y otras condiciones de cultivo se pueden usar sin ninguna limitación particular siempre que pueda usarse para cultivar microorganismos generales. Específicamente, el microorganismo de la presente descripción se puede cultivar en un medio general que incluye una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una fuente de fósforo, un compuesto inorgánico, un aminoácido y/o una vitamina mientras se controla la temperatura, el pH y similares en condiciones aeróbicas.
En la presente descripción, los ejemplos de fuentes de carbono pueden incluir, pero sin limitación, carbohidratos tales como glucosa, fructosa, sacarosa, maltosa, manitol y sorbitol; alcoholes tales como alcohol de sacárido, glicerol, ácido pirúvico, ácido láctico y ácido cítrico; ácidos orgánicos; y aminoácidos tales como ácido glutámico, metionina y lisina. Además, se pueden usar fuentes de nutrientes naturales tales como hidrolizado de almidón, melaza, melaza residual, salvado de arroz, mandioca, residuos de caña de azúcar y líquidos de inmersión de maíz. Específicamente, se pueden usar carbohidratos tales como glucosa y melaza pretratada esterilizada (es decir, melaza convertida en azúcares reductores) y se pueden usar diversas cantidades adecuadas de otras fuentes de carbono sin limitación. Estas fuentes de carbono se pueden usar solas o en una combinación de dos o más.
Los ejemplos de las fuentes de nitrógeno pueden incluir fuentes de nitrógeno inorgánico tales como amoníaco, sulfato de amonio, cloruro de amonio, acetato de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio; y fuentes de nitrógeno orgánico, tales como aminoácidos tales como ácido glutámico, metionina y glutamina, peptona, NZ-amina, extractos de carne, extractos de levadura, extractos de malta, líquidos de inmersión de maíz, hidrolizados de caseína, pescado o productos de degradación del mismo, y torta de soja desgrasada o productos de degradación de los mismos. Estas fuentes de nitrógeno se pueden usar solas o en una combinación de dos o más. Sin embargo, la presente invención no se limita a ello.
Los ejemplos de las fuentes de fósforo pueden incluir fosfato de potasio, fosfito de potasio y sales que contienen sodio de los mismos. Los ejemplos del compuesto inorgánico pueden incluir cloruro de sodio, cloruro de calcio, cloruro de hierro, sulfato de magnesio, sulfato de hierro, sulfato de manganeso y carbonato de calcio, y pueden incluir, pero sin limitación, aminoácidos, vitaminas y/o precursores adecuados. Estos medios o precursores se pueden añadir a un cultivo de manera discontinua o continua, pero sin limitarse a ello.
En la presente descripción, el pH de un cultivo se puede ajustar añadiendo un compuesto tal como hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, amoníaco, ácido fosfórico o ácido sulfúrico a un cultivo de manera apropiada durante el cultivo de microorganismos. Además, durante el cultivo de microorganismos, la formación de burbujas se puede suprimir usando un agente antiespumante tal como éster de poliglicol alifático. Además, se puede inyectar oxígeno o gas que contenga oxígeno en un cultivo para mantener el estado aeróbico del cultivo, o se puede inyectar nitrógeno, hidrógeno o dióxido de carbono en el cultivo para mantener los estados anaeróbico y no aeróbico del cultivo sin inyectar el gas.
La temperatura del cultivo varía dependiendo del microorganismo de la presente descripción. Específicamente, la temperatura del mismo puede ser de 20 0C a 50 0C, más específicamente, de 25 0C a 40 0C, pero no se limita a ello. El período de cultivo puede continuar hasta que se obtenga la cantidad de un material útil deseado. Específicamente, el período de cultivo puede ser de 10 horas a 100 horas, pero no se limita a ello.
Además, el término “cultivo” , como se usa en la presente descripción, se refiere a un producto obtenido después de cultivar el microorganismo de la presente descripción. El cultivo incluye tanto una forma que contiene microorganismos como una forma en la que los microorganismos se retiran por centrifugación o similar en una solución de cultivo que contiene los microorganismos.
Además, en la presente descripción, el microorganismo de la presente descripción puede producir L-metionina o puede añadirse al medio.
Además, en la etapa de recuperación de N-acetil-L-metionina en la presente descripción, la N-acetil-L-metionina diana puede recuperarse de la solución de cultivo usando un método adecuado conocido en la técnica relacionada según el método para cultivar el microorganismo de la presente descripción, por ejemplo, un método de cultivo discontinuo, un método de cultivo continuo o un método de cultivo discontinuo alimentado. Por ejemplo, se puede usar centrifugación, filtración, cromatografía de intercambio aniónico, cristalización, HPLC y similares, y se puede usar una combinación de métodos adecuados conocidos en la técnica.
La etapa de recuperación puede incluir una etapa de separación y/o una etapa de purificación.
Otro aspecto más de la presente descripción proporciona una composición para preparar N-acetil-L-metionina a partir de L-metionina, incluyendo la composición, como ingrediente activo: (i) el microorganismo de la presente descripción o un cultivo del mismo; (ii) el polipéptido de la presente descripción; o una combinación de los mismos. El microorganismo, cultivo, polipéptido y W-acetil-L-metionina son como se han descrito anteriormente.
Modo para la invención
De aquí en adelante, la presente descripción se describirá con más detalle con referencia a los ejemplos. Sin embargo, estos Ejemplos son solo ilustrativos de la presente descripción y el alcance de la presente descripción no se limita a estos Ejemplos.
Ejemplo 1: Selección de enzimas novedosas para producir W-acetilmetionina
Ejemplo 1-1: Selección de microorganismos para producir W-acetil-L-metionina
Como microorganismos que tienen la capacidad de producir W-acetil-L-metionina, se confirmaron manchas de W-acetilmetionina, que son productos, a partir de seis tipos de soluciones de cultivo de microorganismos seleccionados aleatoriamente (Pseudomonas putida, Bacillus subtilis, Enterobacter sp. 638, Pseudovibrio sp. FO-BEG1, Yarrowia lipolytica PO1f (At CC MYA-2613™) y Corynebacterium glutamicum ATCC 13032).
Específicamente, se inoculó Pseudomonas putida, Bacillus subtilis, Enterobacter sp. 638 o Yarrowia lipolytica PO1f en un tubo de cultivo desechable de 14 ml que contenía 3 ml de un medio YPD líquido (extracto de levadura al 1 %, bactopeptona al 2 %, glucosa al 2 %) y se cultivó en agitación durante 24 horas en condiciones de 30 0C y 200 rpm para obtener una solución de cultivo de semilla. Se inoculó 1 ml de la solución de cultivo de semilla en un matraz con deflector angular de 250 ml lleno con 24 ml del medio YPD líquido que contenía el 0,5 % (5 g/l) de metionina y se cultivó con agitación durante 24 horas en condiciones de 30 0C y 200 rpm.
Además, se inoculó Pseudovibrio sp. FO-BEG1 en un tubo de cultivo desechable de 14 ml que contenía 3 ml de medio de caldo marino BACTO líquido (Difco 2216) y se cultivó en agitación durante 24 horas en condiciones de 28 0C y 200 rpm para obtener una solución de cultivo de semilla. Se inoculó 1 ml de la solución de cultivo de semilla en un matraz con deflector angular de 250 ml lleno con 24 ml del medio de caldo marino BACTO líquido (Difco 2216) que contenía el 0,5 % (5 g/l) de metionina y se cultivó con agitación durante 24 horas en condiciones de 28 0C y 200 rpm.
Además, se inoculó Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 en un tubo de cultivo desechable de 14 ml que contenía 3 ml de un medio líquido compuesto específico (los ingredientes se muestran a continuación) y se cultivó con agitación durante 24 horas en condiciones de 30 0C y 200 rpm para obtener una solución de cultivo de semilla. Se inoculó 1 ml de la solución de cultivo de semilla en un matraz con deflector angular de 250 ml lleno con 24 ml del medio líquido compuesto específico que contenía el 0,5 % (5 g/l) de metionina y se cultivó con agitación durante 24 horas en condiciones de 37 0C y 200 rpm.
<Medio líquido compuesto>
20 g de glucosa, 10 g de peptona, 5 g de extracto de levadura, 1,5 g de urea, 4 g de KH2 PO4 , 8 g de K2HPO4 , 0,5 g de MgSO47H2O, 100 μg de biotina, 1000 μg de tiamina HCl, 2000 μg de pantotenato de calcio, 2000 μg de nicotinamida y 25 mg de kanamicina (basado en 1 l de agua destilada)
Después de completar el cultivo, la solución de cultivo se dejó en un horno a 50 0C durante la noche para que se concentrara y se analizó 1 μl de la solución de cultivo concentrada mediante cromatografía en capa fina. Se usaron 10 mM de un reactivo de N-acetil-L-metionina (Sigma Aldrich 01310) como grupo de control. Se confirmó la misma mancha que en el grupo de control a partir del concentrado líquido de cultivo de los seis tipos de microorganismos anteriores.
A partir de los resultados anteriores, se predijo que cada uno de los seis tipos de microorganismos que tienen la capacidad de producir N-acetil-L-metionina contiene una aciltransferasa que incluye L-metionina como sustrato. Ejemplo 1-2: Confirmación de la secuencia de la aciltransferasa novedosa
La metionina aciltransferasa se seleccionó de los seis tipos de microorganismos seleccionados en el Ejemplo 1-1. Se realizaron búsquedas de homología heterogénea para las proteínas seleccionadas restringiendo la base de datos a las especies del microorganismo basándose en una secuencia de aminoácidos con YncA conocida como metionina aciltransferasa convencional. Como resultado, se encontró que los seis tipos de enzimas buscadas tenían una homología baja con la secuencia de aminoácidos de YncA, y la homología de la secuencia de aciltransferasa derivada de Enterobacter sp. 638, que tenía la mayor homología, fue del 82 %. Se proporcionan homologías de las levaduras respectivas con YncA en la Tabla 1.
A partir de los resultados anteriores, se infiere que los tipos de polipéptidos anteriores son polipéptidos que tienen una actividad aciltransferasa novedosa inferior a la homología de una aciltransferasa convencional, y los microorganismos que incluyen estos polipéptidos también son microorganismos que tienen una actividad aciltransferasa novedosa que no se conocía anteriormente.
[Tabla 1]
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Ejemplo 2: Producción de W-acetilmetionina a través de conversión enzimática in vitro usando una aciltransferasa novedosa
Ejemplo 2-1: Preparación de Escherichia coli introducida por una aciltransferasa novedosa
Se sintetizaron genes de aciltransferasa novedosa derivados de Pseudomonas, derivados de Bacillus, derivados de Enterobacter y derivados de Pseudovibrio (SEQ ID NO. 7, 8, 9 y 10) como codones optimizados para Escherichia coli basándose en las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO. 1,2, 3 y 4) de las enzimas respectivas.
Para obtener un gen de aciltransferasa novedosa derivada de Yarrowia, se extrajo ADNg de Yarrowia lipolytica PO1f (ATCC MYA-2613™). Se obtuvo un gen (SEQ ID NO. 11) de un tamaño deseado y una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO. 5) de un tamaño deseado realizando una reacción en cadena de la polimerasa usando los cebadores 1 y 2 con el ADNg como molde.
Para obtener un gen de aciltransferasa novedosa derivada de Corynebacterium, se cultivó por extensión Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 en un medio sólido con estrías y después se cultivó durante la noche para obtener colonias. Se obtuvo un gen (SEQ ID NO. 12) que tenía un tamaño de aproximadamente 0,5 kb y una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO. 6) que tenía un tamaño de aproximadamente 0,5 kb realizando PCR (reacción en cadena de la polimerasa) usando los cebadores 3 y 4 con una colonia como molde. En este caso, la PCR se realizó realizando la desnaturalización a 94 °C durante 5 minutos, repitiendo la desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridando a 56° C durante 30 segundos y polimerizando a 72 °C durante 1 minuto 30 veces, y después realizando una reacción de polimerización a 72 0C durante 7 minutos.
Los seis tipos de ADN se trataron con las enzimas de restricción NdeI y XbaI y después se ligaron a un vector pUCtk tratado con las mismas enzimas de restricción. El plásmido recombinante preparado se transformó aplicando choque térmico a Escherichia coli DH5a a 42 0C durante 90 segundos y después se cultivó por extensión en un medio sólido LB que contenía kanamicina y se cultivó durante la noche a 37 0C. Una colonia obtenida en el cultivo se inoculó en 3 ml de un medio líquido LB que contenía kanamicina y se cultivó durante la noche, y después se recuperó el plásmido recombinante usando un kit de miniprep de plásmido (Bioneer, Corea). La información de la secuencia del plásmido recombinante recuperado se confirmó mediante secuenciación (Macrogen, Corea) y los plásmidos se denominaron pUCtk-ppmat, pUCtk-bsmat, pUCtk-entmat, pUCtk-pvmat, pUCtk-ylmat y pUCtk-cgmat.
Se seleccionaron como transformantes las colonias que sobrevivieron después de introducir el plásmido recombinante en Escherichia coli BL21 (DE3) usando choque térmico y cultivando por extensión esto en un medio sólido LB que contenía kanamicina. Los transformantes seleccionados se denominaron BL21(DE3)/pUCtk-ppmat (o E. coli CC03-9001), BL21 (DE3)/pUCtk-bsmat (o E. coli CC03-9002), BL21(DE3)/pUCtk-entmat (o E. coli CC03-9003), BL21 (DE3)/pUCtk-pvmat (o E. coli CC03-9004) y BL21(DE3)/pUCtk-ylmat (o E. coli CC03-9005), BL21 (DE3)/pUCtkcgmat (o E. coli CC03-9006). Además, los transformantes se depositaron en el Centro coreano de cultivos de microorganismos (KCCM, por sus siglas en inglés) el 15 de julio de 2016 en virtud del Tratado de Budapest y recibieron los números de depósito KCCM11863P, KCCM11864P, KCCM11865P, KCCM11866P, KCCM11867P y KCCM11868P, respectivamente, según el orden descrito anteriormente.
Para examinar la capacidad de producción de W-acetilmetionina del Escherichia coli transformado seleccionado se inoculó una colonia en 3 ml de un medio líquido LB que contenía 25 mg/l de kanamicina y el 0,2 % (p/v) de glucosa, la mezcla se cultivó a 37 0C durante 5 horas y después se cultivó durante 3 horas con la adición de metionina hasta el 2 % (p/v), para obtener 1 μl de una solución de cultivo. La producción de W-acetilmetionina se examinó previamente mediante análisis de cromatografía en capa fina (CCF) usando 1 μl de la solución de cultivo. Se encontraron manchas que se supuso que eran W-acetilmetionina en toda la solución de cultivo, la concentración de las manchas aumentó en el orden de BL21(DE3)/pUCtk-ppmat, BL21(DE3)/pUCtk-entmat, BL21(DE3)/pUCtk-bsmat, BL21(DE3)/pUCtkcgmat, BL21(DE3)/puCtk-pvmat y BL21(DE3)/puCtk-ylmat.
[Tabla 2]
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Ejemplo 2-2: Confirmación de la capacidad de producción de W-acetilmetionina usando una aciltransferasa novedosa
Una colonia del Escherichia co litransformado preparado en el Ejemplo 2-1 se inoculó en 3 ml de un medio líquido LB que contenía 25 mg/l de kanamicina y el 0,2 % (p/v) de glucosa y la mezcla se cultivó a 37 0C durante 8 horas, y después se inoculó en 50 ml del mismo medio y se cultivó durante la noche, para obtener una solución de cultivo. La solución de cultivo se centrifugó para obtener sedimentos, los sedimentos se suspendieron en 5 ml de tampón de fosfato 50 mM (pH 7,0) y después las células se rompieron usando ultrasonidos para obtener residuos celulares. Los residuos celulares se retiraron por centrifugación a 14.000 rpm durante 30 minutos para obtener un sobrenadante. Teniendo en cuenta que el tamaño de la aciltransferasa novedosa es de aproximadamente 19 kDa, el filtrado se hizo pasar a través de una membrana de corte de 30 kDa Amicon Ultra (Milipore, Irlanda) y después a través de una membrana de corte de 10 kDa para obtener un concentrado que permaneció en el filtro. El concentrado llenó una columna HiTrap Q FF (GE, EE. U u . ) llena con Q sepharose, la aciltransferasa novedosa se separó puramente usando gradientes de concentración de NaCl (80, 100, 150, 200, 300, 500 mM, en ese orden). La enzima diluida se reconcentró a través de una membrana de corte de 10 kDa Amicon Ultra. El grado de sobreexpresión y purificación de la aciltransferasa novedosa se confirmó mediante SDS-PAGE.
Para analizar la actividad de la aciltransferasa novedosa purificada, la cantidad de W-acetilmetionina producida después de introducir un concentrado de enzima en un tampón de fosfato de pH 7,0 que contenía acetil coenzima A 20 mM y metionina 20 mM y realizar una reacción a 37 °C durante 10 minutos se midió usando HPLC (Shimadzu, system controller CBM-20A y otros accesorios). Además, la concentración de la aciltransferasa novedosa purificada se midió mediante un ensayo de Bradford, y después el valor de la W-acetilmetionina producida se dividió por la concentración de enzima para comparar la actividad específica de la enzima (Tabla 3).
Entre las aciltransferasas novedosas purificadas, la enzima derivada de Pseudomonas putida presenta la actividad más alta de 3,8 U/mg, que es 5 veces la actividad específica (0,745 U/mg) de YncA descrita en el documento (documento US-8143031 B2, Tabla 3). Además, la enzima derivada de Bacillus subtilis y la enzima derivada de Enterobacter sp. 638 presentan actividades de 1,6 U/mg y 1,7 U/mg, respectivamente, cada una de las cuales es 2 o más veces la actividad específica de YncA. Cada una de las aciltransferasas novedosas derivadas de Pseudovibrio sp. FO-BEG1, derivadas de Yarrowia lipolytica y derivadas de Corynebacterium glutamicum tienen una actividad específica baja inferior a 1 U/mg, pero la cantidad de expresión de las mismas en SDS-PAGE no es tan pequeña. Por lo tanto, se puede esperar que la capacidad de producción de W-acetilmetionina del transformante mejore dependiendo del grado de expresión en el huésped (Tabla 3).
[Tabla 3]
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Ejemplo 3: Reacción de conversión de N-acetilmetionina usando una aciltransferasa novedosa derivada de Pseudomonas putida
Ejemplo 3-1: Reacción de conversión de TV-acetilmetionina usando una aciltransferasa novedosa purificada derivada de Pseudomonas putida
Se realizó una reacción de conversión de metionina usando 1 mg de la aciltransferasa purificada derivada de Pseudomonas putida, que tenía la mayor actividad en el Ejemplo 2. Como solución de sustrato se usaron 3 ml de tampón de fosfato 50 mM de pH 7,0 que contenía metionina 20 mM y acetil coenzima A 20 mM. Cuando la solución de reacción se analizó mediante h PlC (SHIMADZU, SYSTEM CONTROLLER CBM-20A y otros accesorios) después de la reacción durante 3 horas en condiciones de 37 0C y 150 rpm, se confirmó la producción de 3,1 g/l de N-acetilmetionina. Este es un valor obtenido mediante la conversión de metionina y acetil coenzima A en la solución de reacción en un 75 % o más.
Ejemplo 3-2: Reacción de conversión de N acetilmetionina de la célula proporcionada en la presente descripción con aciltransferasa derivada de Pseudomonas putida dependiendo del aumento de la permeabilidad de la membrana celular
Una colonia del Escherichia coli BL21(DE3)/pUCtk-ppmat transformado preparado introduciendo el gen de acetiltransferasa novedosa derivada de Pseudomonas putida preparado en el Ejemplo 2 se inoculó en 3 ml de un medio líquido LB que contenía 25 mg/l de kanamicina y el 1 % (p/v) de glucosa y la mezcla se cultivó a 37 0C durante 8 horas para obtener una solución de cultivo, y después se inocularon 50 μl de la solución de cultivo en 50 ml de un medio líquido LB que contenía 25 mg/l de kanamicina y el 0,2 % (p/v) de glucosa y la mezcla se cultivó durante la noche. La solución de cultivo se centrifugó para obtener sedimentos celulares, los sedimentos celulares se congelaron en un refrigerador a -20 0C. Los procesos de volver a fundir los sedimentos celulares completamente congelados a temperatura ambiente y volver a congelar estos sedimentos celulares se repitieron tres veces para transmitir una permeabilidad alta a la membrana celular. La solución de cultivo se resuspendió hasta un volumen total de 5 ml mediante la adición de tampón de fosfato 50 mM (pH 7,0) para concentrar la solución de cultivo. Se colocaron 1,8 ml de tampón de fosfato 50 mM (pH 7,0) que contenía metionina al 2 % (p/v); 1,8 ml de tampón de fosfato 50 mM (pH 7,0) que contenía metionina al 2 % (p/v) y acetil coenzima A 20 mM; y 1,8 ml de tampón de fosfato 50 mM (pH 7,0) que contenía metionina al 2 % (p/v) y glucosa al 2 % (p/v) respectivamente en tubos de ensayo de 15 ml, y cada uno se mezcló con la enzima bacteria que tenía la permeabilidad de la membrana celular mejorada obtenida a través de los procedimientos anteriores en 200 μl hasta un volumen total de 2 ml, y después se hicieron reaccionar durante 10 horas en condiciones de 37 °C y 150 rpm. El propósito de añadir glucosa a la solución de reacción es aumentar la cantidad de producción de acetil coenzima A, que puede ser deficiente en la reacción, y no está destinado a la supervivencia de Escherichia coli. La solución de reacción se analizó mediante HPLC (SHIMADZU, SYSTEM CONTROLLER CBM-20A y otros accesorios) y los resultados de la misma se proporcionan en la Tabla 4. Como se indica en la Tabla 4, se encontró que cuando se añadía acetil coenzima A en el momento de la fermentación, la tasa de conversión molar de la solución de reacción aumentaba en comparación con cuando no se añadía acetil coenzima A. Además, puesto que se encontró que la tasa de conversión molar de la solución de reacción aumentó incluso cuando se añadió sacarosa en lugar de acetil coenzima A, se estimó que la adición de glucosa produce una porción de la acetil coenzima A. Como resultado del uso de cepas que tenían una membrana celular de permeabilidad alta, se pudo producir N-acetilmetionina a concentración alta, y también se pudo producir a concentración alta incluso cuando sólo se añadió glucosa al medio en lugar de acetil coenzima A.
[Tabla 4]
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Ejemplo 4: Producción de W-acetil-L-metionina a través de la fermentación del transformante proporcionado en la presente descripción con aciltransferasa novedosa
Ejemplo 4-1: Producción de W-acetil-L-metionina a través de Escherichia co liproporcionado en la presente descripción con aciltransferasa novedosa
Una de las colonias de los seis tipos de transformantes preparados en el Ejemplo 2 se inoculó en 3 ml de un medio líquido LB que contenía 25 mg/l de kanamicina y el 1 % (p/v) de glucosa y la mezcla se cultivó a 37 0C durante 8 horas para obtener una solución de cultivo, y después la solución de cultivo se inoculó en 50 ml de un medio líquido LB que contenía 25 mg/l de kanamicina, el 0,2 % (p/v) de glucosa y el 2 % (p/v) de metionina y la mezcla se cultivó durante la noche. En este caso, como grupo de control, se transformó un vector vacío pUCtk en BL21 (DE3) y se usó. Después de retirar las células de la solución de cultivo mediante centrifugación, la N-acetilmetionina producida se analizó mediante HPLC (SHIMADZU, SYSTEM CONTROLLER CBM-20A y otros accesorios). En el caso de BL21(DE3)/pUCtk-ppmat, se produjo W-acetilmetionina en la concentración más alta de 3,03 g/l. En el caso de BL21 (DE3)/pUCtk-entmat, se produjo W-acetilmetionina en la segunda concentración más alta de 2,23 g/l. Incluso en el caso del vector vacío, se detectó una cantidad traza de W-acetilmetionina, que se supone que es una función de la enzima YncA que posee Escherichia coli (Tabla 5).
[Tabla 5]
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Ejemplo 4-2: Producción de W-acetil-L-metionina a través de Corynebacterium proporcionado en la presente descripción con aciltransferasa novedosa
Ejemplo 4-2-1: Preparación del vector de sobreexpresión de aciltransferasa para la introducción en microorganismos del género Corynebacterium
Para examinar el efecto de la producción de W-acetil-L-metionina de las aciltransferasas novedosas (SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 5 y 6) confirmadas en el Ejemplo 1 en microorganismos del género Corynebacterium, se prepararon vectores para sobreexpresar los genes correspondientes. Se sintetizó un cebador en el que se insertó un sitio de enzima de restricción EcoRV en el extremo 5' y un cebador en el que se insertó un sitio PstI en el extremo 3' basándose en las secuencias de bases 7, 8, 9, 10, 11 y 12.
El gen basado en la secuencia de bases 7 se polimerizó a través de PCR usando el vector pUCtk-ppmat del Ejemplo 1 como molde y usando los cebadores 5 y 6. El gen basado en la secuencia de bases 8 se polimerizó a través de PCR usando el vector pUCtk-bsmat del Ejemplo 1 como molde y usando los cebadores 7 y 8. El gen basado en la secuencia de bases 9 se polimerizó a través de PCR usando el vector pUCtk-entmat del Ejemplo 1 como molde y usando los cebadores 9 y 10. El gen basado en la secuencia de bases 10 se polimerizó a través de PCR usando el vector pUCtkpvmat del Ejemplo 1 como molde y usando los cebadores 11 y 12. El gen basado en la secuencia de bases 11 se polimerizó a través de PCR usando el vector pUCtk-ylmat del Ejemplo 1 como molde y usando los cebadores 13 y 14. El gen basado en la secuencia de bases 12 se polimerizó a través de PCR usando el vector pUCtk-cgmat del Ejemplo 1 como molde y usando los cebadores 15 y 16.
Como promotor de la aciltransferasa, se usó un promotor cj7 (Publicación de solicitud de patente coreana no examinada N. ° 10-2004-0107215). Para obtener el fragmento de ADN del promotor cj7, se sintetizó un cebador en el que se insertó una enzima de restricción KpnI en el extremo 5' y un cebador en el que se insertó un sitio EcoRV en el extremo 3', y el promotor cj7 se amplificó a través de PCR usando p117-cj1 -gfp como molde (Publicación de solicitud de patente coreana N.° 10-2004-0107215). En este caso, se realizó una PCR realizando la desnaturalización a 94 °C durante 5 minutos, repitiendo la desnaturalización a 94 0C durante 30 segundos, hibridando a 56° C durante 30 segundos y polimerizando a 72 0C durante 1 minuto 30 veces, y después realizando una reacción de polimerización a 72 °C durante 7 minutos.
Los seis tipos de polinucleótidos de aciltransferasa amplificados se trataron con la enzima de restricción PstI para obtener fragmentos de ADN, y el polinucleótido del promotor cj7 se trató con KpnI y EcoRV para obtener un fragmento de ADN. Después de obtener seis fragmentos de ADN, se unieron a los sitios Kpnl y Pstl del vector pECCG117, que es un vector lanzadera de Escherichia y Corynebacterium, para transformarse en Escherichia coli DH5a y se sembraron por extensión en un medio sólido LB que contenía kanamicina (25 mg/l). Las colonias transformadas con el vector en el que se insertó el gen se seleccionaron por PCR y después los plásmidos se obtuvieron usando un método de extracción de plásmidos generalmente conocido. Los plásmidos obtenidos se denominaron pECCG 117 -Pcj7 -ppmat, pECCG117-Pcj7-bsmat, pECCG117-Pcj7-entmat, pECCG117-Pcj7-pvmat, pECCG117-Pcj7-ylmat y pECCG 117 -Pcj7 -cgmat.
Ejemplo 4-2-2: Preparación de la cepa para introducir un vector de sobreexpresión de aciltransferasa novedosa y confirmación de la capacidad de producción de W-acetil-L-metionina
Cada uno de los vectores pECCG117-Pcj7-ppmat, pECCG117-Pcj7-bsmat, pECCG117-Pcj7-entmat, pECCG117-Pcj7-pvmat, pECCG117-Pcj7-ylmat y pECCG117-Pcj7-cgmat, preparados en el Ejemplo 4-2-1, y el vector pECCG117 del grupo de control experimental se introdujo en el Corynebacterium glutamicum ATCC13032 usando un método de pulso eléctrico, se cultivó por extensión en un medio de placa compuesto que contenía kanamicina (25 mg/l) y después se cultivó a 30 °C durante 24 horas para obtener cepas. Las cepas obtenidas se denominaron 13032/pECCG117-Pcj7-ppmat, 13032/pECCG117-Pcj7-bsmat, 13032/pECCG1 17-Pcj7-entmat, 13032/pECCG117-Pcj7-pvmat, 13032/pECCG117-Pcj7-ylmat, 13032/pECCG117- pcj7-cgmat y 13032/pECCG117. Para confirmar la capacidad de producción de W-acetilmetionina del transformante, las cepas se inocularon en 14 ml de un tubo de cultivo desechable que incluía 3 ml de un medio líquido compuesto que contenía kanamicina (25 mg/l) y se cultivaron con agitación durante 24 horas en condiciones de 30 0C y 200 rpm para obtener una solución de cultivo de semilla. Se inoculó 1 ml de la solución de cultivo de semilla en un matraz con deflector angular de 250 ml que incluía 24 ml de un medio líquido compuesto que contenía kanamicina (25 mg/l) y metionina (2 % (20 g/l)), y se cultivó con agitación durante 24 horas en condiciones de 37 0C y 200 rpm. Después de completar el cultivo, se analizó la concentración de W-acetilmetionina usando HPLC (SH iMa DZU, SYSt Em CONTROLLER CBM-20A y otros accesorios) (Tabla 6).
En el caso del transformante 13032/pECCG117 preparado como grupo control, se produjeron 1,07 g/l de W-acetilmetionina. Se supone que este resultado es provocado por la capacidad de la aciltransferasa que posee Corynebacterium glutamicum, que es una cepa precursora. Además, se puede afirmar que se produce una mayor cantidad de W-acetilmetionina en comparación con la capacidad original como resultado de la sobreexpresión de los seis tipos de aciltransferasas novedosas.
<Medio de placa compuesto>
20 g de glucosa, 50 g de (NH4)2SO4 , 10 g de peptona, 5 g de extracto de levadura, 1,5 g de urea, 5 g de KH2 PO4 , 10 g de K2HPO4 , 0,5 g de MgSO47H2O, 100 μg de biotina, 1000 μg de tiamina HCl, 2000 μg de pantotenato de calcio, 2000 μg de nicotinamida, 20 g de agar y 25 mg de kanamicina (basado en 1 l de agua destilada)
<Medio líquido compuesto>
20 g de glucosa, 10 g de peptona, 5 g de extracto de levadura, 1,5 g de urea, 4 g de KH2 PO4 , 8 g de K2HPO4 , 0,5 g de MgSO47H2O, 100 ug de biotina, 1000 μg de tiamina HCl, 2000 μg de pantotenato de calcio, 2000 μg de nicotinamida y 25 mg de kanamicina (basado en 1 l de agua destilada)
[Tabla 6]
Figure imgf000013_0001
Ejemplo 4-3: Producción de W-acetil-L-metionina a través de Saccharomyces proporcionado en la presente descripción con aciltransferasa novedosa
Ejemplo 4-3-1: Preparación del vector de sobreexpresión de aciltransferasa para Saccharomyces
Para examinar el efecto de la producción de W-acetil-L-metionina de las aciltransferasas novedosas (SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 5 y 6) confirmadas en el Ejemplo 1 en Saccharomyces, se prepararon vectores para sobreexpresar los genes correspondientes. Se sintetizó un cebador en el que se insertó un sitio de enzima de restricción Spel en el extremo 5' y un cebador en el que se insertó un sitio Xhol en el extremo 3' basándose en las secuencias de bases 7, 8, 9, 10, 11 y 12.
El gen basado en la secuencia de bases 7 se polimerizó a través de PCR usando el vector pUCtk-ppmat del Ejemplo 1 como molde y usando los cebadores 17 y 18. El gen basado en la secuencia de bases 8 se polimerizó a través de PCR usando el vector pUCtk-bsmat del Ejemplo 1 como molde y usando los cebadores 19 y 20. El gen basado en la secuencia de bases 9 se polimerizó a través de PCR usando el vector pUCtk-entmat del Ejemplo 1 como molde y usando los cebadores 21 y 22. El gen basado en la secuencia de bases 10 se polimerizó a través de PCR usando el vector pUCtk-pvmat del Ejemplo 1 como molde y usando los cebadores 23 y 24. El gen basado en la secuencia de bases 11 se polimerizó a través de PCR usando el vector pUCtk-ylmat del Ejemplo 1 como molde y usando los cebadores 25 y 26. El gen basado en la secuencia de bases 12 se polimerizó a través de PCR usando el vector pUCtkcgmat del Ejemplo 1 como molde y usando los cebadores 27 y 28. En este caso, la PCR se realizó realizando la desnaturalización a 94 °C durante 5 minutos, repitiendo la desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridando a 56° C durante 30 segundos y polimerizando a 72 °C durante 1 minuto 30 veces, y después realizando una reacción de polimerización a 72 °C durante 7 minutos.
Los seis tipos de polinucleótidos de aciltransferasa amplificados se trataron con las enzimas de restricción SpeI y XhoI para obtener fragmentos de ADN. Después de obtener seis fragmentos de ADN, se unen a los sitios SpeI y XhoI del vector p414ADH, que es un vector lanzadera de Escherichia y Saccharomyces, para transformarse en Escherichia coli DH5a y se sembraron por extensión en un medio sólido Lb que contiene ampicilina (100 mg/l). Las colonias transformadas con el vector en el que se insertó el gen se seleccionaron por PCR y después los plásmidos se obtuvieron usando un kit de minipreparación de plásmidos (Bioneer, Corea). Los plásmidos obtenidos se denominaron p414ADH-ppmat, p414ADH-bsmat, p414ADH-entmat, p414ADH-pvmat, p414ADH-ylmat y p414ADH-cgmat.
Ejemplo 4-3-2: Preparación de la cepa para introducir un vector de sobreexpresión de aciltransferasa novedosa y confirmación de la capacidad de producción de W-acetil-L-metionina
Se introdujeron en Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D (Registro de patente de Corea N.° 10-1577134), que es una levadura silvestre típica recibida de EUROSCARF, usando un método de transformación de levadura, cada uno de los vectores p414ADH-ppmat, p414ADH-bsmat, p414ADH-entmat, p414ADH-pvmat, p414ADH-ylmat y p414ADH-cgmat, preparados en el Ejemplo 4-3-1, y el vector pECCG117 del grupo de control experimental. Los vectores se introdujeron en el Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1 D, y después se cultivó por extensión en un medio de placa YPD (extracto de levadura al 1 %, bactopeptona al 2 %, glucosa al 2 %) y se cultivó a 30 0C durante 24 horas para obtener cepas. Las cepas obtenidas se denominaron ScCEN/p414ADH-ppmat, ScCEN/p414ADH-bsmat, ScCEN/p414ADH-entmat, ScCEN/p414ADH-pvmat, ScCEN/p414ADH-ylmat, ScCEN/p414ADH-cgmat y ScCEN/p414ADH. Para confirmar la capacidad de producción de W-acetilmetionina del transformante, las cepas se inocularon en 14 ml de un tubo de cultivo desechable que incluía 3 ml de un medio líquido YPD que contenía ampicilina (100 mg/l) y se cultivaron con agitación durante 24 horas en condiciones de 30 0C y 200 rpm para obtener una solución de cultivo de semilla. Se inoculó 1 ml de la solución de cultivo de semilla en un matraz con deflector angular de 250 ml que incluía 24 ml de un medio líquido YPD que contenía metionina (0,5 % (5 g/l)), y se cultivó con agitación durante 24 horas en condiciones de 30 0C y 200 rpm. Después de completar el cultivo, se analizó la concentración de W-acetil-L-metionina usando HPLC (SHIMa Dz U, SYSTEM CONTROLLER CBM-20A y otros accesorios) (Tabla 7).
En el caso del transformante 13032/pECCG117 preparado como grupo control, se produjeron 1,07 g/l de W-acetilmetionina. Se supone que este resultado es provocado por la capacidad de la aciltransferasa que posee Corynebacterium glutamicum, que es una cepa precursora. Además, se puede afirmar que se produce una mayor cantidad de W-acetilmetionina en comparación con la capacidad original como un resultado de la sobreexpresión de los seis tipos de aciltransferasas novedosas.
Como puede observarse en el transformante ScCEN/p414ADH, se supone que Saccharomyces cerevisiae en sí mismo no produce W-acetilmetionina, pero se comprobó que las cepas en las que se sobreexpresan seis tipos de aciltransferasas novedosas tienen capacidad de producción de W-acetilmetionina.
[Tabla 7]
Figure imgf000015_0001
Ejemplo 4-4: Producción de W-acetil-L-metionina a través de Yarrowia proporcionado en la presente descripción con aciltransferasa novedosa
Ejemplo 4-4-1: Preparación del vector de sobreexpresión de aciltransferasa para Yarrowia
Para examinar el efecto de la producción de W-acetil-L-metionina de las aciltransferasas novedosas (SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 5 y 6) confirmadas en el Ejemplo 1 en Yarrowia, se prepararon vectores para sobreexpresar los genes correspondientes. Se sintetizó un cebador en el que se insertó un sitio de enzima de restricción Kpnl en el extremo 5' y un cebador en el que se insertó un sitio de enzima de restricción Kpnl en el extremo 3' basándose en las secuencias de bases 7, 8, 9, 10, 11 y 12.
El gen basado en la secuencia de bases 7 se polimerizó a través de PCR usando el vector pUCtk-ppmat del Ejemplo 1 como molde y usando los cebadores 29 y 30. El gen basado en la secuencia de bases 8 se polimerizó a través de PCR usando el vector pUCtk-bsmat del Ejemplo 1 como molde y usando los cebadores 31 y 32. El gen basado en la secuencia de bases 9 se polimerizó a través de PCR usando el vector pUCtk-entmat del Ejemplo 1 como molde y usando los cebadores 33 y 34. El gen basado en la secuencia de bases 10 se polimerizó a través de PCR usando el vector pUCtk-pvmat del Ejemplo 1 como molde y usando los cebadores 35 y 36. El gen basado en la secuencia de bases 11 se polimerizó a través de PCR usando el vector pUCtk-ylmat del Ejemplo 1 como molde y usando los cebadores 37 y 38. El gen basado en la secuencia de bases 12 se polimerizó a través de PCR usando el vector pUCtkcgmat del Ejemplo 1 como molde y usando los cebadores 39 y 40. En este caso, la PCR se realizó realizando la desnaturalización a 94 0C durante 5 minutos, repitiendo la desnaturalización a 94 0C durante 30 segundos, hibridando a 56° C durante 30 segundos y polimerizando a 72 0C durante 1 minuto 30 veces, y después realizando una reacción de polimerización a 72 0C durante 7 minutos.
Los seis tipos de polinucleótidos de aciltransferasa amplificados se trataron con la enzima de restricción KpnI para obtener fragmentos de ADN. Después de obtener seis fragmentos de ADN, se unen al sitio KpnI de un vector lanzadera pIMR53_AUX (FEMS Microbiology Letters volumen 199, número 1, páginas 97-102, mayo de 2001) de Escherichia e Yarrowia, para transformarse en Escherichia coli DH5a y se sembraron por extensión en un medio sólido LB que contenía ampicilina (100 mg/l). Las colonias transformadas con el vector en el que se insertó el gen se seleccionaron por PCR y después los plásmidos se obtuvieron usando un kit de minipreparación de plásmidos (Bioneer, Corea). Los plásmidos obtenidos se denominaron pIMR53U-ppmat, pIMR53U-bsmat, pIMR53U-entmat, pIMR53U-pvmat, pIMR53U-ylmat y pIMR53U-cgmat.
Ejemplo 4-4-2: Preparación de la cepa para introducir un vector de sobreexpresión de aciltransferasa y confirmación de la capacidad de producción de W-acetil-L-metionina
Se introdujeron en Yarrowia lipolytica PO1f (ATCC MYA-2613™) adquirido en la Colección estadounidense de cultivos tipo, usando un método de transformación de levadura, cada uno de los vectores pIMR53U-ppmat, pIMR53U-bsmat, pIMR53U-entmat, pIMR53U-pvmat, pIMR53U-ylmat y pIMR53U-cgmat, y el vector pIMR53_AUX del grupo de control experimental. Los vectores se introdujeron en el Yarrowia lipolytica PO1f, y después se cultivó por extensión en un medio de placa YPD (extracto de levadura al 1 %, bactopeptona al 2 %, glucosa al 2 %) y se cultivó a 30 0C durante 24 horas para obtener cepas. Las cepas obtenidas se denominaron Yl/pIMR53U-ppmat, Yl/pIMR53U-bsmat, Yl/pIMR53U-entmat, Yl/pIMR53U-pvmat, Yl/pIMR53U-ylmat, Yl/pIMR53U-cgmat e Yl/pIMR53U. Para confirmar la capacidad de producción de N-acetilmetionina del transformante, las cepas se inocularon en 14 ml de un tubo de cultivo desechable que incluía 3 ml de un medio líquido YPD y se cultivaron con agitación durante 24 horas en condiciones de 30 0C y 200 rpm para obtener una solución de cultivo de semilla. Se inoculó 1 ml de la solución de cultivo de semilla en un matraz con deflector angular de 250 ml que incluía 24 ml de un medio líquido YPD (10 g de glucosa, 3,28 g de Na2HPO4, 3,22 g de NaH2PO4, 2 g de extracto de levadura y 50 g/l de proteosepeptona) que contenían metionina (0,5 % (5 g/l)), y se cultivaron con agitación durante 24 horas en condiciones de 30 0C y 200 rpm.
Después de completar el cultivo, se analizó la concentración de W-acetil-L-metionina usando HPLC (SHIMADZU, SYSTEM CONTROLLER CBM-20A y otros accesorios) (Tabla 8).
Se supone que también se produce W-acetilmetionina en el transformante Yl/pIMR53U debido al efecto de la aciltransferasa que posee el tipo silvestre de Yarrowia iipolítica, pero se comprobó que las cepas en las que se sobreexpresan seis tipos de aciltransferasas novedosas tienen capacidad de producción de W-acetilmetionina.
[Tabla 8]
Figure imgf000016_0001
A partir de los resultados anteriores, se sugiere que las aciltransferasas recientemente desarrolladas en la presente descripción y los microorganismos que incluyen las mismas producen eficientemente W-acetil-L-metionina en comparación con una aciltransferasa YncA conocida.
Como se describió anteriormente, los expertos en la técnica podrán comprender que la presente descripción se puede ejecutar fácilmente en otras formas detalladas sin cambiar el espíritu técnico o una característica esencial de la misma. Por lo tanto, se debe apreciar que las realizaciones mencionadas son ilustrativas en todos los aspectos y no están restringidas. El alcance de la presente descripción está representado por las reivindicaciones que se describen a continuación en lugar de la descripción detallada, y se debe interpretar que el significado y alcance de las reivindicaciones y todos los cambios o formas modificadas derivadas de los equivalentes de las mismas entran dentro del alcance de la presente descripción.

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Uso de un microorganismo que tiene actividad aciltransferasa para preparar N-acetil-L-metionina, comprendiendo el microorganismo un polipéptido que tiene actividad aciltransferasa en el que el polipéptido está representado por una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO. 1 a 3 o una secuencia de aminoácidos que tiene el 90 % o más de identidad con la secuencia de aminoácidos, en donde el microorganismo se selecciona del grupo que consiste en Escherichia sp., Corynebacterium sp., Saccharomyces sp. e Yarrowia sp.
2. Uso de un polipéptido que tiene una actividad acetiltransferasa para preparar N-acetil-L-metionina, estando representado el polipéptido por una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO. 1 a 3 o una secuencia de aminoácidos que tiene un 90 % o más de identidad con la secuencia de aminoácidos.
3. Uso de un polinucleótido que codifica el polipéptido definido en la reivindicación 2 para preparar N-acetil-L-metionina.
4. Uso de un vector de expresión que comprende el polinucleótido definido en la reivindicación 3 para preparar N-acetil-L-metionina.
5. Uso de una composición para preparar N-acetil-L-metionina a partir de L-metionina, comprendiendo la composición, como ingrediente activo: (i) el microorganismo definido en la reivindicación 1 o un cultivo del mismo; (ii) el polipéptido definido en la reivindicación 2; o una combinación de los mismos
6. Un método para preparar N-acetil-L-metionina, que comprende:
acetilar L-metionina usando (i) el microorganismo definido en la reivindicación 1 o un cultivo del mismo; (ii) el polipéptido definido en la reivindicación 2; o una combinación de los mismos.
7. El método según la reivindicación 6, que comprende además:
recuperar N-acetil-L-metionina, que es la L-metionina acetilada.
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