ES2856951T3 - Variante de O-acetilhomoserina sulfidrilasa y método para producir L-metionina mediante el uso de la misma - Google Patents

Abstract

Un polipéptido modificado que tiene actividad O-acetilhomoserina sulfidrilasa, que es al menos 80 % idéntico a la SEQ ID NO: 1 y en donde el 196º aminoácido del extremo N-terminal del polipéptido, valina, se sustituye por treonina.

Description

DESCRIPCIÓN

Variante de O-acetilhomoserina sulfidrilasa y método para producir L-metionina mediante el uso de la misma

Campo técnico

La presente descripción se refiere a una variante novedosa de O-acetilhomoserina sulfidrilasa, un polinucleótido que codifica la misma, un vector que contiene el polinucleótido, una cepa capaz de expresar la variante y un método para producir L-metionina mediante el uso de la variante.

Antecedentes de la técnica

La L-metionina, un aminoácido esencial en un organismo vivo, se ha utilizado como alimento, infusión, materia prima medicinal, tal como materia prima sintética para fármacos y aditivos alimentarios. La metionina es un aminoácido importante involucrado en la transmetilación in vivo y tiene la función de proporcionar azufre.

Para la síntesis química de metionina, se utiliza principalmente un método para hidrolizar 5-(p-metilmercaptoetil)-hidantoína para producir metionina en forma de una mezcla de tipo L y tipo D. Sin embargo, la síntesis química da como resultado una producción de metionina en forma de una mezcla de tipo L y tipo D. Mientras tanto, la L-metionina se puede producir de forma selectiva con el uso de un método biológico, en el que la L-metionina se produce mediante fermentación directa utilizando un microorganismo o mediante un proceso de dos etapas (publicación de patente internacional núm. WO 2008/013432). Específicamente, el proceso de dos etapas consiste en un proceso para producir un precursor de L-metionina mediante fermentación y un proceso para convertir el precursor de L-metionina en L-metionina mediante una enzima. El proceso de dos etapas puede producir selectivamente sólo L-metionina y además producir simultáneamente ácidos orgánicos, más específicamente ácido succínico o ácido acético como subproductos de la misma reacción.

El precursor de L-metionina puede incluir O-acetilhomoserina y O-succinilhomoserina, y las enzimas utilizadas en el proceso de conversión pueden incluir O-succinilhomoserina sulfidrilasa y O-acetilhomoserina sulfidrilasa. Para maximizar la producción de L-metionina mediante el proceso de dos etapas, es necesario asegurar la cantidad máxima de O-acil homoserina fermentada, que es un precursor de L-metionina. Al mismo tiempo, las enzimas utilizadas para la conversión de enzimas para producir L-metionina deben tener una alta actividad de conversión, exhibir sobreexpresión en microorganismos y mantener una alta velocidad de reacción a altas concentraciones de O-acil homoserina. Además, las enzimas deben tener una baja inhibición de la actividad en un momento en el que el producto final (es decir, L-metionina y ácido orgánico) se acumula en alta concentración y tener estabilidad térmica para no perder su actividad durante las reacciones. A este respecto, la patente KR núm. 10-1250651 describe una O-acetilhomoserina sulfidrilasa derivada de Rhodobacter sphaeroides, que tiene mayor estabilidad térmica que las O-acetilhomoserina sulfidrilasas derivadas de microorganismos distintos de Rhodobacter sphaeroides, y por lo tanto está disponible para su uso en el proceso de dos etapas. Sin embargo, todavía existe la necesidad de desarrollar una enzima que tenga una alta actividad de conversión para su uso en el proceso de dos etapas, etcétera y una baja inhibición de la actividad en un momento en el que se acumulan los productos finales.

Descripción

[Problema técnico]

Los inventores de la presente descripción han realizado esfuerzos para desarrollar una O-acetilhomoserina sulfidrilasa como una enzima con una conversión mejorada. Como resultado, han confirmado que los polipéptidos modificados, en los que el 196° aminoácido de la O-acetilhomoserina sulfidrilasa derivada de Rhodobacter sphaeroides se modifica con un aminoácido distinto de valina, tienen una mayor conversión y estabilidad en comparación con la O-acetilhomoserina sulfidrilasa de tipo silvestre, para completar así la presente descripción.

[Solución técnica]

Un objeto de la presente descripción es proporcionar una variante de O-acetilhomoserina sulfidrilasa.

Otro objeto de la presente descripción es proporcionar un polinucleótido que codifique la variante.

Otro objeto más de la presente descripción es proporcionar un vector que incluya el polinucleótido.

Otro objeto más de la presente descripción es proporcionar un microorganismo que produzca la variante de O-acetilhomoserina sulfidrilasa.

Otro objeto más de la presente descripción es proporcionar un método para producir metionina mediante el uso de la variante de O-acetilhomoserina sulfidrilasa.

[Efectos ventajosos de la invención]

Los polipéptidos modificados de la presente descripción que tienen actividad O-acetilhomoserina sulfidrilasa son polipéptidos modificados que cumplen con todos los requisitos, tales como alta actividad para su uso como enzima de conversión industrial, alta tasa de conversión, posibilidad de sobreexpresión en E. coli, baja inhibición de la actividad en un momento en que se acumula el producto final, mantenimiento de la estabilidad térmica, etcétera. En consecuencia, los polipéptidos modificados de la presente descripción son ventajosos porque pueden usarse para la producción rápida y altamente eficiente de L-metionina junto con ácido acético como subproducto.

[Breve descripción de los dibujos]

La figura 1 muestra una imagen que ilustra los resultados de la electroforesis en gel SDS-PAGE con respecto a las muestras obtenidas en cada etapa después de la purificación de la O-acetilhomoserina sulfidrilasa derivada de Rhodobacter sphaeroides.

[Mejor Modo]

Para lograr los objetos anteriores, un aspecto de la presente descripción proporciona un novedoso polipéptido modificado que tiene actividad O-acetilhomoserina sulfidrilasa. El polipéptido modificado es un polipéptido modificado que tiene actividad O-acetilhomoserina sulfidrilasa, que es al menos 80 % idéntico a la SEQ ID NO: 1 y en donde el 196° aminoácido del extremo N-terminal del polipéptido, valina, se sustituye con treonina. Específicamente, el polipéptido modificado que tiene actividad O-acetilhomoserina sulfidrilasa puede ser un polipéptido modificado que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

El polipéptido modificado como tal tiene una actividad O-acetilhomoserina sulfidrilasa mejorada en comparación con el polipéptido de SEQ ID NO: 1 que tiene la actividad O-acetilhomoserina sulfidrilasa.

Como se usa en la presente descripción, el término "modificación" o "variante" se refiere a un producto de cultivo o sujeto individual, que genéticamente o no genéticamente exhibe un cambio fenotípico estable, y específicamente, se refiere a una variante en la que un aminoácido de la O-acetilhomoserina sulfidrilasa derivada de Rhodobacter sphaeroides se modifica y, por lo tanto, puede aumentar eficazmente su actividad en comparación con la de tipo silvestre. La secuencia de dicha variante puede incluir un polipéptido que tiene una homología de al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % con el polipéptido modificado anterior. Específicamente, el polipéptido modificado de la presente descripción que tiene actividad O-acetilhomoserina sulfidrilasa puede incluir el polipéptido de SEC ID NO: 3 y un polipéptido que tiene una homología con la secuencia de SEC ID NO: 3 de al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 %. Además, es obvio que cualquier variante de la enzima que tenga una secuencia de aminoácidos con deleción, modificación, sustitución o adición en parte de la secuencia a la vez que conserva la modificación del 196° aminoácido (es decir, una posición particular) a treonina, también puede incluirse en el alcance de la presente descripción, siempre que la secuencia de aminoácidos tenga una homología descrita anteriormente y tenga un efecto correspondiente al de la enzima. Además, cualquier polipéptido, que esté codificado por una sonda que pueda prepararse a partir de secuencias génicas conocidas (por ejemplo, un polinucleótido que pueda hibridar en condiciones rigurosas con secuencias complementarias a la totalidad o parte de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido) y tenga la actividad O-acetilhomoserina sulfidrilasa también se puede incluir sin limitación en el alcance de la presente descripción.

Como se usa en la presente descripción, el término "condiciones rigurosas" significa condiciones que permiten la hibridación específica entre polinucleótidos. Tales condiciones se basan en la longitud y el grado de complementariedad de los polinucleótidos, y los parámetros relacionados son bien conocidos en la técnica y se describen específicamente en las referencias (por ejemplo, J. Sambrook y otros, supra). Por ejemplo, las condiciones pueden incluir llevar a cabo la hibridación entre genes que tienen una alta homología, una homología del 80 % o más, específicamente del 90 % o más, más específicamente del 95 % o más, incluso más específicamente del 97 % o más, y más específicamente del 99 % o más, a la vez que no se lleva a cabo la hibridación entre genes que tienen una homología menor a las homologías anteriores; o llevar a cabo la hibridación una vez, específicamente dos o tres veces, en condiciones de lavado convencionales para la hibridación Southern de 60 °C, SSC 1 X y SDS al 0,1 %, específicamente a una concentración de sal y temperatura correspondientes a 60 °C, SSC 0,1 X y SDS al 0,1 %, y más específicamente 68 °C, SSC 0,1 X y Sd S al 0,1 %.

Las sondas utilizadas en la hibridación pueden ser parte de las secuencias complementarias de las secuencias de nucleótidos. Estas sondas se pueden preparar mediante PCR con el uso de oligonucleótidos preparados sobre la base de secuencias conocidas como cebadores y fragmentos génicos que contienen las secuencias de nucleótidos como molde. Además, un experto en la técnica puede ajustar la temperatura y la concentración de sal de las soluciones de lavado según sea necesario, dependiendo de factores tales como la longitud de las sondas.

Como se usa en la presente descripción, el término "homología" se refiere a un porcentaje de identidad entre dos polinucleótidos o porciones polipeptídicas. La homología entre las secuencias de una porción y otra se puede determinar mediante una técnica conocida en la materia. Por ejemplo, la homología se puede determinar mediante la alineación directa de la información de la secuencia, tales como los parámetros que incluyen puntuación, identidad, similitud, etcétera (por ejemplo, BLAST 2.0) entre dos moléculas polinucleotídicas o dos moléculas polipeptídicas mediante el uso de un programa informático fácilmente disponible que pueda alinear información de secuencia. Además, la homología entre polinucleótidos puede determinarse mediante hibridación de los polinucleótidos en condiciones en las que los polinucleótidos pueden formar una doble cadena estable entre regiones homólogas y después descomponerlas con el uso de una nucleasa específica de cadena sencilla para determinar el tamaño de los fragmentos descompuestos.

El polipéptido descrito por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 puede ser un polipéptido de tipo silvestre que tiene una actividad O-acetilhomoserina sulfidrilasa derivada de Rhodobacter sphaeroides. El polipéptido que tiene actividad O-acetilhomoserina sulfidrilasa de SEQ ID NO: 1 tiene mayor estabilidad térmica en comparación con péptidos derivados de otros microorganismos (por ejemplo, Hyphomonas neptunium, etcétera). Por lo tanto, es obvio que el polipéptido modificado de la presente descripción, en el que se introduce una sustitución de aminoácidos en el polipéptido que tiene la actividad O-acetilhomoserina sulfidrilasa de SEQ ID NO: 1, además tendrá la ventaja de una alta estabilidad térmica.

Como se usa en la presente descripción, el término "O-acetilhomoserina" se refiere al primer intermediario específico en la biosíntesis de metionina que se puede observar en microorganismos, y se puede producir por catálisis mediante el uso de homoserina acetiltransferasa en L-homoserina y acetil-CoA en la unión de biosíntesis de treonina.

Como se usa en la presente descripción, el término "precursor" se refiere a un metabolito que es parte de la ruta metabólica específica de metionina producida por cepas productoras de precursores de L-metionina o aquellas derivadas de su metabolito. En la presente descripción, los ejemplos del precursor de L-metionina pueden ser O-succinilhomoserina u O-acetilhomoserina.

Como se usa en la presente descripción, el término "cepa productora de precursor de L-metionina" se refiere a una cepa de microorganismos procariotas o eucariotas que, al ser capaz de producir un precursor de L-metionina in vivo, puede acumular el precursor de L-metionina. Por ejemplo, la cepa productora de precursor de L-metionina puede incluir cepas de microorganismos que pertenecen al género Escherichia, el género Erwinia, el género Serratia, el género Providencia, el género Corynebacterium, el género Pseudomonas, el género Leptospira, el género Salmonella, el género Brevibacterium, el género Hyphomononas, el género Chromobacterium, el género Nocardia, o aquellos microorganismos que pertenezcan a hongos o levaduras. Específicamente, la cepa puede ser un microorganismo del género Escherichia, el género Corynebacterium o el género Leptospira, y más específicamente un microorganismo del género Escherichia (por ejemplo, Escherichia coli).

Otro aspecto de la presente descripción proporciona un polinucleótido que codifica el polipéptido modificado.

El polinucleótido es un polinucleótido que codifica un polipéptido modificado que tiene actividad O-acetilhomoserina sulfidrilasa, que es al menos 80 % idéntico a la SEQ iD NO: 1 y en donde el 196° aminoácido del extremo N-terminal del polipéptido (es decir, valina) se sustituye con treonina. Por ejemplo, el polinucleótido puede ser un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4. Además, el polinucleótido puede ser un polinucleótido que tiene una homología de al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 % o al menos 99 % con la secuencia de SEQ ID NO: 4. Además, sobre la base de la degeneración de codones, es obvio que cualquier secuencia de nucleótidos que codifique polipéptidos, que pueda hibridar en condiciones rigurosas con ácidos nucleicos (que consisten en secuencias de nucleótidos complementarias a polinucleótidos que pueden traducirse en el polipéptido modificado así como en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4) y tienen actividad O-acetilhomoserina sulfidrilasa, pueden incluirse además en el alcance de la presente descripción.

Otro aspecto más de la presente descripción proporciona un vector que incluye un polinucleótido que codifica el polipéptido modificado. El vector puede estar en una forma unida operativamente al polinucleótido.

Como se usa en la presente descripción, el término "unido operativamente" se refiere a una unión operativa entre una secuencia de control para la expresión de nucleótidos y una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína diana para realizar sus funciones generales, y esto puede afectar la expresión de la secuencia de nucleótidos que se codifica. Una unión operativa con un vector se puede preparar mediante el uso de una técnica de recombinación genética conocida en la materia, y se puede realizar la escisión y ligación de ADN específicas de un sitio mediante el uso de una enzima de restricción, una ligasa, etcétera, conocidas en la técnica.

Como se usa en la presente descripción, el término "vector" se refiere a cualquier mediador para la clonación y/o transferencia de nucleótidos a una célula huésped. Un vector puede ser un replicón que permita la replicación de un fragmento de ADN unido por otro fragmento de ADN. El término "replicón" se refiere a cualquier unidad genética que actúe como una unidad de autorreplicación para la replicación del ADN in vivo, es decir, que sea replicable por autorregulación (por ejemplo, plásmidos, fagos, cósmidos, cromosomas, virus, etcétera). El término "vector" puede incluir mediadores virales y no virales para introducir nucleótidos en una célula huésped in vitro, ex vivo o in vivo, y también puede incluir un ADN miniesférico. Por ejemplo, el vector puede ser un plásmido sin ninguna secuencia de ADN bacteriano. El término "vector" puede incluir un transposón como Sleeping Beauty (Izsvak y otros, J. Mol. Biol.

302: 93 a 102 (2000)), o un cromosoma artificial. Los ejemplos de vector convencional pueden incluir plásmidos, cósmidos, virus y bacteriófagos naturales o recombinantes. Por ejemplo, como vector de fago o vector de cósmido, pueden usarse pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A, etcétera; y como vector de plásmido pueden usarse los basados en pBR, pUC, pBluescriptlI, pGEM, pTZ, pCL, pET, etcétera. El vector que puede usarse en la presente solicitud no está particularmente limitado, sino que puede usarse cualquier vector de expresión conocido.

Además, el vector puede ser un vector recombinante que además incluye varios genes de resistencia a antibióticos.

Como se usa en la presente descripción, el término "gen de resistencia a antibióticos" se refiere a un gen que tiene resistencia a antibióticos, y las células que incluyen este gen pueden sobrevivir incluso en un entorno tratado con el antibiótico correspondiente. Por lo tanto, el gen de resistencia a antibióticos se puede utilizar eficazmente como marcador de selección para una producción a gran escala de plásmidos en E. coli. En la presente descripción, el gen de resistencia a antibióticos no es un factor que afecte significativamente la eficiencia de expresión de acuerdo con una combinación óptima de vectores, que es la tecnología central de la presente descripción y, por lo tanto, cualquier gen de resistencia a antibióticos común puede usarse como marcador de selección sin limitación. Por ejemplo, pueden usarse genes de resistencia contra ampicilina, tetraciclina, kanamicina, cloranfenicol, estreptomicina o neomicina, etcétera.

Otro aspecto más de la presente descripción proporciona un microorganismo del género Escherichia que produce O-acetilhomoserina sulfidrilasa, en donde el microorganismo expresa un polipéptido modificado que tiene actividad O-acetilhomoserina sulfidrilasa, que es al menos 80 % idéntico a la SEQ ID NO: 1 y en donde el 196o aminoácido del extremo N terminal del polipéptido, valina, se sustituye con treonina; o se puede incluir un vector que incluye un polinucleótido que codifica el polipéptido modificado.

En la presente descripción, la introducción se puede realizar mediante transformación, y el término "transformación" se refiere a la introducción de un gen en una célula huésped para la expresión del gen. Por ejemplo, la transformación se puede realizar mediante el uso de un método para introducir un vector que incluye un polinucleótido que codifica el polipéptido modificado en una célula huésped, y el método de transformar el vector puede incluir cualquier método que pueda introducir nucleótidos en las células y se puede realizar mediante la selección de una técnica estándar apropiada conocida en la materia. Se pueden utilizar métodos tales como electroporación, coprecipitación con fosfato cálcico, infección retroviral, microinyección, DEAE-dextrano, liposoma catiónico, etcétera.

Con respecto al gen transformado, se incluyen tanto una forma en la que el gen se inserta en el cromosoma de una célula huésped como una forma en la que el gen se encuentra fuera del cromosoma, siempre que el gen pueda expresarse en la célula huésped. Además, el gen incluye ADN y ARN como un polinucleótido que codifica un polipéptido, y cualquier gen que pueda introducirse y expresarse en una célula huésped puede usarse sin limitación. Por ejemplo, el gen puede introducirse en una célula huésped en forma de un casete de expresión, que es una construcción polinucleotídica que incluye todos los elementos esenciales necesarios para la autoexpresión. El casete de expresión puede incluir convencionalmente un promotor unido operativamente al gen, una señal de terminación de la transcripción, un dominio de unión al ribosoma y una señal de terminación de la traducción. El casete de expresión puede estar en forma de un vector de expresión capaz de autorreplicarse. Además, el gen puede introducirse en una célula huésped por sí mismo o en forma de una construcción polinucleotídica y unirse operativamente a secuencias necesarias para la expresión en la célula huésped.

Como se usa en la presente descripción, el término "una célula huésped (transformada) que incluye un vector" se refiere a una célula transformada con un vector que incluye un gen que codifica al menos una proteína diana. En la presente descripción, se puede usar cualquiera de los microorganismos procariotas y eucariotas siempre que el microorganismo pueda producir O-acetilhomoserina sulfidrilasa mediante la inclusión del vector. Por ejemplo, se pueden utilizar cepas microbianas pertenecientes al género de Escherichia, el género de Erwinia, el género de Serratia, el género de Providencia, el género de Corynebacteria y el género de Brevibacteria, y E. coli como ejemplo de género de Escherichia.

El microorganismo del género de Escherichia que produce O-acetilhomoserina sulfidrilasa, que expresa el polipéptido modificado que tiene actividad O-acetilhomoserina sulfidrilasa, puede incluir todos los microorganismos que pueden expresar el polipéptido modificado mediante varios métodos conocidos en la técnica, además del método de introducción de vectores descrito anteriormente.

Otro aspecto más de la presente descripción proporciona un método para producir metionina, mediante el uso del polipéptido modificado que tiene actividad O-acetilhomoserina sulfidrilasa, o un microorganismo que produce el polipéptido modificado o producto de cultivo de este. Específicamente, el método puede ser un método para producir metionina, que incluye hacer reaccionar el polipéptido modificado o un microorganismo que produce el polipéptido modificado o producto de cultivo de este con O-acetilhomoserina y metilmercaptano. La metionina puede ser L-metionina.

El producto de cultivo del microorganismo que produce O-acetilhomoserina sulfidrilasa se puede preparar a partir de cultivar en un medio el microorganismo que produce O-acetilhomoserina sulfidrilasa, que puede expresar el polipéptido modificado que tiene actividad O-acetilhomoserina sulfidrilasa, o que incluye el vector que incluye un polinucleótido que codifica el polipéptido modificado.

Como se usa en la presente descripción, el término "cultivo" se refiere al crecimiento del microorganismo en un entorno ajustado adecuadamente. En la presente descripción, el cultivo puede realizarse en un medio apropiado y en condiciones de cultivo bien conocidas en la técnica. El cultivo se puede usar fácilmente después del ajuste de acuerdo con la cepa microbiana seleccionada por un experto en la técnica. El cultivo del microorganismo se puede realizar de forma continua en un proceso discontinuo, proceso continuo, proceso semicontinuo, etcétera, conocidos en la técnica. En particular, con respecto a las condiciones de cultivo, el pH del cultivo se puede ajustar a un pH adecuado (por ejemplo, pH 5 a 9, específicamente pH 6 a 8, más específicamente pH 6,8), mediante el uso de un compuesto básico apropiado (por ejemplo, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio o amoniaco) o un compuesto ácido (por ejemplo, ácido fosfórico o ácido sulfúrico). Adicionalmente, durante el cultivo, puede usarse un agente antiespumante tal como un éster de poliglicol de ácido graso para evitar la generación de espuma. Además, la condición aeróbica del cultivo se puede mantener mediante la introducción de oxígeno o una mezcla de gases que contenga oxígeno al cultivo, y los estados anaeróbico y microaeróbico del cultivo se pueden mantener mediante la introducción de gas de nitrógeno, hidrógeno o dióxido de carbono en el cultivo sin la inyección de un gas. La temperatura de cultivo se puede mantener en el intervalo de 20 °C a 45 °C, y específicamente de 25 °C a 40 °C. Además, el cultivo puede continuarse hasta obtener la producción de un material útil, y específicamente durante 10 horas a 160 horas.

Además, como fuentes de carbono que se utilizarán en el medio de cultivo, los azúcares y carbohidratos (por ejemplo, glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, almidón y celulosa); aceites y grasas (por ejemplo, aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y aceite de coco); ácidos grasos (por ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico); alcoholes (por ejemplo, glicerol y etanol); y ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido acético) pueden usarse solos o en combinación. Como fuentes de nitrógeno que se utilizarán en el medio de cultivo, los compuestos orgánicos que contienen nitrógeno (por ejemplo, peptona, extracto de levadura, jugo de carne, extracto de malta, licor de maceración de maíz, harina de soja y urea) o compuestos inorgánicos (por ejemplo, sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio), etcétera, pueden usarse solos o en combinación. Como fuentes de fósforo para usar en el medio de cultivo, pueden usarse dihidrogenofosfato de potasio, hidrogenofosfato dipotásico, las sales correspondientes que contienen sodio, etcétera, solos o en combinación. Además, el medio de cultivo puede contener sales metálicas (por ejemplo, sulfato de magnesio o sulfato de hierro), aminoácidos, vitaminas, etcétera, que son materiales esenciales que promueven el crecimiento.

La O-acetilhomoserina puede estar en forma purificada de O-acetilhomoserina o caldo de fermentación que contiene O-acetilhomoserina. Además, el metilmercaptano puede referirse a una forma de metilmercaptano de sodio licuado (CH3S-Na) y una forma de metilmercaptano gaseoso o licuado (CH3SH), así como metilmercaptano que contiene dimetilsulfuro (DMS) (descrito en la publicación de patente internacional núm. WO 2010/098629).

El método para preparar metionina puede determinarse fácilmente en condiciones de cultivo optimizadas conocidas en la técnica por un experto en la técnica, y el método para la producción a gran escala de metionina mediante el uso del polipéptido modificado y/o un microorganismo que produce el polipéptido modificado o el producto de cultivo de este puede determinarse fácilmente en condiciones optimizadas de activación de enzimas conocidas en la técnica por un experto en la técnica.

El método para preparar metionina puede incluir además recuperar la metionina producida en la reacción anterior. El proceso de recuperación se puede realizar mediante el uso de un método apropiado conocido en la técnica. Por ejemplo, se pueden usar métodos tales como centrifugación, filtración, cromatografía de intercambio iónico, cristalización, HPLC, etcétera.

Además, el proceso de recuperación puede incluir una etapa de purificación, que se puede realizar mediante el uso de un método apropiado conocido en la técnica.

[Descripción detallada de la invención]

A continuación, la presente descripción se describirá en detalle a través de modalidades representativas.

Ejemplo 1: Preparación de la variante V196T de O-acetilhomoserina sulfidrilasa y evaluación de su actividad

Ejemplo 1-1: Expresión de O-acetilhomoserina sulfidrilasa derivada de un microorganismo del género Rhodobacter

Las células de Escherichia coli K12 W3110 (ATCC 27325) se transformaron mediante choque térmico con el vector pCL-Pcji:metZ-rsp (patente KR núm. 10-1250651), en el que la O-acetilhomoserina sulfidrilasa se derivó de (un microorganismo representativo conocido del género Rhodobacter sphaeroides). Después, los transformantes se cultivaron en un medio LB que contenía cloranfenicol (25 pg/ml). Las colonias seleccionadas se inocularon en el medio LB (3 ml) y se cultivaron a 200 rpm a 33 °C durante 6 horas. El cultivo resultante en una cantidad de 250 |jl se recogió y se volvió a inocular en un medio LB fresco (25 ml en un matraz de 250 ml) que contenía cloranfenicol (25 jg/m l) y se cultivó a 200 rpm a 33 °C durante 15 horas y de ese modo se expresó la O-acetilhomoserina sulfidrilasa de tipo silvestre.

Ejemplo 1-2: Preparación de la variante V196T (variante novedosa de O-acetilhomoserina sulfidrilasa)

Como una posición para la modificación para aumentar la actividad de la O-acetilhomoserina sulfidrilasa de tipo silvestre, se seleccionó el 196° aminoácido (es decir, valina).

El 196° aminoácido, valina (Val, V), de la O-acetilhomoserina sulfidrilasa de tipo silvestre derivada de Rhodobacter sphaeroides se sustituyó por treonina (Thr, T) mediante el uso del kit de mutagénesis dirigida a un sitio Quikchange (Agilent Technologies). Específicamente, un vector recombinante en el que se introdujo un gen que codifica una variante de O-acetilhomoserina sulfidrilasa se preparó mediante reacción de PCR con el uso de como molde junto con los cebadores de las SEQ ID NO: 5 y 6 (Tabla 1).

[Tabla 1]

Después, se confirmó la introducción de la O-acetilhomoserina sulfidrilasa modificada mediante secuenciación, y la O-acetilhomoserina sulfidrilasa modificada se introdujo en E. coli K12 W3110 mediante choque térmico. La cepa transformada se denominó CA05-4012 y se depositó en el Centro de cultivo de microorganismos de Corea (KCCM), una autoridad de depósito internacional en virtud del Tratado de Budapest, el 27 de noviembre de 2014, con el número de acceso KCCM11611P.

La Escherichia coli K12 W3110 transformada se inoculó en un medio LB que contenía cloranfenicol (25 jg/m l) y se cultivó a 33 °C durante 6 horas, y parte del cultivo se recogió y transfirió a un medio LB que contenía cloranfenicol (25 jg/m l) y se cultivó a 33 °C durante 15 horas para inducir la expresión de una variante de la enzima.

Ejemplo 1-3: Evaluación de la actividad de la solución de cultivo de la variante V196T

Se añadió p-xileno al 2 % (v/v) al cultivo de la variante de la enzima y al cultivo de la enzima de tipo silvestre, respectivamente, y se trató a 1150 rpm a 33 °C durante 1 hora. Después, se recogió parte de cada uno de los cultivos y se añadió a un tampón (que contenía fosfato de potasio 50 mM (pH 7,4, pH 6,4), O-acetilhomoserina a 15 g/l, PLP 0,05 mM (piridoxal 5'-fosfato) y metilmercaptano de sodio 30 mM), y se hizo reaccionar a 1150 rpm a 33 °C durante 5 minutos, y los reactivos se sometieron a análisis de HPLC para medir la cantidad de L-metionina producida. La cantidad de L-metionina producida se consideró como la actividad de conversión a metionina de las enzimas y, como tal, la actividad de la O-acetilhomoserina sulfidrilasa de tipo silvestre derivada de Rhodobacter sphaeroides y la de la variante V196T de esta se muestran en la Tabla 2 a continuación.

[Tabla 2]

Como resultado, como se muestra en la Tabla 2 anterior, se confirmó que la solución de cultivo de la enzima variante mostró un aumento de actividad de 1,86 veces en una condición a pH 7,4 en comparación con la de la propia enzima de tipo silvestre y aproximadamente un aumento de actividad de 2,60 veces a pH 6,4 en comparación con la de la propia enzima de tipo silvestre.

Ejemplo 2: Purificación de O-acetilhomoserina sulfidrilasa y evaluación de la actividad O-acetilhomoserina sulfidrilasa

Ejemplo 2-1: Purificación de O-acetilhomoserina sulfidrilasas

Se centrifugaron 25 ml de cada una de las soluciones de cultivo de O-acetilhomoserina sulfidrilasa de tipo silvestre derivada de Rhodobacter sphaeroides y la de su variante V196T obtenida en el Ejemplo 1 y se recogieron las células, respectivamente. Para preparar cada extracto libre de células que contiene O-acetilhomoserina sulfidrilasa, las células se suspendieron en 15 ml de fosfato de potasio 50 mM (pH 7,8) que contenía NaCl 150 mM y glicerol al 5 % y se lisaron con el uso de un sonicador mientras se mantenía la suspensión celular por debajo de 10 °C, respectivamente. Después, cada suspensión celular se centrifugó a 15000 X g durante 25 minutos para eliminar los restos celulares. Se cargó una alícuota (15 ml) de cada uno de los extractos libres de células en 10 ml de la columna MonoQ de GE Healthcare, que se equilibró con fosfato de potasio 50 mM (pH 7,8) de antemano y se lavó/eluyó en fosfato de potasio 50 mM (pH 7,8) que contenía NaCl 800 mM mediante la aplicación de un gradiente de 10 volúmenes de columna a la columna. La O-acetilhomoserina sulfidrilasa se eluyó a una conductividad eléctrica entre 15 mS/cm y 20 mS/cm. Cada eluyente se concentró hasta un volumen de 2 ml a 3 ml mediante el uso del separador centrífugo Centricon de Millipore/Amicon (MWCO: 3 kDa). Cada concentrado se cargó en la columna Superdex (HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, GE Healthcare), que se equilibró con fosfato de potasio 50 mM (pH 7,8) que contenía NaCl 150 mM y glicerol al 5 % de antemano, y se separó de acuerdo con el peso molecular.

La O-acetilhomoserina sulfidrilasa se eluyó en forma de un tetrámero dentro de un volumen de elución de 50 ml y después se concentró hasta un volumen de 200 pl o menos mediante el uso del separador centrífugo Centricon de Millipore/Amicon (MWCO: 3 kDa).

La pureza de las enzimas purificadas se examinó mediante análisis en gel SDS-PAGE al 10 % (Figura 1) y las enzimas se almacenaron a -80 °C.

Los resultados mostrados en la Figura 1 sugieren que la variante de la presente descripción se puede purificar con alta pureza, además de que se puede sobreexpresar en E. coli.

Ejemplo 2-2: Evaluación de la actividad de las O-acetilhomoserina sulfidrilasas purificadas de tipo silvestre y V196T

Las O-acetilhomoserina sulfidrilasas purificadas de tipo silvestre y variante V196T derivadas de Rhodobacter sphaeroides, cada una a una concentración de 1,3 mg/ml, se añadieron a una cantidad igual de un tampón que contenía fosfato de potasio 50 mM (pH 7,4 y pH 6,4), O-acetilhomoserina a 15 g/l, PLP (piridoxal 5'-fosfato) 0,05 mM y metilmercaptano sódico 30 mM, y se hizo reaccionar a 1150 rpm a 33 °C durante 5 minutos. Después, los reactivos se sometieron a análisis de HPLC para medir la cantidad de L-metionina producida. La actividad de las O-acetilhomoserina sulfidrilasas de tipo silvestre y la variante V196T se muestra en la Tabla 3 a continuación.

[Tabla 3]

Como resultado, como se muestra en la Tabla 3 anterior, se confirmó que la enzima variante purificada mostró un aumento de actividad de 1,90 veces en una condición a pH 7,4 en comparación con la de la propia enzima de tipo silvestre y aproximadamente un aumento de actividad de 2,68 veces a pH 6,4 en comparación con la de la propia enzima de tipo silvestre.

Ejemplo 3: Evaluación de las variantes en donde el 196° aminoácido de O-acetilhomoserina sulfidrilasa se sustituye con un aminoácido diferente

Ejemplo 3-1: Preparación de las variantes V196S, V196L, V196D y V196K

Los vectores que contienen los genes y las cepas de E. coli K12 W3110transformadas con los vectores se prepararon de la misma manera que en el Ejemplo 1-2, excepto que las variantes de la O-acetilhomoserina sulfidrilasa de tipo silvestre derivada de Rhodobacter sphaeroides, en las que el 196o aminoácido, valina (Val, V), de la O-acetilhomoserina sulfidrilasa de tipo silvestre derivada de Rhodobacter sphaeroides se sustituyó por serina (Ser, S), leucina (Leu, L), ácido aspártico (Asp, D) y lisina (Lys, K), respectivamente, preparadas mediante mutagénesis dirigida al sitio como en el Ejemplo 1.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido modificado que tiene actividad O-acetilhomoserina sulfidrilasa, que es al menos 80 % idéntico a la SEQ ID NO: 1 y en donde el 196° aminoácido del extremo N-terminal del polipéptido, valina, se sustituye por treonina.

2. Un polinucleótido que codifica el polipéptido modificado de la reivindicación 1.

3. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 2.

4. Un microorganismo del género Escherichia que produce O-acetilhomoserina sulfidrilasa, en donde el microorganismo expresa un polipéptido modificado que tiene actividad O-acetilhomoserina sulfidrilasa, que es al menos 80 % idéntico a la SEQ ID NO: 1 y en donde el 196° aminoácido del extremo N-terminal del polipéptido, valina, se sustituye con treonina; o comprende el vector de la reivindicación 3.

5. El microorganismo de la reivindicación 4, en donde el microorganismo del género Escherichia es Escherichia coli.

6. Un método para producir metionina, que comprende hacer reaccionar el polipéptido modificado de la reivindicación 1, o un microorganismo que produce el polipéptido modificado o producto de cultivo de este con O-acetilhomoserina y metilmercaptano.

7. El método de la reivindicación 6, que comprende además recuperar la metionina producida por la reacción.