WO2017065529A1 - O-아세틸호모세린 설피드릴라제 변이체 및 이를 이용한 l-메치오닌 제조 방법 - Google Patents

O-아세틸호모세린 설피드릴라제 변이체 및 이를 이용한 l-메치오닌 제조 방법 Download PDF

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WO2017065529A1
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acetylhomoserine
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sulfidylase
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이임상
손성광
유혜련
이재희
이주희
장진숙
최진근
김소영
신용욱
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씨제이제일제당 (주)
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    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Definitions

  • the present application provides a novel O-acetylhomoserine sulfhydrylase variant, a polynucleotide encoding the same, a vector comprising the polynucleotide, a strain capable of expressing the variant, and the variant. It relates to a method for producing L-methionine.
  • L-methionine is a type of essential amino acid in vivo, it is used as a pharmaceutical raw material and food additives, such as synthetic raw materials of feed, sap, pharmaceuticals. Methionine is an important amino acid involved in the methyl transfer reaction in vivo and serves to provide sulfur.
  • the two-stage process consists of a process for producing L-methionine precursor by fermentation and a process for converting the L-methionine precursor to L-methionine by an enzyme.
  • the two-stage process can selectively produce only L-methionine, and can additionally produce organic acids, more specifically succinic acid and acetic acid as by-products through the same reaction.
  • the L-methionine precursor may include O-acetylhomoserine and O-succinyl homoserine, and the enzyme used in the conversion process is O-succinylhomoserine sulfhydrylase, or O- Acetylhomoserine sulfhydrylase (O-acetylhomoserine sulfhydrylase).
  • O-acetylhomoserine sulfhydrylase O-acetylhomoserine sulfhydrylase
  • the enzymes used in the enzyme conversion reaction to produce L-methionine should have high conversion activity, overexpression in microorganisms, and high reaction rate in high concentrations of O-acylhomoserine.
  • the inhibition of activity should be low when the final product of L-methionine and organic acid accumulate at high concentrations, and the enzyme should have thermal stability in order not to lose activity during the reaction.
  • Rhodobacter O-acetylhomoserine sulfidylase derived from sphaeroides has higher thermal stability than O-acetylhomoserine sulfidylase derived from other genera, and therefore, an enzyme that can be newly used in the two-step process is disclosed.
  • Rhodobacter O-acetylhomoserine sulfidylase derived from sphaeroides has higher thermal stability than O-acetylhomoserine sulfidylase derived from other genera, and therefore, an enzyme that can be newly used in the two-step process is disclosed.
  • Rhodobacter O-acetylhomoserine sulfidylase derived from sphaeroides has higher thermal stability than O-acetylhomoserine sulfidylase derived from other genera, and therefore, an enzyme that can be newly used in the two-step process is disclosed.
  • Rhodobacter The variant polypeptide in which the 196th amino acid of O-acetylhomoserine sulfidylase derived from sphaeroides ) was changed to an amino acid other than valine was confirmed to have higher conversion and stability than the wild type, and the present application was completed.
  • One object of the present application is to provide O-acetylhomoserine sulfidylase variants.
  • Another object of the present application is to provide a polynucleotide encoding the variant.
  • Another object of the present application is to provide a vector comprising the polynucleotide.
  • Still another object of the present application is to provide a microorganism producing the O-acetylhomoserine sulfidylase variant.
  • Still another object of the present application is to provide a method for preparing methionine using the O-acetylhomoserine sulfidylase variant.
  • Variant polypeptides having O-acetylhomoserine sulfidylase activity of the present application have high activity, high conversion rate, possibility of overexpression in E. coli, low activity inhibition and heat at the time of final product accumulation
  • a variant polypeptide having all the requirements such as maintaining stability it can be used to produce L-methionine with high efficiency and fast, there is also an advantage that can be produced by-product acetic acid.
  • Rhodobacter The figure shows the result of SDS-PAGE gel analysis of the sample obtained in each step after purifying O-acetylhomoserine sulfidylase derived from sphaeroides ).
  • One aspect of the present application for achieving the above object may be a variant polypeptide having novel O-acetylhomoserine sulfidylase activity.
  • the novel variant polypeptide is Rhodobacter sphaeroides ) O-acetylhomoserine sulfido, wherein the amino acid sequence of O-acetylhomoserine sulfidylase, specifically the 196th amino acid from the N-terminus of the polypeptide set forth in SEQ ID NO: 1 is substituted with an amino acid other than valine
  • It may be a variant polypeptide having drillase activity.
  • the variant polypeptide having O-acetylhomoserine sulfidylase activity may be a variant polypeptide which is an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.
  • Such variant polypeptides have enhanced O-acetylhomoserine sulfidylase activity compared to polypeptides having the activity of O-acetyl homoserine sulfidylase of SEQ ID NO: 1.
  • variant refers to a culture or individual that exhibits one stable phenotypic change, genetically or non-genetically, and specifically in this application, Rhodobacter spheroid-derived O-acetylhomoserine sulfidila
  • Rhodobacter spheroid-derived O-acetylhomoserine sulfidila By amino acid of the O-Acetylhomoserine sulfhydrylase (mutation) means a variant whose activity can be increased efficiently compared to the wild type.
  • the sequence of such variants may comprise a polypeptide having at least 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% homology to the variant polypeptide.
  • the variant polypeptide having the O-acetylhomoserine sulfidylase activity of the present application is at least 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 3, or Polypeptides having 99% homology.
  • the mutation of the 196th amino acid, which is a specific mutation position, to an amino acid other than valine is fixed, and some sequences are deleted, modified, substituted or added. It is obvious that enzyme variants having amino acid sequences are also included within the scope of the present application.
  • a probe encoded by a known gene sequence for example, a polypeptide encoded by a polynucleotide hybridized under stringent conditions with a complementary sequence to all or part of a nucleotide sequence encoding the polypeptide, may be O-.
  • Polypeptides having acetylhomoserine sulfidylase activity may also be included without limitation.
  • stringent conditions refers to conditions that enable specific hybridization between polynucleotides. Such conditions depend on the length of the polynucleotide and the degree of complementarity and the parameters are well known in the art and are described specifically in the literature (eg, J. Sambrook et al., Homology).
  • genes with high homology 80% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more, more specifically 97% or more, particularly specifically 99% or more homologous genes 60 ° C., 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, specifically 60 ° C., 0.1 ⁇ SSC, 0.1, which is a condition for hybridizing with each other and not having homologous genes with each other, or washing conditions for normal Southern hybridization.
  • a salt concentration and temperature corresponding to% SDS more specifically 68 ° C., 0.1 ⁇ SSC, and 0.1% SDS, the conditions for washing once, specifically, two to three times can be enumerated.
  • the probe used for hybridization may be part of the complementary sequence of the nucleotide sequence.
  • a probe can be constructed by PCR using an oligonucleotide made based on a known sequence as a primer as a template of a gene fragment containing such a nucleotide sequence.
  • those skilled in the art can adjust the temperature and wash solution salt concentration as needed depending on factors such as the length of the probe.
  • homology refers to the percent identity between two polynucleotide or polypeptide moieties. Homology between sequences from one moiety to another may be determined by known techniques. For example, homology may be sequence information between two polynucleotide molecules or two polypeptide molecules, such as score, identity, and similarity, using a computer program that aligns the sequence information and is readily available. Parameters can be determined by direct alignment (eg BLAST 2.0). In addition, homology between polynucleotides can be determined by hybridization of polynucleotides under conditions of stable double-stranding between homologous regions, followed by digestion with single-strand-specific nucleases to determine the size of the digested fragments.
  • polypeptide described in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be a wild-type polypeptide having O-acetylhomoserine sulfidylase activity derived from Rhodobacter sphaeroides .
  • Such a polypeptide having O-acetylhomoserine sulfidylase activity of SEQ ID NO: 1 has high thermal stability as compared to a polypeptide derived from Hypomonas neptunium derived from other microorganisms, and thus, O-acetyl homoserine of SEQ ID NO: It is apparent that the variant polypeptide of the present application in which amino acid substitution is introduced into a polypeptide having sulfidylase activity also has a high thermal stability advantage.
  • O-acetylhomoserine is the first specific intermediate in methionine biosynthesis seen in microorganisms, and it is used for homoserine acetyltransferase in L-homoserine and acetylCoA at the junction of threonine biosynthesis. Can be catalyzed and produced.
  • the term “precursor” refers to a metabolite that is part of a methionine-specific metabolic pathway produced by an L-methionine precursor producing strain or a substance derived from this metabolite.
  • the L-methionine precursor in the present application may be O-succinyl homoserine or O-acetylhomoserine.
  • L-methionine precursor producing strain refers to a prokaryotic or eukaryotic microorganism strain capable of producing L-methionine precursor in an organism, and refers to a strain capable of accumulating L-methionine precursor.
  • strains include Escherichia sp . , Erwinia. sp . ), Serratia sp . , Providencia sp . ), Genus Corynebacterium sp . ), Pseudomonas sp . ), Leptospira sp . ), Salmonellar sp . , Brevibacteria sp .
  • microbial strains belonging to the genus Nocardia sp . Or fungi or yeast it may be a microbial strain and yeast of the genus Escherichia, Corynebacterium, Leptospira, among which the Escherichia microorganism strain may be used, but is not limited thereto, examples of the Escherichia microorganism Escherichia coli .
  • Another aspect of the present application is a polynucleotide encoding the variant polypeptide.
  • the valine which is the 196th amino acid from the N-terminus of the polypeptide described in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, may be a polynucleotide encoding a variant polypeptide having O-acetylhomoserine sulfidylase activity, which is substituted with another amino acid.
  • the polynucleotide may be a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, but is not limited thereto. It may also be a polynucleotide having at least 80%, 90%, 95%, 97% or 99% homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • nucleic acid consisting of a polynucleotide that can be translated into the variant polypeptide by codon degeneracy and a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, and the O-acetylhomoserine It is apparent that base sequences encoding polypeptides having sulfidylase activity may also be included.
  • Another aspect of the present application is a vector comprising a polynucleotide encoding the variant polypeptide.
  • the vector may be in the form in which the polynucleotide is operably linked.
  • operably linked may generally affect the expression of a base sequence that is operably linked to and encodes a base sequence encoding a protein of interest to perform a function.
  • Operable linkages with vectors can be made using genetic recombination techniques known in the art, and site-specific DNA cleavage and linkage can be made using cleavage and linking enzymes, and the like, in the art.
  • the term "vector” refers to any medium for cloning and / or transferring bases to a host cell.
  • the vector may be a replica that other DNA fragments can bind to and result in replication of the bound fragments.
  • a "replicating unit” refers to any genetic unit (e.g., plasmid, phage, cosmid, chromosome, virus) that functions as a self-unit of DNA replication in vivo, i.e., is replicable by its own regulation. .
  • the term “vector” may include viral and non-viral mediators for introducing a base into a host cell in vitro, ex vivo or in vivo.
  • the term “vector” may also include minispherical DNA.
  • the vector may be a plasmid that does not have a bacterial DNA sequence.
  • the term “vector” may also include transposons (Szping, et al. J. MoI. Biol. 302: 93-102 (2000)), such as Sleeping Beauty, or artificial chromosomes. Examples of commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages. For example, pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A, etc.
  • phage vector or cosmid vector can be used as a phage vector or cosmid vector, and pBR-based, pUC-based, pBluescriptII-based, etc. , pGEM-based, pTZ-based, pCL-based and pET-based and the like can be used.
  • the vector usable in the present application is not particularly limited and known expression vectors may be used.
  • the vector may be a recombinant vector, further comprising a variety of antibiotic resistance genes.
  • antibiotic resistance gene is a gene that has resistance to antibiotics, and since the cells having the cells survive in the environment treated with the antibiotic, they are useful as a selection marker in the process of obtaining plasmids in large quantities in E. coli. do. Since the antibiotic resistance gene in the present application is not a factor that greatly affects the expression efficiency according to the optimal combination of vectors, which is the core technology of the present application, antibiotic resistance genes generally used as selection markers can be used without limitation. As specific examples, resistance genes for ampicillin, tetratracyclin, kanamycin, kanamycin, chloroamphenicol, streptomycin, or neomycin may be used.
  • Another aspect of the present application is a microorganism that produces O-acetylhomoserine sulfidylase, which may express a variant polypeptide having 0-acetylhomoserine sulfidylase activity or comprise the vector.
  • a variant polypeptide having O-acetylhomoserine sulfidylase activity in which valine, which is the 196th amino acid from the N-terminus of the polypeptide of SEQ ID NO: 1, is substituted with threonine, or It is an Escherichia microorganism that produces 0-acetylhomoserine sulfidylase, which may include a vector comprising a polynucleotide encoding a variant polypeptide.
  • the introduction can be made by transformation, and "transformation" means that the gene can be expressed after introduction into the host cell, but is not limited thereto.
  • a method of introducing a vector containing a polynucleotide encoding the variant polypeptide into a host cell may be used, and the method of transforming the vector may include any method of introducing a base into a cell.
  • a suitable standard technique can be selected and performed. Electroporation, calcium phosphate co-precipitation, retroviral infection, microinjection, DEAE-dextran, cationic liposome Law, heat shock method, and the like, but is not limited thereto.
  • the transformed gene includes both the form inserted into the chromosome of the host cell and the form located outside the chromosome as long as it can be expressed in the host cell.
  • the gene may include DNA and RNA as a polynucleotide capable of encoding a polypeptide, and may be used without limitation as long as it can be introduced into and expressed in a host cell.
  • the gene may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a polynucleotide construct containing all the elements necessary for self expression.
  • the expression cassette may include a promoter, a transcription termination signal, a ribosomal binding site, and a translation termination signal, which are typically operably linked to the gene.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self replication.
  • the gene may be introduced into the host cell in its own form or in the form of a polynucleotide structure, and may be operably linked to a sequence required for expression in the host cell.
  • transformed (host) -containing host cell refers to a cell that has been transfected with a vector having a gene encoding one or more target proteins, and in the present application, O-acetyl, including the vector described above.
  • Any microorganism capable of producing homoserine sulfidylase variants can include both prokaryotic and eukaryotic microorganisms. For example, S.
  • genus Escherichia Escherichia
  • An air Winiah Erwinia
  • Serratia marcescens Serratia
  • Providencia Providencia
  • Corynebacterium Corynebacterium
  • Brevibacterium Brevibacterium It may include a microbial strain belonging, it may be E. coli, but is not limited to an example of the genus Escherichia.
  • Microorganisms of the genus Escherichia producing O-acetylhomoserine sulfidylase capable of expressing the mutant polypeptide having the O-acetylhomoserine sulfidylase activity of the present application, may be used in various known methods in addition to the vector introduction. It can include all microorganisms capable of expressing the variant polypeptide.
  • Another aspect of the present application is a method for producing methionine using the above-described variant polypeptide having O-acetylhomoserine sulfidylase activity, or a microorganism or a culture thereof.
  • it may be a method of producing methionine, comprising reacting the variant polypeptide, or a microorganism producing the same or a culture thereof with O-acetylhomoserine and methylmercaptan.
  • the methionine may be L-methionine.
  • a culture of microorganisms producing O-acetylhomoserine sulfidylase can express an mutant polypeptide having the 0-acetylhomoserine sulfidylase activity or include the vector, O-acetylhomoserine sulfidrilla.
  • Microorganisms producing an aze may be prepared from the step of culturing in the medium.
  • the term "culture” means growing the microorganisms under appropriately controlled environmental conditions. Cultivation process of the present application can be made according to the appropriate medium and culture conditions known in the art. This culture process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the strain selected.
  • the step of culturing the microorganism is not particularly limited thereto, but may be performed by a known batch culture method, continuous culture method, fed-batch culture method, or the like.
  • the culture conditions are not particularly limited thereto, but using a basic compound (eg, sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia) or an acidic compound (eg, phosphoric acid or sulfuric acid), an appropriate pH (eg, pH 5 to 9, specifically, PH 6 to 8, most specifically pH 6.8) can be adjusted.
  • a basic compound eg, sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia
  • an acidic compound eg, phosphoric acid or sulfuric acid
  • pH eg, pH 5 to 9, specifically, PH 6 to 8, most specifically pH 6.8
  • antifoaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used to suppress bubble formation, and in order to maintain the aerobic state of the culture, oxygen or oxygen-containing gas is injected into the culture, or anaerobic and microaerobic conditions are maintained. To maintain, it can be injected with no gas or with nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas.
  • the culture temperature may be maintained at 20 to 45 °C, specifically 25 to 40 °C, but is not limited thereto.
  • the incubation period may continue until the desired amount of useful material is obtained, specifically, may be incubated for about 10 to 160 hours, but is not limited thereto.
  • the culture medium used includes sugars and carbohydrates (e.g. glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose), fats and fats (e.g. soybean oil, sunflower seeds) as carbon sources.
  • Oils, peanut oils and coconut oils fatty acids (e.g. palmitic acid, stearic acid and linoleic acid), alcohols (e.g.
  • Nitrogen sources include nitrogen-containing organic compounds (eg peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea), or inorganic compounds (eg ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and Ammonium nitrate) and the like can be used individually or in combination, but is not limited thereto.
  • nitrogen-containing organic compounds eg peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea
  • inorganic compounds eg ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and Ammonium nitrate
  • As a source of phosphorus, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, a corresponding sodium-containing salt, and the like may be used individually or in combination, but is not limited thereto.
  • the medium may also contain essential growth-promoting substances such as other metal salts (eg magnesium
  • the O-acetylhomoserine may be a purified form or microbial fermentation broth containing O-acetylhomoserine.
  • the methyl mercaptan is in the form of liquid sodium methyl mercaptan (CH 3 S-Na), gas or liquefied methyl mercaptan (CH 3 SH), as well as in International Publication No. WO2010 / 098629
  • CH 3 S-Na liquid sodium methyl mercaptan
  • CH 3 SH gas or liquefied methyl mercaptan
  • the method for preparing the methionine can be readily determined by those skilled in the art under optimized culture conditions known in the art, and mass production of methionine using the microorganism or culture thereof producing the variant polypeptide and / or the variant polypeptide
  • the method of production can be readily determined by one skilled in the art at optimized enzyme activity conditions known in the art.
  • the method for preparing methionine may further include recovering methionine produced by the reaction.
  • the recovery step can be carried out using any suitable method known in the art. For example, centrifugation, filtration, ion exchange chromatography, crystallization and HPLC may be used, but is not limited thereto.
  • the recovery step may include a purification process, it may be carried out using a suitable method known in the art.
  • Example 1 O- Acetylhomoserine Sulfidylase V196T Variant Manufacturing and Activity Assessment
  • Example 1-1 Rhodobacter O-derived Acetylhomoserine Sulfidylase Expression
  • a vector pCL-P CJ1 metZ-rsp (Korean Patent Registration No. 10-1250651) cloned with O-acetylhomoserine sulfidylase from Rhodobacter sphaeroides , a known representative Rhodobacter spp. Escherichia coli K12 W3110 (ATCC 27325) cells were transformed using heat shock. Subsequently, transformed colonies were selected after culturing in LB medium containing 25 ⁇ g / ml chloramphenicol. Selected colonies were inoculated in 3 ml of LB medium containing 25 ⁇ g / ml chloramphenicol and incubated at 33 ° C.
  • Example 1-2 New O- Acetylhomoserine Sulfidylase Variant Chain V196T Variant making
  • the amino acid valine, 196 was selected as a mutation position to increase the activity of the wild type O-acetylhomoserine sulfidylase.
  • Rhodobacter Made using the Quikchange site-directed mutagenesis kit (Agilent technologies) Lloyd (Rhodobacter 196 amino acid valine (Val, V) in the amino acid sequence of wild type O-acetylhomoserine sulfidylase from sphaeroides ) was replaced with threonine (Thr, T).
  • Thr threonine
  • O-acetylhomoserine sulfidylase variants were prepared by PCR using pCL-P CJ1 : metZ-rsp vector as a template. Recombinant vectors in which the coding genes were introduced were constructed.
  • the transformed strain was named CA05-4012, and was deposited on November 27, 2014 at the Korea Culture Center of Microorganisms (KCCM), an international depository organization under the Budapest Treaty, and received accession number KCCM11611P.
  • KCCM Culture Center of Microorganisms
  • the transformed E. coli K12 W3110 was inoculated in LB medium containing 25 ⁇ g / ml of chloramphenicol, incubated at 33 ° C. for 6 hours, and then partially taken to contain 25 ⁇ g / ml of chloramphenicol. Transfer to the medium was incubated for 15 hours at 33 °C to induce the expression of enzyme variants.
  • the amount of L-methionine produced was reported as the methionine conversion activity of the enzyme, and the activity of the O-acetylhomoserine sulfidylase wild type derived from Rhodobacter spheroid and its V196T variant is shown in Table 2 below.
  • O-acetylhomoserine sulfidylase (enzyme culture) L-Methionine, pH 7.4 (g / l) L-Methionine, pH 6.4 (g / l) Wild type 1.10 0.30 V196T variants 2.05 0.78
  • the mutant enzyme culture was found to be 1.60 times higher than the activity of the wild type itself, pH 2.6.4 conditions, 2.60 times increased activity compared to the activity of the wild type itself at pH 7.4 conditions .
  • Example 2-1 O- Acetylhomoserine Sulfidylase refine
  • Cells were harvested by centrifuging 25 ml of the O-acetylhomoserine sulfidylase wild type and V196T variants derived from Rhodobacter spheroid obtained in Example 1 above.
  • the concentrate was loaded on a previously equilibrated Superdex column (HiLoad 16/600 Superdex 75pg, GE Healthcare) with 50 mM potassium phosphate (pH 7.8) containing 150 mM NaCl, 5% glycerol and separated by molecular weight size.
  • O-acetylhomoserine sulfidylase was eluted within 50 ml elution volume in tetramer form. It was concentrated to 200 ⁇ l or less using a Millipore / Amicon Centricon centrifuge filter device (MWCO 3kDa).
  • Purity of the purified enzyme was examined by 10% SDS-PAGE gel analysis (FIG. 1), and stored at -80 ° C.
  • Example 2-2 purified O- Acetylhomoserine Sulfidylase Wild type and Of V196T Active evaluation
  • O-acetylhomoserine sulfidylase purified form of enzyme
  • L-Methionine pH 7.4 (g / l) L-Methionine, pH 6.4 (g / l) Wild type 1.86 0.50 V196T variants 3.53 1.34
  • the purified enzyme variant was found to be 1.90 times higher than the activity of the wild type itself at pH 7.4 conditions, 2.68 times higher activity than the activity of the wild type itself at pH 6.4 conditions there was.
  • Example 3 O- Acetylhomoserine Sulfidylase The 196th amino acid Threonine Substituted with amino acids other than Variant Active evaluation
  • Example 3-1 V196S , V196L , V196D , V196K Variant making
  • Embodiment Rhodobacter Made using the position selective mutation (site-directed mutagenesis) method as in Example 1 Lloyd (Rhodobacter The valine (Val, V) amino acid sequence of amino acid sequence 196 amino acid of wild-type O-acetylhomoserine sulfidylase derived from sphaeroides ) was serine (Ser, S), leucine (Leu, L), aspartic acid (Asp, D), lysine A vector containing the gene and an E. coli K12 W3110 strain transformed with the vector were prepared in the same manner as in Example 1-2, except that the enzyme variants substituted with (Lys, K) were used.
  • Example 3-2 V196S , V196L , V196D , V196K Variant Enzyme Culture Activity Evaluation
  • Example 3-1 The cultures of the variants obtained in Example 3-1 were evaluated in the same manner as in Example 1-3, and are shown in Table 4.
  • O-acetylhomoserine sulfidylase (enzyme culture) L-Methionine, pH 7.4 (g / l) L-Methionine, pH 6.4 (g / l) Wild type 1.10 0.30 V196T 2.05 0.78 V196S 0.94 0.35 V196L 0.51 0.12 V196D n.d. n.d. V196K n.d. n.d.
  • the enzymatic activity of the novel variant of the present application is significantly improved compared to the wild type, so that L-methionine can be produced in excess, but also low.
  • the pH is increased, the L-methionine conversion activity is increased, thereby producing an excessive amount of L-methionine, suggesting that an excessive amount of L-methionine can be produced even when the final product acetic acid is accumulated at a high concentration.
  • the L-methionine can be prepared by converting it to an excess even when purified in the form of cell-free extract as well as in the culture medium.

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Abstract

본 출원은 신규한 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 (O-acetylhomoserine sulfhydrylase) 변이체, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 변이체를 발현할 수 있는 균주, 및 상기 변이체를 이용하여 L-메치오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

O-아세틸호모세린 설피드릴라제 변이체 및 이를 이용한 L-메치오닌 제조 방법
본 출원은 신규한 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 (O-acetylhomoserine sulfhydrylase) 변이체, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 변이체를 발현할 수 있는 균주, 및 상기 변이체를 이용하여 L-메치오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.
L-메치오닌 (methionine)은 생체내의 필수 아미노산의 한 종류로서, 사료, 수액제, 의약품의 합성 원료 등 의약 원료 및 식품 첨가제로 사용된다. 메치오닌은 생체 내에서 메틸기 전이 반응에 관여하는 중요한 아미노산이며, 황을 제공하는 역할을 한다.
메치오닌의 화학합성은 주로 5-(β-메틸머캅토에틸)하이단토인 (5-(β-methylmercaptoethyl)-hydantoin)을 가수분해시키는 반응을 통하여, L-형과 D-형이 혼합된 형태로 메치오닌을 생산하는 방법이 이용되고 있다. 그러나, 상기 화학합성은 L-형과 D-형이 혼합된 형태로 생산된다. 한편, 생물학적 방법을 이용하여 L-메치오닌을 선택적으로 생산할 수 있는데, 미생물을 이용하여 직접 발효로 생산하거나, 2단계 공법(국제공개 특허 제WO2008/013432호)으로 생산할 수 있다. 구체적으로, 2단계 공법은 발효에 의한 L-메치오닌 전구체 생산 공정 및 상기 L-메치오닌 전구체를 효소에 의하여 L-메치오닌으로 전환하는 공정으로 구성되어 있다. 상기 2단계 공법은 L-메치오닌만을 선택적으로 생산할 수 있으며, 추가적으로 동일한 반응을 통하여 부산물로서 유기산, 보다 구체적으로는 숙신산, 아세트산을 동시에 생산할 수 있다.
상기 L-메치오닌 전구체는 O-아세틸호모세린과 O-숙시닐호모세린을 포함할 수 있으며, 전환공정에 사용하는 효소는 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제 (O-succinylhomoserine sulfhydrylase), 또는 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 (O-acetylhomoserine sulfhydrylase)를 포함할 수 있다. 상기와 같은 2단계 공법을 통해 L-메치오닌의 생산을 극대화하기 위해서 L-메치오닌의 전구체인 O-아실호모세린의 발효양을 최대로 확보할 필요성이 있다. 동시에, L-메치오닌을 생산하기 위한 효소 전환 반응에 사용하는 효소가 높은 전환 활성을 보유하고, 미생물에서 과발현이 가능하며, 고농도의 O-아실호모세린에서 높은 반응 속도를 유지해야 한다. 또한, 당해 효소가 최종 산물인 L-메치오닌과 유기산이 고농도로 축적되는 시점에서 활성 저해가 낮아야 하며, 당해 효소가 반응이 진행되는 동안 활성을 잃지 않기 위해서 열 안정성을 지녀야 한다. 이에 대한민국 등록 특허 제 10-1250651호에서 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides) 유래 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제가 다른 속 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제보다 열안정성이 높아, 상기 2단계 공법에 신규하게 이용할 수 있는 효소가 개시되어 있다. 그러나, 여전히 상기 2단계 공법 등에 이용하기 위한 높은 전환 활성 및 최종 산물이 축적되는 시점에서 활성 저해가 낮은 효과적인 전환효소 개발 필요성이 대두되고 있다.
본 발명자들은 개량된 전환효소로 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides) 유래 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제의 196번째 아미노산이 발린 이외의 다른 아미노산으로 바뀐 변이형 폴리펩티드가 야생형에 비해 높은 전환율 및 안정성을 가지는 것을 확인하고, 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은, O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 변이체를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 변이체를 생산하는 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 변이체를 이용하여 메치오닌을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드는 산업적인 전환효소로 사용하기 위한 높은 활성, 높은 전환율, 대장균에서의 과발현 가능성, 최종산물이 축적되는 시점에서 낮은 활성저해 및 열안정성 유지 등의 요건을 모두 갖춘 변이형 폴리펩타이드로서, 이를 이용하여 빠르고 높은 효율로 L-메치오닌을 제조할 수 있으며, 또한 이의 부산물인 아세트산도 생산할 수 있는 이점이 있다.
도 1은 로도박터 스페로이드 (Rhodobacter sphaeroides) 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제를 정제한 후 각 단계에서 얻은 샘플을 SDS-PAGE 젤 분석한 결과를 나타내는 도이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는, 신규한 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드일 수 있다. 상기 신규한 변이형 폴리펩티드는 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides) 유래 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제의 아미노산 서열, 구체적으로 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재된 폴리펩티드의 N-말단으로부터 196번째 아미노산이 발린 이외의 다른 아미노산으로 치환된, O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드일 수 있다. 더욱 구체적으로는, N-말단으로부터 196번째 아미노산인 발린이 쓰레오닌으로 치환된 변이체일 수 있다. 구체적으로, 상기 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열인 변이형 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이와 같은 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1의 O-아세틸 호모세린 설피드릴라아제의 활성을 갖는 폴리펩티드에 비해 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 활성이 강화된 특징을 갖는다.
본 출원에서 용어, "변이" 또는 "변이체"는 유전적 또는 비유전적으로 하나의 안정적인 표현형적 변화를 나타내는 배양물이나 개체를 뜻하며, 구체적으로 본 출원에서는 로도박터 스페로이드 유래 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제(O-Acetylhomoserine sulfhydrylase)의 아미노산이 변이되어 그 활성이 야생형과 비교하여 효율적으로 증가될 수 있는 변이체를 의미한다. 이러한 변이체의 서열은 상기 변이형 폴리펩티드에 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 구체적으로 본 출원의 상기 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드는 서열번호 3 및 상기 서열번호 3과 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한 이러한 상동성을 가지며 상기 효소에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 특정 변이 위치인 196번째 아미노산이 발린이외의 다른 아미노산으로 변이된 것은 고정된 채, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 효소 변이체도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다. 또한, 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드로서, O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 활성을 가지는 폴리펩티드도 제한 없이 포함될 수 있다.
본 출원에서 용어, "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있고, 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다
상기 하이브리드화에 사용된 프로브는, 염기서열의 상보 서열의 일부일 수 있다. 이러한 프로브는, 공지 서열에 근거하여 만들어진 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여, 이러한 염기 서열을 포함하는 유전자 단편을 주형으로 하는 PCR에 의해 작제될 수 있다. 또한, 당업자는 온도 및 세척 용액 염 농도를 프로브의 길이와 같은 요소에 따라 필요할 경우 조절할 수 있다.
본 출원에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보, 예로는 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)를 직접 정렬하여 결정될 수 있다(예: BLAST 2.0). 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재된 폴리펩티드는, 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides) 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 활성을 가지는 야생형 폴리펩티드일 수 있다. 이와 같은 서열번호 1의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 활성을 가지는 폴리펩티드는 다른 미생물 유래인 하이포모나스 넵튜니움 유래의 폴리펩티드 등에 비교하여 열안정성이 높은 바, 상기 서열번호 1의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 활성을 가지는 폴리펩티드에 아미노산 치환이 도입된 본 출원의 변이형 폴리펩티드 역시 열안정성이 높은 이점이 있음은 자명하다.
본 출원에서 용어, "O-아세틸호모세린"은 미생물에서 볼 수 있는 메치오닌 생합성에서 최초의 특이적 중간체로, 쓰레오닌 생합성과의 분기점에서 L-호모세린과 아세틸CoA에서 호모세린 아세틸전달효소에 의해 촉매되어 생성될 수 있다.
본 출원에서 용어, "전구체"는 L-메치오닌 전구체 생산 균주에 의해 생산되는 메치오닌 특화 대사 경로의 일부분인 대사물질 또는 이 대사물질에서 파생된 물질을 말한다. 그 예로 이에 제한되지 않으나, 본 출원에서 L-메치오닌 전구체는 O-숙시닐호모세린 또는 O-아세틸호모세린일 수 있다.
본 출원에서 용어, "L-메치오닌 전구체 생산 균주"란 L-메치오닌 전구체를 생물체 내에서 생산할 수 있는 원핵 또는 진핵 미생물 균주로서, L-메치오닌 전구체를 축적할 수 있는 균주를 말한다. 예를 들어, 균주는 에스케리키아 속 (Escherichia sp .), 어위니아 속 (Erwinia sp .), 세라티아 속 (Serratia sp .), 프로비덴시아 속 (Providencia sp .), 코리네박테리움 속 (Corynebacteria sp .), 슈도모나스 속 (Pseudomonas sp .), 렙토스피라 속 (Leptospira sp .), 살모넬라 속 (Salmonellar sp .), 브레비박테리아 속 (Brevibacteria sp .), 하이포모나스 속 (Hyphomononas sp .), 크로모박테리움 속 (Chromobacterium sp .) 및 노카디아 속 (Nocardia sp .) 또는 곰팡이류 (fungi) 또는 효모류 (yeast)에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있다. 구체적으로, 에스케리키아 속, 코리네박테리움 속, 렙토스피라 속의 미생물 균주와 효모일 수 있으며, 그 중의 에스케리키아속 미생물 균주가 이용될 수 있으며, 이에 제한되지 않으나, 에스케리키아속 미생물의 예로 대장균 (Escherichia coli)일 수 있다.
본 출원의 다른 양태는, 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재된 폴리펩티드의 N-말단으로부터 196번째 아미노산인 발린이 다른 아미노산으로 치환된, O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 그 예로 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 서열번호 4의 염기 서열과 적어도 80 %, 90 %, 95 %, 97 % 또는 99 % 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또한 코돈 축퇴성 (codon degeneracy)에 의해 상기 변이형 폴리펩티드로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 4의 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하고, 상기 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열 역시 포함될 수 있음은 자명하다.
본 출원의 또 다른 양태는, 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다. 벡터는 상기 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 형태일 수 있다.
본 출원에서 용어, "작동 가능하게 연결된"이란 일반적으로 기능을 수행하도록 염기 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 염기 서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩하는 염기 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 벡터와의 작동가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있다.
본 출원에서 용어, "벡터"는 숙주 세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비 바이러스 매개물을 포함할 수 있다. 용어 "벡터"는 또한 미니구형 DNA를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 벡터는 박테리아 DNA 서열을 갖지 않는 플라스미드일 수 있다. 용어 "벡터"는 또한 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty)같은 트랜스포존(Izsvak et al. J. MoI. Biol. 302:93-102 (2000)), 또는 인공 염색체를 포함할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 출원에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다.
또한, 상기 벡터는 다양한 항생제 저항성 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터일 수 있다.
본 출원에서 용어, "항생제 저항성 유전자"란 항생제에 대하여 저항성을 가지는 유전자로서, 이것을 가지고 있는 세포는 해당 항생제를 처리한 환경에서도 생존하므로, 대장균에서 대량으로 플라스미드를 얻는 과정에 선별 마커로서 유용하게 사용된다. 본 출원에서 항생제 저항성 유전자는 본 출원의 핵심적 기술인 벡터의 최적의 조합에 따른 발현 효율에 크게 영향을 미치는 요소가 아니므로, 선별 마커로서 일반적으로 사용되는 항생제 저항성 유전자를 제한 없이 사용할 수 있다. 구체적인 예로는, 암피실린(ampicilin), 테트라사이클린(tetracyclin), 카나마이신(kanamycin), 클로람페니콜(chloroamphenicol), 스트렙토마이신 (streptomycin), 또는 네오마이신(neomycin)에 대한 저항 유전자 등을 사용할 수 있다.
본 출원의 또 다른 양태는, 상기 0-아세틸호모세린 설피드릴라아제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 발현하거나 상기 벡터를 포함할 수 있는, O-아세틸호모세린 설피드릴라아제를 생산하는 미생물이다. 구체적으로는, 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재된 폴리펩티드의 N-말단으로부터 196번째 아미노산인 발린이 쓰레오닌으로 치환된, O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 발현하거나, 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 포함될 수 있는, 0-아세틸호모세린 설피드릴라아제를 생산하는 에스케리키아속 미생물이다.
본 출원에서 상기 도입은 형질 전환에 의해 이루어질 수 있으며, "형질전환"은 유전자를 숙주세포 내에 도입 후 발현시킬 수 있도록 하는 것을 의미하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내로 도입하는 방법을 이용할 수 있으며, 상기 벡터를 형질전환시키는 방법은 염기를 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 일렉트로포레이션(electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전(calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(microinjection), DEAE-덱스트란(DEAE-dextran), 양이온 리포좀(cationic liposome) 법, 열 충격법 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다.
형질전환된 유전자는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체내에 삽입된 형태 및 염색체 외에 위치하고 있는 형태 모두를 포함한다. 또한, 상기 유전자는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드로 DNA 및 RNA를 포함하며, 숙주세포내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
본 출원에서 용어, "벡터를 포함한 (형질전환된) 숙주 세포"는 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 갖는 벡터로 형질감염된 세포를 말하며, 본 출원에 있어서, 상기의 벡터를 포함하여 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 변이체를 생산할 수 있는 미생물이라면, 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함될 수 있다. 예를 들면 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium)속에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있으며, 에스케리키아속의 예로 대장균일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 상기 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 발현할 수 있는, O-아세틸호모세린 설피드릴라아제를 생산하는 에스케리키아 속 미생물은 상기 벡터 도입 이외에도 다양한 공지의 방법에 의해 상기 변이형 폴리펩티드를 발현할 수 있는 미생물을 모두 포함할 수 있다.
본 출원의 또 다른 양태는, 상기 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드, 또는 이를 생산하는 미생물 또는 이의 배양물을 이용하여 메치오닌을 제조하는 방법이다. 구체적으로 상기 변이형 폴리펩티드, 또는 이를 생산하는 미생물 또는 이의 배양물을, O-아세틸호모세린 및 메틸머캅탄과 반응시키는 단계를 포함하는, 메치오닌을 제조하는 방법일 수 있다. 상기 메치오닌은 L-메치오닌일 수 있다.
O-아세틸호모세린 설피드릴라아제를 생산하는 미생물의 배양물은, 상기 0-아세틸호모세린 설피드릴라아제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 발현하거나 상기 벡터를 포함할 수 있는, O-아세틸호모세린 설피드릴라아제를 생산하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계로부터 제조될 수 있다.
본 출원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물 (예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH (예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있고, 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양온도는 20 내지 45 ℃, 구체적으로는 25 내지 40 ℃를 유지할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 배양기간은 원하는 유용 물질의 생산량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산 (예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
상기의 O-아세틸호모세린은 정제된 형태 또는 O-아세틸호모세린을 함유한 미생물 발효액일 수 있다. 또한 상기의 메틸머캅탄은 액상의 소디움메틸머캅탄(sodium methyl mercaptan, CH3S-Na) 형태, 가스 또는 액화 상태의 메틸머캅탄(CH3SH) 뿐만 아니라 국제 공개특허 제WO2010/098629호에 언급된 형태로 디메칠설파이드(DMS, Dimethylsulfide)를 포함한 메틸머캅탄 등 황 원자를 제공할 수 있는 형태를 포함하고 있는 메틸머캅탄 유도체 모두를 의미할 수 있다.
상기 메치오닌을 제조하는 방법은 당업계에 공지된 최적화된 배양 조건에서 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 상기 변이형 폴리펩티드 및/또는 변이형 폴리펩티드를 생산하는 미생물 또는 이의 배양물을 이용하여 메치오닌을 대량 생산하는 방법은 당업계에 공지된 최적화된 효소 활성 조건에서 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 메치오닌을 제조하는 방법은 상기 반응으로 생성된 메치오닌을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 회수 단계는 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 출원을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 출원을 예시하기 위한 것으로, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: O- 아세틸호모세린 설피드릴라아제의 V196T 변이체의 제조 및 활성 평가
실시예 1-1: 로도박터속 유래의 O- 아세틸호모세린 설피드릴라아제의 발현
공지된 대표적인 로도박터속 미생물인 로도박터 스페로이드 (Rhodobacter sphaeroides) 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제가 클로닝된 벡터 pCL-PCJ1:metZ-rsp (대한민국 특허 등록번호 제10-1250651호)를 대장균 (Escherichia coli) K12 W3110 (ATCC 27325) 세포에 열 충격법을 이용하여 형질전환시켰다. 그 후, 25㎍/㎖의 클로람페니콜 (chloramphenicol)을 함유하고 있는 LB 배지에서 배양한 후 형질전환된 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니를 25㎍/㎖ 클로람페니콜이 포함된 LB 배지 3㎖에 접종하여 33 ℃, 200rpm 조건으로 6시간 배양하였다. 이를 다시 250 ㎕를 취하여, 새로운 25㎍/㎖ 클로람페니콜이 포함된 25㎖ LB 배지 (250㎖ 용량의 플라스크)에 재접종한 후, 33 ℃, 200rpm 조건으로 15시간 배양하여, 야생형인 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제를 발현시켰다.
실시예 1-2: 신규한 O- 아세틸호모세린 설피드릴라아제 변이체인 V196T 변이체 제작
상기 야생형 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제의 활성을 높일 수 있는 변이 위치로 196번 아미노산인 발린을 선정하였다.
Quikchange site-directed mutagenesis kit (Agilent technologies)을 사용하여 로도박터 스페로이드 (Rhodobacter sphaeroides) 유래의 야생형 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제의 아미노산 서열 중 196번째 아미노산인 발린 (Val, V)을 쓰레오닌 (Thr, T)으로 치환하였다. 구체적으로, 서열 번호 5 및 6의 프라이머 (primer)를 이용하여 (표 1), pCL-PCJ1:metZ-rsp 벡터를 주형 (template)으로 하여 PCR 반응으로 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 변이체를 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 벡터를 제작하였다.
프라이머 서열 서열번호
Primer for V196T mutant (forward) CTC GTC ATC GTG GAC AAT ACC TTC GCG ACG CCC GTC TTC 5
Primer for V196T mutant (reverse) GAA GAC GGG CGT CGC GAA GGT ATT GTC CAC GAT GAC GAG 6
그 후, 상기 변이가 도입되었는지 여부를 시퀀싱으로 확인한 다음, 이를 열 충격법을 이용하여 E. coli K12 W3110에 형질전환으로 도입하였다. 상기 형질 전환된 균주를 CA05-4012로 명명하고, 2014년 11월 27일자로 부다페스트조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korea Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 기탁하여 수탁번호 KCCM11611P를 부여받았다.
상기 형질 전환된 E. coli K12 W3110를 25㎍/㎖의 클로람페니콜을 함유하고 있는 LB 배지에 접종하고, 33 ℃에서 6시간 배양한 다음, 이를 일부 취하여 25㎍/㎖의 클로람페니콜을 포함하고, 있는 LB 배지로 옮겨 33 ℃에서 15시간 배양하여 효소 변이체의 발현을 유도하였다.
실시예 1-3: V196T 변이체 효소 배양액 활성 평가
상기 효소 변이체 및 야생형 효소의 배양액에 2% (v/v) 자일렌 (p-Xylene)을 첨가하여 33 ℃, 1,150rpm에서 1시간 처리하였다. 그 후, 일부를 취하여 50mM 인산 칼륨 (potassium phosphate) (pH 7.4, pH 6.4), 15g/l O-아세틸호모세린, 0.05mM PLP (pyridoxal 5'-phosphate), 30mM 소디움 메틸머캅탄 (sodium methyl mercaptan)이 포함된 완충액에 넣고, 33 ℃, 1,150rpm에서 5분 반응시킨 다음, 반응액을 HPLC 분석으로, 생성된 L-메치오닌을 양을 측정하였다.
상기 생성된 L-메치오닌의 양을 효소의 메치오닌 전환 활성으로 보고, 상기 로도박터 스페로이드 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 야생형 및 이의 V196T 변이체의 활성을 하기 표 2에 나타내었다.
O-아세틸호모세린 설피드릴라아제(효소 배양액) L-메치오닌, pH 7.4(g/l) L-메치오닌, pH 6.4(g/l)
야생형 1.10 0.30
V196T 변이체 2.05 0.78
그 결과, 상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 변이체 효소 배양액은 pH 7.4 조건에서, 야생형 자체의 활성에 비해 1.86배, pH 6.4 조건에서는 야생형 자체의 활성에 비해 2.60배 정도 활성이 증가된 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2: O- 아세틸호모세린 설피드릴라아제의 정제 및 활성 평가
실시예 2-1: O- 아세틸호모세린 설피드릴라아제의 정제
상기 실시예 1에서 얻은 로도박터 스페로이드 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 야생형 및 V196T 변이체의 배양액 25㎖을 원심분리하여 세포를 수거하였다. O-아세틸호모세린 설피드릴라아제를 함유하는 무세포 추출물을 제조하기 위해 세포를, 150mM NaCl, 5% 글리세롤 (glycerol)을 함유하는 15㎖의 50mM 인산 칼륨 (potassium phosphate) (pH 7.8)에 현탁시키고, 현탁액의 온도를 10 ℃ 미만으로 유지하면서, 소니케이터 (sonicator)를 사용하여 파쇄하였다. 그 후, 세포 현탁액을 15,000xg으로 25분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다. 무세포 추출물 15㎖의 분취량을, 앞서 50mM 인산 칼륨 (potassium phosphate) (pH 7.8)으로 평형화된 10㎖의 GE 헬스케어 모노 큐 (MonoQ) 칼럼에 샘플을 로딩한 후, 800mM NaCl을 함유하는 50mM 인산 칼륨 (pH 7.8)에 10 칼럼 부피로 gradient를 걸어 칼럼을 세척/용리시켰다. O-아세틸호모세린 설피드릴라아제는 전기전도도 (conductivity) 15~20 (mS/cm)에서 용리되었다. 용리액을 밀리포어/아미콘 센트리콘 (Millipore/Amicon Centricon) 원심분리기식 여과기 장치 (MWCO 3kDa)을 사용하여 2~3㎖로 농축시켰다. 농축액을 150mM NaCl, 5% 글리세롤을 함유하는 50mM 인산 칼륨 (pH 7.8)으로 앞서 평형화된 수퍼덱스 칼럼(HiLoad 16/600 Superdex 75pg, GE헬스케어)에 로딩하여 분자량 사이즈 별로 분리하였다.
O-아세틸호모세린 설피드릴라아제는 테트라머 (tetramer) 형태로 50㎖ elution volume 이내에서 용리되었다. 이를 밀리포어/아미콘 센트리콘 (Millipore/Amicon Centricon) 원심분리기식 여과기 장치 (MWCO 3kDa)을 사용하여 200㎕ 이하로 농축하였다.
10% SDS-PAGE 젤 분석을 통하여 정제된 효소의 순도를 검사한 후 (도 1), -80 ℃에 보관하였다.
상기 도 1의 결과는 본 출원의 변이체는 대장균에서 과량으로 발현할 뿐 아니라, 고 순도로 정제할 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 2-2: 정제된 O- 아세틸호모세린 설피드릴라아제 야생형 및 V196T의 활성 평가
정제된 상기 로도박터 스페로이드 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 야생형 및 V196T 변이체를 1.3mg/㎖ 농도로 동량 50mM 인산 칼륨 (potassium phosphate) (pH 7.4 및 pH 6.4), 15g/l O-아세틸호모세린, 0.05mM PLP (pyridoxal 5'-phosphate), 30mM 소디움 메틸머캅탄 (sodium methyl mercaptan)이 포함된 완충액에 넣고, 33 ℃, 1,150rpm에서 5분 반응시켰다. 그 후, 반응액을 HPLC 분석하여 생성된 L-메치오닌을 양을 측정하였다. 변이체 및 야생형의 활성을 하기 표 3에 나타내었다.
O-아세틸호모세린 설피드릴라아제(정제된 형태의 효소) L-메치오닌, pH 7.4(g/l) L-메치오닌, pH 6.4(g/l)
야생형 1.86 0.50
V196T 변이체 3.53 1.34
그 결과, 상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 정제된 효소 변이체는 pH 7.4 조건에서, 야생형 자체의 활성에 비해 1.90배, pH 6.4 조건에서는 야생형 자체의 활성에 비해 2.68배 정도 활성이 증가된 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: O- 아세틸호모세린 설피드릴라아제의 196번째 아미노산이 쓰레오닌 이외의 다른 아미노산으로 치환된 변이체의 활성 평가
실시예 3-1: V196S , V196L , V196D , V196K 변이체 제작
실시예 1에서 위치 선택적 돌연변이 (site-directed mutagenesis) 방법을 이용하여 로도박터 스페로이드 (Rhodobacter sphaeroides) 유래의 야생형 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제의 아미노산 서열 196번째 아미노산인 발린 (Val, V)을 세린 (Ser, S), 류신 (Leu, L), 아스파르트산 (Asp, D), 라이신 (Lys, K)로 각각 치환한, 효소 변이체를 사용한 것을 제외하고 실시예 1-2와 동일하게 실시하여 상기 유전자를 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질 전환된 E. coli K12 W3110 균주를 제조하였다.
실시예 3-2: V196S , V196L , V196D , V196K 변이체 효소 배양액 활성 평가
상기 실시예 3-1에서 얻은 변이체들의 배양액을 실시예 1-3과 동일하게 평가하여 표 4에 나타내었다.
O-아세틸호모세린 설피드릴라아제(효소 배양액) L-메치오닌, pH 7.4(g/l) L-메치오닌, pH 6.4(g/l)
야생형 1.10 0.30
V196T 2.05 0.78
V196S 0.94 0.35
V196L 0.51 0.12
V196D n.d. n.d.
V196K n.d. n.d.
n.d. none detected
측정 결과, 196번째 아미노산이 쓰레오닌 이외의 다른 아미노산으로 치환된 변이체들은 야생형 자체의 활성에 비해 활성이 감소하거나 없어지는 것을 확인할 수 있었다.
이와 같은 결과들은 본 출원의 신규한 변이체인 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 변이체인 V196T 변이체의 효소 활성이 야생형에 비해 유의적으로 개선되어, L-메치오닌을 과량으로 제조할 수 있을 뿐 아니라, 낮은 pH 일수록 증대된 L-메치오닌 전환 활성을 나타내어, 과량의 L-메치오닌을 생산하므로 최종 산물인 아세트산이 고농도로 축적되는 시점에서도 활성 저해가 낮아, 과량의 L-메치오닌을 생산할 수 있음을 시사하는 것이다. 또한, 세포 내 배양액 형태뿐 아니라 무세포 추출물 형태로 정제하였을 경우에도 L-메치오닌을 과량으로 전환하여 제조할 수 있음을 시사하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2016011503-appb-I000001

Claims (7)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재된 폴리펩티드의 N-말단으로부터 196번째 아미노산인 발린이 쓰레오닌으로 치환된, O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드.
  2. 제1항의 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  4. 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재된 폴리펩티드의 N-말단으로부터 196번째 아미노산인 발린이 쓰레오닌으로 치환된, O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 발현하거나, 제3항의 벡터를 포함할 수 있는, 0-아세틸호모세린 설피드릴라아제를 생산하는 에스케리키아속 미생물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 에스케리키아속 미생물은 대장균(Escherichia coli)인 것인, 에스케리키아속 미생물.
  6. 제1항의 변이형 폴리펩티드, 또는 이를 생산하는 미생물 또는 이의 배양물을, O-아세틸호모세린 및 메틸머캅탄과 반응시키는 단계를 포함하는, 메치오닌을 제조하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 반응으로 생성된 메치오닌을 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 메치오닌을 제조하는 방법.
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