CN108138205B

CN108138205B - O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶变体以及使用其产生l-甲硫氨酸的方法

Info

Publication number: CN108138205B
Application number: CN201680059432.7A
Authority: CN
Inventors: 李任相; 孙晟光; 柳惠连; 李在熙; 李周姬; 张真淑; 崔珍根; 金素影; 申容旭
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2015-10-13
Filing date: 2016-10-13
Publication date: 2021-06-22
Anticipated expiration: 2036-10-13
Also published as: WO2017065529A1; US10378031B2; US20180355389A1; HUE053394T2; JP6510733B2; PL3363908T3; MY186559A; EP3363908B1; EP3363908A4; KR101836719B1; KR20170044048A; ES2856951T3; EP3363908A1; RU2694041C1; CN108138205A; BR112018007387A2; JP2018527944A

Abstract

本申请涉及新型O‑乙酰高丝氨酸硫化氢解酶变体、编码其的多核苷酸、包括该多核苷酸的载体、能够表达该变体的菌株和使用该变体产生L‑甲硫氨酸的方法。

Description

O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶变体以及使用其产生L-甲硫氨酸的方法

技术领域

本公开内容涉及新型O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶变体、编码其的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体、能够表达该变体的菌株、和使用该变体产生L-甲硫氨酸的方法。

背景技术

L-甲硫氨酸，一种生物体内的必需氨基酸，已被用作饲料、浸剂、药用原料诸如药物的合成原料、和食品添加剂。甲硫氨酸是参与体内转甲基作用的重要氨基酸并且具有提供硫的作用。

对于甲硫氨酸的化学合成，主要使用水解5-(β-甲硫基乙基)-乙内酰脲产生L-型和D-型的混合物形式的甲硫氨酸的方法。然而，化学合成导致产生L-型和D-型的混合物形式的甲硫氨酸。同时，使用生物方法可以选择性地产生L-甲硫氨酸，其中通过使用微生物直接发酵或者通过两步法(国际专利公开号WO 2008/013432)产生L-甲硫氨酸。具体地，两步法由通过发酵产生L-甲硫氨酸前体的过程和通过酶将L-甲硫氨酸前体转变为L-甲硫氨酸的过程构成。两步法可以选择性地仅产生L-甲硫氨酸并且进一步地通过同一反应同时产生作为副产物的有机酸，更具体地琥珀酸或醋酸。

L-甲硫氨酸前体可以包括O-乙酰高丝氨酸和O-琥珀酰高丝氨酸，并且在转变过程中使用的酶可以包括O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶和O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶。为了通过两步法最大化L-甲硫氨酸产生，必要的是确保最大量的发酵的O-酰基高丝氨酸，其是L-甲硫氨酸的前体。同时，用于酶转变以产生L-甲硫氨酸的酶必须具有高转变活性，在微生物中表现出过表达，并且在高浓度的O-酰基高丝氨酸下保持高反应速率。另外地，在当最终产物(即，L-甲硫氨酸和有机酸)以高浓度聚集的时间点酶必须具有低活性抑制并且酶具有热稳定性而不会在反应期间失去它们的活性。在这方面，韩国专利号10-1250651公开了衍生自类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶，其具有比衍生自非类球红细菌的微生物的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶更高的热稳定性，并且因而新近可供在两步法中使用。然而，仍然需要开发酶，其用于两步法等中具有高转变活性和在当最终产物聚集的时间点具有低活性抑制。

发明内容

技术问题

本公开内容的发明人已经努力开发了O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶作为具有改进转变的酶。结果，他们已经证实，与野生型O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶相比，修饰的多肽，其中类球红细菌衍生的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的第196位氨基酸被用除了缬氨酸之外的氨基酸修饰，具有更高的转变和稳定性，从而完成本公开内容。

技术方案

本公开内容的一个目的是提供O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶变体。

本公开内容的另一目的是提供编码该变体的多核苷酸。

本公开内容的仍另一目的是提供包括该多核苷酸的载体。

本公开内容的仍另一目的是提供产生O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶变体的微生物。

本公开内容的仍另一目的是提供使用O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶变体产生甲硫氨酸的方法。

本发明的有益效果

具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的本公开内容的修饰的多肽是满足所有要求的修饰的多肽，诸如用作工业转变酶的高活性、高转变率、在大肠杆菌中过表达的可能性，在当最终产物聚集的时间点的低活性抑制、热稳定性的维持等。因此，本公开内容的修饰的多肽的优势在于它们可以用于L-甲硫氨酸连同作为副产物的醋酸的快速且高效的生产。

附图说明

图1显示了图解关于如此样品的SDS-PAGE凝胶电泳结果的图像，所述样品在纯化衍生自类球红细菌的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶之后的每个步骤中获得

最佳方式

为了实现以上目的，本公开内容的方面可以提供具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的新型修饰的多肽。该修饰的多肽可以是具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的修饰的多肽，其中从衍生自类球红细菌的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的氨基酸序列的N-末端的第196位氨基酸，并且具体地从由SEQ ID NO:1的氨基酸序列描述的多肽的N-末端的第196位氨基酸，被除了缬氨酸之外的氨基酸取代。更具体地，该修饰的多肽可以是其中从N-末端的第196位氨基酸(即，缬氨酸)被苏氨酸取代的变体。具体地，具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的修饰的多肽可以是具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的修饰的多肽，但是修饰的多肽不限于此。

与具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的SEQ ID NO:1的多肽相比，如此修饰的多肽具有增强的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性。

如本文所使用的，术语“修饰”或“变体”是指基因上或非基因上表现出稳定的表型改变的培养产物或个体对象，并且具体地，是指其中衍生自类球红细菌的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的氨基酸被修饰并因而与其野生型相比能够有效地增大其活性的变体。这种变体的序列可以包括具有与以上修饰的多肽至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性的多肽。具体地，具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的本公开内容的修饰的多肽可以包括SEQ ID NO:3的多肽和具有与SEQ ID NO:3的序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性的多肽。另外地，显而易见的是，具有在部分序列中带有缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列同时保留将第196位氨基酸(即，特定位置)修饰为除了缬氨酸之外的氨基酸的任何酶变体，也可以包括在本公开内容的范围内，只要该氨基酸序列具有以上所述的同源性并且具有与该酶的效果对应的效果。另外地，任何多肽，其由可以从已知的基因序列制备的探针(例如，在严格条件下可以与编码该多肽的核苷酸序列的全部或部分的互补序列杂交的多核苷酸)编码并且具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性，也可以非限制性地包括在本公开内容的范围内。

如本文所使用的，术语“严格条件”是指允许多核苷酸之间特异性杂交的条件。这种条件依赖于多核苷酸的长度和互补程度，并且相关参数在本领域中是公知的，并且在参考文献(例如，J.Sambrook等，同上)中具体描述。例如，该条件可以包括在具有高同源性——80％或更高，具体地90％或更高，更具体地95％或更高，甚至更具体地97％或更高，并且最具体地99％或更高——的同源性的基因之间进行杂交，而不在同源性低于以上同源性的基因之间进行杂交；或者在60℃、1×SSC和0.1％SDS的用于DNA杂交的常规洗涤条件下，具体地对应于60℃、0.1×SSC和0.1％SDS，并且更具体地对应于68℃、0.1×SSC和0.1％SDS的盐浓度和温度下，进行一次杂交，具体地两次或三次。

在杂交中使用的探针可以是核苷酸序列的互补序列的部分。这些探针可以使用基于已知序列制备的寡核苷酸作为引物和含有该核苷酸序列的基因片段作为模板通过PCR制备。另外地，本领域普通技术人员可以根据诸如探针的长度等因素按需调节洗涤溶液的温度和盐浓度。

如本文所使用的，术语“同源性”是指两个多核苷酸或多肽部分之间的同一性的百分比。通过本领域已知的技术可以确定序列之间从一部分至另一部分的同源性。例如，可以通过使用能够比对序列信息的容易获得的计算机程序直接比对两个多核苷酸分子或两个多肽分子之间的序列信息——诸如包括分数、同一性、相似性等的参数(例如，BLAST2.0)——确定同源性。另外地，可以通过在其中多核苷酸可以在同源区域之间形成稳定双链的条件下杂交多核苷酸接着使用单链特异性核酸酶分解它们以便确定分解的片段的大小来确定多核苷酸之间的同源性。

由SEQ ID NO:1的氨基酸序列描述的多肽可以是衍生自类球红细菌的具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的野生型多肽。与衍生自其他微生物(例如，海王生丝单胞菌(Hyphomonas neptunium)等)的肽类相比，具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的SEQ IDNO:1的多肽具有更高的热稳定性。因此，显而易见的是，本公开内容的修饰的多肽，其中氨基酸取代被引入至具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的SEQ ID NO:1的多肽，也将具有优势，因为其具有高热稳定性。

如本文所使用的，术语“O-乙酰高丝氨酸”是指可以在微生物中观察到的甲硫氨酸生物合成中的第一特异性中间体，并且它可以在苏氨酸生物合成的接点(junction)在L-高丝氨酸和乙酰基-CoA中使用高丝氨酸乙酰转移酶通过催化作用产生。

如本文所使用的，术语“前体”是指由产L-甲硫氨酸前体的菌株产生的是甲硫氨酸特异性代谢路径的一部分的代谢物或衍生自其代谢物的那些。在本公开内容中，L-甲硫氨酸前体的实例可以是O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰高丝氨酸，但不限于此。

如本文所使用的，术语“产L-甲硫氨酸前体的菌株”是指原核或真核微生物菌株，其能够在体内产生L-甲硫氨酸前体，能够聚集L-甲硫氨酸前体。例如，产L-甲硫氨酸前体的菌株可以包括属于埃希氏菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、普罗威登斯菌属、棒状杆菌属、假单胞菌属、钩端螺旋体属、沙门氏菌属、短杆菌属、生丝单胞菌属、色杆菌属、诺卡氏菌属(genus Norcardia)的微生物菌株，或者属于真菌或酵母的那些微生物。具体地，菌株可以是埃希氏菌属、棒状杆菌属或钩端螺旋体属的微生物，并且更具体地是埃希氏菌属的微生物(例如，大肠杆菌)，但菌株不限于此。

本公开内容的另一方面提供编码该修饰的多肽的多核苷酸。

多核苷酸可以是编码具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的修饰的多肽的多核苷酸，在该修饰的多肽中从SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的多肽的N-末端的第196位氨基酸(即，缬氨酸)用不同的氨基酸取代。例如，多核苷酸可以是具有SEQ ID NO:4的核苷酸序列的多核苷酸，但核苷酸序列不限于此。另外地，多核苷酸可以是具有与SEQ ID NO:4的序列至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同源性的多核苷酸。另外地，基于密码子简并性，显而易见的是，任何编码多肽的核苷酸序列——其可以在严格条件下与核酸(其由与可以被翻译成修饰的多肽的多核苷酸互补以及与SEQ ID NO:4的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成)杂交并且具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性——也可以包括在本公开内容的范围内。

本公开内容的仍另一方面提供包括编码该修饰的多肽的多核苷酸的载体。载体可以是可操作地连接至多核苷酸的形式。

如本文所使用，术语“可操作地连接”是指用于核苷酸表达的控制序列和编码用于执行其一般功能的靶蛋白的核苷酸序列之间的可操作连锁，并且这可以影响被编码的核苷酸序列的表达。可以使用本领域已知的基因重组技术制备与载体的可操作连锁，并且可以使用本领域已知的限制酶、连接酶等进行位点特异性DNA切割和连接。

如本文所使用的，术语“载体”是指用于克隆和/或转移核苷酸到宿主细胞中的任何介体。载体可以是复制子以能够复制被另一个DNA片段结合的DNA片段。术语“复制子”是指用作体内DNA复制的自复制单位，即，通过自调节可复制的任何遗传单位(例如，质粒、噬菌体、黏粒、染色体、病毒等)。术语“载体”可以包括用于体外、先体外后体内或体内将核苷酸引入宿主细胞的病毒和非病毒介体，并且也可包括微球形DNA。例如，载体可以是没有任何细菌DNA序列的质粒。术语“载体”可以包括转座子诸如睡美人(Sleeping Beauty)(Izsvak等，J.MoI.Biol.302:93to 102(2000))，或人工染色体。常规载体的实例可以包括天然或重组质粒、黏粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或黏粒载体，可以使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等；并且作为质粒载体，可以使用基于pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pET等的那些。可以在本申请中使用的载体不是特别受限制的但是可以使用任何已知的表达载体。

另外地，载体可以是进一步包括各种抗生素抗性基因的重组载体。

如本文所使用的，术语“抗生素抗性基因”是指具有对抗生素抗性的基因，并且包括该基因的细胞即使在用相应抗生素处理的环境下可存活。因此，抗生素抗性基因可以有效地用作大肠杆菌中大规模生产质粒的选择标记。在本公开内容中，抗生素抗性基因不是显著地影响根据为本公开内容核心技术的载体最佳组合的表达效率的因素，并且因而任何常见的抗生素抗性基因可以非限制性地用作选择标记。例如，可使用抗氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、氯霉素、链霉素或新霉素等的抗性基因。

本公开内容的仍另一方面提供产生O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的微生物，其可以表达具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的修饰的多肽或包括包含编码该修饰的多肽的多核苷酸的载体并且具体地是产生O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的埃希氏菌属微生物，其中从由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的多肽的N-末端的第196位氨基酸缬氨酸可以用苏氨酸取代；或者可以包括包含编码该修饰的多肽的多核苷酸的载体。

在本公开内容中，引入可以通过转化进行，并且术语“转化”是指将基因引入到用于表达基因的宿主细胞，但不限于此。例如，可以使用将包含编码修饰的多肽的多核苷酸的载体引入宿主细胞的方法进行转化，并且转化载体的方法可以包括可以将核苷酸引入到细胞并且可以通过选择本领域已知的适当标准技术进行的任何方法。可以使用诸如电穿孔、磷酸钙共沉淀、反转录病毒感染、微注射、DEAE-葡聚糖、阳离子脂质体等的方法，但方法不限于此。

对于转化的基因，包括其中基因插入到宿主细胞的染色体的形式和其中基因定位在染色体外部的形式二者，只要基因可以在宿主细胞中表达。另外地，基因包括作为编码多肽的多核苷酸的DNA和RNA，并且可以非限制性地使用可以被引入并且在宿主细胞中表达的任何基因。例如，基因可以以为多核苷酸构建体的表达盒的形式引入到宿主细胞中，其包括自表达需要的所有基本元件。表达盒可以常规地包括可操作地连接至基因的启动子、转录终止信号、核糖体结合结构域和翻译终止信号。表达盒可以是能够自复制的表达载体的形式。另外地，基因可以以其本身或以多核苷酸构建体形式引入宿主细胞并且与在宿主细胞中表达需要的序列可操作地连接。

如本文所使用的，术语“包括载体的(转化的)宿主细胞”是指用包含编码至少一种靶蛋白的基因的载体转化的细胞。在本公开内容中，可以使用任意的原核和真核微生物，只要该微生物通过包括载体可以产生O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶。例如，可以使用属于埃希氏菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、普罗威登斯菌属、棒状杆菌属和短杆菌属的微生物菌株，并且大肠杆菌作为埃希氏菌属的实例，但是微生物菌株不限于此。

产生O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的埃希氏菌属的微生物——其可以表达具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的修饰的多肽——可以包括可以通过除了以上所述的载体引入方法之外的本领域已知的各种方法表达修饰的多肽的所有微生物。

本公开内容的仍另一方面提供使用具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的修饰的多肽，或者产生该修饰的多肽的微生物或其培养产物产生甲硫氨酸的方法。具体地，方法可以是用于产生甲硫氨酸的方法，其包括使修饰的多肽或产生该修饰的多肽的微生物或其培养产物与O-乙酰高丝氨酸和甲硫醇反应。甲硫氨酸可以是L-甲硫氨酸。

产生O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的微生物的培养产物可以由在培养基中培养产生O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的微生物制备，该微生物可以表达具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的修饰的多肽，或包括包含编码该修饰的多肽的多核苷酸的载体。

如本文所使用的，术语“培养”是指在适当调节的环境中生长微生物。在本公开内容中，培养可以在本领域熟知的适当的培养基和培养条件下进行。在本领域普通技术人员根据选择的微生物菌株进行调节之后，可以容易地使用培养。微生物的培养可以在本领域已知的分批工艺、连续工艺、补料分批工艺等中连续地进行，但是培养工艺不具体地限于此。具体地，对于培养条件，通过使用适当的碱性化合物(例如，氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)，可以将培养物的pH调节至合适的pH(例如，pH5至9，具体地pH6至8，更具体地pH6.8)。另外地，在培养期间，消泡剂诸如脂肪酸聚乙二醇酯可以用于防止泡沫生成。另外地，通过引入氧气或含氧气的气体混合物至培养物可以维持培养物的需氧条件，并且通过引入氮气、氢气或二氧化碳气体至培养物而不注入氧气可以维持培养物的厌氧和微需氧状态。培养温度可以维持在20℃至45℃的范围内，并且具体地25℃至40℃，但培养温度不限于此。此外，培养可以继续直到获得有用材料的产生，并且具体地持续10小时至160小时，但培养条件不限于此。

另外地，作为待在培养基中使用的碳源，糖类和碳水化合物(例如，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)；油和脂肪(例如，大豆油、葵花油、花生油和椰子油)；脂肪酸(例如，棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)；醇类(例如，丙三醇和乙醇)；和有机酸(例如，醋酸)可以单独或组合使用，但不限于此。作为待在培养基中使用的氮源，含氮有机化合物(例如，蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽汁、玉米浆、大豆粉和尿素)或无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)等可以单独或组合使用，但不限于此。作为待在培养基中使用的磷源，磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、相应的含钠盐等可以单独或组合使用，但不限于此。另外地，培养基中可以含有为必需的生长促进材料的金属盐(例如，硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸、维生素等。

O-乙酰高丝氨酸可以是纯化形式的O-乙酰高丝氨酸或含有O-乙酰高丝氨酸的发酵肉汤。另外地，甲硫醇可以指液化的甲硫醇钠(CH₃S-Na)形式，和气态或液化的甲硫醇(CH₃SH)形式，以及含有二甲硫醚(DMS)的甲硫醇(在国际专利公开号WO 2010/098629中公开)。

本领域普通技术人员在本领域已知的最佳培养条件中可以容易地确定制备甲硫氨酸的方法，并且本领域普通技术人员在本领域已知的最佳酶活化条件中可以容易地确定使用修饰的多肽和/或产生该修饰的多肽的微生物或其培养产物大规模生产甲硫氨酸的方法。

制备甲硫氨酸的方法可以进一步包括回收在以上反应中产生的甲硫氨酸。使用本领域已知的适当方法可以进行回收过程。例如，可以使用方法诸如离心、过滤、离子交换色谱、结晶、HPLC等，但方法不限于此。

另外地，回收过程可以包括纯化步骤，其可以使用本领域已知的适当方法进行。

本发明的具体实施方式

在下文中，将通过示例性实施方式详细地描述本公开内容。然而，这些示例性实施方式仅为了说明的目的提供并且不旨在限制本公开内容的范围。

实施例1:通过O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶制备V196T变体和其活性的评估

实施例1-1:衍生自红细菌属微生物的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的表达

pCL-P_CJ1:metZ-rsp载体(韩国专利号10-1250651)，其中衍生自(已知代表性的类球红细菌属的微生物)的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶，通过热激被转化到大肠杆菌K12W3110(ATCC 27325)细胞中。然后，在含有氯霉素(25μg/mL)的LB培养基中培养转化体。将选择的菌落接种到LB培养基(3mL)中并且在200rpm、33℃下培养6小时。收集250μL量的所得培养物并将其再接种到含有氯霉素(25μg/mL)的新鲜LB培养基(在250mL烧瓶中25mL)并且在200rpm、33℃下培养15小时，并且从而表达野生型O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶。

实施例1-2：V196T变体(新型O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶变体)的制备

作为进行修饰以增加野生型O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的位置，选择第196位氨基酸(即，缬氨酸)。

衍生自类球红细菌的野生型O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的第196位氨基酸缬氨酸(Val，V)使用Quikchange位点定向诱变试剂盒(Agilent Technologies)用苏氨酸(Thr，T)取代。具体地，其中通过PCR反应使用其作为模板连同SEQ ID NOS:5和6(表1)的引物制备引入编码O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶变体的基因的重组载体。

[表1]

然后，通过测序证实修饰的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的引入，并且通过热激将修饰的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶引入到大肠杆菌K12W3110中。转化菌株被命名为CA05-4012并且在2014年11月27日以登录号KCCM11611P保藏在韩国微生物保藏中心(KCCM)——布达佩斯条约下的国际保藏机构。

将转化的大肠杆菌K12W3110接种到含有氯霉素(25μg/mL)的LB培养基中并且在33℃下培养6小时，并且收集培养物的一部分并且将其转移至含有氯霉素(25μg/mL)的LB培养基并且在33℃下培养持续15小时以诱导酶变体的表达。

实施例1-3:V196T变体的培养溶液的活性评估

2％(v/v)对二甲苯被分别添加至酶变体的培养物和野生型酶的培养物，并且以1,150rpm在33℃下处理1小时。然后，每种培养物的一部分被收集并且将其添加至缓冲液(含有50mM磷酸钾(pH 7.4，pH 6.4)，15g/L O-乙酰高丝氨酸，0.05mM PLP(吡哆醛5'-磷酸)，和30mM甲硫醇钠)中，并且在1,150rpm、33℃下反应5分钟，并且反应物经受HPLC分析以测量产生的L-甲硫氨酸的量。产生的L-甲硫氨酸的量被认为是酶的甲硫氨酸转变活性，并且因此，衍生自类球红细菌的野生型O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的活性和其V196T变体的活性在以下表2中显示。

[表2]

结果，如以上表2中所显示的，证实了变体酶的培养液显示与野生型酶本身相比在pH 7.4的条件下活性增加了1.86倍并且与野生型酶本身相比在pH6.4下活性增加了约2.60倍。

实施例2：O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的纯化和O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的评估

实施例2-1：O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的纯化

衍生自类球红细菌的野生型O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶和实施例1中获得的其V196T变体的培养液各25mL离心并且分别收集细胞。为了制备含有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的每种无细胞的提取物，分别在10℃以下将细胞悬浮在15mL含有150mM NaCl和5％丙三醇的50mM磷酸钾(pH 7.8)中并且使用超声发生器裂解，同时维持细胞悬浮。然后，将每种细胞悬浮液在15,000×g下离心25分钟以去除细胞碎片。将每种无细胞的提取物的整分试样(15mL)加载到10mL的用50mM磷酸钾(pH 7.8)预先平衡的GE Healthcare MonoQ柱，并且通过施加10个柱体积的梯度至柱以含有800mM NaCl的50mM磷酸钾(pH 7.8)洗涤/洗脱。在15mS/cm和20mS/cm之间的电导率下洗脱O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶。使用Millipore/Amicon Centricon离心分离机(MWCO:3kDa)将每种洗脱液浓缩至2mL至3mL的体积。将每种浓缩液加载到用含有150mM NaCl和5％丙三醇的50mM磷酸钾(pH 7.8)预先平衡的Superdex柱(HiLoad 16/600Superdex 75pg，GE Healthcare)，并且根据分子量分离。

O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶在50mL洗脱体积内以四聚体形式洗脱并且然后使用Millipore/Amicon Centricon离心分离机(MWCO:3kDa)浓缩至200μL或更小的体积

通过10％SDS-PAGE凝胶分析(图1)检查纯化的酶的纯度，并且将酶在-80℃下存储。

图1中显示的结果表明本公开内容的变体可以以高纯度纯化并且能够在大肠杆菌中过表达。

实施例2-2：纯化的野生型和V196T O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的活性的评估

将衍生自类球红细菌的纯化的野生型和V196T变体O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶各自以1.3mg/mL的浓度添加到等量的含有50mM磷酸钾(pH 7.4和pH 6.4)、15g/L O-乙酰高丝氨酸、0.05mM PLP(吡哆醛5'-磷酸)和30mM甲硫醇钠的缓冲液中，并且在1,150rpm、33℃下反应5分钟。然后，反应物经受HPLC分析以测量产生的L-甲硫氨酸的量。野生型和V196T变体O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的活性在以下表3中显示。

[表3]

结果，如以上表3中所显示，证实了纯化的变体酶显示与野生型酶本身相比在pH7.4的条件下活性增加了1.90倍并且与野生型酶本身相比在pH 6.4下活性增加了约2.68倍。

实施例3：其中O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的第196位氨基酸被不同氨基酸取代的变体的评估

实施例3-1：V196S、V196L、V196D和V196K变体的制备

以与实施例1-2相同的方式制备含有该基因的载体和用该载体转化的大肠杆菌K12W3110菌株，除了其中以如实施例1中的位点定向诱变制备衍生自类球红细菌的野生型O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的变体，在所述变体中衍生自类球红细菌的野生型O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的第196位氨基酸缬氨酸(Val，V)被分别用丝氨酸(Ser，S)、亮氨酸(Leu，L)、天冬氨酸(Asp，D)和赖氨酸(Lys，K)取代。

实施例3-2：V196S、V196L、V196D和V196K变体的酶培养液的活性的评估

以与实施例1-3中相同的方式评估在实施例3-1中获得的变体的培养液并且结果在以下表4中显示。

[表4]

(*n.d.：未检测)

结果，如以上表4中所显示，证实了其中第196位氨基酸被除了苏氨酸之外的不同氨基酸取代的变体显示了活性的减小或丧失。

这些结果表明本公开内容的V196T变体，一种新型O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶变体，与野生型相比具有显著改进的酶活性并且因而可以用于制备过量的L-甲硫氨酸，并且另外，V196T变体在较低的pH下显示较高的L-甲硫氨酸转化活性并且产生过量的L-甲硫氨酸并且因而即使在醋酸(即，最终产物)聚集的时间点具有低活性抑制，从而能够产生过量的L-甲硫氨酸。另外地，这些结果表明即使当以无细胞的提取物以及细胞内培养物的形式纯化时L-甲硫氨酸可以以过量产生。

从前述，本公开内容所属领域的技术人员将能够理解，本公开内容可以以其他具体形式体现，而无需修改本公开内容的技术概念或必要特征。在这方面，本文公开的示例性实施仅为了说明性的目的并且不应当被解释为限制本公开内容的范围。相反，本公开内容旨在不仅覆盖该示例性实施而且覆盖各种替代、修改、等同物和其他实施方式，其可以包括在由所附的权利要求限定的本公开内容的精神和范围内。

<110> CJ 第一制糖株式会社

<120> O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶变体以及使用其产生L-甲硫氨酸的方法

<130> OPA16220

<150> KR 10-2015-0143035

<151> 2015-10-13

<160> 6

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 404

<212> PRT

<213> 类球红细菌

<400> 1

Met Gly Ile Ala Phe Arg Glu Gly Arg Thr Gly Met Thr Lys Asp Trp

1 5 10 15

Lys Thr Arg Thr Gln Leu Val His Gly Gly Ser Arg Arg Ser Gln Tyr

20 25 30

Gly Glu Met Ala Glu Ala Ile Phe Leu Thr Gln Gly Phe Val Tyr Asp

35 40 45

Ser Ala Glu Gln Ala Glu Ala Arg Phe Ile Glu Thr Gly Ala Asp Glu

50 55 60

Phe Ile Tyr Ala Arg Tyr Gly Asn Pro Thr Thr Arg Met Phe Glu Glu

65 70 75 80

Arg Ile Ala Ala Val Glu Gly Thr Glu Asp Ala Phe Ala Thr Ala Ser

85 90 95

Gly Met Ala Ala Ile His Gly Val Leu Thr Ser Ile Val Arg Ala Gly

100 105 110

Asp His Leu Val Ala Ala Arg Ala Leu Phe Gly Ser Cys Ile Tyr Ile

115 120 125

Leu Glu Glu Val Leu Gly Arg Phe Gly Val Glu Val Thr Phe Val Asp

130 135 140

Gly Thr Asp Leu Asp Gln Trp Arg Ala Ala Val Arg Pro Gly Thr Lys

145 150 155 160

Ala Val Phe Phe Glu Ser Val Ser Asn Pro Thr Leu Glu Val Ala Asp

165 170 175

Ile Gly Ala Ile Ala Glu Ile Ala His Ala Val Gly Ala Leu Val Ile

180 185 190

Val Asp Asn Val Phe Ala Thr Pro Val Phe Ser Thr Ala Val Arg Gln

195 200 205

Gly Ala Asp Val Val Ile Tyr Ser Ala Thr Lys His Ile Asp Gly Gln

210 215 220

Gly Arg Ala Leu Gly Gly Val Val Cys Ala Ser Gln Ala Phe Ile Arg

225 230 235 240

Lys Val Leu Glu Pro Phe Met Lys His Thr Gly Gly Ser Met Ser Pro

245 250 255

Phe Asn Ala Trp Leu Met Leu Asn Gly Met Ala Thr Leu Asp Leu Arg

260 265 270

Cys Arg Ala Met Ala Asp Thr Ala Glu Lys Ile Ala Arg Ala Leu Glu

275 280 285

Gly His Pro Gln Leu Gly Arg Val Ile His Pro Ala Leu Glu Ser His

290 295 300

Pro Gln His Glu Met Ala Lys Ala Gln Met Glu Arg Pro Gly Thr Met

305 310 315 320

Ile Ala Leu Asp Leu Ala Gly Gly Lys Glu Ala Ala Phe Arg Phe Leu

325 330 335

Asp Ala Leu Arg Ile Val Lys Ile Ser Asn Asn Leu Gly Asp Ala Arg

340 345 350

Ser Ile Ala Thr His Pro Ala Thr Thr Thr His Gln Arg Leu Ser Asp

355 360 365

Ala Gln Lys Ala His Leu Gly Ile Thr Pro Gly Leu Val Arg Leu Ser

370 375 380

Val Gly Leu Glu Asp Ala Asp Asp Leu Ile Ala Asp Leu Lys Gln Ala

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Leu Ala Val Ile

<210> 2

<211> 1215

<212> DNA

<213> 类球红细菌

<400> 2

atgggtatcg cgtttcgtga aggacggacg ggcatgacga aggactggaa gacaaggacg 60

caactcgtcc acgggggcag ccgccggagc cagtatggcg aaatggccga ggcgatcttc 120

ctgacccagg gcttcgtcta cgactcggcc gaacaggccg aagcgcgctt catcgagacc 180

ggcgccgacg aattcatcta tgcccgctac ggcaacccca cgacgcgcat gttcgaagag 240

cgcatcgcgg ccgtcgaggg caccgaggat gcgttcgcca ccgcctcggg catggccgcg 300

atccacggcg tgctcacctc gatcgtgcgg gcgggcgatc atctggtggc ggcgcgcgct 360

ctgttcggct cctgcatcta catcctcgag gaggtgctgg gccgattcgg cgtcgaggtg 420

accttcgtcg acggcaccga tctcgatcag tggcgcgcgg cggtgcggcc cggcacgaag 480

gccgtgttct tcgagtcggt ctcgaatccg acgctcgagg tggccgatat cggcgccatc 540

gccgagatcg cccatgccgt gggcgcgctc gtcatcgtgg acaatgtctt cgcgacgccc 600

gtcttctcga cggcggtgcg gcagggcgcg gatgtggtga tctattcggc caccaagcac 660

atcgacgggc aagggcgcgc gctcggcggc gtggtctgcg cctcgcaggc cttcatccgc 720

aaggtgctcg aacccttcat gaagcacacc ggcggctcga tgagcccctt caacgcctgg 780

ctcatgctga acgggatggc gacgctcgac ctgcgctgcc gcgcgatggc cgacacggcc 840

gagaagatcg cccgcgcgct cgagggccat ccgcagctcg gccgcgtgat ccatcccgcg 900

ctggaaagcc acccgcagca cgagatggcc aaggcgcaga tggagcgtcc cggcacgatg 960

atcgcgctcg acctcgccgg gggcaaggag gcggccttcc gcttcctcga cgccctgagg 1020

atcgtgaaga tctccaacaa tctgggcgat gcccgctcga tcgcgaccca cccggcaacg 1080

accacccacc agcgtctttc cgacgcgcag aaggcccatc tcggcatcac gcccgggctc 1140

gtgcggctgt cggtggggct cgaggatgcg gacgacctga tcgccgatct gaaacaggcg 1200

ctcgcggtga tctga 1215

<210> 3

<211> 404

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 类球红细菌MetZ V196T氨基酸序列

<400> 3

Met Gly Ile Ala Phe Arg Glu Gly Arg Thr Gly Met Thr Lys Asp Trp

1 5 10 15

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Gly Glu Met Ala Glu Ala Ile Phe Leu Thr Gln Gly Phe Val Tyr Asp

35 40 45

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Gly Met Ala Ala Ile His Gly Val Leu Thr Ser Ile Val Arg Ala Gly

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Leu Glu Glu Val Leu Gly Arg Phe Gly Val Glu Val Thr Phe Val Asp

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340 345 350

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Leu Ala Val Ile

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<211> 1215

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 类球红细菌metZ V196T DNA序列

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<210> 5

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<213> 人工序列

<220>

<223> V196T突变体的引物 (正向)

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<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> V196T突变体的引物 (反向)

<400> 6

gaagacgggc gtcgcgaagg tattgtccac gatgacgag 39

Claims

1.一种具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的修饰的多肽，其中从由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的多肽的N-末端的第196位氨基酸缬氨酸被苏氨酸取代。

2.一种编码权利要求1所述的修饰的多肽的多核苷酸。

3.一种包括权利要求2所述的多核苷酸的载体。

4.一种产生O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的埃希氏菌属的微生物，其中所述微生物表达具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的修饰的多肽，其中从由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的多肽的N-末端的第196位氨基酸缬氨酸被苏氨酸取代，并且其中所述埃希氏菌属的微生物是大肠杆菌；或包括权利要求3所述的载体，并且其中所述埃希氏菌属的微生物是大肠杆菌。

5.一种产生甲硫氨酸的方法，其包括使权利要求1所述的修饰的多肽、或产生所述修饰的多肽的微生物或其培养产物与O-乙酰高丝氨酸和甲硫醇反应。

6.权利要求5所述的方法，进一步包括回收通过所述反应产生的所述甲硫氨酸。