CN101356281A - 生产l-蛋氨酸前体的微生物以及由l-蛋氨酸前体制备l-蛋氨酸和有机酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备L－蛋氨酸与有机酸的方法，包括下列步骤：步骤1)制备一种生产L－蛋氨酸前体的菌株并且通过发酵该菌株生产L－蛋氨酸；步骤2)以L－蛋氨酸前体作为底物，在有酶的情况下通过酶反应产生L－蛋氨酸和有机酸，而且在每一步骤中采用微生物菌株。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备L-蛋氨酸和有机酸的方法。更特别是，本发明涉及一种由L-蛋氨酸前体通过酶转化反应制备具有高产量的L-蛋氨酸和有机酸的方法，所述酶转化反应来自通过根据本发明而制备的L-蛋氨酸前体生产菌株的发酵而生产的L-蛋氨酸前体。本发明生产L-蛋氨酸的方法比传统方法更环保并能对L-蛋氨酸进行选择性生产，目的是使用工业上不同领域中的L-蛋氨酸作为食品、食物添加剂和医学供应品的原料以及药物等。
背景技术
蛋氨酸是人体内的一种必需氨基酸，其可以广泛用作食品和食物添加剂并进一步用作医疗液体和医疗供应品的人造原料。蛋氨酸作为类似化合物如胆碱(卵磷脂)和肌酸的前体，并且同时用作半胱氨酸和牛黄酸的人造原料。蛋氨酸还可以提供硫。S-腺苷蛋氨酸衍生自L-蛋氨酸并且在人体内扮演了一个固定供应甲基的角色，并且还参与合成大脑内的神经传递素。蛋氨酸和/或S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)可抑制脂肪堆积在肺里和动脉里并且可降压、消炎、减轻肝脏疾病和缓解肌肉痛疼等。
蛋氨酸和/或S-腺苷-L-蛋氨酸在体内的功能目前已知如下。
1)它能抑制脂肪在肺部和动脉的堆积促进类脂物的代谢并能提高大脑、心脏和肾脏内的血液循环(J Hepatol.Jeon BR等，2001 Mar；34(3)：395-401)。
2)它能促进消化，解毒和有毒物质的排出以及重金属如Pb的排出。
3)它以800-1,600mg/天的剂量可用作抗抑郁剂(Am J Clin Nutr.Mischoulon D.等，2002 Nov；76(5)：1158S-61S)。
4)它增强了肺部功能(FASEB J.Mato JM.，2002 Jan；16(1)：15-26)，并对由乙醇导致的肺部疾病特别有效(Cochrane Database Syst Rev.，Rambaldi A.，2001；(4)：CD002235)。
5)它对骨关节疾病具有消炎作用并能促进关节的恢复(ACP JClub.Sander O.，2003 Jan-Feb；138(1)：21，J Fam Pract，Soeken KL等，2002 May；51(5)：425-30)。
6)它是头发的基本营养物。它可以给头发提供营养而防止脱发(Audiol Neurootol.，Lockwood DS等，2000 Sep-Oct；5(5)：263-266)。
蛋氨酸可以在化学上或生物上合成以用作饲料、食品和药品。
在化学合成中，蛋氨酸主要由5-(β-甲基巯基乙基)-乙内腺脲的水解制备。该化学合成的蛋氨酸具有的缺点是仅能制成L-型和D-型的混合物。
在生物合成中，蛋氨酸通过参与蛋氨酸合成的蛋白质进行制备。L-蛋氨酸由高丝氨酸通过酶表达作用以生物学方法合成，例如通过基因metA，metB，metC，metE和metH。特别地，metA是编码高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的基因并且可将高丝氨酸转化成O-琥珀酰-L-蛋氨酸，上述高丝氨酸O-琥珀酰转移酶是蛋氨酸生物合成必需的初始酶。由metB基因编码的O-琥珀酰高丝氨酸裂解酶或胱硫醚伽马合酶将O-琥珀酰-L-高丝氨酸转化成胱硫醚。由metC基因编码的胱硫醚β裂解酶将胱硫醚转化成L-高半胱氨酸。由metE编码的钴胺素非依赖性(cobalamine-independent)蛋氨酸合酶以及由metH编码的钴胺素依赖性(cobalamine-dependent)蛋氨酸合酶，二者都可将L-高半胱氨酸转化成L-蛋氨酸。同时，由metF编码的5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶和由glyA编码的丝氨酸羟甲基转移酶同时作用以合成N(5)-亚甲基四氢叶酸从而提供合成L-蛋氨酸所必需的甲基。L-蛋氨酸通过上面的酶由一系列有机反应合成。上述基因修饰蛋白或其它影响上述蛋白的蛋白可能导致L-蛋氨酸在合成上的变动。例如，日本专利提前公开公布号2000/139471描述了一种通过Escherichiasp制备L-蛋氨酸的方法。其中基因组中的thrBC和metJ基因被删除，metBL为过表达，并且metK由渗漏突变体替换。此外，美国专利公开号US2003/0092026A1描述了一种采用metD(L-蛋氨酸合成抑制剂)敲除(knock-out)微生物方法，其属于棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)美国专利公开号US2002/0049305描述了一种通过增加5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(metF)的表达增加L-蛋氨酸产量的方法。
美国专利专利公开号US2005/0054060A1描述了一种制备L-蛋氨酸采用胱硫醚合酶(O-琥珀酰高丝氨酸裂解酶)突变体生产微生物的方法。该胱硫醚合酶突变体可以直接地由H2S或CH3SH取代半胱氨酸产生高半胱氨酸或蛋氨酸。在这种方法中，突变体胱硫醚合酶直接诱导进细胞内并参与胞内蛋氨酸的生物合成过程。在这种方法中，由于采用胞内蛋氨酸的生物合成渠道胱硫醚合酶反应并不是很有效。而且，H2S或CH3SH对细胞的高毒性降低了这种方法的有效性。在我们的实验中，我们还发现胱硫醚合酶对CH3SH的底物特异性比衍生自假单胞菌属或色素杆菌属的琥珀酰高丝氨酸合酶的底物特异性低。
根据现有技术，胱硫醚合酶与不同的底物反应趋向于产生不同的产物。胱硫醚合酶介于高半胱氨酸和O-琥珀酰高丝氨酸之间相互作用以产生具有高效应的高羊毛氨酸(J.Bacteriol(2006)vol 188：p609-618)。该细胞内的胱硫醚合酶可以与不同的蛋氨酸前体反应并能产生不同的具有高效的副产物。因此，胱硫醚合酶的过表达由于较高的副产物可以导致较低的效率。
由传统的生物方法制备的该蛋氨酸是L型的，其具有优点但是产量太低。这是因为该蛋氨酸的生物合成渠道具有紧密的反馈调节系统。一旦合成的蛋氨酸到达确定水平，最终产物蛋氨酸抑制了在蛋氨酸生物合成开始时metA基因编码初始蛋白的转录。metA基因本身的过表达并不能增加蛋氨酸产量，因为该metA基因在转录阶段被蛋氨酸抑制并在接下来的翻译阶段由细胞内蛋白酶降低(Dvora Biran，Eyal Gur，Leora Gollanand Eliora Z.Ron：通过蛋白水解作用对大肠杆菌中蛋氨酸的抑制(2000)37(6)，1436-1443)。因此，许多在先专利关注怎样从metA基因的反馈管理系统中释放它(WO2005/108561，WO1403813)。
当蛋氨酸在生物系统中产生时，在蛋氨酸降解渠道由蛋氨酸中的S-腺蛋氨酸合酶使产生的蛋氨酸被转化成S-腺蛋氨酸。由于S-腺蛋氨酸是细胞内的基本物质，因此S-腺蛋氨酸合酶并不能被检测出。根据在先专利，该基因编码S-腺蛋氨酸合酶变异成具有低的活性以增加该蛋氨酸的产量(WO2005/108561)。
发明内容
传统的蛋氨酸生物合成方法采用胱硫醚合酶代谢渠道以产生蛋氨酸，由于硫化物的毒性并伴随着副产物的产生以至于酶的反应过程效率很低。另外，在蛋氨酸合成渠道中的反馈调节抑制了蛋氨酸的大量产生。
本发明的目的在于提供一种生产L-蛋氨酸可选择的方法以克服传统方法中存在的上述问题。该可选方法由两步组成，其中L-蛋氨酸前体通过发酵产生并且L-蛋氨酸前体在酶的作用下转化成L-蛋氨酸。
本发明的另一个目的在于提供一种选择性地生产L-蛋氨酸的方法。
本发明进一步的目的在于提供一种在不增加工艺步骤的情况下同时产生作为副产物的有机酸的方法。
本发明将在下文中作详细描述。为了完成本发明的目的，本发明提供了一种制备L-蛋氨酸的方法，其组成步骤有1)制备L-蛋氨酸前体生产菌株并通过发酵该菌株以制备L-蛋氨酸前体，和2)通过与L-蛋氨酸前体的酶反应制备L-蛋氨酸以及有机酸。特别是，在步骤1)中，生产和发酵L-蛋氨酸前体产生菌株以在培养基中积聚L-蛋氨酸前体。同时，产生L-蛋氨酸前体的菌株通过本发明的方法由本发明者有计划地制备，以至于本发明还包括该菌株以及在它的范围内生产菌株的方法。
文中的L-蛋氨酸前体被组成为下列公式的O-酰基高丝氨酸基团之一取代；[公式1]
其中R为包括C，H，O，N和其它最多带有15个碳分子的化合物。例如，该O-酰基高丝氨酸基团包括，但不限于，O-乙酰基高丝氨酸，O-琥珀酰基高丝氨酸，丙酰基高丝氨酸，乙酸乙酰基高丝氨酸，香豆酰基高丝氨酸，丙二酰高丝氨酸，羟甲基戊二酰基高丝氨酸和pimelyl高丝氨酸。
本发明中的L-蛋氨酸前体优选为O-乙酰基高丝氨酸或O-琥珀酰基高丝氨酸。文中所用的″L-蛋氨酸前体生产菌株″指的是一种原核或真核的微生物菌株，通过本发明的处理它们能够积聚L-蛋氨酸前体。例如，该菌株可以选自由埃希氏菌属(Escherichia sp.)、欧文氏菌属(Erwiniasp.)、沙雷氏菌属(Serratia sp.)、普罗威登斯菌属(Providencia sp.)、棒状杆菌属(Coryne bacteria sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、钩端螺旋体菌属(Leptospira sp.)、沙门氏菌属(Salmonellar sp.)、Brevibacteriasp.、Hypomononas sp.、色素杆菌属(Chromobacterium sp.)和诺卡氏菌属(Norcardia sp.)微生物或真菌类或酵母类组成的组中。优选地，该假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、诺卡氏菌属(Norcardia sp.)和埃希氏菌属(Escherichia sp.)微生物可以被用作生产O-琥珀酰基高丝氨酸，并且该埃希氏菌属(Escherichia sp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)、Reptospira sp.和酵母的微生物可用于生产O-乙酰基高丝氨酸。更优选地是，使用埃希氏菌属(Escherichia sp.)微生物，并且最优选是使用大肠杆菌(Escherichia coli.)(下文中称为″E.coli”)。此外，可将外部基因引进埃希氏菌属(Escherichia sp.)微生物以选择性生产O-琥珀酰基高丝氨酸和O-乙酰基高丝氨酸。
本发明提供一种L-蛋氨酸前体生产菌株，其中参与O-琥珀酰基高丝氨酸和O-乙酰基高丝氨酸降解的基因被删除或被削弱。本发明还提供了一种L-蛋氨酸前体生产菌株，其中参与O-琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸的合成的基因被诱导或放大。本发明还选择性提供一种菌株，其中苏氨酸的生物合成渠道被封闭或削弱从而提高了O-琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸的产量。本发明进一步提供一种菌株，其中诱导、过表达或应急的基因从反馈调节系统中释放出来并且编码参与琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸合成的蛋白。
更特别地是，本发明通过删除参与L-蛋氨酸前体降解的metB基因、参与苏氨酸生物合成渠道的thrB基因和控制L-蛋氨酸前体合成基因的转录的metJ基因的菌株提高参与L-蛋氨酸前体生物合成的metA或metX基因的表达或引入在反馈调节系统中释放的metA或metX基因；或敲除(knocking-out)metA基因并取代引入的metX基因；或检测metX基因并取代引入的metA基因以提供一种L-蛋氨酸前体生产菌株。
在本发明中，基因的删除可以通过剪掉某段基因或在染色体上通过引入特定的DNA序列修饰该蛋白序列来实施。基因的削弱(weakening)可以通过在靶基因的ORF区域引入突变体以降低蛋白的活性来实施或通过修饰基因的启动区或5′-UTR的核苷酸序列以降低蛋白的表达来实施。
在本发明中，该蛋白表达的增加通过修饰基因的启动区或5′-UTR的核苷酸序列以实现，并且该蛋白的活性的增加可以通过在靶基因的ORF区域引入突变体来实现，并且该蛋白表达的提高还可以通过在染色体上引入靶基因的额外复本来实现或通过诱导该载体，该载体是带有自启动子的靶基因或该菌株中的其它增强启动子。
在本发明中的一个优选实施例中，制备L-蛋氨酸前体生产菌株的方法如下：
在步骤1中，基因编码蛋白例如胱硫醚伽马合酶，O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶在菌株中被删除或敲除(knocking-out)目的是积聚L-蛋氨酸前体例如O-琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸。
编码胱硫醚伽马合酶的基因指的是metB，编码O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶的基因指的是metZ，以及编码O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶的基因指的是metY。编码具有上述活性的蛋白的基因为例如metB，其metB为公知的E.coli。在现有技术中(Blattner等，Science 277：1453-1462(1997))披露了该基因的染色体组序列可以从E.coli(保藏号AAC75876)的染色体组序列中得到。上述染色体组序列还可以从NCBI(NationalCenter for Biotechnology Information)和DDBJ(DNA Data Bank Japan)中获得。其它具有上述活性的基因由衍生自棒状杆菌的metB和metY以及衍生自假单胞菌属的metZ中获得。
胱硫醚伽马合酶或O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶如下反应式所示具有将O-琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转化成的胱硫醚或高半胱氨酸的活性。因而，菌株中删除或削弱上述活性的基因时，在培养液中显示出O-琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸的积聚。
L-半胱氨酸+O-琥珀酰基-L-高丝氨酸<＝>琥珀酸盐+胱硫醚
L-半胱氨酸+O-乙酰基-L-高丝氨酸<＝>醋酸盐+胱硫醚
HS-+O-琥珀酰基-L-高丝氨酸<＝>琥珀酸盐+高半胱氨酸
HS-+0-乙酰基-L-高丝氨酸<＝>醋酸盐+高半胱氨酸
在步骤2中，thrB基因编码在步骤1中制备的菌株中的高丝氨酸激酶被删除或削弱。该thrB基因参与从高丝氨酸合成O-含磷高丝氨酸，该高丝氨酸接着被thrC基因转化成苏氨酸。删除或削弱thrB基因用在所有已制得的高丝氨酸中以用于蛋氨酸前体的合成。
在步骤3中，metJ基因是metA基因的转录调节剂并被删除或削弱。metA基因包含在蛋氨酸前体的合成中，其通过蛋氨酸的反馈调节系统进行调节并且metJ基因作为阻抑物包含在metA基因的转录中。为了在构成上过表达该metA基因并激活合成的蛋氨酸前体，对metA基因消除其转录的阻抑物是有用的。因此，在E.coli中metJ基因被消除并metA基因的表达增加，从而大量生产L-蛋氨酸前体。
上述步骤2和3可根据一种前体生产菌株可进行修改且其并不是该前体生产菌株所必需的。然而，在埃希氏菌属微生物中为了提高前体的产量的方法其可以优选实施。
在步骤4中，作为蛋氨酸生物合成阶段第一阶段中的酶介质的可编码高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶或高丝氨酸O-乙酰基转移酶的metA或metX基因，其表达的提高可以促进蛋氨酸前体的合成。metA基因是可编码高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶的基因的通用术语，并且metX基因是可编码高丝氨酸O-乙酰基转移酶的基因的通用术语。为了提高metA或metX基因的表达，可以引入基因的附加复本或5′-UTR或修饰启动子或突变每个基因的ORF区。这种基因的放大表达导致了L-蛋氨酸前体合成的显著增加。
如果蛋氨酸被认为是菌株生长所必须的，引入的metA或metX基因可从反馈调节剂中释放。在这个实施例中，L-蛋氨酸前体的合成与介质中蛋氨酸的含量无关并且在介质中添加的蛋氨酸促进了L-蛋氨酸前体的合成以及细胞的生长。
为了增加从O-琥珀酰基高丝氨酸生产菌株中的O-乙酰基高丝氨酸的产量，编码染色体中存在的高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶的metA基因可被删除。其中O-琥珀酰基高丝氨酸的产量因metA基因的删除受到抑制并且通过引入附加的metX基因生产O-乙酰基高丝氨酸，O-乙酰基高丝氨酸与现存的metA基因中引入metX基因的实例相比可以得到较高的产量。
通过删除编码存在于菌株染色体中的高丝氨酸O-乙酰基转移酶的metX基因，使得在O-乙酰基高丝氨酸生产菌株中增加O-琥珀酰基高丝氨酸的产量是可能的。其中O-乙酰基高丝氨酸的产量由于metX基因的删除而受到抑制并且O-琥珀酰基高丝氨酸由于另外引入metA基因而产生，O-琥珀酰基高丝氨酸以较高产量产出。
通过选取上述步骤1-4中的有益部分或全部工艺，可以使O-琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸、L-蛋氨酸前体在菌株中积累。
该L-蛋氨酸前体生产菌株可以由L-赖氨酸、L-苏氨酸或L-异亮氨酸菌株生产，优选地，它可以采用L-苏氨酸生产菌株进行制备。在这种菌株中，高丝氨酸的合成率已经提高，从而蛋氨酸前体的产量也相应地增加。因此，蛋氨酸前体的积聚是通过删除或敲除(knocking-out)在苏氨酸生物合成渠道中包含的基因实现，以及接下来的metA或metY或MetZ基因采用L-苏氨酸生产菌株。更优选地是首先删除或削弱thrB基因，并且接着metB，metY或metZ以合成蛋氨酸前体。同时，增加了metA或metX基因的表达从而使合成的蛋氨酸前体增加。
本发明中″L-苏氨酸生产菌株″指的是原核微生物菌株或真核微生物菌株，其能够在体内产生L-苏氨酸。例如，该菌株包括在属于埃希氏菌属(Escherichia sp.)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)、沙雷氏菌属(Serratiasp.)、普罗威登斯菌属(Providencia sp.)、棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)和短杆菌属(Brevibacterium sp.)中的L-苏氨酸生产微生物菌株。它们之中，优选埃希氏菌属(Escherichia sp.)微生物并且大肠杆菌(Escherichia coli.)是更优选的。
该L-苏氨酸生产菌株不但包括自然界中的微生物还包括它们的突变株，这些突变株可举例为如下微生物：通过那些对异亮氨酸具有渗漏需要并且对L-赖氨酸类似物和α-氨基丁酸具有抑制作用的微生物；和通过至少添加引入内源性磷酸烯醇丙酮酸盐羧化酶(ppc)基因的额外复本进行突变的微生物；和灭活参与草酰乙酸盐(OAA)转化到磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)过程的pckA基因的微生物，其中草酰乙酸盐(OAA)是L-蛋氨酸的一种中间体；和灭活tyrR基因的微生物，上述tyrR基因可抑制参与L-蛋氨酸生物合成的tyrB基因的表达；和灭活galR基因的微生物，上述galR基因可抑制参与葡萄糖转移的galP基因的表达。文中的L-赖氨酸的类似物(analoges)可以是选自包含S-(2-氨乙酸)-L-半胱氨酸和δ-甲基-L-赖氨酸的组中的一种或多种化合物。
在本发明的一个优选实施例中，CJM002，该L-苏氨酸产生和L-蛋氨酸-独立菌株突变自TF4076(KFCC 10718，韩国专利号92-8365)，采用该产生L-苏氨酸的E.coli突变菌株。TF4076需要蛋氨酸，并且具有与蛋氨酸类似物(例如，α-氨基-β-羟基戊酸，AHV)，赖氨酸类似物(例如，S-(2-氨乙酸)-L-半胱氨酸，AEC)，和异亮氨酸类似物(例如，α-氨基丁酸)的抵抗性。包含在上述韩国专利中的信息包含在本发明权利要求的范围内。由于TF4076为需要蛋氨酸的菌株，而不能在体内合成蛋氨酸。在本发明中，为了通过解除对蛋氨酸的需要性从而使将这种菌株作为蛋氨酸生产菌株来使用，本发明者采用NTG人工突变制备解除了对蛋氨酸的需要性的L-苏氨酸生产菌株E.coli CJM002。所述E.coli CJM002被称为大肠杆菌(Escherichia coli.)MF001并于2004年4月9日保藏在KCCM(韩国微生物保藏中心，友林大厦，弘济1洞，西大门区，首尔，361-221，韩国)(保藏号：KCCM-10568).O-琥珀酰基高丝氨酸通过上述方法产生制备的大肠杆菌(Escherichia coli.)CJM-BTJ(pMetA-CL)也于2006年7月21日保藏(保藏号：KCCM-10767)并且大肠杆菌(Escherichia coli.)CJM-BTJ(pCJ-MetA-CL)在2007年7月5日保藏(保藏号：KCCM-10872).O-乙酰基高丝氨酸通过本发明的上述方法产生制备的大肠杆菌(Escherichia coli.)CJM-BTJA(pCJ-MetX-CL)于2007年7月5日保藏(保藏号：KCCM-10873)。
上述制备的L-蛋氨酸前体生产菌株培养基可以通过现有技术中已知的常规介质和条件实现。本领域人员易于理解根据所选择的菌株采用的培养基的方法也容易调节。例如，该培养基方法包括但并不限于分批(batch)，连续培养(continous culture)和分批培养(fed-batch)。各种不同的培养基方法在下面的参考文献中有描述：″生物化学技术″由James M.Lee撰写，Prentice-Hall International Editions，pp 138-176.
所述介质必须满足特定菌株的培养基条件。各种不同的微生物培养基介质在下列文献中有描述：″普通细菌学方法手册(Manual of Methodsfor General Bacteriology)″，美国细菌学会，华盛顿，，USA，1981。那些介质包含不同的碳源、氮源和示踪原子。碳源举例为碳水化合物如葡萄糖，、蔗糖，、乳糖，、果糖，、麦芽糖、淀粉、纤维素；脂类如大豆油、葵花油、蓖麻油和椰子油；油脂酸如棕榈酸、硬脂酸、和亚油酸；醇类如甘油和乙醇；以及有机酸如乙酸。这些化合物中的一种或它们的混合物可作为碳源。氮源举例为，有机氮源如胨、酵母膏、肉汁、麦芽提取物、玉米浆(CSL)和黄豆粉以及无机氮源如尿素、硫酸胺、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些化合物中的一种或它们的混合物可作为氮源。这里的介质还包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和以及相应的含钠盐作为磷酸盐的来源。所述介质还包括金属盐，如硫酸镁或硫酸铁。此外，氨基酸、维他命以及常规的前体也可以加进来。所述介质或前体可以分批处理或连续地加入培养基中。培养基的pH在培养过程中通过以适当的方式添加如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸的化合物来进行调节。在培养过程中通过采用抗发泡剂例如脂肪酸聚乙二醇酯来抑制气泡的产生。为了维持培养基的需氧条件，可将氧气或含氧气体(例如，空气)通入培养基中。培养基的温度通常在20-45℃，优选为25-40℃。培养周期在L-蛋氨酸前体的产量在达到所需水平之前一直是连续的，优选的培养时间是10-160小时。
步骤2)的过程包括经酶反应产生L-蛋氨酸和有机酸的过程，所用的酶是具有活性的胱硫醚合酶或O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或在使用时含有这些酶的活性菌株。O-琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸产自上述L-蛋氨酸前体生产菌株以甲基硫醇作为底物。
更特别的是，本发明提供了一种通过酶反应产生L-蛋氨酸的方法，所用酶是胱硫醚合酶或O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶，通过采用由上述方法作为底物积聚的高丝氨酸，O-含磷高丝氨酸，O-琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸。本发明优选采用O-琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸作为底物。
在本发明中，所述胱硫醚伽马合酶或O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶可以衍生自埃希氏菌属(Escherichiasp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、钩端螺旋体菌属(Leptospira sp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)、酵母菌属(Saccharomyces sp.)、色素杆菌属(Chromobacterium sp.)、奴卡氏菌属(Nocardia sp.)、博斯特属(Bradyrhizobium sp.)、生丝单胞菌属(Hyphomonas sp.)、甲基球菌属(Methylococcus sp.)、Methylo杆菌属(Methylobacillus sp.)、亚硝化单细胞菌属(Nitrosomonas sp.)、Klesiella sp.、杆菌属(Bacillus sp.)、志贺氏菌属(Shigella sp.)、Colwellia sp.、沙门氏菌属(Salmonella sp.)、酵母或真菌类。
在步骤2)的过程中，其中O-琥珀酰基高丝氨酸用作L-蛋氨酸前体，优选采用的是衍生自假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、奴卡氏菌属(Nocardia sp.)或色素杆菌属(Chromobacterium sp.)的胱硫醚伽马合酶或O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶，更优选用的是衍生自Pseudomonas aurogenosa、鼻疽诺卡菌(NocardiaFarcinica)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)或青色素杆菌(Chromobacterium Violaceum)。
在步骤2)的过程中，其中O-乙酰基高丝氨酸用作L-蛋氨酸前体，优选采用衍生自钩端螺旋体菌属(Leptospira sp.)、色素杆菌属(Chromobacterium sp.)或生丝单胞菌属(Hyphomonas sp.)的胱硫醚伽马合酶或O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶，更优选用衍生自Leptospira meyeri、Pseudomonas aurogenosa、Hyphomonas Neptunium或青色素杆菌(Chromobacterium Violaceum)。
上述的酶反应如下列反应式所示，并且其结构式如图2所示。
CH3SH+O-琥珀酰基-L-高丝氨酸<＝>琥珀酸盐+蛋氨酸
CH3SH+O-乙酰基-L-高丝氨酸<＝>乙酸盐+蛋氨酸
在上述反应中，如图2公式所示，CH3S-甲基硫醇残基被O-琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸的琥珀酸盐或乙酸盐残基取代以产生蛋氨酸在反应中甲硫醇(CH3SH)可以不同的形态加入。
具有上述酶活性的基因编码酶序列可以从美国的NCBI数据库，和日本的DNA数据库(KEGG)中获得。
为了生物转化反应，将获得的基因序列克隆，然后将其诱导加入到表达载体。待表达的酶以活性状态来自重组菌株。酶表达菌株和已表达的酶二者都可直接用于反应。
从上述基因或微生物菌株表达的那些酶可以直接进行混合或部分混合或不混合，在发酵的上清或肉汁积聚L-蛋氨酸前体以开始反应。在本发明优选的实施例中，O-琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸积聚在发酵溶液中可以由酶转化成蛋氨酸，所述酶是衍生自假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、色素杆菌属(Chromobacterium sp.)、钩端螺旋体菌属(Leptospira sp.)或生丝单胞菌属(Hyphomonas sp.)的胱硫醚伽马合酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶。
更优选地，O-琥珀酰基高丝氨酸积聚在发酵溶液中可以由酶转化成蛋氨酸，所述酶是衍生自Pseudomonas aurogenosa、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)或青色素杆菌(Chromobacterium Violaceum)胱硫醚伽马合酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶。O-乙酰基高丝氨酸积聚在发酵溶液中可以由酶转化成蛋氨酸，所述酶是衍生自Leptospira meyeri、Hyphomonas Neptunium或青色素杆菌(Chromobacterium Violaceum)的胱硫醚伽马合酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶。
pCL-CJ1载体(CJ，韩国)中的每个表达基因，E.coli的表达用载体，以及被表达的蛋白从采用超声波降解法分解细胞制备的酶溶液中获得。所述酶溶液加入积聚有O-琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸的发酵溶液，并将和甲基硫醇溶液也加入其中以开始反应。该反应采用DTNB(5，5-二硫基-双(2-硝基-苯甲酸，Sigma，美国)控制并且反应产物由HPLC进行分析。
在本发明中，在没有分离步骤下，通过CH3SH分别与O-琥珀酰基高丝氨酸和O-乙酰基高丝氨酸反应可以额外得到副产物如琥珀酸或乙酸。
附图说明
本发明的优选实施例的应用参照附图可以很好地理解，其中：
图1显示的是蛋氨酸前体生产菌株的基因处理图。
图2显示的是步骤2中蛋氨酸产物的化学结构。
图3是由pMetA-CL得到metA基因表达的原理图。
图4是由pCJ-MetB-CL得到metB基因表达的原理图。
图5是反应曲线图，显示了与不同的酶反应的O-琥珀酰高丝氨酸使用量。
每种酶溶液的来源如下。酶溶液#21是一种不包含特定基因的细胞提取液。
图6是反应曲线图，显示了与不同的酶反应的O-乙酰基高丝氨酸使用量(consumptions)。每一数字如图5中所示。
图7显示了用于转化反应的每种酶的氨基酸序列，按照DNAstar的megalign排列。
具体实施方式
本发明实用的和当前优选的实施例如下所示。
然而，本领域技术人员应当理解，鉴于本文的公开在本发明的精神和范围之内可对其进行修改和改进。
实施例1：构建蛋氨酸前体生产菌株
<1-1>删除metB基因
为了在E.coli菌株中删除编码胱硫醚合酶的metB基因，实施FRT一步PCR删除(FRT-one-step PRC deletion)操作(PNAS(2000)vol97：P6640-6645)。序列1和序列2的引物用于PCR，采用pKD3载体(PNAS(2000)vol97：P6640-6645)作为模板，导致缺失基因盒的结构。PCR操作如下；在94℃变性30秒，在55℃下退火30秒，在72℃下延伸1分钟，循环以上操作30回。
PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶中进行电泳，之后对从1.2kbp带获得的DNA进行纯化。回收的DNA片段在E.coli(K12)W3110中经电穿孔与pKD46载体(PNAS(2000)vol97：P6640-6645)转化。在电穿孔之前，W3110在带有pKD46下，在30℃含有100μg/L的氨苄青霉素和5mM的1-阿拉伯糖的LB介质中孵育，直到OD600达到0.6。然后用无菌蒸馏水清洗培养基菌株2次，再用10％甘油清洗一次。在2500V下电穿孔。该回收的菌株在含有25μg/L的氯霉素LB平板介质中涂布，接着在37℃下在培养基中培养过夜。然后，选择显示抗生素抗性的菌株。
采用选择的菌株作为模板以及上述相同的引物在相同的条件下进行PCR扩增。通过在1.0％琼脂糖凝胶中识别大小为1.2kb的菌株从而确认metB基因的删除。然后该菌株与pCP20载体(PNAS(2000)vol97：P6640-6645)进行转化并在LB介质中孵育。最后构建成敲除(knock-out)metB的菌株，其中metB基因在相同的条件下通过在1.0％琼脂糖凝胶中PCR扩增，大小减至150bp。确认氯霉素标记物被消除。构建的菌株称为W3-B。
<1-2>删除thrB基因
本发明者试图通过删除thrB基因编码高丝氨酸激酶来增加由高丝氨酸到O-琥珀酰高丝氨酸的合成。特别是，采用苏氨酸生产菌株，由于采用的高丝氨酸的活性非常强删除这种基因是相当必需的。为了从上述构建的W3-B菌株中删除thrB基因，通过上述删除metB基因相同的方法进行FRT一步PCR删除。
为了构建thrB缺失基因盒，采用pKD4载体(PNAS(2000)vol97：P6640-6645)作为模板进行PCR扩增，所用的引物为序列3和序列4，如下；在94℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，在72℃下延伸1分钟，循环以上操作30回。PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶中进行电穿孔，接着将得到的1.6kbp带的DNA进行纯化。将回收的DNA片段经电穿孔成W3-B菌株与pKD46载体进行转化。将回收的菌株在含有50μg/L的卡那霉素的LB平板介质中涂布，接着在37℃下在培养基中培养过夜。然后，显示抗性的菌株被选择。
采用选择的菌株作为模板利用序列3和序列4的引物在上述相同条件下进行PCR扩增。通过在1.0％琼脂糖凝胶中选择大小为1.6kb的菌株从而确认ThrB基因的删除。然后该菌株用pCP20载体进行转化，并在LB介质中培养。最终构建出thrB敲除(knock out)菌株，其中thrB基因的大小在1.0％琼脂糖凝胶中在相同条件下通过PCR减至150kb。确认卡那霉素标记物被消除。构建的菌株称为W3-BT。
<1-3>metJ基因的删除
为了删除metJ基因，其为包含在蛋氨酸前体合成中的metA基因的调节基因，采用与删除metB基因相同的方法即FRT一步PCR进行操作。
为了构建metJ缺失基因盒，PCR扩增使用序列5和序列6的引物，如下；在94℃变性30秒，在55℃下退火30秒，在72℃下延伸1分钟，循环以上操作30回。PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶中进行电穿孔，接着将得到的1.2kbp带的DNA进行纯化。将回收的DNA片段经电穿孔成W3-BT菌株与pKD46载体进行转化。将回收的菌株在含有氯霉素的LB平板介质中涂布，接着在37℃下在培养基中培养过夜。然后，选择显示抗生素抗性的菌株。
采用选择的菌株作为模板利用序列7和序列8的引物在上述相同条件下进行PCR扩增。通过在1.0％琼脂糖凝胶中选择大小为1.6kb的菌株从而确认metJ基因的删除。然后该菌株用pCP20载体进行转化，并在LB介质中培养。最终构建出metJ敲除(knock out)菌株，其中metJ基因的大小在1.0％琼脂糖凝胶中在相同条件下通过PCR减至600kb。确认氯霉素标记物被消除。构建的菌株称为W3-BTJ。
<1-4-1>过表达metA基因
为了增加蛋氨酸前体的合成，metA基因编码参与O-琥珀酰高丝氨酸合成中的高丝氨酸O-琥珀酰转移酶，该蛋氨酸前体被过表达。
采用E.coli w3110的染色体作为模板进行PCR扩增，所用引物为序列9和序列10，如下；在94℃变性30秒，在55℃下退火30秒，在72℃下延伸2分钟，循环以上操作25回。
该PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶中电泳，接着将得到的1.2kbp带的DNA进行纯化。回收的DNA片断与另一通过用Smal消化的pCL1920载体中获得的DNA片断连接。E.coli与所述连接的载体转化，接着置于含有50μg/L的奇放线菌素中的LB介质中孵育，随后经过选择。因而构建的载体称为pMetA-CL。pMetA-CL的原理图如图3所示。W3-BTJ菌株与所述载体转化。构建后的菌株称为W3-BTJ/pMetA-CL并且在那里观察到O-琥珀酰高丝氨酸量的增加。
增加metA基因表达的另一个方法是，metA基因通过采用CJ1启动子(CJ，韩国)和EcoRV与pCL1920载体连接。E.coli与接连的载体进行转化，其接着置于含有50μg/L的奇放线菌素中的LB介质中孵育，随后经过选择。因而构建的载体称为pCJ-MetA-CL。W3-BTJ菌株与所述载体进行转化。构建后的菌株称为W3-BTJ/pCJ-MetA-CL并且在那里观察到O-琥珀酰高丝氨酸量的增加。
<1-4-2>metX基因的过表达
为了合成O-乙酰基高丝氨酸，metX基因编码参与O-乙酰基高丝氨酸合成的高丝氨酸O-乙酰基转移酶，该蛋氨酸前体被过表达。
采用Leptospira meyeri的染色体作为模板进行PCR扩增，所用引物为序列11和序列12，如下；在94℃变性30秒，在55℃下退火30秒，在72℃下延伸2分钟，循环以上操作25回。
该PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶中电泳，接着将得到的1.1kbp带的DNA进行纯化。回收的DNA片段通过采用CJ1启动子和EcoRV连接到pCL1920载体。E.coli与所述连接的载体转化，接着置于含有50μg/L的奇放线菌素中的LB介质中孵育，随后经过选择。因而构建的载体称为pCJ1-MetXlme-CL。W3-BTJ菌株与所述载体转化。构建后的菌株称为W3-BTJ/pCJ-MetXlme-CL并且在那里观察到O-乙酰基高丝氨酸量的增加。
过表达metX基因的另一个方法是通过PCR扩增，采用棒状杆菌的染色体作为模板，所用引物为序列68和序列69，如下；在94℃变性30秒，在55℃下退火30秒，在72℃下延伸2分钟，循环以上操作25回。该PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶中电泳，接着将DNA进行纯化。回收的DNA片段通过采用CJ1启动子和EcoRV连接到pCL1920载体。E.coli与所述连接的载体转化，接着置于含有50μg/L的奇放线菌素中的LB介质中孵育，随后经过选择。因而构建的载体称为pCJ-MetXcgl-CL。W3-BTJ菌株与所述载体转化。构建后的菌株称为W3-BTJ/pCJ-MetXcgl-CL并且在那里观察到O-乙酰基高丝氨酸量的增加。
<1-4-3>metA基因的删除
为了增加O-乙酰基高丝氨酸的产量，在W3-BTJ菌株中删除编码高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的metA基因。基于发现只有metX基因诱导导致O-琥珀酰高丝氨酸的积聚，希望metA基因缺失带来O-乙酰基高丝氨酸(表3)的积聚量的提高。为了删除metA基因，进行FRT一步PCR操作。
为了构建metA缺失基因盒，进行PCR扩增，所用引物为序列70和序列71，如下；在94℃变性30秒，在55℃下退火30秒，在72℃下延伸1分钟，循环以上操作30回。
该PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶中电泳，接着将得到的1.2kbp带的DNA进行纯化。将回收的DNA片段经电穿孔成E.coli W3-BTJ菌株与pKD46载体进行转化。将回收的菌株在含有氯霉素的LB平板介质中涂布，接着在37℃下在培养基中过夜。然后，显示抗性的菌株被选择。
采用选择的菌株作为模板利用序列70和序列71的引物在上述相同条件下进行PCR扩增。metA基因的删除通过在1.0％琼脂糖凝胶中确认大小为1.1kb的基因进行识别。然后该菌株用pCP20载体进行转化，并在LB介质中培养。最终构建出metA敲除(knock out)菌株，其中metA基因的大小在1.0％琼脂糖凝胶中在相同条件下通过PCR减至100kb。确认氯霉素标记物被消除。构建的菌株称为W3-BTJA。W3-BTJA菌株与pCJ-MeTXlme-CL载体进行转化并将得到的菌株称为W3-BTJA/pCJ-MetX-CL。该菌株在上述相同的方法下孵育，结果没有观测到O-琥珀酰高丝氨酸的积聚，但O-乙酰基高丝氨酸的产量相比较W3-BTJ显著地增加了大约20％。
<1-5>L-苏氨酸生产菌株的转化
蛋氨酸前体生产菌株通过与所述实施例<1-1>到<1-3>采用的E.coli CJM002(KCCM-10568)相同的方式构建，该L-苏氨酸分离于所需的蛋氨酸。构建的菌株分别称为CJM-BTJ，CJM-BTJ/pMetA-CL和CJM-BTJ/pCJ-MetA-CL。该metA基因敲除(knock-out)菌株还可以通过<1-4-3>中采用CJM-BTJ菌株相同的方式进行构建，以及所得菌株被称为CJM-BTJA。
实施例2：发酵产生L-蛋氨酸前体
<2-1>瓶装培养基实验
为了检测实施例1中构建的菌株的蛋氨酸前体产量的能力，采用锥形瓶培养基操作。W3-BTJ、CJM-BTJ和W3-BTJ与metA和metX的表达载体进行转化在含有奇放线菌素的LB平板介质中31℃下孵育过夜。单菌落与含有奇放线菌素的LB介质3ml接种，随后在在31℃下孵育5小时。该培养溶液是在含有25ml的蛋氨酸前体产生介质的250ml锥形瓶中以200倍稀释，随后在31℃下培养，200rpm时间是64小时。采用以比较蛋氨酸前体产生能力(表2和表3)。结果是，在蛋氨酸前体生产菌株中蛋氨酸的产生能力显著增加，该蛋氨酸前体生产菌株由L-苏氨酸生产菌株制备分离于所需要的蛋氨酸。
[表1]用于蛋氨酸前体产物的瓶装介质混合物
| 混合物 | 浓度(每升) |
| 葡萄糖 | 40g |
| 硫酸铵 | 17g |
| KH2PO4 | 1.0g |
| MgSO4·7H2O | 0.5g |
| FeSO4·7H2O | 5mg |
| MnSO4·8H2O | 5mg |
| ZnSO4 | 5mg |
| 碳酸钙 | 30g |
| 酵母提取物 | 2g |
| 蛋氨酸 | 0.15g |
| 苏氨酸 | 0.15g |
[表2]由瓶装培养基得到的蛋氨酸前体(O-琥珀酰高丝氨酸)产物
| OD | 葡萄糖消耗物(g/l) | O-琥珀酰高丝氨酸(g/l) | |
| W3-BTJ | 10 | 40 | 0.3 |
| W3-BTJ/pMetA-CL | 12 | 40 | 1.2 |
| W3-BTJ/pCJ-MetA-CL | 12 | 40 | 1.8 |
| CJM-BTJ | 5.0 | 33 | 0.6 |
| CJM-BTJ/pMetA-CL | 6.0 | 36 | 5.2 |
| CJM-BTJ/pCJ-MetA-CL | 6.0 | 40 | 10.1 |
[表3]由瓶装培养基得到的蛋氨酸前体(O-乙酰基高丝氨酸)产物
| OD | 葡萄糖消耗物(g/l) | O-乙酰基高丝氨酸(g/l) | |
| W3-BTJ | 10 | 40 | 0 |
| W3-BTJ/pCJ-MetXlme-CL | 12 | 40 | 1.5 |
| W3-BTJ/pCJ-metXcgl-CL | 12 | 40 | 1.4 |
| W3-BTJA/pCJ-metXlme-CL | 11 | 40 | 1.8 |
| CJM-BTJ | 5.0 | 33 | 0 |
| CJM-BTJ/pCJ-metXlme-CL | 5.5 | 40 | 4.8 |
| CJM-BTJ/pCJ-MetXcgl-CL | 6.0 | 36 | 4.6 |
| CJM-BTJA/pCJ-metX-CL | 5.8 | 40 | 6.5 |
<2-2>大规模发酵
实施例1中的菌株显示了最高的蛋氨酸前体生产能力，被选作批量生产蛋氨酸前体，其随后在5L发酵器中发酵。CJM-BTJ/pCJ-metA-CL或CJM-BTJA/pCJ-metXlme-CL接种在含有奇放线菌素的LB介质中，随后在31℃下孵育过夜。然后，单菌落与含有奇放线菌素的LB介质10ml接种，其在31℃下孵育5小时。该培养溶液在含有200ml的蛋氨酸前体种子介质的1000ml锥形瓶中稀释100倍，随后在31℃下培养，200rpm时间是3-10小时。该培养液在5L发酵器中接种，在接下来经分批补料(fed-batch)发酵中进一步培养50-100小时。在发酵液中该蛋氨酸前体的浓度经HPLC测量，结果显示在表5中。
[表4]用于蛋氨酸前体产物的发酵器介质混合物
| 混合物 | 种子介质 | 主要介质 | 饲料介质 |
| 葡萄糖(g/l) | 10.1 | 40 | 600 |
| MgSO4.7H2O(g/l) | 0.5 | 4.2 | |
| 酵母提取物(g/l) | 10 | 3.2 | |
| KH2PO4 | 3 | 3 | 8 |
| 硫酸铵(g/l) | 6.3 | ||
| NH4Cl(g/l) | 1 | ||
| NaCl(g/l) | 0.5 | ||
| Na2HPO412H2O(g/l) | 5.07 | ||
| DL-蛋氨酸(g/l) | 0.5 | 0.5 | |
| L-异亮氨酸(g/l) | 0.05 | 0.5 | 0.5 |
| L-苏氨酸(g/l) | 0.5 | 0.5 |
[表5]发酵器中的蛋氨酸前体产物
| O-琥珀酰高丝氨酸(g/l) | O-琥珀酰高丝氨酸(g/l) |
| CJM-BTJ/pCJ-MetA-CL | ＞80 | 0 |
| CJM-BTJA/pCJ-MetXlme-CL | 0 | ＞55 |
实施例3：蛋氨酸转化酶产物
<3-1>衍生自E.coli的胱硫醚伽马合酶
克隆对衍生自E.coli的胱硫醚伽马合酶编码的metB基因，其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用E.coli的染色体作为模板，所用引物为序列13和序列14，如下；在94℃变性30秒，在55℃下退火30秒，在72℃下延伸2分钟，循环以上操作25回。
得到的DNA片段用Ncol/Hindlll消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJ1载体(CJ，韩国)。得到的载体称为pCJ-MetB-CL，其原理图如图4所示。E.coli W3110用克隆的载体转化，然后在含有50μg/L of奇放线菌素的LB平板介质中培养，随后经菌落选择。该选择的菌落在含有50μg/L of奇放线菌素的3ml LB介质中接种，随后在37℃下孵育过夜。回收培育的细胞，用0.1M的磷酸钾缓冲液(pH 7.5)冲洗干净，在200μl的磷酸钾缓冲液中悬浮，并用超声波降解法破碎5次间隔时间为30秒。该细胞溶解物在12,000rpm下离心分离10分钟并取所得的上清液采用Bio-Rad蛋白质定量溶液(BIO-Rad，USA)量化整个蛋白质的量。该蛋白表达通过SDS-PAGE识别。从细胞提取物中得到的上清液用于酶转化反应。
<3-2>O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶衍生于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)
克隆对衍生自假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶编码的metZ基因，其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。作为假单胞菌属(Pseudomona sp.)微生物，Pseudomonas aeruginosa和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)被采用。
PCR扩增采用每一菌株的染色体作为模板，Pseudomonasaeruginosa时所用的引物为序列15和序列16以及恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)时所用的引物为序列17和序列18，如下；在94℃变性30秒，在55℃下退火30秒，在72℃下延伸2分钟，循环以上操作30回。
得到的DNA片段用Ndel/Pacl消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJ1载体(CJ，韩国)。采用上述实施例<1-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-3>衍生自假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶
克隆对衍生自假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶编码的metY基因，其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用Pseudomonas aeruginosa的染色体作为模板，所用引物为序列19和序列20，如下；在94℃变性30秒，在55℃下退火30秒，在72℃下延伸2分钟，循环以上操作30回。
得到的DNA片段用Ndel/Pacl消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJ1载体(CJ，韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-4>衍生自谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的胱硫醚合酶
克隆对衍生自谷氨酸棒杆菌的胱硫醚合酶编码的metB基因，其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用谷氨酸棒杆菌的染色体作为模板，所用引物为序列21和序列22，如下；在94℃变性30秒，在55℃下退火30秒，在72℃下延伸2分钟，循环如下操作30回。
得到的DNA片段用NcoI/HindIII消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJ1载体(CJ，韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-5>衍生自谷氨酸棒杆菌的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶
克隆对衍生自谷氨酸棒杆菌的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶编码的metZ基因，其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用谷氨酸棒杆菌的染色体作为模板，所用引物为序列23和序列24，如下；在94℃变性30秒，在55℃下退火30秒，在72℃下扩展2分钟，循环以上操作30回。
得到的DNA片段用Ndel/Avr II消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJ1载体(CJ，韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-6>衍生自钩端螺旋体菌属(Leptospira sp.)的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶
克隆对衍生自Leptospira meyeri的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶编码的metY基因，其可用于将作为蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用Leptospira meyeri的染色体作为模板，所用引物为序列25和序列26，如下；在94℃变性30秒，在55℃下退火30秒，在72℃下延伸2分钟，循环以上操作30回。
得到的DNA片段用Ndel/Avrll消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJ1载体(CJ，韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-7>衍生自Saccharomyces sp.的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶
克隆对衍生自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶编码的met25基因，其可用于将作为蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的染色体作为模板，所用引物为序列27和序列28，如下；在94℃变性30秒，在55℃下退火30秒，在72℃下延伸2分钟，循环以上操作30回。
得到的DNA片段用Ndel/Pacl消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJ1载体(CJ，韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-8>衍生自色素杆菌属(Chromobacterium sp.)的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶
克隆对衍生自青色素杆菌(Chromobacterium Violaceum)的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶编码的metZ基因，其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用青色素杆菌(Chromobacterium Violaceum)的染色体作为模板，所用引物为序列29和序列30，如下；在94℃变性30秒，在55℃下退火30秒，在72℃下延伸2分钟，循环以上操作30回。
得到的DNA片段用Ndel/Avrll消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJ1载体(CJ，韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-9>衍生自奴卡氏菌属(Nocardia sp.)的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶
克隆对衍生自鼻疽诺卡菌(Nocardia Farcinica)的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶编码的metZ基因，其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用鼻疽诺卡菌(Nocardia Farcinica)的染色体作为模板，所用引物为序列31和序列32，如下；在94℃变性30秒，在55℃下退火30秒，在72℃下延伸2分钟，循环以上操作30回。
得到的DNA片段用Ndel/Avrll消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJ1载体(CJ，韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-10>衍生自博斯特属(Bradyrhizobium sp.)的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶
克隆对衍生自鼻疽诺卡菌(Nocardia Farcinica)的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶编码的metZ基因，其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium Japonicum)的染色体作为模板，所用引物为序列33和序列34，如下；在94℃变性30秒，在55℃下退火30秒，在72℃下延伸2分钟，循环以上操作30回。
得到的DNA片段用Ndel/Avrll消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJ1载体(CJ，韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-11>衍生自生丝单胞菌属(Hyphomonas sp.)的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶
克隆对衍生自Hyphomonas Neptunium的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶编码的metZ基因，其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用Hyphomonas Neptunium的染色体作为模板，所用的引物为序列35和序列36，如下；在94℃变性30秒，在55℃下退火30秒，在72℃下延伸2分钟，循环以上操作30回。
得到的DNA片段用BamHII/HindIII消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJ1载体(CJ，韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-12>衍生自Methylococcus sp.的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶
克隆对衍生自甲基球菌(Methylococcus Capsulatus)的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶编码的metZ基因，其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用甲基球菌(Methylococcus Capsulatus)的染色体作为模板，所用的引物为序列37和序列38，如下；在94℃变性30秒，在55℃下退火30秒，在72℃下延伸2分钟，循环以上操作30回。
得到的DNA片段用Ndel/Avrll消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJ1载体(CJ，韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-13>衍生自Methylo杆菌属(Bacillus sp.)的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶
克隆对衍生自Methylobacillus Flagellatus的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶编码的metZ基因，其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用Methylobacillus Flagellatus的染色体作为模板，所用引物为序列39和序列40，如下；在94℃变性30秒，在55℃下退火30秒，在72℃下延伸2分钟，操作以上操作30回。
得到的DNA片段用Ndel/Avrll消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJ1载体(CJ，韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-14>衍生自亚硝化单细胞菌属(Nitrosomonas sp.)的O-琥珀酰honioserine硫化氢解酶
克隆对衍生自Nitrosomonas Europaea的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶编码的metZ基因，其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用Nitrosomonas Europaea的染色体作为模板，所用引物为序列41和序列42，如下；在94℃变性30秒，在55℃下退火30秒，在72℃下延伸2分钟，循环以上操作30回。
得到的DNA片段用Ndel/Avrll消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJ1载体(CJ，韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-15>衍生自Klesiella sp.的胱硫醚合酶
克隆对衍生自Klesiella Pneumoniae的胱硫醚合酶编码的metB基因，其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用Klesiella Pneumoniae的染色体作为模板，所用的引物为序列43和序列44，如下；在94℃变性30秒，在55℃下退火30秒，在72℃下延伸2分钟，循环以上操作30回。
得到的DNA片段用Ndel/Avrll消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJ1载体(CJ，韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-16>衍生自杆菌属(Bacillus sp.)的胱硫醚合酶
克隆对衍生自枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)的胱硫醚合酶编码的metB基因，其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)的染色体作为模板，所用的引物为序列45和序列46，如下；在94℃变性30秒，在55℃下退火30秒，在72℃下延伸2分钟，循环以上操作30回。
得到的DNA片段用Ndel/Avr II消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJ1载体(CJ，韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-17>衍生自志贺氏菌属(Shigella sp.)的胱硫醚合酶
克隆对衍生自痢疾杆菌2457T(Shigella flexneri 2457T)的胱硫醚合酶编码的metB基因，其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用痢疾杆菌2457T(Shigella flexneri 2457T)的染色体作为模板，所用的引物为序列47和序列48，如下；在94℃变性30个循环时间30秒，在55℃下退火30秒，在72℃下延伸2分钟，循环以上操作30回。
得到的DNA片段用Ndel/Avrll消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJ1载体(CJ，韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-18>衍生自Colwellia sp.的胱硫醚合酶
克隆对衍生自Colwellia Psychrerythraea的胱硫醚合酶编码的metB基因，其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用Colwellia Psychrerythraea的染色体作为模板，所用的引物为序列49和序列50，如下；在94℃变性30秒，在55℃下退火30秒，在72℃下延伸2分钟，循环以上操作30回。
得到的DNA片段用Ndel/Avrll消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJ1载体(CJ，韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-19>衍生自沙门氏菌属(Salmonella sp.)的胱硫醚合酶
克隆对衍生自Salmonella enterica serovar Paratyphi A的胱硫醚合酶编码的metB基因，其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用Salmonella enterica serovar Paratyphi A的染色体作为模板，所用引物为序列51和序列52，如下；在94℃变性30秒，在55℃下退火30秒，在72℃下延伸2分钟，循环以上操作30回。
得到的DNA片段用Ndel/Avrll消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJ1载体(CJ，韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清液，并用于酶转化反应。
<3-20>OSHS用作底物转化酶活性的比较
将实施例<3-1>到<3-19>得到的每种酶溶液的活性进行比较以选出最佳蛋氨酸转移酶。
首先，将O-琥珀酰高丝氨酸(Sigma，USA)溶解在0.1M的磷酸钾缓冲液(pH 7.5)中得到浓度为3mM。将吡哆醛5′-磷酸盐(Sigma，USA)作为辅酶加入反应液中，得最后的浓度为10μM甲基硫醇(甲基硫醇，Tokyo Kasei Organic Chemicals，日本)作为另一种底物加入反应液中，得到浓度为2mM。将1ml反应液置于37℃中，加入每种酶溶液10μl(蛋白浓度：5mg/ml)。每隔5-10分钟收集100μl反应液，并加入900μl浓度为4mg/ml的DTNB(Sigma，USA)溶液。测量OD415以确认反应继续。
DTNB与甲基硫醇的SH基团反应并存在反应液中，并接着合成一种黄色物质。因此，不管反应是否继续，通过观察反应液中黄色物质的消失检测甲基硫醇向蛋氨酸的转化反应。
如图5所示，衍生自色素杆菌属(Chromobacterium sp.)的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶，衍生自诺卡氏菌属的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶，衍生自假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶和O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶显示出较高的酶活性。其它酶液显示了某种程度的活性，但它们的反应速度相对较慢。
每种酶与底物的反应性概括在表6中。完全反应(Upon completion)1小时，采用HPLC以确认蛋氨酸和琥珀酸最后的产量。结果显示在表7中。
<3-21>OAHS用作底物转移酶的活性比较
采用O-乙酰基高丝氨酸实施与上述实施例<3-20>进行相同的试验。O-乙酰基高丝氨酸是从发酵溶液的上清液中纯化的。采用与O-琥珀酰高丝氨酸用于试验时相同的反应液和酶溶液。如图6所示，衍生自Hypomononas sp.的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶，衍生自假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶，衍生自色素杆菌属(Chromobacterium sp.)的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶和衍生自钩端螺旋体菌属(Leptospira sp.)的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶其它酶液显示了某种程度的活性，但它们的反应速度相对较慢。每种酶与底物的反应性概括在表6中。完全反应(Upon completion)1小时，采用HPLC以确认蛋氨酸和琥珀酸最后的产量。结果显示在表8中。
[表6]通过衍生自每种菌株中的酶O-琥珀酰高丝氨酸和O-乙酰基高丝氨酸的转化反应
[表7]通过每种酶由O-琥珀酰高丝氨酸得到蛋氨酸和琥珀酸的生产能力
| 酶基因 | 蛋氨酸的量(g/l) | 琥珀酸的量(g/l) |
| 谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)metB | 0.05 | 0.03 |
| 大肠杆菌(Escherichia coli.)metB | 0.14 | 0.1 |
| 鼻疽诺卡菌(Nocardia Farcinica)metZ | 0.21 | 0.17 |
| 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)metZ | 0.22 | 0.17 |
| Pseudomonas aurogenosa metZ | 0.22 | 0.17 |
| 青色素杆菌(ChromobacteriumViolaceum) | 0.22 | 0.17 |
| Pseudomonas aurogenosa metY | 0.21 | 0.17 |
[表8]通过每种酶由O-乙酰基高丝氨酸得到蛋氨酸和乙酸的产量
| 酶基因 | 蛋氨酸的量(g/l) | 乙酸的量(g/l) |
| 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)metY | 0.22 | 0.081 |
| 青色素杆菌(ChromobacteriumViolaceum)metZ | 0.18 | 0.068 |
| Hyphomonas Neptunium metZ | 0.22 | 0.082 |
| 谷氨酸棒杆菌(Chromobacteriumglutamicum)metY | 0.05 | 0.015 |
| Leptospira meyeri metY | 0.15 | 0.05 |
<3-22>对转移酶反馈抑制的识别
在蛋氨酸中是否存在反馈抑制通过与所述实施例<3-20>和<3-21>相同的方法予以识别。通过上述相同的方法制备的反应液以及通过在每一反应液中添加或不添加5g/L的蛋氨酸以进行相同的反应。在没有蛋氨酸时反应液的反应速度作为100％，基于它在蛋氨酸中保留的活性计算为％.结果显示在表9中。
结果是，衍生自假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶，衍生自诺卡氏菌属的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶和衍生自钩端螺旋体菌属(Leptospira sp.)的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶的每种活性受到蛋氨酸的抑制，揭示了在存在蛋氨酸时那些酶的活性受到反馈系统的抑制。没有反馈系统的酶可用于进一步反应。推知上述实施例中受反馈系统抑制的酶可以用于其中的突变菌株分离自反馈系统的同样的反应中。
[表9]受蛋氨酸抑制的酶活性
<3-23>转化酶中的同源性比较
转化酶中的同源性用作转化反应与检测O-琥珀酰高丝氨酸和O-乙酰基高丝氨酸以及反馈抑制的相互反应相比较。
在这里所用的转化酶之间的同源性比较可以确认，与编码O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶的metZs之间的同源性和编码O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶的metYs之间的同源性相比metZs和metYs之间的同源性要高。关于上述实施例，编码O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶的metZ存在许多例子，其并不显示反馈抑制性。然而，由于实施例中用到的所有的酶受反馈抑制，所以受抑制的编码O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶的metY可以被相关的高反馈系统识别出来。关于对O-琥珀酰高丝氨酸和O-乙酰基高丝氨酸的选择性，该metZ基因基团显示出对O-琥珀酰高丝氨酸的高选择性，而该metY基因基团对O-乙酰基高丝氨酸显示出高选择性。同时，衍生自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的metY以及衍生自青色素杆菌(Chromobacterium Violaceum)的metZ对二者的底物都显示出高的特异性选择。
这里用的所有酶的氨基酸序列由Clustal W program(DNAstar)进行排列。结果是，它们都具有被下列片段取代的域。因此，具有如下域的酶可以由同样的方法产生蛋氨酸。
域1：Y-(S，I，T，V)-R-X-X-(N，S)
域2：
(V，A，I)-(V，L，I)-D-N-X-(F，V，M，I)-X-(T，S)-(P，A)-X-(L，I)-(Q，C，V)-X-(P，G)-(L，F)-X-(L，M，H)-G-(A，V)-(D，H)
域3：
(S，A，G，P)-(P，A，V)-F-(N，D)-(A，S)-(W，F，Y)-X-X-X-(K，Q，R，S)-G-(L，M，V，I，M)-(E，K，D，R)-T-(L，M)-
域5：
(H，Y)-(P，A)-(A，S)-(T，S)-(T，M，Q)-(T，S)-H
域6：(V，I，L)-R-(V，I，L，F)-(S，A)-(V，I，T)-G-(L，I)-E-
实施例4；通过蛋氨酸转移酶的蛋氨酸转化反应
<4-1>转移酶的大量生产
为了大量生产在实施例2(2-2和2-8)中构建的产生蛋氨酸转移酶的菌株，该菌株在1L发酵器中培养。菌株(W3110)采用衍生自假单胞菌属(Pseudomonassp.)的metZ表达载体或衍生自生丝单胞菌属(Hyphomonas sp.)的metZ表达载体进行转移。所述转化后的菌株在含有奇放线菌素的LB平板介质上接种，随后在30-40℃的培养基中孵育过夜。得到的单一菌落在含有奇放线菌素的40ml的LB介质中接种5小时。将孵育的衍生自假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的metZ表达菌株和衍生自生丝单胞菌属(Hyphomonas sp.)的metZ表达菌株置于1L发酵器中在30-40℃，600-900rpm下孵育15-30小时。所用培养基的介质混合物如表10所示。
该蛋氨酸转移酶溶液通过对发酵溶液采用超声波降解法将细胞均匀化进行制备。
[表10]用于产生转移酶的介质混合物
| 2XYT介质混合物 | |
| 酵母提取物(g/L) | 10 |
| 色氨酸(g/L) | 16 |
| 葡萄糖(g/L) | 40 |
| 奇放线菌素(g/L) | 50 |
<4-2>蛋氨酸转化反应
通过采用衍生自假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的O-琥珀酰高丝氨酸转移酶溶液和衍生自生丝单胞菌属(Hyphomonas sp.)的O-乙酰基高丝氨酸转移酶溶液进行蛋氨酸转化反应，所述转移酶溶液是分别在实施例4(4-1)中在实施例2(2-2)中制备的O-琥珀酰高丝氨酸和O-乙酰基高丝氨酸的发酵溶液中制备的。
将0.1L的细胞分解酶培养基溶液加入到2.0L未去处细胞的蛋氨酸前体的发酵溶液中，并加入0.3L的15％Na-甲基硫醇以激发反应。2小时之后，回收发酵溶液并将细胞去除。进行HPLC以确认蛋氨酸的产生。结果显示在表11中。
[表11]
| L-蛋氨酸(g/L) | 琥珀酸(g/L) | 乙酸(g/L) | |
| 琥珀酰基高丝氨酸的发酵溶液(＞80g/L) | ＞42 | ＞33 | 0 |
| 乙酰基高丝氨酸的发酵溶液(＞55g/L) | ＞40 | 0 | ＞15 |
结果是，在传统方法中L-蛋氨酸产生浓度以低至10g/L产生，而以本发明的方法L-蛋氨酸可以大量生产浓度达到30g/L。
工业实用性
本发明的方法能够得到可选择的L-蛋氨酸产物，其领先于在传统的化学合成中D-蛋氨酸和L-蛋氨酸一并产生的方法，并且在不添加额外的工艺条件下得到有机酸的副产物，如琥珀酸和乙酸。
序列表
<110>CJ第一制糖株式会社
<120>生产L-蛋氨酸前体的微生物以及由L-蛋氨酸前体制备L-蛋氨酸和有机酸的方法
<130>FP08KR547
<150>KR 10-2006-0071581
<151>2006-07-28
<150>KR 10-2007-0076045
<151>2007-07-27
<160>71
<170>KopatentIn 1.71
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<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer for amplification of Chloramphenichol
<400>1
ttactctggt gcctgacatt tcaccgacaa agcccaggga acttcatcac gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
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<212>DNA
<213>Artificial Sequence
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<223>primer for amplification of Chloramphenichol
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ttaccccttg tttgcagccc ggaagccatt ttccaggtcg gcaattaaat catatgaata 60
tcctccttag 70
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<212>DNA
<213>Artificial Sequence
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<223>primer for amplification of kanamycin
<400>3
aaagaatatg ccgatcggtt cgggcttagg ctccagtgcc tgttcggtgg gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
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<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer for amplification of kanamycin
<400>4
agacaaccga catcgctttc aacattggcg accggagccg ggaaggcaaa catatgaata 60
tcctccttag 70
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<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer for amplification of Chloramphenichol
<400>5
atggctgaat ggagcggcga atatatcagc ccatacgctg agcacggcaa ggtgtaggct 60
ggagctgcttc 71
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<211>65
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer for amplification of Chloramphenichol
<400>6
gtattcccac gtctccgggt taatccccat ctcacgcatg atctccatat gaatatcctc 60
cttag 65
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<213>Escherichia coli
<400>7
gggct ttgtc ggtgaaatg 19
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<211>19
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>8
actttgcgat gagcgagag 19
<210>9
<211>28
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>9
aatggatcct gccgtgagcg gcgaatac 28
<210>10
<211>28
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>10
agctctagac tgctgaggta cgtttcgg 28
<210>11
<211>23
<212>DNA
<213>Leptospira meyeri
<400>11
catatgccta cctccgaaca gaa 23
<210>12
<211>26
<212>DNA
<213>Leptospira meyeri
<400>12
aagctttcaa aggaaaactc cttcgt 26
<210>13
<211>33
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>13
gagatatacc atggtgacgc gtaaacaggc cac 33
<210>14
<211>30
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>14
ccgcaagctt tttacccctt gtttgcagcc 30
<210>15
<211>30
<212>DNA
<213>Pseudomonas aeruginosa
<400>15
ggaattccat atgactcagg actgggatgc 30
<210>16
<211>27
<212>DNA
<213>Pseudomonas aeruginosa
<400>16
ccttaattaa tcacagcgcg gccagcc 27
<210>17
<211>30
<212>DNA
<213>Pseudomonas putida
<400>17
ggaattccat atgacggatc aatgggatgc 30
<210>18
<211>27
<212>DNA
<213>Pseudomonas putida
<400>18
ccttaattaa tcacaatgcc gccagcc 27
<210>19
<211>29
<212>DNA
<213>Pseudomonas aeruginosa
<400>19
ggaattccat atgaagctgg aaacgcttg 29
<210>20
<211>28
<212>DNA
<213>Pseudomonas aeruginosa
<400>20
ccttaattaa tcagccgcgg ctggcctc 28
<210>21
<211>29
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<400>21
cgcaggccat ggtgtctttt gacccaaac 29
<210>22
<211>27
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<400>22
ccgccgaagc ttctaaaggt tattgag 27
<210>23
<211>30
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<400>23
agtcgtcata tgccaaagta cgacaattcc 30
<210>24
<211>31
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<400>24
ctggcaccta ggctagattg cagcaaagcc g 31
<210>25
<211>28
<212>DNA
<213>Leptospira meyeri
<400>25
agtcgtcata tggtaggacc atcggggg 28
<210>26
<211>38
<212>DNA
<213>Leptospira meyeri
<400>26
ctggcaccta ggttatcaga tattttttaa tgcctctt 38
<210>27
<211>28
<212>DNA
<213>Saccharomyces cerevisiae
<400>27
ggaattccat atgccatctc atttcgat 28
<210>28
<211>28
<212>DNA
<213>Saccharomyces cerevisiae
<400>28
ccttaattaa tcatggtttt tggccagc 28
<210>29
<211>21
<212>DNA
<213>Chromobacterium violaceum
<400>29
catatggcat ccgacgcgcc g 21
<210>30
<211>24
<212>DNA
<213>Chromobacterium violaceum
<400>30
cctaggttag tcaaggcccc gcaa 24
<210>31
<211>24
<212>DNA
<213>Nocardia farcinica
<400>31
catatggtga tcaccggcgg cgcg 24
<210>32
<211>24
<212>DNA
<213>Nocardia farcinica
<400>32
cctaggtcag ctcagcgcgt gctc 24
<210>33
<211>24
<212>DNA
<213>Bradyrhizobium japonicum
<400>33
catatggtgg atatatccag gccg 24
<210>34
<211>24
<212>DNA
<213>Bradyrhizobium japonicum
<400>34
cctaggtcac gccttctcca gcgc 24
<210>35
<211>25
<212>DNA
<213>Hyphomonas Neptunium
<400>35
ggatccgatg gcggatgcac ccggc 25
<210>36
<211>24
<212>DNA
<213>Hyphomonas Neptunium
<400>36
aagctttcac aagctgttaa gcga 24
<210>37
<211>21
<212>DNA
<213>Methylococcus capsulatus
<400>37
catatggaga cccgggccgt g 21
<210>38
<211>23
<212>DNA
<213>Methylococcus capsulatus
<400>38
cctaggtcag gcgaagcgag cca 23
<210>39
<211>25
<212>DNA
<213>Methylobacillus Flagellatus
<400>39
catatgagtc agcatgaatg gcatg 25
<210>40
<211>25
<212>DNA
<213>Methylobacillus Flagellatus
<400>40
cctaggagtc agcatgaatg gcatg 25
<210>41
<211>22
<212>DNA
<213>Nitrosomonas europaea
<400>41
catatgacga acgatctgga tc 22
<210>42
<211>25
<212>DNA
<213>Nitrosomonas europaea
<400>42
cctaggttat tgcaatccgc gagca 25
<210>43
<211>23
<212>DNA
<213>Klesiella pneumoniae
<400>43
catatgacgc gtaaacaggc cac 23
<210>44
<211>25
<212>DNA
<213>Klesiella pneumoniae
<400>44
cctaggttat tcctcgtttg ctgcc 25
<210>45
<211>23
<212>DNA
<213>Bacillus subtilis
<400>45
catatgtcac agcacgttga aac 23
<210>46
<211>27
<212>DNA
<213>Bacillus subtilis
<400>46
cctaggttac tcaaatgaaa cagctcc 27
<210>47
<211>24
<212>DNA
<213>Shigella flexneri 2457T
<400>47
catatgacgc gtaaacaggc cacc 24
<210>48
<211>27
<212>DNA
<213>Shigella flexneri 2457T
<400>48
cctaggttac cccttgtttg cagcccg 27
<210>49
<211>33
<212>DNA
<213>Colwellia Psychrerythraea
<400>49
catatgtcga ttactaaaaa aggtaatatt acc 33
<210>50
<211>30
<212>DNA
<213>Colwellia Psychrerythraea
<400>50
cctaggttac agttggctct gcgttaaacc 30
<210>51
<211>23
<212>DNA
<213>Salmonella enterica serovar Paratyphi A
<400>51
catatgacgc gtaaacaggc cac 23
<210>52
<211>27
<212>DNA
<213>Salmonella enterica serovar Paratyphi A
<400>52
cctaggttac cccttgtttg cagcccg 27
<210>53
<211>403
<212>PRT
<213>Pseudomonas aeruginosa
<400>53
Met Thr Gln Asp Trp Asp Ala Gly Arg Leu Asp Ser Asp Leu Glu Gly
1 5 10 15
Ala Ala Phe Asp Thr Leu Ala Val Arg Ala Gly Gln Arg Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Gly Glu His Gly Glu Ala Leu Phe Thr Thr Ser Ser Tyr Val Phe
35 40 45
Arg Thr Ala Ala Asp Ala Ala Ala Arg Phe Ala Gly Glu Val Pro Gly
50 55 60
Asn Val Tyr Ser Arg Tyr Thr Asn Pro Thr Val Arg Thr Phe Glu Glu
65 70 75 80
Arg Ile Ala Ala Leu Glu Gly Ala Glu Gln Ala Val Ala Thr Ala Ser
85 90 95
Gly Met Ser Ala Ile Leu Ala Leu Val Met Ser Leu Cys Ser Ser Gly
100 105 110
Asp His Val Leu Val Ser Arg Ser Val Phe Gly Ser Thr Ile Ser Leu
115 120 125
Phe Asp Lys Tyr Phe Lys Arg Phe Gly Ile Gln Val Asp Tyr Pro Pro
130 135 140
Leu Ser Asp Leu Ala Ala Trp Glu Ala Ala Cys Lys Pro Asn Thr Lys
145 150 155 160
Leu Phe Phe Val Glu Ser Pro Ser Asn Pro Leu Ala Glu Leu Val Asp
165 170 175
Ile Ala Ala Leu Ala Glu Ile Ala His Ala Lys Gly Ala Leu Leu Ala
180 185 190
Val Asp Asn Cys Phe Cys Thr Pro Ala Leu Gln Gln Pro Leu Lys Leu
195 200 205
Gly Ala Asp Val Val Ile His Ser Ala Thr Lys TyrIle Asp Gly Gln
210 215 220
Gly Arg Gly Met Gly Gly Val Val Ala Gly Arg Gly Glu Gln Met Lys
225 230 235 240
Glu Val Val Gly Phe Leu Arg Thr Ala Gly Pro Thr Leu Ser Pro Phe
245 250 255
Asn Ala Trp Leu Phe Leu Lys Gly Leu Glu Thr Leu Arg Ile Arg Met
260 265 270
Gln Ala His Ser Ala Ser Ala Leu Ala Leu Ala Glu Trp Leu Glu Arg
275 280 285
Gln Pro Gly Ile Glu Arg Val Tyr Tyr Ala Gly Leu Gln Ser His Pro
290 295 300
Gln His Glu Leu Ala Arg Arg Gln Gln Ser Gly Phe Gly Ala Val Val
305 310 315 320
Ser Phe Asp Val Lys Gly Gly Arg Asp Ala Ala Trp Arg Phe Ile Asp
325 330 335
Ala Thr Arg Met Val Ser Ile Thr Thr Asn Leu Gly Asp Thr Lys Thr
340 345 350
Thr Ile Ala His Pro Ala Thr Thr Ser His Gly Arg Leu Ser Pro Glu
355 360 365
Asp Arg Ala Arg Ala Gly Ile Gly Asp Ser Leu Ile Arg Val Ala Val
370 375 380
Gly Leu Glu Asp Leu Asp Asp Leu Lys Ala Asp Met Ala Arg Gly Leu
385 390 395 400
Ala Ala Leu
<210>54
<211>403
<212>PRT
<213>Pseudomonas putida
<400>54
Met Thr Asp Gln Trp Asp Ala Gly Arg Leu Asp Ser Asp Leu Glu Gly
1 5 10 15
Val Gly Phe Asp Thr Leu Ala Val Arg Ala Gly Gln His Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Gly Glu His Ser Glu Ala Leu Phe Leu Thr Ser Ser Tyr Val Phe
35 40 45
Arg Thr Ala Ala Asp Ala Ala Ala Arg Phe Ala Gly Glu Thr Pro Gly
50 55 60
Asn Val Tyr Ser Arg Tyr Thr Asn Pro Ser Val Arg Ala Phe Glu Glu
65 70 75 80
Arg Leu Ala Ala Met Glu Gly Ala Glu Gln Ala Val Gly Thr Ser Thr
85 90 95
Gly Met Ala Ala Ile Leu Ala Val Val Met Ser Leu Cys Ser Ala Gly
100 105 110
Asp His Val Leu Val Ser Gln Ser Val Phe Gly Ser Thr Ile Ser Leu
115 120 125
Phe Glu Lys Tyr Phe Lys Arg Phe Gly Val Gln Val Asp Tyr Val Pro
130 135 140
Leu Val Asp Leu Ala Gly Trp Glu Lys Ala Ile Lys Ala Asn Thr Arg
145 150 155 160
Leu Leu Ile Val Glu Ser Pro Ser Asn Pro Leu Ala Glu Leu Val Asp
165 170 175
Ile Thr Ala Leu Ser Glu Ile Ala His Ala His Gly Ala Met Leu Val
180 185 190
Val Asp Asn Cys Phe Ser Thr Pro Ala Leu Gln Gln Pro Leu Lys Leu
195 200 205
Gly Ala Asp Ile Val Phe His Ser Ala Thr Lys Phe Ile Asp Gly Gln
210 215 220
Gly Arg Cys Met Gly Gly Val Val Ala Gly Arg Ala Glu Gln Met Lys
225 230 235 240
Glu Val Val Gly Phe Leu Arg Thr Ala Gly Pro Thr Leu Ser Pro Phe
245 250 255
Asn Ala Trp Ile Phe Thr Lys Gly Leu Glu Thr Leu Arg Leu Arg Met
260 265 270
Arg Ala His Cys Glu Ser Ala Gln Ala Leu Ala Glu Trp Leu Glu Gln
275 280 285
Gln Asp Gly Val Glu Lys Val His Tyr Ala Gly Leu Pro Ser His Pro
290 295 300
Gln His Ala Leu Ala Lys Arg Gln Met Ser Gly Phe Gly Ala Val Val
305 310 315 320
Ser Phe Glu Val Lys Gly Gly Lys Glu Gly Ala Trp Arg Phe Ile Asp
325 330 335
Ala Thr Arg Val Ile Ser Ile Thr Thr Asn Leu Gly Asp Ser Lys Thr
340 345 350
Thr Ile Ala His Pro Ala Thr Thr Ser His Gly Arg Leu Ser Pro Gln
355 360 365
Glu Arg Glu Ala Ala Gly Ile Arg Asp Ser Leu Ile Arg Val Ala Val
370 375 380
Gly Leu Glu Asp Val Ala Asp Leu Gln Ala Asp Leu Ala Arg Gly Leu
385 390 395 400
Ala Ala Leu
<210>55
<211>425
<212>PRT
<213>Pseudomonas putida
<400>55
Met Lys Leu Glu Thr Leu Ala Ile His Ala Gly Phe Ser Pro Asp Pro
1 5 10 15
Thr Thr Lys Ala Val Ala Val Pro Ile Tyr Gln Thr Thr Ser Phe Ala
20 25 30
Phe Asp Asp Thr Gln His Gly Ala Asp Leu Phe Asp Leu Lys Val Ala
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Ser Arg Ile Met Asn Pro Thr Asn Asp Val Leu Glu
50 55 60
Gln Arg Met Ala Ala Leu Glu Gly Gly Val Gly Ala Leu Ala Val Ala
65 70 75 80
Ser Gly Met Ala Ala Ile Thr Tyr Ala Ile Gln Thr Val Ala Glu Ala
85 90 95
Gly Asp Asn Ile Val Ser Val Ala Lys Leu Tyr Gly Gly Thr Tyr Asn
100 105 110
Leu Leu Ala His Thr Leu Pro Arg Met Gly Ile His Thr Arg Phe Ala
115 120 125
Ala His Asp Asp Ile Ala Ala Leu Glu Ala Leu Ile Asp Ala Arg Thr
130 135 140
Lys Ala Val Phe Cys Glu Ser Ile Gly Asn Pro Ala Gly Asn Ile Val
145 150 155 160
Asp Ile Ala Ala Leu Ala Glu Ala Ala His Arg His Gly Val Pro Leu
165 170 175
Ile Val Asp Asn Thr Val Ala Thr Pro Val Leu Cys Arg Pro Phe Glu
180 185 190
His Gly Ala Asp Ile Val Val His Ser Leu Thr Lys Tyr Ile Gly Gly
195 200 205
His Gly Thr Ser Ile Gly Gly Ile Val Ile Asp Ser Gly Lys Phe Pro
210 215 220
Trp Ala Glu Asn Lys Glu Arg Phe Ala Leu Leu Asn Thr Pro Asp Pro
225 230 235 240
Ser Tyr His Gly Val Thr Tyr Thr Glu Ala Phe Gly Pro Ala Ala Phe
245 250 255
Ile Gly Arg Cys Arg Val Val Pro Leu Arg Asn Thr Gly Ala Ala Leu
260 265 270
Ser Pro Phe Asn Ala Phe Leu Ile Leu Gln Gly Leu Glu Thr Leu Ala
275 280 285
Leu Arg Met Glu Arg His Thr Glu Asn Ala Leu Lys Val Ala His Tyr
290 295 300
Leu Gln Ala His Glu Gln Val Ala Trp Val Lys Phe Ala Gly Leu Pro
305 310 315 320
Asp His Pro Glu His Ala Leu Ala Gln Arg Tyr Thr Gly Gly Lys Pro
325 330 335
Ala Ser Ile Leu Ser Phe Gly Ile Lys Gly Gly Gln Ala Ala Gly Ala
340 345 350
Arg Phe Ile Asp Ala Leu Gln Leu Val Val Arg Leu Val Asn Ile Gly
355 360 365
Asp Ala Lys Ser Leu Ala Cys His Pro Ala Ser Thr Thr His Arg Gln
370 375 380
Leu Asn Asp Asp Glu Leu Glu Lys Ala Gly Val Pro Arg Asp Met Val
385 390 395 400
Arg Leu Ser Ile Gly Ile Glu His Ser Asp Asp Ile Ile Ala Asp Leu
405 410 415
Ala Gln Ala Leu Glu Ala Ser Arg Gly
420 425
<210>56
<211>394
<212>PRT
<213>Chromobacterium violaceum
<400>56
Met Ala Ser Asp Ala Pro His Leu Pro Leu His Pro Glu Thr Leu Ala
1 5 10 15
Ile Arg Ala Gly Leu Glu Thr Ser Gln Phe Asn Glu His Ser Gln Gly
20 25 30
Leu Phe Leu Thr Ser Ser Phe Thr Tyr Glu Ser Ala Ala Gln Ala Ala
35 40 45
Ala Met Phe Leu Gly Glu Ile Asp Gly Tyr Thr Tyr Ser Arg Phe Thr
50 55 60
Asn Pro Thr Val Ala Ala Phe Gln His Arg Leu Ala Gln Met Glu Gly
65 70 75 80
Gly Glu Arg Ala Ile Ala Thr Ala Thr Gly Met Ala Ala Ile Gln Ala
85 90 95
Ile Met Met Thr Leu Leu Gln Ala Gly Asp His Ile Val Ser Ser Gln
100 105 110
Ser Leu Phe Gly Ser Thr Thr Asn Leu Phe Ala Asn Gln Leu Ala Lys
115 120 125
Phe Ala Val Ala Thr Asp Phe Val Asp Ala Arg Asp Leu Ser Ala Trp
130 135 140
Arg Glu Ala Leu Arg Pro Asn Thr Lys Leu Leu Phe Leu Glu Thr Pro
145 150 155 160
Ser Asn Pro Leu Thr Glu Val Ala Asp Ile Ala Ala Ile Ala Asp Ile
165 170 175
Ala His Ala His Gly Ala Leu Leu Val Val Asp Asn Ser Phe Cys Ser
180 185 190
Pro Ala Leu Gln Gln Pro Leu Lys Leu Gly Ala Asp Leu Val Met His
195 200 205
Ser Ala Thr Lys Phe Ile Asp Gly His Gly Arg Val Met Gly Gly Ala
210 215 220
Val Val Gly Ser Asp Lys Leu Val Glu Gln Val Tyr Leu His Val Arg
225 230 235 240
Ala Ala Gly Pro Ser Leu Ala Pro Phe Asn Ala Trp Thr Leu Leu Ser
245 250 255
Gly Leu Glu Thr Leu His Leu Arg Met Glu Lys His Ser Ala Asn Ala
260 265 270
Leu Glu Leu Ala Arg Trp Leu Glu Ala Gln Pro Asn Val Glu Arg Val
275 280 285
Tyr Tyr Pro Gly Leu Glu Ser His Pro Gln His Glu Leu Ala Leu Arg
290 295 300
Gln Gln Lys Ser Gly Gly Ala Val Val Ser Phe Val Val Lys Gly Gly
305 310 315 320
Arg Lys Ala Ala Trp Lys Val Val Asp Ala Val Arg ValIle Ser Arg
325 330 335
Thr Ala Asn Leu Gly Asp Val Lys Thr Thr Leu Thr His Pro Ala Ser
340 345 350
Thr Thr His Ala Arg Val Thr Gln Glu Ala Arg Glu Arg Ala Gly Ile
355 360 365
Val Glu Gly Leu Leu Arg Val Ser Val Gly Leu Glu Asn Val Arg Asp
370 375 380
Leu Gln Gln Asp Leu Leu Arg Gly Leu Asp
385 390
<210>57
<211>404
<212>PRT
<213>Nocardia farcinica
<400>57
Val Ile Thr Gly Gly Ala Phe Asp Lys Pro Leu Pro Glu Gly Val Gly
1 5 10 15
Pro Ala Thr Leu Gly Val Arg Gly Gly Leu Arg Arg Ser Gly Phe Glu
20 25 30
Glu Thr Ala Glu Ala Leu Tyr Leu Thr Ser Gly Phe Val Tyr Glu Ser
35 40 45
Ala Glu Ala Ala Glu Ala Ala Phe Thr Gly Glu Val Glu His Phe Val
50 55 60
Tyr Ser Arg Tyr Gly Asn Pro Thr Val Ala Met Phe Glu Glu Arg Ile
65 70 75 80
Arg Leu Met Asp Gly Ala Glu Ala Ala Phe Ala Thr Ala Ser Gly Met
85 90 95
Ser Ala Val Phe Thr Ala Leu Gly Ala Leu Leu Gly Ala Gly Asp Arg
100 105 110
Leu Val Ala Ala Arg Ser Leu Phe Gly Ser Cys Phe Val Val Cys Asn
115 120 125
Glu Ile Leu Pro Arg Trp Gly Val Glu Thr Val Phe Val Asp Gly Glu
130 135 140
Asp Leu Asp Gln Trp Glu Arg Ala Leu Ser Val Pro Thr Ala Ala Val
145 150 155 160
Phe Phe Glu Thr Pro Ala Asn Pro Met Gln Thr Leu Val Asp Val Arg
165 170 175
Arg Val Thr Glu Leu Ala His Ala Ala Gly Ala Lys Val Val Leu Asp
180 185 190
Asn Val Phe Ala Thr Pro Leu Leu Gln Lys Gly Phe Asp Leu Gly Ala
195 200 205
Asp Val Val Val Tyr Ser Gly Thr Lys His Ile Asp Gly Gln Gly Arg
210 215 220
Val Leu Gly Gly Ala Ile Leu Gly Asp Arg Glu Tyr Ile Asp Gly Pro
225 230 235 240
Val Lys Thr Leu Met Arg His Thr Gly Pro Ala Leu Ser Pro Phe Asn
245 250 255
Ala Trp Thr Leu Leu Lys Gly Leu Glu Thr Met Pro Leu Arg Val Arg
260 265 270
His Ser Thr Glu Ser Ala Leu Arg Ile Ala Arg Phe Leu Glu Ser Asn
275 280 285
Pro Ala Val Ser Trp Val Lys Tyr Pro Phe Leu Glu Ser His Pro Gln
290 295 300
Tyr Asp Leu Ala Arg Ala Gln Met Ser Gly Gly Gly Thr Val Val Thr
305 310 315 320
Phe Glu Leu Lys Ala Ala Glu Gly Glu Ala Lys Lys Arg Ala Phe Glu
325 330 335
Val Leu Asp Arg Leu Arg Ile Ile Asp Ile Ser Asn Asn Leu Gly Asp
340 345 350
Ala Lys Thr Leu Ile Thr His Pro Ala Thr Thr Thr His Arg Ala Met
355 360 365
Gly Pro Glu Gly Arg Ala Gly Ile Gly Leu Thr Asp Gly Val Val Arg
370 375 380
Ile Ser Val Gly Leu Glu Asp Val Asp Asp Leu Leu Ser Asp Leu Glu
385 390 395 400
His Ala Leu Ser
<210>58
<211>417
<212>PRT
<213>Bradyrhizobium Japonicum
<400>58
Val Asp Ile Ser Arg Pro Val Phe Phe Val Thr Val Phe Asp Glu Thr
1 5 10 15
Val Met Ser Glu Val Pro Met Ser Lys Ser Pro Ala Thr Tyr Arg Pro
20 25 30
Glu Thr Arg Leu Val His Ser Gly Thr Leu Arg Ser Gln Phe Gly Glu
35 40 45
Thr Ser Glu Ala Leu Phe Leu Thr Gln Gly Tyr Val Tyr Asn Ser Ala
50 55 60
Glu Glu Cys Glu Ala Arg Phe Lys Gly Glu Asp Pro Gly Phe Ile Tyr
65 70 75 80
Ser Arg Tyr Ser Asn Pro Thr Ile Ser Met Phe Glu Arg Arg Met Ile
85 90 95
Glu Leu Glu Gly Ala Glu Ala Ala Arg Ser Ala Ala Thr Gly Met Ala
100 105 110
Ala Val Thr Thr Ala Ile Leu Ala Pro Leu Lys Thr Gly Asp His Val
115 120 125
Val Ala Ser Arg Ala Leu Phe Gly Ser Cys Leu Tyr Val Ile Gln Asp
130 135 140
Leu Leu Pro Arg Tyr Gly Ile Glu Thr Thr Leu Val Asp Gly Leu Asp
145 150 155 160
Leu Asp Gln Trp Gln Arg Ala Leu Arg Pro Asn Thr Lys Thr Phe Phe
165 170 175
Leu Glu Ser Pro Thr Asn Pro Thr Leu Asp Val Leu Asp Ile Pro Gly
180 185 190
Ile Ala Glu Ile Ala His Lys Gly Gly Ala Arg Leu Val Val Asp Asn
195 200 205
Val Phe Ala Thr Pro Ile Trp Gln Ser Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp
210 215 220
Val Val Val Tyr Ser Ala Thr Lys His Ile Asp Gly Gln Gly Arg Cys
225 230 235 240
Leu Gly Gly Ile Ile Leu Ser Ser Glu Ala Phe Val Ala Glu His Leu
245 250 255
His Asn Phe Met Arg Gln Thr Gly Pro Ser Ile Ser Pro Phe Asn Ala
260 265 270
Trp Val Leu Leu Lys Gly Leu Glu Thr Leu Ala Val Arg Val Arg Ala
275 280 285
Gln Thr Asp Thr Ala Ala Ser Val Ala Glu Val Leu Ala Gly His Pro
290 295 300
Lys Ile Ser Arg Leu Ile Tyr Pro Gly Arg Ala Asp His Pro Gln Ala
305 310 315 320
Ala Leu Val Lys Lys Gln Met Arg Gly Gly Ser Thr Leu Val Gly Phe
325 330 335
Glu Val Lys Gly Gly Lys Ala Ala Ala Phe Arg Val Leu Asn Glu Leu
340 345 350
Lys Leu Ala Lys Ile Ser Asn Asn Leu Gly Asp Ala Lys Ser Leu Val
355 360 365
Thr His Pro Ala Thr Thr Thr His Gln Arg Leu Lys Pro Glu Asp Arg
370 375 380
Ala Ala Leu Gly Ile Ser Glu Gly Phe Ile Arg Phe Ser Ala Gly Leu
385 390 395 400
Glu His Ala Asp Asp Leu Ile Glu Asp Leu Thr Ala Ala Leu Glu Lys
405 410 415
Ala
<210>59
<211>399
<212>PRT
<213>Hyphomonas Neptunium
<400>59
Met Ala Asp Ala Pro Gly Gly Asp Lys Lys Gly Trp Lys Pro Ala Thr
1 5 10 15
Gln Ala Val Arg Gly Gly Leu Met Arg Ser Gln His Gly Glu Ile Ser
20 25 30
Glu Ala Leu Tyr Leu Thr Ser Gly Tyr Ala Tyr Asp Ser Ala Glu Gln
35 40 45
Ala Met Arg Arg Met Ala Gly Glu Glu Glu Gly Phe Val Tyr Ser Arg
50 55 60
Tyr Gly Ser Pro Thr Asn Glu Met Leu Gln Gln Arg Leu Ala Leu Ile
65 70 75 80
Glu Gly Ala Glu Ala Cys Arg Val Thr Gly Ser Gly Met Gly Ala Ile
85 90 95
Ser Ser Ala Ile Leu Ala Pro Leu Lys Ala Gly Asp Arg Val Val Ala
100 105 110
Ala Thr Ala Leu Phe Gly Ser Cys Arg Trp Ile Ile Ala Asn Gln Met
115 120 125
Pro Lys Phe Gly Ile Glu Ala Val Phe Val Asp Gly Ala Asp Leu Asp
130 135 140
Ala Trp Lys Arg Glu Ile Asp Lys Gly Cys Gln Leu Val Leu Ile Glu
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asn Pro Leu Leu Asp Gly Val Asp Ile Glu Ala Val Ala
165 170 175
Arg Leu Ala Lys Ala Ala Gly Ala Leu Leu Val Val Asp Asn Val Phe
180 185 190
Ala Thr Pro Val Leu Gln Arg Pro Leu Glu Met Gly Ala Asp Val Ile
195 200 205
Ala Tyr Ser Ala Thr Lys His Met Asp Gly Gln Gly Arg Val Leu Leu
210 215 220
Gly Ala Ile Leu Thr Asp Ala Lys Arg Met Ser Asp Val Tyr Asp Pro
225 230 235 240
Trp Leu Arg His Met Gly Pro Ala Ala Ser Pro Phe Asn Ala Trp Val
245 250 255
Val Leu Lys Gly Leu Glu Thr Met Gln Leu Arg Val Glu Ala Gln Ser
260 265 270
Arg Thr Ala Ala Arg Leu Ala Asp Val Leu Ala Asp His Pro Ala Val
275 280 285
Asn Ala Val Arg Tyr Pro His Arg Lys Asp His Pro His Tyr Glu Val
290 295 300
His Lys Arg Gln Met Lys Ser Gly Gly Thr Leu Leu Ala Leu Ser Leu
305 310 315 320
Lys Gly Gly Gln Asp Ala Ala Phe Arg Phe Leu Asn Gly Leu Gln Leu
325 330 335
Val Asp Ile Cys Asn Asn Leu Gly Asp Thr Lys Ser Leu Ala Cys His
340 345 350
Pro Ser Thr Thr Thr His Arg Ala Leu Ser Asp Glu Asp Gln Ala Ala
355 360 365
Met Gly Leu Asp Arg Ser Trp Val Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp
370 375 380
Ala Asp Asp Leu Glu Ala Asp Leu Leu Ala Ser Leu Asn Ser Leu
385 390 395
<210>60
<211>383
<212>PRT
<213>Methylococcus Capsulatus
<400>60
Met Glu Thr Arg Ala Val Arg Ala Gly Gln Arg Arg Thr Met Glu Gln
1 5 10 15
Glu His Ala Glu Pro Ile Phe Ala Thr Ser Ser Tyr Val Phe Ala Ser
20 25 30
Ala Ala Glu Ala Ala Glu Arg Phe Ala Gly Lys Ala Ala Gly Asn Ile
35 40 45
Tyr Ser Arg Phe Thr Asn Pro Thr Val Arg Thr Phe Glu Glu Arg Leu
50 55 60
Ala Ala Leu Glu Gly Gly Glu Arg Cys Val Ala Val Gly Ser Gly Met
65 70 75 80
Ala Ala Ile Ala Ser Thr Ala Phe Gly Leu Leu Lys Ala Gly Asp His
85 90 95
Val Val Cys Ser Arg Ser Val Phe Gly Asn Thr Thr Leu Leu Phe Gln
100 105 110
Asn Tyr Leu Ala Lys Phe Gly Val Pro Thr Thr Phe Val Gly Leu Thr
115 120 125
Asp Tyr Asp Gly Trp Ala Ala Ala Ile Arg Pro Glu Thr Arg Phe Leu
130 135 140
Phe Ile Glu Thr Pro Ser Asn Pro Leu Thr Glu Ile Ala Asp Ile Pro
145 150 155 160
Arg Leu Ala Glu Ile Ala His Ser Arg Gly Cys Leu Leu Val Val Asp
165 170 175
Asn Cys Phe Cys Thr Pro Ala Leu Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala
180 185 190
Asp Ile Val Ile His Ser Ala Thr Lys Tyr Leu Asp Gly Gln Gly Arg
195 200 205
Cys Val Gly Gly Ala Ile Val Gly Gly Arg Glu Leu Leu Asp Ala Glu
210 215 220
Ile Tyr Pro Phe Leu Arg Thr Gly Gly Pro Ser Met Ser Pro Phe Asn
225 230 235 240
Ala Trp Val Phe Leu Lys Gly Leu Glu Thr Leu Asn Leu Arg Met Lys
245 250 255
Ala His Cys Glu Asn Ala Leu Gly Leu Ala Arg Trp Leu Glu Ala Gln
260 265 270
Pro Trp Val Glu Arg Val His Tyr Pro Gly Leu Ala Ser His Pro Gln
275 280 285
His Glu Leu Ala Ala Arg Gln Gln Ser Gly Phe Gly Gly Ile Val Ser
290 295 300
Phe Glu Val Lys Gly Gly Gln Glu Ala Ala Trp Arg Leu Ile Asp Ser
305 310 315 320
Thr Arg Leu Leu Ser Ile Thr Gly Asn Leu Gly Asp Ala Lys Thr Thr
325 330 335
Ile Thr His Pro Ala Thr Thr Thr His Gly Arg Leu Ser Pro Glu Ala
340 345 350
Arg Ala Ala Ala Gly Ile Ala Asp Gly Leu Ile Arg Ile Ala Val Gly
355 360 365
Leu Glu Asn Leu Ala Asp Ile Gln Ala Asp Leu Ala Arg Phe Ala
370 375 380
<210>61
<211>392
<212>PRT
<213>Methylobacillus Flagellatus
<400>61
Met Ser Gln His Glu Trp His Ala Glu Thr Leu Gly Val Arg Ala Gly
1 5 10 15
Ser Glu His Thr Pro Phe Gly Glu Asn Ser Glu Ala Met Phe Leu Thr
20 25 30
Ser Ser Phe Val Phe Glu Asn Ala Ala Gln Ala Ala Ala Arg Phe Gly
35 40 45
Gly Gln Glu Pro Gly Asn Ile Tyr Ser Arg Phe Thr Asn Pro Thr Val
50 55 60
Ser Met Phe Gln Asn Lys Leu Ala Ala Leu Glu Gly Ala Glu Phe Cys
65 70 75 80
Val Ala Thr Ser Ser Gly Met Ser Ala Ile Leu Ala Cys Val Met Gly
85 90 95
Val Cys Ser Ala Gly Asp His Val Val Ala Ser Arg Ser Ile Phe Gly
100 105 110
Thr Ser Val Gln Leu Phe Ser Asn Ile Leu Lys Arg Trp Gly Leu Glu
115 120 125
Thr Thr Phe Val Gln Leu Ser Asp Pro Glu Ala Trp Thr Ala Ala Val
130 135 140
Lys Pro Asn Thr Lys Leu Phe Phe Leu Glu Thr Pro Ser Asn Pro Leu
145 150 155 160
Thr Glu Ile Cys Asp Ile Ala Val Val Ala Glu Ile Ala His Gln Ala
165 170 175
Gly Ala Leu Leu Ala Val Asp Asn Cys Phe Cys Thr Pro Ala Leu Gln
180 185 190
Lys Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Val Val His Ser Ala Thr Lys
195 200 205
Tyr Ile Asp Gly Gln Gly Arg Cys Leu Gly Gly Ala Val Leu Gly Arg
210 215 220
Lys Asp Val Leu Glu Pro Val Tyr Gly Phe Leu Arg Thr Ala Gly Pro
225 230 235 240
Thr Met Ser Ala Phe Asn Ala Trp Val Phe Leu Lys Gly Leu Glu Thr
245 250 255
Leu His Leu Arg Met Glu Ala His Ala Arg Asn Ala Leu Ala Leu Ala
260 265 270
Gln Trp Leu Glu Gln Gln Pro Arg Val Glu Arg Val Tyr Tyr Pro Gly
275 280 285
Leu Pro Ser His Pro Gln Tyr Ala Leu Ala Gln Lys Gln Gln Lys Ser
290 295 300
Gly Gly Ala Ile Val Ser Phe Asp Val Lys Gly Gly Gln Pro Ala Ala
305 310 315 320
Trp His Leu Ile Asp Ala Thr Arg Met Leu Ser Ile Thr Ala Asn Leu
325 330 335
Gly Asp Ala Lys Ser Thr Ile Thr His Pro Ala Thr Thr Thr His Ser
340 345 350
Arg Val Ser Ala Glu Ala Arg Ala Ala Ala Gly Ile Gly Asp Gly Leu
355 360 365
Val Arg Ile Ala Val Gly Leu Glu His Ile Asp Asp Ile Lys Ala Asp
370 375 380
Leu Ala Trp Leu Gly His Gln Asp
385 390
<210>62
<211>391
<212>PRT
<213>Nitrosomonas Europaea
<400>62
Met Thr Asn Asp Leu Asp Pro Glu Thr Leu Ala Ile His Thr Gly Val
1 5 10 15
His Arg Ser Gln Phe Asn Glu His Ser Glu Ser Leu Tyr Leu Thr Ser
20 25 30
Ser Phe Val Phe Asp Ser Ala Ala Gln Ala Ala Ala Arg Phe Ser Gly
35 40 45
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50 55 60
Ala Met Gln Glu Arg Leu Ala Val Leu Glu Gly Ala Glu Ala Cys Ile
65 70 75 80
Ala Thr Ala Ser Gly Met Ser Ala Ile Leu Thr Cys Val Met Gly Leu
85 90 95
Leu Ser Ala Gly Asp His Ile Val Ala Ser Arg Ser Leu Phe Gly Ser
100 105 110
Thr Val Ser Leu Phe Asn Asn Ile Leu Ser Arg Phe Gly Ile Gln Thr
115 120 125
Thr Phe Val Ser Ala Thr Asp Pro Ala Glu Trp Gln Ala Ala Val Arg
130 135 140
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145 150 155 160
Glu Ile Ser Asp Ile Ala Ala Leu Ala Glu Ile Ala Lys Arg Ala Gly
165 170 175
Val Trp Leu Ala Val Asp Asn Cys Phe Cys Thr Pro Ile Ile Gln Gln
180 185 190
Pro Leu Lys Leu Gly Ala Asp Leu Val Ile His Ser Ala Thr Lys Tyr
195 200 205
Leu Asp Gly Gln Gly Arg Val Leu Gly Gly Ala Ile Leu Gly Lys Arg
210 215 220
Asp Leu Leu Met Asp Ser Gly Ile Phe Ser Phe Leu Arg Thr Ala Gly
225 230 235 240
Pro Ser Leu Ser Ala Phe Asn Ala Trp Ile Ile Leu Lys Gly Met Glu
245 250 255
Thr Leu Ser Leu Arg Val Lys Ala His Ser Asp His Ala Leu Glu Val
260 265 270
Ala Arg Trp Leu Glu Thr His Pro Arg Val Gly Arg Val Phe Tyr Pro
275 280 285
Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Ala Met Arg Gln Gln Lys
290 295 300
Thr Gly Gly Gly Ile Val Ser Phe Glu Val Lys Gly Gly Arg Glu Ala
305 310 315 320
Ala Trp Arg Val Val Asp Ala Ala Arg Leu Met Ser Ile Thr Ala Asn
325 330 335
Leu Gly Asp Thr Lys Ser Thr Leu Thr His Pro Ala Thr Thr Thr His
340 345 350
Gly Arg Ile Ser Gln Glu Ala Arg Glu Ala Ala Gly Ile Arg Asp Gly
355 360 365
Leu Leu Arg Ile Ala Val Gly Leu Glu Ser Pro Asp Asp Leu Lys Ala
370 375 380
Asp Leu Ala Arg Gly Leu Gln
385 390
<210>63
<211>386
<212>PRT
<213>Klesiella Pneumoniae
<400>63
Met Thr Arg Lys Gln Ala Thr Ile Ala Val Arg Ser Gly Leu Asn Asp
1 5 10 15
Asp Glu Gln Tyr Gly Cys Val Val Pro Pro Ile His Leu Ser Ser Thr
20 25 30
Tyr Asn Phe Thr Gly Phe Asn Glu Pro Arg Ala His Asp Tyr Ser Arg
35 40 45
Arg Gly Asn Pro Thr Arg Asp Val Val Gln Arg Ala Leu Ala Glu Leu
50 55 60
Glu Gly Gly Ala Gly Ala Val Leu Thr Asn Thr Gly Met Ser Ala Ile
65 70 75 80
Leu Leu Val Thr Thr Val Phe Leu Lys Pro Gly Asp Leu Leu Val Ala
85 90 95
Pro His Asp Cys Tyr Gly Gly Ser Tyr Arg Leu Phe Asp Ser Leu Ala
100 105 110
Lys Arg Gly Cys Tyr Arg Val Gln Phe Val Asp Gln Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Ala Leu Arg Ala Ala Leu Ala Glu Lys Pro Lys Leu Val Leu Val Glu
130 135 140
Ser Pro Ser Asn Pro Leu Leu Arg Val Val Asp Ile Ala Lys Ile Cys
145 150 155 160
Gly Leu Ala Arg Glu Ala Gly Ala Ile Ser Val Val Asp Asn Thr Phe
165 170 175
Leu Ser Pro Ala Leu Gln Asn Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Leu Val
180 185 190
Leu His Ser Cys Thr Lys Tyr Leu Asn Gly His Ser Asp Val Val Ala
195 200 205
Gly Val Val Ile Ala Lys Asp Pro Thr Thr Val Thr Glu Leu Ala Trp
210 215 220
Trp Ala Asn Asn Ile Gly Val Thr Gly Ser Ala Phe Asp Ser Tyr Leu
225 230 235 240
Leu Leu Arg Gly Leu Arg Thr Leu Ser Pro Arg Met Glu Val Ala Gln
245 250 255
Arg Asn Ala Leu Ala Ile Val Glu Tyr Leu Lys Thr Gln Pro Leu Val
260 265 270
Lys Lys Leu Tyr His Pro Ser Leu Pro Glu Asn Gln Gly His Glu Ile
275 280 285
Ala Ala Arg Gln Gln Lys Gly Phe Gly Ala Met Leu Ser Phe Glu Leu
290 295 300
Asp Gly Asp Glu Gln Thr Leu Arg Arg Phe Leu Ser Gly Leu Ser Leu
305 310 315 320
Phe Thr Leu Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Leu Ile Ser His
325 330 335
Ala Ala Thr Met Thr His Ala Gly Met Ala Pro Glu Ala Arg Ala Ala
340 345 350
Ala Gly Ile Ser Glu Thr Leu Leu Arg Ile Ser Thr Gly Ile Glu Asp
355 360 365
Gly Glu Asp Leu Ile Ala Asp Leu Glu Asn Gly Phe Arg Ala Ala Asn
370 375 380
Glu Glu
385
<210>64
<211>373
<212>PRT
<213>Bacillus Subtilis
<400>64
Met Ser Gln His Val Glu Thr Lys Leu Ala Gln Ile Gly Asn Arg Ser
1 5 10 15
Asp Glu Val Thr Gly Thr Val Ser Ala Pro Ile Tyr Leu Ser Thr Ala
20 25 30
Tyr Arg His Arg Gly Ile Gly Glu Ser Thr Gly Phe Asp Tyr Val Arg
35 40 45
Thr Lys Asn Pro Thr Arg Gln Leu Val Glu Asp Ala Ile Ala Asn Leu
50 55 60
Glu Asn Gly Ala Arg Gly Leu Ala Phe Ser Ser Gly Met Ala Ala Ile
65 70 75 80
Gln Thr Ile Met Ala Leu Phe Lys Ser Gly Asp Glu Leu Ile Val Ser
85 90 95
Ser Asp Leu Tyr Gly Gly Thr Tyr Arg Leu Phe Glu Asn Glu Trp Lys
100 105 110
Lys Tyr Gly Leu Thr Phe His Tyr Asp Asp Phe Ser Asp Glu Asp Cys
115 120 125
Leu Arg Ser Lys Ile Thr Pro Asn Thr Lys Ala Val Phe Val Glu Thr
130 135 140
Pro Thr Asn Pro Leu Met Gln Glu Ala Asp Ile Glu His Ile Ala Arg
145 150 155 160
Ile Thr Lys Glu His Gly Leu Leu Leu Ile Val Asp Asn Thr Phe Tyr
165 170 175
Thr Pro Val Leu Gln Arg Pro Leu Glu Leu Gly Ala Asp Ile Val Ile
180 185 190
His Ser Ala Thr Lys Tyr Leu Gly Gly His Asn Asp Leu Leu Ala Gly
195 200 205
Leu Val Val Val Lys Asp Glu Arg Leu Gly Glu Glu Met Phe Gln His
210 215 220
Gln Asn Ala Ile Gly Ala Val Leu Pro Pro Phe Asp Ser Trp Leu Leu
225 230 235 240
Met Arg Gly Met Lys Thr Leu Ser Leu Arg Met Arg Gln His Gln Ala
245 250 255
Asn Ala Gln Glu Leu Ala Ala Phe Leu Glu Glu Gln Glu Glu Ile Ser
260 265 270
Asp Val Leu Tyr Pro Gly Lys Gly Gly Met Leu Ser Phe Arg Leu Gln
275 280 285
Lys Glu Glu Trp Val Asn Pro Phe Leu Lys Ala Leu Lys Thr Ile Cys
290 295 300
Phe Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Phe Ile Thr Tyr Pro Ala
305 310 315 320
Thr Gln Thr His Met Asp Ile Pro Glu Glu Ile Arg Ile Ala Asn Gly
325 330 335
Val Cys Asn Arg Leu Leu Arg Phe Ser Val Gly Ile Glu His Ala Glu
340 345 350
Asp Leu Lys Glu Asp Leu Lys Gln Ala Leu Cys Gln Val Lys Glu Gly
355 360 365
Ala Val Ser Phe Glu
370
<210>65
<211>386
<212>PRT
<213>Shigella flexneri 2457T
<400>65
Met Thr Arg Lys Gln Ala Thr Ile Ala Val Arg Ser Gly Leu Asn Asp
1 5 10 15
Asp Glu Gln Tyr Gly Cys Val Val Pro Pro Ile His Leu Ser Ser Thr
20 25 30
Tyr Asn Phe Thr Gly Phe Asn Glu Pro Arg Ala His Asp Tyr Ser Arg
35 40 45
Arg Gly Asn Pro Thr Arg Asp Val Val Gln Arg Ala Leu Ala Glu Leu
50 55 60
Glu Gly Gly Ala Gly Ala Val Leu Thr Asn Thr Gly Met Ser Ala Ile
65 70 75 80
His Leu Val Thr Thr Val Phe Leu Lys Pro Gly Asp Leu Leu Val Ala
85 90 95
Pro His Asp Cys Tyr Gly Gly Ser Tyr Arg Leu Phe Asp Ser Leu Ala
100 105 110
Lys Arg Gly Cys Tyr Arg Val Leu Phe Val Asp Gln Gly Asp Glu Gln
115 120 125
Ala Leu Arg Ala Ala Leu Ala Glu Lys Pro Lys Leu Val Leu Val Glu
130 135 140
Ser Pro Ser Asn Pro Leu Leu Arg Val Val Asp Ile Ala Lys Ile Cys
145 150 155 160
His Leu Ala Arg Glu Val Gly Ala Val Ser Val Val Asp Asn Thr Phe
165 170 175
Leu Ser Pro Ala Leu Gln Asn Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Leu Val
180 185 190
Leu His Ser Cys Thr Lys Tyr Leu Asn Gly His Ser Asp Val Val Ala
195 200 205
Gly Val Val Ile Ala Lys Asp Pro Asp Val Val Thr Glu Leu Ala Trp
210 215 220
Trp Ala Asn Asn Ile Gly Val Thr Gly Gly Ala Phe Asp Ser Tyr Leu
225 230 235 240
Leu Leu Arg Gly Leu Arg Thr Leu Val Pro Arg Met Glu Leu Ala Gln
245 250 255
Arg Asn Ala Gln Ala Ile Val Lys Tyr Leu Gln Thr Gln Pro Leu Val
260 265 270
Lys Lys Leu Tyr His Pro Ser Leu Pro Glu Asn Gln Gly His Glu Ile
275 280 285
Ala Ala Arg Gln Gln Lys Gly Phe Gly Ala Met Leu Ser Phe Glu Leu
290 295 300
Asp Gly Asp Glu Gln Thr Leu Cys Arg Phe Leu Gly Gly Leu Ser Leu
305 310 315 320
Phe Thr Leu Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Leu Ile Ser His
325 330 335
Ala Ala Thr Met Thr His Ala Gly Met Ala Pro Glu Ala Arg Ala Ala
340 345 350
Ala Gly Ile Ser Glu Thr Leu Leu Arg Ile Ser Thr Gly Ile Glu Asp
355 360 365
Gly Glu Asp Leu Ile Ala Asp Leu Glu Asn Gly Phe Arg Ala Ala Asn
370 375 380
Lys Gly
385
<210>66
<211>388
<212>PRT
<213>Colwellia Psychrerythraea
<400>66
Met Ser Ile Thr Lys Lys Gly Asn Ile Thr Thr Ser Ala Val Arg Ala
1 5 10 15
Gly Ile Asn Thr Asp Gln Gln His Gly Ala Val Val Ala Pro Ile Tyr
20 25 30
Leu Ser Ser Thr Tyr Ser Leu Lys Gly Phe Asn Asn Lys Arg Gln Phe
35 40 45
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50 55 60
Ile Ala Glu Leu Glu Gln Gly Ser Val Gly Ile Val Thr Ser Thr Gly
65 70 75 80
Met Ala Ala Val His Leu Ile Cys Gln Leu Leu Ser Thr Gln Asp Thr
85 90 95
Val Val Ile Pro His Asp Cys Tyr Gly Gly Ser Phe Arg Leu Phe Thr
100 105 110
His Leu Ala Lys Arg Gly Gln Phe Lys Leu Ile Val Val Asp Gln Asn
115 120 125
Asp Gln Gln Ala Leu Asp Asn Ala Leu Ala His Lys Pro Lys Leu Val
130 135 140
Leu Leu Glu Ser Pro Ser Asn Pro Leu Leu Arg Leu Val Asp Ile Glu
145 150 155 160
Val Val Thr Lys Ala Cys His Ala Val Gly Ala Leu Val Ala Val Asp
165 170 175
Asn Thr Phe Leu Ser Pro Ala Leu Gln Gln Pro Leu Thr Leu Gly Ala
180 185 190
Asp Ile Val Phe His Ser Thr Thr Lys Tyr Ile Asn Gly His Ser Asp
195 200 205
Val Val Gly Gly Val Val Val Ala Lys Thr Glu Glu Leu Gly Glu Gln
210 215 220
Leu Ala Trp Trp Ala Asn Cys Ile Gly Ile Thr Gly Ser Ala Phe Asp
225 230 235 240
Ser Phe Leu Ala Leu Arg Gly Leu Lys Thr Leu Pro Val Arg Met Lys
245 250 255
Gln His Gln Glu Asn Ala Leu Arg Val Ala Asp Phe Leu Lys Asn His
260 265 270
Asp Ala Ile Asp Ala Ile Tyr Phe Pro Gly Phe Pro Glu His Thr Gly
275 280 285
His His Ile Ala Lys Lys Gln Gln Tyr Gly Phe Gly Ala Met Leu Ser
290 295 300
Phe Glu Ile Lys Gly Asp Val Glu Ala Val Lys Lys Leu Phe Glu Asn
305 310 315 320
Leu Glu Leu Phe Thr Leu Ala Gln Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Leu
325 330 335
Ile Ser His Pro Ser Thr Met Thr His Ala Gly Met Thr Ile Pro Asp
340 345 350
Gln Leu Glu Ala Gly Ile Thr Gln Ser Leu Val Arg Ile Ser Val Gly
355 360 365
Ile Glu Asp Ile Asp Asp Ile Leu Ala Asp Leu Ala His Gly Leu Thr
370 375 380
Gln Ser Gln Leu
385
<210>67
<211>386
<212>PRT
<213>Salmonella enterica serovar Paratyphi A
<400>67
Met Thr Arg Lys Gln Ala Thr Ile Ala Val Arg Ser Gly Leu Asn Asp
1 5 10 15
Asp Glu Gln Tyr Gly Cys Val Val Pro Pro Ile His Leu Ser Ser Thr
20 25 30
Tyr Asn Phe Thr Gly Phe Asn Glu Pro Arg Ala His Asp Tyr Ser Arg
35 40 45
Arg Gly Asn Pro Thr Arg Asp Val Val Gln Arg Ala Leu Ala Glu Leu
50 55 60
Glu Gly Gly Ala Gly Ala Val Leu Thr Asn Thr Gly Met Ser Ala Ile
65 70 75 80
His Leu Val Thr Thr Val Phe Leu Lys Pro Gly Asp Leu Leu Val Ala
85 90 95
Pro His Asp Cys Tyr Gly Gly Ser Tyr Arg Leu Phe Asp Ser Leu Ala
100 105 110
Thr Arg Gly Cys Tyr Cys Val Arg Phe Val Asp Gln Gly Asp Glu Arg
115 120 125
Ala Leu Gln Ala Ala Leu Glu Glu Lys Pro Lys Leu Val Leu Val Glu
130 135 140
Ser Pro Ser Asn Pro Leu Leu Arg Val Val Asp Ile Ala Lys Ile Cys
145 150 155 160
Arg Leu Ala Arg Glu Ala Gly Ala Val Ser Val Val Asp Asn Thr Phe
165 170 175
Leu Ser Pro Ala Leu Gln Asn Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Leu Val
180 185 190
Leu His Ser Cys Thr Lys Tyr Leu Asn Gly His Ser Asp Val Val Ala
195 200 205
Gly Val Val Ile Ala Lys Asp Pro Glu Val Val Thr Glu Leu Ala Trp
210 215 220
Trp Ala Asn Asn Ile Gly Val Thr Gly Gly Ala Phe Asp Ser Tyr Leu
225 230 235 240
Leu Leu Arg Gly Leu Arg Thr Leu Val Pro Arg Met Glu Leu Ala Gln
245 250 255
Arg Asn Ala Gln Ala Ile Val Lys Tyr Leu Gln Thr Gln Pro Leu Val
260 265 270
Lys Lys Leu Tyr His Pro Ser Leu Pro Glu Asn Gln Gly His Glu Ile
275 280 285
Ala Ala Arg Gln Gln Lys Gly Phe Gly Ala Met Leu Ser Phe Glu Leu
290 295 300
Asp Gly Asp Glu Glu Thr Leu Arg Arg Phe Leu Gly Gly Leu Ser Leu
305 310 315 320
Phe Thr Leu Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Leu Ile Ser His
325 330 335
Ala Ala Thr Met Thr His Ala Gly Met Ser Pro Gln Ala Arg Ala Ala
340 345 350
Ala Gly Ile Ser Glu Thr Leu Leu Arg Ile Ser Thr Gly Ile Glu Asp
355 360 365
Gly Glu Asp Leu Ile Ala Asp Leu Gly Asn Gly Phe Arg Ala Ala Asn
370 375 380
Lys Gly
385
<210>68
<211>20
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<400>68
catatgccca ccctcgcgcc 20
<210>69
<211>25
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<400>69
aagcttttag atgtagaact cgatg 25
<210>70
<211>70
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>70
caatttcttg cgtgaagaaa acgtctttgt gatgacaact tctcgtgcgt gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210>71
<211>70
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>71
aatccagcgt tggattcatg tgccgtagat cgtatggcgt gatctggtag catatgaata 60
tcctccttag 70
Claims (53)
1.一种生产L-蛋氨酸和有机酸的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)制备L-蛋氨酸前体产生菌株和通过发酵该菌株产生L-蛋氨酸前体；和
2)采用该L-蛋氨酸前体作为底物，在存在转移酶的情况下通过酶反应产生L-蛋氨酸和有机酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该L-蛋氨酸前体是由公式1取代的O-酰基高丝氨酸；
[公式I]
其中，
R基是含有C，H，O，N的物质和其它最多带有15个碳原子的化合物。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该L-蛋氨酸前体是O-乙酰基高丝氨酸或O-琥珀酰高丝氨酸。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中的L-蛋氨酸前体产生菌株是选自埃希氏菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、普罗威登斯菌属、棒状杆菌属、假单胞菌属、螺旋体菌属、沙门氏菌属、短杆菌属、Hypomononas sp.、色素杆菌属和诺卡氏菌属或真菌或酵母组成的组。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中的L-蛋氨酸前体产生菌株是衍生自L-苏氨酸、L-异亮氨酸或L-赖氨酸产生菌株。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中的L-蛋氨酸前体产生菌株是衍生自L-苏氨酸产生菌株。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，该L-苏氨酸产生菌株选自埃希氏菌属或棒状杆菌属。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中的L-蛋氨酸前体产生菌株是大肠杆菌。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该L-蛋氨酸前体产生菌株的制备是通过删除或敲除包含在L-蛋氨酸前体降解中的胱硫醚伽马合酶或O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶的活性实现。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，该胱硫醚伽马合酶或O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶分别被metB或metZ或metY或它们的突变基因编码。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中的L-蛋氨酸前体产生菌株，使用生物合成渠道中苏氨酸、异亮氨酸或赖氨酸受到敲除或删除的菌株。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，该菌株其特征在于删除或敲除包含在苏氨酸生物合成渠道中的高丝氨酸激酶。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，基因编码该高丝氨酸激酶的是thrB。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中的L-蛋氨酸前体产生菌株的特征在于所用的菌株其由高丝氨酸合成L-蛋氨酸前体渠道被提高。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，该菌株是通过提高从高丝氨酸到包含在L-蛋氨酸前体合成渠道中高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶或高丝氨酸O-乙酰基转移酶的表达或活性来制备的。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，该L-蛋氨酸前体的合成通过metA基因编码高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶或metX基因编码高丝氨酸O-乙酰基转移酶的过表达提高。
17.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，该L-蛋氨酸前体的合成是通过分离自反馈调节系统的高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶或高丝氨酸O-乙酰基转移酶的诱导提高。
18.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，该L-蛋氨酸前体的合成是通过删除或敲除包含在L-蛋氨酸前体合成基因中的调节基因来提高。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，包含在L-蛋氨酸前体合成基因的转录中的调节基因是metJ。
20.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，微生物菌株的该可靠的高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶被删除或敲除，然后新的外部或可靠的高丝氨酸O-乙酰基转移酶被诱导或提高，目的是在合成中提高O-乙酰基高丝氨酸，该L-蛋氨酸前体。
21.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，微生物菌株的该可靠的高丝氨酸O-乙酰基转移酶被删除或敲除，然后新的外部或可靠的高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶被诱导或提高，目的是在合成中提高O-琥珀酰高丝氨酸，该L-蛋氨酸前体。
22.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该L-蛋氨酸前体产生菌株是通过权利要求4-21所述的全部方法或部分方法制得。
23.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该L-蛋氨酸前体产生菌株衍生自分离于依赖蛋氨酸的苏氨酸产生菌株大肠杆菌MF001(保藏号：KCCM-10568)。
24.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该L-蛋氨酸前体产生菌株是大肠杆菌CJM-BTJ(pMetA-CL)(保藏号：KCCM-10767)，O-琥珀酰高丝氨酸产生菌株。
25.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该L-蛋氨酸前体产生菌株是大肠杆菌CJM-B TJ(pCJ-Met A-CL)(保藏号：KCCM-10872)，O-琥珀酰高丝氨酸产生菌株.
26.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该L-蛋氨酸前体产生菌株是大肠杆菌CJM-BTJA(pCJ-MetX-CL)(保藏号：KCCM-10873)，O-乙酰基高丝氨酸产生菌株。
27.一种用于制备权利要求1的步骤1)中的L-蛋氨酸前体的菌株，其特征在于，选自组成为埃希氏菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、普罗威登斯菌属、棒状杆菌属、假单胞菌属、螺旋体菌属、沙门氏菌属、短杆菌属、Hypomononas sp.、色素杆菌属和诺卡氏菌属或真菌或酵母的组。
28.根据权利要求27的用于制备L-蛋氨酸前体的菌株，其特征在于，该菌株受到删除或敲除，酶具有包含在L-蛋氨酸前体降解中的胱硫醚伽马合酶或O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶的活性。
29.根据权利要求28的用于制备L-蛋氨酸前体的菌株，其特征在于，酶具有胱硫醚伽马合酶或O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶的活性，由metB或metZ或metY或它们的突变基因编码。
30.根据权利要求27的用于制备L-蛋氨酸前体的菌株，其特征在于，该菌株衍生自苏氨酸、异亮氨酸或赖氨酸产生菌株。
31.根据权利要求27的用于制备L-蛋氨酸前体的菌株，其特征在于，高丝氨酸激酶的活性受到敲除或缺失。
32.根据权利要求31的用于制备L-蛋氨酸前体的菌株，其特征在于，该thrB基因编码该高丝氨酸激酶受到敲除或缺失。
33.根据权利要求27的用于制备L-蛋氨酸前体的菌株，其特征在于，提高了由高丝氨酸到该L-蛋氨酸前体的合成方法。
34.根据权利要求33的用于制备L-蛋氨酸前体的菌株，其特征在于，提高了高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶或高丝氨酸O-乙酰基转移酶的表达或活性。
35.根据权利要求34的用于制备L-蛋氨酸前体的菌株，其特征在于，该菌株为编码高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶的metA基因或编码高丝氨酸O-乙酰基转移酶的metX基因过表达的菌株。
36.根据权利要求33的用于制备L-蛋氨酸前体的菌株，其特征在于，诱导分离自反馈调节系统的高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶或高丝氨酸O-乙酰基转移酶。
37.根据权利要求33的用于制备L-蛋氨酸前体的菌株，其特征在于，删除或敲除包含在L-蛋氨酸前体合成基因的转录中的调节基因。
38.根据权利要求37的用于制备L-蛋氨酸前体的菌株，其特征在于，删除或敲除包含在L-蛋氨酸前体合成基因的转录中的该met J基因、调节基因。
39.根据权利要求33的用于制备L-蛋氨酸前体的菌株，其特征在于，删除或敲除微生物菌株的可靠的高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶，并诱导或提高一新的或可靠的高丝氨酸O-乙酰基转移酶。
40.根据权利要求33的用于制备L-蛋氨酸前体的菌株，其特征在于，删除或敲除微生物菌株的可靠的高丝氨酸O-乙酰基转移酶，并诱导或提高一新的或可靠的高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶。
41.根据权利要求27的用于制备L-蛋氨酸前体的菌株，其特征在于，该菌株是大肠杆菌。
42.根据权利要求27的用于制备L-蛋氨酸前体的菌株，其特征在于，该菌株采用权利要求4-21方法中的全部工艺或部分工艺制备。
43.根据权利要求27的用于制备L-蛋氨酸前体的菌株，其特征在于，该菌株衍生自分离于依赖蛋氨酸(保藏号：KCCM-10568)的苏氨酸产生菌株大肠杆菌MF001。
44.根据权利要求27的用于制备L-蛋氨酸前体的菌株，其特征在于，该菌株为大肠杆菌CJM-BTJ(pMetA-CL)(保藏号：KCCM-10767)，O-琥珀酰高丝氨酸产生菌株。
45.根据权利要求27的用于制备L-蛋氨酸前体的菌株，其特征在于，该菌株为大肠杆菌CJM-BTJ(pCJ-MetA-CL)(保藏号：KCCM-10872)，O-琥珀酰高丝氨酸产生菌株.
46.根据权利要求27的用于制备L-蛋氨酸前体的菌株，其特征在于，该菌株为大肠杆菌CJM-BTJA(pCJ-MetX-CL)(保藏号：KCCM-10873)，O-乙酰基高丝氨酸产生菌株.
47.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)将L-蛋氨酸前体转化为蛋氨酸的转移酶衍生自一种选自组成为埃希氏菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、普罗威登斯菌属、棒状杆菌属、假单胞菌属、螺旋体菌属、沙门氏菌属短杆菌属、Hypomononas sp.、色素杆菌属和诺卡氏菌属和真菌或酵母的菌株组。
48.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)将L-蛋氨酸前体转化为蛋氨酸的转移酶衍生自一种选自组成为假单胞菌属、色素杆菌属、螺旋体菌属和Hypomononas sp.的菌株组。
49.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)将L-蛋氨酸前体转化为蛋氨酸的转移酶衍生自一种选择组成为下列的菌株。
50.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)将L-蛋氨酸前体转化为蛋氨酸的转移酶衍生自一种选自含有假单胞菌属、青色素杆菌、Leptospira meyeri和Hyphomonas Neptunium的菌株组。
51.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将L-蛋氨酸前体转化成蛋氨酸的酶反应被一种酶或具有胱硫醚伽马合酶或O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶活性的菌株诱导。
52.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将步骤2)的L-蛋氨酸前体转化成蛋氨酸的酶反应包含如图7所示的1，2，3，4，5或6的至少一部分或整个氨基酸序列。
序列1：Y-(S，I，T，V)-R-X-X-(N，S)-
序列2：
(V，A，I)-(V，L，I)-D-N-X-(F，V，M，I)-X-(T，S)-(P，A)-X-(L，I)-(Q，C，V)-X-(P，G)-(L，F)-X-(L，M，H)-G-(A，V)-(D，H)-
序列3：
(D，G，N，T)-G-(Q，H，N)-(S，G，N)-(R，T，D，S)-X-(V，I，L，M)-(G，A，L)-G-(I，V，A，L)-(I，V，A，L)-(I，V，A，L)
序列4：
(S，A，G，P)-(P，A，V)-F-(N，D)-(A，S)-(W，F，Y)-X-X-X-(K，Q，R，S)-G-(L，M，V，I，M)-(E，K，D，R)-T-(L，M)-
序列5：(H，Y)-(P，A)-(A，S)-(T，S)-(T，M，Q)-(T，S)-H-
序列6：(V，I，L)-R-(V，I，L，F)-(S，A)-(V，I，T)-G-(L，I)-E-
53.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该有机酸是琥珀酸或乙酸。
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Cited By (15)
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| CN103764832A (zh) * | 2011-09-02 | 2014-04-30 | 阿克马法国公司 | L-甲硫氨酸的制备方法 |
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| KR101547651B1 (ko) * | 2014-06-03 | 2015-08-26 | 씨제이제일제당 주식회사 | O-숙시닐호모세린 또는 숙신산의 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 숙신산 또는 o-숙시닐호모세린의 생산 방법 |
| KR20160111285A (ko) | 2015-03-16 | 2016-09-26 | 씨제이제일제당 (주) | 사료 첨가제용 조성물 및 이를 포함하는 동물 사료 조성물 |
| US10544436B2 (en) | 2015-05-06 | 2020-01-28 | Trelys, Inc. | Compositions and methods for biological production of methionine |
| WO2017009047A1 (en) * | 2015-07-13 | 2017-01-19 | Evonik Degussa Gmbh | Method for producing l-methionine |
| US20180223319A1 (en) | 2015-08-07 | 2018-08-09 | Evonik Degussa Gmbh | Protein thiocarboxylate-dependent l-methionine production by fermentation |
| FR3041658B1 (fr) * | 2015-09-30 | 2017-10-20 | Arkema France | Procede de production de l-methionine |
| WO2017065567A1 (en) * | 2015-10-14 | 2017-04-20 | Cj Cheiljedang Corporation | Bio-based n-acetyl-l-methionine and use thereof |
| KR101851452B1 (ko) | 2016-07-18 | 2018-04-24 | 씨제이제일제당 (주) | O-아세틸-호모세린을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 o-아세틸-호모세린을 생산하는 방법 |
| CN106065411B (zh) * | 2016-08-10 | 2021-12-07 | 洛阳华荣生物技术有限公司 | 发酵法生产肌酸 |
| EP3330380A1 (en) | 2016-12-05 | 2018-06-06 | Evonik Degussa GmbH | Process for producing l-methionine from methional |
| FR3061493B1 (fr) | 2016-12-29 | 2020-07-03 | Arkema France | Procede de synthese de polysulfures fonctionnalises |
| FR3061494B1 (fr) * | 2016-12-29 | 2020-07-03 | Arkema France | Procede de synthese de dithiocarbamates cycliques fonctionnalises |
| BR112019028095B1 (pt) * | 2017-06-30 | 2023-03-21 | Cj Cheiljedang Corporation | Mutante de o-succinil homosserina transferase inovador e método para produção de o-succinil homosserina com o uso da mesma |
| SG11201913889WA (en) * | 2017-06-30 | 2020-01-30 | Cj Cheiljedang Corp | Novel o-succinyl homoserine transferase variant and method of producing o-succinyl homoserine using the same |
| KR101866884B1 (ko) | 2018-01-29 | 2018-06-14 | 씨제이제일제당(주) | 사료 첨가제용 조성물 및 이를 포함하는 동물 사료 조성물 |
| KR102182497B1 (ko) | 2019-12-20 | 2020-11-24 | 씨제이제일제당 주식회사 | 내막 단백질의 변이체 및 이를 이용한 목적 산물 생산 방법 |
| BR112022026480A2 (pt) | 2020-06-26 | 2023-03-07 | Cj Cheiljedang Corp | Composição de alimentação, grânulos de aminoácido e seu método de preparação |
| FR3112549A1 (fr) | 2020-07-20 | 2022-01-21 | Arkema France | Procede ameliore de synthese de mercaptans fonctionnalises |
| FR3117115B1 (fr) | 2020-12-04 | 2023-05-05 | Arkema France | Procede de synthese de mercaptans fonctionnalises sous pression d’h2s |
| KR102525074B1 (ko) | 2021-03-10 | 2023-04-24 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규한 시트레이트 신타아제 변이체 및 이를 이용한 o-아세틸-l-호모세린 또는 l-메티오닌 생산 방법 |
| MX2023011496A (es) | 2021-04-01 | 2023-10-04 | Evonik Operations Gmbh | Procedimiento enzimatico para la produccion de l-glufosinato y sus fosfoesteres. |
| CN113088503B (zh) * | 2021-04-27 | 2023-01-10 | 浙江工业大学 | 一种o-琥珀酰巯基转移酶突变体及其在l-甲硫氨酸合成中的应用 |
| KR102377745B1 (ko) | 2021-05-12 | 2022-03-23 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규 프로모터 및 이의 용도 |
| KR102685904B1 (ko) | 2021-05-20 | 2024-07-19 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규 프로모터 및 이의 용도 |
| TW202333581A (zh) | 2021-12-24 | 2023-09-01 | 南韓商Ｃｊ第一製糖股份有限公司 | 由發酵液製備含胺基酸製品之方法 |
| KR20230139597A (ko) * | 2022-03-28 | 2023-10-05 | 씨제이제일제당 (주) | O-아세틸 호모세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-아세틸 호모세린 또는 l-메치오닌 생산 방법 |
| WO2024061455A1 (en) | 2022-09-21 | 2024-03-28 | Evonik Operations Gmbh | Enzymatic method for producing l-glufosinate and its phosphoesters |
| WO2024061456A1 (en) | 2022-09-21 | 2024-03-28 | Evonik Operations Gmbh | Enzymatic method for producing l-glufosinate and its phosphoesters |
| WO2024162751A1 (en) * | 2023-01-31 | 2024-08-08 | Cj Cheiljedang Corporation | O-acylhomoserine sulfhydrylase variant and use thereof |
Family Cites Families (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR920008365Y1 (ko) | 1990-01-31 | 1992-11-20 | 주식회사 기아기공 | Nc 연삭기 오버트래블(over travel) 해제회로 |
| KR920009598B1 (ko) | 1990-10-11 | 1992-10-21 | 주식회사삼성전자 | 풀림방지용 체결기구 |
| KR920008365B1 (ko) | 1990-12-31 | 1992-09-26 | 제일제당 주식회사 | L-스레오닌 제조방법 |
| WO1993017112A1 (en) * | 1992-02-20 | 1993-09-02 | Genencor International, Inc. | Biosynthesis of methionine using a reduced source of sulfur |
| JP4110641B2 (ja) * | 1998-11-17 | 2008-07-02 | 味の素株式会社 | 発酵法によるｌ−メチオニンの製造法 |
| CN100577794C (zh) | 2000-01-21 | 2010-01-06 | 味之素株式会社 | 生产l-赖氨酸的方法 |
| US20020049305A1 (en) | 2000-08-02 | 2002-04-25 | Degussa Ag | Nucleotide sequences which code for the metF gene |
| DE10107002A1 (de) * | 2001-02-15 | 2002-08-29 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur fermentativen Herstellung von O-Acetyl-L-Serin |
| US6579705B2 (en) * | 2001-04-04 | 2003-06-17 | Consortium Fur Elektrochemische Industrie Gmbh | Process for preparing non-proteinogenic L-amino acids |
| DE10126164A1 (de) | 2001-05-30 | 2002-12-05 | Degussa | Für das metD-gen kodierende Nukleotidsequenzen |
| US7160711B2 (en) | 2001-08-06 | 2007-01-09 | Degussa Ag | Coryneform bacteria which produce chemical compounds I |
| DE10239073A1 (de) * | 2002-08-26 | 2004-03-11 | Basf Ag | Verfahren zur fermentativen Herstellung schwefelhaltiger Feinchemikalien |
| DE10247437A1 (de) | 2002-10-11 | 2004-04-29 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Feedback-resistente Homoserin-Transsuccinylasen |
| DE10249642A1 (de) | 2002-10-24 | 2004-05-13 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Feedback-resistente Homoserin-Transsuccinylasen mit modifiziertem C-Terminus |
| FR2851256A1 (fr) * | 2003-02-18 | 2004-08-20 | Metabolic Explorer Sa | Procede de criblage et d'evolution dirigee de souches produisant de la methionine par nouvelle voie metabolique |
| EP1597364B1 (fr) * | 2003-02-18 | 2013-07-24 | Metabolic Explorer | Procede de preparation de microorganismes evolues permettant la creation ou la modification de voies metaboliques |
| US20040199941A1 (en) | 2003-03-24 | 2004-10-07 | Rice University | Increased bacterial CoA and acetyl-CoA pools |
| DE10316109A1 (de) | 2003-04-09 | 2004-10-21 | Degussa Ag | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| WO2005052180A2 (en) | 2003-11-24 | 2005-06-09 | Genaissance Pharmaceuticals, Inc. | Ntrk1 genetic markers associated with progression of alzheimer’s disease |
| KR100576342B1 (ko) | 2004-02-05 | 2006-05-03 | 씨제이 주식회사 | ｇａｌＲ 유전자가 불활성화된 Ｌ-쓰레오닌 생성 미생물,그를 제조하는 방법 및 상기 미생물을 이용한Ｌ-쓰레오닌의 제조방법 |
| ES2267026T3 (es) | 2004-04-29 | 2007-03-01 | Borealis Technology Oy | Proceso de produccion de polietileno. |
| WO2005111202A1 (en) | 2004-05-12 | 2005-11-24 | Metabolic Explorer | Recombinant enzyme with altered feedback sensitivity |
| KR100651220B1 (ko) * | 2004-06-29 | 2006-11-29 | 씨제이 주식회사 | Ｌ-메씨오닌 생산 균주 및 상기 균주를 이용한ｌ-메씨오닌의 생산방법 |
| WO2006082252A2 (en) | 2005-02-07 | 2006-08-10 | Metabolic Explorer | Method for the enzymatic production of alpha-ketobutyrate |
| EP1891226A4 (en) | 2005-06-17 | 2010-03-24 | Microbia Inc | IMPROVED BIOSYNTHESIS OF AMINO ACIDS AND METABOLITES |
| EP1907559A1 (en) | 2005-07-18 | 2008-04-09 | Basf Se | Methionine producing recombinant microorganisms |
| BRPI0620880B1 (pt) | 2006-01-04 | 2018-10-09 | Evonik Degussa Gmbh | método para a produção de metionina, pelo cultivo de um microorganismo, e, microorganismo |
| JP2009060791A (ja) | 2006-03-30 | 2009-03-26 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| KR100905381B1 (ko) | 2006-07-28 | 2009-06-30 | 씨제이제일제당 (주) | Ｌ-메치오닌 전구체 생산 균주 및 상기 ｌ-메치오닌전구체로부터의 ｌ-메치오닌 및 유기산의 생산방법 |
| EP2066782A4 (en) | 2006-09-15 | 2010-02-03 | Cj Cheiljedang Corp | CORYNEBACTERIA WITH IMPROVED L-LYSINE PRODUCTIVITY AND METHOD FOR THE PREPARATION OF L-LYSINE THEREWITH |
| WO2008039177A2 (en) | 2006-09-22 | 2008-04-03 | Rice University | Pantothenate kinase expressing cells |
| PL2808381T3 (pl) | 2007-04-11 | 2016-09-30 | Kompozycje i sposoby wytwarzania metioniny | |
| US7851180B2 (en) * | 2008-04-04 | 2010-12-14 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism producing L-methionine precursor and the method of producing L-methionine precursor using the microorganism |
| US9005952B2 (en) | 2008-04-04 | 2015-04-14 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism producing L-methionine precursor and the method of producing L-methionine precursor using the microorganism |
| US8283152B2 (en) | 2009-08-28 | 2012-10-09 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism producing O-acetyl-homoserine and the method of producing O-acetyl-homoserine using the microorganism |
-
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2008
- 2008-11-05 KR KR1020080109357A patent/KR100951766B1/ko active IP Right Grant
-
2012
- 2012-07-02 JP JP2012148175A patent/JP5371073B2/ja active Active
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2013
- 2013-01-29 US US13/752,907 patent/US9029105B2/en active Active
-
2015
- 2015-04-07 US US14/680,355 patent/US20150211034A1/en not_active Abandoned
Cited By (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104911136A (zh) * | 2009-08-28 | 2015-09-16 | Cj第一制糖株式会社 | 产生o-乙酰高丝氨酸的微生物和利用所述微生物产生o-乙酰高丝氨酸的方法 |
| CN102002473A (zh) * | 2009-08-28 | 2011-04-06 | Cj第一制糖株式会社 | 产生o-乙酰高丝氨酸的微生物和利用所述微生物产生o-乙酰高丝氨酸的方法 |
| CN106868066A (zh) * | 2009-08-28 | 2017-06-20 | Cj第制糖株式会社 | 产生o‑乙酰高丝氨酸的微生物和利用所述微生物产生o‑乙酰高丝氨酸的方法 |
| CN104862352B (zh) * | 2010-10-20 | 2021-10-26 | Cj第一制糖株式会社 | 生产o-磷酸丝氨酸的微生物和使用该微生物由o-磷酸丝氨酸生产l-半胱氨酸或其衍生物的方法 |
| CN104862352A (zh) * | 2010-10-20 | 2015-08-26 | Cj第一制糖株式会社 | 生产o-磷酸丝氨酸的微生物和使用该微生物由o-磷酸丝氨酸生产l-半胱氨酸或其衍生物的方法 |
| CN106480120B (zh) * | 2010-12-29 | 2020-03-03 | Cj 第一制糖株式会社 | L-甲硫氨酸和相关产物的生产方法 |
| CN103476938B (zh) * | 2010-12-29 | 2016-10-12 | Cj第一制糖株式会社 | L-甲硫氨酸和相关产物的生产方法 |
| CN106480120A (zh) * | 2010-12-29 | 2017-03-08 | Cj 第制糖株式会社 | L‑甲硫氨酸和相关产物的生产方法 |
| CN103476938A (zh) * | 2010-12-29 | 2013-12-25 | Cj第一制糖株式会社 | L-甲硫氨酸和相关产物的生产方法 |
| US9752167B2 (en) | 2010-12-29 | 2017-09-05 | Cj Cheiljedang Corporation | Methods for production of L-methionine and related products |
| CN103764832A (zh) * | 2011-09-02 | 2014-04-30 | 阿克马法国公司 | L-甲硫氨酸的制备方法 |
| CN107475319A (zh) * | 2011-09-02 | 2017-12-15 | 阿克马法国公司 | L‑甲硫氨酸的制备方法 |
| CN108342424A (zh) * | 2011-09-02 | 2018-07-31 | 阿克马法国公司 | L-甲硫氨酸的制备方法 |
| CN106795533A (zh) * | 2013-03-20 | 2017-05-31 | Cj第制糖株式会社 | 由源自微生物的o‑酰基高丝氨酸制备源自生物的高丝氨酸内酯盐酸盐及源自生物的有机酸的方法 |
| CN106795533B (zh) * | 2013-03-20 | 2021-09-28 | Cj第一制糖株式会社 | 由产生于微生物的o-酰基高丝氨酸制备基于生物的高丝氨酸内酯盐酸盐及基于生物的有机酸的方法 |
| CN105705636A (zh) * | 2013-10-23 | 2016-06-22 | Cj第制糖株式会社 | 生产o-琥珀酰高丝氨酸的微生物和使用其生产o-琥珀酰高丝氨酸的方法 |
| CN105705636B (zh) * | 2013-10-23 | 2019-09-24 | Cj第一制糖株式会社 | 生产o-琥珀酰高丝氨酸的微生物和使用其生产o-琥珀酰高丝氨酸的方法 |
| CN106574237B (zh) * | 2014-06-05 | 2020-03-27 | Cj第一制糖株式会社 | 生产o-乙酰高丝氨酸的微生物和使用其生产o-乙酰高丝氨酸的方法 |
| US10501763B2 (en) | 2014-06-05 | 2019-12-10 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism producing O-acetyl-homoserine and method for producing O-acetylhomoserine using the same |
| CN106574237A (zh) * | 2014-06-05 | 2017-04-19 | Cj第制糖株式会社 | 生产o‑乙酰高丝氨酸的微生物和使用其生产o‑乙酰高丝氨酸的方法 |
| CN110592153A (zh) * | 2014-06-23 | 2019-12-20 | Cj第一制糖株式会社 | 生产o-乙酰基高丝氨酸的微生物和用其生产o-乙酰基高丝氨酸的方法 |
| CN108026147B (zh) * | 2015-06-04 | 2021-10-01 | Cj第一制糖株式会社 | 生产o-乙酰-高丝氨酸的微生物和使用其生产o-乙酰-高丝氨酸的方法 |
| CN108026147A (zh) * | 2015-06-04 | 2018-05-11 | Cj第制糖株式会社 | 生产o-乙酰-高丝氨酸的微生物和使用其生产o-乙酰-高丝氨酸的方法 |
| CN108026551A (zh) * | 2015-09-30 | 2018-05-11 | 阿肯马法国公司 | 用于制备l-甲硫氨酸的方法 |
| CN108026551B (zh) * | 2015-09-30 | 2021-12-28 | 阿肯马法国公司 | 用于制备l-甲硫氨酸的方法 |
| CN108138205A (zh) * | 2015-10-13 | 2018-06-08 | Cj第制糖株式会社 | O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶变体以及使用其产生l-甲硫氨酸的方法 |
| CN108138205B (zh) * | 2015-10-13 | 2021-06-22 | Cj第一制糖株式会社 | O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶变体以及使用其产生l-甲硫氨酸的方法 |
| CN108603206A (zh) * | 2015-10-14 | 2018-09-28 | Cj第制糖株式会社 | 生物基n-乙酰基-l-蛋氨酸及其用途 |
| CN108603206B (zh) * | 2015-10-14 | 2022-03-18 | Cj第一制糖株式会社 | 生物基n-乙酰基-l-蛋氨酸及其用途 |
| CN108291243A (zh) * | 2015-11-27 | 2018-07-17 | 赢创德固赛有限公司 | 生产l-甲硫氨酸的方法 |
| CN107541531A (zh) * | 2017-09-26 | 2018-01-05 | 扬州工业职业技术学院 | 一种利用微生物代谢处理石油化工污水生产蛋氨酸的方法 |
| CN114729379A (zh) * | 2019-10-28 | 2022-07-08 | Cj第一制糖株式会社 | 引入外源metZ基因编码蛋白的L-蛋氨酸生产微生物及利用其生产L-蛋氨酸的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US8426171B2 (en) | 2013-04-23 |
| JP5078101B2 (ja) | 2012-11-21 |
| CN102943096B (zh) | 2014-08-27 |
| US9029105B2 (en) | 2015-05-12 |
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| CN103397057A (zh) | 2013-11-20 |
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