ES2855048T3 - Microorganismo que tiene la capacidad de producir l-lisina y método para producir l-lisina mediante el uso del mismo - Google Patents
Microorganismo que tiene la capacidad de producir l-lisina y método para producir l-lisina mediante el uso del mismoInfo
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Abstract
Un método para producir L-lisina, que comprende: (i) cultivar un microorganismo modificado del género Corynebacterium en el que se mejora una actividad de la acetato quinasa en comparación con la de un microorganismo no modificado en un medio, en donde la actividad de la acetato quinasa se mejora mediante al menos un método seleccionado del grupo que consiste en un método para incrementar el número de copias de un polinucleótido que codifica la acetato quinasa, un método para introducir una modificación en la secuencia reguladora de un gen que codifica la acetato quinasa, un método para sustituir la secuencia reguladora de un gen que codifica la acetato quinasa en el cromosoma con una secuencia que tiene una actividad fuerte, un método para sustituir el gen que codifica la acetato quinasa por un gen mutado para incrementar la actividad de la acetato quinasa y un método para introducir una modificación en el gen que codifica la acetato quinasa en el cromosoma para mejorar la actividad de la acetato quinasa; y (ii) recuperar L-lisina del microorganismo cultivado o del medio cultivado.
Description
DESCRIPCIÓN
Microorganismo que tiene la capacidad de producir l-lisina y método para producir l-lisina mediante el uso del mismo
Campo técnico
La presente descripción se refiere a un microorganismo que produce L-lisina y un método para producir L-lisina mediante el uso del microorganismo.
Antecedentes de la técnica
Un microorganismo del género Corynebacterium puede utilizar ácidos orgánicos como gluconato, acetato y piruvato, así como también glucosa, sacarosa y fructosa, como fuente de carbono. Entre estos, el acetato, que es un ácido orgánico que pertenece a los ácidos monocarboxílicos, se introduce en las células mediante difusión pasiva o un transportador de ácido monocarboxílico (MctC) cuando es utilizado por un microorganismo del género Corynebacterium, fosforilado por la acetato quinasa (ackA) para convertirse en acetilfosfato y transformado en acetil-CoA mediante fosfotransacetilasa (pta). La acetil-CoA así formada se introduce inmediatamente en el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) y el ciclo del glioxilato (J. Bacteriol. 2009. 191: 940-948) y, de esta manera, se forma el oxalacetato, que es un precursor de la lisina.
Sin embargo, cuando se cultiva una cepa del género Corynebacterium mediante el uso de acetato como fuente de carbono única o mixta, existe el problema de que puede producirse un fenómeno de inhibición del crecimiento de acuerdo con su concentración. Se conoce que el acetato tiene limitaciones porque su tasa metabólica es baja en comparación con la de los sacáridos tales como la glucosa, y además, dado que el acetato puede inhibir el crecimiento celular cuando está presente en una cierta concentración en una célula, el incremento de la concentración de acetato en un medio de cultivo puede incrementar la fase de latencia, lo que retrasa de esta manera todo el tiempo de cultivo (Arch. Microbiol. 1991. 155: 505 - 510). Por consiguiente, existe la necesidad de desarrollar un método para convertir rápidamente el acetato en un medio de cultivo en acetil-CoA en una célula.
Sin embargo, la acetato quinasa y la fosfotransacetilasa, que se usan en la vía de activación del acetato, tienen una bidireccionalidad (una reacción reversible) y, por lo tanto, existe el problema de que la acetil-CoA puede convertirse nuevamente en acetato, y además hay un informe de que estos pueden tener una referencia a la siguiente descripción: > efecto negativo sobre la producción de L-lisina. Por lo tanto, el desarrollo de un método para utilizar eficazmente el acetato aún permanece inactivo.
Reinscheid y otros, Microbiol., 145 (2), 503-513 (1999) se refiere a "clonación, análisis de secuencia, expresión e inactivación del operón pta-ack de Corynebacterium glutamicum que codifica la fosfotransacetilasa y la acetato quinasa".
El número de acceso de Genbank WP_003862874 se refiere a una "acetato quinasa de múltiples especies [Corynebacterium]".
El número de acceso de Genbank WP_011015350 se refiere a una "fosfato acetiltransferasa [Corynebacterium glutamicum]".
El número de acceso de Genbank WP_000078239 se refiere a una "acetil coenzima A sintetasa de múltiples especies [Enterobacteriaceae]".
Paegle y otros, J. Biotechnol., 104 (103), 123-128 (2003) se refiere al "control de la síntesis de lisina en Corynebacterium glutamicum RC115 en medio de sustrato mixto (glucosa-acetato)".
Descripción
Problema técnico
Los presentes autores han realizado muchos esfuerzos para desarrollar un microorganismo para la utilización eficiente del acetato, que se produce durante el proceso de fermentación o se proporciona como una nueva fuente de carbono, y como resultado, han confirmado que un microorganismo con una actividad de la acetato quinasa mejorada en la vía de activación del acetato puede incrementar la capacidad para utilizar acetato y producir L-lisina, lo que completa de esta manera la presente descripción.
Solución técnica
Un objeto de la presente descripción es proporcionar un microorganismo del género Corynebacterium que produce L-lisina, en el que se mejora la actividad de la acetato quinasa en comparación con su actividad endógena.
Otro objeto de la presente descripción es proporcionar un método para producir L-lisina mediante el uso del microorganismo anterior. Otros aspectos de la descripción pueden entenderse más completamente tras hacer referencia a la siguiente descripción.
Efectos ventajosos
El microorganismo de acuerdo con la presente descripción, que es una cepa que tiene una capacidad de utilización de acetato incrementada debido a una vía mejorada de activación del acetato, es un microorganismo que puede producir L-lisina con un alto rendimiento. La L-lisina así preparada puede usarse en varios productos, que incluyen no solo alimentos para animales o aditivos para alimentos para animales, sino también alimentos para humanos o aditivos alimentarios, fármacos, etcétera.
Breve descripción de los dibujos
Las Figuras 1a y 1b muestran gráficos que ilustran el análisis de las capacidades de utilización de acetato de KCCM11016P (una cepa de control) y una KCCM11016P modificada (una cepa modificada introducida con pta y pta-ackA), en un medio con acetato (Figura 1a) y en un medio sin acetato (Figura 1b).
La Figura 2 muestra un diagrama esquemático de pDZTn-lysCP1-ackA, un vector para sobreexpresar ackA por el promotor LysCP1, que es un promotor fuerte.
La Figura 3 muestra un gráfico que ilustra el análisis de las capacidades de utilización de acetato de KCCM11016P (una cepa de control) y una KCCM11016P modificada (una cepa modificada introducida con pta, pta-ackA y acs).
Mejor modo
Un aspecto de la presente descripción proporciona un microorganismo del género Corynebacterium que produce L-lisina, en el que se mejora la actividad de la acetato quinasa. Específicamente, el microorganismo es un microorganismo del género Corynebacterium que produce L-lisina, en el que se mejora la actividad de la acetato quinasa en comparación con su actividad endógena.
Como se usa en la presente descripción, el término "L-lisina" se refiere a un tipo de L-aminoácido, que es un a-aminoácido básico y un aminoácido esencial no sintetizado in vivo, que tiene una fórmula química de NH2(CH2)4CH(NH2)COOH.
El acetato es un ácido orgánico perteneciente a los ácidos monocarboxílicos, que se introduce en las células mediante difusión pasiva o un transportador de ácido monocarboxílico cuando es utilizado por un microorganismo del género Corynebacterium, fosforilado por la acetato quinasa para convertirse en acetilfosfato y transformado en acetil-CoA por la fosfotransacetilasa. La acetil-CoA así formada se introduce inmediatamente en el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) y en el ciclo del glioxilato, y de esta manera se forma el oxalacetato, un precursor de la lisina. El acetato puede usarse como fuente de carbono en un microorganismo del género Corynebacterium. Sin embargo, cuando el microorganismo se cultiva mediante el uso de acetato como fuente de carbono única o mixta, existe el problema de que se produce un fenómeno de inhibición del crecimiento de acuerdo con la concentración (Arch. Microbiol. 1991. 155: 505 - 510).
En términos generales, existen dos vías para activar el acetato para convertir el acetato en acetil-CoA en una célula. Como se describió anteriormente, dos enzimas (es decir, acetato quinasa y fosfotransacetilasa) actúan secuencialmente en una cepa del género Corynebacterium. Se conoce que un gen, ackA, codifica la acetato quinasa y un gen, pta, codifica la fosfotransacetilasa (Microbiol. 1999 145: 503 - 513). En otra vía, la acetil-CoA sintetasa está involucrada en una cepa del género Escherichia y se conoce que un gen, acs, codifica la acetil-CoA sintetasa (Appl Microbiol Biotechnol. 2006. 71: 870 - 874). Sin embargo, dado que la vía de activación en la cepa del género Escherichia se debe a una reacción reversible, no se ha intentado simplemente mejorar la vía.
Sorprendentemente, sin embargo, los presentes autores han confirmado no solo que la mejora de la acetato quinasa puede convertir rápidamente el acetato en acetil-CoA en una célula, sino también que el inconveniente de la inhibición del crecimiento descrito anteriormente puede superarse para incrementar la capacidad de producción del L-aminoácido. Por tanto, los presentes autores pudieron proporcionar un microorganismo novedoso del género Corynebacterium que produce L-lisina, en el que se mejora la actividad de la acetato quinasa en comparación con su actividad endógena.
En una modalidad ilustrativa de la presente descripción, se confirmó que un microorganismo en el que se mejoraba la actividad del gen ackA mostraba una tasa de consumo rápida de acetato y además una reducción significativa en la fase de latencia en el crecimiento del microorganismo. Por el contrario, se confirmó que cuando se mejoró la actividad del gen pta, el microorganismo no mostró ninguna diferencia significativa en la tasa de consumo de acetato en comparación con la del grupo control (Figuras 1a y 1b), por lo que se confirmó que la proteína importante para incrementar la capacidad de utilización de acetato mediante la activación del acetato y de incrementar la capacidad de producción de L-lisina sin inhibición del crecimiento es la acetato quinasa. Es decir, se confirmó que puede prepararse
un microorganismo que puede producir L-lisina con alto rendimiento y que tiene una capacidad de utilización de acetato incrementada sin inhibición del crecimiento tras mejorar la actividad de la acetato quinasa mediante el uso de varios métodos conocidos basados en los resultados anteriores.
El microorganismo del género Corynebacterium de la presente descripción, que tiene una capacidad de utilización de acetato incrementada y una capacidad de producción de L-lisina incrementada, puede ser un microorganismo del género Corynebacterium que puede producir L-lisina y tiene una actividad de acetato quinasa mejorada en comparación con su actividad endógena.
Adicionalmente, el microorganismo del género Corynebacterium que tiene una capacidad de utilización de acetato incrementada y una capacidad de producción de L-lisina incrementada puede ser un microorganismo del género Corynebacterium que tiene una actividad de acetato quinasa mejorada en comparación con su actividad endógena, en la que, adicionalmente, (i) se mejora la actividad de la fosfotransacetilasa en comparación con su actividad endógena; (ii) se introduce o mejora una actividad de acetil-CoA sintetasa; o (iii) se mejora una actividad de fosfotransacetilasa en comparación con su actividad endógena y se introduce o mejora una actividad de acetil-CoA sintetasa.
Los presentes autores han confirmado que, en un microorganismo que tiene una actividad de acetato quinasa, que es más importante para incrementar la capacidad de utilización de acetato y la capacidad de producción de L-lisina, se mejora en comparación con su actividad endógena, cuando se mejora adicionalmente una actividad de fosfotransacetilasa en comparación con su actividad endógena y/o se introduce o mejora adicionalmente una actividad de acetil-CoA sintetasa, la capacidad de utilización de acetato se incrementa adicionalmente y los presentes autores proporcionan el microorganismo novedoso en la presente descripción. En una modalidad ilustrativa de la presente descripción, se confirmó que la introducción adicional del gen acs, que se deriva de un microorganismo del género Escherichia y codifica acetil-CoA, puede incrementar la tasa de consumo de acetato (Figura 3), y el resultado sugiere que la introducción o mejora de la actividad de la acetil-CoA sintetasa puede incrementar además la tasa de consumo de acetato, lo que incrementa de esta manera la capacidad de producción de L-lisina.
Como se usa en la presente descripción, el término "acetato quinasa (EC 2.7.2.1)" se refiere a una enzima que tiene la función de producir acetilfosfato tras fosforilar acetato. Los genes que codifican la acetato quinasa pueden denominarse colectivamente ackA, y las secuencias de proteínas y genes de la acetato quinasa pueden obtenerse de una base de datos conocida (por ejemplo, GenBank de NCBI), pero no se limitan a ella. La acetato quinasa puede tener una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 pero puede incluirse sin limitación cualquier secuencia de proteína que tenga la actividad de acetato quinasa.
Como se usa en la presente descripción, el término "fosfotransacetilasa (EC 2.3.1.8)" se refiere a una enzima que tiene la función de convertir acetilfosfato en acetil-CoA mediante la reacción que se muestra a continuación.
CoA acetilfosfato ^ acetil-CoA fosfato
Como se usa en la presente descripción, el término "fosfotransacetilasa" puede usarse indistintamente con enzimas tales como fosfato acetiltransferasa y fosfoacilasa. El gen que codifica la fosfotransacetilasa puede denominarse colectivamente pta, y la proteína y las secuencias génicas de la fosfotransacetilasa pueden obtenerse de una base de datos conocida (por ejemplo, GenBank de NCBI), pero no se limitan a ello. La fosfotransacetilasa puede tener una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, pero puede incluirse sin limitación cualquier secuencia de proteína que tenga la actividad de fosfotransacetilasa.
Como se usa en la presente descripción, el término "acetil-CoA sintetasa (EC 6.2.1.1)" se refiere a una enzima que tiene la función de convertir acetato en acetil-CoA mediante la reacción que se muestra a continuación.
acetato CoA ^ acetil-CoA
El gen que codifica la acetil-CoA sintetasa puede denominarse colectivamente acs, y la proteína y las secuencias génicas de la acetil-CoA sintetasa pueden obtenerse de una base de datos conocida (por ejemplo, GenBank de NCBI), pero no se limitan a ello. La acetil-CoA sintetasa puede tener una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, pero puede incluirse sin limitación cualquier secuencia de proteína que tenga la actividad de acetil-CoA sintetasa.
Cada una de las proteínas descritas anteriormente puede incluir sin limitación, en adición a las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NO, cualquier secuencia de aminoácidos que tenga una homología con las secuencias de aminoácidos enumeradas anteriormente de 80 % o mayor, específicamente 90 % o mayor, más específicamente 95 % o mayor, e incluso más específicamente 97 % o mayor, siempre que las secuencias de aminoácidos codifiquen proteínas que tengan un efecto sustancialmente igual o correspondiente a cada una de las proteínas. Adicionalmente, es obvio que cualquier proteína modificada que tenga la homología descrita anteriormente puede pertenecer al alcance de la presente descripción, aunque la proteína puede tener una secuencia de aminoácidos con una modificación, sustitución, adición, o deleción parcial en esta.
Adicionalmente, los genes que codifican cada una de las proteínas de la presente descripción pueden incluir además sin limitación, en adición a las secuencias polinucleotídicas descritas por las SEQ ID NO, cualquier secuencia génica que codifique las proteínas, que tenga homología con cada una de las secuencias polinucleotídicas enumeradas anteriormente de 80 % o mayor, específicamente 90 % o mayor, más específicamente 95 % o mayor, incluso más específicamente 98 % o mayor, y con la máxima especificidad 99 % o mayor, siempre que la secuencia génica codifique una proteína que tenga un efecto sustancialmente igual o correspondiente a cada una de las proteínas. Adicionalmente, es obvio que cualquier secuencia polinucleotídica que tenga las homologías anteriores puede pertenecer al alcance de la presente descripción, aunque la secuencia puede tener una deleción, modificación, sustitución o adición parcial en esta.
Como se usa en la presente descripción, el término "homología" se refiere a un grado de identidad entre secuencias de polipéptidos o secuencias de aminoácidos que codifican proteínas, y cuando hay un porcentaje suficientemente alto de homología, los productos de expresión de genes correspondientes pueden tener actividades iguales o similares.
Como se usa en la presente descripción, el término "actividad endógena" se refiere a un estado activo de un polipéptido en un microorganismo en un estado no modificado, es decir, en un estado natural.
Como se usa en la presente descripción, el término "mejora de una actividad de una proteína en comparación con su actividad endógena" se refiere al incremento de la actividad intracelular de una proteína en un microorganismo tras modificar la proteína para mejorar la actividad intracelular en comparación con la actividad que posee la proteína en su estado natural. Adicionalmente, como se usa en la presente descripción, el término "mejora de la actividad de una proteína" se refiere no solo a la mejora de la actividad de una proteína en comparación con su actividad endógena, sino también al incremento de la actividad intracelular de una proteína en particular tras modificar un microorganismo que no poseía la actividad de la proteína particular originalmente para tener la actividad de la proteína particular y modificarse para mejorar su actividad intracelular.
La "mejora" no solo incluye la obtención de un efecto mayor que la función original debido al incremento en la actividad de la proteína en sí, sino que puede realizarse por al menos un método seleccionado del grupo que consiste en un método para incrementar la número de copias de un polinucleótido que codifica la proteína, un método para introducir una modificación en la secuencia reguladora de un gen que codifica la proteína, un método para sustituir la secuencia reguladora de un gen que codifica la proteína en el cromosoma con una secuencia que tiene una actividad fuerte, un método para sustituir el gen que codifica la proteína con un gen mutado para incrementar la actividad de la proteína, y un método para introducir una modificación en el gen que codifica la proteína en el cromosoma para mejorar la actividad de la proteína, pero cualquier método conocido que pueda mejorar la actividad de la proteína en comparación con su actividad endógena o mejorar la actividad introducida puede incluirse sin limitación.
Como se usa en la presente descripción, el término "introducción de una actividad de una proteína" se refiere a proporcionar una actividad de una proteína particular a un microorganismo que no tiene la actividad de la proteína particular.
La "introducción de una actividad de una proteína" puede realizarse en varios métodos conocidos en la técnica, por ejemplo: un método para insertar un polinucleótido que incluye una secuencia polinucleotídica que codifica la proteína en el cromosoma; un método para incrementar el número de copias de un polinucleótido mediante un método tal como introducir el polinucleótido en un microorganismo a través de una introducción en un sistema de vector; un método para introducir un promotor capaz de exhibir una actividad mejorada o introducir la proteína con una modificación en el promotor en una región aguas arriba de la secuencia polinucleotídica que codifica la proteína; un método para introducir una modificación en la secuencia polinucleotídica que codifica la proteína; etcétera, pero puede incluirse sin limitación cualquier método conocido que pueda introducir una actividad de una proteína.
En lo anterior, el incremento del número de copias de un polinucleótido puede realizarse en una forma en la que el polinucleótido esté unido operativamente a un vector, o tras insertar el polinucleótido en el cromosoma de una célula huésped, aunque el método no está particularmente limitado a ello. Específicamente, el incremento del número de copias de un polinucleótido puede realizarse tras introducir un vector que puede replicarse y funcionar independientemente de una célula huésped y al cual el polinucleótido que codifica la proteína de la presente descripción está unida operativamente; o puede realizarse tras introducir un vector en una célula huésped, que puede insertar el polinucleótido en el cromosoma de la célula huésped y al cual el polinucleótido está unido operativamente.
El vector es una construcción de ADN que incluye la secuencia polinucleotídica de un polinucleótido que codifica una proteína diana, que está unida operativamente a una secuencia reguladora apropiada para permitir la expresión de la proteína diana en una célula huésped. La secuencia reguladora incluye un promotor capaz de iniciar la transcripción, cualquier secuencia operadora para la regulación de la transcripción, una secuencia que codifica un dominio de unión al ribosoma de ARNm apropiado y una secuencia que regula la terminación de la transcripción y traducción. El vector, después de transformarse en una célula huésped apropiada, puede replicarse o funcionar independientemente del genoma del huésped, o puede integrarse en el propio genoma del huésped.
El vector usado en la presente descripción puede no estar particularmente limitado siempre que el vector sea replicable en la célula huésped, y puede construirse mediante el uso de cualquier vector conocido en la técnica. Los ejemplos de los vectores pueden incluir plásmidos, cósmidos, virus, y bacteriófagos naturales o recombinantes. Por ejemplo, como vector de fago o vector de cósmido, pueden usarse pWE15, M13, ÁMBL3, ÁMBL4, AIXII, AASHII, ÁAPII, Át10, At11, Charon4A, Charon21A, etcétera; y como vector de plásmido pueden usarse los basados en pBR, pUC, pBluescriptlI, pGEM, pTZ, pCL, pET, etcétera. Los vectores que pueden usarse en la presente descripción no están particularmente limitados, pero puede usarse cualquier vector de expresión conocido, por ejemplo, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCCIBAC, etcétera.
Adicionalmente, el polinucleótido que codifica la proteína diana endógena puede reemplazarse con un polinucleótido modificado dentro del cromosoma por un vector para la inserción de un cromosoma dentro de la célula huésped. Alternativamente, el polinucleótido que codifica una proteína diana extraña a introducir en el cromosoma puede reemplazarse con un polinucleótido modificado. La inserción del polinucleótido en el cromosoma puede realizarse mediante el uso de cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, mediante recombinación homóloga. Dado que el vector de la presente descripción puede insertarse en el cromosoma a través de recombinación homóloga, puede incluirse adicionalmente un marcador de selección para la confirmación de la inserción en el cromosoma. El marcador de selección se usa para la selección de una célula transformada, es decir, para confirmar si se insertó el polinucleótido diana, y pueden usarse marcadores capaces de proporcionar fenotipos seleccionables tales como resistencia a fármacos, requerimiento de nutrientes, resistencia a agentes citotóxicos y expresión de proteínas de superficie. En las circunstancias en las que se tratan agentes selectivos, solo las células capaces de expresar los marcadores de selección pueden sobrevivir o expresar otros rasgos fenotípicos y así pueden seleccionarse las células transformadas.
Como se usa en la presente descripción, el término "transformación" se refiere a un proceso de introducción de un vector que incluye un polinucleótido que codifica una proteína diana en una célula huésped, lo que permite, de esta manera, la expresión del polinucleótido codificado por la proteína en la célula huésped. Para el polinucleótido transformado, no importa si se inserta en el cromosoma de una célula huésped y se localiza en allí, o si se localiza fuera del cromosoma, siempre que pueda expresarse en la célula huésped. Adicionalmente, los polinucleótidos incluyen ADN y ARN, que codifican la proteína diana. El polinucleótido puede insertarse en cualquier forma siempre que pueda introducirse en una célula huésped y expresarse en ella. Por ejemplo, el polinucleótido puede introducirse en una célula huésped en forma de un casete de expresión, que es una construcción génica que incluye todos los elementos esenciales necesarios para la autoexpresión. El casete de expresión puede incluir convencionalmente un promotor conectado operativamente al polinucleótido, una señal de terminación de la transcripción, un dominio de unión al ribosoma, y una señal de terminación de la traducción. El casete de expresión puede estar en forma de un vector de expresión capaz de autorreplicarse. Adicionalmente, el polinucleótido puede introducirse en una célula huésped tal como está y conectarse operativamente a una secuencia esencial para su expresión en la célula huésped.
Adicionalmente, como se usa en la presente descripción el término "conectado operativamente" se refiere a una conexión funcional entre una secuencia promotora, que inicia y media la transcripción del polinucleótido que codifica la proteína diana de la presente descripción, y la secuencia génica anterior.
El método para transformar un vector de la presente descripción puede incluir cualquier método que pueda introducir un polinucleótido en una célula, y la transformación puede realizarse tras seleccionar una técnica apropiada conocida en la técnica de acuerdo con la célula huésped. Por ejemplo, el método puede incluir electroporación, precipitación con fosfato cálcico (CaPO4), precipitación con cloruro cálcico (CaCh), microinyección, un método con polietilenglicol (PEG), un método con DEAE-dextrano, un método con liposomas catiónicos y un método con acetato de litio/DMSO, etcétera, pero no se limita a ellos.
sería mejor que la célula huésped a usar tuviera una alta eficiencia de introducción de ADN y una alta eficiencia de expresión del ADN introducido, y para el propósito de la presente descripción, la célula huésped puede ser un microorganismo del género Corynebacterium.
Entonces, la introducción de una modificación en la secuencia de control de expresión para incrementar la expresión de un polinucleótido, aunque no está particularmente limitada a esto, puede realizarse mediante la inducción de una modificación en la secuencia polinucleotídica a través de deleción, inserción, sustitución conservadora o sustitución no conservadora, o una combinación de estas para mejorar adicionalmente la actividad de la secuencia de control de expresión; o mediante el reemplazo de la secuencia polinucleotídicas con una secuencia polinucleotídica con una actividad mejorada. La secuencia de control de expresión, aunque no está particularmente limitada a esto, puede incluir un promotor, una secuencia de operador, una secuencia que codifica un dominio de unión al ribosoma, una secuencia para regular la terminación de la transcripción y la traducción, etcétera.
Un promotor exógeno fuerte, en lugar del promotor original, puede conectarse a la región aguas arriba de la unidad de expresión del polinucleótido. Los ejemplos del promotor exógeno fuerte pueden incluir el promotor pcj7, el promotor lysCP1, el promotor EF-Tu, el promotor groEL, el promotor aceA, el promotor aceB, etcétera, y preferentemente, un promotor derivado de Corynebacterium tales como el promotor pcj7 o el promotor lysCP1. La secuencia del promotor lysCP1 y un método para su preparación se describen en la patente coreana núm. 10-0930203, y la totalidad de la
patente coreana anterior se incluye en la presente descripción como ejemplo de referencia. En una modalidad ilustrativa de la presente descripción, se confirmó que la unión del gen ackA al promotor lysCPI, que es un promotor fuerte, dio como resultado una capacidad de utilización de etilo mejorada en comparación con la del grupo control (Figura 3), y el resultado sugiere que a medida que se incrementa la cantidad de expresión del gen ackA, se incrementa la tasa de utilización de acetato.
Además, la modificación de una secuencia polinucleotídica en el cromosoma puede realizarse tras inducir una modificación en la secuencia de control de expresión a través de deleción, inserción, sustitución no conservadora o conservadora, o una combinación de estas para mejorar adicionalmente la actividad de la secuencia polinucleotídica; o tras reemplazarla con una secuencia polinucleotídica mejorada para proporcionar una actividad más fuerte.
Generalmente, la introducción o mejora de la actividad de una proteína puede incrementar la actividad o concentración de la proteína correspondiente en relación con la actividad o concentración de una proteína de tipo salvaje o en una cepa de microorganismos en la etapa inicial de al menos 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 %, o 500 %, hasta un máximo de 1000 % o 2000 %, pero no se limita a esto.
Como se usa en la presente descripción, el término "un microorganismo que produce L-lisina" se refiere a una cepa de microorganismos que puede producir L-lisina para el propósito de la presente descripción, y es una cepa que puede utilizar eficientemente acetato en el medio de cultivo y acumular L -acetato sin inhibición del crecimiento. El microorganismo puede incluir todos los microorganismos del género Corynebacterium que tienen una actividad mejorada de acetato quinasa en comparación con su actividad endógena, por ejemplo, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium flavum, Brevibacterium fermentum, etcétera, pero no se limita a ellos. En una modalidad ilustrativa, el microorganismo del género Corynebacterium puede ser Corynebacterium glutamicum, y los ejemplos de Corynebacterium glutamicum pueden incluir KCCM11016P (Patente coreana núm. 10-0397322), KCCM10770P (Patente coreana núm. 10-0924065), KCCM11347P (Patente coreana número 10-0073610) y CJ3P (Binder y otros. Genome Biology 2012, 13: R40), pero no se limitan a ellos.
En una modalidad ilustrativa de la presente descripción, se confirmó que cuando el gen ackA se sobreexpresaba en Corynebacterium glutamicum KCCM11016P usado como cepa parental del microorganismo representativo del género Corynebacterium, la capacidad de utilización de acetato se incrementó y la cantidad de producción de L-lisina se incrementó sin inhibición del crecimiento (Ejemplos 2 a 6). Además, la sobreexpresión del gen ackA en varios microorganismos del género Corynebacterium (KCCM10770P, KCCM11347P o CJ3P) también mostró un incremento en su capacidad para producir L-lisina (Ejemplo 7), y el resultado sugiere que la capacidad para producir L- la lisina se incrementa por la mejora de la actividad de la proteína en el microorganismo del género Corynebacterium, en el que la acetato quinasa codificada por el gen ackA se usa en la utilización del acetato. Adicionalmente, se confirmó que una adición más de actividad fosfotransacetilasa y/o introducción o mejora de la actividad acetil-CoA, además de la mejora de la actividad de la acetato quinasa, codificada por el gen ackA, también puede incrementar la capacidad de utilización de acetato y la capacidad de producción de L-lisina.
Otro aspecto de la presente descripción proporciona un método para producir L-lisina, que incluye: (i) cultivar el microorganismo novedoso del género Corynebacterium que tiene una capacidad de producción de L-lisina incrementada debido a una capacidad de utilización de acetato incrementada en un medio; y (ii) recuperar L-lisina del medio cultivado o del microorganismo cultivado.
El microorganismo del género Corynebacterium que tiene una capacidad de producción de L-lisina incrementada es el mismo que se describió anteriormente.
Como se usa en la presente descripción, el término “cultivo” se refiere al crecimiento de un microorganismo en condiciones ambientales apropiadas y controladas artificialmente. En la presente descripción, el proceso de obtención de L-lisina mediante el cultivo del microorganismo del género Corynebacterium puede realizarse mediante el uso de los métodos bien conocidos en la técnica. Específicamente, el cultivo puede realizarse de forma continua en un proceso por lotes (proceso de alimentación por lotes o proceso de alimentación por lotes repetido), pero no se limita a ello.
El medio usado en el cultivo debe satisfacer adecuadamente los requisitos para cepas específicas. El medio de cultivo para las cepas de Corynebacterium ya se conoce (por ejemplo, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington DC, EE. UU., 1981). Los ejemplos de las fuentes de carbono a usar en el medio pueden incluir azúcares y carbohidratos tales como glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, almidón y celulosa; aceites y grasas tales como aceite de soja, aceite de girasol, aceite de ricino y aceite de coco; ácidos grasos tales como ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico; alcoholes tales como glicerol y etanol; y ácidos orgánicos tales como ácido glucónico, ácido acético y ácido pirúvico, pero no se limitan a estos. Estas fuentes de carbono pueden usarse solas o en combinación. Los ejemplos de las fuentes de nitrógeno a usar en el medio pueden incluir peptona, extracto de levadura, salsa de carne, extracto de malta, licor de maceración de maíz, harina de soja y urea; o compuestos inorgánico tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Estas fuentes de nitrógeno pueden usarse además solas o en combinación. Los ejemplos de las
fuentes de fósforo a usar en el medio pueden incluir dihidrogenofosfato de potasio, hidrogenofosfato de dipotasio o las correspondientes sales que contienen sodio. Adicionalmente, el medio puede contener sales metálicas tales como sulfato de magnesio o sulfato de hierro necesarios para el crecimiento. Por último, materiales esenciales para el crecimiento, tales como aminoácidos y vitaminas, pueden también contenerse además de los materiales descritos anteriormente. Adicionalmente, pueden usarse precursores adecuados para un medio de cultivo. Estas fuentes pueden añadirse a un cultivo de una manera apropiada durante el cultivo mediante un cultivo por lotes o un cultivo continuo. Estos diversos métodos se describen en las referencias (por ejemplo, "Biochemical Engineering" de James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, 138-176).
El pH de un cultivo puede ajustarse mediante el uso de un compuesto tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio y amoniaco, o un ácido como ácido fosfórico y ácido sulfúrico apropiadamente. Adicionalmente, puede usarse un agente antiespumante tal como un éster de poliglicol de ácido graso para evitar la generación de espuma. Adicionalmente, para mantener el estado aeróbico del cultivo, puede inyectarse oxígeno o un gas que contenga oxígeno (por ejemplo, aire) en el cultivo. La temperatura de cultivo puede ser normalmente de 20 °C a 45 °C, específicamente, de 25 °C a 40 °C, pero puede variar de acuerdo con las condiciones. Adicionalmente, el cultivo puede continuarse hasta que se obtenga la cantidad máxima del L-aminoácido deseado, lo que puede lograrse en 10 a 100 horas. La L-lisina puede secretarse en un medio de cultivo o puede estar contenida en células.
El método para producir L-lisina de la presente descripción puede incluir recuperar lisina del microorganismo cultivado o del medio cultivado. El método para recuperar L-lisina del microorganismo cultivado o el medio cultivado puede realizarse mediante el uso de un método conocido en la técnica, por ejemplo, centrifugación, filtración, cromatografía de intercambio aniónico, cristalización, HPLC, etcétera), pero el método no está limitado al mismo.
La recuperación puede incluir un proceso de purificación.
Descripción detallada
En lo adelante, los microorganismos y métodos de la descripción se describirán con más detalle con referencia a los siguientes ejemplos y ejemplos experimentales.
Ejemplo 1: Preparación de un vector para insertar ackA, pta o pta y ackA en el cromosoma
Con el fin de preparar un vector para insertar adicionalmente de forma independiente o simultánea el gen ackA y el gen pta en el cromosoma de Corynebacterium, se usó el vector pDZTN (patente coreana núm. 10-1126041) diseñado a partir del vector pDZ como vector básico para la inserción de genes diana en la región de transposones. Dado que los dos genes establecen un operón en forma de pta-ackA, para la única sobreexpresión del gen ackA para una inserción adicional, la región promotora del operón pta-ackA se unió operativamente a la región aguas arriba del marco de lectura abierto (ORF) del gen ackA. Las secuencias de cebadores usadas en los Ejemplos se muestran en la Tabla 1 a continuación.
Para la preparación de un vector para la inserción adicional del gen ackA, se sintetizaron cebadores (SEQ ID NOS: 1 y 2) para amplificar el gen ackA basados en las secuencias polinucleotídicas informadas anteriormente, y la región ORF del gen ackA con un tamaño de aproximadamente 1300 pb se amplificó por PCR mediante el uso del cromosoma de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 como molde. En particular, la PCR se realizó en las siguientes condiciones: desnaturalización a 94 °C durante 5 min; 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridación a 56 °C durante 30 segundos y polimerización a 72 °C durante 90 segundos; y polimerización a 72 °C durante 7 min. Las partes subrayadas en las secuencias polinucleotídicas representan los sitios de restricción.
Tabla 1
Además, se sintetizaron cebadores (SEQ ID NOS: 3 y 4) para amplificar la región promotora del operón pta-ackA y se amplificó una región promotora con un tamaño de aproximadamente 350 pb por PCR mediante el uso del ADN cromosómico de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 como plantilla. En particular, la PCR se realizó en las siguientes condiciones: desnaturalización a 94 °C durante 5 min; 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridación a 56 °C durante 30 segundos y polimerización a 72 °C durante 90 segundos; y polimerización a 72 °C durante 7 min. Las partes subrayadas en las secuencias polinucleotídicas representan los sitios de restricción.
Los fragmentos de ADN amplificados por PCR se trataron con enzimas de restricción, SpeI y NdeI, para obtener segmentos de ADN, respectivamente. Los segmentos de ADN así obtenidos se ligaron en el vector pDZTN que tenía un extremo Spel, se transformaron en E. coli DH5a y se sembraron en medio sólido LB que contenía kanamicina (25 mg/l). Se seleccionaron las colonias transformadas con el vector, en las que se insertó un gen diana, se obtuvo el plásmido mediante el método de extracción de plásmido conocido convencionalmente, y el plásmido así obtenido se denominó pDZTN-Ppta_ackA.
Para la preparación de un vector para la inserción adicional del gen pta, se sintetizó un cebador (SEQ ID NO: 5) en la región del extremo ORF del gen pta, y se amplificó la región del gen pta con un tamaño de aproximadamente 1750 pb por PCR mediante el uso del cromosoma de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 como plantilla junto con cebadores (SEQ ID NOS: 3 y 5) para la amplificación de la región que se extiende desde el promotor hasta el extremo ORF del gen pta. En particular, la PCR se realizó en las siguientes condiciones: desnaturalización a 94 °C durante 5 min; 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridación a 56 °C durante 30 segundos y polimerización a 72 °C durante 90 segundos; y polimerización a 72 °C durante 7 min.
Los fragmentos de ADN amplificados por PCR se trataron con una enzima de restricción, Spel, para obtener segmentos de ADN. Los segmentos de ADN así obtenidos se ligaron en un vector pDZTN que tenía un extremo Spel para obtener un plásmido y el plásmido se denominó pDZTN-pta.
Para la preparación de un vector para la inserción simultánea de los dos genes en forma de operón, se obtuvo la región del gen pta-ackA con un tamaño de aproximadamente 3000 pb por PCR mediante el uso del cromosoma de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 como plantilla junto con cebadores (SEQ ID NOS: 3 y 2), que son para amplificar la región que se extiende desde la región promotora prevista del operón del gen pta-ackA (SEQ ID NO: 10) hasta el extremo ORF del gen ackA. En particular, la PCR se realizó en las siguientes condiciones: desnaturalización a 94 °C durante 5 min; 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridación a 56 °C durante 30 segundos y polimerización a 72 °C durante 3 minutos; y polimerización a 72 °C durante 7 min. Los fragmentos de ADN amplificados por PCR se trataron con una enzima de restricción, SpeI, para obtener segmentos de ADN. Los segmentos de ADN así obtenidos se ligaron en un vector pDZTN que tenía un extremo SpeI para obtener un plásmido y el plásmido se denominó pDZTN-pta-ackA.
Ejemplo 2: Análisis de la capacidad de utilización de acetato de la cepa con el gen ackA y/o pta insertado en el cromosoma
Los tres tipos de vectores preparados en el Ejemplo 1, es decir, pDZTN-Ppta_ackA, pDZTN-pta, y pDZTN-pta-ackA, se transformaron en Corynebacterium glutamicum KCCM11016P (el microorganismo se describió originalmente como KFCC10881, y se volvió a depositar ante una autoridad internacional de depósito bajo el Tratado de Budapest y se le asignó el número de acceso KCCM11016P; patentes coreanas números 10-0159812 y 10-0397322) por el método de pulso eléctrico, y las cepas, en las que los genes diana se insertaron en el cromosoma mediante recombinación homóloga, se aislaron selectivamente por PCR y denominado KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn), KCCM11016P::pta(Tn), and KCCM11016P::pta-ackA(Tn).
Los tres tipos de cepas y el grupo control se inocularon en un matraz con deflector de esquina de 250 ml que contenía 25 ml de medio de cultivo para siembra y se cultivaron con agitación a 200 rpm a 30 °C durante 20 horas. A continuación, se inoculó 1 ml de la solución de cultivo para siembra en un matraz con deflector de esquina de 250 ml que contenía 24 ml del medio de producción y se cultivó con agitación a 200 rpm, a 37 °C durante 96 horas. El medio cultivado se recogió cada 12 horas durante el cultivo y se analizaron la cantidad de glucosa y acetato que quedaba en el medio cultivado y la absorbancia a 562 nm, y los resultados se muestran en las Figuras 1a y 1b.
Medio de cultivo para siembra (pH 7,0)
Glucosa (20 g), (NH4)2SO4 (10 g), peptona (10 g), extracto de levadura (5 g), urea (1,5 g), K2HPO4 (4 g), K2HPO4 (8 g), MgSO47H2O (0,5 g), biotina (100 pg), tiamina HCl (1000 g), calcio-ácido pantoténico (2000 g), y nicotinamida (2000 g) (basado en 1 l de agua destilada)
Medio de producción (pH 7,0)
Glucosa (100 g), acetato de amonio (7,1 g) (con o sin adición), (NH4)2SO4 (40 g), proteína de soja (2,5 g), sólidos de maceración de maíz (5 g), urea (3 g), KH2PO4 (1 g), MgSO4 7 H2O (0,5 g), biotina (100 pg), tiamina HCl (1000 pg), calcio-ácido pantoténico (2000 pg), nicotinamida (3000 pg) y CaCO3 (30 g) (basado en 1 l de agua destilada)
Como se muestra en la Figura 1a, la cepa KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn) produjo acetato en un medio sin acetato mientras consumía glucosa y consumía acetato después de consumir toda la glucosa, a diferencia de la cepa parental KCCM11016P. A partir de este resultado, se confirmó que la acetato quinasa está involucrada en la producción de acetato. Adicionalmente, se observó que la tasa de cultivo se retrasó tras la producción de acetato.
Sin embargo, como se muestra en la Figura 1b, la cepa KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn) mostró una característica de consumo de acetato más rápido en la etapa inicial de cultivo cuando se cultivó en un medio con acetato, en comparación con la cepa KCCM11016P (grupo control), y como resultado, la fase de latencia en el crecimiento de la cepa se redujo significativamente en comparación con la del grupo control. La cepa KCCM11016P::pta(Tn) no mostró una diferencia significativa en la tasa de consumo de acetato en comparación con la del grupo control. Sin embargo, se confirmó que la cepa KCCM11016P::pta-ackA(Tn), en la que se introdujeron dos genes en forma de operón, mostró un incremento ligero en la tasa de consumo de acetato en comparación con la cepa KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn), en la que solo se introdujo el gen ackA.
A partir de los resultados anteriores, se confirmó que la acetato quinasa, que está codificada por el gen ackA, es la principal enzima en la producción o activación de acetato, y está involucrada en la producción de acetato cuando el acetato no está presente en el medio, mientras que cuando el acetato está presente en el medio, se usa en la vía de activación del acetato. Adicionalmente, se confirmó que la sobreexpresión de ackA puede incrementar significativamente la capacidad de utilización de acetato debido a la mejora de la vía de activación mientras que reduce la inhibición del crecimiento, lo que de esta manera reduce posiblemente la fase de latencia.
Ejemplo 3: Preparación de una cepa que sobreexpresa el gen ackA mediante un promotor fuerte y confirmación de su efecto
Con el fin de reconfirmar la capacidad de utilización de acetato y su efecto por la sobreexpresión del gen ackA, se intentó inducir la expresión del gen ackA que se inserta adicionalmente mediante el uso del promotor lysCP1 (Patente coreana núm. 10-0930203), que es un promotor fuerte informado anteriormente. Los cebadores usados en los Ejemplos de la presente descripción se muestran en la Tabla 2 a continuación.
Se preparó un vector para insertar un cromosoma mediante el uso del vector pDZTn descrito en el Ejemplo 1 como vector básico. Los cebadores (SEQ ID NOS: 6 y 7) para amplificar la región promotora lysCP1 se sintetizaron basados en las secuencias polinucleotídicas reportadas anteriormente, y se obtuvo un segmento de ADN con un tamaño de aproximadamente 450 pb por PCR mediante el uso del ADN cromosómico de Corynebacterium glutamicum. KCCM11016P-lysCP1 (Patente coreana núm. 10-0930203) como plantilla. En particular, la PCR se realizó en las siguientes condiciones: desnaturalización a 94 °C durante 5 min; 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridación a 56 °C durante 30 segundos y polimerización a 72 °C durante 30 segundos; y polimerización a 72 °C durante 7 min.
Tabla 2
Los fragmentos de ADN amplificados por PCR se trataron con enzimas de restricción, XhoI y NdeI, para obtener segmentos de ADN, respectivamente. Los fragmentos de ADN así obtenidos se ligaron en el vector pDZTN que tiene extremos XhoI y SpeI junto con los fragmentos de ADN alrededor de la región ORF del gen ackA que tiene extremos NdeI y SpeI preparados en el Ejemplo 1, transformados en E. coli DH5a, y se sembró en medio sólido LB que contenía kanamicina (25 mg/l). Se seleccionaron las colonias transformadas con el vector, en las que se insertó un gen diana, se obtuvo el plásmido por el método de extracción de plásmido convencionalmente conocido, y el plásmido así obtenido se denominó pDZTN-lysCP1_ackA (Figura 2).
El vector pDZTN-lysCP1_ackA así preparado se transformó en Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, que produce L-lisina, mediante recombinación homóloga. Después, las colonias, en las que pDZTN-lysCP1_ackA se integró en el cromosoma por PCR, se aislaron selectivamente y se denominaron KCCM11016P::lysCP1_ackA(Tn).
La cepa KCCM11016P::lysCP1_ackA(Tn), la cepa KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn) y la cepa KCCM11016P (grupo control) se cultivaron de la misma manera que en el Ejemplo 2, y la cantidad de acetato restante en el medio de cultivo se analizó cada 12 horas. Los resultados se muestran en la Figura 3.
Como resultado, la cepa KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn) mostró una capacidad de utilización de acetato mejorada en comparación con el grupo control, como se muestra en el resultado del Ejemplo 2. Adicionalmente, se confirmó que la cepa KCCM11016P::lysCP1_ackA(Tn) mostró una tasa de consumo de acetato incrementada en comparación con la cepa KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn).
El resultado anterior indica que la tasa de utilización de acetato se incrementa a medida que se incrementa la cantidad de expresión del gen ackA y, a partir del resultado, se volvió a confirmar que la sobreexpresión del gen ackA es la principal causa de incremento de la capacidad de utilización de acetato.
Ejemplo 4: Análisis de la capacidad de producción de Usina de la cepa que sobreexpresa el gen ackA
Para confirmar la capacidad de producción de Usina de la cepa Corynebacterium glutamicum KCCM11016P::lysCP1_ackA(Tn) preparada en el Ejemplo 3, se cultivó la cepa Corynebacterium glutamicum KCCM11016P::lysCP1_ackA(Tn) junto con la cepa KCCM11016P (grupo control) de la misma manera que en el Ejemplo 2. Tras el completamiento del cultivo, se analizó la concentración de L-lisina por HPLC y los resultados se muestran en la Tabla 3 a continuación.
Como resultado, cuando las cepas se cultivaron mediante el uso de glucosa como única fuente de carbono sin adición de acetato, la cepa KCCM11016P::lysCP1_ackA(Tn) mostró el mismo nivel de capacidad de producción de lisina que el grupo control, como se muestra en la Tabla 3. Sin embargo, se confirmó que cuando las cepas se cultivaron en medios que contenían acetato, la cepa KCCM11016P::lysCP1_ackA(Tn) mostró un incremento promedio del 12 % en el rendimiento de lisina (rendimiento total de la fuente de carbono = concentración de lisina/(cantidad añadida de (glucosa acetato)) en comparación con el grupo control.
Los resultados anteriores apoyan que la mejora de la vía de activación del acetato no solo incrementa la capacidad de utilización de acetato sino también la capacidad de producción de L-lisina. Adicionalmente, estos resultados sugieren que, cuando se usa acetato como fuente de carbono, el uso de la cepa con el gen ackA mejorado de la presente descripción puede producir lisina con alto rendimiento mientras se reduce el tiempo de cultivo sin inhibición del crecimiento celular.
En estas circunstancias, los presentes autores denominaron a la cepa KCCM11016P::lysCP1_ackA(Tn) con capacidad de utilización de acetato y capacidad de producción de L-lisina incrementadas como Corynebacterium glutamicum "CA01-2278" depositada en el Centro de cultivo coreano de microorganismos (KCCM) en el número de depósito KCCM11480P.
Ejemplo 5: Preparación de una cepa introducida con el gen acs y análisis del efecto de la cepa
Para insertar la vía de activación del acetato derivada de Escherichia en el cromosoma de Corynebacterium, se preparó un vector para la inserción del cromosoma mediante el uso del vector pDZTn mencionado en el Ejemplo 1 como vector básico, después de obtener el gen acs (SEQ ID NO: 11), que se conoce como la vía de activación del acetato derivada de Escherichia. La expresión se indujo tras unir operativamente el promotor del gen pta-ackA derivado de Corynebacterium en la región aguas arriba del codón de iniciación del gen acs. Los cebadores usados en la presente descripción se muestran en la Tabla 4 a continuación.
Los cebadores (SEQ ID NOS: 8 y 9) para amplificar la región del gen acs se sintetizaron basados en las secuencias polinucleotídicas informadas anteriormente, y la región ORF del gen acs con un tamaño de aproximadamente 2000 pb se amplificó por PCR mediante el uso del cromosoma de la cepa E. coli W(ATCC9637) como plantilla. En particular, la PCR se realizó en las siguientes condiciones: desnaturalización a 94 °C durante 5 min; 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridación a 56 °C durante 30 segundos y polimerización a 72 °C durante 2 minutos; y polimerización a 72 °C durante 7 min.
Tabla 4
Los fragmentos de ADN amplificados por PCR se trataron con las enzimas de restricción, SpeI y NdeI, junto con los fragmentos de ADN del promotor del operón pta_ackA, que se obtuvieron en el Ejemplo 5, para obtener cada segmento de ADN. Los segmentos de ADN así obtenidos se ligaron en el vector pDZTN que tenía un extremo SpeI, se transformaron en E. coli DH5a y se sembraron en medio sólido LB que contenía kanamicina (25 mg/l). Se seleccionaron las colonias transformadas con el vector, en las que se insertó un gen diana, se obtuvo el plásmido mediante el método de extracción de plásmido convencionalmente conocido, y el plásmido así obtenido se denominó pDZTN-Ppta-acs.
El vector así preparado se transformó en Corynebacterium glutamicum KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn) preparado en el Ejemplo 2 mediante el método de pulso eléctrico, y se seleccionaron las cepas en las que se insertó el gen acs en el cromosoma mediante recombinación homóloga. En particular, aquellas colonias en las que se insertó el gen acs en un transposón diferente del transposón en el que se insertó previamente el gen Ppta_ackA se aislaron selectivamente por PCR y se denominaron KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn)-Ppta_acs(Tn).
La cepa KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn)-Ppta_acs(Tn) y la cepa KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn) (grupo control) se cultivaron de la misma manera que en el Ejemplo 2, y la cantidad de acetato restante en el medio de cultivo se analizó cada 12 horas.
Como resultado, se confirmó que la cepa KCCM11016P::Ppta_ackA(Tn)-Ppta_acs(Tn) mostró un incremento ligero en la tasa de consumo de acetato en comparación con el grupo control (Figura 3).
El resultado sugiere que no solo la sobreexpresión del gen ackA sino también la introducción del gen acs, que es un gen extraño derivado de Escherichia, en un microorganismo del género Corynebacterium puede incrementar la tasa de consumo de acetato y la capacidad de producción de L-lisina.
Ejemplo 7: Comparación de la capacidad de producción de L-lisina de cepas, las cuales sobreexpresan el gen ackA, derivadas de la cepa productora de L-lisina
Para confirmar el efecto de mejorar la producción de lisina por las cepas que sobreexpresan ackA, se comparó la capacidad de producción de L-lisina de varias cepas productoras de lisina derivadas de Corynebacterium.
El gen ackA se introdujo en tres cepas representativas productoras de lisina, Corynebacterium glutamicum KCCM10770P (Patente coreana núm. 10-0924065), KCCM11347P (el microorganismo se describió originalmente como KFCC10750 y se volvió a depositar en una autoridad internacional de depósito en virtud del Tratado de Budapest y se asignó el número de acceso KCCM11347P; la patente coreana número 10-0073610) y CJ3P (Binder y otros. Genome Biology 2012, 13: R40), y se compararon sus capacidades de producción de L-lisina.
El vector pDZTN-lysCP1_ackA preparado en el Ejemplo 3 se transformó en Corynebacterium glutamicum KCCM10770P, KCCM11347P y CJ3P, respectivamente en el cromosoma mediante recombinación homóloga. Después, las colonias se aislaron selectivamente por PCR, y cada una de las cepas se denominó KCCM10770P::lysCP1_ackA(Tn), KCCM11347P::lysCP1_ackA(Tn) y CJ3P::lysCP1_ackA(Tn), respectivamente.
Para la comparación de la capacidad de producción de lisina de las cepas anteriores, las cepas se cultivaron junto con cada uno de los grupos de control de la misma manera que en el Ejemplo 2. Tras el completamiento del cultivo, se analizó la concentración de L-lisina por HPLC y los resultados se muestran en la Tabla 5 a continuación.
Tabla 5
Como resultado, como se m uestra en la Tabla 5, todas las cepas que s obreexpresan ackA derivadas de una cepa productora de lisina mostraron un incremento en la capacidad de producción de L-lisina. La cepa KCCM10770P::lysCP1_ackA(Tn) mostró un incremento de aproximadamente 11 % en la concentración de lisina en co mparación con la cepa KCCM10770P (grupo control). La cepa KCCM11347P::lysCP1_ackA(Tn) mostró un incremento de aproximadamente 10 % en la concentración de lisina en comparación con la cepa KCCM11347P (grupo control). La cepa CJ3P::lysCP1_ackA(Tn) mostró un incremento de aproximadamente 11 % en la concentración de lisina en comparación con la cepa CJ3P (grupo control).
Por consiguiente, a partir de los resultados anteriores, se confirmó que el incremento en la actividad de la acetato quinasa en varios tipos de cepas productoras de L-lisina derivadas de Corynebacterium glutamicum tiene el efecto de incrementar la capacidad de producción de L-lisina.
Claims (12)
1. Un método para producir L-lisina, que comprende:
(i) cultivar un microorganismo modificado del género Corynebacterium en el que se mejora una actividad de la acetato quinasa en comparación con la de un microorganismo no modificado en un medio, en donde la actividad de la acetato quinasa se mejora mediante al menos un método seleccionado del grupo que consiste en un método para incrementar el número de copias de un polinucleótido que codifica la acetato quinasa, un método para introducir una modificación en la secuencia reguladora de un gen que codifica la acetato quinasa, un método para sustituir la secuencia reguladora de un gen que codifica la acetato quinasa en el cromosoma con una secuencia que tiene una actividad fuerte, un método para sustituir el gen que codifica la acetato quinasa por un gen mutado para incrementar la actividad de la acetato quinasa y un método para introducir una modificación en el gen que codifica la acetato quinasa en el cromosoma para mejorar la actividad de la acetato quinasa; y
(ii) recuperar L-lisina del microorganismo cultivado o del medio cultivado.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde, en el microorganismo modificado:
(i) se mejora una actividad de la fosfotransacetilasa en comparación con su actividad endógena;
(ii) se introduce o mejora una actividad de acetil-CoA sintetasa; o
(iii) se mejora una actividad de la fosfotransacetilasa en comparación con su actividad endógena y se introduce o mejora una actividad de acetil-CoA sintetasa.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el microorganismo del género Corynebacterium es Corynebacterium glutamicum.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la acetato quinasa consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la fosfotransacetilasa consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la acetil-CoA sintetasa consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.
7. Uso de un microorganismo modificado del género Corynebacterium en el que se mejora una actividad de la acetato quinasa en comparación con la de un microorganismo no modificado, para producir L-lisina, en donde la actividad de la acetato quinasa se mejora mediante al menos un método seleccionado del grupo que consiste en un método para incrementar el número de copias de un polinucleótido que codifica la acetato quinasa, un método para introducir una modificación en la secuencia reguladora de un gen que codifica la acetato quinasa, un método para sustituir la secuencia reguladora de un gen que codifica la acetato quinasa en el cromosoma con una secuencia que tiene una actividad fuerte, un método para sustituir el gen que codifica la acetato quinasa por un gen mutado para incrementar la actividad de la acetato quinasa, y un método para introducir una modificación en el gen que codifica la acetato quinasa en el cromosoma para mejorar la actividad de la acetato quinasa.
8. El uso de la reivindicación 7, en donde, en el microorganismo modificado:
(i) se mejora una actividad de la fosfotransacetilasa en comparación con su actividad endógena;
(ii) se introduce o mejora una actividad de acetil-CoA sintetasa; o
(iii) se mejora una actividad de la fosfotransacetilasa en comparación con su actividad endógena y se introduce o mejora una actividad de acetil-CoA sintetasa.
9. El uso de la reivindicación 7, en donde el microorganismo del género Corynebacterium es Corynebacterium glutamicum.
10. El uso de la reivindicación 7, en donde la acetato quinasa consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.
11. El uso de la reivindicación 7, en donde la fosfotransacetilasa consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.
12. El uso de la reivindicación 7, en donde la acetil-CoA sintetasa consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.
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