ES2682696T3 - Microorganismo recombinante con productividad de putrescina mejorada, y procedimiento de producción de putrescina utilizando el mismo - Google Patents

Abstract

Un microorganismo de Corynebacterium glutamicum recombinante que tiene la capacidad para producir putrescina, en el que el microorganismo se ha modificado de manera que una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 17 o la SEQ ID NO: 19, o la expresión de las mismas, está modificada en el microorganismo para debilitar o eliminar la actividad de dicha proteína y aumentar la producción de putrescina en comparación con la actividad de dicha proteína y la producción de putrescina en la misma cepa de microorganismo pero sin modificar, en el que la actividad de la proteína está debilitada por 1) una eliminación parcial o completa de un polinucleótido que codifica la proteína, 2) una reducción de la expresión del polinucleótido, 3) una modificación de la secuencia de polinucleótido en el cromosoma para debilitar la actividad de la proteína o 4) una combinación de las mismas.

Description

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DESCRIPCION

Microorganismo recombinante con productividad de putrescina mejorada, y procedimiento de produccion de putrescina utilizando el mismo

Campo de la tecnica

La presente invencion se refiere a microorganismos recombinantes que tienen una capacidad mejorada para producir putrescina y un procedimiento para la produccion de putrescina utilizando los mismos.

Tecnica antecedente

La putrescina (o 1,4-butanodiamina) es un tipo de poliamina, tal como la espermidina y espermina, y se encuentra en bacterias Gram-negativas y hongos. Como la putrescina esta presente en un amplio intervalo de concentraciones en distintas especies, se espera que tenga un papel importante en el metabolismo de los microorganismos. La putrescina se produce comunmente por smtesis qmmica mediante acrilonitrilo y succinonitrilo a partir de propileno. La smtesis qmmica utiliza sustancias derivadas de petroqmmicos como materiales de partida y utiliza qmmicos toxicos, y por lo tanto no respeta el medio ambiente y tiene un problema de agotamiento de petroleo.

Con el fin de resolver estos problemas, se ha investigado mucho sobre el desarrollo de un procedimiento de biosmtesis de putrescina utilizando microorganismos, que es mas cuidadosos con el medio ambiente y reduce el consumo de energfa. De acuerdo con el conocimiento actual, la putrescina se puede biosintetizar mediante dos rutas. En una ruta, se produce ornitina a partir de glutamato y la ornitina se descarboxila para sintetizar putrescina. En la otra ruta, se sintetiza a partir de ornitina, se produce agmatina a partir de arginina, y entonces se sintetiza la putrescina a partir de agmatina. Ademas, hay otros procedimientos para sintetizar putrescina utilizando un microorganismo diana que se transforma con las enzimas implicadas en las rutas sinteticas conocidas de putrescina. Por ejemplo, el documento WO 09/125924 desvela un procedimiento para la produccion de putrescina con alto rendimiento inactivando la ruta implicada en la descomposicion y utilizacion de putrescina en E. coli, inactivando la ruta en la que la ornitina, un precursor de putrescina se convierte en arginina, y aumentando la ruta biosintetica de la ornitina. Un artmulo publicado en 2010 desvela un procedimiento para la produccion de putrescina a altas concentraciones introduciendo y aumentando la protema que convierte la ornitina en putrescina en cepas de Corynebacterium que no son capaces de producir putrescina. Ademas, desvela un procedimiento de produccion de putrescina a partir de arginina introduciendo arginina descarboxilasa y agmatinasa derivadas de E. coli en las cepas. A este respecto, la ruta ornitina produda una cantidad aproximadamente 50 veces mayor que la ruta de arginina (Schneider y col., Appl. Microbiol. Biotechnol. 88:4, 859-868, 2010).

Divulgacion

Problemas tecnicos

En este escenario, los presentes inventores identificaron que la putrescina se puede producir con un alto rendimiento en un microorganismo del genero Corynebacterium debilitando o eliminando la actividad de la protema NCgl0101, completando de esta manera la presente invencion.

Solucion tecnica

Un objetivo de la presente invencion es proporcionar un microorganismo recombinante del genero Corynebacterium capaz de producir putrescina con alto rendimiento, que se modifica para que tenga una actividad de NCgl0101 debilitada, en comparacion con la actividad endogena de la misma.

Otro objetivo de la presente invencion es proporcionar un procedimiento para la produccion de putrescina utilizando el microorganismo.

Efecto ventajoso

Cuando el microorganismo del genero Corynebacterium que tiene una capacidad mejorada para producir putrescina de la presente invencion se utiliza para la produccion de putrescina, se modifica para debilitar la actividad de NCgl0l01 en comparacion con la actividad endogena de la misma, se puede producir putrescina con alto rendimiento. En consecuencia, el microorganismo puede utilizarse ampliamente para la produccion mas eficaz de putrescina.

Descripcion de las figuras

La FIG. 1 representa un diagrama esquematico que muestra las posiciones relativas de genes que codifican NCgl0100, Ncgl0101, NCgl0102, NCgl0103 y NCgl0104, que estan en el cromosoma de la cepa de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 de tipo silvestre; y

La FIG. 2 representa el resultado del ensayo de comparacion de crecimiento entre las cepas recombinantes preparados en la presente invencion, en el que se preparan 1, 2, 3, 4, 5 y 6 cepas introduciendo los pHC139T, pHC139T-P(CJ7)-NCgl0100, pHC139T-P(CJ7)-tNCgl0100, pHC139T-P(CJ7)-NCgl0101, pHC139T-P(CJ7)-

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NCgl0102-NCgl0103, y pHC139T-P(CJ7)-NCgl0104 en KCCM 11138P, respectivamente.

Mejor modo

En un aspecto para conseguir los objetivos anteriores, la presente invencion proporciona un microorganismo recombinante de Corynebacterium glutamicum que tiene la capacidad de producir putrescina, en el que el microorganismo se ha modificado de manera que una protema que tiene una secuencia de aminoacidos representada por la SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 19, o la expresion de la misma, se modifica en el microorganismo para debilitar o eliminar la actividad de dicha protema y el aumento de la produccion de putrescina en comparacion con la actividad de dicha protema y la produccion de putrescina en la misma cepa de microorganismo pero sin modificar, en el que la actividad de la protema se debilita por 1) una eliminacion parcial o completa de un polinucleotido que codifica la protema, 2) una reduccion de la expresion del polinucleotido, 3) una modificacion de la secuencia del polinucleotido en el cromosoma para debilitar la actividad de la protema o 4) una combinacion de los mismos.

Como se utiliza en el presente documento, el termino “NCgl0101” significa una protema que presenta la actividad de una enzima dependiente de un metal, que se expresan en Corynebacterium glutamicum, y cuya funcion no se conoce aun completamente. Incluye un dominio de union al metal de la familia M20 de peptidasas o la protema de utilizacion de glutamato de aminobenzoilo (AbgB). La AbgB de E. coli constituye la glutamato de aminobenzoilo hidrolasa con AbgA para hidrolizar el glutamato de aminobenzoilo a aminobenzoato y glutamato. El aminobenzoato se sebe que se utiliza como un precursor para la smtesis de folato, pero su relacion con la productividad de putrescina no se conoce.

La protema NCgl0101 de la presente invencion puede comprender la secuencia de aminoacidos representada por la SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 19. Sin embargo, no se limita a estas, debido a que puede haber diferencia en la secuencia de aminoacidos de la protema dependiendo de la especie o cepas del microbio. En otras palabras, puede ser una protema mutante o variante artificial con una secuencia de aminoacidos que comprende una sustitucion, eliminacion, insercion, o adicion de uno o varios aminoacidos en una o mas localizaciones de la secuencia de aminoacidos representada por la SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 19, a condicion de que ayude a aumentar la capacidad para producir putrescina por debilitamiento de la actividad de la protema. En el presente documento, “varios” puede diferenciarse dependiendo de la localizacion o tipo en la estructura tridimensional de los restos de aminoacidos de la protema, pero significa espedficamente 2 a 20, espedficamente 2 a 10, y mas espedficamente 2 a 5. Ademas, la sustitucion, eliminacion, insercion, adicion o inversion del aminoacido incluye los producidos por variantes artificiales o mutacion natural, basandose en la diferencia del individuo o especie del microorganismo.

El polinucleotido que codifica la secuencia de aminoacidos de la presente invencion puede comprender la secuencia de polinucleotidos que codifica la protema que tiene la secuencia de aminoacidos representada por la SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 19, o la secuencia de aminoacidos con un 80 % o mas, espedficamente un 90 % o mas, mas espedficamente un 95 % o mas, y particularmente espedficamente un 97 % o mas de homologfa con la misma, a condicion de que tenga una actividad similar que la protema NCgl0101. Mas espedficamente, puede ser la secuencia de polinucleotidos representada por la SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18.

El termino “homologfa” se refiere a la identidad entre dos secuencias de aminoacidos y puede determinarse por el procedimiento bien conocido por los expertos en la tecnica, que utiliza BLAST 2.0 para computar los parametros tales como valoracion, identidad y similitud.

Ademas, la secuencia de polinucleotido que codifica la NCgl0101 de la presente invencion se puede hibridar con el polinucleotido de la SEQ ID NO: 16 o la sonda preparada de la misma en 'condiciones rigurosas', y puede ser una secuencia de polinucleotido modificada que codifica la protema NCgl0101 que normalmente funciona. Como se utiliza en el presente documento, “condiciones rigurosas” se refiere a condiciones que permiten la hibridacion espedfica entre el oligonucleotido, y se describen espedficamente, por ejemplo, en Molecular Cloning (A Laboratory Manual, J. Sambrook y col., Editores, 2a Edicion, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989) o Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel y col., Editores, John Wiley & Sons, Inc., New York). Por ejemplo, se lleva a cabo la hibridacion en el tampon de hibridacion a 65 °C (3,5 x SSC, 0,02 % de Ficoll, 0,02 % de polivinilpirrolidona, un 0,02 % de albumina serica bovina, 2,5 mM de NaH2PO4 (pH 7), un 0,5 % de SDS, 2 mM de EDTA). El SSC es 0,15 M de cloruro sodico/0,15 M de citrato sodico de pH 7. Despues de la hibridacion, la membrana a la que se transfiere el ADN se aclara con 2 x SSC a temperatura ambiente y despues se aclara de nuevo con 0,1 a 0,5 x SSC/0,1 x SDS a una temperatura de 68 °C.

La actividad de la protema NCgl0101 de la presente invencion puede estar debilitado por 1) una eliminacion parcial o completa de un polinucleotido que codifica la protema, 2) modificacion de una secuencia reguladora de la expresion para reducir la expresion del polinucleotido, 3) una modificacion de la secuencia de polinucleotido en el cromosoma o 4) una combinacion de los mismos.

En lo anterior, se puede llevar a cabo una eliminacion parcial o completa de un polinucleotido que codifica la protema sustituyendo el polinucleotido que codifica una protema diana endogena en el cromosoma por un gen marcador o un polinucleotido cuya secuencia parcial se ha eliminado, con un vector para la insercion genetica

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cromosomica. La longitud de la eliminacion “parcial” depende del tipo de polinucleotido, pero es espedficamente de 2 pb a 200 pb, mas espedficamente de 100 pb a 100 pb, y mas espedficamente de 1 pb a 5 pb.

Tambien, para disminuir la expresion del polinucleotido, se puede modificar una secuencia reguladora de la expresion induciendo mutaciones en la secuencia reguladora de la expresion mediante eliminacion, insercion, sustitucion conservadora o no conservadora de la secuencia de nucleotidos o una combinacion de la misma para debilitar adicionalmente la actividad de la secuencia reguladora de la expresion, o sustituyendo la secuencia reguladora de la expresion por una secuencia que tenga una actividad mas debil. La secuencia reguladora de la expresion puede incluir una secuencia codificante de promotor, secuencia operadora, sitio de union al ribosoma y la secuencia que controla la terminacion de la transcripcion o traduccion.

Ademas, la secuencia de polinucleotido en el cromosoma para debilitar la actividad de la protema se puede modificar induciendo mutaciones en la secuencia mediante eliminacion, insercion, sustitucion conservadora o no conservador de la secuencia de nucleotidos o una combinacion de las mismas para debilitar adicionalmente la actividad de la secuencia, o sustituyendo la secuencia de polinucleotidos con la secuencia modificada que tiene una actividad de la protema mas debil.

Entre tanto, se puede modificar adicionalmente un microorganismo del genero Corynebacterium que tenga una capacidad mejorada para producir putrescina de la presente invencion para debilitar la actividad de la ornitina carbamoil transferasa (ArgF) implicada en la smtesis de arginina a partir de ornitina y/o la actividad de la protema (NCgl1221) implicada en la exportacion de glutamato, en comparacion con la actividad endogena de la misma. Ademas, se puede modificar el microorganismo del genero Corynebacterium se puede modificar introduciendo adicionalmente la actividad de la ornitina descarboxilasa (ODC). Tambien, se puede modificar adicionalmente el microorganismo del genero Corynebacterium para mejorar la actividad de la acetil glutamato sintasa para convertir el glutamato a acetil glutamato, la actividad de la ornitina acetiltransferasa (ArgJ) para convertir la acetil ornitina a ornitina, la actividad de la acetil glutamato cinasa (ArgB) para convertir la acetil glutamato a acetil glutamil fosfato, la actividad de la acetil glutamil fosfato reductasa (ArgC) para convertir el acetil glutamil fosfato en acetil glutamato semialdeddo, y/o la actividad de acetil ornitina amino transferasa (ArgD) para convertir el acetil glutamato semialdeddo en acetil ornitina, en comparacion con las actividades endogenas de los mismos, aumentando de esta manera la ruta biosintetica de la ornitina, un precursor de putrescina (Sakanyan V y col., Microbiology. 142:1, 99108, 1996).

En este caso, ArgF, NCgl1221, ODC, ArgC, ArgJ, ArgB y ArgD pueden tener, pero no se limitan a, las secuencias de aminoacidos representadas en SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, respectivamente, o las secuencias de aminoacidos con un 80 % o mas, espedficamente un 90 % o mas, mas espedficamente un 95 % o mas, y mas espedficamente un 97 % o mas de homologfa con las mismas.

Como se utiliza en el presente documento, la expresion “ornitina descarboxilasa (ODC)” se refiere a una enzima que produce putrescina utilizando ornitina, y la ODC necesita fosfato de piridoxal (5'-fosfato de piridoxal, PLP) como coenzima. La ODC se encuentra en la mayona de las bacterias Gram-negativas y se pueden encontrar en algunas de las bacterias intestinales tales como bacterias Gram-negativas de Lactobacillus. La E. coli tiene dos tipos de genes que codifican la ODC, uno de los cuales, speC, se expresa continuamente a cierta concentracion y el otro, speF, se expresa en condiciones espedficas (en presencia de ornitina con mayores de ciertas concentraciones y pH bajo). Dependiendo de las especies, algunas especies, como E. coli, tiene dos tipos de ODC, y otras tienes solo un tipo. Las especies tales como Escherichia sp., Shigella sp., Citrobacter sp., Salmonella sp., y Enterobacter sp. tiene dos tipos de ODC (speC, speF), y las cepas de Yersinia sp., Klebsiella sp., Erwinia sp., tiene un tipo de ODC (speC). En el caso de Lactobacillus, se expresa ODC en un tipo de gen (speF), y se sabe que se induce su expresion en condiciones de bajo pH o con abundante ornitina e histidina.

La actividad de ODC se puede introducir en el microorganismo recombinante del genero Corynebacterium de la presente invencion utilizando genes que codifican ODC derivados de distintas especies. El polinucleotido que codifica la ODC puede incluir, pero no se limita a, el polinucleotido que codifica la protema que consiste en la secuencia de aminoacidos representada por la SEQ ID NO: 22 y la secuencia de aminoacido con un 70 % o mas, espedficamente un 80 % o mas, mas espedficamente un 90 % o mas de homologfa con la misma.

Ademas, la introduccion de la actividad de la ornitina descarboxilasa (ODC) en los microorganismos se puede llevar a cabo por los distintos procedimientos bien conocidos en la tecnica; por ejemplo, el procedimiento para insertar el polinucleotido incluyendo una secuencia de nucleotidos que codifica la ODC en el cromosoma, el procedimiento para introducir el polinucleotido en los microorganismo introduciendolo en el sistema de vector, el procedimiento para insertar un promotor que esta modificado o tiene actividad mejorada en la region superior de la secuencia de nucleotidos que codifica la ODC, y el procedimiento para insertar la mutacion en la secuencia de nucleotidos que codifica la ODC. Mas espedficamente, si se introduce la secuencia de nucleotidos que codifica la ODC, se puede utilizar un promotor CJ7 conocido como promotor para controlar la expresion de la misma.

Ademas, la mejora de la actividad de ArgC, ArgJ, ArgB, y ArgD se pueden conseguir por 1) un aumento del numero de copias del polinucleotido que codifica la enzima, 2) una modificacion de la secuencia reguladora de la expresion para aumentar la expresion del polinucleotido, 3) una modificacion de la secuencia de polinucleotido que codifica la

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enzima en el cromosoma para aumentar la actividad de la enzima o 4) una combinacion de los mismos.

En el procedimiento 1), el aumento del numero de copias del polinucleotido que codifica la enzima se puede conseguir uniendo operativamente el polinucleotido al vector o insertando el mismo en el cromosoma de la celula huesped. Mas espedficamente, el numero de copias del polinucleotidos de la celula huesped se puede aumentar introduciendo un vector que sea capaz de replicarse y funcionar independientemente, al que esta unido operativamente el polinucleotido que codifica la enzima de la presente invencion, o introduciendo el vector capaz de insertar el polinucleotido en el cromosoma de la celula huesped, al que esta unido operativamente el polinucleotido.

Como se utiliza en el presente documento, el termino “vector” se refiere a la construccion de ADN que comprende la secuencia del polinucleotido que codifica la protema diana unida operativamente a la secuencia reguladora

apropiada para expresar la protema diana en el huesped apropiado. La secuencia reguladora incluye el promotor

que puede iniciar la transcripcion, cualquier secuencia operadora para controlar la transcripcion, la secuencia que codifica ARNm apropiado del sitio de union al ribosoma, y la secuencia de control de la terminacion de la transcripcion y la traduccion. El vector se puede transfectar en un huesped adecuado, y despues se puede replicar o funcionar independientemente del genoma del huesped, y se puede integrar en el propio genoma.

En la presente invencion, se puede utilizar cualquier vector que se conozca en la tecnica, sin ninguna limitacion, a condicion de que se pueda replicar en el huesped. Ejemplos de vectores utilizados comunmente son los plasmidos, cosmidos, virus y bacteriofagos en su estado natural o estado recombinante. Por ejemplo, se pueden utilizar pWE15, M13, AMBL3, aMbL4, AIXII, AASHII, AAPII, At10, At11, Charon4A, y Charon21A como fagos vectores o cosmidos vectores, y se pueden utilizar como vectores plasirndicos el sistema pBR, sistema pUC, sistema pBluescriptll, sistema pGEM, sistema pTZ, el sistema pCL y el sistema pET. El vector que se puede utilizar en la presente

invencion no esta limitado particularmente y se pueden utilizar los vectores de expresion conocidos.

Espedficamente, se pueden utilizar los vectores pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCClBAC. Mas espedficamente, se pueden utilizar los vectores pAcYci77, pCL, pCClBAc.

Ademas, el vector que puede insertar el polinucleotido que codifica la protema diana en el cromosoma de una celula huesped puede ser espedficamente, por ejemplo, un vector lanzadera, pECCG112 (Publicacion de Patente Coreana N.° 1992-000933) que es capaz de replicarse por sf mismo en E. coli y bacterias de Corynebacterium, pero no se limita a este.

Ademas, el polinucleotido que codifica la protema dina en el cromosoma se puede remplazar por un nuevo polinucleotido utilizando un vector para la insercion genetica en el cromosoma. La insercion del polinucleotido en el cromosoma se puede conseguir por cualquier procedimiento conocido en la tecnica, por ejemplo, por recombinacion homologa. Como el vector de la presente invencion se puede insertar en el cromosoma induciendo una recombinacion homologa, se puede incluir adicionalmente un marcador de seleccion para confirmar una insercion genetica satisfactoria en el cromosoma. El marcador de seleccion es para explorar las celulas que se han transformado con el vector, en otras palabras, para determinar si se ha insertado el polinucleotido diana. Se pueden utilizar marcadores que proporcionan fenotipos seleccionables tales como resistencia a farmacos, auxotrofia, resistencia a agentes toxicos o protemas de expresion en la superficie. En un ambiente tratado con un agente selectivo, solo pueden sobrevivir las celulas que expresan el marcador de seleccion o las celulas que presentan un fenotipo distinto, y por tanto las celulas transformadas satisfactoriamente se pueden seleccionar mediante este procedimiento.

Como se utiliza en el presente documento, el termino “transformacion” se refiere a la introduccion del vector que comprende un polinucleotido que codifica la protema diana en la celula huesped de manera que la protema se puede expresar en la celula. El polinucleotido transformado incluye todo polinucleotido que codifica protemas diana que se puedan expresar en la celula huesped independientemente de la localizacion, sea si se inserta en el cromosoma de la celula huesped o se localice fuera del cromosoma. Ademas, el polinucleotido incluye un ADN y ARN que codifican la protema diana. El polinucleotido se puede introducir de cualquier manera a condicion de que se pueda introducir y expresar en la celula huesped. Por ejemplo, el polinucleotido se puede introducir en una celula huesped en forma de casete de expresion que es una construccion genetica, que comprende todos los elementos necesarios para la auto expresion. El casete de expresion normalmente incluye un promotor unido operativamente al polinucleotido, una senal de terminacion de la transcripcion, un sitio de union al ribosoma, y una senal de terminacion de la traduccion. El casete de expresion puede estar en forma de vector de expresion capaz de auto- replicacion. Ademas, el polinucleotido se puede introducir en una celula huesped en su propia forma y unirse operativamente a las secuencias necesarias para la expresion en la celula huesped.

Como se utiliza en el presente documento, la expresion “unido operativamente” se refiere a la conexion funcional entre la secuencia promotora que inicia o media en la transcripcion del polinucleotido que codifica la protema diana y el polinucleotido.

Ademas, el procedimiento 2) modificacion de la secuencia reguladora de la expresion para aumentar la expresion del polinucleotido en la presente invencion se puede llevar a cabo induciendo la mutacion de la secuencia mediante eliminacion, insercion, sustitucion conservadora o no conservadora de la secuencia de nucleotidos o una combinacion de las mismas, o por sustitucion por la secuencia de nucleotidos con actividad mejorada. La secuencia

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reguladora de la expresion incluye, el promotor, la secuencia operadora, la secuencia de los sitios de union al ribosoma, y la secuencia que controla la terminacion de la transcripcion y traduccion.

Se puede unir un fuerte promotor heterologo en la zona superior de la unidad de expresion del polinucleotido en vez de promotores originales. Un ejemplo de un promotor fuerte es el promotor pcj7, el promotor lysCP1, el promotor EF- Tu, el promotor groEL, el promotor aceA o el promotor aceB, etc., y mas espedficamente el promotor lysCPI o el promotor pcj7 derivados de Corynebacterium esta unido operativamente para aumentar la expresion del polinucleotido que codifica la enzima. En el presente documento el promotor lysCPI, que es un promotor mejorado mediante la sustitucion de la secuencia de nucleotidos de la region promotora del polinucleotido que codifica la aspartato cinasa y la aspartato semialdeddo deshidrogenasa, es suficientemente fuerte para aumentar la actividad de la enzima correspondiente unas 5 veces en comparacion con el tipo silvestre mediante el aumento de expresion del gen de aspartato cinasa (Publicacion de Patente Internacional N.° 2009-096689). Ademas, se identifico que el promotor pcj7 se expresaba en Corynebacterium ammoniagenes y Escherichia y que tema una actividad promotora fuerte, y se puede expresar en Corynebacterium glutamicum tambien con alta intensidad (Patente coreana N.° 0620092).

Ademas, se puede llevar a cabo el procedimiento 3) modificacion de la secuencia de polinucleotido sobre el cromosoma, pero no se limita espedficamente a, inducir la mutacion de la secuencia mediante eliminacion, insercion, sustitucion conservadora o no conservadora de la secuencia de nucleotidos una combinacion de las mismas para aumentar la actividad de la secuencia, o por sustitucion con la secuencia de nucleotidos que tiene aumentada la actividad.

El microorganismo de la presente invencion, que es un microorganismo que tiene la capacidad para producir putrescina, incluye microorganismos procariotas, en los que la protema que comprende una secuencia de aminoacidos representada por las SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 19 se expresa y puede ser por ejemplo, el microorganismo de Escherichia sp., Shigella sp., Citrobacter sp., Salmonella sp., Enterobacter sp., Yersinia sp., Klebsiella sp., Erwinia sp., Corynebacterium sp., Brevibacterium sp., Lactobacillus sp., Selenomonas sp., y Vibrio sp.

El microorganismo de la presente invencion es espedficamente el microorganismo del genero Corynebacterium y puede ser mas espedficamente el Corynebacterium glutamicum.

En una realizacion de la presente invencion, se modifica el microorganismo del genero Corynebacterium de N.° de acceso KCCM 11138P (Patente coreana abierta a inspeccion N.° 2012-0064046) que tiene la capacidad para producir putrescina en una alta concentracion mediante una ruta de biosmtesis de putrescina mejorada. Espedficamente, la cepa KCCM 11138P productora de putrescina es la cepa de sobre-produccion de putrescina, en la que el gen que codifica la ornitina carbamoil transferasa (ArgF) para la acumulacion de ornitina y el gen que codifica el exportador de glutamato (NCgl1221) de aumento de glutamato intracelular se eliminan de las cepas ATCC 13032, se introduce el gen que codifica la ornitina descarboxilasa (speC), y se aumenta el nivel de los genes de biosmtesis de ornitina (argCJBD). Por lo tanto, en el microorganismo de acuerdo con la invencion, se puede introducir adicionalmente la actividad de la ornitina descarboxilasa (speC) al mismo.

En otra realizacion de la presente invencion, se modifico la cepa DAB12-a productora de putrescina basada en el Corynebacterium glutamicum ATCC 13869. La cepa ATCC 13869 se basaba en el mismo genotipo que la KCCM 11138P, que es la cepa productora de putrescina basada en el Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. Espedficamente la cepa DAB12-a es a partir de la cepa ATCC 13869 obtenida de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC), en la que el gen que codifica la ornitina carbamoil transferasa (ArgF) y el gen que codifica la protema NCgl1221 para exportar glutamato se han eliminado, el gen (speC) que codifica la ornitina descarboxilasa (ODC) derivado de E. coli se ha introducido, y el promotor del operon genetico de biosmtesis de ornitina (argCJBD) se ha remplazado por el promotor mejorado.

De acuerdo con una realizacion de la presente invencion, un microorganismo del genero Corynebacterium (KCCM 11138P) tiene la capacidad de producir putrescina, que se prepara por eliminacion del gen que codifica la ornitina carbamoil transferasa (ArgF) y el gen que codifica el exportador de glutamato (NCgl1221) implicado en la exportacion de glutamato, la sustitucion del promotor propio del agrupamiento genetico ArgCJBD que codifica una enzima implicada en la smtesis de ornitina a partir de glutamato, y la introduccion del gen (speC) que codifica la ornitina descarboxilasa (ODC) nen el cromosoma del Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 de tipo silvestre. Basandose en el KCCM 11138P, se selecciono un clon (A15) que creda bien en un medio que contema alta concentracion de putrescina, y se confirmo que el A15 seleccionado inclrna los genes que codifican NCgl0100, NCgl0101, NCgl0102, NCgl0103 and NCgl0104 (Ejemplo 1). Ademas, el microorganismo creda en el medio que contema una alta concentracion de putrescina debido al gen que codifica NCgl0101 entre los cinco tipos de genes (Ejemplo 2). Con respecto a la caracterizacion del gen que codifica NCgl0101, se confirmo que la produccion de putrescina estaba reducida en una cepa en la que el gen que codifica NCgl0101 esta sobre-expresado (Ejemplo 3). y la produccion de putrescina estaba aumentada en una cepa en la que el gen que codifica NCgl0101 se ha eliminado (Ejemplo 4).

En consecuencia, los presentes inventores llamaron a la cepa de Corynebacterium glutamicum que tema un aumento de la capacidad para producir putrescina, que se prepara eliminando el gen NCgl0101 en la cepa KCCM

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11138P productora de putrescina, como el Corynebacterium CC01-0244, y se deposito en el Centro Coreano de Cultivos de Microorganismos (de aqu en adelante, abreviado como “KCCM”) el 26 de Dic de 2011, con el N.° de acceso KCCM 11241P.

En otro aspecto de la presente invencion, para conseguir los objetivos anteriores, la presente invencion se refiere a un procedimiento para la produccion de putrescina, que comprende el cultivo, para producir un caldo de cultivo celular, un microorganismo de Corynebacterium glutamicum que tiene la capacidad para producir putrescina, en el que el microorganismo se ha modificado de manera que una protema que tiene la secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 19, o la expresion de la misma, se ha modificado en el microorganismo para debilitar o eliminar la actividad de dicha protema y aumento de la produccion de putrescina en comparacion con la actividad de dicha protema y produccion de putrescina en la misma cepa del microorganismo pero sin modificar, en el que la actividad de la protema se debilita por 1) una eliminacion parcial o completa de un polinucleotido que codifica la protema, 2) una reduccion de la expresion del polinucleotido, 3) una modificacion de la secuencia de polinucleotido en el cromosoma para debilitar la actividad de la protema o 4) una combinacion de los mismos; y el aislamiento de la protema del caldo de cultivo celular obtenido.

El procedimiento de cultivo en la presente invencion se puede llevar a cabo en un medio y en condiciones de cultivos apropiados conocidos en la tecnica. Los expertos en la tecnica pueden ajustar facilmente y utilizar el procedimiento de cultivo dependiendo de las cepas seleccionadas. Un ejemplo del procedimiento de cultivo incluye cultivos tipo discontinuo, continuo y semicontinuo, pero no se limita a estos. El medio de cultivo puede tener que satisfacer apropiadamente las necesidades de una cepa espedfica.

El medio de cultivo puede tener que satisfacer apropiadamente las necesidades de las cepas espedficas. Los medios de cultivo para distintos microorganismos se desvelan (por ejemplo, en "Manual of Methods for General Bacteriology" from American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)). Como fuente de carbono en el medio se puede utilizar, azucar y carbohidratos (por ejemplo, glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, molasas, almidon y celulosa), grasa butmca y grasa (por ejemplo, aceite de soja, aceite de semilla de girasol, aceite de mam y aceite de coco), acidos grasos (por ejemplo, acido palmftico, acido estearico y acido linoleico), alcohol (por ejemplo, glicerol y etanol) y acidos organicos (por ejemplo, acido acetico), etc. Estas sustancias se pueden utilizar individualmente o como una mezcla. Como fuente de nitrogeno, se puede utilizar un compuesto organico que contenga nitrogeno (por ejemplo, peptona, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, liquido de maceracion de mafz, harina en polvo de soja y urea) o un compuesto inorganico (por ejemplo, sulfato amonico, cloruro amonico, fosfato amonico y nitrato amonico) y estas sustancias pueden utilizarse tambien individualmente o como una mezcla. Como fuente de fosforo, se puede utilizar fosfato potasico dihidrogeno o fosfato dipotasico hidrogeno o la sal que contiene sodio correspondiente. Ademas, el medio de cultivo puede comprender una sal metalica (por ejemplo, sulfato de magnesio o sulfato de hierro) que son esenciales para el crecimiento, y finalmente, se pueden utilizar sustancias promotoras del crecimiento esenciales tales como aminoacidos y vitaminas ademas de las sustancias mencionadas anteriormente. El precursor adecuado se puede anadir ademas al medio de cultivo. La sustancia alimentaria se puede proporcionar en el cultivo enseguida o adecuadamente mientras se cultiva.

El pH del cultivo se puede ajustar mediante un compuesto basico apropiado (por ejemplo, hidroxido sodico, hidroxido potasico o amoniaco) o un compuesto acido (por ejemplo, acido fosforico o acido sulfurico). Se puede ajustarla formacion de espuma mediante un agente antiespumante tal como un ester poliglicolico de acido graso. La condicion aerobica del cultivo se puede mantener introduciendo oxfgeno o mezclas de gases que contengan oxfgeno, por ejemplo, aire. La temperatura de cultivo puede ser normalmente de 20 a 45 °C, espedficamente de 25 a 40 °C. El cultivo puede continuar hasta que la produccion de putrescina alcance un maximo deseado, que se puede conseguir normalmente en 10 a 160 horas. La putrescina puede liberarse en el medio de cultivo, o estar contenida en la celula.

Para el procedimiento de recoleccion y recuperacion de la putrescina producida en el procedimiento de cultivo de la presente invencion, se puede recuperar la sustancia diana a partir del medio de cultivo utilizando el procedimiento apropiado conocido en la tecnica dependiendo del procedimiento de cultivo, por ejemplo, un tipo de cultivo discontinuo, continuo o semicontinuo.

Modo para la invencion

De aqrn en adelante, la invencion se describira en mas de talle con los siguientes Ejemplos. Sin embargo, estos Ejemplos son solo con fines ilustrativos, y la invencion no pretende estar limitada por estos Ejemplos.

Ejemplo 1: Preparacion de la biblioteca para la seleccion de genes eficaces para la biosmtesis de putrescina y seleccion de clones

En el fin de explorar genes eficaces para la biosmtesis de putrescina a partir del cromosoma de la cepa de Corynebacterium de tipo silvestre, se preparo una biblioteca del cromosoma de la cepa de Corynebacterium de tipo silvestre. En detalle, el cromosoma extrafdo del Corynebacterium glutamicum ATCc 13032 de tipo silvestre se escindio aleatoriamente con la enzima de restriccion Sau3AI, y se seleccionaron del mismo, fragmentos de 5 a 8 kb, y despues se clonaron en un vector lanzadera de E. coli-Corynebacterium pECCG122 (Patente coreana abierta a inspeccion N.° 1992-0000933) para preparar una biblioteca del cromosoma.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Con el fin de seleccionar genes eficaces para la biosmtesis de putrescina de la biblioteca cromosomica de Corynebacterium asf preparada, se obtuvieron colonias que credan en un medio que contema una alta concentracion de putrescina.

Entre tanto, se introdujeron las bibliotecas en un microorganismo del genero Corynebacterium (KCCM 11138P) que tema una capacidad de producir putrescina, para preparar de esa manera cada uno de los transformantes. Se seleccionaron los transformantes que eran capaces de crecer en un medio mmimo que contema 0,35 M de putrescina (10 g/l de glucosa, 0,4 g/l de MgSO4 ■ 7 H2O, 4 g/l de NH4C 1 g/l de KH2PO4, 1 g/l de K2HPO4, 2 g/l de urea, 10 mg/l de FeSO4 ■ 7 H2O, 1 mg/l de MnSO4 ■ 5 H2O, 5 mg/l de nicotinamida, 5 mg/l de hidrocloruro de tiamina, 0,1 mg/l de biotina, 1 mM de arginina, 25 mg/l de kanamicina, 0, 35 M de putrescina, pH 7,0). La cepa KCCM 11138P se desvela en una patente solicitada por los presentes inventores (Patente coreana abierta a inspeccion N.° 2012-0064046), que se preparo eliminando los genes que codifican la ornitina carbamoil transferasa (argF) y el exportador de glutamato (NCgl1221) en el cromosoma de la cepa ATCC 13032 de Corynebacterium glutamicum de tipo silvestre, introduciendo un gen (speC) que codifica la ornitina descarboxilasa (ODC) derivado de una cepa W3110 de E. coli de tipo silvestre en el cromosoma, y sustituyendo el promotor del agrupamiento genetico argCJBD que codifica la enzima implicada en la smtesis de ornitina a partir de glutamato, para preparar de esta manera cada uno de los transformantes. Como resultado se seleccionaron 275 colonias, y las colonias que credan bien en el medio que contema una alta concentracion de putrescina se identificaron secundariamente. Cada clon de la biblioteca se obtuvo y se introdujo de nuevo en la cepa de putrescina. A continuacion, se identificaron las colonias que credan bien en el medio que contema una alta concentracion de putrescina y de esta manera finalmente se selecciono un clon (A15). Este clon seleccionado se identifico por secuenciacion. Como resultado, se confirmo que el clon comprendfa un total de 5 ORF de NCgl0100, NCgl0101, NCgl0102, NCgl0103 y NCgl0104, de los cuales se eliminaron 436 aminoacidos del extremo N (FIG. 1). La FIG. 1 es un diagrama esquematico que muestra las posiciones relativas de genes que codifican NCgl0100, NCgl0101, NCgl0102, NCgl0103 y NCgl0104, que estan en el cromosoma de la cepa ATCC 13032 del Corynebacterium glutamicum de tipo silvestre.

Ejemplo 2. Identificacion de los genes eficaces para la smtesis de putrescina en el clon A15

Ejemplo 2-1: Clonacion de 5 genes del clon A15 y preparacion de un transformante

La secuencia de nucleotidos del clon A15 obtenida en el Ejemplo 1 ya se conoda. Basandose en la secuencia de nucleotidos de la cepa ATCC 13032 previamente informada, se construyeron NCgl0100-F y NCgl0100-R representados por las SEQ ID NO: 1 y 2 como cebadores para la amplificacion del gen NCgl0100, NCgl0100-R y tNCgl0100-F representados por la SEQ ID NO: 2 y 3 como cebadores para la amplificacion del gen tNCgl0100 del que se habfan eliminado 436 aminoacidos del extremo N, NCgl0101-F y NCgl0101-R representados por las SEQ ID NO: 4 y 5 como cebadores para la amplificacion del gen NCgl0101, NCgl0102-F y NCgl0103-R representados por las SeQ ID NO: 6 y 7 como cebadores para la amplificacion de los genes NCgl0102 y NCgl0103, y NCgl0104-F y NCgl0104-R representados por las SEQ ID NO: 8 y 9 como cebadores para la amplificacion del gen NCgl0104. Ademas, se construyeron P(CJ7)-F y P(CJ7)-R representados por las SEQ ID NO: 10 y 11 como cebadores para la amplificacion del promotor P(CJ7) (o pcj7) (Patente coreana N.° 10-0620092) (Tabla 1).

A continuacion, se llevo a cabo la PCR utilizando el cromosoma de la cepa ATCC 13032 como matriz y cada uno de los cebadores representados por las SEQ ID NO: 1 a 9 (desnaturalizacion a 95 °C durante 30 segundos, hibridacion a 50 °C durante 30 segundos, y extension a 72 °C durante 1 minuto ~ 1 minuto 30 segundos, 25 ciclos), para amplificar de esta manera 5 tipos de fragmentos geneticos. Ademas, se llevo a cabo la PCR utilizando en cromosoma de Corynebacterium ammoniagenes como matriz y los cebadores representados por las SEQ ID NO: 10 y 11 para amplificar de esta manera el fragmento de promotor.

Se ligaron 5 genes escindidos con XpnI y XbaI, y se escindio el promotor CJ7 con EcoRV y KpnI en un vector de expresion pHC139T (Patente coreana N.° 10-0860932) escindido con EcoRV y XbaI, para preparar de esta manera un total de 5 tipos de vectores de expresion pHC139T-P(CJ7)-NCgl0100, pHC139T-P(CJ7)-tNCgl0100, pHC139T- P(CJ7)-NCgl0101, pHCl39T-P(CJ7)-NCgl0102-NCgl0103, y pHC139T-P(CJ7)-NCgl0104.

[Tabla 1]

Cebadores para la preparacion de cepas que expresan 5 genes contenidos en el clon A15

NCgl0100-F (SEQ ID NO: 1)

GCGCAT ATGAGCTCAACAACCTCAAAAACC

NCgl0100-R (SEQ ID NO: 2)

GCGTCTAGA TTATCCTTCGAGGAAGATCGCAG

tNCgt0100-F (SEQ ID NO: 3)

GCGCAT ATGTGGACGCTGATGGCTGC

NCgl0101-F (SEQ ID NO: 4)

GCGCAT ATGAGTACTGACAATTTTTCTCCAC

NCgl0101-R (SEQ ID NO: 5)

GCGTCTAGA CTAAGCCAAATAGTCCCCTAC

NCgl0102-F (SEQ ID NO: 6)

GCGCAT ATGGATGAACGAAGCCGGTTTG

5

10

15

20

25

30

(continuacion)

Cebadores para la preparacion de cepas que expresan 5 genes contenidos en el clon A15

NCgl0103-R (SEQ ID NO: 7)

GCGTCTAGATTAATCAATGAAGACGAATACAATTCC

NCgl0104-F (SEQ ID NO: 8)

GCGCATATGGCGGGTGACAAATTGTGG

NCgl0104-R (SEQ ID NO: 9)

GCGTCTAGATT AGGACAGTTCCGCTGGAGC

P(CJ7)-F (SEQ ID NO: 10)

CAGATATCGCCGGCATAGCCTACCGATG

P(CJ7)-R (SEQ ID NO: 11)

GCGTCTAGAGATATCAGTGTTTCCTTTCG

Se introdujeron los 5 tipos de vectores de expresion as^ preparados y un grupo de control pHC139T en la cepa KCCM 11138P del Ejemplo 1 por electroporacion, y entonces se diseminaron en placas BHIS que conteman 25 pg/ml de kanamicina para seleccionar los transformantes.

Ejemplo 2-2: Busqueda de genes eficaces para putrescina

Del total de 6 tipos de transformantes obtenidos en el Ejemplo 2-1, se seleccionaron los transformantes crecfan bien en el medio que contema una alta concentracion de putrescina de la misma manera que en el Ejemplo 1 (FIG. 2). La FIG. 2 es el resultado del ensayo de la comparacion del crecimiento entre los transformantes preparados en la presente invencion, en los que 1, 2, 3, 4, 5 y 6 representan las cepas introducidas con los 6 tipos de vectores de expresion, pHC139T, pHC139T-P(CJ7)-NCgl0100, pHC139T-P(CJ7)-tNCgl0100, pHC139T-P(CJ7)-NCgl0101,

pHC139T-P(CJ7)-NCgl0102-NCgl0103 y pHC139T-P(cJ7)-NCgl0104, presentaban un crecimiento excelente en el medio que contema una alta concentracion de putrescina, y asf se selecciono el NCgl0101 como gen eficaz para la biosmtesis de putrescina.

Ejemplo 3: Evaluacion de la capacidad para producir putrescina en la cepa que sobre-expresa NCgl0101

Se evaluo la capacidad para producir putrescina de la cepa que sobre-expresa el gen NCgl0101 que se identifico como el gen eficaz en el Ejemplo 2. Se preparo una cepa para la evaluacion introduciendo el pHC139T-P(CJ7)- NCgl0101 en la cepa productora de putrescina KCCM 11138P.

El pHC139T-P(CJ7)-NCgl0101 preparado en el Ejemplo 2-1 y el vector pHC139T como grupo de control se introdujeron en la cepa KCCM 11138P productora de putrescina por electroporacion, y entonces se disemino en placas BHIS que conteman 25 pg/ml de kanamicina para seleccionar transformantes. Los transformantes se denominaron KCCM 11138P/pHC139T, y KCCM 11138P/pHC139T-P(CJ7)-NCgl0101, respectivamente. Estos dos transformantes seleccionaron de esta manera se cultivaron en placas CM que conteman 1 mM de arginina (un 1 % de glucosa, un 1 % de polipeptona, un 0,5 % de extracto de levadura, un 0,5 % de extracto de carne, un 0,25 % de NaCl, un 0,2 % de urea, 100 pl de NaOH al 50 %, un 2 % de agar, pH 6,8 por litro) a 30 °C durante 24 horas, y despues se inoculo un asa de cultivo celular en 25 ml de medio de titulacion de la Tabla 2 que contema 25 pg/ml de kanamicina, y se cultivo con agitado a 200 rpm a 30 °C durante 96 horas. Todas las cepas preparadas se cultivaron con la adicion de 1 mM de arginina en el medio durante la fermentacion.

[Tabla 2]

Composicion

Concentracion (por 1 l)

Glucosa

8 %

Protema de soja

0,25 %

Solidos de macerado de mafz

0,5 %

(NH4)2SO4

4 %

Urea

0,15 %

KH2PO4

0,1 %

MgSO4 7 H2O

0,05 %

Biotina

100 pg

Hidrocloruro de tiamina

3000 pg

Calcio-acido pantotenico

3000 pg

(continuacion)

Composicion

Concentracion (por 1 l)

Nicotinamida

3000 pg

CaCO3

5 %

Como resultado, como se muestra en la Tabla 3, cuando se sobre-expresaba el NCgl0101, la produccion de putrescina se reduda.

5 [Tabla 3]

Tipo de cepa

Putrescina (g/L)

KCCM 11138P/pHC139T

9,5

KCCM 11138P/pHC139T-P(CJ7)-NCgl0101

5,1

Ejemplo 4: Evaluacion de la capacidad para producir putrescina en la cepa con NCgl0101 eliminado

Ejemplo 4-1: Preparacion de la cepa con NCgl0101 eliminado en la cepa productora de putrescina basada en ATCC 13032

10 La sobre-expresion de NCgl0101 aumentaba el crecimiento celular en el medio que contema una alta concentracion de putrescina, pero disminma la produccion de putrescina de acuerdo con el Ejemplo 3. Basandose en este resultado, se examino el efecto de la eliminacion de NCgl0101 sobre la capacidad para producir putrescina.

En detalle, basandose en la secuencia de nucleotidos del NCgl0101 de la cepa ATCC 13032, se construyeron NCgl0101-del-F1_BamHI y NCgl0101-del-R1_SalI representados por las SEQ ID NO: 12 y 13 como cebadores para 15 obtener un fragmento recombinante homologo de la region terminal de NCgl0101. Se construyeron NCgl0101-del- F2_SalI y NCgl0101-del-R2_XbaI representados por las SEQ ID NO: 14 y 15 como cebadores para obtener un fragmento recombinante homologo de la region del extremo C de NCgl0101 (Tabla 4). Los fragmentos de las regiones del extremo N y el extremo C del gen NCgl0101 se prepararon por PCR utilizando los dos pares de cebadores. Los productos de la PCR se trataron con BamHI y SalI y SalI y Xbal, respectivamente y se clonaron en 20 un vector pDZ tratado con BamHI y Xbal. El plasmido clonado se denomino pDZ-NCgl0101(K/O).

[Tabla 4]

Cebadores para la preparacion de cepas con NCgl0101 eliminados

NCgl0101-del-F1_BamHI (SEQ ID NO: 12)

CGGGATCC CGGATTCCCTGCGATCATTG

NCgl0101-del-R1_SalI (SEQ ID NO: 13)

ACGCGTCGAC CAGTCGACGGAACTTGTGGAG

NCgl0101-del-F2_SalI (SEQ ID NO: 14)

ACGCGTCGAC GGCAACGACTCCGAAACCTTC

NCgl0101-del-R2_XbaI (SEQ ID NO: 15)

CTAGTCTAGA CTGGATCCTCATGAATGCGC

El vector pDZ-NCgl0101(K/O) preparado para la obtencion de la cepa KCCM 11138P ANCgl0101 se introdujo en a cepa KCCM 11138P por electroporacion, y entonces se disperso en la placa BHIS que contema 25 pg/ml de 25 kanamicina. La insercion satisfactoria del vector en el cromosoma se confirmo observando si la colonia era azul en el medio solido que contema X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indol-p-D-galactosido). El cromosoma primario de la cepa insertada se cultivo con agitado (30 °C, 8 horas), se diluyo entonces de 10'4 a 10'10, y se disemino en el medio solido que contema X-gal. Aunque la mayona de las colonias aparedan como colonias azulas, una baja proporcion de colonias aparecio como colonias blancas. Las cepas con el gen NCgl0101 eliminado se seleccionaron finalmente por 30 doble cruzamiento con las colonias blancas, y se identificaron por PCR utilizando los cebadores representados por las SEQ ID NO: 12 y 15. La variante asf identificada se denomino KCCM 11138P ANCgl0101.

Ejemplo 4-2: Preparacion de la cepa con el NCgI0101 eliminado en la cepa productora de putrescina basada en 13869

La cepa DAB12-a (cepa con argF eliminado, NCgl1221 eliminado, con speC de E. coli introducido, y operon arg- 35 promotor argCJBD sustituido) productora de putrescina basada en el Corynebacterium glutamicum AtCc 13869, que tiene el mismo genotipo que la cepa productora de putrescina KCCM 11138P basada en el Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, se utilizo para preparar cepas con el NCgl0101 eliminado.

En detalle, con el fin de identificar el gen que codifica NCgl0101 derivado de Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 y la secuencia de aminoacidos de la protema expresada a partir de este, se llevo a cabo la PCR utilizando el ADN genomico de Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 como matriz y un par de cebadores, SEQ ID NO: 12 y 15 (NCgl0101-del-F1_BamHI, NCgl0101-del-R2_XbaI). Aqm, la reaccion de PCR se llevo a cabo con 30 ciclos de 5 desnaturalizacion a 95 °C durante 30 segundo, hibridacion a 53 °C durante 30 segundos, y extension a 72 °C durante 2 minutos y 30 segundos. Los productos de la PCR se separaron por electroforesis y se analizaron sus secuencias. Mediante el analisis de secuencia, se identifico que el gen que codifica la NCgl0101 derivada de Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 incluye una secuencia de nucleotidos representada por la SEQ ID NO: 18 y la protema codificada de esta manera incluye una secuencia de aminoacidos representada por la SEQ ID NO: 10 19. Cuando se compararon las secuencias de aminoacidos de NCgl0101 derivadas de Corynebacterium glutamicum

ATCC 13032 y las de la NCgl0101 derivada de Corynebacterium glutamicum ATCC 13869, presentaban una homologfa del 98 %.

Con el fin de eliminar el gen que codifica NCgl0101 derivado del Corynebacterium glutamicum ATCC 13869, se amplificaron la region del extremo N y el extremo C del gen NCgl0101 por PCR utilizando un ADN genomico de 15 Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 como matriz y dos pares de cebadores enumerados en la Tabla 4 de la misma manera que en el Ejemplo <4-1>- Despues, se trataron los productos de la PCR con BamHI y SalI y con SalI y XbaI, respectivamente y entonces se clonaron en el vector pDZ tratado con BanHI y XbaI, construyendo de esta manera el plasmido pDZ-2'NCgl0101(K/O).

El plasmido pDZ-2'NCgl0101(K/O) se transformo en el Corynebacterium glutamicum DAB12-a de la misma manera 20 que en el Ejemplo <4-1>, y se selecciono la cepa en la que se elimino el gen que codifica NCgl0101. La variante de Corynebacterium glutamicum seleccionada se denomino DAB12-a ANCgl0101.

Ejemplo 4-3: Evaluacion de la capacidad para producir putrescina en la cepa con NCgl0101 eliminado

Con el fin de investigar el efecto de la eliminacion de NCgl0101 sobre la capacidad para producir putrescina en la cepa productora de putrescina, se compararon las variantes de Corynebacterium glutamicum preparadas en los 25 Ejemplos <4-1> y <4-2>.

En detalle, la capacidad de produccion de putrescina en dos tipos de variantes de Corynebacterium glutamicum (KCCM 11138P ANCgl0101 y DAB12-a ANCgl0101) se evaluo de la misma manera que en el Ejemplo 3. como se muestra en la Tabla 5 siguiente, se descubrio que la produccion de putrescina aumentaba por la eliminacion de NCgl0101.

30 [Tabla 5]

Tipo de cepa

Putrescina (g/l)

KCCM 11138P

9,8

KCCM 11138P ANCgl0101

11,3

DAB12-a

10,1

DAB12-a ANCgl0101

11,0

En conjunto, los resultados de los Ejemplos 3 y 4 demuestran que la produccion de putrescina disminma por sobreexpresion del gen que codifica NCgl0101 y aumentaba por eliminacion del gen en la cepa de Corynebacterium glutamicum de tipo silvestre, indicando que NCgl0101 afecta directamente la biosmtesis de putrescina.

35 En consecuencia, los presentes inventores denominaron a la cepa de Corynebacterium glutamicum que tiene una capacidad mejorada para producir putrescina, que se preparo eliminando el gen NCgl0101 en la cepa KCCM 11138P productora de putrescina en el Ejemplo anterior, como Corynebacterium glutamicum CC01-0244, y se deposito en el Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos (de aqm en adelante, abreviado como “KCCM”) que es una autoridad depositaria internacional bajo el Tratado de Budapest el 26 de Dic de 2011, con el N.° de acceso 40 KCCM 11241P.

<110> CJ CheilJedang Corporation

<120> Microorganismos que tienen un aumento de productibilidad de putrescina y procedimiento para la produccion de putrescina utilizandolos 45

<130> OPA12195PCT

<150> KR 10-2012-0007004 <151>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<160> 26

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1 <211> 30 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador <400> 1

gcgcatatga gctcaacaac ctcaaaaacc 30

<210> 2 <211> 32 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador <400>2

gcgtctagat tatccttcga ggaagatcgc ag 32

<210> 3 <211> 26 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador <400>3

gcgoatatgt ggaogctgat ggotgo 26

<210> 4 <211> 31 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador <400>4

gcgcatatga gtactgacaa tttttctcca c 31

<210> 5 <211> 30 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador <400>5

gcgtctagac taagccaaat agtcccctac 30

<210> 6 <211> 28 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<223> Cebador <400>6

gcgcatatgg atgaacgaag ccggtttg 28

<210>7 <211> 36 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador <400>7

gcgtctagat taatcaatga agacgaatac aattcc 36

<210>8 <211> 27 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador <400>8

gogcatatgg cgggtgacaa attgtgg 27

<210>9 <211> 30 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador <400>9

gcgtctagat taggacagtt ccgctggagc 30

<210> 10 <211> 28 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador <400> 10

cagatatcgc cggcatagcc taccgatg 28

<210> 11 <211> 29 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador <400> 11

gcgtctagag atatcagtgt ttcctttcg 29

<210> 12 <211> 28 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

<220>

<223> Cebador <400> 12

cgggatcccg gattccctgc gatcattg 28

<210> 13 <211> 31 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador <400> 13

acgcgtcgac cagtcgacgg aacttgtgga g 31

<210> 14 <211> 31 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador <400> 14

acgcgtcgac ggcaacgact ccgaaacctt c 31

<210> 15 <211> 30 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador <400> 15

ctagtctaga ctggatcctc atgaatgcgc 30

<210> 16 <211>1389 <212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum <400> 16

atgagtactg

acaatttttc tccacaagtt

caagggattg

ccgcgcgcaa agcggaggca

ccggattatc

caggccagca ggttatttgg

cgtgatgaac

tgcgcacact ggctttcacg

gaggtgttcg

ccaccgagga aatcacaaaa

agtggagttt

atggtgttaa aaccgctcta

ccagcgcagc

acccaagcat tgcgatcttg

catgcatgcg

ggcacaatat catcgcagca

aacatgatca

aaactgccga agtgaaaggc

gtgctgttgg

gaacacctgc tgaggagggg

ggcgcattcg

atggcattga tgcgtcgatt

gagcatgttt

gggtgggcag acgtaccatg

gcgtcttcgc

agcctttcat gggtaaaaat

ggcttcggag

ttttgcgtca gcaaatgcca

gaaggcggaa

accggccaag catcattoca

tctttgttgc

cggaagcact caaagacata

gcggcottga

tggcgggggt tggcgtcgaa

cccgtgcgca

acaatcatgt gttggcgcgg

cgaacggcgc

tttcggaggg tattttgccc

aatgtctcgc

acctggttcc gggcattcat

gcgctccaca

ccaaggaatt cgccgcttat

gtcgacgccg

caatcgggct ggcgcaagtc

cttatcgacg

cgaccctcga gttcaccaac

ttggcttag

<210> 17 <211> 462 5 <212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum <400> 17

ccgtcgactg

tgtatttgga ttacatggag 60

gaatctaacg

ccagcacgaa 120

cgcctgatcc

aggaagcagg ggagtcgttg 180

ctgcacgacc

atccggaaga agcgttcgag 240

cttctgcaaa

atcatggttt tgaggttcag 300

gaaactagtt

ttgaaacccc tggttatgat 360

gcggaatacg

atgcccttcc agagatcggc 420

gctggtgttg

gcgcattttt agctgtcacc 480

gtggatcacc

tcgactttga aggccggatc 540

cattccggoa

aggaatacat gatccgaaat 600

atgatgcacc

cctttggctt ogatctggcg 660

aoggcgacgt

tccacggtgt ctctgcacac 720

gocctcgacg

ctgcaagttt ggcgtaccag 780

ccgagcgacc

gcottcacgc cattattacg 840

gacactgcaa

cgatgtcgct gtacgtgcgt 900

tcgaaacgcg

tggatgatgt gctcgatggg 960

aagcaatggg

atgtgcacco agctagcttg 1020

cgttgggcaa

aaacgcagaa tctgcgtggt 1080

gacactctgg

cagcatcgac tgattttggc 1140

ccgatggtga

aaatttctcc ggaaaacgtt 1200

gcgcgcacgg

aagaggccat cgacgcagcc 1260

gccgttgacg

cgcttgcaga tccgcaaatg 1320

tccggcgacg

tacttaaagfc aggggactat 1380

1389

Claims (8)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Un microorganismo de Corynebacterium glutamicum recombinante que tiene la capacidad para producir putrescina, en el que el microorganismo se ha modificado de manera que una protema que tiene la secuencia de aminoacidos representada por la SEQ ID NO: 17 o la SEQ ID NO: 19, o la expresion de las mismas, esta modificada en el microorganismo para debilitar o eliminar la actividad de dicha protema y aumentar la produccion de putrescina en comparacion con la actividad de dicha protema y la produccion de putrescina en la misma cepa de microorganismo pero sin modificar, en el que la actividad de la protema esta debilitada por 1) una eliminacion parcial o completa de un polinucleotido que codifica la protema, 2) una reduccion de la expresion del polinucleotido, 3) una modificacion de la secuencia de polinucleotido en el cromosoma para debilitar la actividad de la protema o 4) una combinacion de las mismas.
2. 2. El microorganismo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la actividad de ornitina descarboxilasa (SpeC) se ha introducido adicionalmente en este.
3. 3. El microorganismo de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que la ornitina descarboxilasa tiene la secuencia de aminoacidos representada por la SEQ ID NO: 22.
4. 4. El microorganismo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que las actividades en el microorganismo recombinante de uno o mas de los seleccionados de entre el grupo que consiste en ornitina carbamoil transferasa (ArgF) y exportador de glutamato (NCgl1221) estan debilitadas adicionalmente en comparacion con la actividad de la misma protema en la misma cepa, pero sin modificar.
5. 5. El microorganismo de acuerdo con la reivindicacion 4, en el que la ArgF tiene la secuencia de aminoacidos representada por la SEQ ID NO: 20, y la NCgl1221 tiene la secuencia de aminoacidos representada por la SEQ ID NO: 21.
6. 6. El microorganismo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que las actividades en el microorganismo recombinante de uno o mas de los seleccionados de entre el grupo que consiste en acetil gamma glutamil fosfato reductasa (ArgC), acetil glutamato sintasa u ornitina acetiltransferasa (ArgJ), acetil glutamato cinasa (ArgB), y acetil ornitina amino transferasa (ArgD) estan aumentadas adicionalmente, en comparacion con la actividad de la misma protema en la misma cepa, pero sin modificar.
7. 7. El microorganismo de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que ArgC, ArgJ, ArgB y ArgD tienen las secuencias de aminoacidos representadas por las SEQ ID NO: 23, 24, 25, y 26, respectivamente.
8. 8. Un procedimiento para producir putrescina, que comprende

   el cultivo, para producir un caldo de cultivo celular, de un microorganismo modificado de Corynebacterium glutamicum que tiene la capacidad para producir putrescina, en el que el microorganismo se ha modificado de manera que una protema que tiene la secuencia de aminoacidos representada por la SEQ ID NO: 17 o la SEQ ID NO: 19, o la expresion de las mismas, se ha modificado en el microorganismo para debilitar o eliminar la actividad de dicha protema y aumentar la produccion de putrescina en comparacion con la actividad de dicha protema y la produccion de putrescina en la misma cepa de microorganismo pero sin modificar, en el que la actividad de la protema se debilita por 1) una eliminacion parcial o completa de un polinucleotido que codifica la protema, 2) una reduccion de la expresion del polinucleotido, 3) una modificacion de la secuencia de polinucleotido en el cromosoma para debilitar la actividad de la protema o 4) una combinacion de las mismas; y el aislamiento de putrescina en el caldo de cultivo celular obtenido.

   [Figura 1]

   NCgIQI 01

   ... A

   [Figura 2]

   NCgtQIOQ (forma truncada)

   «kn

   ■..

   W

   NCglOl 02

   Ncgl0103 NcgI01D4

   imagen1

   A15

   3824 pb

   imagen2