WO2013109121A1 - 퓨트레신 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법 - Google Patents

퓨트레신 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법 Download PDF

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WO2013109121A1 PCT/KR2013/000487 KR2013000487W WO2013109121A1 WO 2013109121 A1 WO2013109121 A1 WO 2013109121A1 KR 2013000487 W KR2013000487 W KR 2013000487W WO 2013109121 A1 WO2013109121 A1 WO 2013109121A1
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ncgl0101
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이경민
김선혜
엄혜원
강민선
최수진
정희경
전성후
리홍선
곽원식
이종호
양영렬
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씨제이제일제당 (주)
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant microorganism having improved putrescine production capacity and a method for producing putrescine using the same.
  • Putrescine (putrescine or 1,4-butanediamine) is a kind of polyamine such as spermidine, spermine, etc., which is found in gram-negative bacteria or fungi, and is present in high concentrations in various species. It is expected to play an important role in the metabolism of microorganisms. Putrescine is mainly produced from propylene by chemical synthesis via acrylonitrile and succinonitrile. This chemical synthesis method originates from petrochemicals and is not environmentally friendly due to the use of toxic substances and has a problem of exhaustion of petroleum resources.
  • putrescine can be biosynthesized through two pathways in microorganisms. One is the route to produce ornithine from glutamate, decarboxylation the ornithine to synthesize putrescine, and the other is to use arginine synthesized from the synthesized ornithine. Agmatine is produced and is a pathway for synthesizing putrescine from the agmatine.
  • WO09 / 125924 inactivates the pathway involved in the degradation and utilization of putrescine in E. coli, inactivates the pathway in which ornithine, a precursor of putrescine, to arginine, and inactivates the ornithine biosynthetic pathway.
  • a method for producing putrescine in high yield by strengthening is disclosed.
  • the inventors have found that when the activity of the NCgl0101 protein is weakened or deleted, the production of putrescine in the microorganism of the genus Corynebacterium was increased, and the present invention was completed.
  • One object of the present invention is to provide a recombinant Corynebacterium microorganism capable of producing a high yield of putrescine in which the activity of NCgl0101 is mutated relative to the intrinsic activity.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing putrescine using the microorganism.
  • the activity of NCgl0101 is mutated to be weaker than the endogenous activity, so that putrescine can be produced in high yield, and thus widely used for the production of more effective putrescine.
  • the activity of NCgl0101 is mutated to be weaker than the endogenous activity, so that putrescine can be produced in high yield, and thus widely used for the production of more effective putrescine.
  • 1 is a schematic diagram showing the relative positions of genes encoding NCgl0100, NCgl0101, NCgl0102, NCgl0103 and NCgl0104 present on the chromosome of wild type Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 strain.
  • Figure 2 shows the growth comparison test results of each mutant strain prepared in the present invention.
  • 1, 2, 3, 4, 5 and 6 are pHC139T, pHC139T-P (CJ7) -NCgl0100, pHC139T-P (CJ7) -tNCgl0100, pHC139T-P (CJ7) -NCgl0101, pHC139T-P (CJ7)-in KCCM11138P.
  • NCgl0102-NCgl0103 and pHC139T-P (CJ7) -NCgl0104 are introduced strains.
  • the present invention is the activity of the NCgl0101 protein having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 19 in the genus Corynebacterium microorganism modified to produce putrescine It provides a microorganism of the genus Corynebacterium having improved putrescine production capacity, weakened or deleted compared to this intrinsic activity.
  • NCgl0101 refers to a protein that expresses metal-dependent enzymatic activity in Corynebacterium glutamicum and has not yet been clearly characterized.
  • Peptides M20 family or aminobenzoyl glutamate degrading protein (aminobenzoyl -glutamate utilization protein (abgB) contains a metal binding domain.
  • AbgB present in Escherichia coli constitutes an aminobenzoyl glutamate hydrolase with abgA to decompose aminobenzoyl glutamate into aminobenzoate and glutamate, and the aminobenzoate is known to be used as a precursor for synthesizing folate However, no association with putrescine production capacity is known.
  • the NCgl0101 protein of the invention may comprise the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 19.
  • It may be a mutant or an artificial variant encoding a protein having an amino acid sequence including the addition and the like.
  • “several” is different depending on the position and kind in the three-dimensional structure of the amino acid residue of a protein, Specifically, it is 2 to 20, Preferably it is 2 to 10, More preferably, it is 2 to 5 .
  • substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of such amino acids is caused by naturally occurring mutations or artificial variations, such as those based on differences in individuals or species of microorganisms containing the activity of the polypeptide. It also includes.
  • the polynucleotide encoding the amino acid sequence of the present invention is at least 80%, preferably at least 90%, more preferably 95% of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or 19, as long as it has similar activity to the NCgl0101 protein of the present invention. It may comprise a polynucleotide encoding a protein having at least%, particularly preferably at least 97% homology, and most preferably may comprise a polynucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 18.
  • homology refers to identity between two amino acid sequences, and is well known to those skilled in the art using BLAST 2.0 to calculate parameters such as score, identity, similarity, etc. Can be determined.
  • polynucleotide sequence encoding NCgl0101 of the present invention may be hybridized under 'strict conditions' with the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 16 or a probe prepared from the nucleotide sequence, and encodes a normally functioning NCgl0101 protein. It may be variant.
  • stringent conditions refers to conditions that enable specific hybridization between polynucleotides. For example, Molecular Cloning (A Laboratory Manual, J. Sambrook et al. , Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989) or Current Protocols in Molecular Biology (FM Ausubel et al .
  • hybridization buffer (3.5 X SSC, 0.02% Ficoll, 0.02% polyvinylpyrrolidone, 0.02% bovine serum albumin) at 65 ° C.
  • SSC is 0.15 M sodium chloride / 0.15 M sodium citrate at pH 7.
  • the membranes to which DNA has been delivered are washed with 2 ⁇ SSC at room temperature and then with 0.1-0.5 ⁇ SSC / 0.1 ⁇ SDS at 68 ° C.
  • Attenuation of the activity of NCgl0101 protein of the present invention may include 1) deletion of part or all of the polynucleotide encoding the protein, 2) modification of expression control sequences to reduce expression of the polynucleotide, 3) attenuation of the activity of the NCgl0101 protein. Possibly by modification of the polynucleotide sequence on the chromosome or 4) combinations thereof.
  • a method of deleting part or all of the polynucleotide encoding the protein may include a polynucleotide encoding a target protein intrinsic in a chromosome through a bacterial chromosome insertion vector, into a polynucleotide or a marker gene in which some nucleic acid sequences are deleted. By replacement.
  • the term "some” differs depending on the kind of polynucleotide, but specifically 2 to 300, preferably 2 to 100, and more preferably 1 to 5.
  • the method of modifying the expression control sequence to reduce the expression of the polynucleotide is to delete, insert, non-conservative or conservative substitution or combination of nucleic acid sequences to further weaken the activity of the expression control sequence on the expression control sequence
  • the mutation can be carried out by inducing or by replacing with a nucleic acid sequence having weaker activity.
  • the expression control sequences include promoters, operator sequences, sequences encoding ribosomal binding sites, and sequences that control the termination of transcription and translation.
  • a method of modifying a polynucleotide sequence on a chromosome, which encodes a protein of the present invention involves altering the sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof, to further weaken the activity of the sequence. It can be done by induction or by replacing with a nucleic acid sequence that has been improved to have weaker activity.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium having improved putrescine production ability of the present invention is a protein involved in the release of ornithine carbamoyltransfrase (ArgF) and glutamate involved in arginine synthesis from ornithine (NCgl1221). It can be further mutated to weaken the activity of compared to the intrinsic activity.
  • ArgF ornithine carbamoyltransfrase
  • NCgl1221 glutamate involved in arginine synthesis from ornithine
  • acetyl glutamate synthase can be mutated to introduce the activity of ornithine decarboxylase (ODC) and convert glutamate to acetyl glutamate to enhance ornithine biosynthetic pathway, a putrescine precursor, or Ornithine acetyl transferase (ArgJ) for converting acetyl ornithine to ornithine, acetyl glutamate kinase (ArgB) for converting acetyl glutamate to acetyl glutamyl phosphate, and acetyl gamma glutamate for converting acetyl glutamate semialdehyde to acetyl glutamate semialdehyde Further modifications to increase the activity of acetyl ornithine amino transferase (ArgD), which converts Tamil phosphate reductase (ArgC) and acetyl glutamate semialde
  • ArgF, NCgl1221, ODC, ArgC, ArgJ, ArgB and ArgD described above are not particularly limited, but preferably the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 or 80% thereof. Or more, preferably at least 90%, more preferably at least 95%, particularly preferably at least 97% homology.
  • ornithine decarboxylase (ODC) refers to an enzyme that produces putrescine using ornithine, wherein the ODC is a coenzyme pyridoxal phosphate (Pyridoxal 5'-phosphate). , PLP) and are present in most Gram-negative bacteria and may be present in some of the intestinal bacteria, such as Lactobacillus , among Gram-positive bacteria.
  • ODC pyridoxal 5'-phosphate
  • ODCs Some species have two types of ODCs, such as E. coli, and others have only one type. Two species are found: Escherichia sp., Shigella sp., Citrobacter sp., Salmonella sp. And Enterobacter sp. ODCs (speC, speF), Yersinia sp., Klebsiella sp., Erwinia sp., Etc., have one type of ODC (speC). . In the case of lactic acid bacteria, ODC is expressed in one type of gene (speF), and it is known that expression is induced at low pH or rich conditions of ornithine and histidine.
  • the recombinant Corynebacterium genus microorganism of the present invention can be introduced ODC activity using ODC coding genes derived from the various species.
  • the polynucleotide encoding the ODC is not particularly limited, but includes an amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 or an amino acid sequence having at least 70%, more preferably 80%, more preferably 90% or more homology thereof. Polynucleotides encoding proteins.
  • introducing the activity of ornithine decarboxylase (ODC) into the microorganism can be carried out by various methods well known in the art, for example, chromosomes of polynucleotides comprising the nucleotide sequence encoding the ODC Method for inserting into the microorganism by introducing the polynucleotide into the vector system, introducing a promoter exhibiting improved activity upstream of the nucleotide sequence encoding the ODC, or introducing a modified ODC into the promoter, ODC
  • a method of introducing a variant of the nucleotide sequence encoding the nucleotide sequence can be used, and more preferably, when introducing the nucleotide sequence encoding the ODC, a known CJ7 promoter can be used as a promoter for controlling its expression.
  • the increased activity of the ArgC, ArgJ, ArgB and ArgD is 1) increased the number of copies of the polynucleotide encoding the enzyme, 2) modification of the expression control sequence to increase the expression of the polynucleotide, 3) activity of the enzyme
  • the increase in the number of copies of the polynucleotide may be specifically carried out in a form operably linked to the vector, or by insertion into a chromosome in the host cell.
  • a host capable of being cloned and functioning independently of a host, in which a polynucleotide encoding an enzyme of the present invention is operably linked may be performed by introducing into a host cell, or the host is operably linked.
  • a vector capable of inserting the polynucleotide into the chromosome in the cell may be introduced into the host cell to increase the copy number of the polynucleotide in the chromosome of the host cell.
  • the term "vector” refers to a DNA preparation containing a nucleotide sequence of a polynucleotide encoding said target protein operably linked to a suitable regulatory sequence to enable expression of the target protein in a suitable host.
  • the regulatory sequence includes a promoter capable of initiating transcription, any operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosomal binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation.
  • the vector used in the present invention is not particularly limited as long as it can be replicated in the host, and any vector known in the art may be used.
  • Examples of commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages.
  • pWE15, M13, ⁇ MBL3, ⁇ MBL4, ⁇ IXII, ⁇ ASHII, ⁇ APII, ⁇ t10, ⁇ t11, Charon4A, Charon21A, etc. can be used as a phage vector or cosmid vector
  • pBR, pUC, and pBluescriptII systems are used as plasmid vectors.
  • pGEM-based, pTZ-based, pCL-based and pET-based and the like can be used.
  • the vector usable in the present invention is not particularly limited and known expression vectors can be used.
  • pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vector and the like can be used.
  • pACYC177, pCL, pCC1BAC vectors can be used.
  • a vector capable of inserting a polynucleotide encoding a protein of interest into the chromosome in the host cell into a chromosome in the host cell is preferably a shuttle vector pECCG112 vector capable of self-replicating in both E. coli and coryneform bacteria. 1992-0000933), but is not limited thereto.
  • a vector for inserting a bacterial chromosome may replace a polynucleotide encoding an endogenous target protein in a chromosome with a new polynucleotide. Insertion of the polynucleotide into the chromosome can be by any method known in the art, such as homologous recombination.
  • the vector of the present invention may be inserted into a chromosome by causing homologous recombination
  • the vector may further include a selection marker for confirming whether the chromosome is inserted, and the selection marker selects cells transformed with the vector, That is, to confirm the insertion of the desired polynucleotide, markers may be used that confer a selectable phenotype such as drug resistance, nutritional requirements, resistance to cytotoxic agents, or expression of surface proteins. In an environment treated with a selective agent, only cells expressing a selection marker survive or exhibit different expression traits, so that transformed cells can be selected.
  • transformation in the present invention means introducing a vector comprising a polynucleotide encoding a target protein into a host cell so that the protein encoded by the polynucleotide can be expressed in the host cell.
  • Transformed polynucleotides include all of them, as long as they can be expressed in the host cell, regardless of whether they are inserted into or located outside the chromosome of the host cell.
  • the polynucleotide also includes DNA and RNA encoding the target protein.
  • the polynucleotide may be introduced in any form as long as it can be introduced into and expressed in a host cell.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a gene construct containing all elements necessary for self expression.
  • the expression cassette typically includes a promoter, transcription termination signal, ribosomal binding site and translation termination signal operably linked to the polynucleotide.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self replication.
  • the polynucleotide may be introduced into the host cell in its own form and operably linked with a sequence required for expression in the host cell.
  • operably linked means that the gene sequence is functionally linked with a promoter sequence for initiating and mediating the transcription of a polynucleotide encoding a protein of interest.
  • the method of modifying the expression control sequence to increase the expression of the polynucleotide of the present invention by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution or a combination thereof to further enhance the activity of the expression control sequence. This can be done by inducing a variation in sequence or by replacing with a nucleic acid sequence having stronger activity.
  • expression control sequences include promoters, operator sequences, sequences encoding ribosomal binding sites, and sequences that control the termination of transcription and translation.
  • a strong heterologous promoter may be linked to the upper end of the polynucleotide expression unit, but examples of the strong promoter include a pcj7 promoter, a lysCP1 promoter, an EF-Tu promoter, a groEL promoter, an aceA or aceB promoter, and the like.
  • the lysCP1 promoter or the pcj7 promoter which is a Corynebacterium-derived promoter, may be operably linked to improve the expression rate of the polynucleotide encoding the enzyme.
  • the lysCP1 promoter is an improved promoter through nucleotide sequence substitution of the polynucleotides encoding aspartate kinase and aspartate semialdehyde dehydrogenase. It is a powerful promoter that can be increased by five times (International Patent Publication No. 2009-096689).
  • the pcj7 promoter was expressed in Corynebacterium ammonia genes and Escherichia while searching for a region having a strong promoter sequence from Corynebacterium ammonia genes, and was confirmed as a promoter having strong promoter activity.
  • Bacterium glutamicum is also a promoter of high intensity expression (Korean Patent No. 0620092).
  • the method of modifying the polynucleotide sequence on the chromosome is not particularly limited, but the mutation on the expression control sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof, to further enhance the activity of the sequence. Or by replacing with a polynucleotide sequence that has been modified to have stronger activity.
  • the microorganism of the present invention is a microorganism capable of producing putrescine, and includes a prokaryotic microorganism in which a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 19 is expressed, and examples thereof include Escherichia sp. , Genus Shigella sp., Genus Citrobacter sp., Genus Salmonella sp., Genus Enterobacter sp., Genus Yersinia sp., Genus Krebs.
  • Klebsiella sp. Erwinia sp., Corynebacterium sp., Brevibacterium sp., Lactobacillus sp., Selenomonas genus ( Selenomanas sp.), Vibrio sp.
  • the microorganism of the present invention is a microorganism belonging to the genus Corynebacterium, more preferably Corynebacterium glutamicum.
  • the glutathione production pathway was enhanced to alter the Corynebacterium microorganism (Korean Patent Publication No. 2012-0064046) of Accession No. KCCM11138P, which has a high concentration of putrescine production capacity.
  • putrescine-producing strain KCCM11138P encodes a gene encoding ornithine carbamoyl transferase (argF) for ornithine accumulation in ATCC13032 strain and a glutamate exporter (NCgl1221) for increasing intracellular glutamate.
  • peC ornithine decarboxylase
  • argCJBD ornithine biosynthetic gene
  • putrescine producing strain DAB12 based on Corynebacterium glutamicum ATCC13869 having the same genotype as KCCM11138P, which is a putrescine producing strain based on Corynebacterium glutamicum ATCC13032 -a was mutated.
  • the putrescine producing strain DAB12-a is a gene encoding glutathione carbamoyl transferase (ArgF) and a glutamate releasing protein NCgl1221 in the ATCC13869 strain obtained from the American Type Culture Collection (ATCC).
  • the gene coding for is deleted, the gene coding for Escherichia coli derived ornithine decarboxylase (OCD) (speC) is introduced, and the promoter of the ornithine biosynthetic gene operon (argCJBD) is substituted with an improved promoter. It is done.
  • OCD Escherichia coli derived ornithine decarboxylase
  • argCJBD ornithine biosynthetic gene operon
  • a gene encoding ornithine carbamoyl transferase (ArgF) in a chromosome and a glutamate exporter (NCgl1221) involved in glutamate release in wild-type Corynebacterium glutamicum strain ATCC13032 The gene of the gene is deleted, the promoter of the ArgCJBD gene group encoding an enzyme involved in ornithine synthesis in glutamate is substituted, and the gene encoding ornithine dicarboxylase (ODC) (speC) is introduced into the chromosome.
  • ODC ornithine dicarboxylase
  • KCCM11138P Corynebacterium genus microorganisms having the ability to produce putrescine
  • a high-growth clone (A15) was selected in a high concentration putrescine medium, and NCgl0100, NCgl0101, NCgl0102, It was confirmed that genes encoding NCgl0103 and NCgl0104 were included (Example 1), and among them, NCgl01 It was confirmed that the microorganism grows even in a high concentration of putrescine medium due to the gene encoding 01 (Example 2).
  • the present inventor named the Corynebacterium glutamicum strain improved putrescine production capacity by deleting the NCgl0101 gene in KCCM 11138P, putrescine producing strain Corynebacterium glutamicum CC01-0244, as of December 26, 2011 It was deposited with the accession number KCCM11241P to the Korean Culture Center of Microorganisms (hereinafter abbreviated as "KCCM").
  • the present invention has an improved putrescine production capacity, modified to weaken the activity of the NCgl0101 protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 19 Culturing the microorganism of the genus Corynebacterium;
  • It relates to a putrescine production method comprising the step of separating putrescine from the culture obtained in the step.
  • the culturing process of the present invention can be made according to the appropriate medium and culture conditions known in the art. This culture process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the strain selected. Examples of the culture method include, but are not limited to, batch, continuous and fed-batch cultivation. The medium used for cultivation should suitably meet the requirements of the particular strain.
  • the culture medium used should suitably meet the requirements of the particular strain.
  • Culture media for various microorganisms are known (eg, "Manual of Methods for General Bacteriology” from American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)).
  • Carbon sources in the medium include sugars and carbohydrates (e.g. glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose), fats and fats (e.g. soybean oil, sunflower seed oil, peanut oil and coconut oil). ), Fatty acids such as palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, alcohols such as glycerol and ethanol, organic acids such as acetic acid, and the like.
  • sugars and carbohydrates e.g. glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose
  • fats and fats e.g. soybean oil, sunflower seed oil, peanut oil and coconut oil.
  • Nitrogen sources can be nitrogen-containing organic compounds such as peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea, or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and nitrate Ammonium) can be used, and these materials can also be used individually or as a mixture. Potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium containing salts can be used as the phosphorus source.
  • the culture medium may contain metal salts necessary for growth (eg, magnesium sulfate or iron sulfate), and finally, essential growth-promoting substances such as amino acids and vitamins may be used in addition to the substances mentioned above.
  • Suitable precursors may further be added to the culture medium.
  • the feed material may be added to the culture all at once or may be appropriately supplied during the culture.
  • the pH of the culture can be adjusted by appropriate use of a basic compound (eg sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia) or an acidic compound (eg phosphoric acid or sulfuric acid).
  • Foaming can be controlled using foaming agents such as fatty acid polyglycol esters.
  • Oxygen or oxygen-containing gas mixtures, such as air, may be introduced into the culture to maintain aerobic conditions.
  • Incubation temperature is usually 20 to 45 °C, preferably 25 to 40 °C. Incubation is continued until the desired amount of putrescine production is achieved. For this purpose it is usually achieved in 10 to 160 hours.
  • Putrescine may be excreted in culture medium or contained in cells.
  • the method for collecting and recovering putrescine produced in the culturing step of the present invention is a desired amino acid from the culture medium using a suitable method known in the art according to the culture method, for example, batch, continuous or fed-batch culture method. Can be collected.
  • Chromosomal libraries of wild type Corynebacterium strains were constructed to screen genes effective for putrescine biosynthesis from chromosomes of wild type Corynebacterium strains. Specifically, chromosomes extracted from wild-type Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 strain were randomly cleaved by restriction enzyme Sau3AI, and fragments of 5 to 8 kb were selected from the shuttle vector of E. coli and Corynebacterium. Was cloned into pECCG122 (Korean Patent Publication No. 1992-0000933) to prepare a chromosome library.
  • genes and glutamate emissions encoding ornithine carbamoyl transferase (argF) in the chromosome in wild-type Corynebacterium glutamicum strain ATCC 13032 disclosed in our patent application (Patent Publication 2012-0064046)
  • the gene encoding the glutamate exporter (NCgl1221) involved in the gene is deleted, the gene encoding ornithine dicarboxylase (ODC) from the wild type E. coli W3110 strain (speC) is introduced into the chromosome, and glutamate is synthesized for ornithine synthesis.
  • the transformant was introduced into the Corynebacterium genus microorganism (KCCM11138P) having putrescine-producing ability (KCCM11138P) produced by substituting a promoter of the argCJBD gene group encoding an enzyme of interest, and each transformant was prepared.
  • Minimum medium containing M putrescine (glucose 10g / l, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.4g / l, NH 4 Cl 4g / l, KH 2 PO 4 1g / l , K 2 HPO 4 1g / l, urea 2g / l, FeSO 4 .7H 2 O 10 mg / l, MnSO 4 ⁇ 5H 2 O 1 mg / l, nicotinamide 5 mg / l, thiamine hydrochloride 5 mg / l, Transformants growing at biotin 0.1 mg / l, 1 mM arginine, kanamycin 25 mg / l, 0.35 M putrescine, pH 7.0) were selected.
  • 1 is a schematic diagram showing the relative positions of genes encoding NCgl0100, NCgl0101, NCgl0102, NCgl0103 and NCgl0104 present on the chromosome of wild type Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 strain.
  • the base sequence of the A15 clone obtained in Example 1 has already been disclosed.
  • primers NCgl0102-F and NCgl0103-R of SEQ ID NO: 6 and 7, and NCgl0104-F and NCgl0104-R of SEQ ID NO: 8 and 9 were prepared as primers for amplifying the NCgl0104 gene.
  • P (CJ7) -F, P (CJ7) -R of SEQ ID NO: 10 and 11 as a primer for amplifying the expression promoter P (CJ7) (or pcj7) (reference; Korean Patent No. 10-0620092) Produced. (Table 1).
  • PCR using each primer of SEQ ID NOs: 1 to 9 was performed (95 ° C. 30 sec denaturation, 50 ° C. 30 sec annealing, and 72 ° C. 1 minute to 1 minute 30 seconds). extension, 25 cycles), and five kinds of gene fragments were amplified.
  • a chromosome of Corynebacterium ammonia genes was used as a template, and PCR using the primers of SEQ ID NOs: 10 and 11 was performed to amplify the promoter fragments.
  • the five expression vectors and the control pHC139T prepared above were introduced into the KCCM11138P strain used in Example 1 by electroporation, and then plated in a 25 ⁇ g / ml kanamycin-containing BHIS plate medium to transformants. Were screened.
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of comparing the growth of each of the mutant strains prepared in the present invention, 1, 2, 3, 4, 5 and 6 are the above six expression vectors pHC139T, pHC139T-P (CJ7 ) -NCgl0100, pHC139T-P (CJ7) -tNCgl0100, pHC139T-P (CJ7) -NCgl0101, pHC139T-P (CJ7) -NCgl0102-NCgl0103 and pHC139T-P (CJ7) -NCgl0104 are shown.
  • the transformant (No. 4) to which pHC139T-P (CJ7) -NCgl0101 was introduced showed an excellent growth degree in a medium containing high concentration of putrescine, thereby making the NCgl0101 effective in putrescine. Gene was selected.
  • Putrescine production capacity of the strain overexpressing the NCgl0101 gene identified as an effective gene in Example 2 was evaluated.
  • a strain in which pHC139T-P (CJ7) -NCgl0101 was introduced into putrescine-producing strain KCCM11138P was used.
  • the pHC139T-P (CJ7) -NCgl0101 prepared in Example 2-1 and the pHC139T vector to be used as a control were introduced into the KCCM 11138P putrescine producing strain by electroporation and then contained 25 ⁇ g / ml kanamycin.
  • the transformants were screened by BHIS plated medium and named as KCCM 11138P / pHC139T and KCCM 11138P / pHC139T-P (CJ7) -NCgl0101.
  • CM plate medium containing 1 mM arginine (glucose 1%, polypeptone 1%, yeast extract 0.5%, beef extract 0.5%, NaCl 0.25%, urea 0.2%, 50% NaOH 100)
  • 1 mM arginine glucose 1%, polypeptone 1%, yeast extract 0.5%, beef extract 0.5%, NaCl 0.25%, urea 0.2%, 50% NaOH 100
  • about one platinum was inoculated into 25 ml titer medium of Table 2 containing 25 ⁇ g / ml kanamycin and then 30 ⁇ C And incubated for 96 hours at 200 rpm.
  • all the produced strains were cultured by adding 1 mM arginine to the medium during fermentation.
  • Example 4-1 Construction of NCgl0101 Deficient Strains in ATCC 13032-based Putrescine-producing Strains
  • NCgl0101-del-F1_BamHI, NCgl0101-del-R1_SalI of SEQ ID NOs: 12 and 13 as primers for obtaining homologous recombination fragments of the N-terminal outer portion of NCgl0101 based on the NCgl0101 nucleotide sequence of the ATCC 13032 strain.
  • primers for obtaining homologous recombinant fragments of the C-terminal outer portion of NCgl0101 NCgl0101-del-F2_SalI and NCgl0101-del-R2_XbaI of SEQ ID NOs: 14 and 15 were prepared (Table 4).
  • N-terminal and C-terminal fragments of the NCgl0101 gene were prepared by PCR using two pairs of primers, and the PCR products were treated with BamHI & SalI and SalI & XbaI, respectively, and treated with BamHI & XbaI. Cloned into. The resulting plasmid was named pDZ-NCgl0101 (K / O).
  • PDZ-NCgl0101 (K / O) vector prepared to obtain KCCM 11138P ⁇ NCgl0101 strain was introduced into KCCM 11138P strain by electroporation and plated on BHIS plate medium containing 25 ⁇ g / ml kanamycine. .
  • Successful chromosome insertion of the vector was determined by whether it was blue in solid media, including X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-galactoside).
  • the primary chromosome-inserted strains were shaken in nutrient medium (30 ° C., 8 hours), diluted from 10 ⁇ 4 to 10 ⁇ 10 , respectively, and plated on solid medium containing X-gal.
  • NCgl0101 deletion strains were selected by secondary crossover and confirmed by PCR using primers of SEQ ID NOs: 12 and 15.
  • the identified strain was named KCCM 11138P ⁇ NCgl0101.
  • Corynebacterium glutamicum ATCC13032-based putrescine-producing strain DAB12-a (argF deficiency, NCgl1221 deficiency, having the same genotype as KCCM11138P) NCgl0101 deficient strains were prepared for E. coli speC introduction, enhanced by replacing the arg operon-argCJBD promoter.
  • NCgl0101 derived from Corynebacterium glutamicum ATCC13869 was used as a template and SEQ ID NOs: 12 and 15 (PCR was performed using primer pairs of NCgl0101-del-F1_BamHI, NCgl0101-del-R2_XbaI). At this time, the PCR reaction was repeated 30 times of denaturation of 30 seconds at 95 °C, annealing of 30 seconds at 55 °C and extension of 2 minutes 30 seconds at 72 °C. PCR products obtained therefrom were subjected to electrophoresis and sequence analysis.
  • genes encoding NCgl0101 derived from Corynebacterium glutamicum ATCC13869 include the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 18.
  • the protein encoded was confirmed to comprise the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19.
  • a comparison of the amino acid sequences of NCgl0101 from Corynebacterium glutamicum ATCC13032 and NCgl0101 from Corynebacterium glutamicum ATCC13869 confirmed that they had 98% sequence homology.
  • NCgl0101 derived from Corynebacterium glutamicum ATCC13869
  • the genomic DNA of Corynebacterium glutamicum ATCC13869 was used as a template, and 2 as shown in Table 4 was used.
  • N-terminal fragment and C-terminal fragment of the NCgl0101 gene were prepared by PCR using a pair of primers, and PCR products were treated with BamHI & SalI and SalI & XbaI, and pDZ vector was treated with BamHI & XbaI. Cloning to make plasmid pDZ-2'NCgl0101 (K / O).
  • the plasmid pDZ-2'NCgl0101 (K / O) was transformed into Corynebacterium glutamicum DAB12-a in the same manner as in Example ⁇ 4-1> to select a strain lacking the gene encoding NCgl0101. .
  • the Corynebacterium glutamicum mutant selected therefrom was named DAB12-a ⁇ NCgl0101.
  • putrescine productivity was measured in the same manner as in Example 3 for two Corynebacterium glutamicum mutants (KCCM11138P ⁇ NCgl0101 and DAB12-a ⁇ NCgl0101). As a result, it was confirmed that putrescine production due to the deletion of NCgl0101 as shown in Table 5.
  • the present inventors named the Corynebacterium glutamicum strain improved in the putrescine production capacity by deleting the NCgl0101 gene in the putrescine producing strain KCCM 11138P produced in the above example, Corynebacterium glutamicum CC01-0244, On December 26, 2011, it was deposited with the accession number KCCM11241P to the Korean Culture Center of Microorganisms (hereinafter abbreviated as "KCCM”), an international depository organization under the Budapest Treaty.
  • KCCM Korean Culture Center of Microorganisms

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Abstract

본 발명은 퓨트레신을 생산할 수 있도록 변이된 코리네박테리움속 미생물에서 NCgl0101 활성이 약화되어 높은 수율로 퓨트레신을 생산할 수 있는 재조합 미생물 및 상기 미생물을 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

퓨트레신 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법
본 발명은 퓨트레신 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법에 관한 것이다.
퓨트레신(putrescine 또는 1,4-butanediamine)은 스퍼미딘(spermidine), 스퍼민(spermine) 등과 같은 폴리아민(polyamine)의 일종으로, 그람 음성 박테리아나 곰팡이에서 발견되며, 다양한 종에서 고농도로 존재하기 때문에 미생물의 대사에 중요한 역할을 수행할 것으로 예측되고 있다. 퓨트레신은 주로 프로필렌(propylene)으로부터 아크릴로니트릴 (acrylonitrile) 및 숙시노니트릴(succinonitrile)을 거치는 화학 합성법으로 생산된다. 이 화학 합성법은 석유 화학 물질 유래로 출발하며 유독성 물질 등을 사용하여 환경친화적이지 못하며 석유자원의 고갈문제를 안고 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여, 보다 환경친화적이고 에너지소비를 절감할 수 있도록 미생물을 이용하여 퓨트레신을 생합성하는 방법을 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 지금까지 알려진 바에 의하면, 퓨트레신은 미생물에서 두가지 경로를 통하여 생합성될 수 있다. 하나는 글루타메이트(glutamate)로부터 오르니틴(ornithine)을 생성하고, 상기 오르니틴을 디카복실화(decarboxylation)시켜서 퓨트레신을 합성하는 경로이고, 다른 하나는 상기 합성된 오르니틴으로부터 합성된 아르기닌을 사용하여 아그마틴(agmatine)을 생성하고, 상기 아그마틴으로부터 퓨트레신을 합성하는 경로이다. 아울러, 이처럼 공지된 퓨트레신 합성경로에 관여하는 효소를 이용하여 목적하는 미생물을 형질전환 시켜서 퓨트레신을 합성하는 방법 역시 연구되고 있다. 예를 들어, WO09/125924에는 대장균에 존재하는 퓨트레신의 분해 및 이용에 관여하는 경로를 불활성화 시키고, 퓨트레신의 전구체인 오르니틴이 아르기닌으로 전환되는 경로를 불활성화 시키며, 오르니틴 생합성 경로를 강화함으로써 퓨트레신을 고수율로 제조하는 방법이 개시되어 있다. 2010년에 발표된 논문에서는 퓨트레신 생산능이 없는 코리네박테리움 속 균주에 오르니틴을 퓨트레신으로 전환시키는 단백질을 도입하고, 활성을 강화하여 퓨트레신을 고농도로 생산하는 방법이 개시되어 있으며 또는 대장균 유래의 아르기닌 디카복실레이즈와 아그마티네이즈(Agmatinase)를 도입하여 아르기닌으로부터 퓨트레신을 생산하는 방법이 공지되었다. 이때, 아르기닌 경로보다 오르니틴 경로를 통한 퓨트레신 생산이 약 50배 높았다(Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 88:4, 859-868, 2010).
이러한 배경하에, 본 발명자들은 NCgl0101 단백질의 활성을 약화시키거나 또는 결실시킨 경우, 코리네박테리움 속 미생물에서 퓨트레신의 생산량이 증가함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 NCgl0101의 활성이 내재적 활성에 비하여 약화되도록 변이되어, 퓨트레신을 고수율로 생산할 수 있는 재조합 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 미생물을 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 사용할 경우 NCgl0101의 활성이 내재적 활성보다 약화되도록 변이되어, 퓨트레신을 높은 수율로 제조할 수 있으므로, 보다 효과적인 퓨트레신의 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주의 염색체에 존재하는 NCgl0100, NCgl0101, NCgl0102, NCgl0103 및 NCgl0104을 코딩하는 유전자의 상대적인 위치를 나타내는 개략도이다.
도 2는 본 발명에서 제조한 각 변이균주의 성장 비교 테스트 결과를 나타낸 것이다. 1, 2, 3, 4, 5 및 6은 KCCM11138P에 pHC139T, pHC139T-P(CJ7)-NCgl0100, pHC139T-P(CJ7)-tNCgl0100, pHC139T-P(CJ7)-NCgl0101, pHC139T-P(CJ7)-NCgl0102-NCgl0103, pHC139T-P(CJ7)-NCgl0104가 도입된 균주이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 퓨트레신을 생산할 수 있도록 변이된 코리네박테리움속 미생물에서 서열번호 17 또는 서열번호 19로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 NCgl0101 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 약화 또는 결실된, 향상된 퓨트레신 생산능을 가지는 재조합 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
본 발명의 용어 "NCgl0101"이란, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 발현되고 아직까지 기능이 명확히 규명되지 않은 금속의존적 효소활성을 나타내는 단백질을 의미하는데, 펩티데이즈 M20 패밀리 또는 아미노벤조일 글루타메이트 분해 단백질(aminobenzoyl-glutamate utilization protein, abgB)이 가지고 있는 금속 결합 도메인을 포함하고 있다. 대장균에 존재하는 abgB는 abgA와 함께 아미노벤조일 글루타메이트 하이드로레이즈를 구성하여, 아미노벤조일 글루타메이트를 아미노벤조에이트와 글루타메이트로 분해할 수 있고, 상기 아미노벤조에이트는 엽산(folate)를 합성하는 전구체로 이용된다고 알려져 있으나, 퓨트레신 생산능에 관한 연관성은 알려지지 않았다.
본 발명의 NCgl0101 단백질은 서열번호 17 또는 서열번호 19로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 그러나 미생물의 종 또는 균주에 따라 상기 활성을 나타내는 단백질의 아미노산 서열에 차이가 존재하는 경우가 있기 때문에, 이에 한정되지 않는다. 즉, 활성을 약화시킴으로써 퓨트레신 생산성 증가에 도움이 될 수 있는 단백질인 한, 서열번호 17 또는 서열번호 19의 아미노산 서열의 하나 이상의 위치에서의 1개 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 첨가 등을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 돌연변이체 또는 인위적인 변형체일 수 있다. 여기에서, "수개"란, 단백질의 아미노산 잔기의 입체 구조에 있어서의 위치나 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 2에서 20개, 바람직하게는 2에서 10개, 보다 바람직하게는 2에서 5개이다. 또한, 이러한 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위 등에는 상기 폴리펩티드의 활성을 함유하는 미생물의 개체 또는 종의 차이에 근거하는 경우 등의 천연적으로 생기는 돌연변이 또는 인위적인 변이(variant)에 의해서 발생하는 것도 포함된다.
본 발명의 상기 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 NCgl0101단백질과 유사한 활성을 가지는 한, 서열번호 17또는 19의 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 가지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 16 또는 서열번호 18로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
상기 용어 "상동성"이란 두 아미노산 서열 간의 동일성을 나타내는 것으로, 점수(score), 동일성(identity), 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 BLAST 2.0를 이용하는, 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있다.
또한, 본 발명의 NCgl0101을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 16의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 상기 뉴클레오티드 서열로부터 제조된 프로브(probe)와 '엄격한 조건'에서 혼성화될 수 있으며, 정상적으로 기능하는 NCgl0101 단백질을 코딩하는 변이형일 수 있다. 본 발명에서 "엄격한 조건(stringent conditions)"이란 폴리뉴클레오타이드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미하는 것이다. 예를 들어, Molecular Cloning (A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989) 또는 Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York)에 구체적으로 기재되어 있으며, 예컨대, 65℃의 혼성화 완충액(3.5 X SSC, 0.02% Ficoll, 0.02% 폴리비닐피롤리돈, 0.02% 소 혈청 알부민, 2.5mM NaH2PO4 (pH 7), 0.5% SDS, 2mM EDTA)에서의 혼성화를 기재하고 있다. SSC는 pH 7의 0.15M 염화나트륨/0.15M 시트르산나트륨이다. 혼성화 후, DNA가 전달되어 있는 멤브레인을 실온에서 2 X SSC로 세척하고 나서, 68℃의 온도에서 0.1 내지 0.5 X SSC/0.1 X SDS로 세척한다.
본 발명의 NCgl0101단백질의 활성 약화는 1) 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 결실, 2) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 감소하도록 발현조절 서열의 변형, 3) 상기 NCgl0101단백질의 활성이 약화되도록 염색체 상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 또는 4) 이의 조합에 의해 이루어질 수 있다.
이중에서, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은 세균내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 일부 핵산서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 상기 "일부"란 폴리뉴클레오티드의 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 2에서 300개, 바람직하게는 2에서 100개, 보다 바람직하게는 1에서 5개이다.
또한, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 감소하도록 발현조절 서열을 변형하는 방법은 상기 발현조절 서열의 활성을 더욱 약화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현조절 서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.
아울러, 본 발명의 단백질을 암호화하는, 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열을 변형하는 방법은 상기 서열의 활성을 더욱 약화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 핵산 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다.
한편, 본 발명의 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물은 오르니틴에서 아르기닌 합성에 관여하는 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼레이즈(ornithine carbamoyltransfrase, ArgF) 및 글루타메이트의 배출에 관여하는 단백질(NCgl1221)의 활성을 내재적 활성에 비하여 약화시키도록 추가로 변이될 수 있다. 뿐만 아니라, 오르니틴 디카르복실라아제(ornithine decarboxylase, ODC)의 활성을 도입하도록 변이될 수 있고, 퓨트레신 전구체인 오르니틴 생합성 경로 강화를 위해 글루타메이트를 아세틸 글루타메이트로 전환시키는 아세틸 글루타메이트 신테이즈 또는 아세틸 오르니틴을 오르니틴으로 전환하는 오르니틴 아세틸 트랜스퍼레이즈(ArgJ), 아세틸 글루타메이트를 아세틸 글루타밀 포스페이트로 전환시키는 아세틸 글루타메이트 카이네이즈(ArgB), 아세틸 글루타밀 포스페이트를 아세틸 글루타메이트 세미알데하이드로 전환시키는 아세틸 감마 글루타밀 포스페이트 리덕테이즈(ArgC) 및 아세틸 글루타메이트 세미알데하이드를 아세틸 오르니틴으로 전환시키는 아세틸 오르니틴 아미노 트랜스퍼레이즈(ArgD)의 활성을 내재적 활성에 비하여 증대시키도록 추가로 변이될 수 있다. (Sakanyan V et al., Microbiology. 142:1, 99-108, 1996).
이때, 상기 기재된 ArgF, NCgl1221, ODC, ArgC, ArgJ, ArgB 및 ArgD는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 각각 서열번호 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26의 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "오르니틴 디카르복실라아제(ornithine decarboxylase, ODC)"란, 오르니틴을 이용하여 퓨트레신을 생성하는 효소를 의미하는데, 상기 ODC는 조효소로서 피리독살 포스페이트 (Pyridoxal 5'-phosphate, PLP)를 필요로 하고 대부분의 그람음성균에 존재하며, 그람 양성균 중에서 락토바실러스(Lactobacillus)와 같은 장내 세균중의 일부에 존재할 수 있다. 대장균의 경우 ODC를 암호화하는 유전자는 두 종류가 있는데, 그 중 하나인 speC는 지속적으로 일정 농도로 발현되고, 다른 하나인 speF는 특정 조건 (오르니틴이 일정농도 이상 존재 및 낮은 pH 조건)하에서 발현이 유도되는 유전자이다. 종에 따라 대장균처럼 2종류의 ODC를 가진 종도 있고, 한가지 종류만 갖는 종도 있다. 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 시겔라 속(Shigella sp.), 시트로박터 속(Citrobacter sp.), 살모넬라 속(Salmonella sp.), 엔테로박터 속(Enterobacter sp.) 등의 종에서는 두 종류의 ODC (speC, speF)를, 여시니아 속(Yersinia sp.), 크렙시엘라 속(Klebsiella sp.), 어위니아 속(Erwinia sp.) 등의 균주는 한 종류의 ODC (speC)를 갖는다. 유산균의 경우 ODC가 한 종류의 유전자 (speF)에서 발현되며, 낮은 pH나 오르니틴(ornithine)과 히스티딘(histidine)이 풍부한 조건에서 발현이 유도되는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 재조합 코리네박테리움 속 미생물은 상기 여러 종 유래의 ODC 코딩 유전자를 이용하여 ODC 활성이 도입될 수 있다. 상기 ODC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 특별히 이에 제한되지 않으나, 서열번호 22의 아미노산 서열 또는 이와 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
아울러, 미생물에 오르니틴 디카르복실라아제(ODC)의 활성을 도입하는 것은 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법으로 수행될 수 있는데, 예를 들어, ODC를 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 염색체에 삽입하는 방법, 상기 폴리뉴클레오티드를 벡터 시스템에 도입하여 미생물에 도입하는 방법, ODC를 코딩하는 염기서열의 상류에 개량된 활성을 나타내는 프로모터를 도입하거나 프로모터에 변이를 준 ODC를 도입하는 방법, ODC를 코딩하는 염기서열의 변이체를 도입하는 방법 등을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 ODC를 코딩하는 염기서열을 도입할 경우, 이의 발현을 조절하기 위한 프로모터로서 공지된 CJ7 프로모터를 사용할 수 있다.
아울러, 상기 ArgC, ArgJ, ArgB 및 ArgD의 활성증대는 1) 상기 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가, 2) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형, 3) 상기 효소의 활성이 강화되도록 염색체 상의 상기 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형, 4) 이의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법 등에 의하여 수행될 수 있다.
상기 1) 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가는 구체적으로, 벡터에 작동가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있거나, 상기 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 상기 숙주세포의 염색체내 상기 폴리뉴클레오티드의 카피수를 증가하는 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명의 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 적당한 숙주 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당 업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 pACYC177, pCL, pCC1BAC 벡터를 사용할 수 있다.
또한, 숙주세포로 형질전환되어 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입시킬 수 있는 벡터로 바람직하게는 대장균과 코리네형 세균에서 양방으로 자가복제가 가능한 셔틀벡터 pECCG112 벡터(특허공개번호 제1992-0000933호)를 예로 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 세균내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 신규 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동 재조합에 의하여 이루어질 수 있다. 본 발명의 벡터는 상동 재조합을 일으켜서, 염색체 내로 삽입될 수 있으므로 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있는데, 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉, 목적 폴리뉴클레오티드의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나, 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 발명에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하든지 상관없이 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
또한, 상기 용어 "작동 가능하게 연결"이란 본 발명의 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
또한, 본 발명의 2) 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열을 변형하는 방법은 상기 발현조절 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현조절 서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.
상기 폴리뉴클레오티드 발현단위의 상단부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터가 연결될 수 있는데, 상기 강력한 프로모터의 예로는 pcj7 프로모터, lysCP1 프로모터, EF-Tu 프로모터, groEL 프로모터, aceA 혹은 aceB 프로모터 등이 있으며, 더욱 바람직하게는 코리네박테리움 유래 프로모터인 lysCP1 프로모터 혹은 pcj7 프로모터와 작동가능하게 연결되어 상기 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현율을 향상시킬 수 있다. 여기서 lysCP1 프로모터는 아스파테이트 키나제 및 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나제를 암호화 하는 폴리뉴클레오티드의 프로모터 부위 염기서열 치환을 통해 개량한 프로모터로서 아스파테이트 키나제 유전자의 발현량 증대를 통해 당 효소의 활성을 야생형 대비 5배 정도 높일 수 있는 강력한 프로모터이다 (국제 공개특허 제2009-096689호). 또한 pcj7 프로모터는 코리네박테리움 암모니아게네스로부터 강력한 프로모터 서열을 갖는 영역을 탐색하던 중 코리네박테리움 암모니아게네스 및 에세리키아에서 발현가능하고, 강력한 프로모터 활성을 갖는 것이 확인된 프로모터로서 코리네박테리움 글루타미쿰에서 역시 높은 강도로 발현 가능한 프로모터이다 (대한민국 등록특허 제0620092호).
아울러, 3) 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열을 변형하는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나 상기 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다.
본 발명의 미생물은 퓨트레신 생산 가능한 미생물로서, 서열번호 17 또는 서열번호 19로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 발현되는 원핵 미생물을 포함하며, 이의 예로는 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 시겔라 속(Shigella sp.), 시트로박터 속(Citrobacter sp.), 살모넬라 속(Salmonella sp.), 엔테로박터 속(Enterobacter sp.) 여시니아 속(Yersinia sp.), 크렙시엘라 속(Klebsiella sp.), 어위니아 속(Erwinia sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 브레비박테리움 속(Brevibacterium sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 셀레노모나스 속(Selenomanas sp.), 비브리오 속(Vibrio sp.)에 속하는 미생물일 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 미생물은 코리네박테리움 속에 속하는 미생물이며, 보다 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서는 글루타메이트에서 퓨트레신 생성 경로가 강화되어 고농도 퓨트레신 생산능을 갖는, 기탁번호 KCCM11138P의 코리네박테리움 속 미생물 (대한민국 특허공개번호 제2012-0064046호)을 변이시켰다. 구체적으로, 퓨트레신 생산균주 KCCM11138P는 ATCC13032 균주에서 오르니틴 축적을 위한 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라아제(argF)를 코딩하는 유전자 및 세포내 글루타메이트를 증가시키기 위한 글루타메이트 엑스포터(NCgl1221)를 코딩하는 유전자가 결손되고, 오르니틴 디카르복실라아제(speC)를 코딩하는 유전자가 도입되며, 오르니틴 생합성 유전자(argCJBD)의 발현양이 증가된 퓨트레신 과생산 균주이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서는, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 기반의 퓨트레신 생산 균주인 KCCM11138P와 동일한 유전형(genotype)을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 기반의 퓨트레신 생산 균주 DAB12-a를 변이시켰다. 구체적으로, 퓨트레신 생산 균주 DAB12-a는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection; ATCC)으로부터 입수한 ATCC13869 균주에서 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라아제(ArgF)를 코딩하는 유전자 및 글루타메이트 배출 단백질 NCgl1221을 코딩하는 유전자는 결손되고, 대장균 유래 오르니틴 디카르복실라아제(OCD)를 코딩하는 유전자(speC)가 도입되며, 오르니틴 생합성 유전자 오페론(argCJBD)의 프로모터가 개량된 프로모터로 치환된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC13032에서 염색체 내 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼레이즈(ArgF)를 암호화하는 유전자 및 글루타메이트 배출에 관여하는 글루타메이트 엑스포터(NCgl1221)를 암호화하는 유전자가 결손되고, 글루타메이트에서 오르니틴 합성에 관여하는 효소를 코딩하고 있는 ArgCJBD 유전자군의 프로모터가 치환되며, 오르니틴 디카복실레이즈(ODC)를 암호화하는 유전자(speC)가 염색체 내에 도입되어, 제작된 퓨트레신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물(KCCM11138P)을 기초로 하여, 고농도 퓨트레신 배지에서 성장성이 좋은 클론(A15)을 선발하고, 상기 선발된 A15에 NCgl0100, NCgl0101, NCgl0102, NCgl0103 및 NCgl0104을 코딩하는 유전자가 포함되어 있음을 확인하였으며(실시예 1), 상기 5종의 유전자 중에서 NCgl0101을 코딩하는 유전자로 인해 고농도 퓨트레신 배지에서도 상기 미생물이 성장함을 확인하였다(실시예 2). NCgl0101을 코딩하는 유전자의 특성을 연구한 결과, NCgl0101을 코딩하는 유전자가 과발현된 균주에서는 퓨트레신의 생산량이 감소되고(실시예 3), 상기 NCgl0101을 코딩하는 유전자가 결실된 균주에서는 퓨트레신의 생산량이 증가됨을(실시예 4) 확인하였다.
이에, 본 발명자는 퓨트레신 생산균주인 KCCM 11138P에서 NCgl0101 유전자를 결실하여 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 Corynebacterium glutamicum CC01-0244로 명명하고, 2011년 12월 26일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, 이하, "KCCM"이라 약칭함)에 수탁번호 KCCM11241P로 기탁하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 서열번호 17 또는 서열번호 19로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 NCgl0101 단백질의 활성이 약화되도록 변형된, 향상된 퓨트레신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물을 배양하는 단계; 및
상기 단계에서 수득되는 배양물로부터 퓨트레신을 분리하는 단계를 포함하는 퓨트레신 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명의 상기 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양방법의 예에는 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 만족시켜야 한다.
사용되는 배양 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 충족시켜야 한다. 다양한 미생물에 대한 배양 배지는 공지되어 있다(예를 들면, "Manual of Methods for General Bacteriology" from American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)). 배지 내 탄소 공급원은 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알콜(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 이용할 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 질소 공급원은 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄)을 이용할 수 있으며, 이들 물질 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 인 공급원으로서 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨 함유 염을 이용할 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필수적인 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철)을 함유할 수 있으며, 최종적으로, 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 상기 언급한 물질 외에 사용할 수 있다. 적합한 전구체를 상기 배양 배지에 추가로 가할 수 있다. 상기 공급 물질은 배양물에 한번에 모두 가하거나, 배양중 적절하게 공급할 수 있다.
배양물의 pH는 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 적절히 사용하여 조절할 수 있다. 발포는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 거포제를 사용하여 조절할 수 있다. 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물, 예를 들어 공기를 배양물 중으로 도입시켜 호기성 조건을 유지시킬 수 있다. 배양 온도는 통상적으로 20 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃이다. 배양은 원하는 퓨트레신의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160 시간에서 달성된다. 퓨트레신은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.
본 발명의 상기 배양 단계에서 생산된 퓨트레신을 수집 및 회수하는 방법은 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 아미노산을 수집할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 퓨트레신에 대한 유효유전자 선별용 라이브러리의 제작 및 클론 선별
야생형 코리네박테리움 균주의 염색체로부터 퓨트레신 생합성에 유효한 유전자를 스크리닝하기 위하여 야생형 코리네박테리움 균주의 염색체 라이브러리를 제작하였다. 구체적으로, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주로부터 추출된 염색체를 제한효소 Sau3AI으로 처리하여 무작위적으로 절단하고, 이중에서 5 내지 8kb의 단편을 선별하여 대장균과 코리네박테리움의 셔틀벡터인 pECCG122(한국공개특허 제1992-0000933호)에 클로닝하여 염색체 라이브러리를 제작하였다.
제작한 코리네박테리움 염색체 라이브러리로부터 퓨트레신 생합성에 유효한 유전자를 선별하기 위해 퓨트레신을 고농도로 포함하는 배지에서 생장가능한 콜로니를 확보하였다.
한편, 본 발명자들의 특허출원(특허공개 제2012-0064046호)에 개시된, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC 13032에서 염색체 내 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼레이즈(argF)를 암호화하는 유전자 및 글루타메이트 배출에 관여하는 글루타메이트 엑스포터(NCgl1221)를 암호화하는 유전자가 결손되고, 야생형 대장균 W3110 균주 유래의 오르니틴 디카복실레이즈(ODC)를 암호화하는 유전자(speC)가 염색체 내에 도입되며, 글루타메이트에서 오르니틴 합성에 관여하는 효소를 코딩하고 있는 argCJBD 유전자군의 프로모터를 치환함으로써 제작된 퓨트레신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물 (KCCM11138P)에, 상기 라이브러리를 도입하여 각각의 형질전환체를 제작하고, 0.35M의 퓨트레신이 포함된 최소배지(포도당 10g/ℓ, MgSO4ㆍ7H2O 0.4g/ℓ, NH4Cl 4g/ℓ, KH2PO4 1g/ℓ, K2HPO4 1g/ℓ, 요소 2g/ℓ, FeSO4ㆍ7H2O 10㎎/ℓ, MnSO4ㆍ5H2O 1 ㎎/ℓ, 니코틴아미드 5㎎/ℓ, 티아민 염산염 5㎎/ℓ, 바이오틴 0.1㎎/ℓ, 1 mM 아르기닌, 카나마이신 25㎎/ℓ, 0.35M 퓨트레신, pH 7.0)에서 성장하는 형질전환체를 선별하였다. 그 결과, 275개의 콜로니가 선별되었고, 고농도 퓨트레신을 포함하는 배지에서 성장이 우수한 콜로니를 2차로 확인하고, 각 라이브러리 클론을 획득하여 퓨트레신 균주에 재도입한 후, 고농도 퓨트레신을 포함하는 배지에서 성장이 우수한 콜로니를 3차 확인함으로써 최종 1개의 클론(A15)을 선발하였다. 상기 선발된 클론을 시퀀싱으로 확인한 결과, N 말단의 436개 아미노산이 제거된 NCgl0100, NCgl0101, NCgl0102, NCgl0103 및 NCgl0104의 총 5개의 ORF가 포함되어 있음을 확인하였다(도 1). 도 1은 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주의 염색체에 존재하는 NCgl0100, NCgl0101, NCgl0102, NCgl0103 및 NCgl0104을 코딩하는 유전자의 상대적인 위치를 나타내는 개략도이다.
실시예 2. A15 클론에 포함된 퓨트레신에 대한 유효 유전자 확인
실시예 2-1. A15 클론에 포함된 5개 유전자의 클로닝 및 형질전환체 제조
실시예 1에서 획득한 A15 클론의 염기서열은 이미 공개되어 있다. ATCC13032 균주의 보고된 염기서열에 기초하여 NCgl0100 유전자를 증폭하기 위한 프라이머로 서열번호1과 2의 NCgl0100-F, NCgl0100-R를, N-말단의 436개 아미노산이 제거된 형태의 tNCgl0100 유전자를 증폭하기 위한 프라이머로 서열번호 2와 3의 NCgl0100-R, tNCgl0100-F를, NCgl0101 유전자를 증폭하기 위한 프라이머로 서열번호 4와 5의 NCgl0101-F, NCgl0101-R를, NCgl0102와 NCgl0103 유전자를 동시에 증폭하기 위한 프라이머로 서열번호 6과 7의 NCgl0102-F, NCgl0103-R를, NCgl0104 유전자를 증폭하기 위한 프라이머로 서열번호 8과 9의 NCgl0104-F, NCgl0104-R를 제작하였다. 또한 발현 프로모터인 P(CJ7)(또는pcj7) (참고; 대한민국 등록특허 제10-0620092호)를 증폭하기 위한 프라이머로 서열번호 10과 11의 P(CJ7)-F, P(CJ7)-R를 제작하였다. (표1).
그런 다음, ATCC 13032균주의 염색체를 주형으로 하고, 상기 서열번호 1 내지 9의 각 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여(95℃ 30초 denaturation, 50℃ 30초 annealing 및 72℃ 1분~1분30초 extension, 25cycle), 5종류의 유전자 단편을 증폭하였다. 또한, 코리네박테리움 암모니아게네스의 염색체를 주형으로 하고, 상기 서열번호 10 및 11의 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여 프로모터 단편을 증폭하였다.
KpnI과 XbaI으로 절단된 5개 유전자와EcoRV와 KpnI으로 절단된 CJ7 프로모터를 EcoRV와 XbaI으로 절단된 발현벡터인 pHC139T (대한민국 등록특허 제10-0860932호)에 접합하여 총 5개의 발현벡터 pHC139T-P(CJ7)-NCgl0100, pHC139T-P(CJ7)-tNCgl0100, pHC139T-P(CJ7)-NCgl0101, pHC139T-P(CJ7)-NCgl0102-NCgl0103, 및 pHC139T-P(CJ7)-NCgl0104를 제작하였다.
[표 1]
Figure PCTKR2013000487-appb-I000001
상기 제작된 5개 발현벡터와 대조군인 pHC139T를 실시예 1에 사용된 KCCM11138P 균주에 전기 천공법(electroporation)을 이용하여 도입한 뒤 25 ㎍/㎖ 카나마이신이 함유된 BHIS 평판 배지에 도말하여 형질전환체를 선별하였다.
실시예 2-2. 퓨트레신에 대한 유효유전자 탐색
상기 실시예 2-1에서 수득한 총 6종의 형질전환체를 대상으로 하여, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 고농도 퓨트레신을 포함하는 배지에서 성장이 우수한 형질전환체를 선별하였다(도 2). 도 2는 본 발명에서 제조한 각 변이균주의 성장정도를 비교한 결과를 나타내는 사진으로서, 1, 2, 3, 4, 5 및 6은 각각 상기 6종의 발현벡터인 pHC139T, pHC139T-P(CJ7)-NCgl0100, pHC139T-P(CJ7)-tNCgl0100, pHC139T-P(CJ7)-NCgl0101, pHC139T-P(CJ7)-NCgl0102-NCgl0103 및 pHC139T-P(CJ7)-NCgl0104이 도입된 균주를 나타낸다. 상기 도 2에서 보듯이, pHC139T-P(CJ7)-NCgl0101이 도입된 형질전환체(4번)만이 고농도 퓨트레신을 포함하는 배지에서 우수한 성장정도를 나타냄을 확인함으로써, 상기 NCgl0101를 퓨트레신 유효유전자로 선별하였다.
실시예 3. NCgl0101 과발현 균주에서의 퓨트레신 생산능 평가
실시예 2에서 유효 유전자로 확인된 NCgl0101유전자를 과발현하는 균주의 퓨트레신 생산능을 평가하였다. 퓨트레신 생산균주 KCCM11138P에 pHC139T-P(CJ7)-NCgl0101이 도입된 균주를 사용하였다.
실시예 2-1에서 제작한 pHC139T-P(CJ7)-NCgl0101과 대조군으로 사용할 pHC139T 벡터를 KCCM 11138P퓨트레신 생산균주에 전기 천공법(electroporation)을 이용하여 도입한 뒤 25 ㎍/㎖ 카나마이신이 함유된 BHIS 평판 배지에 도말하여 형질전환체를 선별하여 KCCM 11138P/pHC139T, KCCM 11138P/pHC139T-P(CJ7)-NCgl0101로 명명하였다. 선별한 2개의 형질전환체를 대상으로 1 mM 아르기닌이 포함된 CM 평판 배지(포도당 1%, polypeptone 1%, 효모추출물 0.5%, beef extract 0.5%, NaCl 0.25%, urea 0.2%, 50%NaOH 100㎕, agar 2%, pH 6.8, 1L 기준)에서 30˚C, 24시간 배양한 후, 25 ㎍/㎖ 카나마이신이 함유된 표 2의 25 ㎖ 역가 배지에 한 백금이 정도 접종한 다음 이를 30˚C, 200rpm으로 96시간동안 진탕배양하였다. 제작된 모든 균주의 경우 발효 시 배지에 1 mM 아르기닌을 첨가하여 배양하였다.
[표 2]
Figure PCTKR2013000487-appb-I000002
그 결과, 표 3에서 보는 바와 같이 NCgl0101를 과발현한 경우, 퓨트레신 생산양이 감소됨을 확인하였다.
[표 3]
Figure PCTKR2013000487-appb-I000003
실시예 4. NCgl0101이 결실된 균주에서의 퓨트레신 생산능 평가
실시예 4-1. ATCC 13032 기반 퓨트레신 생산균주에서의 NCgl0101 결손 균주 제작
NCgl0101 과발현시 고농도 퓨트레신 배지에서 세포성장성이 증가되지만 실시예 3에 따르면 NCgl0101 과발현시 퓨트레신 생산양이 감소함을 확인하였다. 이러한 결과를 토대로 NCgl0101 결손시 퓨트레신 생산성에 대한 영향성을 확인하였다.
구체적으로, ATCC 13032 균주의 NCgl0101 염기서열을 기초로 NCgl0101의 N-말단 외부 부분의 상동 재조합 (homologous recombination) 단편을 얻기 위한 프라이머로 서열번호 12와 13의 NCgl0101-del-F1_BamHI, NCgl0101-del-R1_SalI을 제작하였고, NCgl0101의 C-말단 외부 부분의 상동 재조합 단편을 얻기 위한 프라이머로 서열번호 14와 15의 NCgl0101-del-F2_SalI, NCgl0101-del-R2_XbaI를 제작하였다 (표 4 ). 2쌍의 프라이머를 이용하여 NCgl0101 유전자의 N-말단 부분 단편과 C-말단 부분 단편을 PCR로 제조하였고, PCR 산물을 각각 BamHI & SalI과 SalI & XbaI을 처리하고, BamHI & XbaI을 처리한 pDZ 벡터에 클로닝하였다. 그 결과 얻어진 플라스미드를 pDZ-NCgl0101(K/O)로 명명하였다.
[표 4]
Figure PCTKR2013000487-appb-I000004
KCCM 11138P △NCgl0101 균주를 얻기 위해 제작된 pDZ-NCgl0101(K/O) 벡터를 KCCM 11138P 균주에 전기 천공법(electroporation)을 이용하여 도입한 뒤 25 ㎍/㎖ kanamycine이 함유된 BHIS 평판 배지에 도말하였다. 벡터의 성공적인 염색체 삽입은 X-gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드)을 포함한 고체배지에서 푸른색을 나타내는가 여부로 판별하였다. 1차 염색체 삽입된 균주를 영양 배지에서 진탕 배양 (30℃, 8시간)한 후, 각각 10-4으로부터 10-10까지 희석하여, X-gal을 포함하고 있는 고체배지에 도말하였다. 대부분의 콜로니가 푸른색을 나타내는데 반해 낮은 비율로 나타나는 백색의 콜로니를 선별함으로써, 2차 교차(crossover)에 의해 최종 NCgl0101 결실 균주를 선별하고 서열번호 12와 15의 프라이머를 이용해 PCR로 확인하였다. 확인된 균주를 KCCM 11138P △NCgl0101로 명명하였다.
실시예 4-2. ATCC 13869 기반 퓨트레신 생산균주에서의 NCgl0101 결손 균주 제작
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 기반의 퓨트레신 생산 균주인 KCCM11138P와 동일한 유전형(genotype)을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 기반의 퓨트레신 생산 균주 DAB12-a(argF 결손, NCgl1221 결손, 대장균 speC 도입, arg 오페론-argCJBD 프로모터 치환하여 강화)를 대상으로 NCgl0101 결손 균주를 제작하였다.
구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래 NCgl0101을 코딩하는 유전자 및 그로부터 발현되는 단백질 서열을 확인하기 위해, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869의 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호: 12 및 15(NCgl0101-del-F1_BamHI, NCgl0101-del-R2_XbaI)의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 2분 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이로부터 수득된 PCR 산물을 전기영동으로 분리한 후 서열분석을 수행한 결과, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래의 NCgl0101를 코딩하는 유전자는 서열번호 18로 기재되는 염기서열을 포함하며, 이로부터 코딩되는 단백질은 서열번호 19로 기재되는 아미노산 서열을 포함함을 확인하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래의 NCgl0101과 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래의 NCgl0101의 아미노산 서열을 비교한 결과, 이들은 98%의 서열 상동성을 갖는 것으로 확인되었다.
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래 NCgl0101을 코딩하는 유전자를 결손하기 위해 상기 실시예 <4-1>에서와 같이 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 표 4에 기재된 2쌍의 프라이머를 이용하여 NCgl0101 유전자의 N-말단 부분 단편과 C-말단 부분 단편을 PCR로 제조하였고, PCR 산물을 각각 BamHI & SalI과 SalI & XbaI을 처리하고, pDZ 벡터는 BamHI & XbaI을 처리하여 클로닝하여 플라스미드 pDZ-2'NCgl0101(K/O)를 제작하였다.
상기 플라스미드 pDZ-2'NCgl0101(K/O)를 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 DAB12-a에 형질전환하여 NCgl0101를 코딩하는 유전자가 결실된 균주를 선발하였다. 이로부터 선발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 DAB12-a△NCgl0101로 명명하였다.
실시예 4-3. NCgl0101 결손 균주의 퓨트레신 생산능 평가
퓨트레신 생산 균주에서 NCgl0101 결손이 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 <4-1> 및 <4-2>에서 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 대상으로 퓨트레신 생산능을 비교하였다.
구체적으로, 2종의 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주(KCCM11138P△NCgl0101, DAB12-a△NCgl0101)를 대상으로 실시예 3과 같은 평가방법에 의해 퓨트레신 생산성을 측정하였다. 그 결과, 하기 표5에서와 같이 NCgl0101 결실로 인해 퓨트레신 생산양이 증가됨을 확인하였다.
[표 5]
Figure PCTKR2013000487-appb-I000005
상기 실시예 3 및 4의 내용을 종합하면, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서 NCgl0101을 코딩하는 유전자가 과발현되면 퓨트레신의 생산량이 감소하고, 결실되면 퓨트레신의 생산량이 증가하였으므로, 상기 NCgl0101은 퓨트레신의 생합성에 직접적으로 영향을 나타냄을 알 수 있었다.
이에, 본 발명자는 상기 실시예에서 제작된, 퓨트레신 생산균주인 KCCM 11138P에서 NCgl0101 유전자를 결실시켜 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 Corynebacterium glutamicum CC01-0244로 명명하고, 2011년 12월 26일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, 이하, "KCCM"으로 약칭함)에 수탁번호 KCCM11241P로 기탁하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당 업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2013000487-appb-I000006

Claims (11)

  1. 퓨트레신을 생산할 수 있도록 변이된 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물에서 서열번호 17 또는 서열번호 19로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 약화 또는 결실된, 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물.
  2. 제 1항에 있어서, 추가로 오르니틴 디카복실레이즈(speC)의 활성이 도입된 것인 미생물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 ODC는 서열번호 22의 아미노산 서열을 가지는 것인 미생물.
  4. 제 1항에 있어서, 추가로 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼레이즈(ArgF) 및 글루타메이트 엑스포터(NCgl1221)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된 것인 미생물.
  5. 제 4항에 있어서, ArgF는 서열번호 20의 아미노산 서열을 가지고, NCgl1221은 서열번호 21의 아미노산 서열을 가지는 것인 미생물.
  6. 제1항에 있어서, 추가로 아세틸 감마 글루타밀 포스페이트 리덕테이즈(ArgC), 아세틸 글루타메이트 신테이즈 또는 오르니틴 아세틸 트랜스퍼레이즈(ArgJ), 아세틸 글루타메이트 카이네이즈(ArgB), 및 아세틸 오르니틴 아미노 트랜스퍼레이즈(ArgD)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 활성이 증가된 것인 미생물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 ArgC, ArgJ, ArgB 및 ArgD는 각각 서열번호 23, 24, 25, 및 26의 아미노산 서열을 가지는 것인 미생물.
  8. 제1항에 있어서, 활성 약화는 1) 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 일부 또는 전체의 결실, 2) 상기 유전자 발현의 감소, 3) 상기 단백질의 활성이 약화되도록 염색체 상의 상기 유전자 서열의 변이 또는 4) 이의 조합에 의해 수행되는 것인 미생물.
  9. 제1항에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인 것인 미생물.
  10. 서열번호 17 또는 서열번호 19로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 약화 또는 결실된, 향상된 퓨트레신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물을 배양하는 단계; 및
    상기 단계에서 수득되는 배양물로부터 퓨트레신을 분리하는 단계를 포함하는 퓨트레신 생산 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인 퓨트레신 생산 방법.
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