TR201810509T4 - Geliştirilmiş putresin üretkenliğine sahip rekombinant mikroorganizma ve bunu kullanarak putresin üretmeye yönelik yöntem. - Google Patents
Geliştirilmiş putresin üretkenliğine sahip rekombinant mikroorganizma ve bunu kullanarak putresin üretmeye yönelik yöntem. Download PDFInfo
- Publication number
- TR201810509T4 TR201810509T4 TR2018/10509T TR201810509T TR201810509T4 TR 201810509 T4 TR201810509 T4 TR 201810509T4 TR 2018/10509 T TR2018/10509 T TR 2018/10509T TR 201810509 T TR201810509 T TR 201810509T TR 201810509 T4 TR201810509 T4 TR 201810509T4
- Authority
- TR
- Turkey
- Prior art keywords
- protein
- activity
- putrescine
- seq
- microorganism
- Prior art date
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 55
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 27
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 162
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 111
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 claims description 80
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 63
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 63
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 63
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 54
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 37
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 33
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 30
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 18
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 15
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 claims description 15
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 12
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 claims description 11
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 7
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 5
- RFMMMVDNIPUKGG-YFKPBYRVSA-N N-acetyl-L-glutamic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O RFMMMVDNIPUKGG-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 3
- 101800001241 Acetylglutamate kinase Proteins 0.000 claims description 2
- 108020000311 Glutamate Synthase Proteins 0.000 claims description 2
- 101710165738 Acetylornithine aminotransferase Proteins 0.000 claims 1
- 108010072610 N-acetyl-gamma-glutamyl-phosphate reductase Proteins 0.000 claims 1
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 claims 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 claims 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 claims 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 abstract description 20
- 102000052812 Ornithine decarboxylases Human genes 0.000 description 25
- 108700005126 Ornithine decarboxylases Proteins 0.000 description 25
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 16
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 11
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 10
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 10
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 9
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 9
- -1 aminobenzoyl-glutamate aminobenzoate Chemical compound 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 3
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 235000007682 pyridoxal 5'-phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000011589 pyridoxal 5'-phosphate Substances 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- QYPPJABKJHAVHS-UHFFFAOYSA-N Agmatine Natural products NCCCCNC(N)=N QYPPJABKJHAVHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007132 Carboxyl and Carbamoyl Transferases Human genes 0.000 description 2
- 108010072957 Carboxyl and Carbamoyl Transferases Proteins 0.000 description 2
- 241000873310 Citrobacter sp. Species 0.000 description 2
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 2
- 241000147019 Enterobacter sp. Species 0.000 description 2
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- JRLGPAXAGHMNOL-LURJTMIESA-N N(2)-acetyl-L-ornithine Chemical compound CC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CCC[NH3+] JRLGPAXAGHMNOL-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007981 Ornithine carbamoyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 101710113020 Ornithine transcarbamylase, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000607149 Salmonella sp. Species 0.000 description 2
- 235000012377 Salvia columbariae var. columbariae Nutrition 0.000 description 2
- 240000005481 Salvia hispanica Species 0.000 description 2
- 235000001498 Salvia hispanica Nutrition 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- QYPPJABKJHAVHS-UHFFFAOYSA-P agmatinium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCCC[NH3+] QYPPJABKJHAVHS-UHFFFAOYSA-P 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 235000014167 chia Nutrition 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 229940096118 ella Drugs 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 2
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 2
- 238000002803 maceration Methods 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 101150022778 speF gene Proteins 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N spermine Chemical compound NCCCNCCCCNCCCN PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229960000344 thiamine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 2
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 2
- OOLLAFOLCSJHRE-ZHAKMVSLSA-N ulipristal acetate Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1[C@@H]1C2=C3CCC(=O)C=C3CC[C@H]2[C@H](CC[C@]2(OC(C)=O)C(C)=O)[C@]2(C)C1 OOLLAFOLCSJHRE-ZHAKMVSLSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 2
- XVZCXCTYGHPNEM-IHRRRGAJSA-N (2s)-1-[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O XVZCXCTYGHPNEM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- GRSIQCSSMDOXBZ-IBGZPJMESA-N (4s)-4-amino-5-hexadecoxy-5-oxopentanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCOC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O GRSIQCSSMDOXBZ-IBGZPJMESA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- OHVLMTFVQDZYHP-UHFFFAOYSA-N 1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-2-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]ethanone Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)C(CN1CCN(CC1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)=O OHVLMTFVQDZYHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GADGMZDHLQLZRI-UHFFFAOYSA-N 2-[(4-Aminobenzoyl)amino]pentanedioic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 GADGMZDHLQLZRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IHCCLXNEEPMSIO-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperidin-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1CCN(CC1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 IHCCLXNEEPMSIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]propan-1-one Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)CCC(=O)N1CCN(CC1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N Acrylonitrile Chemical compound C=CC#N NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 102100032252 Antizyme inhibitor 2 Human genes 0.000 description 1
- KZYSHAMXEBPJBD-JRQIVUDYSA-N Asn-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O KZYSHAMXEBPJBD-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 1
- WSWYMRLTJVKRCE-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ala-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WSWYMRLTJVKRCE-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 101100242035 Bacillus subtilis (strain 168) pdhA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100350224 Bacillus subtilis (strain 168) pdhB gene Proteins 0.000 description 1
- 101100096227 Bacteroides fragilis (strain 638R) argF' gene Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100439426 Bradyrhizobium diazoefficiens (strain JCM 10833 / BCRC 13528 / IAM 13628 / NBRC 14792 / USDA 110) groEL4 gene Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004031 Carboxy-Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090000489 Carboxy-Lyases Proteins 0.000 description 1
- 101100236536 Corynebacterium glutamicum (strain ATCC 13032 / DSM 20300 / BCRC 11384 / JCM 1318 / LMG 3730 / NCIMB 10025) glcB gene Proteins 0.000 description 1
- 241000186249 Corynebacterium sp. Species 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100030801 Elongation factor 1-alpha 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- NCWOMXABNYEPLY-NRPADANISA-N Glu-Ala-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NCWOMXABNYEPLY-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- QGZSAHIZRQHCEQ-QWRGUYRKSA-N Gly-Asp-Tyr Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 QGZSAHIZRQHCEQ-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- FQKKPCWTZZEDIC-XPUUQOCRSA-N Gly-His-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CN=CN1 FQKKPCWTZZEDIC-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- GGAPHLIUUTVYMX-QWRGUYRKSA-N Gly-Phe-Ser Chemical compound OC[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)C[NH3+])CC1=CC=CC=C1 GGAPHLIUUTVYMX-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- FNXSYBOHALPRHV-ONGXEEELSA-N Gly-Val-Lys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN FNXSYBOHALPRHV-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- VHOLZZKNEBBHTH-YUMQZZPRSA-N His-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 VHOLZZKNEBBHTH-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- ZVKDCQVQTGYBQT-LSJOCFKGSA-N His-Pro-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZVKDCQVQTGYBQT-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- 101000798222 Homo sapiens Antizyme inhibitor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- MKWSZEHGHSLNPF-NAKRPEOUSA-N Ile-Ala-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N MKWSZEHGHSLNPF-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- RGSOCXHDOPQREB-ZPFDUUQYSA-N Ile-Asp-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)N RGSOCXHDOPQREB-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 101100123255 Komagataeibacter xylinus aceC gene Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241000186610 Lactobacillus sp. Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- ZFNLIDNJUWNIJL-WDCWCFNPSA-N Leu-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ZFNLIDNJUWNIJL-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N Leu-Leu-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)N1CCCC1C(O)=O XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZRHDPZAAWLXXIR-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZRHDPZAAWLXXIR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- DBMLDOWSVHMQQN-XGEHTFHBSA-N Met-Ser-Thr Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DBMLDOWSVHMQQN-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- 101100354186 Mycoplasma capricolum subsp. capricolum (strain California kid / ATCC 27343 / NCTC 10154) ptcA gene Proteins 0.000 description 1
- AUEJLPRZGVVDNU-UHFFFAOYSA-N N-L-tyrosyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 AUEJLPRZGVVDNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 102000009299 Peptidase M20 Human genes 0.000 description 1
- 108050000132 Peptidase M20 Proteins 0.000 description 1
- 108010049977 Peptide Elongation Factor Tu Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHAQGFGGJSLLHE-BQBZGAKWSA-N Pro-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 SHAQGFGGJSLLHE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 101100134871 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) aceE gene Proteins 0.000 description 1
- 101100406344 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) aceF gene Proteins 0.000 description 1
- 244000000231 Sesamum indicum Species 0.000 description 1
- 235000003434 Sesamum indicum Nutrition 0.000 description 1
- 241000607758 Shigella sp. Species 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- JHBHMCMKSPXRHV-NUMRIWBASA-N Thr-Asn-Gln Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N)O JHBHMCMKSPXRHV-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 101150094017 aceA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150036393 aceB gene Proteins 0.000 description 1
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010070944 alanylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940064734 aminobenzoate Drugs 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- SCJNCDSAIRBRIA-DOFZRALJSA-N arachidonyl-2'-chloroethylamide Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(=O)NCCCl SCJNCDSAIRBRIA-DOFZRALJSA-N 0.000 description 1
- 101150056313 argF gene Proteins 0.000 description 1
- JGGLZQUGOKVDGS-VYTIMWRQSA-N aspartate semialdehyde Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC(=O)C)CO[C@H](CO)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(C)=O)[C@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]3[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O3)O[C@@H]3[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O3)O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O3)O)[C@@H](O)[C@H](CO[C@@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]4[C@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O4)O)[C@@H](O)[C@H](CO)O3)O)O2)O)[C@H](CO)O1 JGGLZQUGOKVDGS-VYTIMWRQSA-N 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- 101150070136 axeA gene Proteins 0.000 description 1
- 150000007514 bases Chemical class 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 1
- ZIWNLPKLQFDFEU-FJXQXJEOSA-N calcium;3-[[(2r)-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound [Ca].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O ZIWNLPKLQFDFEU-FJXQXJEOSA-N 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000481 chemical toxicant Toxicity 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- WXTNYUCRVLGGNF-ZETCQYMHSA-N diacetyl (2s)-2-aminopentanedioate Chemical compound CC(=O)OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)OC(C)=O WXTNYUCRVLGGNF-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 229940014144 folate Drugs 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 108010050322 glutamate acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101150077981 groEL gene Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 1
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910017464 nitrogen compound Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002830 nitrogen compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000003348 petrochemical agent Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920001522 polyglycol ester Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N propylene Natural products CC=C QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004805 propylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 108020001775 protein parts Proteins 0.000 description 1
- 229960001327 pyridoxal phosphate Drugs 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- IAHFWCOBPZCAEA-UHFFFAOYSA-N succinonitrile Chemical compound N#CCCC#N IAHFWCOBPZCAEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/001—Amines; Imines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/15—Corynebacterium
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Mevcut buluş, NCgl0101'in aktivitesinin, putresin üretmek üzere modifiye edilen Corynebacterium cinsi bir mikroorganizmada zayıflatıldığı durumda, yüksek verimde geliştirilmiş putresin üretme yeteneğine sahip bir rekombinant mikroorganizma ve bunu kullanarak putresin üretmeye yönelik bir yöntem ile ilgilidir.
Description
TARIFNAME
GELISTIRILMIS PUTRESIN ÜRETKENLIGINE SAHIP
REKOMBINANT MIKROORGANIZMA VE BUNU KULLANARAK
PUTRESIN ÜRETMEYE YÖNELIK YÖNTEM
Gelistirilmis bir putresin üretme yetenegine sahip rekombinant mikroorganizmalar
ve bunu kullanarak putresin üretmeye yönelik bir yöntem ile ilgilidir.
Putresin (veya 1,4-bütandiamin), spermidin ve spermin gibi bir poliainin çesididir
ve gram-negatif bakterilerde ve mantarlarda bulunur. Putresinin çesitli türlerdeki
genis bir yogunluk yelpazesinde mevcut olmasi nedeniyle, mikroorganizmalarin
metabolizinasinda önemli bir rol oynamasi beklenir. Putresin genellikle,
propilenden akrilonitril ve süksinonitril yoluyla kimyasal sentez ile üretilir.
Kimyasal sentez, baslangiç materyalleri olarak petrokimyasallardan türetilen
maddeleri kullanir ve toksik kimyasallari kullanir ve dolayisiyla çevre dostu
degildir ve yag bosalmasi problemine sahiptir.
Bu sorunlari çözmek amaciyla, daha çevre dostu olan ve enerji tüketimini azaltan,
mikroorganizmalar kullanilarak putresin biyosentezine yönelik bir yöntemin
gelistirilmesi üzerinde çok sayida arastirma mevcuttur. Mevcut bilgiye göre
putresinin, iki yol ile biyosentezi yapilabilir. Bir yolda omitin, glutamattan üretilir
ve omitin, putresin sentezlemek üzere karboksilden ayrilir. Diger yolda arginin,
ornitinden sentezlenir ve agmatin, argininden üretilir ve ardindan putresin,
agmatinden sentezlenir. Ek olarak, putresinin bilinen sentetik yollarina dahil
edilen enzimler ile dönüstürülen bir hedef mikroorganizma kullanilarak putresin
sentezine yönelik diger yöntemler mevcuttur. Örnegin WOO9/ 125924, putresinin
bir öncülü olan ornitinin, arginine dönüstürüldügü yol devre disi birakilarak E.
01537-P0028
Coli 'deki putresinin ayristirilmasi ve kullanimina dahil edilen yol devre disi
birakilarak ve omitinin biyosentetik yolu gelistirilerek, yüksek verimlilik ile
putresin üretilmesine yönelik bir yöntemi açiklar. 2010 yilinda yayinlanan bir
makale, omitini putresine dönüstüren proteini gelistirerek ve putresin üretemeyen
Corynebacterium suslarina ekleyerek yüksek yogunlukta putresin üretimine
yönelik bir yöntemi açiklar. Ek olarak, E.coli türevli arginin dekarboksilazi ve
agmatinazi, suslara ekleyerek, argininden putresin üretilmesine yönelik bir
yöntemi açiklar. Bu açidan omitin, arginin yolundan 50 kat daha fazla miktarda
2010).
Bu altyapida mevcut bulusçular, putresinin NCglOlOl proteininin aktivitesi
zayiflatilarak veya ortadan kaldirilarak, dolayisiyla mevcut bulus tamamlanarak,
Corynebacterium cinsinin bir mikroorganizmasinda yüksek verimde
üretilebildigini saptamistir.
Mevcut bulusun bir amaci, bunun endojen aktivitesine nazaran, zayiflatilmis
NCg10101 aktivitesine sahip olmak üzere modifiye edilen, yüksek verimde
putresin üretebilen Corynebacterium cinsinin bir rekombinant
mikroorganizmasinin saglanmasidir.
Mevcut bulusun diger bir amaci, mikroorganizma kullanarak putresin üretimine
yönelik bir yöntemin saglanmasidir.
01537-P0028
Mevcut bulusa ait gelistirilinis bir putresin üretebiline yetenegine sahip olan
Corynebacterium cinsinin mikroorganizmasinin, putresin üretimine yönelik olarak
kullanilmasi durumunda, bunun endojen aktivitesine nazaran NCglOlOl
aktivitesini zayiflatmak üzere modifiye edilir ve bu nedenle, yüksek verimde
putresin üretebilir. Dolayisiyla mikroorganizma, daha etkin putresin üretimine
yönelik olarak yaygin biçimde kullanilabilir.
SEKIL l, Coryiiebacterium glutamicum ATCC 13032 dogal susunun
kromozomu üzerindeki NCglOlOO, NCglOlOl, NCg10102, NCglOlO3 ve
NCg10104,ü kodlayan genlerin bagil pozisyonlarini gösteren sematik bir
diyagramdir.
SEKIL 2, mevcut bulusta hazirlanan rekombinant suslar arasindaki
gelisme karsilastirmasinin test sonuçlarini temsil eder, burada 1, 2, 3, 4, 5
karistirilarak hazirlanan suslardir.
Yukaridaki amaçlari saglamak üzere bir açida mevcut bulus, putresin üretme
yetenegine sahip olan Corjynebacteri'um glutamicumhn bir rekombinant
mikroorganizmasini saglar, burada mikroorganizma, SEQ ID NO. 17 veya SEQ
bunun ifadesi, söz konusu proteinin aktivitesini zayiflatmak veya ortadan
kaldirmak ve söz konusu proteinin aktivitesine nazaran putresin üretimini ve ayni
olan ancak modifiye edilmemis olan mikroorganizma suslarinda putresin
01537-P0028
üretimini artirmak üzere modifiye edilecegi sekilde modifiye edilmistir, burada
proteinin aktivitesi, 1) proteini kodlayan bir polinükleotidin kismen veya tamamen
çikarilmasi, 2) polinükleotit ifadesinin bir azaltimi, 3) proteinin aktivitesini
zayiflatmak üzere kromozom üzerindeki polinükleotit diziliminin bir
modifikasyonu veya 4) bunlarin bir kombinasyonu yoluyla zayiflatilir.
Burada kullanildigi üzere "NCglOlOl” ifadesi, Corynebacterium glutamicum
içinde ifade edilen ve islevi henüz tamamen bilinmeyen bir metal-bagimli enzimin
aktivitesini gösteren bir protein anlamina gelir. Bu, peptidaz M20 familyasi veya
aminobenzoil-glutamat kullanma proteininin (AbgB) bir metal baglayici alanini
içerir. E.coli7nin AbgB”si, aminobenzoil-glutamati aminobenzoata ve glutamata
hidrolizlemek üzere AbgA ile aminobenzoil-glutamat hidrolazi olusturur.
Aminobenzoatin, folat sentezine yönelik bir öncül olarak kullanildigi bilinir,
ancak bunun putresin verimliligi ile iliskisi, bilinmemektedir.
Mevcut bulusun NCglOlOl proteini, SEQ ID NO: 17 veya SEQ ID NO: 19 ile
temsil edilen amino asit dizilimini içerebilir. Ancak mikrobiyal türlere veya
suslara bagli olarak proteinin amino asit diziliminde fark olabilmesi nedeniyle, bu
durum bununla sinirli degildir. Diger bir deyisle proteinin aktivitesini zayiflatarak
putresin üretme yetenegini artirmayi sagladigi sürece, SEQ ID NO: 17 veya SEQ
lD NO: 19 ile temsil edilen amino asit diziliminin bir veya daha fazla
konumundaki bir veya çok sayida amino asidin sübstitüe edilmesi, çikarilmasi,
ilave edilmesi veya eklenmesini içeren amino asit dizilimine sahip bir inutant
protein veya yapay varyant olabilir. Burada “çok sayida”, proteinin amino asit
kalintilarinin üç boyutlu yapisindaki lokasyon veya çeside bagli olarak degisebilir,
ancak spesifik olarak 2 ila 20, spesifik olarak 2 ila 10 ve daha spesifik olarak 2 ila
anlamina gelir. Ek olarak amino asidin sübstitüe edilmesi, çikarilmasi, ilave
edilmesi, eklenmesi veya evrilmesi, mikroorganizmanin her biri veya türlerindeki
farkliliga bagli olarak yapay varyantlar veya dogal mutasyon ile ortaya çikanlari
01537-P0028
Mevcut bulusun amino asit dizilimini kodlayan polinükleotit, NCglOlOl proteini
ile benzer aktiviteye sahip oldugu sürece, SEQ 1D NO: 17 veya SEQ ID NO: 19
veya bununla %80 veya daha fazla, spesifik olarak %90 veya daha fazla, daha
spesifik olarak %95 veya daha fazla ve özellikle spesifik olarak %97 veya daha
fazla homoloji ile temsil edilen amino asit dizilimini kodlayan polinükleotit
dizilimini içerebilir. En spesifik olarak bu, SEQ ID NO: 16 veya SEQ ID NO: 18
ile temsil edilen polinükleotit dizilimi olabilir.
Özdeslik ve benzerlik gibi parametreleri hesaplamak üzere BLAST 2.0
kullanilarak teknikte uzman kisiler tarafindan iyi bilinen yöntem ile belirlenebilir.
Ek olarak inevcut bulusun NCglOlOl ,ini kodlayan polinükleotit dizilimi, SEQ ID.
NO: 16,nin polinükleotidi veya “sert kosullar” altinda bundan hazirlanan prob ile
melezlestirilebilir ve normal olarak islev gören NCglOlOl proteinini kodlayan
modifiye edilmis bir polinükleotit dizilimi olabilir. Burada kullanildigi üzere “sert
kosullar”, polinükleotit arasinda spesifik melezlestirrneye olanak saglayan
kosullara refere eder ve örnegin Molecular Cloning (A Laboratory Manual, J.
Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold
Spring Harbor, New York, 1989) veya Current Protocols in Molecular Biology
(F.M. Ausubel vd., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York) içinde spesifik
polivinilpirrolidon, %002 bovin serum albumin, , %05
SDS, 2 mM EDTA) melezlestirme tamponunda gerçeklestirilir. SSC, pH 7
degerinde 0.15 M sodyum klorid/0.15 M sodyum sitrattir. Melezlestirme
sonrasinda DNA°nin transfer edildigi membran, oda sicakliginda 2 X SSC ile
yikanir ve ardindan 68°C sicaklikta, 0.1 ila 0.5 X SSC/0.1 X SDS ile yeniden
yikanir.
Mevcut bulusta NCglOlOl proteininin aktivitesi, 1) proteini kodlayan bir
polinükleotidin kismen veya tamamen çikarilmasi, 2) polinükleotidin ifadesini
01537-P0028
azaltmak üzere bir ifade düzenleyici dizilimin modifiye edilmesi, 3) kromozom
üzerindeki polinükleotit diziliminin bir modifikasyonu veya 4) bunlarin bir
kombinasyonu yoluyla zayiflatilabilir.
Yukarida proteini kodlayan polinükleotidin kismen veya tamamen çikarilmasi,
kromozomdaki bir endojen hedef proteini bir isaretleyici gene kodlayan
polinükleotidi veya kismi nükleotit dizilimi çikarilmis olan bir polinükleotidin,
kromozomal gen eklememe yönelik bir vektör ile sübstitüe edilmesi yoluyla
gerçeklestirilebilir. “Kismi” çikarmanin uzunlugu, polinükleotidin çesidine
baglidir, ancak spesifik olarak 2bp ila 300bp, daha spesifik olarak 2bp ila lOObp
ve daha spesifik olarak lbp ila Sbp'dir.
Ayrica polinükleotit ifadesini azaltmak amaciyla bir ifade düzenleyici dizilim,
nükleotit diziliminin çikarilmasi, ilavesi, konservatif veya konservatif olmayan
sübstitüe edilmesi veya ifade düzenleyici dizilimin aktivitesini daha fazla
zayiflatmak üzere bunlarin bir kombinasyonu yoluyla ifade düzenleyici
dizilimdeki mutasyonlari indükleyerek veya ifade düzenleyici dizilimi, daha zayif
aktiviteye sahip olan dizilim ile degistirerek modifiye edilebilir. Ifade düzenleyici
dizilim, transkripsiyon baslaticiyi kodlayan bir dizilimi, isletici dizilimi,
ribozomal baglayici bölgeyi ve transkripsiyon ve translasyonun sonlandirilmasini
kontrol eden dizilimi içerebilir.
Ek olarak proteinin aktivitesini zayiflatmak üzere kromozom üzerindeki
polinükleotit dizilimi, nükleotit diziliininin çikarilmasi, ilavesi, konservatif veya
konservatif olmayan sübstitüe edilmesi veya dizilimin aktivitesini daha fazla
zayiflatmak üzere bunlarin bir kombinasyonu yoluyla dizilimdeki mutasyonlari
indükleyerek veya polinükleotit dizilimini daha zayif aktiviteye sahip olan
modifiye edilmis dizilim ile degistirerek modifiye edilebilir.
Bu sirada mevcut bulusa ait putresin üretmek üzere gelistirilmis yetenege sahip
olan Corynebacterium cinsinin bir mikroorganizmasi, omitinden arginin
01537-P0028
sentezlenmesine dahil edilen ornitin karbamoiltransferaz (ArgF) aktivitesini
ve/veya bunun endojen aktivitesine nazaran, glutamat çikarilmasina dahil edilen
proteinin (NCg11221) aktivitesini zayiflatmak üzere ilaveten modifiye edilebilir.
Ek olarak Corynebacterium cinsinin mikroorganizmasi, ornitin dekarboksilaz
(ODC) aktivitesi ilaveten eklenerek modifiye edilebilir. Glutamati asetil glutamata
çevirmek üzere asetil glutamat sentazin aktivitesini, asetil ornitini ornitine
çevirmek üzere omitin asetiltransferazin (ArgJ) aktivitesi, setil glutamati asetil
glutamil fosfata çevirmek üzere asetil glutamat kinazin (ArgB) aktivitesini, asetil
glutamil fosfati, asetil glutamat semialdehide çevirmek üzere asetil gamma
glutamil fosfat redüktazin (ArgC) aktivitesini ve/veya asetil glutamat semialdehidi
asetil ornitine çevirmek üzere asetil omitin amino transferaz aktivitesini, endojen
aktivitelerine nazaran, gelistirmek ve dolayisiyla bir putresin öncülü olan ornitinin
biyosentetik yolunu gelistirmek üzere modifiye edilebilir (Sakanyan V et al.,
Bu durumda ArgF, NCg11221, ODC, ArgC, ArgJ, ArgB ve ArgD, spesifik olarak
temsil edilen amino asit dizilimlerine veya bununla %80 veya daha fazla, spesifik
olarak %90 veya daha fazla, daha spesifik olarak %95 veya daha fazla ve en
spesifik olarak %97 veya daha fazla homolojiye sahip olan amino asit dizilimine
sahip olabilir.
Burada kullanildigi üzere “ornitin dekarboksilaz (ODC)” ifadesi, omitin
kullanarak putresin üreten bir enzime refere eder ve ODC, bir koenzim olarak
piridoksalfosfat (Piridoksal 5'-fosfat, PLP) gerektirir. ODC, çogu Gram-negatif
bakteride bulunur ve Gram-pozitif bakterilerden Lactobacillus gibi bazi bagirsak
bakterilerinde bulunabilir. E. colz', ODC°yi kodlayan iki çesit gene sahiptir,
bunlardan biri olan speC, belirli yogunlukta sürekli olarak ifade edilir ve digeri
olan speF, spesifik kosullar altinda (belirli yogunluklardan daha yüksek olarak
omitinin bulunmasi ve düsük pH) ifade edilir. Türlere bagli olarak, E. coli' gibi
bazi türler, iki çesit ODC”ye sahiptir ve digerleri yalnizca bir çeside sahiptir.
01537-P0028
Escherichi'a Sp., Shigella Sp., Citrobacter sp., Salmonella sp. ve Enterobacter sp.
gibi türler, iki çesit ODC”ye (speC ve speF) sahiptir ve Yersi'm'a sp., Klebsi'ella
sp., Erwim'a sp. Suslari, bir çesit ODC°ye (speC) sahiptir. Lactobacillus
durumunda ODC, bir gen çesidi (speF) ile ifade edilir ve düsük pH veya çok
sayida ornitin ve histidin kosullarinda ifade edilmek üzere indüklendigi bilinir.
ODC aktivitesi, çesitli türlerden türetilen ODC,yi kodlayan genler kullanilarak
mevcut bulusun Corynebacterium cinsi rekombinant mikroorganizmasina
uygulanabilir. ODC,yi kodlayan polinükleotit, bunlarla sinirli olmaksizin, SEQ ID
NO: 22 ile temsil edilen amino asit dizilimi ve bununla %70 veya daha fazla,
spesifik olarak %80 veya daha fazla, daha spesifik olarak %90 veya daha fazla
homolojiye sahip olan amino asit diziliminden olusan proteini kodlayan
polinükleotidi içerebilir.
Ek olarak ornitin dekarboksilaz (ODC) aktivitesinin mikroorganizmalara
uygulanmasi, teknikte iyi bilinen çesitli yöntemler yoluyla, örnegin ODC”yi
kodlayan bir nükleotit dizilimini içeren polinükleotidin kromozoma ilavesi
yöntemi, vektör sistemi uygulanarak mikroorganizmalara polinükleotidin
eklenmesi yöntemi, modifiye edilen veya gelistirilmis aktiviteye sahip olan
transkripsiyon baslaticinin, ODC”yi kodlayan nükleotit diziliminin üst bölgesine
eklenmesi yöntemi ve ODC,yi kodlayan nükleotit dizilimine mutasyonun
eklenmesi yöntemi yoluyla gerçeklestirilebilir. Daha spesifik olarak, ODC,yi
kodlayan nükleotit diziliminin eklenmesi durumunda bilinen CJ7 transkripsiyon
baslatici, bunun ifadesini kontrol etmek üzere bir transkripsiyon baslatici olarak
kullanilabilir.
Ek olarak ArgC, ArgJ, ArgB ve ArgD”nin aktivitesinin gelistirilmesi, l) enzimi
kodlayan polinükleotidin kopya sayinin artirilmasi, 2) polinükleotit ifadesini
artirmak üzere ifade düzenleyici dizilimin bir modifikasyonu, 3) enziinin
aktivitesini gelistirmek üzere kromozom üzerindeki enzimi kodlayan polinükleotit
01537-P0028
diziliminin bir modifikasyonu veya 4) bunlarin bir kombinasyonu yoluyla
saglanabilir.
l) yönteminde enzimi kodlayan polinükleotidin kopya sayisinin artirilmasi,
polinükleotidi uygulanabilir bir sekilde vektöre baglayarak veya bunu konak
hücrenin kromozomuna ilave ederek saglanabilir. Daha spesifik olarak konak
hücrenin polinükleotidinin kopya sayisi, mevcut bulusun enzimini kodlayan
polinükleotidin, uygulanabilir bir biçimde baglandigi durumda, bagimsiz bir
sekilde islev görebilen ve kopya yapabilen bir vektörün uygulanmasi yoluyla veya
polinükleotidin uygulanabilir bir biçimde baglandigi durumda, konak hücrenin
kromozomuna polinükleotidi ilave edebilen vektörün uygulanmasi yoluyla
artirilabilir.
Burada kullanildigi üzere “vektör” terimi, uygun konaktaki hedef proteini ifade
etmek üzere, uygun düzenleyici dizilime uygulanabilir bir sekilde bagli olan hedef
proteini kodlayan polinükleotidin nükleotit dizilimini içeren DNA yapimina refere
eder. Düzenleyici dizilim, transkripsiyonu baslatabilen baslaticiyi, transkripsiyonu
kontrol etmek üzere herhangi bir isletici dizilimi, uygun mRNA ribozom baglayici
bölgeyi kodlama amaçli dizilimi ve transkripsiyon ve translasyonun
sonlandirilmasini kontrol etme amaçli dizilimi içerir. Vektör, uygun bir konaga
verilebilir ve akabinde, konak genomundan bagimsiz olarak islev görebilir veya
kopyalanabilir ve genomun kendisine entegre edilebilir.
Mevcut bulusta teknikte bilinen herhangi bir vektör, konakta kopyalandigi sürece,
herhangi bir spesifik sinirlama olmaksizin kullanilabilir. Yaygin olarak kullanilan
vektörlerin örnekleri, plazmit, kozmit, virüs ve dogal durumunda veya
rekombinant durumunda bakteriyofajdir. Örnegin pWE15, M13, ÄMBL3,
ÄMBL4, ÄIXII, ÄASHII, kAPII, MIO, ktll, Char0n4A ve Char0n21A, bir faj
vektörü veya kozmit vektörü olarak kullanilabilir ve pBR sisteini, pUC sistemi,
pBluescriptII sistemi, pGEM sistemi, pTZ sistemi, pCL sistemi ve pET sistemi,
bir plazmit vektörü olarak kullanilabilir. Mevcut bulusta kullanilabilen vektör
01537-P0028
özellikle sinirli degildir ve bilinen ekspresyon vektörleri kullanilabilir. Spesifik
pCClBAC vektörleri kullanilabilir. Daha spesifik olarak pACYC177, pCL,
pCClBAC vektörleri kullanilabilir.
Ek olarak hedef proteini kodlayan polinükleotidi, bir konak hücrenin
kromozomuna ilave edebilen vektör, örnegin spesifik olarak bir mekik vektörü, E.
coli' ve Coiyneform bakterilerinde kendi kendine kopyalanabilen pECCG olabilir, ancak bunlarla sinirli degildir.
Ek olarak kromozomdaki hedef proteini kodlayan polinükleotit, kromozomal gen
ilavesine yönelik bir vektör kullanilarak, yeni bir polinükleotit ile degistirilebilir.
Polinükleotidin kromozoma eklenmesi, teknikte iyi bilinen bir yöntem ile, örnegin
homolog rekombinasyon yoluyla saglanabilir. Mevcut bulusun vektörünün,
homolog bir rekombinasyonu indükleyerek kromozoma ilave edilebilmesi
nedeniyle isaretleyicinin seçimi, kromozoma basarili bir gen ilavesini dogrulamak
üzere ilaveten dahil edilebilir. Bir seçim isaretleyici, vektör ile dönüstürülen
hücrelerin elenmesine, diger bir deyisle hedef polinükleotidin ilave edilip
edilmediginin belirlenmesine yöneliktir. Ilaca direnç, oksotrofi, toksik ajanlara
direnç veya yüzey proteinlerinin ifadesi gibi seçilebilen fenotipleri saglayan
isaretleyiciler kullanilabilir. Seçici bir ajana tabi tutulan bir çevrede, yalnizca
seçme isaretleyicisini ifade eden hücreler hayatta kalabilir veya hücreler, farkli bir
fenotip gösterir ve bu nedenle basarili bir biçimde dönüstürülen hücreler, bu
yöntem yoluyla seçilebilir.
Burada kullanildigi üzere “dönüsüm” ifadesi, proteinin hücrede ifade edilebilecegi
sekilde, hedef proteini kodlayan bir polinükleotidi içeren vektörün konak hücreye
eklenmesine refere eder. Dönüstürülen polinükleotit, konak hücrenin
kromozomuna takilmasi veya kromozomun disinda yer almasi göz önünde
bulundurulmaksizin, lokasyondan bagimsiz olarak konak hücrede ifade edilebilen
hedef proteinleri kodlayan bütün polinükleotitleri içerir. Ek olarak polinükleotit,
01537-P0028
hedef proteini kodlayan DNA ve RNA”y1 içerir. Polinükleotit, konak hücreye
eklendigi ve ifade edildigi sürece, herhangi bir biçimde olabilir. Örnegin
polinükleotit, kendini ifade için gereken bütün elemanlari içeren, gen yapiini olan
bir ifade kaseti biçimindeki bir konak hücreye eklenebilir. Ifade kaseti tipik olarak
polinükleotide uygulanabilir bir biçimde bagli olan bir baslatici, transkripsiyon
sonlandirma sinyali, ribozomal baglayici alan ve translasyon sonlandinna
sinyalini içerir. Ifade kaseti kendi kendini kopyalayabilen ekspresyon vektörü
biçiminde olabilir. Ek olarak polinükleotit, kendi formunda bir konak hücreye
eklenebilir ve konak hücrenin ifadesi için gereken dizilimlere uygulanabilir bir
biçimde baglanabilir.
Burada kullanildigi üzere “uygulanabilir bir biçimde bagli” ifadesi, hedef proteini
kodlayan polinükleotidin transkripsiyonunu baslatan ve buna aracilik eden
baslatici dizilim ile polinükleotit arasindaki islevsel baglantiya refere eder.
Buna ek olarak 2) mevcut bulustaki polinükleotidin ifadesini artirmak üzere ifade
düzenleyici dizilimin modifikasyonunu yöntemi, nükleotit diziliminin çikarilmasi,
ilavesi, konservatif veya konservatif olmayan sübstitüe edilmesi veya bunlarin bir
kombinasyonu yoluyla, dizilimin mutasyonunu indükleyerek veya gelistirilmis
aktiviteye sahip olan nükleotit dizilimi tarafindan sübstitüe etme yoluyla
gerçeklestirilebilir. Ifade düzenleyici dizilim, transkripsiyon baslaticiyi, isletici
dizilimi, ribozomal baglayici bölgeyi kodlayan dizilimi ve transkripsiyon ve
translasyonun sonlandirilmasini kontrol etme amaçli dizilimi içerir.
Güçlü bir heterolog baslatici, orijinal baslaticilar yerine, polinükleotidin ifade
biriminin üstüne baglanabilir. Güçlü bir baslaticinin bir örnegi, pcj7 baslatici,
lysCPl baslatici, EF-Tu baslatici, groEL baslatici, aceA veya aceB baslatici ve
benzerleridir ve daha spesifik olarak Corynebacteri'um 'dan türetilen pcj7 baslatici
veya lysCPl baslatici, enzimi kodlayan polinükleotidin ifadesini gelistirmek üzere
uygulanabilir bir biçimde baglanir. Burada aspartat kinaz ve aspartat semialdehid
dehidrogenazi kodlayan polinükleotidin baslatici bölgesinin nükleotit diziliminin
01537-P0028
sübstitüe edilmesi yoluyla gelistirilmis bir baslatici olan lysCPl baslatici, ilgili
enzimin aktivitesini aspartat kinaz geninin ifadesinin gelistirilmesi yoluyla dogal
susa nazaran 5 kat artiracak kadar güçlüdür (Uluslararasi Patent Yayin No. 2009-
096689). Buna ek olarak pcj7 baslaticinin, Corynebacterium
ammoniagenes ve Escheri'chia içinde ifade edildigi ve güçlü bir baslatici
aktiviteye sahip oldugu belirlenmistir ve bu, yüksek yogunlugun yani sira
Corynebacterium glutami'cum içinde ifade edilebilir (Kore Patenti No. 0620092).
Buna ek olarak 3) kromozom üzerindeki polinükleotit diziliminin
modifikasyonunu yöntemi, dizilimin aktivitesini artirmak amaciyla, nükleotit
diziliminin çikarilmasi, ilavesi, konservatif veya konservatif olmayan sübstitüe
edilmesi veya bunlarin bir kombinasyonu yoluyla veya gelistirilmis aktiviteye
sahip olan nükleotit dizilimi tarafindan sübstitüe etme yoluyla gerçeklestirilebilir,
ancak spesifik olarak bunlarla sinirli degildir.
Putresin üretme yetenegine sahip olan bir mikroorganizma olan, mevcut bulustaki
mikroorganizma, prokaryot mikroorganizmayi içerir, burada SEQ ID NO: 17 veya
SEQ ID NO: 19 ile temsil edilen amino asit dizilimini içeren protein ifade edilir
ve örnegin Escheri'chia sp., Shi'gella sp., Citrobacter sp.) Salmonella sp.,
Enterobacter sp., Yersi'nia Sp., Klebsi'ella sp., Erwz'm'a Sp., Corynebacterium Sp.,
Brevibacterz'um sp., Lactobacillus sp., Sllenomanas sp. ve Vibri'o sp.
Mikroorganizmasi olabilir
Mevcut bulustaki mikroorganizma spesifik olarak, Corynebacterium cinsi
mikroorganizmadir ve daha spesifik olarak Corynebacteri'um glutamicum°a aittir.
Mevcut bulusun bir düzenlemesinde, gelistirilmis putresin-biyosentez yolu
araciligiyla yüksek bir yogunlukta putresin üretme yetenegine sahip olan
Corynebacterium cinsi mikroorganizma modifiye edilmistir. Spesifik olarak
putresin-üreten sus KCCM11138P, asiri putresin üreten sustur, burada ornitin
01537-P0028
biriktirme amaciyla ornitin karbamoiltransferaz (ArgF) kodlayan gen ve
intraselüler glutamati artirmak amaciyla glutamat çikariciyi (NCgllZZl) kodlayan
gen, ATCC13032 suslarindan çikarilir, ornitin dekarboksilaz (speC) kodlayan gen
eklenir ve ornitin biyosentez genlerinin (argCJBD) ifade seviyesi artirilir. Bu
nedenle bulusa göre mikroorganizmada, ornitin dekarboksilazin (SpeC) aktivitesi
buraya ayrica uygulanabilir.
Mevcut bulusun diger bir düzenlemesi olan Coiynebacterium
glutami'cum ATCCl3869-bazli putresin üreten sus DABlZ-a modifiye edilmistir.
putresin üreten sus olan KCCM11138P ile ayni genotipe dayandirilmistir. Spesifik
olarak putresin üreten sus DABlZ-a, American Type Culture Collection
(ATCCYdan elde edilen ATCC13869 susundandir, burada ornitin
karbamoiltransferazi (ArgF) kodlayan gen ve glutamati disariya çikarmak üzere
protein NCg11221”i kodlayan gen çikarilir, E. C0!i'”den türetilen ornitin
dekarboksilazi (ODC) kodlayan gen (speC) eklenir ve ornitin biyosentez gen
operonunun (argCJ BD) baslaticisi, gelistirilmis baslatici ile degistirilir.
Mevcut bulusun bir düzenlemesine göre Corynebacterium cinsi (KCCM11138P)
bir mikroorganizma, ornitin karbomoil transferaz (ArgF) kodlayan gen ve disari
glutainat çikarilmasina dahil edilen, glutamat çikariciyi (NCgllZZl) kodlayan
genin çikarilmasi, glutamattan ornitin sentezlenmesine dahil edilen bir enzimi
kodlayan ArgCJBD gen kümesinin kendi baslaticisinin yer yer degistirmesi ve
ornitin dekarboksilaz (ODC) kodlayan genin (speC) Corynebacterium glutamicum
ATCC13032 susundaki kromozoma eklenmesi yoluyla hazirlanarak putresin
üretme yetenegine sahip olabilir. KCCMlll38P°ye dayanarak, yüksek
yogunluklu putresin içeren bir ortamda iyi bir sekilde gelisen bir klon (A15)
seçilmistir ve seçilen A153in, NCglOlOO, NCglOlOl, NCglOlOZ, NCg10103 ve
NCglOlO4 (Örnek 1) kodlayan genleri içerdigi dogrulanmistir. Buna ek olarak
mikroorganizma, bes çesit gen arasindan NCg10101”i kodlayan gen nedeniyle,
yüksek yogunluklu putresin içeren ortamda gelisir (Örnek 2). NCglOlOFi
01537-P0028
kodlayan genin karakteri ile ilgili olarak, NCg10101°i kodlayan genin asiri ifade
edildigi (Örnek 3) bir susta putresin üretiminin azaltildigi ve NCglOlOPi
kodlayan genin çikarildigi (Örnek 4) bir susta putresin üretiminin artirildigi
dogrulanmistir.
Buna göre mevcut bulusçular, putresin üreten sus KCCM lll38P,deki NCglOlOl
genini çikararak hazirlanan, gelistirilmis bir putresin üretme yetenegine sahip olan
Corynebacterium glutamicum susunu, Corynebacterium glutamicum CCOl-0244
olarak adlandinnistir ve Korean Culture Center of Microorganisins”de (buradan
itibaren “KCCM” olarak kisaltilmistir) Erisim No. KCCM11241P ile 26 Aralik
2011 tarihinde depolanmistir.
Mevcut bulusun, yukaridaki ainaçlari gerçeklestirmek üzere diger bir açisinda
mevcut bulus, bir hücre kültürü besiyeri üretmek üzere, putresin üretme
yetenegine sahip olan Corynebacterium glutamicum7un modifiye edilen bir
mikroorganizmasinin kültürlenmesini içerir, burada mikroorganizma, SEQ ID
NO. 17 veya SEQ ID NO. 19 ile temsil edilen bir amino asit dizilimi veya bunun
bir ifadesine sahip olan bir protein, söz konusu proteinin aktivitesini zayiflatmak
veya çikarmak ve söz konusu proteinin aktivitesine nazaran putresin üretimini ve
ayni ancak modifiye edilmemis mikroorganizma susundaki putresinin üretimini
artirmak amaciyla mikroorganizmada modifiye edilecek sekilde modifiye
edilmistir,
burada proteinin aktivitesi, l) proteini kodlayan bir polinükleotidin kisinen veya
tamamen çikarilmasi, 2) polinükleotit ifadesinin bir azaltimi, 3) proteinin
aktivitesini zayiflatmak üzere kromozom üzerindeki polinükleotit diziliminin bir
modifikasyonu veya 4) bunlarin bir kombinasyonu yoluyla zayiflatilir; ayrica elde
edilen hücre kültürü besiyerinden putresinin izole edilmesini içerir.
Mevcut bulustaki kültürleme prosesi, uygun ortamda ve teknikte bilinen
kültürleine kosullari altinda gerçeklestirilebilir. Teknikte uzman kisiler, seçilen
suslara bagli olarak kültürleme prosesini kolay bir sekilde ayarlayabilir ve
01537-P0028
kullanabilir. Kültürleme prosesinin bir örnegi kesikli, sürekli ve beslemeli-kesikli
tür kültürleri içerir, ancak bunlar ile sinirli degildir. Kültür ortami, spesifik bir
susun gerekliliklerini uygun bir biçimde karsilamak zorunda olabilir.
Kültür ortami, spesifik bir susun gerekliliklerini uygun bir biçimde karsilamak
zorunda olabilir. Çesitli mikroorganizmalara yönelik kültür ortamlari açiklanir
(örnegin "Manual of Methods for General Bacteriology" from American Society
for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)). Ortamda bir karbon kaynagi
olarak, seker ve karbonhidratlar (örnegin, glikoz, sükroz, laktoz, früktoz, maltoz,
melas, nisasta ve selüloz), tereyagi ve yag (ömegin, soya fasulyesi yagi, ayçiçegi
tohumu yagi, yerfistigi yagi ve hindistancevizi yagi), yag asidi (örnegin, palmitik
asit, stearik asit ve linoleik asit), alkol (örnegin, gliserol ve etanol) ve organik asit
(örnegin asetik asit) ve benzerleri kullanilabilir. Bu maddeler, tek basina veya bir
karisim olarak kullanilabilir. Nitrojen kaynagi olarak, nitrojen içeren organik
bilesik (örnegin pepton, maya özütü, sigir eti özütü, malt özütü, misir maserasyon
sivisi, soya küspesi tozu ve üre) veya inorganik bilesik (örnegin, amonyum sülfat,
amonyum klorit, amonyum fosfat, amonyum karbonat ve amonyum nitrat)
kullanilabilir ve bu maddeler ayrica, tek basina veya bir karisim olarak
kullanilabilir. Bir fosfor kaynagi olarak potasyum dihidrojen fosfat veya
dipotasyum hidrojen fosfat veya karsilik gelen sodyum içeren tuz kullanilabilir.
Buna ek olarak kültür ortami, gelisme için gerekli olan metal tuzu (örnegin,
magnezyum sülfat veya demir sülfat) ve son olarak, amino asitler ve vitaminler
gibi gelisme artirici temel maddeler, yukarida bahsedilen maddelere ek olarak
kullanilabilir. Uygun öncül, kültür ortamina ilave olarak eklenebilir. Besin
maddesi, bir kere veya kültürleme sirasinda yeteri kadar saglanabilir.
Kültürün pH7si, uygun bir temel bilesik (örnegin, sodyum hidroksit, potasyum
hidroksit veya amonyak) veya asidik bilesik (örnegin, fosforik asit veya sülfürik
asit) tarafindan ayarlanabilir. Köpürme, yag asidi poliglikolester gibi bir köpük
önleyici ajan tarafindan ayarlanabilir. Kültürün aerobik kosulu, oksijen veya
oksijen içeren hgaz karisimlari, örnegin hava eklenerek korunabilir. Kültürleme
01537-P0028
sicakligi tipik olarak 20 ila 45°C, spesifik olarak 25 ila 40°C olabilir. Kültürleme,
putresin üretimi istenen maksimum düzeye ulasana kadar sürdürülebilir,
genellikle 10 ila 160 saatte saglanir. Putresin, kültür ortamina salinabilir veya
hücrede bulundurulabilir.
Mevcut bulusun kültürleme prosesinde üretilen putresini biriktirmeye ve elde
etmeye yönelik yöntem açisindan hedef madde, kültür yöntemine, örnegin kesikli,
sürekli veya beslemeli-kesikli tür kültüre bagli olarak teknikte bilinen uygun
yöntem kullanilarak kültür ortamindan elde edilebilir.
Asagida mevcut bulus, asagidaki Örnekler ile daha detayli olarak açiklanacaktir.
Ancak bu Örnekler yalnizca gösterme amaçlidir ve bulusun bu Örnekler ile
sinirlandirilmasi amaçlanmaz.
Örnek 1: Putresin biyosentezine yönelik etkili genlerin seçilmesine yönelik
kütüphane hazirligi ve klonlarin Seçilmesi
Dogal Corynebacterium susunun kromozomundan putresin biyosentezine yönelik
etkili genlerin elenmesi amaciyla, dogal Corynebacterium susunun bir kromozom
kütüphanesi hazirlanmistir. Detayli olarak dogal Corynebacterium glutamicum
ATCC 13032 susundan özütlenen kromozom, restriksiyon enzimi Sau3AI ile
klevaj edilmistir ve 5 ila 8 kb parçaciklar buradan seçilinistir ve ardindan bir
kromozom kütüphanesi hazirlamak üzere E.coli-Corynebacterium mekik vektörü
Bu sekilde hazirlanan Corynebacterium kromozom kütüphanesinden putresin
biyosentezine yönelik etkili genleri seçme amaciyla, yüksek yogunluklu putresin
içeren bir ortamda gelisen koloniler elde edilmistir.
01537-P0028
Bu sirada kütüphaneler, dönüsüm geçirenlerin her birini hazirlamak amaciyla,
putresin üretme yetenegine sahip olan Corynebacterium cinsi (KCCMl 1 138P) bir
mikroorganizmaya eklenmistir. 0.35 M putresin içeren minimal bir ortamda (10
tiyamin hidroklorid, 0.1 mg/l biyotin, l mM arginin, 25 mg/l kanamisin, 0.35 M
putresin, pH 7.0) gelisebilen dönüsüm geçirenler seçilmistir.
Karbamoiltransferaz (argF) ve dogal Corynebacterium glutamicum susu ATCC
çikarilmasi, dogal E.coli W
kodlayan bir genin (speC), kromozoma eklenmesi ve glutamattan ornitin
sentezlenmesine dahil edilen enzimi kodlayan argCJBD gen kümesinin baslaticisi,
her bir dönüsüm geçirenin hazirlanmasi ainaciyla ikame edilerek hazirlanmis olan
sus KCCM11138P, mevcut bulusçular tarafindan basvurusu yapilan bir patentte
seçilmistir ve ikinci olarak yüksek yogunluklu putresin içeren ortamda iyi gelisen
koloniler tanimlanmistir. Her bir kütüphane klonu elde edilmistir ve tekrar
putresin susuna eklenmistir. Ardindan yüksek yogunluklu putresin içeren ortamda
iyi gelisen koloniler belirlenmistir ve bu nedenle bir klon (A15) son olarak
seçilmistir. Bu seçilen klon, siralama yoluyla belirlenmistir. Sonuç olarak klonun,
dogrulanmistir, bunlarin N ucundaki 436 amino asidi çikarilmistir (SEKIL l).
SEKIL l, dogal Corynebacterium glutainicuin ATCC 13032 susunun kroinozomu
genlerin göreli konumlarini gösteren sematik bir diyagramdir.
01537-P0028
Örnek 2: A15 klonunda putresin sentezine yönelik etkili genlerin
belirlenmesi
Örnek 2-1: A15 klonundaki 5 genin Klonlanmasi ve bir dönüsüm geçirenin
hazirlanmasi
Örnek 1°de elde edilen A15 klonunun nükleotit dizilimi halihazirda bilinmistir.
Daha önce belirtilen ATCC13032 susunun nükleotit dizilimine dayanarak,
NCglOlOO geninin amplifikasyonuna yönelik primerler olarak SEQ ID NO 1 ve 2
ile temsil edilen NCglOlOO-F ve NCglOlOO-R, N ucundaki 436 amino asidi
çikarilmis olan tNCglOlOO geninin amplifikasyonuna yönelik primerler olarak
SEQ ID NO. 2 ve 3 ile temsil edilen NCglOlOO-R ve tNCglOlOO-F, NCglOlOl
geninin amplifikasyonuna yönelik primerler olarak SEQ ID NO. 4 ve 5 ile temsil
edilen NCglOlOl-F ve NCglOlOl-R, NCglOlO2 ve NCglOlO3 geninin
amplifikasyonuna yönelik primerler olarak SEQ ID NO. 6 ve 7 ile temsil edilen
NCglOlOZ-F ve NCglOlO3-R ve NCglOlO4 geninin amplifikasyonuna yönelik
primerler olarak SEQ ID NO. 8 ve 9 ile temsil edilen NCglOlO4-F ve NCglOlO4-
R olusturulmustur. Buna ek olarak ekspresyon baslaticinin p(CJ7) (veya pcj7)
amplifikasyonuna yönelik primerler olarak SEQ ID NO. 10 ve 1 1 ile temsil edilen
Ardindan 5 çesit gen parçasinin çogaltilmasi amaciyla, sablon olarak ATCC
13032 susunun kromozomu ve SEQ ID NO. 1 ila 9 ile temsil edilen her bir primer
(30 saniye boyunca 95°Cide denatürasyon, 30 saniye boyunca 50°C3de tavlama
ve 1 dakika ~ 1 dakika 30 saniye boyunca 72°C'de genisletme, 25 döngü)
kullanilarak PCR gerçeklestirilmistir. Buna ek olarak baslatici parçasini
çogaltmak amaciyla, SEQ ID NO. 10 ve 11 ile temsil edilen primerler ve bir
sablon olarak Corynebacterium ammoniagenesîn kromozomu kullanilarak PCR
gerçeklestirilmistir.
Kpnl ve Xbal ile klevaj edilen 5 gen ve EcoRV ve Kpnl ile klevaj edilen CJ7
01537-P0028
baslatici, toplam 5 çesit ekspresyon vektörünü; pHCl39T-P(CJ7)-NCglOlOO,
NCglOlOZ-NCg10103 ve pHCl39T-P(CJ7)-NCglOlO4,ü hazirlamak amaciyla,
EcoRV ve Xbal ile klevaj edilen bir ekspresyon vektörü olan pHC139T,ye (Kore
Patent No. 10-0860932) baglanmistir.
AlS klonuna dahil edilen 5 geni ifade eden suslarin hazirlanmasina yönelik
NCglOlOO-F
(SEQ ID NO.
NCglOlOO-R
(SEQ ID NO.
tNCgtOlOO-F
(SEQ ID NO.
NCglOlOl-F
(SEQ ID NO.
NCglOlOl-R
(SEQ ID NO.
NCglO i 02-F
(SEQ ID NO.
NCglO lO3-R
(SEQ ID NO.
(SEQ ID NO.
NCglO lO4-R
(SEQ ID NO.
GCGTCTAGATTAATCAATGAAGACGAATACAATTCC
GCGTCTAGATTAGGACAGTTCCGCTGGAGC
01537-P0028
A15 klonuna dahil edilen 5 geni ifade eden suslarin hazirlanmasina yönelik
primerler
P(CJ7)-F (SEQ CAGATATCGCCGGCATAGCCTACCGATG
P(CJ7)-R (SEQ GCGTCTAGAGATATCAGTGTTTCCTTTCG
Bu sekilde hazirlanan 5 çesit ekspresyon vektörü ve bir kontrol grubu pHCl39T,
elektroporasyon yoluyla Örnek liin KCCM11138P susuna eklenmistir ve
ardindan dönüsüm geçirenleri seçmek üzere, 25 tig/ml kanamisin içeren BHIS
tabakalari üzerine yayilmistir.
Örnek 2-2: Putresine yönelik etkili genlerin arastirilmasi
Örnek 2-l”de elde edilen dönüsüm geçiren toplam 6 çesitten, yüksek yogunluklu
putresin içeren ortamda iyi bir sekilde gelisen dönüsüm geçirenler, Örnek l7deki
ayni yol ile seçilmistir (SEKIL 2). SEKIL 2, mevcut bulusta hazirlanan dönüsüm
geçirenler arasinda gelisimin karsilastirilinasinin test sonucudur, burada 1, 2, 3, 4,
ve 6, 6 çesit ekspresyon vektörü, sirasiyla pHCl39T, pHC139T-P(CJ7)-
NCglOlOO, pHCl39T-P(CJ7)-tNCglOlOO, pHCl39T-P(CJ7)-NCglOlOl,
karistirilan suslari temsil eder. SEKIL 2'de gösterildigi gibi, yalnizca pHC139T-
P(CJ7)-NCglOlOl ile karistirilan dönüsüm geçirenler, yüksek yogunluklu putresin
içeren ortamda kusursuz gelisim göstermistir ve dolayisiyla NCglOlOl, putresin
biyosentezine yönelik etkili gen olarak seçilmistir.
01537-P0028
Örnek 3: NCg10101”i asiri ifade eden susta putresin üretme yeteneginin
degerlendirilmesi
Örnek 2sde etkili gen olarak belirlenen NCglOlOl genini asiri ifade eden susun
Putresin üretme yetenegi degerlendirilmistir. Degerlendirmeye yönelik bir sus,
pHCl39T-P(CJ7)-NCglOlOl,in putresin üreten sus KCCM11138P,ye eklenmesi
yoluyla hazirlanmistir.
pHC139T vektörü, elektroporasyon yoluyla putresin üreten sus KCCM 11138P°ye
eklenmistir ve ardindan dönüsüm geçirenleri seçmek üzere 25 tig/ml kanamisin
içeren BHIS tabakalari üzerine yayilmistir. Dönüsüm geçirenler sirasiyla KCCM
lll38P/pHC-NCglOlOl olarak
adlandirilmistir. Bu sekilde seçilen bu iki dönüsüm geçiren, 30°C”de 24 saat
boyunca 1 mM arginin içeren CM tabakalarinda (1% glikoz, 1% polipepton, 05%
agar, 1 L basina pH 6.8) kültürlenmistir ve ardindan bir hücre kültürü döngüsü, 25
ug/ml kanamisin içeren Tablo 27nin 25 ml titre ortaminda asilanmistir ve 30°C,de
96 saat boyunca 200 rpm,de çalkalanarak kültürlenmistir. Hazirlanan suslarin
tümü, fermantasyon sirasinda ortama 1 mM arginin ilavesi ile kültürlenmistir.
01537-P0028
Bilesim Yogunluk (1 L basina)
Glikoz %8
Soya proteini %025
Misir maserasyon katilan %05
KH2P04 %0.l
Biyotin 100 ug
Tiyamin Hidroklorit 3000 ug
Kalsiyum-Pantotenik Asit 3000 ug
Nikotinamid 3000 iig
Sonuç olarak Tablo 3'te gösterildigi gibi, NCglOlOVnin asiri ifade edilmesi
durumunda, putresin üretimi azalmistir.
Sus türü Putresin (g/L)
01537-P0028
Örnek 4: NCglOlOlî çikarildigi susta putresin üretme yeteneginin
degerlendirilmesi
Örnek 4-1: ATCC 13032 bazli putresin üreten susta NCglOlOPin çikarildigi
susun hazirlanmasi
NCglOlOl asiri ifadesi, yüksek yogunluklu putresin içeren ortamdaki hücre
gelisimini artirmistir, ancak Örnek 39e göre putresin üretimini azaltmistir. Bu
sonuca dayanarak, NCglOlOl”in çikarilmasinin putresin üretme yetenegi
üzerindeki etkisi degerlendirilmistir.
Detayli olarak ATCC 13032 susunun NCglOlOl nükleotit dizilimine dayanarak,
primerler olarak SEQ ID NO. 12 ve 13 ile temsil edilen NCglOlOl-del-F1_BamHI
ve NCglOlOl-del-R1_Sall, NCglOlOl°in N ucu bölgesinin homolog bir
rekombinant parçasini elde etmek amaciyla olusturulmustur. Primerler olarak
SEQ ID NO. 14 ve 15 ile temsil edilen NCglOlOl-del-F2_Sall ve NCglOlOl-del-
R2_Xbal, NCglOlOl 'in C ucu bölgesinin homolog bir rekombinant parçasini elde
etmek amaciyla olusturulmustur (Tablo 4). NCglOlOl geninin N ucu ve C ucu
bölgelerinin parçalari, iki çift primer kullanilarak PCR ile hazirlanmistir. PCR
ürünlerine, sirasiyla BamHI & SalI and 8311 & XbaI uygulanmistir ve bunlar
BamHI & Xbal uygulanan bir pDz vektörüne klonlanmistir. Klonlanan plazmit,
pDZ-NCglOl 01 (K/O) olarak adlandirilmistir.
01537-P0028
NCglOlOl ”in çikarildigi suslarin hazirlanmasina yönelik primerler
(SEQ ID NO. 12) CGGATTCCCTGCGATCATTG
NCglO 1 0 1 -del-R1_SalI (SEQ ACGCGTCGAC
NCglOlOl-del-F2_Sall (SEQ ACGCGTCGAC
NCglO 1 0 1 -del-RZýXbal (s EQ CTAGTCTAGA
KCCM 11138P ANCglOlOl susunu elde etmek amaciyla hazirlanan pDZ-
eklenmistir ve ardindan 25 tig/ml kanamisin içeren BHIS tabakasi üzerine
yayilmistir. Kromozomda vektörün basarili bir sekilde eklenmesi, koloninin X-gal
(5-bromo-4-klor0-3-indolil-ß-D-galaktosid) içeren kati ortaminda mavi olup
olmadigi gözlemlenerek dogrulanmistir. Birincil kromozom eklenen sus, besin
arasinda seyreltilmistir ve X-gal içeren kati ortam üzerine yayilmistir. Kolonilerin
çogunlugu mavi koloni olarak gözlemlenmistir, kolonilerin düsük bir orani, beyaz
koloniler olarak gözlemlenmistir. NCglOlOl geni çikarilmis suslar, beyaz
koloniler ile çift çaprazlama yoluyla son olarak seçilmistir ve SEQ ID NOS. 12 ve
ile temsil edilen primerler kullanilarak PCR yoluyla tanimlanmistir. Bu sekilde
tanimlanan varyantlar, KCCM 11138P ANCglOlOl olarak adlandirilmistir.
01537-P0028
Örnek 4-2: ATCC 13869 bazli putresin üreten susta NCglOlOl-çikarilmis
susun hazirlanmasi
Corynebacterium glutamicum ATCCl3032°ye dayanarak putresin üreten
KCCM11138P susu ile ayni genotipe sahip olan Corynebacterium glutamicum
çikarilmis, E.coli speC-eklenmis ve arg operon-argCJBD baslatici-sübstitüeli sus),
NCglOlOl-çikarilmis suslari hazirlamak üzere kullanilmistir.
Detayli olarak Corynebacterium glutamicum ATCC13869Sdan türetilen
NCg10101”i kodlayan geni ve bundan ifade edilen proteinin ainino asit dizilimini
tanimlamak amaciyla, bir sablon olarak Corynebacterium glutamicum
ATCCl3869”un Genomik DNAssi ve bir primer çifti ,SEQ ID NO. 12 ve 15
(NC glO l 0 l -del-F l_BamHl, NCglOl 01 -del-R2_Xbal) kullanilarak PCR
gerçeklestirilmistir. Burada PCR reaksiyonu, 30 saniye boyunca 95°C7de 30
denatürasyon döngüsü, 30 saniye boyunca 53°C3de tavlama ve 2 dakika ve 30
saniye boyunca 72°C”de genisletme ile gerçeklestirilmistir. PCR ürünleri,
elektroforez yoluyla ayrilmistir ve bunlarin dizilimleri analiz edilmistir. Dizilim
analizi yoluyla, Corynebacterium glutamicum ATCCl3869”dan türetilen
NCglOlOl'i kodlayan genin, SEQ ID NO. 18 ile temsil edilen bir nükleotit
dizilimini içerdigi ve bu sekilde kodlanan proteinin SEQ ID NO. 19 ile temsil
edilen amino asit dizilimini içerdigi belirlenmistir. Corynebacterium glutamicum
ATCCl3032”den türetilen NCglOlOlîn ve Corynebacterium glutamicum
ATCCl3869`dan türetilen NCglOlOlsin amino asit dizilimlerinin karsilastirilmasi
durumunda, bunlar %98 dizilim homolojisi göstermistir.
geni çikarmak amaciyla, NCglOlOl geninin N ucu ve C ucunun bölgesi, sablon
olarak Corynebacterium glutamicum ATCC13869,un bir genomik DNA”si ve
Örnek <4-1> ile ayni sekilde Tablo 4“te listelenen içi çift primer kullanilarak PCR
yoluyla çogaltilmistir. Ardindan PCR ürünlerine, sirasiyla BamHl & Sall and Sall
01537-P0028
vektörüne klonlanmistir, böylece bir plazmit pDZ-2'NCglOlOl(K/O)
olusturulmustur.
Plazmit pDZ-2'NCglOlOl(K/O), Örnek <4-1> ile ayni sekilde Corynebacterium
glutamicum DAB12-a3ya dönüstürülmüstür ve NCglOlOPi kodlayan genin
çikarildigi sus, seçilmistir. Seçilen Corynebacterium glutainicum varyanti,
DAB12-a ANCglOlOl olarak adlandirilmistir.
Örnek 4-3: NCglOlOPi çikarildigi susta putresin üretme yeteneginin
degerlendirilmesi
NCglOlOlîn çikarilmasinin putresin üreten sustaki putresin üretme yetenegi
üzerindeki etkisini arastirmak amaciyla, Örnekler <4-l> ve <4-2>,de hazirlanan
Corynebacterium glutamicum varyantlari karsilastirilmistir.
Detayli olarak iki çesit Corynebacterium glutamicum varyantindaki
(KCCM putresin üretme yetenegi,
örnek 3 ile ayni sekilde degerlendirilmistir. Asagidaki Tablo 5,te gösterildigi
üzere putresin üretiminin, NCglOlOl ,in çikarilmasi ile artirildigi bulunmustur.
Sus türü Putresin (g/L)
DAB12-a ANCglOlOl 11.0
01537-P0028
Birlikte ele alindiginda Örnekler 3 ve 43ün sonuçlari, putresin üretiminin,
NCglOlO] ,i kodlayan genin asiri ifadesi ile azaltildigi ve dogal Corynebacterium
glutamicum susundaki genin çikarilmasi artirildigini gösterir, bu durum,
NCglOlOl 'in dogrudan putresin biyosentezini etkiledigine isaret eder.
Buna göre mevcut bulusçular, yukaridaki Ömekteki putresin üreten sus KCCM
11138P'deki NCglOlOl genini çikararak hazirlanan, gelistirilmis bir putresin
üretme yetenegine sahip olan Corynebacterium glutamicum susunu,
Corynebacterium glutamicum CC01-0244 olarak adlandirmistir ve 26 Aralik
20117de Budapeste Anlasmasi ile uluslararasi depolama otoritesi olan Korean
Culture Center of Microorganismýde (buradan itibaren “KCCM” olarak
kisaltilmistir) Erisim No. KCCM] 1241 P ile depolanmistir.
CJ CheilJedang Corporation
<120> Gelistirilmis putresin üretkenligine sahip mikroorganizmalar ve
bunlar kullanilarak putresin üretimine yönelik proses
<130> OPA12195PCT
<160> 26
Kopatentln 2.0
<210> 1
<21 l> 30
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> Öncül
<400> 1
<210> 2
<21 l> 32
01537-P0028
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> Öncül
<400> 2
<210> 3
<21 1> 26
<212> DNA
<213> Yapay DiZi
<220>
<223> Öncü]
<400> 3
<210> 4
<21 1> 31
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> Öncül
<400> 4
<210> 5
<21 l> 30
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> Öncül
<400> 5
01537-P0028
<210> 6
<21 1> 28
<212> DNA
<2 1 3> Yapay Dizi
<220>
<223> Öncül
<400> 6
<210> 7
<21 1> 36
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> Öncül
<400> 7
<210> 8
<21 1> 27
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> Öncü]
<400> 8
<210> 9
<21 1> 30
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> Öncül
01537-P0028
<400> 9
<210> 10
<21 l> 28
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> Öncül
<400> 10
<210> 1 1
<21 1> 29
<212> DNA
<2 1 3> Yapay Dizi
<220>
<223> Öncül
<400> 11
<210> 12
<21 1> 28
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> Öncül
<400> 12
<210> 13
<21 l> 31
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
01537-P0028
<220>
<223> Öncül
<400> 13
<210> 14
<21 1> 31
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> Öncül
<400> 14
<210> 15
<21 l> 30
<212> DNA
<213> Yapay Dizi
<220>
<223> Öncül
<400> 15
<210> 16
<21 1> 1389
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
01537-P0028
<400> 16
93399C9953
<210> 17
<211> 462
<212> PRT
nectqqtth
<213> Corynebacterium glutamicum
qchtaccag
01537-P0028
<400> 17
1:11:
01537-P0028
<210> 18
<211> 1389
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 18
01537-P0028
93399C9933
<210> 19
<211> 462
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
cantaitacg
01537-P0028
<400> 19
01537-P0028
Leu Lys Ala Gly Asp Tyr Leu Ala
01537-P0028
<210> 20
<211> 319
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 20
01537-P0028
<210> 21
<211> 533
<212> PRT
<2 1 3> Corynebacterium glutamicum
<400> 21
01537-P0028
<210> 22
<211> 711
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
01537-P0028
<400> 22
1.0::
(311.1
01537-P0028
.1.65
01537-P0028
<210> 23
<211> 357
<212> PRT
Giy Val Ban Leu Leu Pro Gly Phe Ser Pro
Sor Glu ?hr asp Ala Asp Gly Val Lys krq
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 23
1.611
01537-P0028
<210> 24
<211> 388
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 24
01537-P0028
<210> 25
<211> 317
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 25
1.9 11
<210> 26
<211> 391
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
01537-P0028
<400> 26
Met Ser Thr Leu Glu Thr rrp Pro Gln vai Ile Iie Asn Thr Tyr Giy
1 5 10 15
25 30
Asp Gin Giy Asu Vai Ty: Ile Asp Leu Leu Ala Giy Ile Ala Val Ann
40 45
Ala Lou Gly His Ala His Pro Ala Il. Il. Glu Ala Val Thr Asn Gln
50 55 60
01537-P0028
HisGlu
01537-P0028
Claims (6)
- ISTEMLER Putresin üretme yetenegine sahip Coifynebacterium glutami'cumun bir rekombinant mikroorganizmasidir, burada mikroorganizma, SEQ ID NO: 17 veya SEQ ID NO: 19 ile temsil edilen bir amino asit dizilimine sahip olan bir protein veya bunun bir ifadesi, söz konusu proteinin aktivitesini zayiflatmak veya ortadan kaldirmak ve söz konusu proteinin aktivitesine nazaran putresin üretimini ve ayni olan ancak modifiye edilmemis olan mikroorganizma suslarinda putresin üretimini artirmak üzere modifiye edilir, burada proteinin aktivitesi, l) proteini kodlayan bir polinükleotidin kismen veya tamamen çikarilmasi, 2) polinükleotit ifadesinin bir azaltimi, 3) proteinin aktivitesini zayiflatmak üzere kromozom üzerindeki polinükleotit diziliminin bir modifikasyonu veya 4) bunlarin bir kombinasyonu yoluyla zayiflatilir.
- Istem l,e göre mikroorganizmadir, burada ornitin dekarboksilazin (SpeC) aktivitesi, ayrica buna eklenir.
- Istem 2,ye göre mikroorganizmadir, burada omitin dekarboksilaz, SEQ ID NO: 22 ile temsil edilen ainino asit dizilimine sahiptir. .
- Istem l”e göre mikroorganizmadir, burada ornitin karbomoiltransferaz (ArgF) ve glutamat çikaricidan (NCg11221) olusan gruptan seçilen bir veya daha fazla rekombinant mikroorganizmadaki aktiviteler, ayni ancak modifiye edilmemis sustaki ayni proteinin aktivitesine nazaran ayrica zayiflatilir. .
- Istem 4°e göre mikroorganizmadir, burada ArgF, SEQ ID NO: 20 ile temsil edilen amino asit dizilimine sahiptir ve NCgllZZl, SEQ ID NO: 21 ile temsil edilen amino asit dizilimine sahiptir.
- 6. istem l”e göre mikroorganizmadir, burada asetil gamma glutamil fosfat redüktaz (ArgC), asetil glutamat sentaz veya omitin asetiltransferaz (ArgJ), asetil glutamat kinaz (ArgB) ve asetil ornitin amino transferazdan (ArgD) olusan gruptan seçilen bir veya daha fazla rekombinant mikroorganizmadaki aktiviteler, ayni ancak modifiye edilmemis sustaki ayni proteinin aktivitesine nazaran ayrica gelistirilir. Istem 6,ya göre mikroorganizmadir, burada ArgC, ArgJ, ArgB ve ArgD, sirasiyla SEQ ID NO: 23, 24, 25 ve 26 ile temsil edilen amino asit dizilimlerine sahiptir. Asagidaki adimlari içeren putresin üretimine yönelik bir yöntemdir: bir hücre kültür besiyeri üretmek amaciyla, putresin üretme yetenegine sahip Corynebacterium glutamicumun modifiye edilen bir mikroorganizmasinin kültürlenmesi, burada mikroorganizma, SEQ ID NO: 17 veya SEQ ID NO: 19 ile temsil edilen bir amino asit dizilimine sahip olan bir protein veya bunun bir ifadesi, söz konusu proteinin aktivitesi zayiflatilacak veya ortadan kaldirilacak sekilde ve söz konusu proteinin aktivitesine nazaran, putresin üretimi ve ayni olan ancak modifiye edilmeyen mikroorganizma susundaki putresin üretimi artirilacak sekilde modifiye edilmistir, burada proteinin aktivitesi 1) proteini kodlayan bir polinükleotidin kismen veya tamamen çikarilmasi, 2) polinükleotit ifadesinin bir azaltimi, 3) proteinin aktivitesini zayiflatmak üzere kromozom üzerindeki polinükleotit diziliminin bir modifikasyonu veya 4) bunlarin bir kombinasyonu yoluyla zayiflatilir ve elde edilen hücre kültür besiyerinden putresinin izole edilmesi.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20120007004 | 2012-01-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TR201810509T4 true TR201810509T4 (tr) | 2018-08-27 |
Family
ID=48799483
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TR2018/10509T TR201810509T4 (tr) | 2012-01-20 | 2013-01-21 | Geliştirilmiş putresin üretkenliğine sahip rekombinant mikroorganizma ve bunu kullanarak putresin üretmeye yönelik yöntem. |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9290771B2 (tr) |
| EP (1) | EP2806022B1 (tr) |
| JP (2) | JP6251187B2 (tr) |
| KR (1) | KR101493586B1 (tr) |
| AU (1) | AU2013210136B2 (tr) |
| BR (1) | BR112014017910B1 (tr) |
| DK (1) | DK2806022T3 (tr) |
| ES (1) | ES2682696T3 (tr) |
| IN (1) | IN2014MN01621A (tr) |
| MY (1) | MY173018A (tr) |
| PL (1) | PL2806022T3 (tr) |
| RU (1) | RU2603089C2 (tr) |
| TR (1) | TR201810509T4 (tr) |
| WO (1) | WO2013109121A1 (tr) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101607741B1 (ko) * | 2013-03-20 | 2016-03-31 | 씨제이제일제당 (주) | 퓨트레신 생산 재조합 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법 |
| MY169049A (en) * | 2014-04-25 | 2019-02-08 | Cj Cheiljedang Corp | Microorganisms for producing putrescine and process for producing putrescine using them |
| KR101773135B1 (ko) * | 2015-05-08 | 2017-08-30 | 씨제이제일제당 주식회사 | 1,4-디아미노부탄의 정제방법 |
| WO2020138543A1 (ko) * | 2018-12-27 | 2020-07-02 | 씨제이제일제당 (주) | 오르니틴 탈탄산 효소의 변이주 및 그의 응용 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR920007401B1 (ko) | 1990-06-21 | 1992-08-31 | 제일제당 주식회사 | 다발성 절단부위를 지닌 대장균과 코리네형 세균에서 발현 가능한 신규 셔틀벡터 |
| US8497098B2 (en) * | 2004-07-15 | 2013-07-30 | Dsm Ip Assets B.V. | Biochemical synthesis of 1,4-butanediamine |
| KR100620092B1 (ko) | 2004-12-16 | 2006-09-08 | 씨제이 주식회사 | 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법 |
| WO2008039293A2 (en) | 2006-09-30 | 2008-04-03 | Osram Sylvania Inc. | Power supply and electronic ballast with auxiliary protection circuit |
| KR100860932B1 (ko) | 2007-02-08 | 2008-09-29 | 씨제이제일제당 (주) | 신규한 프로모터 및 이의 용도 |
| KR101188432B1 (ko) | 2008-04-10 | 2012-10-08 | 한국과학기술원 | 퓨트레신 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신의 제조방법 |
| CN101679964B (zh) | 2008-04-10 | 2013-12-25 | 韩国科学技术院 | 具有腐胺高产能力的突变微生物以及使用其生产腐胺的方法 |
| KR101348461B1 (ko) | 2010-12-08 | 2014-01-08 | 씨제이제일제당 (주) | 퓨트레신을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법 |
-
2013
- 2013-01-21 WO PCT/KR2013/000487 patent/WO2013109121A1/ko active Application Filing
- 2013-01-21 TR TR2018/10509T patent/TR201810509T4/tr unknown
- 2013-01-21 BR BR112014017910-7A patent/BR112014017910B1/pt active IP Right Grant
- 2013-01-21 EP EP13738280.0A patent/EP2806022B1/en active Active
- 2013-01-21 AU AU2013210136A patent/AU2013210136B2/en active Active
- 2013-01-21 PL PL13738280T patent/PL2806022T3/pl unknown
- 2013-01-21 RU RU2014133769/10A patent/RU2603089C2/ru active
- 2013-01-21 JP JP2014553263A patent/JP6251187B2/ja active Active
- 2013-01-21 KR KR20130006707A patent/KR101493586B1/ko active IP Right Grant
- 2013-01-21 MY MYPI2014002114A patent/MY173018A/en unknown
- 2013-01-21 DK DK13738280.0T patent/DK2806022T3/en active
- 2013-01-21 US US14/373,265 patent/US9290771B2/en active Active
- 2013-01-21 IN IN1621MUN2014 patent/IN2014MN01621A/en unknown
- 2013-01-21 ES ES13738280.0T patent/ES2682696T3/es active Active
-
2016
- 2016-07-29 JP JP2016150247A patent/JP2017006133A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US9290771B2 (en) | 2016-03-22 |
| WO2013109121A1 (ko) | 2013-07-25 |
| EP2806022A4 (en) | 2015-10-07 |
| ES2682696T3 (es) | 2018-09-21 |
| PL2806022T3 (pl) | 2018-12-31 |
| EP2806022B1 (en) | 2018-05-23 |
| MY173018A (en) | 2019-12-19 |
| RU2014133769A (ru) | 2016-03-20 |
| JP6251187B2 (ja) | 2017-12-20 |
| RU2603089C2 (ru) | 2016-11-20 |
| JP2015506686A (ja) | 2015-03-05 |
| AU2013210136A1 (en) | 2014-09-11 |
| AU2013210136B2 (en) | 2016-07-07 |
| JP2017006133A (ja) | 2017-01-12 |
| KR101493586B1 (ko) | 2015-02-16 |
| US20140363859A1 (en) | 2014-12-11 |
| KR20130086010A (ko) | 2013-07-30 |
| BR112014017910A2 (pt) | 2017-11-28 |
| CN104136600A (zh) | 2014-11-05 |
| IN2014MN01621A (tr) | 2015-07-03 |
| DK2806022T3 (en) | 2018-08-13 |
| BR112014017910B1 (pt) | 2022-04-26 |
| EP2806022A1 (en) | 2014-11-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2016203949B2 (en) | Recombinant Microorganism Having Improved Putrescine Producing Ability And Method For Producing Putrescine By Using Same | |
| EP0088166A2 (en) | Method for expressing a gene | |
| US11884951B2 (en) | Method for producing RNA | |
| JP2023507482A (ja) | グアニジノ酢酸の発酵生産方法 | |
| RU2683551C1 (ru) | Микроорганизм, обладающий продуктивностью по L-лизину, и способ получения L-лизина с использованием этого микроорганизма | |
| RU2663135C2 (ru) | Микроорганизм, обладающий улучшенной способностью к продуцированию l-лизина, и способ производства l-лизина с использованием данного микроорганизма | |
| TW201623617A (zh) | 具有腐胺生產力之微生物及使用其產生腐胺之方法 | |
| TWI688649B (zh) | 用於製造腐胺之微生物及使用該微生物製造腐胺之方法 | |
| RU2651505C1 (ru) | Микроорганизм Corynebacterium с улучшенной способностью продуцировать L-лизин и способ получения L-лизина с его помощью | |
| TR201810509T4 (tr) | Geliştirilmiş putresin üretkenliğine sahip rekombinant mikroorganizma ve bunu kullanarak putresin üretmeye yönelik yöntem. | |
| JP2018528771A (ja) | Ｌ−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物及びそれを用いたｌ−リジン生産方法 | |
| KR20090018531A (ko) | 신규한 코리네박테리움 글루타미쿰 프로모터 | |
| JP2008283863A (ja) | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造方法 | |
| US7033802B1 (en) | Penicillin binding protein gene and process for producing L-glutamic acid | |
| TWI510621B (zh) | 具有增加之腐胺生產力之重組微生物及使用該微生物之製造腐胺之方法 | |
| RU2819270C1 (ru) | Микроорганизм для продуцирования L-аминокислоты, обладающий повышенной активностью цитохрома С, и способ получения L-аминокислоты с его использованием | |
| CN114008206A (zh) | 具有增强的细胞色素c活性的l-氨基酸生产微生物及使用其的l-氨基酸生产方法 |