TR201810509T4 - Geliştirilmiş putresin üretkenliğine sahip rekombinant mikroorganizma ve bunu kullanarak putresin üretmeye yönelik yöntem. - Google Patents

Geliştirilmiş putresin üretkenliğine sahip rekombinant mikroorganizma ve bunu kullanarak putresin üretmeye yönelik yöntem. Download PDF

Info

Publication number
TR201810509T4
TR201810509T4 TR2018/10509T TR201810509T TR201810509T4 TR 201810509 T4 TR201810509 T4 TR 201810509T4 TR 2018/10509 T TR2018/10509 T TR 2018/10509T TR 201810509 T TR201810509 T TR 201810509T TR 201810509 T4 TR201810509 T4 TR 201810509T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
protein
activity
putrescine
seq
microorganism
Prior art date
Application number
TR2018/10509T
Other languages
English (en)
Inventor
Min Lee Kyoung
Hye Kim Seon
Won Um Hye
Sun Kang Min
Jin Choi Su
Kyoung Jung Hee
Hoo Jhon Sung
Li Hongxian
Sik Gwak Won
Ho Lee Chong
Lyeol Yang Young
Original Assignee
Cj Cheiljedang Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cj Cheiljedang Corp filed Critical Cj Cheiljedang Corp
Publication of TR201810509T4 publication Critical patent/TR201810509T4/tr

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205Bacterial isolates
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001Amines; Imines
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12RINDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15Corynebacterium

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Mevcut buluş, NCgl0101'in aktivitesinin, putresin üretmek üzere modifiye edilen Corynebacterium cinsi bir mikroorganizmada zayıflatıldığı durumda, yüksek verimde geliştirilmiş putresin üretme yeteneğine sahip bir rekombinant mikroorganizma ve bunu kullanarak putresin üretmeye yönelik bir yöntem ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME GELISTIRILMIS PUTRESIN ÜRETKENLIGINE SAHIP REKOMBINANT MIKROORGANIZMA VE BUNU KULLANARAK PUTRESIN ÜRETMEYE YÖNELIK YÖNTEM Gelistirilmis bir putresin üretme yetenegine sahip rekombinant mikroorganizmalar ve bunu kullanarak putresin üretmeye yönelik bir yöntem ile ilgilidir.
Putresin (veya 1,4-bütandiamin), spermidin ve spermin gibi bir poliainin çesididir ve gram-negatif bakterilerde ve mantarlarda bulunur. Putresinin çesitli türlerdeki genis bir yogunluk yelpazesinde mevcut olmasi nedeniyle, mikroorganizmalarin metabolizinasinda önemli bir rol oynamasi beklenir. Putresin genellikle, propilenden akrilonitril ve süksinonitril yoluyla kimyasal sentez ile üretilir.
Kimyasal sentez, baslangiç materyalleri olarak petrokimyasallardan türetilen maddeleri kullanir ve toksik kimyasallari kullanir ve dolayisiyla çevre dostu degildir ve yag bosalmasi problemine sahiptir.
Bu sorunlari çözmek amaciyla, daha çevre dostu olan ve enerji tüketimini azaltan, mikroorganizmalar kullanilarak putresin biyosentezine yönelik bir yöntemin gelistirilmesi üzerinde çok sayida arastirma mevcuttur. Mevcut bilgiye göre putresinin, iki yol ile biyosentezi yapilabilir. Bir yolda omitin, glutamattan üretilir ve omitin, putresin sentezlemek üzere karboksilden ayrilir. Diger yolda arginin, ornitinden sentezlenir ve agmatin, argininden üretilir ve ardindan putresin, agmatinden sentezlenir. Ek olarak, putresinin bilinen sentetik yollarina dahil edilen enzimler ile dönüstürülen bir hedef mikroorganizma kullanilarak putresin sentezine yönelik diger yöntemler mevcuttur. Örnegin WOO9/ 125924, putresinin bir öncülü olan ornitinin, arginine dönüstürüldügü yol devre disi birakilarak E. 01537-P0028 Coli 'deki putresinin ayristirilmasi ve kullanimina dahil edilen yol devre disi birakilarak ve omitinin biyosentetik yolu gelistirilerek, yüksek verimlilik ile putresin üretilmesine yönelik bir yöntemi açiklar. 2010 yilinda yayinlanan bir makale, omitini putresine dönüstüren proteini gelistirerek ve putresin üretemeyen Corynebacterium suslarina ekleyerek yüksek yogunlukta putresin üretimine yönelik bir yöntemi açiklar. Ek olarak, E.coli türevli arginin dekarboksilazi ve agmatinazi, suslara ekleyerek, argininden putresin üretilmesine yönelik bir yöntemi açiklar. Bu açidan omitin, arginin yolundan 50 kat daha fazla miktarda 2010).
Bu altyapida mevcut bulusçular, putresinin NCglOlOl proteininin aktivitesi zayiflatilarak veya ortadan kaldirilarak, dolayisiyla mevcut bulus tamamlanarak, Corynebacterium cinsinin bir mikroorganizmasinda yüksek verimde üretilebildigini saptamistir.
Mevcut bulusun bir amaci, bunun endojen aktivitesine nazaran, zayiflatilmis NCg10101 aktivitesine sahip olmak üzere modifiye edilen, yüksek verimde putresin üretebilen Corynebacterium cinsinin bir rekombinant mikroorganizmasinin saglanmasidir.
Mevcut bulusun diger bir amaci, mikroorganizma kullanarak putresin üretimine yönelik bir yöntemin saglanmasidir. 01537-P0028 Mevcut bulusa ait gelistirilinis bir putresin üretebiline yetenegine sahip olan Corynebacterium cinsinin mikroorganizmasinin, putresin üretimine yönelik olarak kullanilmasi durumunda, bunun endojen aktivitesine nazaran NCglOlOl aktivitesini zayiflatmak üzere modifiye edilir ve bu nedenle, yüksek verimde putresin üretebilir. Dolayisiyla mikroorganizma, daha etkin putresin üretimine yönelik olarak yaygin biçimde kullanilabilir.
SEKIL l, Coryiiebacterium glutamicum ATCC 13032 dogal susunun kromozomu üzerindeki NCglOlOO, NCglOlOl, NCg10102, NCglOlO3 ve NCg10104,ü kodlayan genlerin bagil pozisyonlarini gösteren sematik bir diyagramdir.
SEKIL 2, mevcut bulusta hazirlanan rekombinant suslar arasindaki gelisme karsilastirmasinin test sonuçlarini temsil eder, burada 1, 2, 3, 4, 5 karistirilarak hazirlanan suslardir.
Yukaridaki amaçlari saglamak üzere bir açida mevcut bulus, putresin üretme yetenegine sahip olan Corjynebacteri'um glutamicumhn bir rekombinant mikroorganizmasini saglar, burada mikroorganizma, SEQ ID NO. 17 veya SEQ bunun ifadesi, söz konusu proteinin aktivitesini zayiflatmak veya ortadan kaldirmak ve söz konusu proteinin aktivitesine nazaran putresin üretimini ve ayni olan ancak modifiye edilmemis olan mikroorganizma suslarinda putresin 01537-P0028 üretimini artirmak üzere modifiye edilecegi sekilde modifiye edilmistir, burada proteinin aktivitesi, 1) proteini kodlayan bir polinükleotidin kismen veya tamamen çikarilmasi, 2) polinükleotit ifadesinin bir azaltimi, 3) proteinin aktivitesini zayiflatmak üzere kromozom üzerindeki polinükleotit diziliminin bir modifikasyonu veya 4) bunlarin bir kombinasyonu yoluyla zayiflatilir.
Burada kullanildigi üzere "NCglOlOl” ifadesi, Corynebacterium glutamicum içinde ifade edilen ve islevi henüz tamamen bilinmeyen bir metal-bagimli enzimin aktivitesini gösteren bir protein anlamina gelir. Bu, peptidaz M20 familyasi veya aminobenzoil-glutamat kullanma proteininin (AbgB) bir metal baglayici alanini içerir. E.coli7nin AbgB”si, aminobenzoil-glutamati aminobenzoata ve glutamata hidrolizlemek üzere AbgA ile aminobenzoil-glutamat hidrolazi olusturur.
Aminobenzoatin, folat sentezine yönelik bir öncül olarak kullanildigi bilinir, ancak bunun putresin verimliligi ile iliskisi, bilinmemektedir.
Mevcut bulusun NCglOlOl proteini, SEQ ID NO: 17 veya SEQ ID NO: 19 ile temsil edilen amino asit dizilimini içerebilir. Ancak mikrobiyal türlere veya suslara bagli olarak proteinin amino asit diziliminde fark olabilmesi nedeniyle, bu durum bununla sinirli degildir. Diger bir deyisle proteinin aktivitesini zayiflatarak putresin üretme yetenegini artirmayi sagladigi sürece, SEQ ID NO: 17 veya SEQ lD NO: 19 ile temsil edilen amino asit diziliminin bir veya daha fazla konumundaki bir veya çok sayida amino asidin sübstitüe edilmesi, çikarilmasi, ilave edilmesi veya eklenmesini içeren amino asit dizilimine sahip bir inutant protein veya yapay varyant olabilir. Burada “çok sayida”, proteinin amino asit kalintilarinin üç boyutlu yapisindaki lokasyon veya çeside bagli olarak degisebilir, ancak spesifik olarak 2 ila 20, spesifik olarak 2 ila 10 ve daha spesifik olarak 2 ila anlamina gelir. Ek olarak amino asidin sübstitüe edilmesi, çikarilmasi, ilave edilmesi, eklenmesi veya evrilmesi, mikroorganizmanin her biri veya türlerindeki farkliliga bagli olarak yapay varyantlar veya dogal mutasyon ile ortaya çikanlari 01537-P0028 Mevcut bulusun amino asit dizilimini kodlayan polinükleotit, NCglOlOl proteini ile benzer aktiviteye sahip oldugu sürece, SEQ 1D NO: 17 veya SEQ ID NO: 19 veya bununla %80 veya daha fazla, spesifik olarak %90 veya daha fazla, daha spesifik olarak %95 veya daha fazla ve özellikle spesifik olarak %97 veya daha fazla homoloji ile temsil edilen amino asit dizilimini kodlayan polinükleotit dizilimini içerebilir. En spesifik olarak bu, SEQ ID NO: 16 veya SEQ ID NO: 18 ile temsil edilen polinükleotit dizilimi olabilir. Özdeslik ve benzerlik gibi parametreleri hesaplamak üzere BLAST 2.0 kullanilarak teknikte uzman kisiler tarafindan iyi bilinen yöntem ile belirlenebilir.
Ek olarak inevcut bulusun NCglOlOl ,ini kodlayan polinükleotit dizilimi, SEQ ID.
NO: 16,nin polinükleotidi veya “sert kosullar” altinda bundan hazirlanan prob ile melezlestirilebilir ve normal olarak islev gören NCglOlOl proteinini kodlayan modifiye edilmis bir polinükleotit dizilimi olabilir. Burada kullanildigi üzere “sert kosullar”, polinükleotit arasinda spesifik melezlestirrneye olanak saglayan kosullara refere eder ve örnegin Molecular Cloning (A Laboratory Manual, J.
Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989) veya Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel vd., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York) içinde spesifik polivinilpirrolidon, %002 bovin serum albumin, , %05 SDS, 2 mM EDTA) melezlestirme tamponunda gerçeklestirilir. SSC, pH 7 degerinde 0.15 M sodyum klorid/0.15 M sodyum sitrattir. Melezlestirme sonrasinda DNA°nin transfer edildigi membran, oda sicakliginda 2 X SSC ile yikanir ve ardindan 68°C sicaklikta, 0.1 ila 0.5 X SSC/0.1 X SDS ile yeniden yikanir.
Mevcut bulusta NCglOlOl proteininin aktivitesi, 1) proteini kodlayan bir polinükleotidin kismen veya tamamen çikarilmasi, 2) polinükleotidin ifadesini 01537-P0028 azaltmak üzere bir ifade düzenleyici dizilimin modifiye edilmesi, 3) kromozom üzerindeki polinükleotit diziliminin bir modifikasyonu veya 4) bunlarin bir kombinasyonu yoluyla zayiflatilabilir.
Yukarida proteini kodlayan polinükleotidin kismen veya tamamen çikarilmasi, kromozomdaki bir endojen hedef proteini bir isaretleyici gene kodlayan polinükleotidi veya kismi nükleotit dizilimi çikarilmis olan bir polinükleotidin, kromozomal gen eklememe yönelik bir vektör ile sübstitüe edilmesi yoluyla gerçeklestirilebilir. “Kismi” çikarmanin uzunlugu, polinükleotidin çesidine baglidir, ancak spesifik olarak 2bp ila 300bp, daha spesifik olarak 2bp ila lOObp ve daha spesifik olarak lbp ila Sbp'dir.
Ayrica polinükleotit ifadesini azaltmak amaciyla bir ifade düzenleyici dizilim, nükleotit diziliminin çikarilmasi, ilavesi, konservatif veya konservatif olmayan sübstitüe edilmesi veya ifade düzenleyici dizilimin aktivitesini daha fazla zayiflatmak üzere bunlarin bir kombinasyonu yoluyla ifade düzenleyici dizilimdeki mutasyonlari indükleyerek veya ifade düzenleyici dizilimi, daha zayif aktiviteye sahip olan dizilim ile degistirerek modifiye edilebilir. Ifade düzenleyici dizilim, transkripsiyon baslaticiyi kodlayan bir dizilimi, isletici dizilimi, ribozomal baglayici bölgeyi ve transkripsiyon ve translasyonun sonlandirilmasini kontrol eden dizilimi içerebilir.
Ek olarak proteinin aktivitesini zayiflatmak üzere kromozom üzerindeki polinükleotit dizilimi, nükleotit diziliininin çikarilmasi, ilavesi, konservatif veya konservatif olmayan sübstitüe edilmesi veya dizilimin aktivitesini daha fazla zayiflatmak üzere bunlarin bir kombinasyonu yoluyla dizilimdeki mutasyonlari indükleyerek veya polinükleotit dizilimini daha zayif aktiviteye sahip olan modifiye edilmis dizilim ile degistirerek modifiye edilebilir.
Bu sirada mevcut bulusa ait putresin üretmek üzere gelistirilmis yetenege sahip olan Corynebacterium cinsinin bir mikroorganizmasi, omitinden arginin 01537-P0028 sentezlenmesine dahil edilen ornitin karbamoiltransferaz (ArgF) aktivitesini ve/veya bunun endojen aktivitesine nazaran, glutamat çikarilmasina dahil edilen proteinin (NCg11221) aktivitesini zayiflatmak üzere ilaveten modifiye edilebilir.
Ek olarak Corynebacterium cinsinin mikroorganizmasi, ornitin dekarboksilaz (ODC) aktivitesi ilaveten eklenerek modifiye edilebilir. Glutamati asetil glutamata çevirmek üzere asetil glutamat sentazin aktivitesini, asetil ornitini ornitine çevirmek üzere omitin asetiltransferazin (ArgJ) aktivitesi, setil glutamati asetil glutamil fosfata çevirmek üzere asetil glutamat kinazin (ArgB) aktivitesini, asetil glutamil fosfati, asetil glutamat semialdehide çevirmek üzere asetil gamma glutamil fosfat redüktazin (ArgC) aktivitesini ve/veya asetil glutamat semialdehidi asetil ornitine çevirmek üzere asetil omitin amino transferaz aktivitesini, endojen aktivitelerine nazaran, gelistirmek ve dolayisiyla bir putresin öncülü olan ornitinin biyosentetik yolunu gelistirmek üzere modifiye edilebilir (Sakanyan V et al., Bu durumda ArgF, NCg11221, ODC, ArgC, ArgJ, ArgB ve ArgD, spesifik olarak temsil edilen amino asit dizilimlerine veya bununla %80 veya daha fazla, spesifik olarak %90 veya daha fazla, daha spesifik olarak %95 veya daha fazla ve en spesifik olarak %97 veya daha fazla homolojiye sahip olan amino asit dizilimine sahip olabilir.
Burada kullanildigi üzere “ornitin dekarboksilaz (ODC)” ifadesi, omitin kullanarak putresin üreten bir enzime refere eder ve ODC, bir koenzim olarak piridoksalfosfat (Piridoksal 5'-fosfat, PLP) gerektirir. ODC, çogu Gram-negatif bakteride bulunur ve Gram-pozitif bakterilerden Lactobacillus gibi bazi bagirsak bakterilerinde bulunabilir. E. colz', ODC°yi kodlayan iki çesit gene sahiptir, bunlardan biri olan speC, belirli yogunlukta sürekli olarak ifade edilir ve digeri olan speF, spesifik kosullar altinda (belirli yogunluklardan daha yüksek olarak omitinin bulunmasi ve düsük pH) ifade edilir. Türlere bagli olarak, E. coli' gibi bazi türler, iki çesit ODC”ye sahiptir ve digerleri yalnizca bir çeside sahiptir. 01537-P0028 Escherichi'a Sp., Shigella Sp., Citrobacter sp., Salmonella sp. ve Enterobacter sp. gibi türler, iki çesit ODC”ye (speC ve speF) sahiptir ve Yersi'm'a sp., Klebsi'ella sp., Erwim'a sp. Suslari, bir çesit ODC°ye (speC) sahiptir. Lactobacillus durumunda ODC, bir gen çesidi (speF) ile ifade edilir ve düsük pH veya çok sayida ornitin ve histidin kosullarinda ifade edilmek üzere indüklendigi bilinir.
ODC aktivitesi, çesitli türlerden türetilen ODC,yi kodlayan genler kullanilarak mevcut bulusun Corynebacterium cinsi rekombinant mikroorganizmasina uygulanabilir. ODC,yi kodlayan polinükleotit, bunlarla sinirli olmaksizin, SEQ ID NO: 22 ile temsil edilen amino asit dizilimi ve bununla %70 veya daha fazla, spesifik olarak %80 veya daha fazla, daha spesifik olarak %90 veya daha fazla homolojiye sahip olan amino asit diziliminden olusan proteini kodlayan polinükleotidi içerebilir.
Ek olarak ornitin dekarboksilaz (ODC) aktivitesinin mikroorganizmalara uygulanmasi, teknikte iyi bilinen çesitli yöntemler yoluyla, örnegin ODC”yi kodlayan bir nükleotit dizilimini içeren polinükleotidin kromozoma ilavesi yöntemi, vektör sistemi uygulanarak mikroorganizmalara polinükleotidin eklenmesi yöntemi, modifiye edilen veya gelistirilmis aktiviteye sahip olan transkripsiyon baslaticinin, ODC”yi kodlayan nükleotit diziliminin üst bölgesine eklenmesi yöntemi ve ODC,yi kodlayan nükleotit dizilimine mutasyonun eklenmesi yöntemi yoluyla gerçeklestirilebilir. Daha spesifik olarak, ODC,yi kodlayan nükleotit diziliminin eklenmesi durumunda bilinen CJ7 transkripsiyon baslatici, bunun ifadesini kontrol etmek üzere bir transkripsiyon baslatici olarak kullanilabilir.
Ek olarak ArgC, ArgJ, ArgB ve ArgD”nin aktivitesinin gelistirilmesi, l) enzimi kodlayan polinükleotidin kopya sayinin artirilmasi, 2) polinükleotit ifadesini artirmak üzere ifade düzenleyici dizilimin bir modifikasyonu, 3) enziinin aktivitesini gelistirmek üzere kromozom üzerindeki enzimi kodlayan polinükleotit 01537-P0028 diziliminin bir modifikasyonu veya 4) bunlarin bir kombinasyonu yoluyla saglanabilir. l) yönteminde enzimi kodlayan polinükleotidin kopya sayisinin artirilmasi, polinükleotidi uygulanabilir bir sekilde vektöre baglayarak veya bunu konak hücrenin kromozomuna ilave ederek saglanabilir. Daha spesifik olarak konak hücrenin polinükleotidinin kopya sayisi, mevcut bulusun enzimini kodlayan polinükleotidin, uygulanabilir bir biçimde baglandigi durumda, bagimsiz bir sekilde islev görebilen ve kopya yapabilen bir vektörün uygulanmasi yoluyla veya polinükleotidin uygulanabilir bir biçimde baglandigi durumda, konak hücrenin kromozomuna polinükleotidi ilave edebilen vektörün uygulanmasi yoluyla artirilabilir.
Burada kullanildigi üzere “vektör” terimi, uygun konaktaki hedef proteini ifade etmek üzere, uygun düzenleyici dizilime uygulanabilir bir sekilde bagli olan hedef proteini kodlayan polinükleotidin nükleotit dizilimini içeren DNA yapimina refere eder. Düzenleyici dizilim, transkripsiyonu baslatabilen baslaticiyi, transkripsiyonu kontrol etmek üzere herhangi bir isletici dizilimi, uygun mRNA ribozom baglayici bölgeyi kodlama amaçli dizilimi ve transkripsiyon ve translasyonun sonlandirilmasini kontrol etme amaçli dizilimi içerir. Vektör, uygun bir konaga verilebilir ve akabinde, konak genomundan bagimsiz olarak islev görebilir veya kopyalanabilir ve genomun kendisine entegre edilebilir.
Mevcut bulusta teknikte bilinen herhangi bir vektör, konakta kopyalandigi sürece, herhangi bir spesifik sinirlama olmaksizin kullanilabilir. Yaygin olarak kullanilan vektörlerin örnekleri, plazmit, kozmit, virüs ve dogal durumunda veya rekombinant durumunda bakteriyofajdir. Örnegin pWE15, M13, ÄMBL3, ÄMBL4, ÄIXII, ÄASHII, kAPII, MIO, ktll, Char0n4A ve Char0n21A, bir faj vektörü veya kozmit vektörü olarak kullanilabilir ve pBR sisteini, pUC sistemi, pBluescriptII sistemi, pGEM sistemi, pTZ sistemi, pCL sistemi ve pET sistemi, bir plazmit vektörü olarak kullanilabilir. Mevcut bulusta kullanilabilen vektör 01537-P0028 özellikle sinirli degildir ve bilinen ekspresyon vektörleri kullanilabilir. Spesifik pCClBAC vektörleri kullanilabilir. Daha spesifik olarak pACYC177, pCL, pCClBAC vektörleri kullanilabilir.
Ek olarak hedef proteini kodlayan polinükleotidi, bir konak hücrenin kromozomuna ilave edebilen vektör, örnegin spesifik olarak bir mekik vektörü, E. coli' ve Coiyneform bakterilerinde kendi kendine kopyalanabilen pECCG olabilir, ancak bunlarla sinirli degildir.
Ek olarak kromozomdaki hedef proteini kodlayan polinükleotit, kromozomal gen ilavesine yönelik bir vektör kullanilarak, yeni bir polinükleotit ile degistirilebilir.
Polinükleotidin kromozoma eklenmesi, teknikte iyi bilinen bir yöntem ile, örnegin homolog rekombinasyon yoluyla saglanabilir. Mevcut bulusun vektörünün, homolog bir rekombinasyonu indükleyerek kromozoma ilave edilebilmesi nedeniyle isaretleyicinin seçimi, kromozoma basarili bir gen ilavesini dogrulamak üzere ilaveten dahil edilebilir. Bir seçim isaretleyici, vektör ile dönüstürülen hücrelerin elenmesine, diger bir deyisle hedef polinükleotidin ilave edilip edilmediginin belirlenmesine yöneliktir. Ilaca direnç, oksotrofi, toksik ajanlara direnç veya yüzey proteinlerinin ifadesi gibi seçilebilen fenotipleri saglayan isaretleyiciler kullanilabilir. Seçici bir ajana tabi tutulan bir çevrede, yalnizca seçme isaretleyicisini ifade eden hücreler hayatta kalabilir veya hücreler, farkli bir fenotip gösterir ve bu nedenle basarili bir biçimde dönüstürülen hücreler, bu yöntem yoluyla seçilebilir.
Burada kullanildigi üzere “dönüsüm” ifadesi, proteinin hücrede ifade edilebilecegi sekilde, hedef proteini kodlayan bir polinükleotidi içeren vektörün konak hücreye eklenmesine refere eder. Dönüstürülen polinükleotit, konak hücrenin kromozomuna takilmasi veya kromozomun disinda yer almasi göz önünde bulundurulmaksizin, lokasyondan bagimsiz olarak konak hücrede ifade edilebilen hedef proteinleri kodlayan bütün polinükleotitleri içerir. Ek olarak polinükleotit, 01537-P0028 hedef proteini kodlayan DNA ve RNA”y1 içerir. Polinükleotit, konak hücreye eklendigi ve ifade edildigi sürece, herhangi bir biçimde olabilir. Örnegin polinükleotit, kendini ifade için gereken bütün elemanlari içeren, gen yapiini olan bir ifade kaseti biçimindeki bir konak hücreye eklenebilir. Ifade kaseti tipik olarak polinükleotide uygulanabilir bir biçimde bagli olan bir baslatici, transkripsiyon sonlandirma sinyali, ribozomal baglayici alan ve translasyon sonlandinna sinyalini içerir. Ifade kaseti kendi kendini kopyalayabilen ekspresyon vektörü biçiminde olabilir. Ek olarak polinükleotit, kendi formunda bir konak hücreye eklenebilir ve konak hücrenin ifadesi için gereken dizilimlere uygulanabilir bir biçimde baglanabilir.
Burada kullanildigi üzere “uygulanabilir bir biçimde bagli” ifadesi, hedef proteini kodlayan polinükleotidin transkripsiyonunu baslatan ve buna aracilik eden baslatici dizilim ile polinükleotit arasindaki islevsel baglantiya refere eder.
Buna ek olarak 2) mevcut bulustaki polinükleotidin ifadesini artirmak üzere ifade düzenleyici dizilimin modifikasyonunu yöntemi, nükleotit diziliminin çikarilmasi, ilavesi, konservatif veya konservatif olmayan sübstitüe edilmesi veya bunlarin bir kombinasyonu yoluyla, dizilimin mutasyonunu indükleyerek veya gelistirilmis aktiviteye sahip olan nükleotit dizilimi tarafindan sübstitüe etme yoluyla gerçeklestirilebilir. Ifade düzenleyici dizilim, transkripsiyon baslaticiyi, isletici dizilimi, ribozomal baglayici bölgeyi kodlayan dizilimi ve transkripsiyon ve translasyonun sonlandirilmasini kontrol etme amaçli dizilimi içerir.
Güçlü bir heterolog baslatici, orijinal baslaticilar yerine, polinükleotidin ifade biriminin üstüne baglanabilir. Güçlü bir baslaticinin bir örnegi, pcj7 baslatici, lysCPl baslatici, EF-Tu baslatici, groEL baslatici, aceA veya aceB baslatici ve benzerleridir ve daha spesifik olarak Corynebacteri'um 'dan türetilen pcj7 baslatici veya lysCPl baslatici, enzimi kodlayan polinükleotidin ifadesini gelistirmek üzere uygulanabilir bir biçimde baglanir. Burada aspartat kinaz ve aspartat semialdehid dehidrogenazi kodlayan polinükleotidin baslatici bölgesinin nükleotit diziliminin 01537-P0028 sübstitüe edilmesi yoluyla gelistirilmis bir baslatici olan lysCPl baslatici, ilgili enzimin aktivitesini aspartat kinaz geninin ifadesinin gelistirilmesi yoluyla dogal susa nazaran 5 kat artiracak kadar güçlüdür (Uluslararasi Patent Yayin No. 2009- 096689). Buna ek olarak pcj7 baslaticinin, Corynebacterium ammoniagenes ve Escheri'chia içinde ifade edildigi ve güçlü bir baslatici aktiviteye sahip oldugu belirlenmistir ve bu, yüksek yogunlugun yani sira Corynebacterium glutami'cum içinde ifade edilebilir (Kore Patenti No. 0620092).
Buna ek olarak 3) kromozom üzerindeki polinükleotit diziliminin modifikasyonunu yöntemi, dizilimin aktivitesini artirmak amaciyla, nükleotit diziliminin çikarilmasi, ilavesi, konservatif veya konservatif olmayan sübstitüe edilmesi veya bunlarin bir kombinasyonu yoluyla veya gelistirilmis aktiviteye sahip olan nükleotit dizilimi tarafindan sübstitüe etme yoluyla gerçeklestirilebilir, ancak spesifik olarak bunlarla sinirli degildir.
Putresin üretme yetenegine sahip olan bir mikroorganizma olan, mevcut bulustaki mikroorganizma, prokaryot mikroorganizmayi içerir, burada SEQ ID NO: 17 veya SEQ ID NO: 19 ile temsil edilen amino asit dizilimini içeren protein ifade edilir ve örnegin Escheri'chia sp., Shi'gella sp., Citrobacter sp.) Salmonella sp., Enterobacter sp., Yersi'nia Sp., Klebsi'ella sp., Erwz'm'a Sp., Corynebacterium Sp., Brevibacterz'um sp., Lactobacillus sp., Sllenomanas sp. ve Vibri'o sp.
Mikroorganizmasi olabilir Mevcut bulustaki mikroorganizma spesifik olarak, Corynebacterium cinsi mikroorganizmadir ve daha spesifik olarak Corynebacteri'um glutamicum°a aittir.
Mevcut bulusun bir düzenlemesinde, gelistirilmis putresin-biyosentez yolu araciligiyla yüksek bir yogunlukta putresin üretme yetenegine sahip olan Corynebacterium cinsi mikroorganizma modifiye edilmistir. Spesifik olarak putresin-üreten sus KCCM11138P, asiri putresin üreten sustur, burada ornitin 01537-P0028 biriktirme amaciyla ornitin karbamoiltransferaz (ArgF) kodlayan gen ve intraselüler glutamati artirmak amaciyla glutamat çikariciyi (NCgllZZl) kodlayan gen, ATCC13032 suslarindan çikarilir, ornitin dekarboksilaz (speC) kodlayan gen eklenir ve ornitin biyosentez genlerinin (argCJBD) ifade seviyesi artirilir. Bu nedenle bulusa göre mikroorganizmada, ornitin dekarboksilazin (SpeC) aktivitesi buraya ayrica uygulanabilir.
Mevcut bulusun diger bir düzenlemesi olan Coiynebacterium glutami'cum ATCCl3869-bazli putresin üreten sus DABlZ-a modifiye edilmistir. putresin üreten sus olan KCCM11138P ile ayni genotipe dayandirilmistir. Spesifik olarak putresin üreten sus DABlZ-a, American Type Culture Collection (ATCCYdan elde edilen ATCC13869 susundandir, burada ornitin karbamoiltransferazi (ArgF) kodlayan gen ve glutamati disariya çikarmak üzere protein NCg11221”i kodlayan gen çikarilir, E. C0!i'”den türetilen ornitin dekarboksilazi (ODC) kodlayan gen (speC) eklenir ve ornitin biyosentez gen operonunun (argCJ BD) baslaticisi, gelistirilmis baslatici ile degistirilir.
Mevcut bulusun bir düzenlemesine göre Corynebacterium cinsi (KCCM11138P) bir mikroorganizma, ornitin karbomoil transferaz (ArgF) kodlayan gen ve disari glutainat çikarilmasina dahil edilen, glutamat çikariciyi (NCgllZZl) kodlayan genin çikarilmasi, glutamattan ornitin sentezlenmesine dahil edilen bir enzimi kodlayan ArgCJBD gen kümesinin kendi baslaticisinin yer yer degistirmesi ve ornitin dekarboksilaz (ODC) kodlayan genin (speC) Corynebacterium glutamicum ATCC13032 susundaki kromozoma eklenmesi yoluyla hazirlanarak putresin üretme yetenegine sahip olabilir. KCCMlll38P°ye dayanarak, yüksek yogunluklu putresin içeren bir ortamda iyi bir sekilde gelisen bir klon (A15) seçilmistir ve seçilen A153in, NCglOlOO, NCglOlOl, NCglOlOZ, NCg10103 ve NCglOlO4 (Örnek 1) kodlayan genleri içerdigi dogrulanmistir. Buna ek olarak mikroorganizma, bes çesit gen arasindan NCg10101”i kodlayan gen nedeniyle, yüksek yogunluklu putresin içeren ortamda gelisir (Örnek 2). NCglOlOFi 01537-P0028 kodlayan genin karakteri ile ilgili olarak, NCg10101°i kodlayan genin asiri ifade edildigi (Örnek 3) bir susta putresin üretiminin azaltildigi ve NCglOlOPi kodlayan genin çikarildigi (Örnek 4) bir susta putresin üretiminin artirildigi dogrulanmistir.
Buna göre mevcut bulusçular, putresin üreten sus KCCM lll38P,deki NCglOlOl genini çikararak hazirlanan, gelistirilmis bir putresin üretme yetenegine sahip olan Corynebacterium glutamicum susunu, Corynebacterium glutamicum CCOl-0244 olarak adlandinnistir ve Korean Culture Center of Microorganisins”de (buradan itibaren “KCCM” olarak kisaltilmistir) Erisim No. KCCM11241P ile 26 Aralik 2011 tarihinde depolanmistir.
Mevcut bulusun, yukaridaki ainaçlari gerçeklestirmek üzere diger bir açisinda mevcut bulus, bir hücre kültürü besiyeri üretmek üzere, putresin üretme yetenegine sahip olan Corynebacterium glutamicum7un modifiye edilen bir mikroorganizmasinin kültürlenmesini içerir, burada mikroorganizma, SEQ ID NO. 17 veya SEQ ID NO. 19 ile temsil edilen bir amino asit dizilimi veya bunun bir ifadesine sahip olan bir protein, söz konusu proteinin aktivitesini zayiflatmak veya çikarmak ve söz konusu proteinin aktivitesine nazaran putresin üretimini ve ayni ancak modifiye edilmemis mikroorganizma susundaki putresinin üretimini artirmak amaciyla mikroorganizmada modifiye edilecek sekilde modifiye edilmistir, burada proteinin aktivitesi, l) proteini kodlayan bir polinükleotidin kisinen veya tamamen çikarilmasi, 2) polinükleotit ifadesinin bir azaltimi, 3) proteinin aktivitesini zayiflatmak üzere kromozom üzerindeki polinükleotit diziliminin bir modifikasyonu veya 4) bunlarin bir kombinasyonu yoluyla zayiflatilir; ayrica elde edilen hücre kültürü besiyerinden putresinin izole edilmesini içerir.
Mevcut bulustaki kültürleme prosesi, uygun ortamda ve teknikte bilinen kültürleine kosullari altinda gerçeklestirilebilir. Teknikte uzman kisiler, seçilen suslara bagli olarak kültürleme prosesini kolay bir sekilde ayarlayabilir ve 01537-P0028 kullanabilir. Kültürleme prosesinin bir örnegi kesikli, sürekli ve beslemeli-kesikli tür kültürleri içerir, ancak bunlar ile sinirli degildir. Kültür ortami, spesifik bir susun gerekliliklerini uygun bir biçimde karsilamak zorunda olabilir.
Kültür ortami, spesifik bir susun gerekliliklerini uygun bir biçimde karsilamak zorunda olabilir. Çesitli mikroorganizmalara yönelik kültür ortamlari açiklanir (örnegin "Manual of Methods for General Bacteriology" from American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)). Ortamda bir karbon kaynagi olarak, seker ve karbonhidratlar (örnegin, glikoz, sükroz, laktoz, früktoz, maltoz, melas, nisasta ve selüloz), tereyagi ve yag (ömegin, soya fasulyesi yagi, ayçiçegi tohumu yagi, yerfistigi yagi ve hindistancevizi yagi), yag asidi (örnegin, palmitik asit, stearik asit ve linoleik asit), alkol (örnegin, gliserol ve etanol) ve organik asit (örnegin asetik asit) ve benzerleri kullanilabilir. Bu maddeler, tek basina veya bir karisim olarak kullanilabilir. Nitrojen kaynagi olarak, nitrojen içeren organik bilesik (örnegin pepton, maya özütü, sigir eti özütü, malt özütü, misir maserasyon sivisi, soya küspesi tozu ve üre) veya inorganik bilesik (örnegin, amonyum sülfat, amonyum klorit, amonyum fosfat, amonyum karbonat ve amonyum nitrat) kullanilabilir ve bu maddeler ayrica, tek basina veya bir karisim olarak kullanilabilir. Bir fosfor kaynagi olarak potasyum dihidrojen fosfat veya dipotasyum hidrojen fosfat veya karsilik gelen sodyum içeren tuz kullanilabilir.
Buna ek olarak kültür ortami, gelisme için gerekli olan metal tuzu (örnegin, magnezyum sülfat veya demir sülfat) ve son olarak, amino asitler ve vitaminler gibi gelisme artirici temel maddeler, yukarida bahsedilen maddelere ek olarak kullanilabilir. Uygun öncül, kültür ortamina ilave olarak eklenebilir. Besin maddesi, bir kere veya kültürleme sirasinda yeteri kadar saglanabilir.
Kültürün pH7si, uygun bir temel bilesik (örnegin, sodyum hidroksit, potasyum hidroksit veya amonyak) veya asidik bilesik (örnegin, fosforik asit veya sülfürik asit) tarafindan ayarlanabilir. Köpürme, yag asidi poliglikolester gibi bir köpük önleyici ajan tarafindan ayarlanabilir. Kültürün aerobik kosulu, oksijen veya oksijen içeren hgaz karisimlari, örnegin hava eklenerek korunabilir. Kültürleme 01537-P0028 sicakligi tipik olarak 20 ila 45°C, spesifik olarak 25 ila 40°C olabilir. Kültürleme, putresin üretimi istenen maksimum düzeye ulasana kadar sürdürülebilir, genellikle 10 ila 160 saatte saglanir. Putresin, kültür ortamina salinabilir veya hücrede bulundurulabilir.
Mevcut bulusun kültürleme prosesinde üretilen putresini biriktirmeye ve elde etmeye yönelik yöntem açisindan hedef madde, kültür yöntemine, örnegin kesikli, sürekli veya beslemeli-kesikli tür kültüre bagli olarak teknikte bilinen uygun yöntem kullanilarak kültür ortamindan elde edilebilir.
Asagida mevcut bulus, asagidaki Örnekler ile daha detayli olarak açiklanacaktir.
Ancak bu Örnekler yalnizca gösterme amaçlidir ve bulusun bu Örnekler ile sinirlandirilmasi amaçlanmaz. Örnek 1: Putresin biyosentezine yönelik etkili genlerin seçilmesine yönelik kütüphane hazirligi ve klonlarin Seçilmesi Dogal Corynebacterium susunun kromozomundan putresin biyosentezine yönelik etkili genlerin elenmesi amaciyla, dogal Corynebacterium susunun bir kromozom kütüphanesi hazirlanmistir. Detayli olarak dogal Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 susundan özütlenen kromozom, restriksiyon enzimi Sau3AI ile klevaj edilmistir ve 5 ila 8 kb parçaciklar buradan seçilinistir ve ardindan bir kromozom kütüphanesi hazirlamak üzere E.coli-Corynebacterium mekik vektörü Bu sekilde hazirlanan Corynebacterium kromozom kütüphanesinden putresin biyosentezine yönelik etkili genleri seçme amaciyla, yüksek yogunluklu putresin içeren bir ortamda gelisen koloniler elde edilmistir. 01537-P0028 Bu sirada kütüphaneler, dönüsüm geçirenlerin her birini hazirlamak amaciyla, putresin üretme yetenegine sahip olan Corynebacterium cinsi (KCCMl 1 138P) bir mikroorganizmaya eklenmistir. 0.35 M putresin içeren minimal bir ortamda (10 tiyamin hidroklorid, 0.1 mg/l biyotin, l mM arginin, 25 mg/l kanamisin, 0.35 M putresin, pH 7.0) gelisebilen dönüsüm geçirenler seçilmistir.
Karbamoiltransferaz (argF) ve dogal Corynebacterium glutamicum susu ATCC çikarilmasi, dogal E.coli W kodlayan bir genin (speC), kromozoma eklenmesi ve glutamattan ornitin sentezlenmesine dahil edilen enzimi kodlayan argCJBD gen kümesinin baslaticisi, her bir dönüsüm geçirenin hazirlanmasi ainaciyla ikame edilerek hazirlanmis olan sus KCCM11138P, mevcut bulusçular tarafindan basvurusu yapilan bir patentte seçilmistir ve ikinci olarak yüksek yogunluklu putresin içeren ortamda iyi gelisen koloniler tanimlanmistir. Her bir kütüphane klonu elde edilmistir ve tekrar putresin susuna eklenmistir. Ardindan yüksek yogunluklu putresin içeren ortamda iyi gelisen koloniler belirlenmistir ve bu nedenle bir klon (A15) son olarak seçilmistir. Bu seçilen klon, siralama yoluyla belirlenmistir. Sonuç olarak klonun, dogrulanmistir, bunlarin N ucundaki 436 amino asidi çikarilmistir (SEKIL l).
SEKIL l, dogal Corynebacterium glutainicuin ATCC 13032 susunun kroinozomu genlerin göreli konumlarini gösteren sematik bir diyagramdir. 01537-P0028 Örnek 2: A15 klonunda putresin sentezine yönelik etkili genlerin belirlenmesi Örnek 2-1: A15 klonundaki 5 genin Klonlanmasi ve bir dönüsüm geçirenin hazirlanmasi Örnek 1°de elde edilen A15 klonunun nükleotit dizilimi halihazirda bilinmistir.
Daha önce belirtilen ATCC13032 susunun nükleotit dizilimine dayanarak, NCglOlOO geninin amplifikasyonuna yönelik primerler olarak SEQ ID NO 1 ve 2 ile temsil edilen NCglOlOO-F ve NCglOlOO-R, N ucundaki 436 amino asidi çikarilmis olan tNCglOlOO geninin amplifikasyonuna yönelik primerler olarak SEQ ID NO. 2 ve 3 ile temsil edilen NCglOlOO-R ve tNCglOlOO-F, NCglOlOl geninin amplifikasyonuna yönelik primerler olarak SEQ ID NO. 4 ve 5 ile temsil edilen NCglOlOl-F ve NCglOlOl-R, NCglOlO2 ve NCglOlO3 geninin amplifikasyonuna yönelik primerler olarak SEQ ID NO. 6 ve 7 ile temsil edilen NCglOlOZ-F ve NCglOlO3-R ve NCglOlO4 geninin amplifikasyonuna yönelik primerler olarak SEQ ID NO. 8 ve 9 ile temsil edilen NCglOlO4-F ve NCglOlO4- R olusturulmustur. Buna ek olarak ekspresyon baslaticinin p(CJ7) (veya pcj7) amplifikasyonuna yönelik primerler olarak SEQ ID NO. 10 ve 1 1 ile temsil edilen Ardindan 5 çesit gen parçasinin çogaltilmasi amaciyla, sablon olarak ATCC 13032 susunun kromozomu ve SEQ ID NO. 1 ila 9 ile temsil edilen her bir primer (30 saniye boyunca 95°Cide denatürasyon, 30 saniye boyunca 50°C3de tavlama ve 1 dakika ~ 1 dakika 30 saniye boyunca 72°C'de genisletme, 25 döngü) kullanilarak PCR gerçeklestirilmistir. Buna ek olarak baslatici parçasini çogaltmak amaciyla, SEQ ID NO. 10 ve 11 ile temsil edilen primerler ve bir sablon olarak Corynebacterium ammoniagenesîn kromozomu kullanilarak PCR gerçeklestirilmistir.
Kpnl ve Xbal ile klevaj edilen 5 gen ve EcoRV ve Kpnl ile klevaj edilen CJ7 01537-P0028 baslatici, toplam 5 çesit ekspresyon vektörünü; pHCl39T-P(CJ7)-NCglOlOO, NCglOlOZ-NCg10103 ve pHCl39T-P(CJ7)-NCglOlO4,ü hazirlamak amaciyla, EcoRV ve Xbal ile klevaj edilen bir ekspresyon vektörü olan pHC139T,ye (Kore Patent No. 10-0860932) baglanmistir.
AlS klonuna dahil edilen 5 geni ifade eden suslarin hazirlanmasina yönelik NCglOlOO-F (SEQ ID NO.
NCglOlOO-R (SEQ ID NO. tNCgtOlOO-F (SEQ ID NO.
NCglOlOl-F (SEQ ID NO.
NCglOlOl-R (SEQ ID NO.
NCglO i 02-F (SEQ ID NO.
NCglO lO3-R (SEQ ID NO.
(SEQ ID NO.
NCglO lO4-R (SEQ ID NO.
GCGTCTAGATTAATCAATGAAGACGAATACAATTCC GCGTCTAGATTAGGACAGTTCCGCTGGAGC 01537-P0028 A15 klonuna dahil edilen 5 geni ifade eden suslarin hazirlanmasina yönelik primerler P(CJ7)-F (SEQ CAGATATCGCCGGCATAGCCTACCGATG P(CJ7)-R (SEQ GCGTCTAGAGATATCAGTGTTTCCTTTCG Bu sekilde hazirlanan 5 çesit ekspresyon vektörü ve bir kontrol grubu pHCl39T, elektroporasyon yoluyla Örnek liin KCCM11138P susuna eklenmistir ve ardindan dönüsüm geçirenleri seçmek üzere, 25 tig/ml kanamisin içeren BHIS tabakalari üzerine yayilmistir. Örnek 2-2: Putresine yönelik etkili genlerin arastirilmasi Örnek 2-l”de elde edilen dönüsüm geçiren toplam 6 çesitten, yüksek yogunluklu putresin içeren ortamda iyi bir sekilde gelisen dönüsüm geçirenler, Örnek l7deki ayni yol ile seçilmistir (SEKIL 2). SEKIL 2, mevcut bulusta hazirlanan dönüsüm geçirenler arasinda gelisimin karsilastirilinasinin test sonucudur, burada 1, 2, 3, 4, ve 6, 6 çesit ekspresyon vektörü, sirasiyla pHCl39T, pHC139T-P(CJ7)- NCglOlOO, pHCl39T-P(CJ7)-tNCglOlOO, pHCl39T-P(CJ7)-NCglOlOl, karistirilan suslari temsil eder. SEKIL 2'de gösterildigi gibi, yalnizca pHC139T- P(CJ7)-NCglOlOl ile karistirilan dönüsüm geçirenler, yüksek yogunluklu putresin içeren ortamda kusursuz gelisim göstermistir ve dolayisiyla NCglOlOl, putresin biyosentezine yönelik etkili gen olarak seçilmistir. 01537-P0028 Örnek 3: NCg10101”i asiri ifade eden susta putresin üretme yeteneginin degerlendirilmesi Örnek 2sde etkili gen olarak belirlenen NCglOlOl genini asiri ifade eden susun Putresin üretme yetenegi degerlendirilmistir. Degerlendirmeye yönelik bir sus, pHCl39T-P(CJ7)-NCglOlOl,in putresin üreten sus KCCM11138P,ye eklenmesi yoluyla hazirlanmistir. pHC139T vektörü, elektroporasyon yoluyla putresin üreten sus KCCM 11138P°ye eklenmistir ve ardindan dönüsüm geçirenleri seçmek üzere 25 tig/ml kanamisin içeren BHIS tabakalari üzerine yayilmistir. Dönüsüm geçirenler sirasiyla KCCM lll38P/pHC-NCglOlOl olarak adlandirilmistir. Bu sekilde seçilen bu iki dönüsüm geçiren, 30°C”de 24 saat boyunca 1 mM arginin içeren CM tabakalarinda (1% glikoz, 1% polipepton, 05% agar, 1 L basina pH 6.8) kültürlenmistir ve ardindan bir hücre kültürü döngüsü, 25 ug/ml kanamisin içeren Tablo 27nin 25 ml titre ortaminda asilanmistir ve 30°C,de 96 saat boyunca 200 rpm,de çalkalanarak kültürlenmistir. Hazirlanan suslarin tümü, fermantasyon sirasinda ortama 1 mM arginin ilavesi ile kültürlenmistir. 01537-P0028 Bilesim Yogunluk (1 L basina) Glikoz %8 Soya proteini %025 Misir maserasyon katilan %05 KH2P04 %0.l Biyotin 100 ug Tiyamin Hidroklorit 3000 ug Kalsiyum-Pantotenik Asit 3000 ug Nikotinamid 3000 iig Sonuç olarak Tablo 3'te gösterildigi gibi, NCglOlOVnin asiri ifade edilmesi durumunda, putresin üretimi azalmistir.
Sus türü Putresin (g/L) 01537-P0028 Örnek 4: NCglOlOlî çikarildigi susta putresin üretme yeteneginin degerlendirilmesi Örnek 4-1: ATCC 13032 bazli putresin üreten susta NCglOlOPin çikarildigi susun hazirlanmasi NCglOlOl asiri ifadesi, yüksek yogunluklu putresin içeren ortamdaki hücre gelisimini artirmistir, ancak Örnek 39e göre putresin üretimini azaltmistir. Bu sonuca dayanarak, NCglOlOl”in çikarilmasinin putresin üretme yetenegi üzerindeki etkisi degerlendirilmistir.
Detayli olarak ATCC 13032 susunun NCglOlOl nükleotit dizilimine dayanarak, primerler olarak SEQ ID NO. 12 ve 13 ile temsil edilen NCglOlOl-del-F1_BamHI ve NCglOlOl-del-R1_Sall, NCglOlOl°in N ucu bölgesinin homolog bir rekombinant parçasini elde etmek amaciyla olusturulmustur. Primerler olarak SEQ ID NO. 14 ve 15 ile temsil edilen NCglOlOl-del-F2_Sall ve NCglOlOl-del- R2_Xbal, NCglOlOl 'in C ucu bölgesinin homolog bir rekombinant parçasini elde etmek amaciyla olusturulmustur (Tablo 4). NCglOlOl geninin N ucu ve C ucu bölgelerinin parçalari, iki çift primer kullanilarak PCR ile hazirlanmistir. PCR ürünlerine, sirasiyla BamHI & SalI and 8311 & XbaI uygulanmistir ve bunlar BamHI & Xbal uygulanan bir pDz vektörüne klonlanmistir. Klonlanan plazmit, pDZ-NCglOl 01 (K/O) olarak adlandirilmistir. 01537-P0028 NCglOlOl ”in çikarildigi suslarin hazirlanmasina yönelik primerler (SEQ ID NO. 12) CGGATTCCCTGCGATCATTG NCglO 1 0 1 -del-R1_SalI (SEQ ACGCGTCGAC NCglOlOl-del-F2_Sall (SEQ ACGCGTCGAC NCglO 1 0 1 -del-RZýXbal (s EQ CTAGTCTAGA KCCM 11138P ANCglOlOl susunu elde etmek amaciyla hazirlanan pDZ- eklenmistir ve ardindan 25 tig/ml kanamisin içeren BHIS tabakasi üzerine yayilmistir. Kromozomda vektörün basarili bir sekilde eklenmesi, koloninin X-gal (5-bromo-4-klor0-3-indolil-ß-D-galaktosid) içeren kati ortaminda mavi olup olmadigi gözlemlenerek dogrulanmistir. Birincil kromozom eklenen sus, besin arasinda seyreltilmistir ve X-gal içeren kati ortam üzerine yayilmistir. Kolonilerin çogunlugu mavi koloni olarak gözlemlenmistir, kolonilerin düsük bir orani, beyaz koloniler olarak gözlemlenmistir. NCglOlOl geni çikarilmis suslar, beyaz koloniler ile çift çaprazlama yoluyla son olarak seçilmistir ve SEQ ID NOS. 12 ve ile temsil edilen primerler kullanilarak PCR yoluyla tanimlanmistir. Bu sekilde tanimlanan varyantlar, KCCM 11138P ANCglOlOl olarak adlandirilmistir. 01537-P0028 Örnek 4-2: ATCC 13869 bazli putresin üreten susta NCglOlOl-çikarilmis susun hazirlanmasi Corynebacterium glutamicum ATCCl3032°ye dayanarak putresin üreten KCCM11138P susu ile ayni genotipe sahip olan Corynebacterium glutamicum çikarilmis, E.coli speC-eklenmis ve arg operon-argCJBD baslatici-sübstitüeli sus), NCglOlOl-çikarilmis suslari hazirlamak üzere kullanilmistir.
Detayli olarak Corynebacterium glutamicum ATCC13869Sdan türetilen NCg10101”i kodlayan geni ve bundan ifade edilen proteinin ainino asit dizilimini tanimlamak amaciyla, bir sablon olarak Corynebacterium glutamicum ATCCl3869”un Genomik DNAssi ve bir primer çifti ,SEQ ID NO. 12 ve 15 (NC glO l 0 l -del-F l_BamHl, NCglOl 01 -del-R2_Xbal) kullanilarak PCR gerçeklestirilmistir. Burada PCR reaksiyonu, 30 saniye boyunca 95°C7de 30 denatürasyon döngüsü, 30 saniye boyunca 53°C3de tavlama ve 2 dakika ve 30 saniye boyunca 72°C”de genisletme ile gerçeklestirilmistir. PCR ürünleri, elektroforez yoluyla ayrilmistir ve bunlarin dizilimleri analiz edilmistir. Dizilim analizi yoluyla, Corynebacterium glutamicum ATCCl3869”dan türetilen NCglOlOl'i kodlayan genin, SEQ ID NO. 18 ile temsil edilen bir nükleotit dizilimini içerdigi ve bu sekilde kodlanan proteinin SEQ ID NO. 19 ile temsil edilen amino asit dizilimini içerdigi belirlenmistir. Corynebacterium glutamicum ATCCl3032”den türetilen NCglOlOlîn ve Corynebacterium glutamicum ATCCl3869`dan türetilen NCglOlOlsin amino asit dizilimlerinin karsilastirilmasi durumunda, bunlar %98 dizilim homolojisi göstermistir. geni çikarmak amaciyla, NCglOlOl geninin N ucu ve C ucunun bölgesi, sablon olarak Corynebacterium glutamicum ATCC13869,un bir genomik DNA”si ve Örnek <4-1> ile ayni sekilde Tablo 4“te listelenen içi çift primer kullanilarak PCR yoluyla çogaltilmistir. Ardindan PCR ürünlerine, sirasiyla BamHl & Sall and Sall 01537-P0028 vektörüne klonlanmistir, böylece bir plazmit pDZ-2'NCglOlOl(K/O) olusturulmustur.
Plazmit pDZ-2'NCglOlOl(K/O), Örnek <4-1> ile ayni sekilde Corynebacterium glutamicum DAB12-a3ya dönüstürülmüstür ve NCglOlOPi kodlayan genin çikarildigi sus, seçilmistir. Seçilen Corynebacterium glutainicum varyanti, DAB12-a ANCglOlOl olarak adlandirilmistir. Örnek 4-3: NCglOlOPi çikarildigi susta putresin üretme yeteneginin degerlendirilmesi NCglOlOlîn çikarilmasinin putresin üreten sustaki putresin üretme yetenegi üzerindeki etkisini arastirmak amaciyla, Örnekler <4-l> ve <4-2>,de hazirlanan Corynebacterium glutamicum varyantlari karsilastirilmistir.
Detayli olarak iki çesit Corynebacterium glutamicum varyantindaki (KCCM putresin üretme yetenegi, örnek 3 ile ayni sekilde degerlendirilmistir. Asagidaki Tablo 5,te gösterildigi üzere putresin üretiminin, NCglOlOl ,in çikarilmasi ile artirildigi bulunmustur.
Sus türü Putresin (g/L) DAB12-a ANCglOlOl 11.0 01537-P0028 Birlikte ele alindiginda Örnekler 3 ve 43ün sonuçlari, putresin üretiminin, NCglOlO] ,i kodlayan genin asiri ifadesi ile azaltildigi ve dogal Corynebacterium glutamicum susundaki genin çikarilmasi artirildigini gösterir, bu durum, NCglOlOl 'in dogrudan putresin biyosentezini etkiledigine isaret eder.
Buna göre mevcut bulusçular, yukaridaki Ömekteki putresin üreten sus KCCM 11138P'deki NCglOlOl genini çikararak hazirlanan, gelistirilmis bir putresin üretme yetenegine sahip olan Corynebacterium glutamicum susunu, Corynebacterium glutamicum CC01-0244 olarak adlandirmistir ve 26 Aralik 20117de Budapeste Anlasmasi ile uluslararasi depolama otoritesi olan Korean Culture Center of Microorganismýde (buradan itibaren “KCCM” olarak kisaltilmistir) Erisim No. KCCM] 1241 P ile depolanmistir.
CJ CheilJedang Corporation <120> Gelistirilmis putresin üretkenligine sahip mikroorganizmalar ve bunlar kullanilarak putresin üretimine yönelik proses <130> OPA12195PCT <160> 26 Kopatentln 2.0 <210> 1 <21 l> 30 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> Öncül <400> 1 <210> 2 <21 l> 32 01537-P0028 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> Öncül <400> 2 <210> 3 <21 1> 26 <212> DNA <213> Yapay DiZi <220> <223> Öncü] <400> 3 <210> 4 <21 1> 31 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> Öncül <400> 4 <210> 5 <21 l> 30 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> Öncül <400> 5 01537-P0028 <210> 6 <21 1> 28 <212> DNA <2 1 3> Yapay Dizi <220> <223> Öncül <400> 6 <210> 7 <21 1> 36 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> Öncül <400> 7 <210> 8 <21 1> 27 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> Öncü] <400> 8 <210> 9 <21 1> 30 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> Öncül 01537-P0028 <400> 9 <210> 10 <21 l> 28 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> Öncül <400> 10 <210> 1 1 <21 1> 29 <212> DNA <2 1 3> Yapay Dizi <220> <223> Öncül <400> 11 <210> 12 <21 1> 28 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> Öncül <400> 12 <210> 13 <21 l> 31 <212> DNA <213> Yapay Dizi 01537-P0028 <220> <223> Öncül <400> 13 <210> 14 <21 1> 31 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> Öncül <400> 14 <210> 15 <21 l> 30 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> Öncül <400> 15 <210> 16 <21 1> 1389 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum 01537-P0028 <400> 16 93399C9953 <210> 17 <211> 462 <212> PRT nectqqtth <213> Corynebacterium glutamicum qchtaccag 01537-P0028 <400> 17 1:11: 01537-P0028 <210> 18 <211> 1389 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 18 01537-P0028 93399C9933 <210> 19 <211> 462 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum cantaitacg 01537-P0028 <400> 19 01537-P0028 Leu Lys Ala Gly Asp Tyr Leu Ala 01537-P0028 <210> 20 <211> 319 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 20 01537-P0028 <210> 21 <211> 533 <212> PRT <2 1 3> Corynebacterium glutamicum <400> 21 01537-P0028 <210> 22 <211> 711 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum 01537-P0028 <400> 22 1.0:: (311.1 01537-P0028 .1.65 01537-P0028 <210> 23 <211> 357 <212> PRT Giy Val Ban Leu Leu Pro Gly Phe Ser Pro Sor Glu ?hr asp Ala Asp Gly Val Lys krq <213> Corynebacterium glutamicum <400> 23 1.611 01537-P0028 <210> 24 <211> 388 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 24 01537-P0028 <210> 25 <211> 317 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 25 1.9 11 <210> 26 <211> 391 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum 01537-P0028 <400> 26 Met Ser Thr Leu Glu Thr rrp Pro Gln vai Ile Iie Asn Thr Tyr Giy 1 5 10 15 25 30 Asp Gin Giy Asu Vai Ty: Ile Asp Leu Leu Ala Giy Ile Ala Val Ann 40 45 Ala Lou Gly His Ala His Pro Ala Il. Il. Glu Ala Val Thr Asn Gln 50 55 60 01537-P0028 HisGlu 01537-P0028

Claims (6)

  1. ISTEMLER Putresin üretme yetenegine sahip Coifynebacterium glutami'cumun bir rekombinant mikroorganizmasidir, burada mikroorganizma, SEQ ID NO: 17 veya SEQ ID NO: 19 ile temsil edilen bir amino asit dizilimine sahip olan bir protein veya bunun bir ifadesi, söz konusu proteinin aktivitesini zayiflatmak veya ortadan kaldirmak ve söz konusu proteinin aktivitesine nazaran putresin üretimini ve ayni olan ancak modifiye edilmemis olan mikroorganizma suslarinda putresin üretimini artirmak üzere modifiye edilir, burada proteinin aktivitesi, l) proteini kodlayan bir polinükleotidin kismen veya tamamen çikarilmasi, 2) polinükleotit ifadesinin bir azaltimi, 3) proteinin aktivitesini zayiflatmak üzere kromozom üzerindeki polinükleotit diziliminin bir modifikasyonu veya 4) bunlarin bir kombinasyonu yoluyla zayiflatilir.
  2. Istem l,e göre mikroorganizmadir, burada ornitin dekarboksilazin (SpeC) aktivitesi, ayrica buna eklenir.
  3. Istem 2,ye göre mikroorganizmadir, burada omitin dekarboksilaz, SEQ ID NO: 22 ile temsil edilen ainino asit dizilimine sahiptir. .
  4. Istem l”e göre mikroorganizmadir, burada ornitin karbomoiltransferaz (ArgF) ve glutamat çikaricidan (NCg11221) olusan gruptan seçilen bir veya daha fazla rekombinant mikroorganizmadaki aktiviteler, ayni ancak modifiye edilmemis sustaki ayni proteinin aktivitesine nazaran ayrica zayiflatilir. .
  5. Istem 4°e göre mikroorganizmadir, burada ArgF, SEQ ID NO: 20 ile temsil edilen amino asit dizilimine sahiptir ve NCgllZZl, SEQ ID NO: 21 ile temsil edilen amino asit dizilimine sahiptir.
  6. 6. istem l”e göre mikroorganizmadir, burada asetil gamma glutamil fosfat redüktaz (ArgC), asetil glutamat sentaz veya omitin asetiltransferaz (ArgJ), asetil glutamat kinaz (ArgB) ve asetil ornitin amino transferazdan (ArgD) olusan gruptan seçilen bir veya daha fazla rekombinant mikroorganizmadaki aktiviteler, ayni ancak modifiye edilmemis sustaki ayni proteinin aktivitesine nazaran ayrica gelistirilir. Istem 6,ya göre mikroorganizmadir, burada ArgC, ArgJ, ArgB ve ArgD, sirasiyla SEQ ID NO: 23, 24, 25 ve 26 ile temsil edilen amino asit dizilimlerine sahiptir. Asagidaki adimlari içeren putresin üretimine yönelik bir yöntemdir: bir hücre kültür besiyeri üretmek amaciyla, putresin üretme yetenegine sahip Corynebacterium glutamicumun modifiye edilen bir mikroorganizmasinin kültürlenmesi, burada mikroorganizma, SEQ ID NO: 17 veya SEQ ID NO: 19 ile temsil edilen bir amino asit dizilimine sahip olan bir protein veya bunun bir ifadesi, söz konusu proteinin aktivitesi zayiflatilacak veya ortadan kaldirilacak sekilde ve söz konusu proteinin aktivitesine nazaran, putresin üretimi ve ayni olan ancak modifiye edilmeyen mikroorganizma susundaki putresin üretimi artirilacak sekilde modifiye edilmistir, burada proteinin aktivitesi 1) proteini kodlayan bir polinükleotidin kismen veya tamamen çikarilmasi, 2) polinükleotit ifadesinin bir azaltimi, 3) proteinin aktivitesini zayiflatmak üzere kromozom üzerindeki polinükleotit diziliminin bir modifikasyonu veya 4) bunlarin bir kombinasyonu yoluyla zayiflatilir ve elde edilen hücre kültür besiyerinden putresinin izole edilmesi.
TR2018/10509T 2012-01-20 2013-01-21 Geliştirilmiş putresin üretkenliğine sahip rekombinant mikroorganizma ve bunu kullanarak putresin üretmeye yönelik yöntem. TR201810509T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20120007004 2012-01-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201810509T4 true TR201810509T4 (tr) 2018-08-27

Family

ID=48799483

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/10509T TR201810509T4 (tr) 2012-01-20 2013-01-21 Geliştirilmiş putresin üretkenliğine sahip rekombinant mikroorganizma ve bunu kullanarak putresin üretmeye yönelik yöntem.

Country Status (14)

Country Link
US (1) US9290771B2 (tr)
EP (1) EP2806022B1 (tr)
JP (2) JP6251187B2 (tr)
KR (1) KR101493586B1 (tr)
AU (1) AU2013210136B2 (tr)
BR (1) BR112014017910B1 (tr)
DK (1) DK2806022T3 (tr)
ES (1) ES2682696T3 (tr)
IN (1) IN2014MN01621A (tr)
MY (1) MY173018A (tr)
PL (1) PL2806022T3 (tr)
RU (1) RU2603089C2 (tr)
TR (1) TR201810509T4 (tr)
WO (1) WO2013109121A1 (tr)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101607741B1 (ko) 2013-03-20 2016-03-31 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신 생산 재조합 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법
RU2653453C1 (ru) * 2014-04-25 2018-05-08 СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн Микроорганизм для продуцирования путресцина и способ получения путресцина с его использованием
KR101773135B1 (ko) * 2015-05-08 2017-08-30 씨제이제일제당 주식회사 1,4-디아미노부탄의 정제방법
WO2020138543A1 (ko) * 2018-12-27 2020-07-02 씨제이제일제당 (주) 오르니틴 탈탄산 효소의 변이주 및 그의 응용

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR920007401B1 (ko) 1990-06-21 1992-08-31 제일제당 주식회사 다발성 절단부위를 지닌 대장균과 코리네형 세균에서 발현 가능한 신규 셔틀벡터
EA010179B1 (ru) 2004-07-15 2008-06-30 ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. Биохимический синтез 1,4-бутандиамина
KR100620092B1 (ko) 2004-12-16 2006-09-08 씨제이 주식회사 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법
KR20090096689A (ko) 2006-09-30 2009-09-14 오스람 게젤샤프트 미트 베쉬랭크터 하프퉁 보조 보호 회로를 구비한 전원 및 전자식 안정기
KR100860932B1 (ko) 2007-02-08 2008-09-29 씨제이제일제당 (주) 신규한 프로모터 및 이의 용도
KR101188432B1 (ko) * 2008-04-10 2012-10-08 한국과학기술원 퓨트레신 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신의 제조방법
MY175283A (en) 2008-04-10 2020-06-18 Korea Advanced Inst Sci & Tech Mutant microorganisms having high ability to produce putrescine and method for producing putrescine using the same
KR101348461B1 (ko) 2010-12-08 2014-01-08 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법

Also Published As

Publication number Publication date
DK2806022T3 (en) 2018-08-13
BR112014017910B1 (pt) 2022-04-26
RU2014133769A (ru) 2016-03-20
CN104136600A (zh) 2014-11-05
IN2014MN01621A (tr) 2015-07-03
WO2013109121A1 (ko) 2013-07-25
EP2806022B1 (en) 2018-05-23
AU2013210136B2 (en) 2016-07-07
KR101493586B1 (ko) 2015-02-16
KR20130086010A (ko) 2013-07-30
JP6251187B2 (ja) 2017-12-20
EP2806022A1 (en) 2014-11-26
ES2682696T3 (es) 2018-09-21
PL2806022T3 (pl) 2018-12-31
JP2015506686A (ja) 2015-03-05
EP2806022A4 (en) 2015-10-07
US20140363859A1 (en) 2014-12-11
BR112014017910A2 (pt) 2017-11-28
MY173018A (en) 2019-12-19
RU2603089C2 (ru) 2016-11-20
US9290771B2 (en) 2016-03-22
AU2013210136A1 (en) 2014-09-11
JP2017006133A (ja) 2017-01-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2016203949B2 (en) Recombinant Microorganism Having Improved Putrescine Producing Ability And Method For Producing Putrescine By Using Same
EP0088166A2 (en) Method for expressing a gene
JP2023507482A (ja) グアニジノ酢酸の発酵生産方法
US11884951B2 (en) Method for producing RNA
RU2683551C1 (ru) Микроорганизм, обладающий продуктивностью по L-лизину, и способ получения L-лизина с использованием этого микроорганизма
RU2663135C2 (ru) Микроорганизм, обладающий улучшенной способностью к продуцированию l-лизина, и способ производства l-лизина с использованием данного микроорганизма
TW201623617A (zh) 具有腐胺生產力之微生物及使用其產生腐胺之方法
RU2651505C1 (ru) Микроорганизм Corynebacterium с улучшенной способностью продуцировать L-лизин и способ получения L-лизина с его помощью
TR201810509T4 (tr) Geliştirilmiş putresin üretkenliğine sahip rekombinant mikroorganizma ve bunu kullanarak putresin üretmeye yönelik yöntem.
TW201546279A (zh) 用於製造腐胺之微生物及使用該微生物製造腐胺之方法
JP2018528771A (ja) L−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物及びそれを用いたl−リジン生産方法
KR20090018531A (ko) 신규한 코리네박테리움 글루타미쿰 프로모터
JP2008283863A (ja) L−アミノ酸生産菌及びl−アミノ酸の製造方法
US7033802B1 (en) Penicillin binding protein gene and process for producing L-glutamic acid
TWI510621B (zh) 具有增加之腐胺生產力之重組微生物及使用該微生物之製造腐胺之方法
RU2819270C1 (ru) Микроорганизм для продуцирования L-аминокислоты, обладающий повышенной активностью цитохрома С, и способ получения L-аминокислоты с его использованием
CN114008206A (zh) 具有增强的细胞色素c活性的l-氨基酸生产微生物及使用其的l-氨基酸生产方法