KR920007401B1 - 다발성 절단부위를 지닌 대장균과 코리네형 세균에서 발현 가능한 신규 셔틀벡터 - Google Patents

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내용 없음.

Description

다발성 절단부위를 지닌 대장균과 코리네형 세균에서 발현 가능한 신규 셔틀벡터

제1도는 코리네형 세균과 대장균에서 발현되는 셔틀벡터(Shuttle vector)pECCG1으로부터 축소된 셔틀벡터의 제작도이다.

제2도는 축소된 셔틀벡터에 다발성 절단부위(Multiple cloning site)를 도입시킨 신규 셔틀벡타 pECCG122와 pECCG123의 제작도이다.

본 발명은 기 출원된(출원번호 89-5569)신규 복합프라스미드 pECCG1 및 pECCG2(미생물 수탁번호 KFCC-10673, 10674)중 pECCG1을 사용하여 제1도에 도시한 것과 같이 양 숙주에서 안정하게 복제 발현 유지되는데 필요치 않은 DNA절편을 제거하여 크기를 줄이고, 또한 유전자 라이브러리(genomic library)의 제작 및 서브크로닝(Subcloning)에 유용하게 사용할 수 있도록 다발성 절단부위를 도입한 신규 셔틀벡터에 관한 것이다. pECCG1셔틀벡터는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium gluLamicum) ATCC13058로부터 분리된 크립틱 프라스미드(Cryptic plasmid)pCB1를 제한효소인 Bc11으로 절단한 것과 대장균에서 발현되는 엠피실린(Ampicillin)과 가나마이신(Kanamycin)마커 유전자를 지닌 pACYC 177을 BamH1으로 절단하여 T4 DNA 리가제(T4 DNA ligase)로 접합한 6.94kb의 셔틀벡터로 대장균 및 코리네형 세균에서 모두 복제되며 안정되게 유지되는 프라스미드이다.

그런데 프라스미드 pECCG1은 코리네형 세균에서 엠피실린 마커유전자가 발현되지 않아 이를 제거하고, 더불어 프라스미드 pCB1에서 복제에 관련되지 않은 DNA절편을 제거하여 4.9kb의 셔틀벡터를 제작하였다. 축소된 셔틀벡터로 대장균과 코리네형 세균에서 모두 복제되며 안정하게 유지됨을 확인하였다. 그런데 유전자 라이브러리의 제작과 서브크로닝을 통해 외부 유전자를 숙주에서 발현, 원하는 산물을 대량생산하기위해서는 다발성 절단부위의 도입이 요구된다. 따라서, 축소된 셔틀벡터에 존재하지 않는 여러 제한효소부위를 지닌 다발성 절단부위를 도입하여 대장균 및 코리네박테리움 글루타미쿰에서 복제되며, 안정되게 유지되는 신규 셔틀벡터를 제작함으로써 본 발명을 완성하였다.

또한 종전 코리네형 세균에서 사용해온 원형질체 형질전환법(Protoplast transformation)은 형질전환체(Transformant)를 얻는데 수일이 걸리고 형질 전환빈도도 낮아 크로닝에 불편하였다. 따라서 본 발명에서는 전기장 충격법 (Electrotransformation)을 사용하여 10⁸형질변환체/ug plasmid DNA이상의 높은 형질 전환빈도를 얻는 방법을 개발하여 코리네형 세균에서의 크로닝 작업을 획기적으로 개선하였다.

본 발명에서 사용한 균주 및 프라스미드는 표 1과 같다.

[표 1 본 발명에 사용된 균주 및 프라스미드]

Km : Ka㎚ycin, Amp : Ampicillin, ACE : S-Aminoethyl cysteine

Hse : Homoserine, Leu : Leucine

대장균 및 코리네박테리움의 배양에는 LB배지(1% 트립톤, 0.5% 효모엑기스, 1% NaCl, pH 7.0)를, 전기장 충격법에 의한 형질전환후 발현(Expression)시에는 S O.C.배지(2% 트립톤, 0.5% 효모엑기스, 10mM NaCl, 2.5mM KC1, 10mM MgCl₂, 10mM MgSO₄, 20mM 포도당)를 각각 사용하였다. 또한 필요한 경우 가나마이신 50ug/㎖의 농도가 되도록 첨가하였다. 전기장 충격법에 의한 형질전환에는 BIO-RAD사 제품의 진 펄서(Gene pulser, 165-2076), 펄스조절기(Pulse controller, 165-2098), 0.2㎝간격의 진 필서큐벳(Gene pulser cuvette, 165-2086)을 사용하였다.

본 발명의 상세한 내용은 다음의 실시예와 같다.

[실시예 1]

pECCG1 및 기타 프라스미드의 분리 정제

대장균의 프라스미드 분리는 보편적으로 널리 쓰이는 알칼라인 라이시스(Alkaline lysis, Birnboim, H.C.and Doly, J.Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523)법을 준해 행하였으며 코리네형 세균으로부터 프라스미드의 대량, 소량 신속분리는 위 방법을 변형하여 아래와 같이 수행하였다.

1) 프라스미드의 소량, 신속분리

2㎖의 50ug/㎖의 가나마이신을 함유한 LB배지에 분리된 콜로니를 접종하여 30℃에서 하룻밤 진탕 배양한 뒤 12,000rpm에서 2분간 원심분리하여 세포를 얻었다. 여기에 50mM 포도당, 10mM EDTA, 25mM Tris-HCl(pH 8.0), 50㎎/㎖라이소자임으로 구성된 용액을 150ul 넣어 균체를 현탁시키고 37℃에서 250rpm으로 회전시키며 1.5시간 반응시켰다. 1% SDS, 0.2N NaOH 용액 300ul을 넣어 잘 섞어준 뒤 다시 얼음에 10분 방치시킨 후 12,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취했다. 이 상등액에 TE완충용액(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA)로 포화된 폐놀, 크로르포름액을 동일 부피 넣고 섞어준 뒤 12,000rpm에서 5분간 원심분리하여 상층을 취하고 여기에 동일 부피의 크로르포름 : 이소아밀알콜(24 : 1)액을 넣어 다시 섞어준 뒤 동일한 방법으로 원심분리를 행하였다. 얻은 상층용액에 동일부피의 이소프로판올을 첨가하고 얼음에 15분 방치 후 12,000rpm에서 15분 원심분리하여 DNA침전을 얻었다. 이를 70% 에탄올로 세척하고 다시 원심분리한 후 침전된 DNA을 얻었으며 이를 건조시킨 뒤 여기에 20-50ul의 TE완충용액이나 살균된 증류수를 넣어 DNA를 녹여 실험에 사용하였다.

2) 프라스미드의 대량분리

50ug/㎖의 가나마이신을 함유한 LB배지에서 하룻밤 배양한 배양액 50-100㎖을 0.3u/㎖페니실린 G가 첨가된 LB항생제 함유 배지 1ℓ에 접종하여 600㎚ 흡광도가 약 2-3이 될때까지 배양한 다음 원심분리하고 세포를 앞서 언급한 조성의 라이소자임 용액 50㎖에 현탁사켰다. 교반을 하여 37℃에서 1.5시간 반응시킨 뒤 100㎖ 0.2N NaOH, 1% SDS를 첨가하여 잘 섞어준 후 얼음에 10분 방치하고 여기에 3M Sodiumacetate(pH 4.6)를 첨가하여 얼음에 15분간 방치시킨 뒤 8,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 여기에 2부피의 에탄올을 넣어 -20℃ 냉장고에 30분 방치시키고 8,000rpm에서 20분 원심분리하여 DNA침전을 얻은 뒤 70% 에탄올로 세척하고 건조시킨 뒤 10-20㎖의 TE완충용액에 녹였다. 여기에 1㎖당 0.96g의 CsCl을 넣고 1㎖의 에티디움 브로마이드 용액(Ethidium bromide, 10㎎/㎖)을 넣어 초고속원심분리기(Beckman 70.1 Ti rotor)을 사용하여 50,000rpm에서 48시간 원심분리시킨 뒤 주사기로 프라스미드 DNA를 분리하고 이소프로판올로 에티디움 브로마이드의 제거, 에탄올 침전, 70% 에탄올 세척을 한뒤 건조하였다. 이를 500ul TE완충용액이나 멸균 증류수에 녹여 4℃에 보관하며 사용하였다. 프라스미드는 0.8-1% 아가로스젤(Agarose gel)에서 전기 영동한 후 확인하였다.

[실시예 2]

pECCG1으로부터 축소된 셔틀벡타의 제작

기 제작된 pECCG1 셔틀벡타를 실시예 1의 방법에 따라 분리하여 제1도에 나타낸 것과 같이 Bg1I과 Bg1Ⅱ로 절단한 뒤 멍빈 뉴크리아제(Mung-bean nuclease)로 브런트 말단(Blunt end)를 만든 뒤 T4DNA리가제(T4 DNA ligase)로 15℃에서 15시간 반응시켜 접합시켰다. 이를 대장균 숙주 DH 5에 형질전환시켜 50ug/㎖의 가나마이신을 함유하는 LB배지에 도말하여 형질전환체를 얻은 뒤 프라스미드를 신속분리시키고 전기 영동을 실시하여 5.6kb셔틀벡터인 pECCG12를 얻었다. 이를 다시 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에 넣어 형질전환시켜 셔틀벡터가 복제되며, 안정하게 유지됨을 확인하였다. 이 pECCG12로부터 다시 약 700bp의 Pvu I DNA단편을 제거하고 위의 방법을 거쳐 4.9kb의 셔틀벡터 pECCG121을 제작하였다.

6.94kb 크기의 기 제작된 셔틀벡터 pECCG1으로부터 얻어진 5.6kb, 5.1kb크기의 셔틀벡터 pECCG12 및 pECCG121는 대장균 및 코리네형 세균에서 모두 복제되는 것으로 양 숙주에서 복제에 필요한 복제점(Replication origin)이 손상받지 않은 안정한 셔틀벡터이다.

[실시예 3]

다발성 절단부위의 설정

실시예 2에서 제작된 pECCG12 및 pECCG121에 다발성 절단부위를 도입하기 위해 여리가지 제한효소를 사용하여 위의 셔틀벡터의 절단을 실험해 본 결과 표 2와 같은 제한효소 위치가 위의 셔틀벡터에 없음을 알수 있었다.

[표 2 pECCG12 및 pECCG121를 절단하지 못하는 제한효소의 종류]

[실시예 4]

[다발성 결단부위의 도입]

실시예 3에서 조사한 pECCG12 및 pECCG121에 있지 않은 제한효소 부위들을 지니고 있는 다발성 절단부위를, pBluescript Ⅱ KS⁺(2.96kb)로부터 분리해 위 두 셔틀벡터에 도입시켰다(제2도). 우선 약 170bp의 다발성 절단부위를 지닌 pBluescript Ⅱ KS⁺를 대량 분리정제한 뒤 BssHⅡ 제한효소로 절단하여 저융점 아가로즈겔(Low melting temperature agarose gel)에서 전기영동한 후 다발성 절단부위의 DNA절편을분러리였다. 분리된 젤을 68℃에서 10분간 가열하여 녹인 뒤 페놀 추출 및 크로르포름처리, 에탄올 침전을 통해 DNA절편을 얻었다. 이를 크레노우 프레그먼트(Klenow fragment)처리를 한뒤, BstE Ⅱ 제한효소로 절단된 셔틀벡터 pECCG12 및 pECCG121을 마찬가지로 크레노우 프레그먼트 처리와 카프 인테스틴 포스파타제(Calf intestine phosphatase)처리를 하여 서로 0.1ug대 1ug의 비로 섞어 T4 DNA리가제로 15℃에서20시간 접합한 뒤 대장균 DH 5에 도입시켜 형질전환체를 획득하였다. 얻어진 형질전환체로부터 프라스미드를 분리하여 아가로즈 젤 전기영동을 통해 크기를 확인하고 다발성 절단부위 내 제한효소로 처리하여 다발성 절단부위의 도입을 확인하였다. 다발성 절단부위내에는 Kpn I, Dra Ⅱ, Apa I, Xho I, HincⅡ, Acc I, Sal I, Cla I, Hind Ⅲ, EcoR V, EcoR I, Pst I, Sma I, BamH I, Spe I, XbaI, Not I, Eag I, Sac I 시이트(Site)를 1개씩 지니고 있다. 또한 대장균에서 분리된 다발성 절단부위를 지닌 셔틀벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에 도입하여 복제, 발현됨을 확인하였다.

[실시예 5]

[다발성 절단부위를 지닌 신규 셔틀벡터 pECCG117 및 pECCG122의 안정성(Stability)실험]

셔틀벡터의 안정성을 알아보기 위해 pECCG117 및 pECCG122가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰ATCC 13032를 LB Km 및 LB 배지에 접종하여 30℃에서 진탕배양하고 시간별로 세포배양액을 취해 적절히 희석한 뒤 LB Km 및 LB한천 평판배지위에 도말하여 콜로니(Colony)수를 세어 안정성을 점토하거나 LB 배지에서 성장한 콜로니를 투스피크(Tooth pick)로 LB Km 배지에 옮겨 안정성을 검토하였다. 세대수가 증가함에 따라 안정성이 유지되는 것을 확인하기 위해 균이 정지기에 들어가기 전에 새로운 LB Km 및 LB배지에 접종(1/100부피)을 계속 해가며 시간별로 시료를 취해 안정성을 점토했다.

프라스미드의 안정성은 다음과 같이 계산하였다.

안정성 실험결과 25세대(Generation)이상 가나마이신 첨가 유무에 관계없이 셔틀벡터의 안정성이 유지되었다. 또한 숙주세포인 코리네 박테리움 클루타미쿰 ATCC 13032가 pECCG117 및 pECCG122를 함유하여도 숙주의 성장속도를 크게 저해시키지 않음을 확인하였다.

[실시예 6]

[전기장 충격법에 의한 코리네형 세균의 형질전환]

LB 배지에서 14-15시간 배양한 코리네 박테리움 클루타미쿰 ATCC 13032를 1L 1B배지이 초기 흡광도(600㎚) 0.07 내지 0.1되게 접종한 후 30℃에서 진탕 배양하고 흡광도가 0.3에 달했을때 페니실린 G 최종농도가 0.3unit/㎖이 되게 첨가한 뒤 흡광도 0.6이 될때까지 배양하였다. 이 균체를 원심분리한 뒤 1L 1mM HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N'-(2-ethansulfonnic acid)]완충용액(pH 7.0)에 현탁하고 재차 원심분리하고 다시 500㎖의 차가운 멸균 탈이온 증류수에 현탁시켰다. 이를 다시 원심분리한뒤 균체를 20㎖의 10% 글리세롤 용액에 현탁하여 최종 균체농도를 2-4×10⁸/㎖로 조정하여 사용하였다. 이 세포 현탁액을 드라이아이스 에탄올로 냉동시킨 뒤 -70℃에 보관하면 적어도 1개월간 형질전환 변도의 감소없이 사용할 수 있었다. 엘리쿼트(Aliquots)로 보관된 세포 현탁액 40ul를 얼음속에서 녹인 뒤 여기에 1ng-1ug의 프라스미드 DNA를 가해 축전량(Capacitance) 및 전기장의 세기를 25uF 및 12.5㎸/㎝에 고정하고 200-400Ω의 저항에서 1회의 전기장 충격 후 즉시 1㎖의 S.O.C.배지를 넣어 섞은 뒤 멸균 시험관으로 옮겨 30℃에서 1시간 동안 진탕배양하였다. 이를 적절히 희석하여 LB km한천 평판배지에 도말하여 1-2일후 형질전환체를 얻을 수 있었다. 야생균주인 코리네박테리아 글루타미쿰 ATCC 13032의 경우는 10⁷-10⁸형질 전환체/ug plasmid DNA의 형질전환 빈도를 보였으며 이는 언형질체 사용 형질전환 빈도인 10⁴/ug DNA보다 훨씬 높아 이러한 방법을 통해 용이하게 코리네형 세균에서의 유전자조작을 수행할 수 있었다. 한예로 pECCG117을 사용한 유전자 라이브러리를 제작하여 코리네박테리아 글루타미쿰 ATCC 13032를 형질전환 시도한 결과 5×10⁵형질전환체/ug DNA이상의 형질전환 빈도를 보여 크로닝 작업을 용이하게 수행할 수 있었다.

Claims (7)

1. 코리네박테리움 글루타미쿰 및 대장균에서 복제되며, pBlueschpt Ⅱ KS⁺다발성 절단부위를 지닌 셔틀벡터.
2. 제1항에 있어서, pBluescript Ⅱ KS⁺다발성 절단부위가 코리네박테리움 글루타미쿰 및 대장균에서 복제되며, pACYC177을 BamHI으로, pCB1을 BClI으로 결단하여 T4 DNA 리가제로 결합하여 만든 pECCG1에 도입됨을 특징으로 하는 셔틀벡터.
3. 제2항에 있어서, 셔틀벡터가 pECCG122(KFCC1 0696)임을 특징으로 하는 셔틀벡터.
4. 제2항에 있어서, 셔틀벡터가 pECCG123(KFCC10697)임을 특징으로 하는 셔틀벡터.
5. 셔틀벡터 pECCG122(KFCC10696) 및 pECCG123(KFCC10697)의 복제성 및 항생제 내성의 기능을 손상시키지 않으면서 외부유전자가 도입된 재조합 플라스미드.
6. 셔틀벡터 pECCG122(KFCC10696) 및 pECCG123(KFCC10697)의 복제성 및 항생제 내성의 기능을 손상시키지 않으면서 외부유전자가 도입된 재조합 플라스미드로 형질전환시킨 대장균 및 코리네박테리움 글루타미쿰.
7. 제6항에 있어서, 형질전환은 0.1-1.0unit/㎖의 페니실린 G가 첨가된 배지에서 전기장충격법에 의해 이루어짐을 특징으로 하는 대장균 및 코리네박테리움 글루타미쿰.

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