NO173452B

NO173452B - Fremgangsmaate for fremstilling av polypeptider i streptomyceter

Info

Publication number: NO173452B
Application number: NO85851971A
Authority: NO
Inventors: Klaus-Peter Koller
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1984-05-17
Filing date: 1985-05-15
Publication date: 1993-09-06
Also published as: ES8704540A1; EP0161629A1; DK217285D0; DE3418274A1; IL75214A; ZA853672B; FI81113C; PT80483B; PT80483A; ATE36167T1; JPH0797993B2; NO173452C; ES543120A0; HU197351B; DK172458B1; DK217285A; HUT38670A; AU4264085A; IL75214A0; NZ212085A

Abstract

Et 20-35 aminosyrer omfattende prepeptid med formel. hvori X betyr et hydrofobt område med 10-2 5. aminosyrer, virker i Streptomyceter som signålpeptid, som fjerner et aminoterminalt dermed sammenknyttet peptid fra cellen og utskiller i kulturmediet. En tilsvarende genstruktur kan innbygges foran et strukturgen og bevirker da ved ekspresjon ekskresjon av. det ønskede peptid i kulturmediet. Hertil modifiseres egnede plasmider ved innbygging av slike gener, og vertsorgan-ismer, spesielt Streptomyceter, transformeres dermed.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av polypeptider fra genetisk kodbare aminosyrer.

I den tyske patentsøknad P 33 31 860.3 ble det allerede foreslått en fremgangsmåte til fremstilling av tendamistat ved fermentering av Streptomyces tendae, i det fremgangsmåten er karakterisert ved at tendamistat-produserende S.tendae-stammer anvendes og behandles med subletale doser av Acriflavin. Fra således dannede stammer ble det isolert et DNA-fragment med genet for tendamistat, nemlig et 2,3 kb-Pst I-fragment. Vedinnbygging av dette fragmentet i Pst I kuttede pBR 322 kunne dette DNA amplifiseres i E. coli og igjen isoleres.

Det ble nå funnet at på dette 2,3 kb-fragment umiddelbart før strukturgenet for tendamistat er det kodet et signålpeptid (prepeptid) med formel I

i det X betyr et hydrofobt området som omfatter 17-20 aminosyre.

Det ble videre funnet at dette signålpeptid er i stand til å føre ut også andre peptider fra vertscellene som inneholder en tilsvarende signalpeptidase.

Foreliggende oppfinnelse er følgelig kjennetegnet ved at man i en vertscelle fra arten Streptomyces uttrykker en genstruktur, som i leserammen med strukturgenet for det ønskede polypetidet, inneholder DNA-sekvensen B til et prepeptid, oppnåelig fra tendamistat-produserende Streptomyces tendae-stammen, som fortrinnsvis er blitt behandlet med subletale doser av akriflavin, gjennom isolering av total-DNA, spaltning med Pst I, Southern-hybridisering med DNA-sekvens A isolering av 2,3 kb-Pst I-fragmentet, spaltning med BamHI, Southern-hybridisering med sekvens A, isolering av 0,94 kb-Pst-I-BamHI-subfragmentene, spaltning med Sau 3a, Southern-hybridisering med sekvens A, isolering av 0,525 kb-BamHI-Sau 3a-subfragmentene og sekvensering av DNA, og

a) ligger umiddelbart før strukturgenet,

b) koder ved aminoterminus for Met-Arg-Val-Arg-Ala-Leu-Arg,

c) koder ved karboksy-terminus for Ala-Ser-Ala

d) koder i midten for et hydrofobt område X, som omfatter 10

til 25 aminosyrer.

Denne DNA-sekvens betegnes i det følgende som sekvens B resp. signålpeptid.

De ved sammenligning med standardmarkører fastslåtte kb-tallverdier har den vanlige nøyaktighet.

I stedet for sekvensen A kan det til Southern-hybridisering velges en ønskelig, til tendamistagen eller mottråd kompletaer sekvens.

For de forskjellige trinn til karakterisering av DNA-sekvens B innbringes i praksis respektivt DNA i en egnet vektor, denne transformeres i en vertscelle, amplifiseres der ved kolonihybridisering med sekvens A fastslås transformantene og DNA reisoleres. Disse trinn er i og for seg kjent.

DNA-sekvens C, hvis kodende tråd er nedlagt i vedhenget, viser nukleotidfølge av tendamistat-strukturen fra S. tendae.

De nevnte genstrukturer inneholder således DNA-sekvensen B i leseramme med et strukturgen, som eksempelvis koder for tendamistat, og fortrinnsvis DNA-sekvensen C.

DNA-sekvens B for prepeptidet er isolert fra S. tendae. Plasmider som er karakterisert ved DNA-sekvens B, i leseramme med et strukturgen, som eksempelvis koder for tendamistat, spesielt for DNA-sekvensen C, kan inneholde en i E. coli virksom replikon og er da deretter i stand til å amplifisere og også å uttrykke DNA i E. coli.

Foretrukne plasmider inneholder i tillegg et i streptomyceter virksomt replikon. Dersom en streptomycet transformeres med et slikt plasmid så blir den i stand til å uttrykke det ved strukturgenet bestemte peptid i form av et propeptid med formel II, som deretter innen rammen av prosessen spaltes ved hjelp av en signalpeptidase og utskiller det ønskede peptid i kulturmediet.

Fordelaktig er også såkalte "Shuttle"-plasmider, som så vel inneholder et i E. coli som også et i strptomyceter virksomt replikon. Disse "Shuttle"-vektorer kan amplifiseres i E. coli og etter reisolering transformeres i streptomyceter, hvor deretter produksjonen av det øasekde polypeptid foregår.

Mens det for gram-negative bakterier finnes en mengde vektorer, er det for gram-positive bakterier bare beskrevet få vektorer, vektorer for bakterier av typen S. tendae er hittil ikke kjent. Oppfinnelsen muliggjør således en tilgang for utnyttelse av S. tendae som vertsorganisme.

En spesiell fordel ved oppfinnelsen ligger i at transformerte Streptomyces-stammer, spesielt S. lividans-stamme, spordanner optimalt, dvs. innholdet av det rekombinante plasmid påvirker ikke denne stamme i dens generative fase. De transformerte organismer er således også egnet for ytterligere stamme-forbedringer, eksempelvis til fremstilling og seleksjon av metaboliske mutanter, ved hvis fremstilling det arbeides med sporer. _

I forhold til de kjente stammer av S. tendae danner de transformerte stammer, spesielt S. lividans, intet melamin. Adskillelse derav bortfaller derfor og dette letter isoleringen av det ønskede peptid, eksempelvis tendamistat, og hindrer utbyttetap.

Et ytterligere fortrinn ved oppfinnelsen ligger i at fremmedgener også uttrykkes i S. lividans og de tilsvarende polypeptider utskilles, hvilket likeledes byr mangfoldige muligheter til stammeforbedring og også modifisering av det således fremstilte polypeptid.

Ifølge oppfinnelsen kan imidlertid også andre streptomyces-typer transformeres, eksempelvis S. ghanaensis eller aureofaciens. Transformeres plasmidfrie stammer, som er i stand til å syntetisere et spesifikt signålpeptid med hybridplasmider så fåes stabile transformanter, som uttrykker og utskiller det kodete peptid.

Spesielt foretrukkede utførelser av oppfinnelsen er forklart nærmere i følgende eksempler. Postangivelsene refererer seg her til vekt, hvis intet annet er bemerket. Figurene som viser hybridplasmidene viser snittstedene i riktig målestokk.

I eksemplene ble det anvendt følgende litteraturkjente vektorer: Enkel ttråd-f agene M 13 mp 8 og M 13 mp 9: Messing et al., Gene 19 (1982) 269, pUC 8: Vierra et al., Gene 19

(1982) 259, pAC 177 og 184: Chang et al., J. Bacteriology 134

(1978) 1141, pIJ 102 og 350, Kieser et al., Mol. Gen. Genet. 185 (1982) 223.

Oppbevaring av S. tendae er omtalt i US-patent 4.226.764. Isoleringen av tendamistatgen kan prinsippielt foregå fra enhver tendamistat-produserende stamme. Spesielt fordelaktig er det imidlertid å gå fram ifølge tysk søknad P 33 31 860.3, i hvis eksempel 3 det er omtalt isolering av DNA. Dette isolerte samlede DNA er utgangsmaterialet for følgende eksempel 1.

Eksempel 1

5 jjg DNA fra S. tendae fordøyes komplett med restriksjons-enzym Pst I og overføres etter separering på en 0, 8% agarosegel til nitrocellulosefilter (Southern-Transfer). Filteret med det bundede, denaturerte DNA forhybridiseres 6 timer i 5 ml forhybridiseringsmedium (0,6 M NaCl, 0,06 M Na_EDTA, 0, 1% natriumdodecylsulfatoppløsning, 100 pg/ml ultralydbehandlet kalvetymus-DNA og 4-ganger konsentrert Denhardt-oppløsning). Deretter behandles igjen med 5 ml av forhybridiseringsmediet, hvortil imidlertid er tilsatt 500.000 cpm/ml radioaktivt merket DNA. Denne radioaktivt merkede prøve fåes som føler: DNA-sekvensen A syntetiseres kjemisk etter fosfit-fermgangs-måten. Den inneholder 20 nukleotider (molekylvekt ca. 13.000) og er komplementær til putativ DNA-sekvens for tendamistat, avledet av aminosyresekvensen av tendamistat fra aminosyre 37 av tendamistat under bruk av den av E. coli foretrukkede triplett. Denne DNA-sekvens A merkes radioaktivt ved 5'-enden ved hjelp av \/<32>P-ATP og nukleotidkinase.

Til hybridisering av denne radioaktive prøve til komplementær DNA-sekvens i det samlede DNA lar man blandingen stå 24 timer ved 37°C. Deretter fjernes det ikke-bundede radioaktive DNA og filteret vaskes ved 37° C 5 ganger respektivt 30 minutter med hver gang 200 ml hybridiseringsmedium og autoradiograferes deretter. Etter 24 timers eksponering viser hybridiseringssignalene at genet ligger på et 2,3 kb Pst I-fragment. Dette fragment utvinnes fra en preparativ agarosegel, ved elektroeluering av et til denne fragmentstørrelse tilsvarende påsnitthvorpå det Pstl-frdøyde samlede DNA ble oppdelt. Det eluerte DNA klones i Pst I-snittstedet av plasmidet pUC 8.

Disse hybridplasmider transformeres og amplifiseres i E. coli JM 103. Påvisning av de kloner som har det søkte innskuddet med tendamistat-genet føres gjennom koloni-hybridisering under anvendelse av den radioaktive DNA-prøve A. De således dannede hybridplasmider pKAI I a resp. 1 b er vist på fig. 1 a og 1 b.

Ved ytterligere Southern-hybridiseringer mot isolert 2,3 kb Pst I-fragment og dets subf ragmenter lar det seg nøyaktig fastslå lokalisering av genet (fig. 2a til 2c).

Eksempel 2

I de enkelte snittsteder av plasmid pIJ 102 for Pst I klones 2,3 kb Pst I-fragment fra S. tendae. De således dannede hybridplasmider pAX 1 a og 1 b, som adskiller seg ved innskuddets orientering, gjør etter transformasjonen i S. lividans-stammen denne i stand til produksjon av tendamistat.

Fig. 3 viser plasmidet pAX 1 a.

Eksempel 3

Den kommersielle stammen S. lividans TK 24 (John Innes Institute, Norwich, England) overføres på kjent måte i protoplaster og 1 jjg hybridplasmid pAX 1 a blandes med 10^ protoplaster under tilsetning av 2056 polyetylenglykol 6000. De transformerte protoplaster dyrkes på regenerasjonsmedier R2YE (Thompson et al., NAture 286 (1980) 525) ved 30°C i 5 dager.

Påvisning av den ekstracellulære amylase-inaktivator ble dannet, kan foregå ved hjelp av en plateprøve.

De regenererte kolonier overhelles med 5 ml av en 0,4-1,0 mg/ml pankreatinholdig vandig oppløsning og inkuberes 1 time ved 37°C. Oppløsningen fjernes deretter og erstattes med 5 ml av en 2%- ig stivelsesagar. Etter 2 timers inkubasjon ved 37°C overhelles platene med 5 ml av en jodkaliumjodid-oppløsning til fremkalling. Kolonier med en blå opphopning angir at klonen syntetiserer og ekstreterer tendamistat.

Til kontroll kan det av tendamistat-produserende godt sporulerende stammer isoleres plasmid-DNA og kartlegges. Alle tensdamistat-produserende stammer har det anvendte plasmid-DNA.

Eksempel 4

Man går fram ifølge eksempel 2, anvender imidlertid plasmidet pIJ 350, som Streptomyceter som seleksjonsmarkør har et tiostrepton-resistensgen. Man får således hybridplasmid pAX 350 a og b (som adskiller seg ved orienteringen av insersjonen). Fig. 4 viser plasmidet PAX 350 a.

Etter transformasjon ifølge eksempel 3 selekteres på minimalmedium (Hopwood, Bacteriological Reviews 31 (1967) 373-403 i nærvær av 50 jig/ml tiostrepton resistente kloner. Disse undersøkes enten direkte på minimalmedium eller etter omplating på ikke selektiv R2YE-agar for tendamistat-produksjon.

Eksempel 5

Hybridplasmider som inneholder 2,3 kb Pst I-fragment og foruten Streptomycet-replikon også en E. coli-replikon, har som "Shuttle"-vektorer er rekke fordeler: På grunn av E. colireplikonet og i E. coli virksomme resistentmarkører kan de godt amplifiseres i disse organismer. Etter isolering og transformering i Streptomyceter, spesielt S. lividans, viser de en høy stabilitet. Som følge av deres i Streptomyceter virksomme seleksjonsmarkører og av Streptomyceter-replikonet kan de også godt amplifiseres og uttrykkes i disse organismer og sekreterer tendamistat.

Plasmidet pAC 184 fordøyes komplett med restriksjonsenzymet Sal I og enzymet fjernes ved fenol-kloroform-ekstrahering. De overhengende 5'-ender oppfylles i nærvær av ATP, CTP, GTP og TTP ved hjelp av enzymet DNA-polymerase (Klenow-fragment). På de butte ender (blunt ends) ligeres i en 1igase-reaksjon ved 16°C en Pst I-linker av strukturen

(2 jjg linker på 0,4 jjg DNA). DNA ekstraheres med fenolkloro-form og etter felling fordøyes med enzymet Pst I til utvinning av ligerbare Pst I-ender. DNA defosforyleres deretter, ekstraheres igjen med fenol-kloroform og ligeres med partielt Pst I-fordøyet plasmid pAX 1 a. Ligeringsblandingen transformeres i E. coli (HB 101 resp. MC 1061). Mot kloramfenicol resistente kloner blir tatt ut fra platen og DNA isoleres. S. lividans TK 24 transformeres med 1-2 pg DNA og undersøkes på tendamistat-produksjon.

I tendamistat-prøven positivt reagerende kloner isoleres, plasmid-DNA isoleres ved alkalisk Schnell-lyse og transformeres i E. coli HB 101 resp. MC 1061. Etter amplifisering reisolerte plasmider adskiller seg ikke fra de fra S. lividansstammer isolerte plasmider. Alt etter orientering av insersjonen, som har tendamistatgenet, betegnes de rekombinante plasmider som pSA 2 a eller b (fig. 5 a og b).

Eksempel 6

Går man fram ifølge eksempel 5, imidlertid ut fra plasmid pAX 350 a, selektert i E. coli på kloramfenicol-resistens og i S. lividans på tiostrepton-resistens og tendamistat-produksjon, så får man plasmidene pSA 351 a resp. b (fig. 6 a/b).

Eksempel 7

Går man fram ifølge eksempel 5, imidlertid i stedet for plasmidet pAC 184 ut fra pAC 177, så får man plasmidene pSA 3 resp. b (fig. 7 a/b).

Hertil snittes plasmidet pAX 1 a partielt med PST og enzymet varmeinaktiveres ved 15 minutters oppvarming ved 68°C. DNA ligeres i det med Pst I snittede defosforylerte og deprotein-erte plasmid pAC 177. Etter transformasjon av E. coli HB 101 resp. 1061 taes mot kanamycin resistente kloner ut fra platen, plasmid-DNA isoleres og S. lividans TK 24 transformeres med 1-2 >jg av denne DNA. Tendamistat-produserende kloner seleksjoneres og karalteriserer plasmidet.

Eksempel 8

Går man fram ifølge eksempel 7, anvender imidlertid i stedet for plasmidet pAX 1 plasmidet pAX 350 a og selekterer S. lividans på tiostrepton-resistens, så får man plasmidene pSA 352 a resp. b (fig. 8 a/b).

Eksempel 9

Som det fremgår av fig. 2, er det for tendamistat og signal-sekvenser kodende gen ~ 0,3 kb stort. De i de ovenfor omtalte eksempler anvendte 2,3 kb-fragment kan altså i forkortet form anvendes til konstruksjon av hybridplasmider som bevirker produksjon av tendamistat: Plasmidet pKAI 1 a fordøyes med Sal I og religeres. Man får således det rundt ca. 750 basepar forkortede plasmid pKAI 2. Dette klones, isoleres og snittes med Pst I. DNA defosforyleres med alkalisk fosfatase fra kalvetarm og deproteini-seres med fenol-kloroform.

Plasmidet pIJ 102 snittes komplett med Pst I og fragmentene ligeres etter varmeinaktivering av enzymet i Pst I-snittstedene av pKAI 2. Ligeringsblandingen transformeres i E. coli HP 101 eller MC 10611. Plasmid-DNA fra ampicillin resistente kloner isoleres ved alkalisk Schnell-Lyse-fremgangsmåte og S. lividans TK 24 transformeres med 1-2 pg av dette DNA. Man selekterer på tendamistat-produksjon og isolerer plasmid-DNA fra denne klonen ved alkalisk Schnell-Lyse. Ved tilbaketransformering i E. coli HB 101 resp. MC 1061 og etter isolering av plasmid-DNA fra transformerte E. coli-stammer karakteriserer man plasmid pSA 1 ved restrik-sjonsanalyse (fig. 9). Plasmidet viser ingen forskjell til de fra S. 1 ividans-stammer isolerte plasmider, imidlertid er DNA-opparbeidelsen fra E. coli mer produktiv og mulig i kortere tid.

Eksempel 10

Går man fram ifølge eksempel 9, anvender imidlertid i stedet for plasmidet pIJ 102 plasmidet pIJ 350, idet det kan selekteres i S. lividans da i tillegg etter tiostrepton-resistens, så får man plasmidene pSA 350 a resp. b. Fig. 10 viser plasmidet pSA 350 a. Dette plasmid fører i ryste-kulturer til høyere utbytter av tendamistat enn plasmidet pSA 350 b, som inneholder insersjonen med tendamistat-genet i omvendt orientering. Derimot har minskningen av insersjonen til 1,5 kb ingen tydelig innvirkning på produktdannelsen.

Eksempel 11

Til fastslåelse av struktur og nukleotidsekvens av tendamistatgenet ble 0,94 kb Pst I-Bam HI-subfragment (fig. 1 a og b) samt 295 bp Sau 3a-Bam HI-subfragment (fig. 2 c) klonet i enkeltstrengfagene M 13 mp 8 og M 13 mp. 9. Som primer for dideoksy-sekvensreaksjonen tjente de 20 nukleotider omfattende DNA-sekvens A samt en kommersielt oppnåelig 15 bp-primer (Bethesda Research Laboratories GmbH., Neu-Isenburg). Det ble fastslått DNA-sekvens C.

Eksempel 12

Før strukturgenet av tendamistat befinner det seg på DNA en åpen leseramme inntil startkodon ATG (Met) for et protein, som forlagrer den aminoterminale ende av tendamistat. Dette signålpeptid tilsvarer DNA-sekvens B.

Tillegg:

DNA-sekvens C (kodende streng)

Eksempel 1 og 3 fra tysk søknad P 33 31 860.3:

Eksempel 1

Mutasjonsfremgangsmåte: Ca. 0,25 cm<2> sporet mycel av stammen DSM 2727, som dyrkes på havrefnokkagar (EP-A 49 847), overpodes i 100 ml Erlenmeyer-kolber, som er fylt med 25 ml av følgende kulturmedium: mediet autoklaveres 30 minutter ved 121°C og 1 bar, pH-verdien utgjør 7,0. Podningskolbene inkuberes 2 dager ved 30° C på en rystemaskin. Deretter overpodes 2 ml av den vaskede forkultur i 20 ml hovedkulturmedium, som befinner seg i 100 ml Erlenmeyer-kolber (EP-A 49 847):

Mediets pH-verdi utgjør etter autoklaveringen 7,6.

Til dette medium settes acriflavin i en konsentrasjon på 10-25 pg/ml som mutagent stoff. Kulturen rystes i 5 dager ved 28°C og 220 o/min. Deretter sentrifugeres kulturoppløsningen (1.300 g, 5 minutter) og cellepellet vaskes i hovedkulturmedium. De vaskede celler fragmenteres i en glass-homogenisator og utplateres på agarplater i følgende medium:

Oppløsningens pH-verdi utgjør 7,1 (autoklaveringsbetingelser som oevnfor).

Platene dyrkes 5 dager ved 28°C og enkeltkolonier overpodes i skrårør med havrefnokkagar. Disse dyrkes som omtalt inntil mycelet er forsporet. Det forsporede mycel formeres som omtalt ovenfor i for- og hovedkulturen og kulturfiltratet undersøkes etter 5 dagers hovedkultur på innholdet av tendamistat (sammenlign EP-A 39 847). På denne måte kan stammene 1-9353, 1-9362, 1-9417, 1-9418 selekteres i sin vekstperiode under de omtalte betingelser produserende ca. 90.000-100.000 IE tendamistat/1 kulturoppløsning, tilsvarende 1,5-1,8 g inaktivator/1.

Eksempel 3

Isolering av deoksyribonukleotidsyre fra S. tendae og dens molekylærbiologiske karakterisering.

Oppdrett av cellene foregikk tilsvarende eksempel 1. Etter 3 dagers vekst i hovedkulturmediet rystes cellene av en Erlenmeyer-kolbe ved 5 minutters sentrifugering ved 3000 g ved 4°C og vaskes to ganger med 50 ml av en oppløsning av 50 mM Tris/HCl-buffer, 100 mM NaCl og 25 mM EDTA.

Ved en typisk preparering dypfryses sjokkaktig 3 g fast-sentrifugerte celler i flytende nitrogen ved -198°C og homogeniseres deretter med en skjæreknivhomogenisator (Warring Commercial Blender) i nærvær av N2 til et fint pulver. Dette pulver opptas i 10 ml av nevnte buffer, oppløses på is og inkuberes med 0,8 ml lysozymoppløsning (30 mg/ml) 20 minutter ved 28°C under svak rysting. Til suspensjonen settes deretter 0,8 ml av en proteinase K-oppløsning (15 mg/ml) og 0,8 ml av en 20#-ig oppløsning av natriumsaltet av N-lauroylsarkocin. Etter forsiktig blanding inkuberes blandingen 30 minutter på is og ytterligere 15 minutter ved værelsestemperatur. Etter tilsetning og oppløsning av 22 g fast cesiumklorid, innstilles volumet med ovennevnte buffer på 22 ml og suspensjonen sentrifugeres ved 12.000 g oh 4°C i 25 minutter. Det klare sentrifugat blandes med etidiumbromid og brytningsindeks innstilles med CsCl refraktometrisk på n = 1,3920. Etter preparativ ultrasentrifugering (120.000 g, 36 timer, 15 °C) uttas båndene av kromosomal DNA fra sentrifuge-rørene og resentrifugeres under samme betingelser. De isolerte bånd befris ved utrysting med n-butanol fra etidiumbromid og dialyseres til fullstendig fjerning av CsCl. Det således utvunnede DNA er skjærbar, dvs. med enzymene Pst I, Barn H I, Sau 3 A, Cia I, Bgl II og Xho I, og ikke skjærbar, for eksempel med endonukleoasene Eco R I og Hind

III.

De eksempelvis fra mutantene 1-9353 og 1-9362 fremstilt DNA, er i forhold til DNA fra ATCC 31210 resp. DSM 2727 karakterisert bed et amplifisert genetisk element, hvis enkeltfragmenter fremtrer tydelig synbart etter farging med fluor-essensfargestoffet etidiumbromid fra bakgrunn av ikke selektivt formerte fragmenter. Størrelsen av det amplifiserte element samt de karakteristiske enkeltfragmenter etter fordøying med restriksjonsendonukleaser er gjengitt i det følgende:

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av polypeptider fra genetisk kodbare aminosyrer, karakterisert ved at man i en vertscelle fra arten Streptomyces uttrykker en genstruktur, som i leserammen med strukturgenet for det ønskede polypetidet, inneholder DNA-sekvensen B til et prepeptid, oppnåelig fra tendamistat-produserende Streptomyces tendae-stammen, som fortrinnsvis er blitt behandlet med subletale doser av akriflavin, gjennom isolering av total-DNA, spaltning med Pst I, Southern-hybridisering med DNA-sekvens A isolering av 2,3 kb-Pst I-fragmentet, spaltning med BamHI, Southern-hybridisering med sekvens A, isolering av 0,94 kb-Pst-I-BamHI-subfragmentene, spaltning med Sau 3a, Southern-hybridisering med sekvens A, isolering av 0,525 kb-BamHI-Sau 3a-subfragmentene og sekvensering av DNA, og a) ligger umiddelbart før strukturgenet, b) koder ved aminoterminus for Met-Arg-Val-Arg-Ala-Leu-Arg, c) koder ved karboksy-terminus for Ala-Ser-Ala d) koder i midten for et hydrofobt område X, som omfatter 10 til 25 aminosyrer.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at DNA-sekvens B til prepeptidet i midten, koder for et hydrofobt område X som omfatter 17 til 20 aminosyrer.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at DNA-sekvens B for prepeptidet er isolert fra S. tendae.

4 . Fremgangsmåte ifølge krav 1 til 3, karakterisert ved at vertscellen er av arten S.tendae eller S.lividans.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1 til 4, karakterisert ved at vertscellen inneholder en signalpeptidase som spalter prepeptidet og som utskiller det ønskede polypeptidet i kulturmediet.

6. Fremgangsmåte ifølge ett eller flere av ovennevnte krav, karakterisert ved at genstrukturen blir bragt inn i vertscellen med et plasmid som inneholder et replikon som er virksomt i streptomyceter.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at plasmidet, bortsett fra replikonet som er virksomt i streptomyceter, inneholder et replikon som er virksomt i E.coli.

8. Fremgangsmåte ifølge ett eller flere av ovennevnte krav, karakterisert ved at strukturgenet koder for tendamistat.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at strukturgenet oppviser DNA-sekvens C (vedheng).