NO173452B - Fremgangsmaate for fremstilling av polypeptider i streptomyceter - Google Patents
Fremgangsmaate for fremstilling av polypeptider i streptomyceter Download PDFInfo
- Publication number
- NO173452B NO173452B NO85851971A NO851971A NO173452B NO 173452 B NO173452 B NO 173452B NO 85851971 A NO85851971 A NO 85851971A NO 851971 A NO851971 A NO 851971A NO 173452 B NO173452 B NO 173452B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- dna
- isolation
- sequence
- pst
- codes
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 229950001790 tendamistat Drugs 0.000 claims abstract description 40
- 108010037401 tendamistate Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 23
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 19
- 241000187179 Streptomyces tendae Species 0.000 claims abstract description 17
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 claims abstract description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 10
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- KKAJSJJFBSOMGS-UHFFFAOYSA-N 3,6-diamino-10-methylacridinium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(N)C=C2[N+](C)=C(C=C(N)C=C3)C3=CC2=C1 KKAJSJJFBSOMGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 claims abstract description 5
- 229940023020 acriflavine Drugs 0.000 claims abstract description 5
- DCVYRWFAMZFSDA-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DCVYRWFAMZFSDA-ZLUOBGJFSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims abstract description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 54
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 241000187398 Streptomyces lividans Species 0.000 claims description 10
- 241001655322 Streptomycetales Species 0.000 claims description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 6
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 claims description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 abstract description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 abstract 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 abstract 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 101100518987 Mus musculus Pax1 gene Proteins 0.000 description 5
- NSFFHOGKXHRQEW-UHFFFAOYSA-N Thiostrepton B Natural products N1C(=O)C(C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(C(C)CC)NC(C(C2=N3)O)C=CC2=C(C(C)O)C=C3C(=O)OC(C)C(C=2SC=C(N=2)C2N=3)NC(=O)C(N=4)=CSC=4C(C(C)(O)C(C)O)NC(=O)C(N=4)CSC=4C(=CC)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(N=4)=CSC=4C21CCC=3C1=NC(C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(N)=O)=CS1 NSFFHOGKXHRQEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 229930188070 thiostrepton Natural products 0.000 description 5
- NSFFHOGKXHRQEW-AIHSUZKVSA-N thiostrepton Chemical compound C([C@]12C=3SC=C(N=3)C(=O)N[C@H](C(=O)NC(/C=3SC[C@@H](N=3)C(=O)N[C@H](C=3SC=C(N=3)C(=O)N[C@H](C=3SC=C(N=3)[C@H]1N=1)[C@@H](C)OC(=O)C3=CC(=C4C=C[C@H]([C@@H](C4=N3)O)N[C@H](C(N[C@@H](C)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)=O)[C@@H](C)CC)[C@H](C)O)[C@](C)(O)[C@@H](C)O)=C\C)[C@@H](C)O)CC=1C1=NC(C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(N)=O)=CS1 NSFFHOGKXHRQEW-AIHSUZKVSA-N 0.000 description 5
- 229940063214 thiostrepton Drugs 0.000 description 5
- NSFFHOGKXHRQEW-OFMUQYBVSA-N thiostrepton A Natural products CC[C@H](C)[C@@H]1N[C@@H]2C=Cc3c(cc(nc3[C@H]2O)C(=O)O[C@H](C)[C@@H]4NC(=O)c5csc(n5)[C@@H](NC(=O)[C@H]6CSC(=N6)C(=CC)NC(=O)[C@@H](NC(=O)c7csc(n7)[C@]8(CCC(=N[C@@H]8c9csc4n9)c%10nc(cs%10)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(=O)N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@H](C)NC1=O)[C@@H](C)O)[C@](C)(O)[C@@H](C)O)[C@H](C)O NSFFHOGKXHRQEW-OFMUQYBVSA-N 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241000828254 Streptomyces lividans TK24 Species 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000000937 inactivator Effects 0.000 description 2
- 229940038580 oat bran Drugs 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- DKNPRRRKHAEUMW-UHFFFAOYSA-N Iodine aqueous Chemical compound [K+].I[I-]I DKNPRRRKHAEUMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000877 Melamine resin Polymers 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000948169 Streptomyces viridosporus Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- PEJLNXHANOHNSU-UHFFFAOYSA-N acridine-3,6-diamine;10-methylacridin-10-ium-3,6-diamine;chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=NC3=CC(N)=CC=C3C=C21.C1=C(N)C=C2[N+](C)=C(C=C(N)C=C3)C3=CC2=C1 PEJLNXHANOHNSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- JDSHMPZPIAZGSV-UHFFFAOYSA-N melamine Chemical compound NC1=NC(N)=NC(N)=N1 JDSHMPZPIAZGSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N phosphorous acid Chemical compound OP(O)O OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229940093429 polyethylene glycol 6000 Drugs 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Et 20-35 aminosyrer omfattende prepeptid med formel. hvori X betyr et hydrofobt område med 10-2 5. aminosyrer, virker i Streptomyceter som signålpeptid, som fjerner et aminoterminalt dermed sammenknyttet peptid fra cellen og utskiller i kulturmediet. En tilsvarende genstruktur kan innbygges foran et strukturgen og bevirker da ved ekspresjon ekskresjon av. det ønskede peptid i kulturmediet. Hertil modifiseres egnede plasmider ved innbygging av slike gener, og vertsorgan-ismer, spesielt Streptomyceter, transformeres dermed.
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av polypeptider fra genetisk kodbare aminosyrer.
I den tyske patentsøknad P 33 31 860.3 ble det allerede foreslått en fremgangsmåte til fremstilling av tendamistat ved fermentering av Streptomyces tendae, i det fremgangsmåten er karakterisert ved at tendamistat-produserende S.tendae-stammer anvendes og behandles med subletale doser av Acriflavin. Fra således dannede stammer ble det isolert et DNA-fragment med genet for tendamistat, nemlig et 2,3 kb-Pst I-fragment. Vedinnbygging av dette fragmentet i Pst I kuttede pBR 322 kunne dette DNA amplifiseres i E. coli og igjen isoleres.
Det ble nå funnet at på dette 2,3 kb-fragment umiddelbart før strukturgenet for tendamistat er det kodet et signålpeptid (prepeptid) med formel I
i det X betyr et hydrofobt området som omfatter 17-20 aminosyre.
Det ble videre funnet at dette signålpeptid er i stand til å føre ut også andre peptider fra vertscellene som inneholder en tilsvarende signalpeptidase.
Foreliggende oppfinnelse er følgelig kjennetegnet ved at man i en vertscelle fra arten Streptomyces uttrykker en genstruktur, som i leserammen med strukturgenet for det ønskede polypetidet, inneholder DNA-sekvensen B til et prepeptid, oppnåelig fra tendamistat-produserende Streptomyces tendae-stammen, som fortrinnsvis er blitt behandlet med subletale doser av akriflavin, gjennom isolering av total-DNA, spaltning med Pst I, Southern-hybridisering med DNA-sekvens A isolering av 2,3 kb-Pst I-fragmentet, spaltning med BamHI, Southern-hybridisering med sekvens A, isolering av 0,94 kb-Pst-I-BamHI-subfragmentene, spaltning med Sau 3a, Southern-hybridisering med sekvens A, isolering av 0,525 kb-BamHI-Sau 3a-subfragmentene og sekvensering av DNA, og
a) ligger umiddelbart før strukturgenet,
b) koder ved aminoterminus for Met-Arg-Val-Arg-Ala-Leu-Arg,
c) koder ved karboksy-terminus for Ala-Ser-Ala
d) koder i midten for et hydrofobt område X, som omfatter 10
til 25 aminosyrer.
Denne DNA-sekvens betegnes i det følgende som sekvens B resp. signålpeptid.
De ved sammenligning med standardmarkører fastslåtte kb-tallverdier har den vanlige nøyaktighet.
I stedet for sekvensen A kan det til Southern-hybridisering velges en ønskelig, til tendamistagen eller mottråd kompletaer sekvens.
For de forskjellige trinn til karakterisering av DNA-sekvens B innbringes i praksis respektivt DNA i en egnet vektor, denne transformeres i en vertscelle, amplifiseres der ved kolonihybridisering med sekvens A fastslås transformantene og DNA reisoleres. Disse trinn er i og for seg kjent.
DNA-sekvens C, hvis kodende tråd er nedlagt i vedhenget, viser nukleotidfølge av tendamistat-strukturen fra S. tendae.
De nevnte genstrukturer inneholder således DNA-sekvensen B i leseramme med et strukturgen, som eksempelvis koder for tendamistat, og fortrinnsvis DNA-sekvensen C.
DNA-sekvens B for prepeptidet er isolert fra S. tendae. Plasmider som er karakterisert ved DNA-sekvens B, i leseramme med et strukturgen, som eksempelvis koder for tendamistat, spesielt for DNA-sekvensen C, kan inneholde en i E. coli virksom replikon og er da deretter i stand til å amplifisere og også å uttrykke DNA i E. coli.
Foretrukne plasmider inneholder i tillegg et i streptomyceter virksomt replikon. Dersom en streptomycet transformeres med et slikt plasmid så blir den i stand til å uttrykke det ved strukturgenet bestemte peptid i form av et propeptid med formel II, som deretter innen rammen av prosessen spaltes ved hjelp av en signalpeptidase og utskiller det ønskede peptid i kulturmediet.
Fordelaktig er også såkalte "Shuttle"-plasmider, som så vel inneholder et i E. coli som også et i strptomyceter virksomt replikon. Disse "Shuttle"-vektorer kan amplifiseres i E. coli og etter reisolering transformeres i streptomyceter, hvor deretter produksjonen av det øasekde polypeptid foregår.
Mens det for gram-negative bakterier finnes en mengde vektorer, er det for gram-positive bakterier bare beskrevet få vektorer, vektorer for bakterier av typen S. tendae er hittil ikke kjent. Oppfinnelsen muliggjør således en tilgang for utnyttelse av S. tendae som vertsorganisme.
En spesiell fordel ved oppfinnelsen ligger i at transformerte Streptomyces-stammer, spesielt S. lividans-stamme, spordanner optimalt, dvs. innholdet av det rekombinante plasmid påvirker ikke denne stamme i dens generative fase. De transformerte organismer er således også egnet for ytterligere stamme-forbedringer, eksempelvis til fremstilling og seleksjon av metaboliske mutanter, ved hvis fremstilling det arbeides med sporer. _
I forhold til de kjente stammer av S. tendae danner de transformerte stammer, spesielt S. lividans, intet melamin. Adskillelse derav bortfaller derfor og dette letter isoleringen av det ønskede peptid, eksempelvis tendamistat, og hindrer utbyttetap.
Et ytterligere fortrinn ved oppfinnelsen ligger i at fremmedgener også uttrykkes i S. lividans og de tilsvarende polypeptider utskilles, hvilket likeledes byr mangfoldige muligheter til stammeforbedring og også modifisering av det således fremstilte polypeptid.
Ifølge oppfinnelsen kan imidlertid også andre streptomyces-typer transformeres, eksempelvis S. ghanaensis eller aureofaciens. Transformeres plasmidfrie stammer, som er i stand til å syntetisere et spesifikt signålpeptid med hybridplasmider så fåes stabile transformanter, som uttrykker og utskiller det kodete peptid.
Spesielt foretrukkede utførelser av oppfinnelsen er forklart nærmere i følgende eksempler. Postangivelsene refererer seg her til vekt, hvis intet annet er bemerket. Figurene som viser hybridplasmidene viser snittstedene i riktig målestokk.
I eksemplene ble det anvendt følgende litteraturkjente vektorer: Enkel ttråd-f agene M 13 mp 8 og M 13 mp 9: Messing et al., Gene 19 (1982) 269, pUC 8: Vierra et al., Gene 19
(1982) 259, pAC 177 og 184: Chang et al., J. Bacteriology 134
(1978) 1141, pIJ 102 og 350, Kieser et al., Mol. Gen. Genet. 185 (1982) 223.
Oppbevaring av S. tendae er omtalt i US-patent 4.226.764. Isoleringen av tendamistatgen kan prinsippielt foregå fra enhver tendamistat-produserende stamme. Spesielt fordelaktig er det imidlertid å gå fram ifølge tysk søknad P 33 31 860.3, i hvis eksempel 3 det er omtalt isolering av DNA. Dette isolerte samlede DNA er utgangsmaterialet for følgende eksempel 1.
Eksempel 1
5 jjg DNA fra S. tendae fordøyes komplett med restriksjons-enzym Pst I og overføres etter separering på en 0, 8% agarosegel til nitrocellulosefilter (Southern-Transfer). Filteret med det bundede, denaturerte DNA forhybridiseres 6 timer i 5 ml forhybridiseringsmedium (0,6 M NaCl, 0,06 M Na_EDTA, 0, 1% natriumdodecylsulfatoppløsning, 100 pg/ml ultralydbehandlet kalvetymus-DNA og 4-ganger konsentrert Denhardt-oppløsning). Deretter behandles igjen med 5 ml av forhybridiseringsmediet, hvortil imidlertid er tilsatt 500.000 cpm/ml radioaktivt merket DNA. Denne radioaktivt merkede prøve fåes som føler: DNA-sekvensen A syntetiseres kjemisk etter fosfit-fermgangs-måten. Den inneholder 20 nukleotider (molekylvekt ca. 13.000) og er komplementær til putativ DNA-sekvens for tendamistat, avledet av aminosyresekvensen av tendamistat fra aminosyre 37 av tendamistat under bruk av den av E. coli foretrukkede triplett. Denne DNA-sekvens A merkes radioaktivt ved 5'-enden ved hjelp av \/<32>P-ATP og nukleotidkinase.
Til hybridisering av denne radioaktive prøve til komplementær DNA-sekvens i det samlede DNA lar man blandingen stå 24 timer ved 37°C. Deretter fjernes det ikke-bundede radioaktive DNA og filteret vaskes ved 37° C 5 ganger respektivt 30 minutter med hver gang 200 ml hybridiseringsmedium og autoradiograferes deretter. Etter 24 timers eksponering viser hybridiseringssignalene at genet ligger på et 2,3 kb Pst I-fragment. Dette fragment utvinnes fra en preparativ agarosegel, ved elektroeluering av et til denne fragmentstørrelse tilsvarende påsnitthvorpå det Pstl-frdøyde samlede DNA ble oppdelt. Det eluerte DNA klones i Pst I-snittstedet av plasmidet pUC 8.
Disse hybridplasmider transformeres og amplifiseres i E. coli JM 103. Påvisning av de kloner som har det søkte innskuddet med tendamistat-genet føres gjennom koloni-hybridisering under anvendelse av den radioaktive DNA-prøve A. De således dannede hybridplasmider pKAI I a resp. 1 b er vist på fig. 1 a og 1 b.
Ved ytterligere Southern-hybridiseringer mot isolert 2,3 kb Pst I-fragment og dets subf ragmenter lar det seg nøyaktig fastslå lokalisering av genet (fig. 2a til 2c).
Eksempel 2
I de enkelte snittsteder av plasmid pIJ 102 for Pst I klones 2,3 kb Pst I-fragment fra S. tendae. De således dannede hybridplasmider pAX 1 a og 1 b, som adskiller seg ved innskuddets orientering, gjør etter transformasjonen i S. lividans-stammen denne i stand til produksjon av tendamistat.
Fig. 3 viser plasmidet pAX 1 a.
Eksempel 3
Den kommersielle stammen S. lividans TK 24 (John Innes Institute, Norwich, England) overføres på kjent måte i protoplaster og 1 jjg hybridplasmid pAX 1 a blandes med 10^ protoplaster under tilsetning av 2056 polyetylenglykol 6000. De transformerte protoplaster dyrkes på regenerasjonsmedier R2YE (Thompson et al., NAture 286 (1980) 525) ved 30°C i 5 dager.
Påvisning av den ekstracellulære amylase-inaktivator ble dannet, kan foregå ved hjelp av en plateprøve.
De regenererte kolonier overhelles med 5 ml av en 0,4-1,0 mg/ml pankreatinholdig vandig oppløsning og inkuberes 1 time ved 37°C. Oppløsningen fjernes deretter og erstattes med 5 ml av en 2%- ig stivelsesagar. Etter 2 timers inkubasjon ved 37°C overhelles platene med 5 ml av en jodkaliumjodid-oppløsning til fremkalling. Kolonier med en blå opphopning angir at klonen syntetiserer og ekstreterer tendamistat.
Til kontroll kan det av tendamistat-produserende godt sporulerende stammer isoleres plasmid-DNA og kartlegges. Alle tensdamistat-produserende stammer har det anvendte plasmid-DNA.
Eksempel 4
Man går fram ifølge eksempel 2, anvender imidlertid plasmidet pIJ 350, som Streptomyceter som seleksjonsmarkør har et tiostrepton-resistensgen. Man får således hybridplasmid pAX 350 a og b (som adskiller seg ved orienteringen av insersjonen). Fig. 4 viser plasmidet PAX 350 a.
Etter transformasjon ifølge eksempel 3 selekteres på minimalmedium (Hopwood, Bacteriological Reviews 31 (1967) 373-403 i nærvær av 50 jig/ml tiostrepton resistente kloner. Disse undersøkes enten direkte på minimalmedium eller etter omplating på ikke selektiv R2YE-agar for tendamistat-produksjon.
Eksempel 5
Hybridplasmider som inneholder 2,3 kb Pst I-fragment og foruten Streptomycet-replikon også en E. coli-replikon, har som "Shuttle"-vektorer er rekke fordeler: På grunn av E. colireplikonet og i E. coli virksomme resistentmarkører kan de godt amplifiseres i disse organismer. Etter isolering og transformering i Streptomyceter, spesielt S. lividans, viser de en høy stabilitet. Som følge av deres i Streptomyceter virksomme seleksjonsmarkører og av Streptomyceter-replikonet kan de også godt amplifiseres og uttrykkes i disse organismer og sekreterer tendamistat.
Plasmidet pAC 184 fordøyes komplett med restriksjonsenzymet Sal I og enzymet fjernes ved fenol-kloroform-ekstrahering. De overhengende 5'-ender oppfylles i nærvær av ATP, CTP, GTP og TTP ved hjelp av enzymet DNA-polymerase (Klenow-fragment). På de butte ender (blunt ends) ligeres i en 1igase-reaksjon ved 16°C en Pst I-linker av strukturen
(2 jjg linker på 0,4 jjg DNA). DNA ekstraheres med fenolkloro-form og etter felling fordøyes med enzymet Pst I til utvinning av ligerbare Pst I-ender. DNA defosforyleres deretter, ekstraheres igjen med fenol-kloroform og ligeres med partielt Pst I-fordøyet plasmid pAX 1 a. Ligeringsblandingen transformeres i E. coli (HB 101 resp. MC 1061). Mot kloramfenicol resistente kloner blir tatt ut fra platen og DNA isoleres. S. lividans TK 24 transformeres med 1-2 pg DNA og undersøkes på tendamistat-produksjon.
I tendamistat-prøven positivt reagerende kloner isoleres, plasmid-DNA isoleres ved alkalisk Schnell-lyse og transformeres i E. coli HB 101 resp. MC 1061. Etter amplifisering reisolerte plasmider adskiller seg ikke fra de fra S. lividansstammer isolerte plasmider. Alt etter orientering av insersjonen, som har tendamistatgenet, betegnes de rekombinante plasmider som pSA 2 a eller b (fig. 5 a og b).
Eksempel 6
Går man fram ifølge eksempel 5, imidlertid ut fra plasmid pAX 350 a, selektert i E. coli på kloramfenicol-resistens og i S. lividans på tiostrepton-resistens og tendamistat-produksjon, så får man plasmidene pSA 351 a resp. b (fig. 6 a/b).
Eksempel 7
Går man fram ifølge eksempel 5, imidlertid i stedet for plasmidet pAC 184 ut fra pAC 177, så får man plasmidene pSA 3 resp. b (fig. 7 a/b).
Hertil snittes plasmidet pAX 1 a partielt med PST og enzymet varmeinaktiveres ved 15 minutters oppvarming ved 68°C. DNA ligeres i det med Pst I snittede defosforylerte og deprotein-erte plasmid pAC 177. Etter transformasjon av E. coli HB 101 resp. 1061 taes mot kanamycin resistente kloner ut fra platen, plasmid-DNA isoleres og S. lividans TK 24 transformeres med 1-2 >jg av denne DNA. Tendamistat-produserende kloner seleksjoneres og karalteriserer plasmidet.
Eksempel 8
Går man fram ifølge eksempel 7, anvender imidlertid i stedet for plasmidet pAX 1 plasmidet pAX 350 a og selekterer S. lividans på tiostrepton-resistens, så får man plasmidene pSA 352 a resp. b (fig. 8 a/b).
Eksempel 9
Som det fremgår av fig. 2, er det for tendamistat og signal-sekvenser kodende gen ~ 0,3 kb stort. De i de ovenfor omtalte eksempler anvendte 2,3 kb-fragment kan altså i forkortet form anvendes til konstruksjon av hybridplasmider som bevirker produksjon av tendamistat: Plasmidet pKAI 1 a fordøyes med Sal I og religeres. Man får således det rundt ca. 750 basepar forkortede plasmid pKAI 2. Dette klones, isoleres og snittes med Pst I. DNA defosforyleres med alkalisk fosfatase fra kalvetarm og deproteini-seres med fenol-kloroform.
Plasmidet pIJ 102 snittes komplett med Pst I og fragmentene ligeres etter varmeinaktivering av enzymet i Pst I-snittstedene av pKAI 2. Ligeringsblandingen transformeres i E. coli HP 101 eller MC 10611. Plasmid-DNA fra ampicillin resistente kloner isoleres ved alkalisk Schnell-Lyse-fremgangsmåte og S. lividans TK 24 transformeres med 1-2 pg av dette DNA. Man selekterer på tendamistat-produksjon og isolerer plasmid-DNA fra denne klonen ved alkalisk Schnell-Lyse. Ved tilbaketransformering i E. coli HB 101 resp. MC 1061 og etter isolering av plasmid-DNA fra transformerte E. coli-stammer karakteriserer man plasmid pSA 1 ved restrik-sjonsanalyse (fig. 9). Plasmidet viser ingen forskjell til de fra S. 1 ividans-stammer isolerte plasmider, imidlertid er DNA-opparbeidelsen fra E. coli mer produktiv og mulig i kortere tid.
Eksempel 10
Går man fram ifølge eksempel 9, anvender imidlertid i stedet for plasmidet pIJ 102 plasmidet pIJ 350, idet det kan selekteres i S. lividans da i tillegg etter tiostrepton-resistens, så får man plasmidene pSA 350 a resp. b. Fig. 10 viser plasmidet pSA 350 a. Dette plasmid fører i ryste-kulturer til høyere utbytter av tendamistat enn plasmidet pSA 350 b, som inneholder insersjonen med tendamistat-genet i omvendt orientering. Derimot har minskningen av insersjonen til 1,5 kb ingen tydelig innvirkning på produktdannelsen.
Eksempel 11
Til fastslåelse av struktur og nukleotidsekvens av tendamistatgenet ble 0,94 kb Pst I-Bam HI-subfragment (fig. 1 a og b) samt 295 bp Sau 3a-Bam HI-subfragment (fig. 2 c) klonet i enkeltstrengfagene M 13 mp 8 og M 13 mp. 9. Som primer for dideoksy-sekvensreaksjonen tjente de 20 nukleotider omfattende DNA-sekvens A samt en kommersielt oppnåelig 15 bp-primer (Bethesda Research Laboratories GmbH., Neu-Isenburg). Det ble fastslått DNA-sekvens C.
Eksempel 12
Før strukturgenet av tendamistat befinner det seg på DNA en åpen leseramme inntil startkodon ATG (Met) for et protein, som forlagrer den aminoterminale ende av tendamistat. Dette signålpeptid tilsvarer DNA-sekvens B.
Tillegg:
DNA-sekvens C (kodende streng)
Eksempel 1 og 3 fra tysk søknad P 33 31 860.3:
Eksempel 1
Mutasjonsfremgangsmåte: Ca. 0,25 cm<2> sporet mycel av stammen DSM 2727, som dyrkes på havrefnokkagar (EP-A 49 847), overpodes i 100 ml Erlenmeyer-kolber, som er fylt med 25 ml av følgende kulturmedium: mediet autoklaveres 30 minutter ved 121°C og 1 bar, pH-verdien utgjør 7,0. Podningskolbene inkuberes 2 dager ved 30° C på en rystemaskin. Deretter overpodes 2 ml av den vaskede forkultur i 20 ml hovedkulturmedium, som befinner seg i 100 ml Erlenmeyer-kolber (EP-A 49 847):
Mediets pH-verdi utgjør etter autoklaveringen 7,6.
Til dette medium settes acriflavin i en konsentrasjon på 10-25 pg/ml som mutagent stoff. Kulturen rystes i 5 dager ved 28°C og 220 o/min. Deretter sentrifugeres kulturoppløsningen (1.300 g, 5 minutter) og cellepellet vaskes i hovedkulturmedium. De vaskede celler fragmenteres i en glass-homogenisator og utplateres på agarplater i følgende medium:
Oppløsningens pH-verdi utgjør 7,1 (autoklaveringsbetingelser som oevnfor).
Platene dyrkes 5 dager ved 28°C og enkeltkolonier overpodes i skrårør med havrefnokkagar. Disse dyrkes som omtalt inntil mycelet er forsporet. Det forsporede mycel formeres som omtalt ovenfor i for- og hovedkulturen og kulturfiltratet undersøkes etter 5 dagers hovedkultur på innholdet av tendamistat (sammenlign EP-A 39 847). På denne måte kan stammene 1-9353, 1-9362, 1-9417, 1-9418 selekteres i sin vekstperiode under de omtalte betingelser produserende ca. 90.000-100.000 IE tendamistat/1 kulturoppløsning, tilsvarende 1,5-1,8 g inaktivator/1.
Eksempel 3
Isolering av deoksyribonukleotidsyre fra S. tendae og dens molekylærbiologiske karakterisering.
Oppdrett av cellene foregikk tilsvarende eksempel 1. Etter 3 dagers vekst i hovedkulturmediet rystes cellene av en Erlenmeyer-kolbe ved 5 minutters sentrifugering ved 3000 g ved 4°C og vaskes to ganger med 50 ml av en oppløsning av 50 mM Tris/HCl-buffer, 100 mM NaCl og 25 mM EDTA.
Ved en typisk preparering dypfryses sjokkaktig 3 g fast-sentrifugerte celler i flytende nitrogen ved -198°C og homogeniseres deretter med en skjæreknivhomogenisator (Warring Commercial Blender) i nærvær av N2 til et fint pulver. Dette pulver opptas i 10 ml av nevnte buffer, oppløses på is og inkuberes med 0,8 ml lysozymoppløsning (30 mg/ml) 20 minutter ved 28°C under svak rysting. Til suspensjonen settes deretter 0,8 ml av en proteinase K-oppløsning (15 mg/ml) og 0,8 ml av en 20#-ig oppløsning av natriumsaltet av N-lauroylsarkocin. Etter forsiktig blanding inkuberes blandingen 30 minutter på is og ytterligere 15 minutter ved værelsestemperatur. Etter tilsetning og oppløsning av 22 g fast cesiumklorid, innstilles volumet med ovennevnte buffer på 22 ml og suspensjonen sentrifugeres ved 12.000 g oh 4°C i 25 minutter. Det klare sentrifugat blandes med etidiumbromid og brytningsindeks innstilles med CsCl refraktometrisk på n = 1,3920. Etter preparativ ultrasentrifugering (120.000 g, 36 timer, 15 °C) uttas båndene av kromosomal DNA fra sentrifuge-rørene og resentrifugeres under samme betingelser. De isolerte bånd befris ved utrysting med n-butanol fra etidiumbromid og dialyseres til fullstendig fjerning av CsCl. Det således utvunnede DNA er skjærbar, dvs. med enzymene Pst I, Barn H I, Sau 3 A, Cia I, Bgl II og Xho I, og ikke skjærbar, for eksempel med endonukleoasene Eco R I og Hind
III.
De eksempelvis fra mutantene 1-9353 og 1-9362 fremstilt DNA, er i forhold til DNA fra ATCC 31210 resp. DSM 2727 karakterisert bed et amplifisert genetisk element, hvis enkeltfragmenter fremtrer tydelig synbart etter farging med fluor-essensfargestoffet etidiumbromid fra bakgrunn av ikke selektivt formerte fragmenter. Størrelsen av det amplifiserte element samt de karakteristiske enkeltfragmenter etter fordøying med restriksjonsendonukleaser er gjengitt i det følgende:
Claims (9)
1.
Fremgangsmåte for fremstilling av polypeptider fra genetisk kodbare aminosyrer, karakterisert ved at man i en vertscelle fra arten Streptomyces uttrykker en genstruktur, som i leserammen med strukturgenet for det ønskede polypetidet, inneholder DNA-sekvensen B til et prepeptid, oppnåelig fra tendamistat-produserende Streptomyces tendae-stammen, som fortrinnsvis er blitt behandlet med subletale doser av akriflavin, gjennom isolering av total-DNA, spaltning med Pst I, Southern-hybridisering med DNA-sekvens A
isolering av 2,3 kb-Pst I-fragmentet, spaltning med BamHI, Southern-hybridisering med sekvens A, isolering av 0,94 kb-Pst-I-BamHI-subfragmentene, spaltning med Sau 3a, Southern-hybridisering med sekvens A, isolering av 0,525 kb-BamHI-Sau 3a-subfragmentene og sekvensering av DNA, og a) ligger umiddelbart før strukturgenet, b) koder ved aminoterminus for Met-Arg-Val-Arg-Ala-Leu-Arg, c) koder ved karboksy-terminus for Ala-Ser-Ala d) koder i midten for et hydrofobt område X, som omfatter 10 til 25 aminosyrer.
2.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at DNA-sekvens B til prepeptidet i midten, koder for et hydrofobt område X som omfatter 17 til 20 aminosyrer.
3.
Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at DNA-sekvens B for prepeptidet er isolert fra S. tendae.
4 .
Fremgangsmåte ifølge krav 1 til 3, karakterisert ved at vertscellen er av arten S.tendae eller S.lividans.
5.
Fremgangsmåte ifølge krav 1 til 4, karakterisert ved at vertscellen inneholder en signalpeptidase som spalter prepeptidet og som utskiller det ønskede polypeptidet i kulturmediet.
6.
Fremgangsmåte ifølge ett eller flere av ovennevnte krav, karakterisert ved at genstrukturen blir bragt inn i vertscellen med et plasmid som inneholder et replikon som er virksomt i streptomyceter.
7.
Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at plasmidet, bortsett fra replikonet som er virksomt i streptomyceter, inneholder et replikon som er virksomt i E.coli.
8.
Fremgangsmåte ifølge ett eller flere av ovennevnte krav, karakterisert ved at strukturgenet koder for tendamistat.
9.
Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at strukturgenet oppviser DNA-sekvens C (vedheng).
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19843418274 DE3418274A1 (de) | 1984-05-17 | 1984-05-17 | Signalpeptid fuer die exkretion von peptiden in streptomyceten |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO851971L NO851971L (no) | 1985-11-18 |
NO173452B true NO173452B (no) | 1993-09-06 |
NO173452C NO173452C (no) | 1993-12-22 |
Family
ID=6236073
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO851971A NO173452C (no) | 1984-05-17 | 1985-05-15 | Fremgangsmaate for fremstilling av polypeptider i streptomyceter |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0161629B1 (no) |
JP (1) | JPH0797993B2 (no) |
AT (1) | ATE36167T1 (no) |
AU (1) | AU580062B2 (no) |
CA (1) | CA1309674C (no) |
DE (2) | DE3418274A1 (no) |
DK (1) | DK172458B1 (no) |
ES (1) | ES8704540A1 (no) |
FI (1) | FI81113C (no) |
GR (1) | GR851184B (no) |
HU (1) | HU197351B (no) |
IE (1) | IE58385B1 (no) |
IL (1) | IL75214A (no) |
NO (1) | NO173452C (no) |
NZ (1) | NZ212085A (no) |
PT (1) | PT80483B (no) |
ZA (1) | ZA853672B (no) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1295563C (en) * | 1985-11-01 | 1992-02-11 | Robert T. Garvin | Production of active proteins containing cystine residues |
CA1295566C (en) * | 1987-07-21 | 1992-02-11 | Robert T. Garvin | Characterization and structure of genes for protease a and protease b from streptomyces griseus |
DE3707150A1 (de) * | 1987-03-06 | 1988-09-15 | Hoechst Ag | Tendamistat-derivate |
DE3714866A1 (de) * | 1987-05-05 | 1988-11-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten |
US5426036A (en) * | 1987-05-05 | 1995-06-20 | Hoechst Aktiengesellschaft | Processes for the preparation of foreign proteins in streptomycetes |
DE4012818A1 (de) | 1990-04-21 | 1991-10-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten |
DE3837271A1 (de) * | 1988-11-03 | 1990-05-10 | Hoechst Ag | Verfahren zur selektiven spaltung von fusionsproteinen |
ES2081826T3 (es) * | 1988-11-03 | 1996-03-16 | Hoechst Ag | Procedimiento para la preparacion de un producto previo de insulina en estreptomicetos. |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3331860A1 (de) * | 1983-09-03 | 1985-03-21 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur herstellung von tendamistat |
-
1984
- 1984-05-17 DE DE19843418274 patent/DE3418274A1/de not_active Withdrawn
-
1985
- 1985-05-08 AT AT85105610T patent/ATE36167T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-05-08 EP EP85105610A patent/EP0161629B1/de not_active Expired
- 1985-05-08 DE DE8585105610T patent/DE3564118D1/de not_active Expired
- 1985-05-10 HU HU851786A patent/HU197351B/hu unknown
- 1985-05-14 ES ES543120A patent/ES8704540A1/es not_active Expired
- 1985-05-15 ZA ZA853672A patent/ZA853672B/xx unknown
- 1985-05-15 FI FI851929A patent/FI81113C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-05-15 CA CA000481600A patent/CA1309674C/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-05-15 GR GR851184A patent/GR851184B/el unknown
- 1985-05-15 NO NO851971A patent/NO173452C/no not_active IP Right Cessation
- 1985-05-15 DK DK198502172A patent/DK172458B1/da not_active IP Right Cessation
- 1985-05-15 NZ NZ212085A patent/NZ212085A/xx unknown
- 1985-05-16 IL IL75214A patent/IL75214A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-05-16 IE IE122585A patent/IE58385B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-05-16 AU AU42640/85A patent/AU580062B2/en not_active Ceased
- 1985-05-16 JP JP60102801A patent/JPH0797993B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-17 PT PT80483A patent/PT80483B/pt not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ES8704540A1 (es) | 1987-04-01 |
EP0161629A1 (de) | 1985-11-21 |
DK217285D0 (da) | 1985-05-15 |
DE3418274A1 (de) | 1985-11-21 |
IL75214A (en) | 1991-03-10 |
ZA853672B (en) | 1985-12-24 |
FI81113C (fi) | 1990-09-10 |
PT80483B (pt) | 1987-09-30 |
PT80483A (de) | 1985-06-01 |
ATE36167T1 (de) | 1988-08-15 |
JPH0797993B2 (ja) | 1995-10-25 |
NO173452C (no) | 1993-12-22 |
ES543120A0 (es) | 1987-04-01 |
HU197351B (en) | 1989-03-28 |
DK172458B1 (da) | 1998-08-24 |
DK217285A (da) | 1985-11-18 |
HUT38670A (en) | 1986-06-30 |
AU4264085A (en) | 1985-11-21 |
IL75214A0 (en) | 1985-09-29 |
NZ212085A (en) | 1989-03-29 |
CA1309674C (en) | 1992-11-03 |
FI81113B (fi) | 1990-05-31 |
IE851225L (en) | 1985-11-17 |
JPS60260598A (ja) | 1985-12-23 |
NO851971L (no) | 1985-11-18 |
DE3564118D1 (en) | 1988-09-08 |
FI851929A0 (fi) | 1985-05-15 |
IE58385B1 (en) | 1993-09-08 |
EP0161629B1 (de) | 1988-08-03 |
GR851184B (no) | 1985-11-25 |
FI851929L (fi) | 1985-11-18 |
AU580062B2 (en) | 1988-12-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5470719A (en) | Modified OmpA signal sequence for enhanced secretion of polypeptides | |
US5641648A (en) | Methods for preparing synthetic repetitive DNA | |
KR930001117B1 (ko) | Dna 재조합 기술에 의한 폴리펩티드 제조방법 | |
WO1998010080A1 (en) | Salt-inducible promoter derivable from a lactic acid bacterium, and its use in a lactic acid bacterium for production of a desired protein | |
JPH04507346A (ja) | アルカリ性タンパク質分解酵素およびその製造方法 | |
US4816405A (en) | Vectors for transformation by ascomycetes | |
JP2001525662A (ja) | 合成繰り返しdnaの調製方法 | |
JPS60501837A (ja) | Dnaベクタ−とその組換えdna技術への使用 | |
Sibakov et al. | Secretion of TEM beta-lactamase with signal sequences isolated from the chromosome of Lactococcus lactis subsp. lactis | |
JPH01501755A (ja) | 合成dnaの構成および大ポリペプチドの合成におけるその使用 | |
JPH1084978A (ja) | 改良されたリボフラビン生産 | |
NO173452B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av polypeptider i streptomyceter | |
EP0429600B1 (en) | Saf polypeptide, gene, promoter and use for expression in streptomyces | |
JPH06503945A (ja) | 大腸菌、枯草菌、乳酸球菌および乳酸桿菌中で複製することができるプロモータープローブベクターならびにその使用 | |
JP3154720B2 (ja) | 誘導性発現ベクター | |
EP0191221A1 (en) | Vectors for transformation of ascomycetes | |
US5858745A (en) | Bacillus thuringiensis transformation method | |
Kenri et al. | Construction and characterization of an Escherichia coli mutant deficient in the metY gene encoding tRNAf2Met: either tRNAf1Met or tRNAf2Met is required for cell growth | |
JP2752092B2 (ja) | Deoプロモーターを有する発現プラスミド及び該プラスミドを含む細菌宿主 | |
EP1881071A1 (en) | Methods and materials relating to gene expression | |
JP2770975B2 (ja) | ストレプトミセテス突然変異体を製造する方法 | |
JPS6279794A (ja) | 殺虫用リゾビウム科菌体 | |
JP3302053B2 (ja) | オキセタノシン−aの産生に関与する遺伝子及びそれを含む組換dna | |
JPH02227083A (ja) | 新規プラスミド | |
EP0339569A2 (en) | Expression of the HIV 24 KDA GAG protein in methylotrophic yeasts |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |
Free format text: LAPSED IN NOVEMBER 2000 |