JPH06503945A - 大腸菌、枯草菌、乳酸球菌および乳酸桿菌中で複製することができるプロモータープローブベクターならびにその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２２、枯草菌、乳酸球菌および乳酸桿菌からなる群から選択される請求の範囲第 ２１項の宿主細胞。

２３、所望の異種あるいは同種の蛋白質またはペプチドをグラム陽性宿主細胞中 で生産する方法であって、該宿主細胞を請求の範囲第９項のプラスミドで形質転 換し、形質転換されたその宿主細胞を適切な培地中で、該蛋白質またはペプチド の発現を可能にする条件下で培養し、発現した蛋白質またはペプチドを該宿主細 胞または該培地から回収することからなる方法。

明　細　書 発明の名称 大腸菌、枯草菌、乳酸球菌および乳酸桿菌中で複製することができるプロモータ ープローブベクターならびにその使用本発明は分子生物学の分野に関し、より具 体的には組換え遺伝子学および遺伝子操作の分野に関する。さらに本発明はＬａ ｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉｓ（ラクトコッカス・ラクチス）から誘導され るＤＮＡ配列であって、細菌における異種または同種発現のためのプロモーター およびプロモーター／分泌促進シグナルとして有用なりＮＡ配列に関する。もう １つの側面として、本発明は、本発明の配列を含むプラスミドなどのベクターに 関し、またそのようなベクターで形質転換された宿主細胞に関する。本発明のさ らなる側面は、本発明の配列、ベクターまたは形質転換された宿主を用いて所望 の異種あるいは同種のペプチドまたはタンパク質を生産する方法に関する。本発 明を利用することにより、異種および同種の発現および分泌が著しく改善され得 る。

関連技術の説明 乳酸菌は、とりわけ有機化合物が電子供与体と電子受容体の両方として機能する 過程である発酵を行い得る点で商業上極めて重要である。乳酸発酵は、ＮＡＤ連 動乳酸デヒドロゲナーゼが触媒する一段階反応によって、気体の生成を伴うこと な（ピルビン酸を乳酸に還元し、これはチーズ製造の第１段階である。このよう に乳酸発酵はミルクや他のいくつかの食物の酸味化または酸性化の原因となる。

さらにこれらの過程は、食物や飲料の興味深くかつ望ましい香りの形成にも関与 する。

このように乳酸菌は商業的に極めて重要である。しかし現在までのところ組換え 遺伝子学に関する研究のほとんどは大腸菌などの他の細菌で行われてきた。その ため乳酸菌の遺伝子学については理解や特徴づけが比較的不十分な状態になる。

商業的な乳酸菌の培養に関する実用的な知識は豊富にあるので、これらの細菌を 理解するために組換え遺伝子技術を適用することが常に必要とされてし・る。

デ・ボス、　Ｎｅｔｈ、　Ｍｉｌｋ　Ｄａｉｒｙ　Ｊ、　４０：１４１−１５４ （１９８６）およびＦＥＭＳ　１ｌｉｃｒｏｂｉｏ１．　Ｒ■磨A　４６　： ２８１−２９５（１９８７）は、同種および異種遺伝子のクローニングと発現に 用いられる中温性連鎖球菌宿主−ベクター系を開示している総説である。乳酸連 鎖球菌宿主とクローニングベクターの性質についての要約が、形質転換の成功に 関する困難性および課題と共に記述されている。遺伝子クローニング法も議論さ れており、またいくつかの乳酸連鎖球菌ブローモーター、リポソーム結合部位お よび終結因子についても言及している。

欧州特許出願公開番号０１５７４４１は、Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）、 Ｅ、ｃｏｌｉ（大腸菌）およびＳ　ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉｓ（ 乳連鎖球菌）中で発現することができるい（つかのシャトルベクターであって、 Ｓ、　ｃｒｅ＋＊ｏｒｉｓ　Ｗ　ｇ　２プラスミドｐＷＶＯ１の大Ｃ１ａｌ断片 由来のレプリコンを含有しているベクターを開示している。この出願人らは、こ れらのベクターが、それによって形質転換された乳酸菌に改善された性質あるい は新しい性質を与え得ると述べている。この系の使用例には、Ｓ　、　１ａｃｔ ｉＳ中でのプロテアーゼおよびキモシン前駆体の発現が含まれる。

他のいくつかの報告はＳ、ｃｒｅｍｏｒｉｓ　Ｗｇ　２プロテアーゼ活性の特徴 づけに関すると思われる。例えばコクら、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅ ｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５０：９４−１０１（１９８５）はＳ、ｃｒ ｅｍｏｒｉｓ　Ｗｇ　２プラスミドｐＷＶＯ５由来の大（４，３Ｍｄ）Ｈｉｎｄ ＩＩＩのクローニングとＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ中でのその発現を開示している 。この断片は２つのタンパク質加水分解性タンパク質を含有しており、プロトプ ラスト形質転換後、これをプロテアーゼ欠損Ｓ　、　１ａｃｔｉｓ中で発現させ ることができたと報告されている。ファン・デル・フォラセンら、Ａｐｐｌｉｅ ｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５０：５４０−５４２ （１９８５）は、Ｂ、ｐｕｍｉｌｕｓクロラムフェニコール・アセチルトランス フェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を保持するＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓベクターｐＰＬ ６０８とＳ　、　ｃｒｅｍｏｒｉｓ　Ｗ　ｇ　２プラス−ドｐＷＶＯ１の最大Ｃ １ａｌ断片から誘導されたいくつかのシャトルベクターを開示している。この著 者らは、これらのベクターが乳酸連鎖球菌のブローモーターと転写終結シグナル の単離を可能にすると述べている。しかし後↓ニファン・デル・フォラセンら、 Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５３：２ ４５２−２４５７（１９８７）によって指摘されたように、Ｓ　、　１ａｃｔｉ ｓプロトプラストの形質転換効率が低いために、プロモーター活性を伴う断片は Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ中での予備クローニングを介してのみ得ることができた 。後者の報文は、一部はｐＧＫＶ２１０プラスミドによるｓ、　１ａｃｔｉｓ中 での直接クローニングによって単離され、また一部はＢ、　５ｕｂｔｉｌｉＳ中 での予備クローニングを介して単離された、様々な強度を有するいくつかのＳ　 、　ｃｒｅｗｏｒｉｓプロモーターの特徴づけを開示している。数種のＳ、　ｃ ｒｅｍｏｒｉｓプロモーターのヌクレオチド配列が開示されている。コクら、　 Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５４： ２３９−２４４（１９８ｇ）は、異種宿主Ｓ、　１ａｃｔｉｓ中にクローン化さ れたＳ、　ｃｒｅｓ。

ｒｉｓＷｇ２ブロティナーゼ遺伝子の欠失分析を開示している。ファン・デ・グ クテら、　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｉ＋ｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌ、　５５：２２４−２２８（１９８９）は、Ｌａｃｔｏｃｏモモ浮刀@１ａｃ ｔｉｓ中で異種遺伝子を発現させるための一対のベクターの構築を開示しており 、このベクターはり、　ｃｒｅｍｏｒｉｓ　Ｗ　ｇ　２に由来する遺伝子発現シ グナルが隣接した複数クローニング部位を含有している。この系は、Ｌ、　１ａ ｃｔｉｓ中で真核鶏卵白リゾチーム（ＨＥＬ）コード化配列を含有する融合遺伝 子を発現させるために用いられた。

しかし発現した融合タンパク質からりゾチーム活性は検出されず、この著者らは その理由を、融合タンパク質が不活性であったか、あるいは生産量が少な過ぎる ために検出できなかったからであると述べている。

シモンスら、　Ｊ、　Ｄａｉｒｙ　Ｓｃｉ、　７１（Ｓｕｐｐ　１）　：Ａｂｓ ｔｒ、　Ｄ６４（１９８８）は、潜在（クリブチイー／り）Ｓ、１ａｃｔｉｓプ ラスミドｐｓＨ７ルブリコンと乳酸連鎖球菌特異的発現シグナルに基づく高効率 発現ベクターを開示している。前提となるＥ、ｃｏｌｉおよびＢ、５ｕｂｔｉｌ ｉｓ共通配列に似た配列が同定され、これらの宿主中で極めて効率的に機能した と述べられている。さらに、これらの発現シグナルが乳酸連鎖球菌中でのβ−ガ ラクトシダーゼとキモシンの合成に用いられたと述べられている。

フォスら、　Ｊ、　Ｄａｉｒｙ　Ｓｃｉ、　７１（Ｓｕｐｐ　１）　：Ａｂｓｔ ｒ、　Ｄ６５（１９８ｇ）は、Ｓ　、　ｃｒｅｍｏｒｉｓ　r　Ｋ　１ １が非苦味細胞壁（ｎｏｎ−ｂｉｔｔｅｒ　ｃｅｌｌ　ｗａｌｌ）関連プロテア ーゼを含有することを開示し、その完全な遺伝子をクローン化し、配列決定した 。この遺伝子ともう１−）のプロ子イナーセ遺伝子を含有するＤ　Ｉ’Ｊ　Ａ断 片を乳酸連鎖球菌クローニングベクター（ｐＮＺ５２１）中にり１コーン化し、 発現させたと述べている。

コンド−、Ｊ、　Ｄａｉｒｙ　Ｓｃｉ、　７１（Ｓｕｐｐ　ｉ）：Ａｂｓｔｒ、 　０１２５（１９８８）は、乳酸連鎖球菌中での遺伝ｊ−転移とイ６主−ヘクタ ー系の開発によってこわら工業的に重要な細菌の遺伝１学とプラス、ド生物学の 研究が可能になった−とを開示している。基本的に４種類の遺伝子転移法（即ち 、形質導入、接合、プロトプラスト融合および形質転換（トラごスフォーメーン ヨン）２／トランスフエクノヨン）があるとされている。

また、ＥｓｃｈｅｒｉＣｂｉａ　ｃｎｌｉ（大腸菌）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕ ｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）および５ｔｒｅｐｔｏｃ。

ｃｃｕｓ　ｓａｎｇｕｉｓ（スＩ・レプトコッカス・サンダイス）中で乳酸連鎖 球菌遺伝子をクローニングＩ７分析するためのシャトルベクター系によって、遺 伝子および遺伝子産物の詳細な分子分析が可能になると述べられている。

デ・ボス、　Ｊ、　Ｄａｉｒｙ　Ｓｃｉ、　７１　（Ｓｕｐｐ　１）　：Ａｂｓ ｔｒ、　０１２７（１９８８）は、中温性乳酸連鎖球菌であるＳ、１ａｃｔｉｓ とＳ、ｃｒｅｍｏｒｉｓ中のプラスミドに位置する遺伝子の体制と発現を研究す るために、最近確立された宿主−ベクター系を使用したことを開示している。工 業的な発酵におけるこれらの株の使用にとって重要な同種遺伝子と、新規な性質 を有する株を構築するために使用し得る異種遺伝子に、はとんどの注意が集約さ れたと述べられている。また、乳糖およびカゼイン分解事象をコード化する同種 遺伝子並びにＳ　、　１ａｅｔｉｓプラスミドｐｓＨ７１のコピー数の調節制御 が分析されたこと、および発現したタンパク質の細胞位置を指示する位置決定性 （ｔｏｐｏｇｅｎｉｃ）配列が同定されたことが述べられている。

上述の議論に例示される他の研究者らによる試みにもかかわらず、いまでもグラ ム陽性細菌における同種発現そしてとりわけ異種発現の手段および方法の改善が 必要とされている。さらに本発明者らの知るところでは、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕ ｓ　１ａｃｔｉｓ（ラクトコッカス・ラクチス）亜種１ａｃｔｉｓ（ラクチス） 系に関する有意義な研究は存したがって本発明者らはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　 １ａｃｔｉｓ亜種１ａｃｔｉｓから新規なプロモーターおよびブロモ−ターフ分 泌促進シグナルを発見し、これを単離し、クローン化し、さらに配列決定した。

これはＥ、ｃｏｌｉおよびとりわけグラム陽性細菌中で異種並びに同種のタンパ ク質およびペプチドを生産するのに有用である。

本発明の新規配列を解明する過程で、Ｌａｅｔｏｅｃｘ：ｅｕｓ　１ａｃｔｉｓ 亜種１ａｃｔｉｓプロモーターを同定するためのプローブとして作用するい（つ かのベクターであって、それら自体が新規なベクターを設計し構築する必要があ った。したがって本発明の一態様は、図５に示すように構築されるプラスミドｐ ＫＴＨ１７３４およびｐＫＴＨ１７３６あるいはその機能的誘導体からなる群か ら選択される、Ｅ、ｃｏｌｉ（大腸菌）、Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）、 Ｌａｃｔｏｃｏｃｅｉ　（乳酸球菌）および’Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ（乳 酸桿ｍ＞中で複製することができるプロモーターブローブーベクターを提供する 。また、図１に示すヌクレオチド配列を有する複数クローニング部位あるいはそ の機能的誘導体ををさらに含む上記プロモーターブローブーベクターをも提供す る。

さらに、プラスミドｐＫＴＨ１７５０あるいはその機能的誘導体からなる、Ｅ、 ｃｏ１ｉ％Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ、　ＬａｃｔｏｃｏｃｃｉおよびＬａｃｔｏｂ ａｃｉｌｌｕｓ中で複製することができるプロモータープローブ−ベクターをも 提供する。これらのプロモーターブローブーベクターのいずれかで形質転換され たＥ、ｃｏｌｉ、　Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ、　ＬａｃｔｏｃｏｃｃｉおよびＬａ ｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ宿主は本発明のさらなる態様を構成する。

本発明のプロモータープローブ−ベクターを用いることにより、本発明者らは過 去に知られておらずまた記述されたこともなかったり、　１ａｃｔｉｓ亜種１ａ ｃｔｉｓプロモーターおよびプロモーター／分泌シグナル促進ヌクレオチド配列 をクローン化し、配列決定することができた。したがって、もう１つの態様とし て本発明は、図９．１０．１１．１２．１３．１４．１５．１６．１７または１ ９に示す実質上純粋なヌクレオチド配列あるいはそれらの機能的または化学的誘 導体を提供する。これらの配列を有益にプラスミド中に組込むことができ、それ を用いることによってＥ、　ｃｎｌｉ中で、および特にグラム陽性細菌中で、異 種タンパク質の発現を増大させることが可能になった。したがってこれらのヌク レオチド配列を含むプラスミドは本発明のもう１つの態様を構成する。

本発明の配列およびプラスミド中には、プラスミドｐＫＴＨ１７８９、ｐＫＴＨ １８１６、ｐＫＴＨ１８１７、ｐＫＴＨ１８２０、ｐＫＴＨ１８２］およびｐＫ ＴＨｌ、８７４中に認められる配列によって例示される、Ｌ、　１ａｃｔｉｓ亜 種１ａｃｔｉｓ由来のプロモーター配列を含むものがある。本発明の他の配列お よびプラスミドはプロモーターと分泌促進シグナルの両方を含み、これらはプラ スミドｐＫＴＨ１７９７、ｐＫＴＨ１７９８、ｐＫＴＨ１７９９、ｐＫＴＨｌ８ 旧、ｐＫＴＨ１８０５、ｐＫＴＨ１８０６、ｐＫＴＨ１８０７およびｐＫＴＨ１ ８０９中に認められる配列によって例示される。これらのプラスミドとそれらそ れぞれのヌクレオチド配列は本発明のもう１つの態様を構成する。

しかし上記の配列およびプラスミドに加えて本発明の重要な教示は、これらのプ ラスミドと配列の調節要素を組換えることによって、Ｅ、ｃｏｌｉおよび特にグ ラム陽性細菌中での異種発現の増大を可能するように一体となって機能し得る／ １イブリッド発現単位を作成することができるという本発明者らによる発見であ る。したがってもう１つの態様として、プラスミドｐＫＴＨ１７８９、ｐＫＴＨ １８１６、ｐＫＴＨ１８１７、ｐＫＴＨ１８２０、ｐＫＴＨ１８２１およびｐＫ ＴＨ１８７４中に認められる配列のいずれかによって例示されるプロモーター配 列と、プラスミドｐＫＴＨ１７９７、ｐＫＴＨ１７９８、ｐＫＴＨ１７９９、ｐ ＫＴＨ１８０１、ｐＫＴＨ１８０５、ｐＫＴＨ１８０６、ｐＫＴＨ１８０７およ びｐＫＴＨ１８０９中に認められる配列によって例示されるようなプロモーター と分泌促進シグナルの両方を含む本発明のプラスミドおよび配列から誘導される 分泌促進シグナルとから構成されるハイブリッド発現単位が、本発明によって提 供される。限定のためではなく例示としての一態様では、プロモーター配列がプ ラスミドｐＫＴＨ１，８１７から誘導され、分泌シグナル配列がプラスミドｐＫ ＴＨ１８０７から誘導されるハイブリッド発現単位が提供される。

もう１つの側面として本発明は、本発明の配列またはプラスミドのいずれかによ って形質転換されたＥ、　ｃｏｌｉおよび特にグラム陽性宿主細胞に関する。当 然のことながら、本発明ではプラスミドが、生としてグラム陽性宿主中で発現さ せることが望まれる１またはそれ以上の同種または異種タンパク質あるいはペプ チドをコード化するヌクレオチド配列をさらに含有し２てもよい。本発明の宿主 細胞は、Ｅ、ｅｏｌｉおよびグラム陽性のＢ、５ｕｂｔｉ１ｉｓ、、Ｌａｃｔｏ ｃｃｏｅｉおよびＬａｅｔｏｂａｃｊ、１１ｕｓ宿主からなる群から選択される 。

本発明のさらなる態様は、異種または同種のタンパク質あるいはペプチドを発現 させる方法であって、Ｅ、ｅｏｌｉまたはグラム陽性宿主細胞を本発明のプラス ミド（このプラスミドは所望のタンパク質またはペプチドをコード化するヌクレ オチド配列をも含有する）で形質転換し、その形質転換した宿主細胞を適切な培 地中で該タンパク質またはペプチドの発現を可能にする条件下で培養し、発現し たタンパク質またはペプチドを該宿主細胞または該培地から回収することからな る方法を提供する。

これらの態様や本発明のさらなる態様は、以下に記載する本発明の詳細な説明を 参照することによってより明らかになり、また当業者には容易に理解されるで図 １＝ベクターｐＫＴＨ１７３６中の複数クローニング部位（ＭＣ３）をクローン 化する際に使用されるオリゴヌクレオチド。

図２：インビトロで合成されるβ−ラクタマーゼ前駆体のサイズ。レーン１゜β −ラクタマーゼ対照：レーン２．ｐＫＴＨ１７９７＋レーン３．ｐＫＴＨ１７９ ８：レーン４．ｐＫＴＨ１７９９：レーン５．ｐＫＴＨ１８０１；レーン６゜Ｍ 、標準。技術的詳細については本文を参照のこと。

図３＝ノーザンハイブリッド形成によって得たり、　１ａｃｔｉｓ亜種１ａｃｔ ｉｓプロモーター構築物（パネルＡ）およびプロモーターングナル配列構築物（ パネルＢ）のｍＲＮＡ０パネルＡ：プロモーター構築物ｐＫＴＨ１８１６（１） 、ｐＫＴＨ１８１７（２）、ｐＫＴＨ１８２０（３）、およびｐＫＴＨ１８２１ （４）からｍＲＮＡを単離し、ラベル化したｐＰＬ６０３でプローブした。バン ドを可視化するために、Ｘ線フィルムに１時間暴露した。パネルＢ：プロモータ ーシグナル配列構築物ｐＫＴＨ１８０５（５）、ｐＫＴＨ１８０６（６）、ｐＫ ＴＨ１８０７（７）、およびｐＫＴＨ１８０９（８）からｍＲＮＡを単離し、ラ ベル化したｐＫＴＨ７８をプローブとして用いた。バンドを可視化するために、 フィルムに終夜暴露した。

図４　ベクターｐＫＴＨ１７２２の構築。

図５：ベクターｐＫＴＨ１７３４およびｐＫＴＨ１７３６の構築。

図６：プロモーターブローブベクターｐＫＴＨ１７５０゜図７　：　ｐＫＴＨ３ ３に基づくベクターｐＫＴＨ１７９７、ｐＫＴＨ１７９８、ｐＫＴＨ１７９９お よびｐＫＴＨ１８０１の構築、並びに、ｐＶＳ２に基づくベクターｐＫＴＨ１８ ０５、ｐＫＴＨ１８０６、ｐＫＴＨ１８０７およびｐＫＴＨ１８０９の構築。

図８ニプライマー伸長によるＬ　、　１ａｃｔｉｓ亜種１ａｃｔｉｓプロモータ ー・構築物のｍＲＮＡの５°末端の同定。プロモーターは構築物ｐＫＴＨ１８１ ７（パネルＡ、レーン１）、ｐＫＴＨ１８２０（パネルＡ、レーン２）、ｐＫＴ Ｈ１８２１（）くネルＢ。

レーン３）、およびｐＫＴＨ１８１６（パネルＢ、レーン４）に由来する。パネ ルＡ中の標準配列は構築物ｐＫＴＨ１８１７中のプロモーターに由来し、ｌ＜ネ ルＢは構築物ｐＫＴＨ１８１６中のプロモーターに由来する。

図９　：　ｐＫＴＨ１８１６の配列。配列の上に付した黒点はｍＲＮＡの開始部 位を示し、それが括弧内にある場合には考え得る第２の開始部位を示す（これは プラスミド配列を示すすべての図について一般にあてはまることである）。

図１０　：　ｐＫＴＨ１８１７の配列。

図１１　：　ｐＫＴＨ１８２０の配列。

図１２　：　ｐＫＴＨ１８７４の配列。

図１３　：　ｐＫＴＨ１７８９の配列。

図１４　：　ｐＫＴＨ１７９７の配列。

図１５・ｐＫＴＨ１７９８の配列。

図１６・ｐＫＴＨ１７９９の配列。

図１７　：　ｐＫＴＨ１８０１の配列。

図１８二図２０のハイブリッドベクターの構築で使用したオリゴヌクレオチドブ ライマー。

図１９・ｐＫＴＨ１８２１の配列。

図２０：ハイブリッドベクターｐＫＴＨ１８８９の構築。

好ましい態様の説明 以下の説明では、分子遺伝学と生物学の分野の技術者に知られている様々な方法 論を引用する。ここに引用するそのような既知の方法論について説明した刊行物 その他はすべて、ここに完全に記述したものとして本明細書の一部を構成する。

組換えＤＮＡ技術の一般的原理を記述している標準的な参考文献には下記のもの が含まれる：　ｆａｔｓｏｎ、　Ｊ、　Ｄ、ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ ｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ、第１巻および第■巻、出版社Ｔｈｅ　Ｂｅｎ ｊａｍｉｎ／ＣｕＣｕｍｍ１ｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｉｎ ｃ、カリフォルニア州メロンパーク（１９８７）　：　Ｄａｒｎｅｌｌ、　Ｊ、 　Ｅ、ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、出版社５ｃｉｅｎ ｔ奄■ ｉｃ　Ａ＋＊ｅｒｉｃａｎ　Ｂｏｏｋｓ、　Ｉｎｃ、、ニューヨーク州ニューヨ ーク（１９８６）　；　Ｌｅｗｉｎ、　Ｂ、　Ｍ、　、　Ｇ■獅■ Ｉｌ、出版社Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、ニューヨーク州ニューヨー ク（１９８５）　＋　Ｏｌｄ、　Ｒ，ｆら。

Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：Ａｎ　Ｉ ｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉ獅■■窒奄獅■B 第２版、出版社Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　Ｐｒｅｓ ｓ、カリフォルニア州ノく−クレイ（１９８１）　：　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ 、ら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ ｎｕａｌ、出版社ＣｏPｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク州コールドスプリン グハーバ−（１９ｇ２）。微生物学の一般的原理については、例えばＤａｖｉｓ 、　Ｂ、　Ｄら、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、出版社Ｈａｒｐｅｒ　 ＆　ＲＯｗ、ペンシルバニア州フィラデルフィア（１９８０）などに説明されて いる。

「プロモーター」とは一般にＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を開始するＤＮ Ａ分子上の領域を意味する。プロモーターのヌクレオチド配列は、それに結合す る酵素の性質とＲＮＡ合成速度の両方を決定する。本明細書で用いる場合、「プ ロモーター」は好ましくはり、　１ａｃｔｉｓ亜種１ａｃｔｉｓから誘導される ヌクレオチド配列を指す。同様に、「プロモーター／シグナル促進配列」とは一 般にプロモーター配列に加えて１６〜３５アミノ酸セグメントをコード化する配 列を含むヌクレオ千ド配列を意味し、該アミノ酸セグメントは通常、脂質二層膜 中に埋め込まれることになる疎水性アミノ酸を含有し、付随するタンパク質また はペプチド配列の宿主細胞からの分泌を可能にし、さらに通常は該タンパク質ま たはペプチドから切断される。本明細書で用いる場合、「プロモーター／シグナ ル促進配列」は好ましくはり、　１ａｃｔｉｓ亜種１ａｃｔｉｓから誘導される ヌクレオチド配列を指す。

「ハイブリッド発現単位」とは、発現機能または発現および分泌機能を保持する 異なる、もしくは別個の配列を作成するための、本発明のプロモーターとプロモ ーター／シグナル促進配列のあらゆる組み合わせを意味する。数多くの上記ハイ ブリッド発現単位を作成するために本発明の配列を組み合わせる方法と様式は当 業者にはよく知られており、本明細書でも説明し例示する。さらに、本発明を完 全に理解した当業者なら、与えられた異種または同種タンパク質あるいはペプチ ドの発現と分泌を最適化するために上記ハイブリッド発現単位を作成することが でき、さらにはそれが望ましいことを認識するであろうし、またそれが全（あり きたりの技術によるよく知られた組換え法を用いて行われることをも認識するで あろう。

「クローニング」とは、特定の遺伝子または他のＤＮＡ配列をベクター分子中に 挿入するためのインビトロ組換え技術の使用を意味する。所望の遺伝子を成功裏 にクローン化するためには、ＤＮＡ断片を生成させる方法、その断片をベクター 分子に結合させる方法、混成りＮＡ分子をそれが複製できる宿主細胞中に導入す るための方法、および数ある受容宿主細胞のなかから標的遺伝子を保持するクロ ーンを選択する方法を使用する必要がある。

ｒｃＤＮＡＪとは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）の作用によ ってＲＮＡ鋳型から生産される相補的ＤＮＡまたは複写ＤＮＡを意味する。した がってｒｃＤＮＡクローン」とは、クローニングベクター中に保持された、目的 のＲＮＡ分子に相補的な二本鎖ＤＮＡ配列を意味する。

ｒｃＤＮＡライブラリー」とは、ある生物の全ゲノムと共にｃＤＮＡ挿入物を含 有する組換えＤＮＡ分子の収集物を意味する。このようなｃＤＮＡライブラリー は当業者に公知の方法で調製することができ、例えば上記１１ａｎｉａｔｉｓら 、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１ｌａｎ ｕａｌなどに記述されている。一般にはまず、クローン化しようとする特定の遺 伝子を含有するゲノムをもつ生物の細胞からＲＮＡを単離する。本発明の目的に とって好ましいものは細菌の細胞系である。

「ベクター」とは、プラスミドまたはバクテリオファージから誘導されるＤＮＡ 分子であって、その中にＤＮＡの断片を挿入またはクローン化することができる ものを意味する。ベクターは１またはそれ以上のユニーク（一つしかない）部位 を含有するであろうし、またこれは限定された宿主または運搬生物中で自律的に 複製することが可能であり得るのでクローン化された配列が再生産され得る。し たがってｒＤＮＡ発現ベクター」とは、自律要素のゲノム中に追加のＤＮＡ配列 が挿入された後に、宿主の染色体とは独立して宿主中で複製することができるあ らゆる自律要素を意味する。このようなりＮＡ発現ベクターには細菌プラスミド およびファージが含まれる。ただし、本発明の目的にとって好ましいものはり、 　１ａｃｔｉｓから誘導されるプロモーターとプロモーター−分泌促進配列を含 むプラスミドである。

「実買上純粋な」とは、それぞれ他のタンパク質または遺伝子あるいは天然に通 常認められるであろう他の混入物を基本的に含有せず、それ自体は天然には認め られない形態で存在する、本発明のあらゆるタンパク質またはそのようなタンパ ク質をコード化するあらゆる遺伝子を意味する。この用語は、Ｌ、　１ａｃｔｉ ｓから誘導される本発明のプロモーターおよびプロモーター−分泌促進配列をコ ード化するヌクレオチド配列についても用い得る。「機能的誘導体」とは、ある 分子の「断片」、「変種」、「類縁体」または「化学的誘導体」を意味する。例 えば本発明のＤＮＡ配列のいずれかなどの分子の「断片」とは、その分子のあら ゆるヌクレオチド部分集合を意味する。このような分子の「変種」とは、その全 分子またはその断片のいずれかに実質上類似している天然に存在する分子を意味 する。ある分子の「類縁体」とはその全分子またはその断片のいずれかに実質上 類似している非天然分子を意味する。

２つの分子のアミノ酸配列が実質上同じである場合、それらを互いに「実質上類 似している」という。実質上類似するアミノ酸分子は類似する生物学的活性を有 するであろう。したがって２つの分子が類似する活性を有するとすれば、たとえ それらの分子の一方が他方の分子中には認められないアミノ酸残基を追加して含 有していたとしても、あるいはたとえアミノ酸残基の配列が同一でなかったとし ても、それらは本明細書の用いる用語としての変種であると見なされる。本明細 書で用いる場合、ある分子が通常もう１つの分子の一部を構成しない化学物質部 分を追加して含有する場合、その分子を他方の分子の「化学的誘導体」であると いう。このような部分はその分子の溶解度、吸収性、生物学的半減期などを改善 することがある。あるいはこれらの部分がその分子の毒性を減じたり、その分子 の望ましくない副作用を除去あるいは緩和することもあろう。このような効果を 媒介することができる部分は例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐｈａｒｍａｃ ｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ ｇ　Ｃｏ、　、ベンフルバニア州イーストン（１９８０）などに開示されている 。

同様に、本発明の分子のいずれかをコード化する遺伝子の「機能的誘導体」とは 、ヌクレオチド配列が「実質上類似」し得、また類似する活性を有する分子をコ ード化する、該遺伝子の「断片」、「変種」または「類縁体」を含むことを意味 する。

ＤＮＡなどの核酸分子が転写および翻訳調節情報を含むヌクレオチド配列を含有 し、そのような配列があるポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列に「作 動可能に連結」されている場合、そのような核酸分子はそのポリペプチドを「発 現させることができる」という。作動可能な連結とは、調節ＤＮＡ配列と発現さ せようとするＤＮＡ配列とが、遺伝子発現を可能にするような方法で結合されて いる連結である。遺伝子発現に必要な調節領域の正確な性質は生物によって異な り得るが、一般にプロモーター領域を含むであろう。原核生物の場合、このプロ モーター領域は（ＲＮＡ転写の開始を指示する）プロモーターと、ＲＮＡに転写 された時にタンパク質合成開始の信号となるＤＮＡ配列との両方を含有する。通 常このような領域には、ＴＡＴＡボックスやシャイン−ダルガノ配列など、転写 と翻訳の開始に関与する５°非コ一ド配列が含まれるであろう。

所望により、上述の方法によって、タンパク質をコードする遺伝子配列の３゜側 に位置する非コード領域を得ることもできる。この領域は、終結などの転写終結 調節配列として残しておくことができる。したがってタンパク質をコードするＤ ＮＡ配列に天然に連続している３°領域を残しておくことによって、転写終結シ グナルが提供されることになり得る。その転写終結シグナルが発現宿生細胞中で 十分に機能的でない場合には、その宿主細胞中で機能する３°領域に！換するこ とができる。

２つのＤＮＡ配列（例えばプロモーター領域配列と異種タンパク質コード化配列 ）間の連結の性質が、（１）枠移動（フレームシフト）突然変異をもたらさない 、（２）プロモーター領域の、異種タンパク質遺伝子配列の転写を指示する能力 を妨害しない、あるいは（３）異種タンパク質遺伝子配列の、プロモーター領域 配列によって転写される能力を妨害しない場合に、これら２つのＤＮＡ配列が作 動可能に連結されているという。したがって、あるプロモーターがあるＤＮＡ配 列の転写を達成することができるのであれば、そのプロモーター領域はそのＤＮ Ａ配列に作動可能に連結されているであろう。

上述のように、タンパク質を発現させるためには適当な宿主によって認識される 転写および翻訳シグナルが必要である。

好ましい態様では、導入される配列が、受容宿主中で自律的に複製することがで きるプラスミドベクター中に組み込まれるであろう。この目的には、広範囲にわ たる様々なベクターのいずれをも使用することができる。特定のプラスミドベク ターを選択する際に重要な因子には次のものが含まれる：そのベクターを含有す る受容細胞を認識し、それを、そのベクターを含有しない受容細胞から選択する ことが容易であること：特定の宿主における所望のベクターコピー数：およびそ のベクターを異なる種の宿主細胞間で「シャトル（往復）」させ得ることが望ま しいか否か。好ましい原核ベクターにはＥ、ｃｏｌｉ中で複製可能なものなどの プラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ＣｏＩＥｌ、ｐｓｃｌｏｌ、ｐＡｃＹｃ１８ ４、π■Ｘなど）が含まれる。このようなプラスミドは、例えばＭａｎｉａｔｉ ｓ、　Ｔ、ら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　ニ ューヨ[ク州 コールドスプリングハーバ−（１９８２））に開示されている。ｈｃｉｌｌｕｓ プラスミドにはｐｃ１９４、ｐｃ２２１、ｐＴ１２７などが含まれる。このよう なプラスミドはＧｒｙｃｚａｎ、　Ｔ、　（Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉ ｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂａｃｉｌｌｉ、＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ唐刀A 　ニュー ヨーク（１９８２）、　３０７−３２９頁）に開示されている。特に好ましい本 発明のベクターはＥ、ｃｏｌｉ、　Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ％Ｌａｃｔｏｃｏｃｃ ｉおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ中で複製することができるものである。

上記構築物を含有するベクターあるいはＤＮＡ配列を発現のために調製したら、 そのベクターまたはＤＮＡ構築物を、様々な好適な手段のいずれかによって適当 な宿主細胞中に導入することができる。そのような手段には形質転換（トランス フォーメーシヨン）、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、リン 酸カルシウム沈殿法、あるいはジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストラン などのポリカチオンの応用などの生化学的手段や、エレクトロポレーション（電 気穿孔法）、直接マイクロインジェクション（微量注入法）、あるいはマイクロ プロジェクタイル（微小投射物）（バイオリスティック）衝突法（Ｊｏｈｎｓｔ ｏｎら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４０（４８５８）　：　１５３８（１９８８））な どの機械的手段が含まれる。

ベクターを導入した後、ベクター含有細胞の生育を選択する選択培地中で受容細 胞を生育させる。クローン化した遺伝子配列の発現は、所望の異種または同種タ ンパク質の生産、あるいはこのタンパク質断片の生産をもたらす。

発現したタンパク質は、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニティークロ マトグラフィー、電位泳動など従来の条件に従って単離・精製することができる 。例えば細胞を遠心分離か、あるいは適当な緩衝液を用いて集め、溶解し、タン パク質を例えばＤＥＡＥ−セルロース、ホスホセルロース、ポリリボシチジル酸 −アガロース、ヒドロキシアパタイトなどによるカラムクロマトグラフィーによ って単離するか、あるいは電気泳動や免疫沈降によって単離することができる。

好ましい態様として、本発明のプロモーター／分泌促進シグナルのいずれかを使 用すれば、発現したタンパク質が宿主細胞から分泌もされ、単離および精製操作 が簡潔化されるという利点を与えるであろう。

別法として、発現した異種タンパク質またはその機能的誘導体を、その所望のタ ンパク質または機能的誘導体に対する抗体を使用して単離することもできる。

このような抗体はよく知られている方法で得ることができる。

当業者は、以下の実施例を参照することにより、本発明を実行する手段と方法を より完全に理解するであろう。ただしこれらの実施例は本発明の範囲あるいは本 発明に係る請求の範囲を制限しようとするものではない。

使用した細菌株を表１に列挙する。

表１ 細菌株、遺伝子型および供給源 Ｅ、ｃｏｌｉ　ＴＧＩ　ＥＲＦ１７３　Ｋ１２Δ（ｌａｃ　ｐｒｏ）　ＥＭＢＬ 　（ＥｕｒｏｐｅａｎｓｕｐＥ　ｔｈｉ　ｈｓｄＤ５　Ｍｏ１ｅｕｌａｒ　Ｂｉ ｏｌｏｇｙＦ’　ｔｒａ３５　ｐｒｏ＾＋、　Ｂ＋　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）ｌ ａｑＩｑｌａｃＺ　Ｍ２Ｓ Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＢＲＢＩ　＋ａｅｔＢ５５ａｃＡ３２１　Ｐａ１ｖａ 　１．　、　Ｇｅｎｅ１９：８ｌ−８７（１９８２） Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉｓ　ＧＲＳ５　形質転換可能　Ｖａｌｉｏ ”亜種１ａｃｔｉｓ　１ｌＧ１６１４　Ｇａ５５ｏｎ　Ｍ。

Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｖａｌｉ。

２Ｖａｌｉｏ　Ｆｉｎｎｉｓｈ　Ｃｏ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ　Ｄａｉｒｉｅｓ’ ＾５ｓｏｃｉａｔｉｏｎＥ、ｃｏｌｉとＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ株の増殖にはル リアブロス（Ｌｅｎｎｏｘ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１：１９０−２０６（１９５ ５））を使用した。Ｌ、　１ａｃｔｉｓにはＭ１７ＧまたはＭ１７ＧＳブロス（ Ｔｅｒｚａｇｈｉら。

＾ｐｐ１．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２９　：８０７−８１３（１９７５）　） を使用し、Ｌ、　ｐｌａｎｔａｒｕｍにはＭＲＳブロス（Ｄ■ Ｍａｎら、Ｊ、＾ｐｐ１．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　２３：１３０−１３５（１ ９６０）を使用した。

表２ ｔ　ｃ　１２．５　μｇ／ｍｌ Ｌ、１ａｃｔｉｓＧＲ３５Ｍ１７Ｇ、Ｍ１７ＧＳ　ｃｍ４−５μｇ／＋１ｐ　Ｖ 　Ｓ　２　Ｅ、　ｃｏｌｉ、　Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｌｉｓ、　Ｌ、　１ａｃｔｉ ｓ、　Ｌ、　ｐｌａｎｔａｒｕｍ間のシャトルベクタ[ ５ｋｂ、　ｅｍ’、　ｃｍ’ ｖａｎ　ｆｒｉｇｈｔら、＾ｐｐ１．　Ｅｎｖｉｒｏｎｓ、　ｌ１ｉｃｒｏｂｉ ｏ１．５３　：　１５８４−１５８８（１９８７）に記述されている。

ｐＡＭＢｌｌ　Ｂａｃｉｌｌｕｓベクター、５．３ｋｂ、ｋｍ’、ｃｍ’Ｚｕｋ ｏｗｓｋｉら（Ｇｅｎｅ　４６：２４７−２５５（１９８６））に記述されてい る。

４、６　ｋ　ｂ、　Ｅ、ｃｏｌｉ中でａｐ’、　ｃｍ’、　Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉ ｓ中でｃｍ’（Ｍｉｃｈｅｌら、　Ｇｅｎｅ　１２：１４７−１５４（１９８０ ））ｐｓＨ７１潜在（クリプテイック）ｌ、　１ａｃｔｉｓプラスミド、２ｋｂ Ｇａｓｓｏｎ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５４：１−９（１９８３）に 記述されている。

およびＰｅｎｄｅｎ、　Ｋ、ｆ、　Ｃ，、Ｇｅｎｅ　２２：２７７（１９８３） に記述されている。

ｐＰＬ６０３　Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓのためのプロモータークローニングベクタ ー４．８ｋｂ、ｋｒｒ＋’ Ｄｕｖａｌら、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５８ニア８４−７９０（１９ ８４）に記述されている。

ｐＫＴＨ７８Ｂａｃｉｌｌｕｓベクター５．５　ｋ　ｂ、　ｋｍ’ＴＥＭ−β− ラクタマーゼ遺伝子を含有している。

Ｐａ１ｖａら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾７９ ：５５８２−５５８６（１９８２）に記述されている。

クローンをスクリーニングするためのＥ、ｃｏｌｉからのプラスミドＤＮＡの迅 速単離をＨｏｌｗｅｓら（＾ｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３４：１９３−１ ９７（１９８０））に従って行った。制限酵素消化用のＤＮＡを１１１またはｌ Ｑ＋１の液体培養からＢ　ｉｒｎｂｏｉｍらの方法（Ｎｕｃｌ、　Ａｃｔｄｓ　 Ｒｅｓ、　７：１５１３−１５２３（１９７９））によって調製した。制限酵素 処理に先立ってＲＮＡ５　ｅ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を加えた。

［１，５１ｂｔｉ１．ｉｓからのプラスミドＤＮＡ単離はＧ　ｒｙｃｚａｎら（ Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１３４＋３１８−３２９（１９７８））に従って 行った。Ｌ、　１ａｃｔｉｓ亜種１ａｃｔｉｓからのプラスミドＤＮＡ単離は、 小規模単離および大規模単離のどちらについてもＡｎｄｅｒｓｓｏｎら（＾ｐｐ １．　Ｅｎｖｉｒｏ止」１ｃｒｏｂｉｏ１．４６：５４９−５５２（１９８３） ）に従つて行った。

上述の方法によってり、　１ａｃｔｉｓ亜種１ａｃｔｉｓから染色体ＤＮＡを単 離し、染色体バンドのみをＣｓＣ１工程から集めた。

ＤＮＡのさらなる精製が必要な場合には、そのＤＮＡ！ｉｆ製物の供給源にかか られず、ＣｓＣ１−ＥｔＢｒ密度勾配遠心分離によって行った。

制限酵素消化は製造者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、　ＢＲＬ、　Ｐｒｏａ＋ｅｇａ ）の推奨するところに従って行った。消化したＤＮＡを０．８％アガロースゲル 電気泳動（Ｓｈａｒｐら、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ１ｓｔｒｙ　１２：３０５５−３ ０６３（１９７３））で分離し、次いで下記のフェノール−液体窒素凍結法によ ってＤＮＡを抽出・精製することにより、選択した制限断片を得た：所望の断片 を含有するアガロースの切片をシリコン処理したエツペンドルフチューブに移し 、ガラス棒ですり潰した。約２５０μｍのＴＥ緩衝液を等量のフェノールと共に 加えた。ポルテックス撹拌機で完全に混合した後、チューブを液体窒素に凍結す るまで浸した。１２０Ｏｒｐｍで１５分間の遠心分離によって層を分離し、次い でフェノール抽出を繰り返し、得られた水層をエーテルで処理し、エタノール沈 殿に付した。

もう１つのＤＮＡ断片単離法としてＨａｗｋｉｎｓら（Ｃｕｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ 、　９：３０５−３１１（１９８５））が記述た方法を使用するか、あるいは「 モデルＵＥＡアンダイレクショナル・エレクトロエル−ター・アナリティカル（ Ｍｏｄｅｌ　ＵＥＡ　Ｕｎｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｏ ｒ＾ｎａｌｙｔｉｃａｌ）Ｊ装置（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｉｎｃ、　）を用い、製造者の指示に従って、電気溶出 によってこの単離を行った。

ＤＮＡ断片の末端の修飾 平滑末端断片を作成するために、ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ断片（Ｐｒｏ ＠ｅｇａ）を使用した。代替法として、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅ ｇａ）か、マングビーン（ｓｕｎｇ　ｂｅａｎ）ヌクレアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ ）をも使用した。５−リン酸化末端の脱リン酸化には、牛腸ホスファターゼ（Ｃ ＩＰ、　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を使用した。５゛−ヒドロキシル末端のリン酸 化にはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。

ＤＮＡ断片の末端をＴ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって連結した 。修飾酵素はすべて製造者の推奨するところに従って使用した。

ＤＮＡ形質転換 Ｅ、ｃｏｌｉ細胞の形質転換はＨａｎａｈａｎの方法（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏ ｌ、　１６６＋５５７−２８０（１９８３））で行った。Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉ ｓ細胞はＧ　ｒｙｃｚａｎらの方法（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１３４：３ １ｇ−３２９（１９７８））で形質転換した。Ｌ、　１ａｃｔｉｓプロトプラス ト形質転換はｖａｎ　ｆｒｉｇｈｔら（Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖｉｒｏｎｔ　Ｍｉｃ ｒｏｂｉｏｌ、　５０＋１１００−１１０２（１９８５））に従って行った。エ レクトロポレーションによるり、　ｐｌａｎｔａｒｕｍ形質転換はＡｕｋｒｕｓ ｔらの方法（投稿中）で行った。この方法を以下に記０．５〜１．０（Ａ６゜。

）になるまで細胞を生育させ、氷上で冷却し、遠心分離によって収集し、洗浄し 、約１０９細胞／ｍｌの細胞密度になるようにエレクトロポレーション緩衝液（ Ｅ　Ｂ）中に再懸濁した。水冷細胞懸濁液０．８１１をプラスミドＤＮＡ０．５ 〜１．０Ｉｇと混合した。緩衝液（Ｆ　Ｅ　Ｂ）中でのエレクトロポレーション の前後に細胞を氷上に保存した。シーンパルサー（ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ’″″ ）装置（ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国リッチモンド）を２５ μＦＤの定容量で使用し、完全細胞については１２５０〜６２５０Ｖ／ｃ−の電 界強度で、また浸透感受性細胞については１２５０〜５０００Ｖ／ｃｍの電界強 度でエレクトロポレーションを行った。無傷の細胞のエレクトロポレーシヨンは ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ”操作書（ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

米国リッチモンド）に記述されているようにＥＢ中で行った。浸透感受性細胞は プロトプラストエレクトロポレーション緩衝液（ＰＥＢ）［０，５１１ラフイノ ース。

７ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，４）、５０層篇までのＭｇＣ１，］中でエレ クトロ８（１９７２））に従って検定した。細胞を適当な液体培地中で生育させ た後、細胞画分と上清画分を遠心分離によって分離した。

クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）検定　細胞を対数 増殖期まで生育させ、酵素活性分析のために培養１社を採取した。細胞を遠心分 離によって収集し、５ＱｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）で洗浄し、４Ｉ ｇ／ｍｌリゾチームを含む同緩衝液０．２■１中に懸濁した。細胞を３７℃で３ ０分間インキュベートし、その後、それらをプランソニック（Ｂｒａｎｓｏｉｃ ）超音波装置による超音波処理（４Ｘ１５秒）で破砕した（各１５秒間の超音波 処理後、培地を水浴中で３０秒間冷却した）。超音波処理後、遠心分離によって 細胞残渣をペレット化した。その上清５０μｌを酵素検定に用いた。Ｓｈａｍ、 　Ｗ、　Ｖの方法（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　４３ニア３７−７５５（１ ９７５））に従うてＣＡＴ活性を測定した。

カテコール２．３−ジオキシゲナーゼ　これはＺ　ｕｋｏｗｓｋｉら（Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳ＾８０：１１０１−１１０５（１９８３））に従って検定した。

ＲＮＡ方法 下記の点以外はｖａｎ　ｄｅｒ　Ｖｏｓｓｅｎらの方法（Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖｉ ｒｏｎｓ、關１ｃｒｏｂｉｏ１．５３：２４５２−２４５７（１９８７））に従 ってＲＮＡを単離した　５μｇ／■ｌクロラムフェニコールを含むＭ１７Ｇ培地 ＩＱｍｌ中でクレット（Ｋｌｅｔｔ）　８０に達するまで細胞を培養し、ＲＮＡ （およびＤＮＡ）をエタノールで沈殿させた（３Ｍ　ＮａＡｃを用いて培地を０ ．５Ｍにし、３体積のエタノールを加えた）。そのベレットを蒸留水に溶解した 。１０１麗ンチオスレイトールと４００／ａｌ　リボヌクレアーゼ阻害剤ＲＮＡ 　ｓ　ｉ　ｎＲ（Ｐｒ。

ｍｅｇａ）を含む４０１１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７，９）、１０ｍＭＮａＣ１，６ ｍＭＭｇＣｌ□緩衝液中で、ＤＮＡをＲＮＡ５ｅ非含有Ｄ　Ｎ　Ａ　ａ　ｓ　ｅ 　Ｉ　（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した。

３７℃で１０分間のインキュベーションの後、反応混合物をフェノール、フェノ ール−クロロホルム−イソアミルアルコール（体積比２５＋２４：１）およびク ロロホルム−イソアミルアルコール（体積比２４：１）で１回抽出した。ＲＮＡ をエタノールで沈殿させ、そのベレットを水７５μｌに溶解した。

ノーザン転写およびハイブリッド形成 りローン化したプロモーターまたはプロモーター／シグナル断片によって転写さ れるＲＮＡの長さを見積もるため、並びに、それらのプロモーターの強度を調べ るために、ノーザン分析を行った。ＲＮＡゲルを行い、ニトロセルロース膜（Ｓ ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅ１１）へのノーザン転写をｆｉｌｌｉ ａｉｓら（ｒＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−−Ａ　 Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ＡｐｐｒｏａｅｈＪ、　ｈｍｅｓら編、　ｒＲＬ　Ｐｒｅ ｓｓ、　１３９−１６０（１９８５）jに従って 行った。

ＲＮＡ種を検出するために、上記ニトロセルロースフィルターを０．０６Ｍクエ ン酸ナトリウム（４Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ）、５ＱｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６，５）、５×デンハルト（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　１ｉｅｓ、 　Ｃｏｍｍｕｎ、　２３：６４１−６４６（１９６６））、０．２％ドf ノル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および２００Ｉｇ／耐変性ニシン精子Ｉ）　Ｎ　 Ａ　（Ｓｉｇｍａ）中で予備ハイブリッド形成させた。インキュベーションを６ ５℃で１時間ないし２時間行った。ニックトランスレー／ヨン処理したプローブ （１０’ｃｐａ＋／ｍｌ）を含む同培地中でハイブリッド形成を行った。ハイブ リッド形成後、０．０３Ｍクエン酸ナトリウム（２ＸＳＳＣ）、０．２％ＳＤＳ でフィルターを洗浄（１〜２×）し、３７℃で３０分間および５５℃で３０分間 インキュベートした。

プライマー伸長 プライマー伸長によって転写開始部位を決定した。１５μｌ　ＲＮＡ（５〜１０ Ｉｇ）プライマー（２０塩基オリゴヌクレオチド領２ｐｓ＋ｏｌ）混合物に、２ ×ハイブリツド形成緩衝液（１００ＩＭＩ−リス塩酸（ｐＨ８，３）、２ｍＭ［ ＥＤＴＡ、　０．８１１ＮａＣ１）１５μｍを加えた。この混合物を９５℃に２ 分間加熱し、水槽のサーモスタットを徐々に下げることによって２時間かけて室 温に冷却した。

ＲＮＡ−プライマーハイブリッドをエタノールで沈殿させ、そのベレットを２Ｉ 反応緩衝液（１００ｄｔ−リス塩酸（４２℃でｐＨ８，３）、２０＋ｌＩ　ＤＴ Ｔ、１２ｄＭｇｃ＋２．１００ｍ１ｌ　ＫＣＬ　Ｏ，５ｍＭ　ｄＡＴＰ、、ｄＴ ＴＰおよびｄＧＴＰ。

並びに５０　ｔｔｇ／＋ｏｌアクチノマイシンＣ、（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）） 　５　Ｉｔ　１に溶解した。このＩＲ合物ｒ：、ｆｒキシシ＋　’）　ン（α− ”Ｐ）三！Ｊ　ン酸（３０００Ｃｉ／ｍｅａｌ、ｌ　Ｑｉ＋Ｃｉ／吐＾ｍｅｒｓ ｈａｍ）　１．５　ｕ　１およびＲＮＡ５　ｉｎ’　７　Ｕ　ＡＭＶ逆転写酵素 （Ｐｒｏｓｅｇａ）　４０　Ｕを加え、水を用いてその総反応体積を１０μｌに した。この反応混合物を４２℃で１５分間インキュベートし、次いで１０■Ｍ　 ｄＣＴＰ（チェイス）０．５μｌを加え、４２℃で１時間４５分インキュベージ ジンを続けた。

次いで、上記反応混合物をフェノールとフェノール−クロロホルム−イソアミル アルコール（２５＋２４：１）で抽出し、エタノールで沈殿させた。標準的な配 列決定用ゲル上での電気泳動によってこれらの逆転写酵素反応を分析した。プロ モーター構築物のうちの１つの配列決定反応をサイズマーカーとして使用し、逆 転写酵素（ＲＴ）反応と平行して行った。

他の方法 プレーβ−ラクタマーゼのインビトロ翻訳をＤＮＡ発現系［ＤｕＰｏｎｔ、　Ｎ ＥＮ　ＰｒｏｄｕｃｔＳによるインビトロＤＮＡグイレフテッド・プロ力すオテ ィック（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＤＮＡ　Ｄｉｒｅｃｔｅｄ、　Ｐｒｏｋａｒｙｏｔ ｉｃ）コで行い、次いでその生成物をＬａｅｍｍｌｉ（Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ ｏｎ）　２２７：６８０−３８５（１９７０））に従って５ＤＳ−ＰＡＧＥで分 離し、蛍光光度測定にかけた。

ＤＮＡ配列決定 すべてのＤＮＡ配列決定をＳａｎｇｅｒ法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｅａｄ、 　Ｓｅｔ、　ＵＳ＾８０：３９６３−３９６５（１９７７））に基づいて行った 。プラスミドの配列決定については、シークエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ”、 　Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ ｏｎ、　ＵＳＢ）系を）Ｉａｔｔｏｒｉ轣iＡｎａｌ、　Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、　１５２：２３２−２３８（１９８６））が記述しているように 使用した。

オリゴヌクレオチド合成 配列決定とポリメラーゼ連鎖反応用のプライマーのオリゴヌクレオチド合成を、 アプライド・パイシステムズＤＮＡ合成装置モデル３８１Ａを用いるホスホルア ミダイト化学（Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｔｅｒ ｓ　２２：１８５９−１８６２（１９８１））によってで記述されているシーン アンプＤＮＡアンプリフイケーション（ＧｅｎｅＡｍｐ”　ＤＮ＾＾ｍｐｌｉｆ ｉｃａｔｉｏｎ）キットとＤＮＡサーマルサイクラ−（ＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ 　Ｃｙｃｌｅｒ）（共にＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓから販売されて いる）によって特定の遺伝子断片を増幅した。

ＴａｑポリメラーゼはＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ−Ｃｔｕｓ社から購入した。

実施例ＩＩ プロモータープローブベクターの構築 プロモータ一様活性を含有する染色体ＤＮＡ断片をスクリーニングするために、 Ｅ、ｃｏｌｉ、　Ｂ、５ｕｂｔｆｌｉｓＳＬａｃｔｏｃｏｃｃｉおよびＬａｃｔ ｏｂａｃｉｌｌｕｓ中で複製することができるプロモーターブローブーベクター を構築した。

このシャトルベクター用の複製起点をプラスミドｐｓＨ７１から単離した。プラ スミドｐｓＨ７１を制限酵素Ｃ１ａｌで消化すると約１．７ｋｂとＱ、３ｋｂの ２つの断片が生成し、そのうちの大きい方が複製起点を含有していた。その付着 末端をフレノウ断片で補填した。この混合物をアガロースゲルに流すことによっ て上記の大きいＤＮＡ断片を単離し、そのＤＮＡを電気溶出によっつでゲルから 溶出させた。

この複製断片に２つの抗生物質選択マーカーを付加した。テトラサイクリンをコ ードする遺伝子はプラスミドｐＢＲ３２２から単離し、エリスロマイシン耐性を コードする遺伝子はプラスミドｐＶＳ２から単離した。テトラサイクリン耐性を コードする遺伝子断片を得るために、ｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＩとＰｖｕＩＩで 消化した。ＥｃｏＲＩによって生成した付着末端をフレノウ断片で補填し、その 混合物をアガロースゲルに流し、テトラサイクリン遺伝子含有断片を単離し、そ のＤＮＡ（約２　ｋｂ）を電気溶出によってゲルから溶出させた。

ｐｓＨ７１複製起点を含有するＣ１ａＩ断片とテトラサイクリン遺伝子を含有す る上記ＤＮＡ断片を連結し、コンピテント（受容性）Ｅ、ｃｏｌｉ　ＥＲＦ　１ ７３細胞中に導入（形質転換）した。１２．５μｇ／ｍｌテトラサイタリンを含 むルリアー寒天プレートに形質転換混合物を接種することによって形質転換体を 選択した。このプラスミドの構造を制限酵素消化によって確認した。ｐＫＴＨ１ ７２２と命名したこの新しいプラスミド（図４）に、第２の耐性マーカーを付加 した。ｐＫＴＨ１７２２をＸ■ｎｌ消化によって直鎖化した。エリスロマイシン 遺伝子をＨｉｎｄＩＩＩ−Ｃ１ａＩ消化によってプラスミドｐＶＳ２から単離し 、その付着末端をフレノウ断片で補填した。この混合物をアガロースゲルに流し 、エリスロマイシン遺伝子を含有するゲル断片を単離し、そのＤＮＡ断片を電気 溶出によってゲルから溶出させた。

直鎖化したプラスミドｐＫＴＨ１７２２と上記エリスロマイシン遺伝子含有ＤＮ Ａ断片を連結し、その連結混合物をコンピテントＥ、ｃｏｌｉ　ＥＲＦ　１７３ 細胞中に導入し、その混合物を１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリンの入ったル リア寒天プレートに接種した。１００μｇ／＊ｌエリスロマイシンを含むルイア ー寒天プレート上での生育能によって形質転換体をスクリーニングした。エリス ロマイシン耐性コロニーからプラスミド単離を行い、該遺伝子の存在を制限酵素 消化によって確認した。１つの正しいプラスミド構築物をｐＫＴＨ１７３４と命 名した（図５）。

プロモータープローブプラスミドを構築するために、プラスミドｐＰＬ６０３か ら得られるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードするプロ モーターレス（プロモーターのない）遺伝子をプラスミドｐＫＴＨ１７３４に連 結した。ｐＫＴＨ１７３４をＥｃｏＲＩ消化によって直鎖化し、その付着末端を フレノウ断片で平滑にした。ＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩＩ消化によってプラスミドｐ ＰＬ６０３からプロモーターレスｃａｔ遺伝子を単離し、その付着末端をフレノ ウ断片で補充し、その混合物をアガロースゲルに流した。上述のフェノール−液 体窒素凍結法によってｃａｔ遺伝子含有ＤＮＡ断片（約１．７ｋｂ）を単離した 。

直鎖化したプラスミドｐＫＴＨ１７３４と上記ｃａｔ遺伝子含有ＤＮＡ断片を連 結し、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＥＲＦ　１７３細胞に導入した。プラスミドを単離し、消 化による制限酵素認識様式を調べることによって挿入物をスクリーニングした。

プラスミドｐＫＴＨ１７３６を得た（図５）。

上記ベクターをさらに改善するために、複数クローニング部位（ＭＣ３）を含有 するＤＮＡ断片を上記ｃａｔ遺伝子の前に付加した。ｐＫＴＨ１７３６をＰｓｔ Ｉ消化によって直鎖化した。２つの合成２１塩基一本鎖オリゴヌクレオチド（図 １）をインビトロでアニールさせてＭＣ８配列を構築した。このＭＣ３断片の末 端は、Ｐｓｔ１部位に連結された時に機能的なＰｓｔ１部位を１つだけ形成する ように構築されている。上記ＭＣＳセグメントを直鎖化したｐＫＴＨ１７３６に 連結した後、その混合物をコンピテントＥ、ｃｏｌｉ　ＥＲＦ　１７３細胞中に 導入し、プラスミドを単離し、制限酵素消化を行うことによってＭＣ３配列含有 形質転換体をスクリーニングした。

上記ＭＣ５配列がベクター中に１つだけ存在することを確かめるために、上記方 法によって得たプラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、希釈培地中でそれ自身に連結 させ、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＥＲＦ　１７３中に導入した。この形質転換からプロモー タープローブベクターｐＫＴＨ１７５０を得た（図６）。

実施例ＩＩＩ プロモータープローブベクターｐＫＴＨ１７５０によるＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ プロモータプロモータープローブプラスミドｐＫＴＨ１７５０はＥ、ｃｏｌｉＳ Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ。

およびり、　１ａｃｔｉｓ中で複製することができる。Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ中 とり、　１ａｃｔｉｓ中の両方でプロモーターをスクリーニングした。５ａｕ３ Ａで消化したＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ染色体ＤＮＡを、ＢｇＩＩＩで消化したｐ ＫＴＨ１７５０と２＝１（挿入物：ベクターＤＮＡ）のモル比で連結させた。こ の混合物をり、　１ａｃｔｉｓ　Ｇ　ＲＳ　５細胞に導入してＭ１７ＧＳ−ｃｍ （４μｇ／ｍｌ）プレートに接種すると共に、Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　Ｂ　Ｒ Ｂ　１細胞にも導入し、これをルリアーｃｍ　（５μ（ｓｐ１２ｈ１２ｖｓｂ６ Ｔｇ／社）プレートに接種した。ｃａｔ遺伝子の前にプロモータ一様配列を含有 する形質転換体のみがｃｍプレート上で生育することができた。Ｂ　、　５ｕｂ ｔｉｌｉｓ形質転換から得た形質転換体を、最小阻害濃度検定法（ＭＩＣ）によ ってさらにスクリーニングした。終夜コロニーを５Ｑｍｉｌリン酸緩衝液（ｐＨ ７，０）１＋１に懸濁した。この懸濁液から、異なる濃度のｃｍ（５，１５，４ ５，１００μｇ／＋＊１）を含む一組のルリアーｃｍプレートにガラス棒を使っ て線状塗布した。４５〜１００μｇ、／＋ｌのＣｍ濃度で生育することができた 形質転換体のみをり、１ａｃｔｉｓ亜種１ａｃｔｉｓ　Ｇ　ＲＳ　５に導入した 。

Ｌ、　１ａｃｔｉｓ亜種１ａｃｔｉｓから直接スクリーニングしたクローンと、 最初にＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓ中でスクリーニングしてからＧＲ８５に導入したク ローンを、ＢＲＢ１宿主とＢＲＳ５宿主の両方におけるＣＡＴ検定によって特徴 づけた。クローンｐＫＴＨ１８１６（図９）、ｐＫＴＨ１８１７（図１０）、ｐ ＫＴＨ１８２０（図１１）、ｐＫＴＨ１８２１（図１９）についての結果を表３ に示す。

挿入物をＳ　ａｎｇｅｒのジデオキシ法に従って配列決定し、ノーザンハイブリ ッド形成およびプライマー伸長によってさらに特徴づけた。

表３ ｐＫＴＨ１８１７ＧＲ８５０，２４５，３ｐＫＴＨ１８２０ＢＲＢＩ　Ｏ，０２ ９１２，５ｐＫＴＨ１８２１ＢＲＢＩ　Ｏ，０１２８，ＩＧＲ３５（対照）　０ ．００４　０．０９Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ中で複製することができるプロモータ ープローブベクターｐＡＭＢ１１によるＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓプロモーター断 片のスクリーニング１３、５ｕｂｔｉｌｉｓ中で複製するプロモータープローブ ベクターｐＡＭＢ１１は過去に記述されている（Ｚｕｋｏｗｓｋｉら、Ｇｅｎｅ 　４６：２４７−２５５（１９８６））。平滑末端クローニング部位のためにこ のプラスミドを制限酵素Ｓｍａｌで開環し、また付着末端を生成させるためにＢ ａｍＨＩで開環した。

Ｌ　ａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ染色体ＤＮＡを５ａｕ３Ａで消化することにより、Ｂ ａａ＋ＨＩで処理したベクターとの連結に適合するかなり大きい（１０００ｂｐ 以上）断片を得た。

平滑末端断片については、上記染色体ＤＮＡを超音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎ　５ ｏｎｉｆｉｅｒ、　Ｂｒａｎｓｏｎ　５ｏｎｉｃ　Ｐｏｗｅｒ　Ｃｏ、　）する ことにより、５００〜６００ｂｐの断片を得た。適当な対照と共に少量の処理試 料を０．８％アガロースゲルに流すことによって超音波処理の程度を調べた。次 に、超音波処理した全ＤＮＡを０．８％アガロースゲルに充填し、電気泳動した 。約６００ｂｐの両分をフェノール−液体窒素処理によって抽出・精製した。こ れらＤＮＡ断片の末端を上述のようにフレノウ断片で処理した。

どちらの場合も、連結反応は標準的な条件下で２：１（挿入物：ベクターＤＮＡ ）のモル比で行い、その混合物をＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓ　Ｂ　ＲＢ　ｌ中に導入 した。

細菌コロニーに０．５Ｍカテコールを噴霧することによって、プロモーター含有 プラスミドの選択を行った。カテコールを２−ヒドロキシムコン酸セミアルデヒ ドに変換するカテコール２．３−ジオキシゲナーゼの発現ゆえに、プロモーター 配列を保持する形質転換体は黄色に変化した。この黄色の強さはプロモーター強 度と相関することか知られている。上記形質転換からプラスミドｐＫＴＨ１８７ ４（図１２）とプラスミドｐＫＴＨ１７８９（図１３）を得た。

液体培養におけるカテコール２，３−ジオキシゲナーゼの生産（表４）を研究す るために、１０μｇ／■１カナマイシンを含むルリアブロス中で上記の２株を生 育させた。１０時間の生育の後、遠心分離によって１■ｌの細胞を集め、処理し 、Ｚｕｋ。

ｖｓｋｉらが記述した方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ Ｓ＾８０：１１０１−１１０５（１９８３））に従って酵素活性を決定した。

表４ Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓにおけるカテコール２．３−ジオキシゲナーゼの発現を促 進するＬ　ａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ染色体ＤＮＡ断片構築物　挿入物の　色強度１ ２−ヒドロキシ−ムコン酸サイズ　セミアルデヒドの生成 ｐＫＴＨ１８７４５５０＋　２５．２關ｏ１／分ｐＫＴＨ１７８９５００＋＋　 ２０７ｍｍｏｌ／分対　照　挿入物なし　−　〈２ １詳細については本文を参照のこと。

２検出限界未満 ＤＮＡを陽性クローンから抽出し、プラスミド配列決定に付した。

プラスミドｐＫＴＨ３３は、ＥｃｏＲＩリンカ−に後続するＴＥＭ−β−ラクタ マーセ遺伝子の構造部分を六有している。このプラスミドの一部はｐＢＲ３２２ に由来しており、Ｅ、ｃｏｌｉ中での複製が可能になっている。発現／分泌ノブ ナルを保持する配列が上記マーカー遺伝子β−ラクタマーゼと枠が合うように挿 入されると、形質転換体をアンピノリン耐性にする活性な酵素が生産されること になる。

形質転換体をアンビンリンプレートに直接接種することによって、シグナル配列 断片の陽性選択が得られる。

プラスミドｐＫＴＨ３３をＥｃｏＲＩで開環し、フレノウ断片で処理することに よって平滑末端分子を得、フェノール抽出とエタノール沈殿によってこれを精製 した。

連結混合物をＥ、ｃｏｌｉ　ＥＲＦ　１７３細胞に導入し、ルリアーアンピシリ ン（５０μｇ／ｍｌ）プレートに接種した。微量滴定ウェル上でのニトロセフイ ン検定法により、数個の形質転換体をβ−ラクタマーゼ活性についてスクリーニ ングした。５０＋ＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）中のニトロセフイン（Ｇｌ ａｘｏ）　２００　ＩＩ　１をピペットで微量滴定ウェルに移した。爪楊枝を用 いてプレートから細菌コロニーを移し、ニトロセフイン中に懸濁させた。室温で １〜３０分間のインキュベーション後、陽性クローンは赤変したが、陰性クロー ンは黄色のままであった。

５０〜４５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むルリアーａｐプレートに細胞を接 種したこと以外は前述のようにして、陽性クローンについてアンピシリンの最小 阻害濃度（ＭＩＣ）を決定した。ＭＩＣは最大濃度でもまだ生育を支持した。

さらなる特徴づけのために、アンピシリン（４００μｇ／ｍｌまたはそれ以上） 上で生育したクローンを選択した。

最大のアンビンリン耐性を示す陽性クローンについて、プラスミドＤＮＡの迅速 単離を行った。染色体ＤＮＡ挿入物のサイズを制限酵素消化によって検証した。

クローンｐＫＴＨ１７９７（図１４）、ｐＫＴＨ１７９８（図１５）、ｐＫＴＨ １７９９（図１６）およびｐＫＴＨ１８０１（図１７）を表５に示す。

表５ ｐＫＴＨ１７９８３５０＞４５０ ｐＫＴＨ１７９９５００４００ ｐＫＴＨ１７９７、ｐＫＴＨ１７９８、ｐＫＴＨ１７９９およびｐＫＴＨ１８０ １の挿入物をＳａｎｇｅｔのジデオキシ法に従って配列決定し、発現／分泌シグ ナルの存在について分析した。３つの読み枠をβ−ラクタマーゼの既知の読み枠 と合致させることにより、正しい読み枠を決定した。これらの配列の妥当性を確 認するために、前駆体蛋白質の長さをインビトロ転写−翻訳検定法から得たデー タと比較した（図２）。

適当な株を液体培地中で生育させることにより、上記４つの構築物のβ−ラクタ マーゼ活性をも決定した（表６）。

表６ ｐＫＴＨ１７９８８４１１５５ ｐＫＴＨ１７９９７４４７ ｐＫＴＨ１８０１ｎｄ’　ｎｄ’ ｐＢＲ３２２２４１０３４２ 実施例Ｖｌ プロモーター／分泌シグナル断片のシャトルレプリコンへのサブクローニングｐ ＫＴＨ３３の使用によって所望の断片の直接選択が可能になったが、これらのク ローンはそのままではグラム陽性細菌中で増殖することができなかった。したが って、プロモーター／シグナル配列断片をプラスミドｐＶＳ２中にサブクローニ ングすることによってレプリコンを変更する必要があった。

Ｃ１ａ　Ｉ−ＰｖｕＩに重消化によって挿入物十全β−ラクタマーゼ遺伝子をｐ ＫＴＨ１７９７、ｐＫＴＨ１７８９、ｐＫＴＨ１７９９およびｐＫＴＨ１８０１ から切り出し、所望の断片を上述のように０．８％アガロースゲルから抽出し、 フレノウ断片で処理することによって平滑末端化した。ベクターｐＶＳ２をＨｉ ｎｄＩＩＩで開環し、上述のようにフレノウ断片で処理した。

標準的な条件下、２：１（挿入物ニブラスミド）のモル比で連結を行い、その混 合物をＥ、ｃｏｌｉ　ＥＲＦ　１７３細胞中に導入し、ルリアーｃ　ｍ（１１μ ｇ／＋１）プレートに接種した。上述のニトロセフイン微量滴定ウェル検定法に よってβ−ラクタマーゼの生産を調べた。陽性クローンについてプラスミドＤＮ Ａの迅速単離を行い、挿入物のサイズを制限酵素消化によって確かめた。

サブクローンのなかに不均質性が認められたので、β−ラクタマーゼ活性と変化 していないＤＮＡ構造の両方を保っている４つのクローンをさらなる形質転換の ために選択した。これら４つの分泌ベクターをｐＫＴＨ１８０５、ｐＫＴＨ１８ ０６、ｐＫＴＨ１８０７およびｐＫＴＨ１８０９と命名した（図７）。

実施例ＶＩＩ グラム陽性宿主におけるβ−ラクタマーゼの発現と分泌単離したプロモーター／ シグナル配列断片のグラム陽性細菌における機能性を７Ｊへるために、上記４種 の異なる構築物をＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　Ｂ　ＲＢ　１、Ｌ、１ａｃｔｉｓ　 ＧＲ５５およびり、　ｐｌａｎｔａｒｕ＋ｗ　Ｎ　ＲＬ　Ｂ　１９２中に導入し た。次にこれらの株を各宿主についての至適条件下で液体培地中で生育させた。

８〜１０時間培養から得た細胞画分と上清画分をニトロセフイン検定にかけた（ 表７）。

表７ ｐＫＴＨ１８０５２，６１，３５，８０＜　＜ｐＫＴＨ１８０６１７，１２４， ６７５，２２，５２２９，０４，２ｐＫＴＨ１８０７２，６８，２２４５１，７ １０，５１，１ｐＫＴＨ１８０９１，６６，３７２，６５７５，３＜対照’　＜ 　＜　＜　＜”　＜　＜ １プラスミドを伴わない各宿主株 ２検出限界未滴 抗生物質プレート（プロモータープローブベクターによってクローン化した株に ついてはｃｍプレート；プロモーター／シグナル配列ベクターによってクローン 化した株についてはａｐプレート）上で生育するプロモーターの能力、高いＭＩ Ｃを生み出す能力、または大量の遺伝子産物（クロラムフェニコールアセチルト ランスフェラーゼまたはβ−ラクタマーゼ）を合成する能力、を比較することに よってまずプロモーター強度を評価した。

選択したクローン（プロモータークローンｐＫＴＨ１８１６、ｐＫＴＨ１８１７ 、ｐＫＴＨ１８２０およびｐＫＴＨ１８２１）を／−ｆンハイブリッド形成ｊ： よってさらに研究した（図３）。その結果、プロモータープローブベクター（ｐ ＫＴＨ１７５０）によってクローン化されたプロモーターが、シグナル配列と共 にクローン化されたプロモーターにの場合の試験遺伝子はｂｌａである）より多 量の試験遺伝子（ｃａｔ）特異的ｍＲＮＡを生産することが示された。プローブ の比活性間の相違を考慮すると、その差は約５〜１０倍であった。転写効率によ って判断すると、ｃａｔ−プラスミドｐＫＴＨ１７！５０によってクローン化さ れたプロモーターはシグナル配列と共にクローン化されたプロモーターより強い ようである。

異なるプロモーターとシグナル配列が一体となって本発明のハイブリッド発現単 位として機能する様式を明らかにするために、発現／分泌プラスミドｐＫＴＨ１ ８０７上のプロモーターを発現プラスミドｐＫＨＴ１８１７上のプロモーターに 置き換えた。

プライマーとしてオリゴヌクレオチドＡおよびＢ（図１８）を使用し、ポリメラ ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術によってプラスミドｐＫＴＨ１８１７からそのプロ モーターを取り出した。このプロモーター断片の３′末端のためのプライマーＢ は、そのＰＣＲ断片の末端にＸｂａｌの制限酵素認識部位が生成するように設計 された。

プライマーとしてオリゴヌクレオチドＣおよびＤを使用し、ＰＣＲによってシグ ナル配列−β−ラクタマーゼ（ｂ　Ｉ　ａ）領域をプラスミドｐＫＴＨ１８０７ がら取り出した。この５′末端プライマー（プライマー〇）は、ＸｂａＩの制限 酵素認識部位が生成するように設計された。

ＰＣＲによって得た上記プロモーター断片とシグナル配列−ｂｌａ断片の両方を Ｘｂａｌで消化し、アガロースゲルで精製した。これらを（プロモーター断片に 対する／グナル配列−ｂｌａのモル濃度比をｌ：ｌとして）連結した。このプロ モーター断片とシグナル配列断片の間のＸｂａＩ部位の連結により、その結合領 域に正確な３°−および５′−配列が再生された。この連結混合物をＢｇｌＩＩ とＣ１ａｌで消化した。この消化混合物をアガロースゲルに流し、そこがら適正 な断片（つまりシグナル配列ｂｌａに連結したプロモーターを含有する断片）を 単離した。この断片をＰＣＲで増幅しＰｖｕＩＩで消化した。これを、ＨｐａＩ Ｉで消化しがっフレノウ断片で平滑化したｐＶＳ２ベクターに連結した。

表８ 上記連結混合物をコンピテントＥ、ｃｏｌｉ　ＥＲＦＩ　７３細胞中に導入し、 ルリア−ａｐ（１００μｇ／ｍｌ）プレートに接種した。安定な培養を得るため に、このようにして得た形質転換体をａｐプレート上に数回線状塗布した。

このようにして得たクローンからプラスミドを単離し、Ｌ、　１ａｃｔｉｓ　Ｇ 　ＲＳ　５細胞中に導入し、Ｍ１７ＧＳ−ｃｍ（５μｇ／ｅｌ）プレートに接種 した。これらの形質転換からクローン（ｐＫＴＨ１８８９）を得た。表８に示す ようにこのクローンは、元来のプロモーター／シグナル配列の組み合わせを含有 するり、　１ａｃｔｉｓ株ｐＫＴＨ１８０７より約１０倍多いβ−ラクタマーゼ を生産した。

ＥｃｏＲＩ　ＰｖｕｌＩ　Ｂｇｌｌｌ ブ０２プリント１　ストランドＬ １２３４　５６７Ｂ ＥｃｏＲＩ　Ｃ１ａｌ ＥｃｏＲ１／ＥｃｏＲＩ　Ｐｓｌｌ プロモータープローブベクターｐＫＴＨ１７５０ｆａ１１”；　Ｑ １１ＬＪ、Ｑ １υ　と１１　ｊＩｌ　４υ　）Ｉｔ　ｂυＣ１αＩ Ａ　５’　ＡＡＴＴＴＣＣＡＴＣＣＡＴＴＴＣＡＣ［ｉＴＴＧＧＧＣＭＧＡｌＧ ＡＣＴＴＡＣＧ　：ｌ’ｂａ　Ｉ Ｂ　５’　ＴＣＣＡＴＴＴＣ７Ａ（ＩＡＴＡＴＡＡＴＡＣＣＡＴＴＴＴＴＣＧＣ ＣＡＴＣＴＴ　３’ｖｕｌｌ Ｃ５’　ＴＣＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣ丁ＣＡＴＣＴＡＧＡ［、ＴＡＡＣＡＡＩ：、 ＡＡＣＴＴＡＴＡＣＡＡＴＧＡＴ　３’Ｐｖｕ　ＩＩ　Ｂｇｌ　１１ ＦＩＧ、１８ ２４１　ＴＧＡＣＧＴＣＡＴＧＡＡＡ 全塩基数＋；ｔ２５３ ＤＮＡ配列組成　９２Ａ：３９Ｃ：４９Ｇニア３ＴＦＩＧ、　１２ ＦｆＧ、１３ ！０　２［］　３０　４０　５１１　６０ＡＡＡＴＴＴＴＣＡ丁ＴＴＧＣＴＴＣ ＣＧＡ丁Ｔ丁ＡＣＴＧＡＣＴＴＡＡＡＡＧＴＴＡＡＡＧＡＴＡＴＡＧＴＡＡＡＴ ＴＡＴＡＡＡＡ丁ＡＡＡＡＡ１６丁八丁丁丁Ｔ丁ＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＡ丁ＴＡ ＣＡ丁ＴＴＴＴＴＧＣＴＴＧＣｎＡＡＡＴＧＡＡＡＣＴＡＡＡＣＡ１］０　１４ ０　１５０　１６０　１７０　１８０丁ＧＴＴＡＴＡＣＴＣＣＴＡＧＴＡＴＴＡ ＴＧＡＡＡＭＡＡＴＴＴＴＡＡ　１丁ＡＣＴＡＣＧＡＣＴＣＴＴＧＣＡＣＴＴＧ ［：ＴＣＴＴＦ！Ｇ、１４ １９０　２００　２１０　２２０　２：３０　２４０丁ロロＣＣＣＡＧＡＡＡＣ ６Ｃ丁６６丁ＧＡＡＡＦ！Ｇ、１４（続き　） ＋０　２０　３０　４０　５０　６０ ＡＡＴＴＣＣＡＡＡＡＡＴＴＴＧＴＴＡＴＡＡＴＣ［１ｌＡＴＡＴ［１ＴＧＡＡ ＴＴＴＴＡＡＣＡＣＡＡＡＡＧ（ＪＡＧ丁ＡＡＣＴＡＴＧＡ` Ｄｏ　１４０　１５０　１６０　１７０　１８０ＦＩＧ、＋５ ２５０　２６０　２７０　２８０　２９０　’ｔｏ。

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Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．図５に示すように構築されるプラスミドｐＫＴＨ１７３４およびｐＫＴＨ１ ７３６またはそれらの機能的誘導体からなる群から選択される、大腸菌、枯草菌 、乳酸球菌および乳酸桿菌中で複製することができるプロモータープローブーベ クター。
2. ２．図１に示すヌクレオチド配列を有する複数クローニング部位またはその機能 的誘導体をさらに含む、大腸菌、枯草菌、乳酸球菌および乳酸桿菌中で複製する ことができるプロモータープローブーベクター。
3. ３．プラスミドｐＫＴＨ１７５０またはその機能的誘導体からなる、大腸菌、枯 草菌、乳酸球菌および乳酸桿菌中で複製することができるプロモータープローブ ーベクター。
4. ４．請求の範囲第１項、第２項または第３項のいずれかのプロモータープローブ ーベクターで形質転換された宿主。
5. ５．図９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１９に記載 の実質上純粋なヌクレオチド配列またはそれらの機能的あるいは化学的誘導体。
6. ６．請求の範囲第５項のヌクレオチド配列を含有するプラスミド。
7. ７．図７に示すように構築されるプラスミドｐＫＴＨ１８０５、ｐＫＴＨ１８０ ６、ｐＫＴＨ１８０７およびｐＫＴＨ１８０９またはそれらの機能的誘導体から なる群から選択されるプラスミド。
8. ８．実施例ＩＩまたはＩＩＩに記述したように構築されるプラスミドｐＫＴＨ１ ８１６、ｐＫＴＨ１８１７、ｐＫＴＨ１８２０およびｐＫＴＨ１８２１またはそ れらの機能的誘導体からなる群から選択されるプラスミド。
9. ９．発現させようとする異種あるいは同種の蛋白質またはペプチドをコード化す るヌクレオチド配列をさらに含む請求の範囲第６項、第７項または第８項のプラ スミド。
10. １０．請求の範囲第９項のプラスミドで形質転換されたグラム陽性宿主細胞。
11. １１．枯草菌、乳酸球菌および乳酸桿菌からなる群から選択される請求の範囲第 １０項の宿主細胞。
12. １２．図２０に示すように構築されるプラスミドｐＫＴＨ１８８９。
13. １３．発現させようとする同種あるいは異種の蛋白質またはペプチドをさらに含 む請求の範囲第１２項のプラスミド。
14. １４．請求の範囲第１３項のプラスミドで形質転換されたグラム陽性宿主細胞。
15. １５．枯草菌、乳酸球菌および乳酸桿菌からなる群から選択される請求の範囲第 １４項の宿主細胞。
16. １６．プラスミドｐＫＴＨ１７８９、ｐＫＴＨ１８１６、ｐＫＴＨ１８１７、ｐ ＫＴＨ１８２０、ｐＫＴＨ１８２１およびｐＫＴＨ１８７４またはそれらの機能 的誘導体からなる群から選択される、ラクトコッカス・ラクチスから誘導される プロモーター配列を含有するプラスミド。
17. １７．ｐＫＴＨ１７９７、ｐＫＴＨ１７９８、ｐＫＴＨ１７９９、ｐＫＴＨ１８ ０１、ｐＫＴＨ１８０５、ｐＫＴＨ１８０６、ｐＫＴＨ１８０７およびｐＫＴＨ １８０９またはそれらの機能的誘導体からなる群から選択される、ラクトコッカ ス・ラクチスから誘導されるプロモーター／分泌シグナル配列を含有するプラス ミド。
18. １８．請求の範囲第１６項のプラスミドのいずれかのプロモーター配列および請 求の範囲第１７項のプラスミドのいずれかの分泌シグナル配列からなるハイブリ ッド発現位。
19. １９．該プロモーター配列がプラスミドｐＫＴＨ１８１７から誘導され、該分泌 シグナル配列がプラスミドｐＫＴＨ１８０７から誘導される請求の範囲第１８項 のハイブリッド発現単位。
20. ２０．発現させようとする同種あるいは異種の蛋白質またはペプチドをさらに含 む請求の範囲第１８項または第１９項のハイブリッド発現単位。
21. ２１．請求の範囲第２０項のハイブリッド発現単位で形質転換されたグラム陽性 宿主細胞。
22. ２２．枯草菌、乳酸球菌および乳酸桿菌からなる群から選択される請求の範囲第 ２１項の宿主細胞。
23. ２３．所望の異種あるいは同種の蛋白質またはペプチドをグラム陽性宿主細胞中 で生産する方法であって、該宿主細胞を請求の範囲第９項のプラスミドで形質転 換し、形質転換されたその宿主細胞を適切な培地中で、該蛋白質またはペプチド の発現を可能にする条件下で培養し、発現した蛋白質またはペプチドを該宿主細 胞または該培地から回収することからなる方法。