ES2235159T5 - Bacteria lactico recombinante que contiene un promotor insertado. - Google Patents

Abstract

UN METODO DE AISLAMIENTO DE UN FRAGMENTO DE ACIDO LACTICO BACTERIAL DNA QUE CONTIENE UN PROMOTOR, EL METODO COMPRENDE LA INTRODUCCION DE UNA MOLECULA DE DNA QUE INCLUYE UN ELEMENTO TRANSPORTABLE QUE INCLUYE UN GEN ESTRUCTURAL NO PROMOTOR COMO UN GEN SONDA PROMOTOR EN UNA POBLACION DE BACTERIAS DE ACIDO LACTEO, METODOS DE CONSTRUCCION DE BACTERIAS DE ACIDO LACTICO RECOMBINANTE QUE INCLUYEN UN PROMOTOR REGULABLE USANDO EL METODO ARRIBA DESCRITO, UNA BACTERIA DE ACIDO LACTICO RECOMBINANTE QUE LLEVE LA CODIFICACION GENETICA PARA EL PRODUCTO GENETICO DESEADO Y OPERABLEMENTE UNIDA AL PROMOTOR REGULABLE DE BACTERIA ACIDO LACTICO Y NO DESDE SU ORIGEN ASOCIADO CON EL GEN, EL USO DE ESTA BACTERIA DE ACIDO LACTICO RECOMBINANTE Y LAS PLASMIDAS RECOMBINANTES INCLUYEN UN PROMOTOR DE LA BACTERIA DE ACIDO LACTICO REGULABLE.

Description

Bacteria láctico recombinante que contiene un promotor insertado.

Campo de la invención

La presente invención pertenece al campo de las bacterias ácido lácticas de calidad alimentaria mejoradas genéticamente. En particular se proporciona una bacteria láctica recombinante en la que se utilizan promotores de bacterias ácido lácticas para obtener bacterias ácido lácticas mejoradas que son útiles en la fabricación de alimentos, comida para animales y composiciones probióticamente activas.

Antecedentes técnicos y técnica anterior

Durante siglos, se han usado cultivos de bacterias ácido lácticas en la producción de comida debido a su capacidad de convertir azúcares mediante fermentación en ácidos orgánicos que se conservan, predominantemente ácido láctico, y diversos metabolitos asociados con el desarrollo de productos alimentarios fermentados de sabor y aroma deseables. Varias bacterias ácido lácticas producen enzimas hidrolíticas que incluyen peptidasas, proteasas y enzimas lipolíticas, cuya producción puede, por ejemplo, contribuir a un desarrollo deseado del aroma en quesos.

Sin embargo, para la producción industrial de un amplio intervalo de productos alimentarios fermentados tales como todos los productos lácticos tradicionales bien conocidos incluyendo yogurt, leche acidófila, mantequilla y quesos; vegetales fermentados; productos de carne fermentados y comida para animales, se requiere un amplio intervalo de cultivos de partida de bacterias ácido lácticas, estando cada uno adaptado a tipos particulares de productos alimentarios. Dichos cultivos actualmente se seleccionan entre cepas naturales de bacterias ácido lácticas en base a características tales como su capacidad de fermentar azúcares presentes en los productos alimentarios a fermentar, requerimientos de temperatura de crecimiento específicos, producción de compuestos aromáticos deseados, la combinación específica de las características que hacen que un cultivo de tipo silvestre específicamente seleccionado sea útil para la producción de un producto alimentario particular pero normalmente menos útil para la producción de otros.

Obviamente, este procedimiento usado actualmente para desarrollar cultivos de bacterias ácido lácticas útiles por selección de cepas naturales es incómodo y costoso. Además, se ha comprobado que es difícil proporcionar cepas de cultivos de partida que combinen todas las características requeridas a un nivel óptimo. Actualmente, este problema se soluciona normalmente mediante el uso de cultivos de partida que comprenden una multiplicidad de cepas de bacterias ácido lácticas seleccionadas, teniendo cada uno una o varias características deseables para un producto alimentario particular. La necesidad de usar dichos cultivos mezclados aumentará, por supuesto, los costes de la fabricación de cultivos de partida de bacterias ácido lácticas.

En función de su aplicación tradicional y a largo plazo en la fabricación de alimentos y del hecho de que se consideran no patogénicas, las bacterias ácido lácticas generalmente se reconocen como ingredientes alimentarios seguros (GRAS), incluso si están presentes en un producto alimentario fermentado como bacterias vivas en un número muy alto, tal como 10^{8} a 10^{9} por gramo.

Actualmente, muchos reconocen que existe una necesidad industrial sustancial de encontrar formas económica y técnicamente más factibles de desarrollar cultivos de partida. Es obvio que la tecnología genética puede proporcionar los medios para satisfacer esta necesidad. En este contexto, es crucial que las bacterias ácido lácticas para la fabricación de alimentos que se desarrollan mediante la introducción de genes deseados mediante el uso de tecnología génica puedan seguir reconociéndose como seguras para el consumo. Por lo tanto, la industria considera que es esencial que las bacterias ácido lácticas recombinantes sólo contengan ADN procedente de bacterias ácido lácticas incluyendo ADN de plásmido extracromosómicos de tipo silvestre que suelen encontrarse en cepas de cultivos de partida o ADN de bacterias no ácido lácticas que no confieren a las cepas recombinantes ningún rasgo fenotípico peligroso.

Ha habido varios intentos de proporcionar bacterias ácido lácticas mejoradas genéticamente. La mayoría de estos intentos se ha dirigido a la construcción de vectores de expresión recombinantes que codifican productos génicos deseados y capaces de replicarse en bacterias ácido lácticas. Sin embargo, muy pocos de estos intentos han dado lugar a vectores que comprendan sólo ADN de bacterias ácido lácticas.

Otro enfoque para la mejora de bacterias ácido lácticas sería tener genes útiles insertados en el cromosoma de las bacterias o para mejorar la expresión de genes cromosómicos que codifican productos génicos deseados. Tal enfoque debe, si tiene éxito, evitar el problema que se encuentra frecuentemente cuando se introducen nuevos genes en un plásmido, concretamente, la pérdida de tales plásmidos debido a la inestabilidad inherente o como resultado de la presencia de ostros plásmidos que pertenecen a un grupo de incompatibilidad diferentes. En contraste a esto, un gen introducido que llega a integrarse en el cromosoma se hereda de forma generalmente estable por las células hijas.

Sin embargo, este último enfoque aún no está bien estudiado en bacterias ácido lácticas debido a la carencia de conocimientos detallados de los cromosomas de bacterias ácido lácticas y debido a la carencia de procedimientos adecuados para obtener la integración cromosómica del ADN heterólogo, aunque publicaciones recientes han informado de dicha integración cromosómica en especies de Lactococcus lactis ssp. lactis mediante los llamados vectores de integración (referencia 46).

Se sabe que puede mejorarse la expresión de un gen homólogo o heterólogo, por ejemplo, reemplazando una secuencia promotora asociada de manera natural con ese gen con una secuencia promotora más fuerte que da lugar a una expresión mejorada del gen en el nivel transcripcional. De este modo, el documento DD 228 564 describe un procedimiento para preparar un vector de expresión capaz de replicación en E. coli y/o B. subtilis, que comprende insertar en un único sitio de restricción un plásmido básico sin promotor de E. coli y/o B. subtilis que comprende un gen estructural, un fragmento de ADN que lleva un promotor aislado de un especie de Streptococcus por restricción con una enzima de restricción que corresponde al único sitio de restricción del plásmido básico, y aislar de este modo el vector recombinante de E. coli y/o B. subtilis transformado con el vector y expresar el gen
estructural.

Youngman y col. (1987) describieron un procedimiento para el aislamiento de promotores en Bacillus spp. usando el transposón Tn917. sin embargo, este procedimiento se basa en la capacidad de Bacillus ssp. para crecer a temperaturas superiores a 37ºC y además se ha descubierto que este procedimiento de transposición en Bacillus spp. hace que el transposón se integre en un punto caliente dominante por lo cual se producirá un único integrante dominante.

Se ha sugerido recientemente que pueden usarse secuencias que comprenden un promotor de bacterias ácido lácticas y/o secuencias de promotor-péptido señal para reemplazar promotores nativos más débiles y/o secuencias de promotor-péptido señal en plásmidos para obtener una expresión y secreción más eficaz de un producto génico de E. coli, a saber, \beta-lactamasa en la bacteria láctica Lactococcus lactis. (referencia 28). Estos autores identificaron las secuencias promotoras de Lactococcus mediante un vector de sonda de promotor capaz de replicación en E. coli y/o B. subtilis y que comprende un gen cat sin promotor y sitios de restricción apropiados en los que los fragmentos del cromosoma de Lactococcus podrían insertarse seguido de la selección de plásmidos recombinantes aislados de E. coli o B. subtilis y que expresan el gen cat.

Sin embargo, tal procedimiento que implica la selección en una bacteria no ácido láctica para la inserción de promotores de bacterias ácido lácticas en un vector que no es de bacterias ácido lácticas y que se replica en una bacteria no ácido láctica, no permite una identificación directa in situ de un promotor de bacterias ácido lácticas útil mientras funciona en la bacteria láctica de origen.

Sumario de la invención

En un aspecto, la presente invención se refiere a un Lactococcus spp. recombinante que comprende un gen que codifica un producto génico deseado y unido operativamente al mismo, un promotor que se selecciona entre P170 y el promotor cadena arriba del extremo proximal LacZ de Tn917-LTV1 en uno de los integrantes depositado como DSM 8834, DSM 8835, DSM 8836, DSM 8837, DSM 8838, DSM 8839, DSM 8840, DSM 8841, DSM 8842, DSM 8843, DSM 8844, DSM 8845, DSM 8846, DSM 8847, DSM 8848, DSM 8849, DSM 8850, DSM 8851, DSM 8852, DSM 8853, DSM 8854, DSM 8855, DSM 8856, DSM 8857, DSM 8858 o DSM 8859, la presencia de dicho promotor dando como resultado la expresión del gen que se está alterando en comparación con la expresión del gen cuando está unido operativamente a su promotor nativo.

En otro aspecto más, la presente invención se refiere a un fragmento de ADN aislado que comprende el promotor regulado contenido en el clon integrante de Lactococcus lactis ssp. Lactis MG1363 depositado con un número de acceso seleccionado entre DSM 7360, DSM 8834, DSM 8835, DSM 8836, DSM 8837, DSM 8838, DSM 8839, DSM 8840, DSM 8841, DSM 8842, DSM 8843, DSM 8844, DSM 8845, DSM 8846, DSM 8847, DSM 8848, DSM 8849, DSM 8850, DSM 8851, DSM 8852, DSM 8853, DSM 8854, DSM 8855, DSM 8856, DSM 8857, DSM 8858 y DSM 8859 y unido operativamente al mismo, un gen que codifica un producto génico deseado, siendo dicho promotor uno que no está asociado de forma natural con el gen.

Descripción detallada de la invención

Un objeto principal de la presente invención es proporcionar el medio para construir mejores bacterias ácido lácticas que tengan calidad alimentaria en el sentido de que contengan sólo ADN obtenido de una especie de bacteria láctica o ADN de una especie de bacteria no ácido láctica, cuya presencia puede reconocerse generalmente como segura. Como se usa en este documento, el término "bacteria láctica" designa bacterias gram-positivas, microaerófilas o anaerobias que fermentan azúcares con la producción de ácidos que incluyen ácido láctico como el ácido producido de manera predominante, ácido acético y ácido propiónico. Las bacterias ácido lácticas industrialmente más útil se encuentran entre Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Propionibacterium spp. y Bifidobacterium spp.

Como se ha mencionado anteriormente, la invención describe un procedimiento para aislar un fragmento de ADN de bacteria láctica que comprende un promotor. En una primera etapa de este procedimiento se proporciona una molécula de ADN capaz de replicarse en una bacteria láctica, comprendiendo dicha molécula un elemento transponible, un gen estructural sin promotor como un gen de sonda de promotor, un gen marcador selectivo detectable, y un origen de replicación que es funcional en una bacteria láctica. Con la condición de que tal fragmento pueda introducirse en una bacteria láctica y posteriormente llegar a integrarse en una replicón de la célula huésped (incluyendo el cromosoma y/o plásmidos que lleva el huésped) como resultado de los eventos de transposición, pueden identificarse los promotores de la célula huésped mediante la detección de la expresión en la célula huésped del gen estructural sin promotor del fragmento de ADN integrado, ya que el gen estructural que carece de una región promotora no puede expresarse a menos que se produzca la inserción del elemento transponible en un sitio de un replicón donde una región promotora presente en la molécula del replicón interrumpida llega a estar unida de manera operativa al gen.

En el presente contexto, la expresión "elemento transponible" se usa para designar moléculas de ADN de doble cadena que tienen la capacidad de insertarse por sí mismas en otras moléculas de ADN. El procedimiento por el que un elemento transponible se inserta por sí mismo se denomina "transposición" y este procedimiento requiere una proteína conocida como "transposasa" (cf. referencia 3 para explicaciones más detalladas). El procedimiento de transposición da como resultado la inserción del elemento transponible en un sitio particular en una segunda molécula de ADN. Esta inserción tiene varias consecuencias significativas. Primero, la secuencia de ADN original de la segunda molécula de ADN (receptora) se interrumpe física y funcionalmente. Segundo, como la transposición da como resultado la incorporación de nuevo ADN en una segunda molécula de ADN, se proporcionan los medios para introducir ADN homólogo o heterólogo en una secuencia de ADN particular. Tercero, es posible modificar por ingeniería genética un elemento transponible de forma que su inserción en un secuencia de ADN pueda proporcionar información con respecto a la expresión y organización de la secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción. Por ejemplo, es posible insertar un gen que codifica un producto génico no expresado o no excretado cerca del final de un elemento transponible y por consiguiente, tal elemento transponible proporciona una sonda para promotores y péptidos señal de secreción.

Los elementos transponibles que pueden usarse de acuerdo con la invención son diversos tanto en tamaño como en organización funcional. De este modo, los elementos de transponibles simples, denominados "secuencias de inserción", no codifican funciones no relacionadas con su propio movimiento y generalmente son más cortas de 2 kb. Como todos los elementos transponibles, las secuencias de inserción poseen extremos especializados que contienen secuencias complementarias que son repeticiones invertidas de otra. La presencia de tales secuencias repetidas invertidas parece ser esencial para la transposición. Se cree que las enzimas transposasas median la transposición uniéndose a las secuencias de ADN a ambos extremos del elemento transponible.

Los elementos transponibles útiles incluyen transposones. El término "transposones" significa elementos transponibles que son más grandes que las secuencias de inserción y que además del sistema de transposasa codifican varios productos génicos tales como proteínas que otorgan resistencia celular a antibióticos u otro determinantes seleccionables.

Aunque la mayoría del trabajo que se refiere a la explotación de elementos transponibles como herramientas de tecnología génica se ha hecho en especies de bacterias gram-negativas, se han aislado y estudiado varios transposones que son funcionales en especies gram-positivas, principalmente en Bacillus spp, Listeria spp y Corynebacterium spp, pero también en menor grado en bacterias ácido lácticas. Los ejemplos de transposones que se pueden usar en bacterias ácido lácticas incluyen Tn916 aislado a partir de Streptococcus y funcional, entre otras, en Listeria spp, Micoplasma spp, Staphylococcus spp; Tn919 aislado a partir de Streptococcus sanguis que se ha demostrado que se transpone en las especies de bacterias ácido lácticas Lactobacillus plantarum, Leuconostoc cremoris y Lactococcus lactis; y Tn917 aislado a partir de Streptococcus faecalis que se sabe que se transpone en Bacillus spp y Listeria spp.

Para el propósito de la presente invención, un elemento transponible útil es uno que media la fusión del operón y la fusión transcripcional. Por consiguiente, en el presente procedimiento pueden usarse tales derivados que generan fusión de un transposón que tiene moléculas de ADN de bacterias ácido lácticas como su diana, incluyendo derivados de los transposones gram-positivos mencionados anteriormente. Como ejemplo, los derivados de transposones que generan fusión pueden comprender un gen estructural sin promotor, cuya expresión puede detectarse fácilmente. Tal gen estructural sin promotor puede seleccionarse, por ejemplo, entre un gen que codifica un producto génico que otorga resistencia a antibióticos, un gen que codifica un producto génico que complementa una carencia auxotrófica o un gen que codifica una enzima que tiene un producto final fácilmente detectable tal como un producto que da como resultado una reacción con color en un medio sólido o líquido apropiado.

Por ejemplo, la inserción de un gen lacZ sin promotor en un plásmido que comprende el transposón, en una orientación apropiada para obtener fusiones mediadas por transposición, da como resultado un vector plasmídico que vuelve azul a las bacterias que lo contienen cuando se cultivan en placas que contienen 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido (X-gal) como resultado de la expresión de \beta-galactosidasa. Las inserciones transposicionales en el cromosoma o en un plásmido, generadas con tales vectores producen colonias blancas, a menos que las inserciones se produzcan cadena debajo de un promotor funcional y en la orientación correcta para llevar a cabo una fusión transcripcional. De este modo, el gen sin promotor sirve como un gen de sonda de promotor y/u operón. Como otro ejemplo, un derivado de transposón que genera fusión puede comprender el gen sin promotor cat-86, cuyo producto génico media la resistencia a cloranfenicol.

En el presente contexto, una característica esencial de un elemento transponible adecuado es su capacidad para transponerse con un alto grado de aleatoriedad. Los elementos transponibles varían bastante en especificidad de diana, y sus sitios de inserción suelen mostrar poca o ninguna similitud con las secuencias del elemento. Algunos elementos pueden tener de unos pocos a cientos de sitios diana en cualquier gen, aunque no se ha encontrado ningún elemento que se inserte completamente de manera aleatoria. Otros electos son altamente específicos de sitio, insertándose solamente en un único sitio cromosómico. Otros elementos más parece que se insertan de manera cuasi-aleatoria en algunas especies, pero prefieren regiones particulares de ADN o ciertas regiones de moléculas de ADN. Para el propósito de la presente invención, se prefiere un elemento transponible que se integre de manera aleatoria o al menos cuasi-aleatoria, definiéndose en este documento la expresión "de manera cuasi-aleatoria" como un grado de aleatoriedad de integración en términos de la proporción de la cantidad total de eventos de inserción que se observa en un fragmento diana de ADN de un tamaño conocido con respecto a la proporción de inserciones esperadas es este fragmento de ADN que es como máximo 5, preferiblemente como máximo 4, más preferiblemente como máximo 3 y en particular como máximo 2,5. En realizaciones útiles pueden preferirse los elementos transponibles que tengan preferencia por ADN cromosómico.

En ciertas realizaciones preferidas, para el presente procedimiento puede seleccionarse una molécula de ADN capaz de replicarse en una bacteria láctica y que comprende un derivado del transposón Tn917 que genera fusión. Tales derivados incluyen plásmidos de la serie pTV que incluye pTV32, pLTV1, pLTV3, pTV51, pTV52 y pTV53. De estos, pTV32 y pLTV1 pueden ser particularmente útiles.

Además, la molécula de ADN como se proporciona en la etapa (i) del procedimiento comprende un gen marcador selectivo detectable que permite la selección de células en las que se ha introducido el fragmento de ADN. A este respecto, los genes marcadores convenientes incluyen los que codifican productos génicos que confieren resistencia a antibióticos, por ejemplo, resistencia a antibióticos macrólidos tales como eritromicina y lincomicina; tetraciclina, antibióticos \beta-lactama y cloranfenicol. Como otros ejemplos, el gen marcador puede codificar la complementación de la auxotrofía en la célula huésped en la que se introduce el fragmento de ADN, o puede ser un gen que codifica una enzima capaz de generar un producto final fácilmente detectable tal como, por ejemplo, el gen lacZ mencionado anteriormente.

En una segunda etapa del procedimiento, la molécula de ADN como se ha definido anteriormente se introduce en una población de células de una bacteria láctica. Tal introducción puede realizarse de acuerdo con las técnicas conocidas para introducir ADN en células huésped incluyendo transformación de células en forma de protoplastos, transformación por electroporación o, si el fragmento de ADN es un elemento de conjugación, por conjugación. El procedimiento seleccionado debe dar lugar preferiblemente a una frecuencia de introducción de ADN que es al menos 10^{4} células recombinantes por \mug de ADN tal como al menos 5 x 10^{4} por \mug de ADN, por ejemplo, al menos 10^{5} por \mug de ADN.

Para conseguir una alta probabilidad de obtener la integración del elemento transponible en al ADN de la célula huésped, es esencial que la molécula de ADN sea una que sea capaz de replicarse en la célula huésped. Por consiguiente, la etapa (ii) puede incluir una subetapa que permite que el replicón introducido se replique, seguido de un procedimiento para estudiar qué grado de replicación se ha producido en el transformante o exconjugante. En el presente contexto, se considera que un grado adecuado de replicación es un número de copias que está en el intervalo de 5 a 20 por célula. Se considera que un número de copias que excede sustancialmente este intervalo puede hacer que el curado de los replicones, que es un prerrequisito esencial para que se produzca una transposición posterior, sea más difícil de conseguir.

En una subetapa adicional, la etapa (ii) comprende someter las células transformantes o exconjugantes a condiciones que permitan que se produzca la transposición. Se puede inducir la transposición en bacterias no ácido lácticas mediante uno o más cambios en las condiciones medioambientales de las células. Como un ejemplo de esto, el procedimiento para la mutagénesis con Tn917 basado en pTV en B. subtilis incluye una etapa que implica un cambio antibiótico combinado con una elevación de la temperatura. Tanto la expresión como la transposición del gen erm de Tn917 se inducen en B. subtilis por eritromicina (referencia 57). En B. subtilis, la actividad de replicación de pE197Ts-rep se bloquea a una temperatura superior a 37ºC (referencia 56). Por consiguiente, el curado de los plásmidos pTV, la inducción y selección de transposiciones se hacen cultivando B. subtilis a temperaturas que exceden los 42ºC en presencia de eritromicina.

Durante la experimentación que conduce a la presente invención se descubrió, sin embargo, que el procedimiento anterior usado en B. subtilis no se podía aplicar a bacterias ácido lácticas tales como las Lactococcus lactis ssp. lactis MG1614 y MG1363 ilustradas. Sin embargo, sorprendentemente se descubrió que ni pTV32 ni pLTVI podían extraerse de las células de Lactococcus transformadas con estos plásmidos cuando se cultivaban a 30ºC en presencia de eritromicina. Esto indicó que se había producido la transposición (integración) de los derivados de Tn917 en el cromosoma con una pérdida concomitante de plásmido en estas condiciones.

Por consiguiente, la etapa (ii) del procedimiento incluye una subetapa en la que se induce la transposición de moléculas de ADN que contienen elementos transponibles libres en bacterias ácido lácticas transformadas con un curado concomitante de tales moléculas libres mediante el cultivo de los transformantes a una temperatura en el intervalo de 20 a 35ºC tal como 30ºC en presencia de un antibiótico al que el elemento transponible ofrece resis-
tencia.

En una etapa posterior (iii) del procedimiento, las células integrantes se clonan y someten a un procedimiento de selección para detectar las células integrantes donde puede expresarse el gen sin promotor del elemento transponible. Este procedimiento de selección dependerá del tipo de gen sin promotor. Cuando, por ejemplo, se usa un gen lacZ sin promotor, la selección puede realizarse cultivando en placas los integrantes clonados en un medio que contiene una sustancia degradable por \beta-galactosidasa con el desarrollo de un color o, si se usa un gen de resistencia a antibiótico, los integrantes pueden seleccionarse en un medio suplementado con el correspondiente antibiótico.

En la etapa (iv) del procedimiento, se clona un integrante seleccionado que expresa el gen estructural sin promotor y se aísla una región del replicón de una bacteria láctica que incluye un promotor que está unido operativamente al gen originariamente sin promotor y posiblemente secuencias que regulan la función del promotor, a partir de las células clonadas mediante el uso de enzimas de restricción apropiadas. Las principales secuencias resultantes de ADN que contienen el promotor pueden tener tamaños variables dependiendo de la localización de los sitios de restricción para la enzima o enzimas seleccionadas.

Para una aplicación adicional de las secuencias/fragmentos aislados de ADN que contienen el promotor puede ser ventajoso preparar subsecuencias de estas secuencias principales para obtener fragmentos más pequeños que comprenden el promotor aislado y posiblemente secuencias que regulan la función del promotor. Mientras que un fragmento principal que contiene el promotor puede tener, por ejemplo, un tamaño que está en el intervalo de 40 a 600 kb, se considera que una subsecuencia que comprende el promotor y posiblemente otras secuencias necesarias para su regulación puede tener más apropiadamente un tamaño que está en el intervalo de 50 a 10.000 pares de bases.

De acuerdo con la presente invención, la población de células de una bacteria láctica en la que el fragmento de ADN que comprende el elemento transponible se introduce en la etapa definida anteriormente (ii), se selecciona preferiblemente entre Lactococcus app., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Propionibacterium spp. y Bifidobacterium spp. En una realización particularmente preferida, la bacteria láctica se selecciona entre Lactococcus lactis subespecie lactis tales como las cepas MG1614 y MG1363 de Lactococcus lactis ssp. lactis. Durante el uso industrial en la fabricación alimentaria de bacterias ácido lácticas genéticamente mejoradas como se definen en este documento, puede ser ventajoso que pueda regularse la función de las bacterias de modo que los rasgos fenotípicos específicos de los cultivos de partida de bacterias ácido lácticas puedan activarse o desactivarse o que la velocidad de expresión de ese rasgo se mejore o reduzca durante períodos especificados del procedimiento de fabricación incluyendo un procedimiento de maduración. Como ejemplo, en la fabricación del queso puede ser deseable usar cultivos que no sean proteolítica o lipolíticamente activos a un alto grado durante el procedimiento de cuajado pero que sí lo sean durante la maduración del
queso.

Por consiguiente, el procedimiento puede ser un procedimiento en el que el promotor compuesto por el fragmento de ADN que se está aislando y seleccionando es un promotor regulable. Tal procedimiento incluye etapas por las que se seleccionan con respecto al modo de regulación las secuencias aisladas que contienen el promotor que incluyen posiblemente secuencias reguladoras. En el presente contexto, un promotor regulable puede regularse mediante un factor seleccionado entre el pH y/o el contenido de arginina en el medio, la temperatura de crecimiento, un cambio de temperatura que provoca la expresión de genes de choque térmico, la composición del medio de cultivo que incluye el contenido en resistencia iónica/NaCl y, la velocidad de la fase de cultivo/crecimiento de la bacteria láctica en la que se introduce la molécula de ADN que comprende un promotor. Un ejemplo de un modo de regulación de un promotor es el fenómeno de control estricto por el que se entiende que la síntesis de ARN de una célula se suspende en el caso de que a la célula se le prive de un nutriente esencial tal como un aminoácido. Por consiguiente, un promotor regulable adecuado de acuerdo con la presente invención puede ser uno que esté bajo control estricto.

Otro ejemplo de un modo útil para regular un promotor es seleccionar un promotor que regule un gen que codifique una enzima implicada en la síntesis de novo de nucleótidos de purina a partir de sus precursores. Insertando en una bacteria láctica tal promotor que se regula siendo reprimido en presencia de compuestos de purina, frente a un gen cuya expresión se va a regular, este gen sólo se expresará cuando la bacteria se cultive en un medio que no contenga precursores de compuestos de purina. Un ejemplo de tal promotor regulado es el promotor de purD de lactococcus como se describe más adelante en este documento.

Como ejemplo de selección del modo de regulación del promotor, el promotor aislado puede seleccionarse con respecto a la regulación de la temperatura/fase de cultivo cultivando en placas células en las que el promotor que está unido operativamente a un gen que codifica un producto génico, cuya expresión es fácilmente detectable, se ha introducido por transposición, en un medio apropiado e incubando las placas a diversas temperaturas tales como temperaturas que están en el intervalo de 10 a 30ºC y observando la expresión génica dependiente de temperatura. Sin embargo, como la velocidad de cultivo de las células integrantes dependerá de la temperatura de cultivo, no se puede determinar si una expresión observada aparentemente dependiente de la temperatura es el resultado de una regulación de temperatura directa o la dependencia se debe a la regulación de la fase de cultivo.

Asimismo, puede seleccionarse una posible regulación dependiente de pH y/o arginina de la expresión génica cultivando en placas las anteriores células integrantes en medios que tienen diferentes composiciones que darán como resultado diversos valores de pH después del crecimiento de los cultivos de células integrantes. Como ejemplo, las células pueden cultivarse en medio GM17 en el que el pH final será aproximadamente 5 y en un medio GM17 modifico que tiene 1/5 del contenido de glucosa normal y suplementarse con arginina al 0,5%. El pH en tal medio después del crecimiento de un cultivo de células integrantes de Lactococcus lactis como se ha definido anteriormente será aproximadamente 9. Cuando la expresión del gen bajo control del gen aislado sólo se observa en uno de los dos valores de pH, se demuestra una regulación dependiente de pH y/o arginina.

Como un objeto de la presente invención es proporcionar los medios para construir mejores bacterias ácido lácticas recombinantes insertando secuencias que contienen el promotor que dan como resultado una mejor expresión del gen o genes de bacterias ácido lácticas que codifican productos génicos deseados, es parte de la invención seleccionar secuencias promotoras con respecto a la resistencia. Esta selección se realiza de acuerdo con procedimientos que se conocen per se.

El gen que codifica un producto génico deseado puede ser, de acuerdo con la presente invención, un gen homólogo o puede ser un gen heterólogo insertado incluyendo un gen que se obtiene de una bacteria láctica. Cuando el gen es un gen insertado, éste puede insertarse en la misma secuencia de ADN que la que comprende la secuencia promotora o puede insertarse en una secuencia de ADN distinta.

En una realización útil, la inserción de la anterior secuencia aislada que contiene el promotor puede ser en el cromosoma de la bacteria láctica, y en otra realización útil, la secuencia puede insertarse de manera extracromosómica, por ejemplo, en un plásmido que lleva la bacteria. Como se ha mencionado anteriormente, puede ser ventajoso tener la secuencia que contiene el promotor integrada en el cromosoma, ya que la secuencia y el gen al que está unido operativamente está, por la presente, contenido de manera más estable en comparación con una localización en un elemento extracromosómico. La inserción de la secuencia que contiene el promotor se hace de acuerdo con procedimientos de tecnología génica que se conocen per se tales como por inserción en un plásmido por procedimientos convencionales de restricción y ligación o integración en el cromosoma mediante el uso de transposones o bacteriófagos o por técnicas convencionales de recombinación. En una realización interesante, la secuencia aislada que contiene el promotor comprende una secuencia adicional, de modo que el promotor aislado llega a regularse por un evento estocástico. Tal regulación puede ser útil, por ejemplo, en cultivos ácido lácticos para los que es ventajoso tener una actividad de disminución gradual del gen bajo control de la secuencia insertada que contiene el promotor. Tales secuencias adicionales pueden ser, por ejemplo, secuencias que dan como resultado una escisión recombinante del promotor o de los genes que codifican sustancias que son realmente necesarias para la función del promotor.

Una regulación estocástica de la función del promotor puede también ser en forma de escisión recombinante de una secuencia reguladora que inhibe la función del promotor por lo cual se obtiene una actividad del promotor que aumenta de forma gradual en el nivel de población celular recombinante.

Como se ha mencionado anteriormente, la presente invención describe un procedimiento adicional para construir una bacteria láctica recombinante, comprendiendo la bacteria un gen que codifica un producto génico deseado, cuya expresión se altera en comparación con la expresión del gen cuando está unido operativamente a su promotor nativo. En este procedimiento, se utiliza una molécula de ADN definida anteriormente y que comprende un elemento transponible con un gen de sonda de promotor para identificar un sitio o sitios en un replicón de bacterias ácido lácticas (cromosoma o plásmido) en el que el elemento transponible es integrable y donde el gen de sonda sin promotor llega a unirse de manera operativa a una secuencia promotora presente en el replicón y posteriormente, se inserta en una célula da bacteria láctica no integrante en ese o estos sitios o en sitio/sitios que son funcionalmente equivalentes a éste, un gen que codifica un producto génico deseado, por lo cual este gen llega a unirse de manera operativa a la secuencia promotora identificada.

Considerando que el elemento transponible llegará a insertarse entre dos pares de bases, se entenderá que el gen que codifica un producto génico deseado también puede, además de insertarse entre esas dos pares de bases, insertarse en un sitio adyacente que se encuentra a una distancia del sitio de inserción específico (integración) que seguirá permitiendo a la secuencia promotora identificada controlar la transcripción del gen insertado. En el presente contexto, tales sitios adyacentes se denominan sitios funcionalmente equivalentes. Se considera que la distancia del sitio específico de integración del transposón donde se pueden encontrar tales sitios funcionalmente equivalentes, está en el intervalo de 1 a 2000 pares de bases.

De acuerdo con la invención, el gen que codifica el producto génico deseado que se inserta en el sitio definido anteriormente puede ser un gen homólogo o heterólogo incluyendo un gen que se obtiene de una bacteria láctica.

La presente invención proporciona, en un aspecto adicional, una bacteria láctica recombinante que comprende un gen que codifica un producto génico deseado y unido operativamente al mismo un promotor de bacterias ácido lácticas no asociado con el gen de manera natural, dando como resultado la presencia de dicho promotor la expresión del gen a alterar en comparación con la expresión del gen cuando está unido operativamente a su promotor
nativo.

Como se usa en este documento, el término "expresión alterada" se usa para indicar que la regulación de la expresión del gen es cuantitativa o cualitativamente diferente de la regulación del gen cuando está unido operativamente a su promotor nativo. Una expresión cuantitativamente diferente puede reconocerse como un nivel aumentado de expresión de los productos génicos tal como al menos una expresión aumentada un 10%. Puede ser ventajoso, por ejemplo, que la expresión aumente al menos un 25% tal como al menos un 50%. En ciertas realizaciones, puede ser ventajoso proporcionar bacterias ácido lácticas recombinantes en las que la expresión del gen que codifica un producto génico deseado es menor que la del gen cuando está bajo el control de su promotor nativo. Por consiguiente, una bacteria recombinante útil puede tener una expresión, cuyo nivel está reducido al menos un 10%, preferiblemente al menos un 25% o más preferiblemente está reducido al menos un 50%.

Cualitativamente, la expresión de un gen que codifica un producto génico deseado, cuyo promotor nativo es un promotor constitutivo, puede alterarse uniéndolo de manera operativa a un promotor regulable o la expresión de un gen que tiene un promotor regulable nativo puede alterarse uniéndolo a un promotor constitutivo. En realizaciones adicionales, la expresión del gen que tiene un promotor regulable nativo puede alterarse de forma cualitativa uniéndolo a un promotor regulable que tiene un modo de regulación diferente.

En una realización útil, la presente invención proporciona la bacteria láctica recombinante como una que comprende una secuencia insertada de ADN ácido láctica que comprende el promotor como se ha definido anteriormente, estando el promotor de bacterias ácido lácticas unido operativamente a un gen que codifica un producto génico deseado. El gen que codifica un producto génico deseado puede ser, de acuerdo con la invención, un gen cromosómico o un gen localizado extracromosómicamente.

En ciertas realizaciones preferidas, el anterior gen que codifica un producto génico deseado puede ser un gen nativo que en el presente contexto se define como un gen homólogo que está en su posición natural en un cromosoma o en un plásmido natural en una bacteria láctica particular o puede ser un gen homólogo que está aislado de su posición natural e insertado en la misma cepa de bacteria láctica, pero en otra posición. En otras realizaciones más útiles, el gen que codifica un producto génico deseado es un gen heterólogo aislado de una especie de bacteria no ácido láctica o de otra especie de bacteria láctica.

Aunque en ciertas realizaciones puede preferirse que el promotor insertado sea un promotor regulable, en otras realizaciones útiles también puede ser ventajoso proporcionar una bacteria láctica recombinante donde el promotor insertado sea un promotor constitutivo. Cuando el promotor seleccionado a insertar es un promotor regulable, el modo de regulación puede seleccionarse entre los factores definidos anteriormente en este documento, incluyendo regulación por un evento estocástico.

Pude ser ventajoso proporcionar la bacteria láctica de acuerdo con la presente invención como una en la que se inserta en un plásmido una secuencia de ADN insertada que comprende un promotor de bacterias ácido lácticas. En ciertas realizaciones preferidas tal plásmido es uno que consta además de un gen que codifica un producto génico deseado como se define en este documento, un replicón de bacterias ácido lácticas que es funcional en una bacteria láctica, un sitio de inserción que permite que la secuencia de ADN se inserte de modo que el gen que codifica el producto génico deseado esté unido operativamente al promotor, por lo cual el gen puede transcribirse cuando el plásmido está presente en una bacteria láctica.

El promotor insertado en el plásmido puede ser preferiblemente un promotor que es regulable como se describe en este documento.

En este contexto, una bacteria láctica adecuada es una que lleva el plásmido pAK80 que se describe más adelante, o un derivado del mismo incluyendo pAK80:SB, pAK80:143, pAK80:162, pAK80:163, pAK80:170, pAK80:224 y pAK80:242.

En una realización interesante, la bacteria láctica a recombinar de acuerdo con la presente invención puede llevar el gen que codifica un producto génico deseado en un plásmido que tiene un comportamiento de replicación condicional de modo que aumenta sustancialmente el número de copias plasmídicas en ciertas condiciones, por ejemplo, a varios cientos o miles. Los plásmidos que tienen tal comportamiento de replicación, también se denominan plásmidos autorreplicantes.

Una bacteria láctica recombinante como se define en este documento puede ser una que se selecciona entre Lactococcus spp. incluyendo Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp. diacetylactis y Lactococcus lactis ssp. cremoris.

En realizaciones preferidas, la bacteria láctica recombinante es una en la que la secuencia insertada que contiene el promotor como se define en este documento se obtiene de Lactococcus spp. tal como Lactococcus lactis subespecie lactis. En ciertas realizaciones específicas, el promotor insertado puede aislarse a partir de cepas MG1614, MG1363 o CHCC285 de Lactococcus lactis subespecie lactis (Chr. Hansens Laboratorium A/S). Los promotores interesantes son promotores de ARNt y ARNr incluyendo los promotores PI y PII y el promotor de purD de Lactococcus lactis subespecie lactis como se describe a continuación. Los promotores particularmente interesantes son promotores fuertes tales como promotores de ARNt o ARNr que comprenden la secuencia (motivo) conservada AGTT.

La presente bacteria láctica recombinante preferiblemente es una en la que el gen que codifica un producto génico deseado se selecciona entre un gen que codifica una lipasa, un gen que codifica una nucleasa, un gen que codifica una peptidasa tal como una aminopeptidasa, un gen que codifica una proteasa, un gen que codifica un producto génico implicado en el metabolismo de carbohidratos, un gen que codifica un producto génico implicado en el metabolismo del citrato, un gen que codifica un producto génico implicado en resistencia a bacteriófagos, un gen que codifica una enzima lítica tal como una lisozima o una enzima lítica de fago y un gen que codifica una bacteriocina incluyendo nisina. En un aspecto interesante, el gen que codifica un producto génico deseado puede ser uno cuyo producto génico confiere resistencia a una bacteriocina tal como nisina, o pediocina.

Los anteriores genes que codifican un producto génico deseado pueden ser genes obtenidos de un bacteria láctica o pueden ser genes adecuadamente obtenidos de un especie microbiana de bacterias no ácido lácticas o de una célula eucariota incluyendo células vegetales y células humanas o animales. Como un ejemplo de un gen útil obtenido de un célula eucariota puede mencionarse el plasminógeno.

En una realización preferida específica de la invención, el gen se selecciona entre el gen lacL de una Leuconostoc spp., el gen lacM de una Leuconostoc spp. y un gen de Lactococcus lactis ssp. lactis que codifica una peptidasa tal como una aminopeptidasa de lisina.

De acuerdo con la presente invención, la bacteria láctica recombinante como se define en este documento puede ser adecuadamente una en la que el gen que codifica un producto deseado se inserta en un sitio en un replicón donde está bajo el control de un promotor presente en el replicón, cuyo sitio puede identificarse mediante la inserción de un gen estructural sin promotor por medio de un elemento transponible que comprende el gen estructural sin promotor por lo cual el gen originariamente sin promotor llega a ser expresable estando unido operativamente al promotor presente en dicho replicón, haciendo que la inserción del gen en dicho sitio dé lugar a dicho gen que llega a estar unido operativamente al promotor que está presente en el replicón.

Se entenderá que el sitio en el que el gen que codifica el producto génico deseado puede insertarse, no está limitado al sitio específico entre dos pares de bases identificados por la inserción del elemento transponible, sino que puede ser cualquier sitio a una distancia desde este sitio específico que aún puede permitir al promotor de la bacteria láctica que al gen sin promotor del elemento transponible pueda llegar a estar unido operativamente, controlar la expresión del gen insertado. Los sitios de inserción que están a dicha distancia desde el sitio específicamente identificado pueden referirse en el presente contexto como sitios de inserción funcionalmente equivalentes.

De acuerdo con la presente invención, también puede proporcionarse un Lactococcus recombinante en el que se ha insertado una secuencia que comprende un promotor como se ha definido anteriormente así como un gen que codifica un producto génico deseado también como se ha definido anteriormente.

Como se ha mencionado anteriormente, la presente invención proporciona en un aspecto adicional más un fragmento de ADN aislado de acuerdo con las reivindicaciones.

Tal fragmento de ADN está aislado de acuerdo con el procedimiento que se describe en este documento. En una realización útil, el fragmento de ADN es uno que comprende además al menos un terminador de la transcripción. El presente fragmento de ADN es preferiblemente un fragmento que tiene un tamaño que está en el intervalo de 100 a 10000 pares de bases tal como un tamaño que está en el intervalo de 200 a 5000 pares de bases. De acuerdo con la invención, el fragmento de ADN también puede ser uno que comprende además secuencias que codifican productos génicos implicados en la regulación del promotor.

En realizaciones útiles, el fragmento de ADN en uno en el que el gen que codifica un producto génico deseado se selecciona entre un gen que codifica una lipasa, un gen que codifica una peptidasa, un gen que codifica una proteasa, un gen que codifica un producto génico implicado en el metabolismo de carbohidratos, un gen que codifica un producto génico implicado en el metabolismo de citratos, un gen que codifica un producto génico implicado en resistencia a bacteriófagos, un gen que codifica una enzima lítica y un gen que codifica una bacteriocina. El gen también puede ser uno que codifica un producto génico que confiere resistencia a un antibiótico o una bacteriocina tal como, por ejemplo, nisina o pediocina.

El fragmento de ADN definido anteriormente puede comprender un gen que codifica un producto génico deseado que es un gen homólogo o heterólogo incluyendo un gen obtenido de una bacteria láctica. Por consiguiente, el gen puede, en ciertas realizaciones preferidas, ser uno que se selecciona entre el gen lacL de una Leuconostos spp., el gen lacM de una Leuconostoc spp. y un gen de Lactococcus lactis ssp. lactis que codifica una aminopeptidasa de lisina.

El promotor de bacterias ácido lácticas comprendido en el fragmento de ADN puede aislarse de un Lactococcus lactis. En realizaciones específicas de la invención, el promotor es el promotor regulable contenido en el clon P139-170 integrante de MG1363 de Lactococcus lactis ssp. lactis depositado con el número de acceso DSM 7360.

La bacteria recombinante puede ser, de acuerdo con la invención, una en la que la secuencia de ADN insertada que comprende un promotor de bacterias ácido lácticas regulable se inserta en un vector que comprende un gen sin promotor que codifica un producto génico deseado, un replicón-theta de bacterias ácido lácticas de replicación que es funcional en la bacteria, un sitio de inserción que permite que la secuencia de ADN se inserte de modo que el gen que codifica el producto génico deseado esté unido operativamente al promotor, por lo cual el gen se transcribe. En una realización, tal bacteria puede comprender, como el vector en el que se inserta la secuencia de ADN insertada, el plásmido pAK80. La bacteria láctica recombinante como se ha proporcionado en este documento, puede ser útil en cultivos de partida para la fabricación de productos alimentarios incluyendo productos diarios, productos de carne y productos vegetales y en la conservación de comida para animales. En este último contexto, las presentes bacterias recombinantes son particularmente interesantes como inoculantes en cultivos de campo que se van a ensilar. Cuando las bacterias se van a usar para estos propósitos, pueden proporcionarse convenientemente en forma de concentrados bacterianos secos o congelados, por ejemplo, que contienen de 10^{10} a 10^{12} unidades formadoras de colonias (CFU) por gramo de concentrado.

Un uso interesante de una bacteria láctica recombinante como se define en este documento es en la fabricación de un composición probióticamente activa. La expresión "probióticamente activo" indica que las bacterias seleccionadas para este propósito tienen características que les permiten colonizar en tracto gastrointestinal y de ese modo ejercer un efecto regulador positivo en la flora microbiana en este hábitat. Talecto puede reconocerse como una conversión de alimento o comida mejorada en seres humanos o animales a los que se les administran las bacterias, o como una mayor resistencia contra microorganismos patogénicos invasores.

Además, se considera que las presentes bacterias ácido lácticas recombinantes pueden ser útiles en la preparación de cepas de vacuna recombinantes en las que se insertan uno o más genes que codifican determinantes antigénicos.

El plásmido recombinante de acuerdo con la presente invención es preferiblemente uno en el que el promotor de bacterias ácido lácticas es un promotor que puede regularse de una forma como se ha definido anteriormente. En este contexto, los plásmidos útiles pueden seleccionarse entre el plásmido pAK80 o un derivado del mismo incluyendo pAK80:SB, pAK80:143, pAK80:162, pAK80:163, pAK80:170, pAK80:224 y pAK80:242.

La invención se ilustra además en los siguiente Ejemplos y Figuras, donde:

la Figura 1 es un mapa de pTV32 en el que las siguientes abreviaturas indican sitios de enzimas de restricción: SalI, EcoRI, PstI, XbaI, KnpI y SmaI, Tn917 indica la parte del transposón, erm indica el gen que codifica la resistencia a eritromicina, bla el gen que codifica \beta-lactamasa, ColEI rep el origen de la replicación del plásmido ColEI, cat indica el gen que codifica la resistencia a cloranfenicol mediada por cloranfenicol acetiltransferasa, lacZ el gen de \beta-galactosidasa sin promotor o E. coli, tet indica el gen que codifica la resistencia a ampicilina y pE194 Ts rep indica el origen sensible a temperatura de la replicación derivada del plásmido pE194,

la Figura 2 es un mapa de pLTV1 (abreviaturas, cf. la leyenda de la Figura 1),

la Figura 3 ilustra un análisis de hibridación de Southern de 12 integrantes independientes de TV32 de L. lactis ssp. lactis. El ADN de los integrantes, indicado en la parte superior de cada calle se digirió con EcoRI, se sometió a electroforesis a través de un gel de agarosa, se transfirió a una membrana de nylon y se hibridó con A: pLTV1 marcado con ^{32}P. B: sonda específica del replicón de pE194 marcado con ^{32}P. Los marcadores de tamaño se dan en kilopares de bases,

la Figura 4 muestra la electroforesis en gel con campo pulsátil (PFGE) de ADN digerido con SmaI de integrantes de TV32 de L. lactis ssp. lactis. Los números de integrante se indican en la parte superior de las calles. A: escala lambda (Promoega, Madison, Estados Unidos) empezando por la parte inferior con 48,5 kb, 97,0 kb, 145,5 kb, etc. B: escala delta 39 lambda (Promega) empezando por la parte inferior con 39,0 kb, 78,0 kb, 117 kb etc. M es ADN digerido con SmaI de MG1614 de L. lactis ssp. lactis,

la Figura 5 ilustra la electroforesis en gel con campo pulsátil (PFGE) de 19 clones (E1-E19) elegidos de un cultivo de MG1614 de Lactococcus lactis ssp. lactis que comprende un integrante de TV32 dominante. Las calles indicadas por A, B y M son como se han indicado anteriormente para la Figura 5. La digestión del clon E5 dio como resultado fragmentos que no podían visualizarse como bandas discretas,

la Figura 6 ilustra la electroforesis en gel con campo pulsátil (PFGE) de 18 clones (K1-K2, K4-K14, K16-K20) elegidos de manera aleatoria a partir de un cultivo común de integrantes de TV32 de MG1614 de Lactococcus lactis ssp. lactis. Las calles indicadas por A, B y M son como se han indicado anteriormente para la Figura 5,

la Figura 7 muestra el patrón de estrías para la investigación de la expresión regulada de lacZ en el clon de fusión del promotor número de colección 1. Cada clon se sembró en estrías en una placa que contenía 1 \mug/ml de eritromicina y 320 \mug/ml de X-gal en una línea recta de aprox. 0,5 cm,

la Figura 8 ilustra la construcción de pAK97.7 como se describe en el Ejemplo 6. P representa el promotor de \beta-galactosidasa de Leuconostoc mesenteroides subespecie cremoris, y rbs el sitio de unión al ribosoma. Los sitos de homología con los cebadores lac-1 y lac-2 se indican mediante flechas pequeñas. El sitio de unión al ribosoma también está presente en pAK67.7,

la Figura 9 ilustra el crecimiento y actividad \beta-galactosidasa del integrante 170 de LTV1 cultivado a pH 5,5 y 7,0,

la Figura 10 ilustra el crecimiento y actividad \beta-galactosidasa del integrante SB de LTV1 cultivado a pH 5,5 y 7,0,

la Figura 11 ilustra un fragmento de ADN de la cepa CHCC85 de Lactococcus lactis subespecie lactis que contiene siete genes de ARNt y un gen de ARNr 5S colocados en un único operón incluyendo dos promotores y dos supuestos terminadores de la transcripción,

la Figura 12 muestra la organización génica y la secuencia nucleotídica de trnA. La secuencia de aminoácidos deducida de 'tma se muestra más adelante en código de una letra, el codón finalizador se indica por un asterisco. Las supuestas secuencias promotoras -35 y -10 (PI, PII), un motivo conservado en la región -44 y una secuencia conservada que debe estar implicada en un control estricto (Chiaruttini & Milet, 1993; Ogasawara y col., 1983) está subrayados con doble línea. Las regiones codificantes de los genes de ARNt y rrfU están subrayadas. Los supuestos terminadores de la transcripción se indican por flechas encima de la secuencia. La localización de sitios de enzimas de restricción para ScaI y SpeI, usados para la clonación y la clonación del promotor, se muestra antes de la secuencia,

la Figura 13 muestra una comparación de secuencias promotoras de ARNt y ARNr de Lactococcus lactis y Lactococcus cremoris. La región -44 conservada, región -35, un doblete TG (cf. referencia 19), -10 y una secuencia conservada que se sugieren que están implicadas en el control de la expresión durante una respuesta estricta de Bacillus subtilis (Ogasawara y col., 1983) están subrayadas. A: PI de trnA; B: PII de trnA; C: P21 de un gen de ARNt^{leu} de Lactococcus cremoris (van der Vossen y col., 1987; este estudio); D: P2 de Lactococcus lactis (Koivula y col., 1991); E: región promotora delante de un gen supresor ocre de Lactococcus lactis (F. Dickely & E. Bech Hansen, comunicación personal); F: P10 de un gen de ARNt^{arg} de Lactococcus lactis (Koivula y col., 1991; este estudio); G: promotor de un operón de ARNr de Lactococcus lactis (Chiaruttini & Milet, 1993); H: P2 de un operón de ARNr de Lactococcus lactis (Beresford & Condon, 1993); I: supuesto promotor delante de un gen supresor ámbar de Lactococcus lactis (E. Johansen, resultados no publicados); J: P21 de Lactococcus lactis (Koivula y col., 1991). Con., muestra nucleótidos idénticos en las secuencias alineadas A a H,

la Figura 14 es un fragmento de ADN de 846 pb de Lactococcus lactis que contiene la región promotora de purD completa así como un promotor adyacente que inicia la transcripción en dirección contraria,

la Figura 15 ilustra la DO_{600} y la actividad de \beta-galactosidasa frente al tiempo durante el cultivo del fermentador de pSMA344/MG1363 en medio líquido en condiciones controladas,

la Figura 16 es un mapa de restricción de un fragmento de EcoRI-ClaI de 9,7 kb de lactococcus de p170 y de derivados de deleción,

la Figura 17 es un mapa de restricción de un fragmento NdeI-ClaI de 4,0 kb de llactococcus de p170 y de derivados de deleción, y

La Figura 18 ilustra la integración de tipo Campbell de un plásmido no replicante en el cromosoma de bacterias ácido lácticas donde P representa un promotor, Erm representa un gen de resistencia a eritromicina, el gen informador es el gen de \beta-galactosidasa de Leuconostoc mesenteroides y el replicón de E. coli es el replicón pACYC de pAV891 y donde las áreas negras ilustran la región de homología de ADN entre el plásmido y el cromosoma, y las flechas indican la dirección de la transcripción a partir del promotor P.

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Ejemplo 1 Transformación de MG1614 de Lactococcus lactis ssp. lactis con pTV32 y pLTV1 y demostración de la replicación de estos plásmidos

Se han construido varios vectores (plásmidos pTV) que contienen derivados del transposón Tn917 de la especie de bacterias ácido lácticas Streptococcus faecalis para uso en Bacillus subtilis y otras bacterias gram-positivas (referencias 10, 55 y 57). Se seleccionaron dos derivados de la serie del plásmido pTV, pTV32 (referencia 57) y pLTV (referencia 55) para este y los siguientes experimentos.

pTV32 (15,6 kb) y pLTV1 (20,6 kb) contienen (i) un replicón sensible a temperatura (pE194Ts-rep) del plásmido E194, (ii) en la parte de replicón del plásmido, un gen cat (pTV32) que confiere resistencia a cloranfenicol (Cm^{r}) o un gen (pLTV1) de resistencia a tetraciclina (Tc^{r}), (iii) Tn917 que lleva un gen erm que confiere resistencia a eritromicina (Em^{r}), y (iv) un gen lacZ de E. coli sin promotor con un sitio de unión al ribosoma de Bacillus subtilus insertado en ADN de Tn917 no esencial en el extremo erm-proximal (Figuras 1 y 2). pTV32 y pLTV1 se aislaron a partir de PY1173 de E. coli y PY258 de Bacillus subtilis, respectivamente. Estas cepas se obtuvieron de P. Youngman, Universidad de Pensilvania.

MG1614 de Lactococcus lactis ssp. lactis, que es un derivado sin profago, sin plásmido, resistente a estreptomicina y rifampicina de la cepa NCDO 712 se transformó con pTV32 o pLTV1 usando el procedimiento de electroporación descrito por Holo y Ness (referencia 20) y se seleccionaron transformantes primarios cultivándolos en placas en medio M17 (Sigma Chemical Co.) que contenían glucosa al 0,5% (medio GM17) suplementado con sacarosa 0,5 M, CaCl_{2} 2 mM (medio SGM17, Ca) y el antibiótico selectivo apropiado (eritromicina o cloranfenicol) y se incubaron a 30ºC. Los antibióticos se adquirieron en Sigma y se usaron en las siguientes concentraciones: eritromicina, 1,0 \mug ml^{-1}; cloranfenicol, 5,0 \mug ml^{-1}.

Con cada plásmido, las eficacias de transformación fueron de 10^{4} a 5 x 10^{4} transformantes por \mug de ADN cuando se seleccionan por Cm^{r} o Em^{r}.

Se transfirieron colonias de transformantes primarios seleccionados a medio líquido GM17 suplementado con 5,0 \mug ml^{-1} de cloranfenicol y las células transformantes se cultivaron hasta una cantidad de generaciones que estaba en el intervalo de 10 a 50. El ADN plasmídico se extrajo posteriormente de estos transformantes realizando una lisis alcalina de las células sustancialmente de acuerdo con el procedimiento descrito por Birnboim y col. (referencia 6) con modificaciones como se indica a continuación. Se cultivaron exponencialmente células a una A_{600} de 0,3, se recogieron 5 ml de cultivo por centrifugación a 4.000 x g. Los sedimentos se lavaron en tampón TS (sacarosa 25%, Tris clorhidrato 50 mM, pH 8,0), se resuspendieron en 0,25 ml de solución S1 (EDTA 5 mM, NaCl 50 mM, sacarosa al 25%, Tris clorhidrato 50 mM, pH 8,0) con 10 mg/ml de lisozima y se incubaron a 30ºC durante 30 minutos. Se añadieron suavemente 0,5 ml de solución S2 (NaOH 0,2 M, SDS al 1%) y la suspensión se mantuvo en hielo durante 5 minutos. Posteriormente se añadieron 0,4 ml de acetato sódico 3 M, pH 4,8 y la suspensión se mantuvo en hielo durante 5 minutos. Después de la centrifugación de la suspensión a 10.000 x g, los plásmidos se extrajeron del sobrenadante de acuerdo con el procedimiento descrito por Birnboim y col (referencia 6).

Una porción del ADN plasmídico extraído de este modo y los plásmidos pTV32 y pLTV1 aislados a partir de PY1173 de E. coli y PY258 de Bacillus subtilis, se sometieron respectivamente a un tratamiento en condiciones convencionales con la enzimas de restricción EcoRI, SalI y HindIII. Después, el ADN plasmídico extraído no digerido aislado a partir de MG1614de Lactococcus lactis ssp. lactis y de PY1173 de E. coli y PY258 de Bacillus subtilis PY258 así como el ADN plasmídico tratado con enzimas de restricción se sometieron a un análisis de electroforesis en gel de agarosa, y se descubrió que los tamaños de pTV32 y pLTV1 extraídos de MG1614 de Lactococcus lactis ssp. lactis transformado así como los sitios de enzimas de restricción EcoRI, SalI y HindIII se conservaron en comparación con los plásmidos originales. Asumiendo que el nivel de recuperación en el procedimiento de preparación plasmídico anterior fue del 100%, se estimó que el número de copias medio de ambos plásmidos en MG1614 de Lactococcus lactis ssp. lactis transformado era de 6 a 12 copias por célula realizando una comparación en geles de agarosa con un patrón de ADN del fago lambda de concentración conocida digerida con HindIII. Por consiguiente, podría concluirse de este experimento que las bacterias ácido lácticas pueden transformarse con pTV32 y pLTV1 a una alta eficacia y que estos plásmidos son capaces de replicarse en una bacteria láctica.

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Ejemplo 2 Inducción de la transposición de Tn917 en L. lactis ssp. lactis y curado de plásmidos-pTV

MG1614 de Lactococcus lactis ssp. lactis deja de cultivarse en caldo M17 (Sigma Chemical Co.) que contiene glucosa 0,5 a una temperatura que excede los 37ºC. Como pTV32 o pLTV1 podían extraerse a partir de MG1614 de L. lactis ssp. lactis con estos plásmidos y cultivarse a 37ºC en selección por Cm^{r}, el procedimiento de curado por temperatura desarrollado para B. subtilis no pudo usarse en la cepa de Lactococcus.

Sin embargo, se demostró que ni el ADN de pTV32 ni el ADN de pLTV1 podían extraerse a partir de transformantes de Lactococcus cultivados a 30ºC con selección por Em^{r}. Esto indicó transposición (integración) de Tn917 al cromosoma con pérdida concomitante de plásmido.

La producción de integrantes de Tn917 de Lactococcus lactis ssp. lactis a partir de cultivos individuales, se realizó de acuerdo con el siguiente procedimiento:

las células transformadas primarias preparadas como se describen en el Ejemplo 1, se cultivaron en placas en agar SGM17, Ca que contenía eritromicina y se incubaron a 30ºC durante aproximadamente 40 horas. Se subcultivaron 12 colonias sencillas dos veces en medio de caldo M17 que se selecciona por Em^{r}. Para obtener colonias sencillas, cada cultivo se sembró en estrías en agar GM17 que contenía eritromicina y se volvió a sembrar en estrías una vez una única colonia de cada cultivo. Todas las incubaciones se hicieron a 30ºC.

Para verificar que estos supuestos integrantes independientes habían perdido los plásmidos como moléculas libres y que tenían Tn917 insertado en el cromosoma, se realizó una hibridación de Southern en ADN de los 12 clones de MG1614 Em^{r} independientes inicialmente transformados con pTV32 y subcultivados dos veces en medio líquido que se selecciona por Em^{r}. A partir de los aislados, se extrajo el contenido total de ADN de 100 ml de cultivos recogiendo las células por centrifugación a 7000 rpm durante 10 minutos. Las células se lavaron en tampón TE (Tris clorhidrato 10 mM, EDTA 1 mM pH 7,5) y se recogieron. Los sedimentos se congelaron a -20ºC y posteriormente se disolvieron en 3 ml de tampón STET (sacarosa al 8% p/v, Triton X-100 al 5% v/v, EDTA 50 mM [pH 8,0], Tris clorhidrato 50 mM [pH 8,0]). Se añadieron 750 \mul de lisozima (10 mg/ml) y la solución se incubó a 37ºC durante 1 hora. Se añadieron 750 \mul de SDS al 10% y la incubación continuó a 37ºC durante 1/2 hora seguido de incubación a 65ºC durante 1/2 hora. Se añadieron dos ml de tampón TE y la solución acuosa se extrajo tres veces con 5 ml de fenol:cloroformo (1:1). A la suspensión se le añadieron 1/10 volúmenes de NaCl 5 M y 1 volumen de isopropanol. La solución se mezcló muy cuidadosamente hasta que el ADN precipitó en forma de largos hilos blancos. El ADN se enrolló en una aguja de inoculación y se transfirió a tubos Eppendorf y se lavó 3 veces en etanol al 70%. El ADN se disolvió en 500 \mul de tampón TE.

Se digirió 1 \mug del ADN preparado de este modo de cada aislado con EcoRI y se separó por electroforesis a través de geles de agarosa al 1,0%, se transfirió a membranas Hybond-N (Amersham, UK) y se sometió a hibridación usando sondas de ADN marcadas con ^{32}P, concretamente, pLTV1 y un fragmento EcoRI de 4 kb de pLTV1 que contiene el replicón pE194. El fragmento de 4 kb se aisló de los geles de agarosa por electroelución en bolsas de diálisis. Las sondas se tradujeron con traducción de mella con [\alpha-^{32}P] dCTP (Amersham, UK). La digestión de enzimas de restricción, la electroforesis, la transferencia de ADN, las traducciones de mella y las hibridaciones se hicieron como se describe por Maniatis y col. (referencia 34).

Los clones integrantes hibridados con la el pLTV1 marcado con ^{32}P y/o la sonda específica del replicón pTV se ilustran en la Figura 3. pTV32 es de 15,6 kb y tiene un único sitio EcoRI que se localiza en la parte de replicón del plásmido. La parte Tn917 de pTV32 es de 8 kb. Se detectó una única señal en 8 de los 12 integrantes de TV32 con pLTV1 como sonda (Figura 3A) mientras que no se veía señal con la sonda específica del replicón pTV (Figura 3B). Estos 8 integrantes eran Em^{r} y Cm^{r} como podría esperarse si TV32 se hubiera transpuesto en el cromosoma y pTV32 se hubiera perdido. De los cuatro integrantes restantes (número 27, 33, 36 y 39) se detectaron dos señales con pLTV1 como sonda (Figura 3A). Las mismas dos bandas se hibridaron con la sonda específica del replicón y no se observó ninguna señal del tamaño esperado para pTV32 de replicación libre (Figura 3B). Por consiguiente, estas tres cuatro cepas tenían ADN de la parte del replicón de pTV32 integrado en el cromosoma junto con el transposón Tv32. En cada uno de los cuatro integrantes, el ADN de la parte del replicón incluía el gen cat, ya que los cuatro eran Cm^{r}.

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Ejemplo 3 Demostración de la cuasi-aleatoriedad de la inserción de Tn917 en el cromosoma de MG1614 de Lactococcus lactis ssp. lactis

Para usar Tn917 como una herramienta de mutagénesis eficaz en Lactococcus lactis ssp. lactis, las inserciones del transposón deben ser aleatorias. Se realizó un análisis de aleatoriedad de transposición por determinación de la localización física de TV32 en fragmentos SmaI cromosómicos de 61 integrantes de TV32 de MG1614 independientes que se prepararon de acuerdo con el procedimiento como se describe en el Ejemplo 2. La preparación y la digestión con la enzima de restricción SmaI in situ del ADN genómico se hizo como se describe por Tanskanen y col. (referencia 52). De estos integrantes, 10 expresaron \beta-galactosidasa como se muestra cultivándolos en placas en agar GM suplementado con 160 \mug/ml de X-gal.

Los fragmentos de restricción de SmaI se separaron por electroforesis en gel de campo pulsátil (PFGE) usando un aparato modelo CHEF-DR II (Bio Rad Laboratorios, Richmond, California). Los geles eran geles de agarosa al 1,5% en 0,5 x TBE (1 x TBE en ácido bórico 89 mM, EDTA 2 mM y Tris borato 89 mM [pH 8,3]). Los parámetros de electroforesis fueron como los siguientes: 175 v durante 20 horas a 14ºC con tiempos de pulso en rampa durante 1 a 70 segundos. Los geles se tiñeron con una solución de bromuro de etidio (1 mg/ml) en 0,5 x TBE durante 30 minutos, se destiñeron durante 4 horas en 0,5 x TBE y se fotografiaron usando un transiluminador UV.

El cromosoma de MG1614 digerido con SmaI generó los siguientes diez fragmentos mayores de 45 kb (Figura 3, calle 3): 600, 310, 280, 200, 175, 175, 140, 120, 105 y 65 kb. TV32 contiene un único sitio SmaI. Por lo tanto, la inserción de TV32 en cualquiera de los diez fragmentos SmaI fue detectable en geles de electroforesis en gel de campo pulsátil (PFGE) salvo que la inserción se localizara muy cerca del extremo del fragmento.

Las localizaciones de TV32 en los fragmentos SmaI de los 61 integrantes se dan en la Tabla 1.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

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1

TABLA 1 (continuación)

2

TABLA 1 (continuación)

3

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En función de la localización física de TV32 en los fragmentos SmaI, los 61 integrantes podrían dividirse en 38 grupos. La Figura 4 muestra la PFGE de integrantes que representan cada grupos indicados en la Tabla 1. Un grupo (Nº 30) contenía cuatro integrantes, cinco grupos (Nº 3, 8, 10, 16 y 29) contenían tres integrantes y diez grupos (Nº 2, 4, 6, 9, 12, 15, 18, 120, 28 y 33) contenían dos integrantes. Sin embrago, los miembros del mismo grupo integrante no llevan necesariamente el TV32 en la misma posición en el fragmento. Las inserciones localizadas de manera simétrica en un fragmento son indistinguibles en geles de PFGE y el límite de resolución varía de dos a diez kb dependiendo de la longitud del fragmento.

TV32 (Tabla 1 y Figura 4) había dirigido todos los fragmentos SmaI cromosómicos de 600, 310, 200, 175, 140 y 120 kb. Aparentemente ninguno de los integrantes llevaba inserciones en los fragmentos de 280, 105 y 65 kb. Sin embargo, podría no establecerse a partir de los datos de PFGE si el TV32 en el integrante 46 estaba en el extremo de un fragmento mayor de 45 kb o en cualquier posición en un fragmento menor de 65 kb en tamaño. El integrante 19 contenía una inserción doble (Figura 4). Los fragmentos de 200 kb y 600 kb llevaban dos copias de TV32, respectivamente. Estas inserciones dobles hacen un número total de eventos de inserción en este estudio de 62.

Las 62 inserciones de TV32 en el cromosoma de Lactococcus lactis ssp. lactis no estaban distribuidos uniformemente a lo largo del cromosoma. Esto se reveló por un análisis de ji al cuadrado por lo cual se ensayó si la probabilidad de inserción en un fragmento SmaI sólo dependía de la longitud del fragmento (Tabla 2).

La Tabla 2 da el número de integrantes obtenidos en cada fragmento, junto con el número esperado de integrantes suponiendo que la probabilidad de integración en un fragmento dependa sólo de la longitud del fragmento. Para ensayar esta suposición se usó un ensayo de ji al cuadrado. El ensayo de ji al cuadrado demostró (P < 0,005) que las inserciones obtenidas no estaban distribuidas absolutamente de manera aleatoria en el cromosoma. La principal contribución a esta falta de desigualdad vino de una sobrerrepresentación de 2,5 veces de inserciones en el fragmento de 60 kb y una ausencia de inserciones en el fragmento de 280 kb. Las 37 inserciones en el fragmento de 600 kb se localizaron en al menos 21 posiciones diferentes con no más de 3 inserciones en la misma posición. Estos resultados indican que la sobrerrepresentación anterior no puede deberse a un único punto caliente dominante. El fragmento de 280 kb no es totalmente refractario a inserciones de TV32, ya que tales integrantes se obtuvieron en experimentos paralelos. Por consiguiente, en el presente contexto el patrón de distribución de inserciones de TV32 como el obtenido en la cepa MG1614 de Lactococcus lactis ssp. lactis se denomina "cuasi-aleatorio".

Los siguientes factores pueden haber contribuido a la distribución no uniforme observada de las inserciones: (1) los fragmentos cerca del origen de replicación cromosómico tienen mayor número de copias que los fragmentos cerca del extremo; (2) los genes esenciales pueden haberse distribuido de manera no uniforme; y (3) Tn917 puede llegar a insertarse de manera preferente en regiones con características particulares.

TABLA 2

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4

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A pesar de la distribución algo desigual de las inserciones de TV32 en el cromosoma de MG1614 de Lactococcus lactis ssp. lactis, se concluyó que los derivados de Tn917 eran herramientas muy útiles para el análisis genético de bacterias ácido lácticas, ya que, en experimentos adicionales, también se descubrió en experimentos adicionales que un gran número de sitios de inserción, además de los mencionados anteriormente, no podían encontrarse con estos derivados de transposón.

El clon de MG1614 de Lactococcus lactis ssp. lactis anterior denominado 63b se depositó el 21 de diciembre de 1992 en el documento DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Cellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania, con el número de acceso DSM 7361.

Ejemplo 4 Producción de un grupo de inserciones de Tn917 en Lactococcus lactis

Para preparar un grupo de inserciones de Tn917 en Lactococcus lactis, se siguió el siguiente procedimiento:

Se inoculó una única colonia de una cepa MG1614 de Lactococcus lactis ssp. lactis que contenía pTV32 en medio GM17 y se cultivó durante 8 a 10 generaciones con selección por Cm^{r}. El uno por ciento de estas células se cultivó durante 8 a 10 generaciones en medio GM17 con selección por Em^{r}. La temperatura se mantuvo a 30ºC. Las células resultantes se cultivaron en placas de agar GM17 con selección por Em^{r}. Se cogieron 19 colonias aleatoriamente y la preparación y la digestión de ADN genómico in situ en bloques de agarosa se hicieron como se ha descrito en el Ejemplo 3. La Figura 5 y la tabla 3 muestran que 12 de 18 clones (la digestión de un clon dio lugar a fragmentos que podrían visualizarse como bandas separadas) tenían el transposón insertado en la misma localización en el cromosoma, indicando que el cultivo estaba dominado por un único integrante.

TABLA 3

6

Para evitar un integrante dominante en un cultivo, se seleccionó el siguiente procedimiento:

La cepa MG1614 se transformó con pTV32 como se ha descrito en el Ejemplo 1. Las células transformadas se cultivaron en placas de agar SGM17 que contenían 1 \mug/ml de eritromicina. Después de una incubación a 30ºC durante 48 horas, 20 placas, cada una con 100 colonias, se cultivaron en réplica en placas de agar GM17 con selección por Em^{r}. Las placas replicadas se incubaron a 30ºC durante 30 horas. La etapa de replicación se repitió y las colonias se retiraron por lavado y se reunieron. Del cultivo reunido, se seleccionaron aleatoriamente 18 integrantes y se analizaron por PFGE como se ha definido anteriormente. En función de la localización de las inserciones de bTn917 en los fragmentos cromosómicos SmaI, los 18 integrantes se dividieron en 13 grupos de los que ninguno contenía más de 2 inserciones (Figura 6 y tabla 4). Por lo tanto, se concluyó que el cultivo reunido contenía un grupo de inserciones de TV32 de transposón cuasi-aleatorias en la cepa MG1614.

TABLA 4

7

Se añadió glicerol estéril al cultivo reunido a una concentración de hasta el 25% y esta mezcla se almacenó a -80ºC.

Se preparó un cultivo reunido que contenía un grupo de inserciones de LTV1 cuasi-aleatorias en MG1363 de Lactococcus lactis ssp. lactis esencialmente como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, antes del retirar por lavado y de reunir las colonias, se realizó lo siguiente:

Se añadieron 320 \mug/ml de X-gal a las placas usadas para la segunda replicación. Se vieron 242 colonias con diversas intensidades de azul en la segunda placa de replicación. En contraste, menos del 5% de estas colonias eran azules en placas de agar GM17 que contenían 40 \mug/ml de X-gal incubado durante más de 48 horas. (40 \mug/ml de X-gal es la concentración convencional para la identificación de la expresión de lacZ en E. coli). Cada una de las 242 colonias azules que aparecieron en la placa que contenía 320 \mug/ml de X-gal se volvieron a sembrar en estrías para obtener colonias únicas en GM17 que contenía 1 \mug/ml de eritromicina y 320 \mug/ml de X-gal seguido de otra siembra en estrías en el mismo medio. Se inoculó una colonia única de cada uno de estos subcultivos en medio GM17 líquido suplementado con 1 \mug/ml de eritromicina, se incubó durante una noche a 30ºC y se añadió glicerol estéril a una concentración del 25% a cada uno de estos subcultivos para almacenarlos a -80ºC. Estos 242 clones se mencionadas a continuación como grupo de fusión del promotor Nº 1 (PFC-1).

Se depositó uno de los clones PFC-1 en MG1363 de Lactococcus lactis ssp. lactis con la denominación P139-170 en el documento DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Cellkulturen GMBH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania el 21 de diciembre de 1992 con el número de acceso DSM 7360.

Ejemplo 5 Identificación y clonación de promotores regulables del cromosoma de Lactococcus lactis ssp. lactis

El grupo de inserciones de Tn917 cuasi-aleatorias en el cromosoma de MG1363 de Lactococcus lactis ssp. lactis preparado como se ha descrito en el Ejemplo 4 (PFC-1) se usó en este experimento que se diseñó como una selección de la presencia de promotores regulables en estos fragmentos.

Expresión de lacZ regulada por temperatura/fase de cultivo

Cada clon de PFC-1 se sembró en estrías en un lote duplicado de placas GM17 que contenían 1 \mug/ml de eritromicina y 320 \mug/ml de X-gal. El patrón de estrías se muestra en la Figura 7. En un lote de placas, los clones se sembraron en estrías y se incubaron a 15ºC el día 1. En el segundo lote de placas, los clones se sembraron en estrías y se incubaron a 30ºC el día 4. El día 5 se examinaron ambos lotes de placas. Se observaron tres tipos principales de expresión de lacZ para los clones PFC-1:

(i)

El tipo 1T que muestra alta expresión de lacZ (estría azul oscuro) a 30ºC y baja o ninguna expresión de lacZ (estría azul claro o blanca) a 15ºC.

(ii)

El tipo 2T que muestra un nivel similar de expresión de lacZ en las dos temperaturas.

(iii)

El tipo 3T que muestra baja o ninguna expresión de lacZ a 30ºC y alta expresión de lacZ a 15ºC.

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De un total de 242 de clones ensayados, 23 fueron del tipo 1T, 215 del tipo 2T y 4 clones fueron del tipo 3T. Debido al prolongado período de crecimiento a 15ºC, no es posible determinar si la expresión regulada de lacZ es una función de la fase /velocidad de cultivo y/o de la temperatura.

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Expresión de lacZ regulada por arginina/pH

Cada clon de PFC-1 se sembró en estrías en un lote de placas M17 que contenían glucosa al 0.1%, arginina al 0,5%, 1 \mug/ml de eritromicina y 320 \mug/ml de X-gal y en un lote de placas GM17 que contenía 1 \mug/ml de eritromicina y 320 \mug/ml de X-gal usando el mismo patrón de estrías descrito anteriormente. Ambos lotes de placas se incubaron a 30ºC durante aproximadamente 30 horas. Se observaron tres tipos principales de expresión de lacZ en las placas incubadas:

(i)

El tipo 1A que muestra alta expresión de lacZ en placas sin suplementar con arginina y baja o ninguna expresión de lacZ en placas suplementadas con arginina.

(ii)

El tipo 2A que muestra expresión de lacZ similar sin tener en cuenta la suplementación con arginina.

(iii)

El tipo 3A que muestra baja o ninguna expresión de lacZ en placas sin arginina y alta expresión de lacZ en las placas suplementadas con arginina.

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De los 242 clones ensayados, 21 eran del tipo 1A, 219 eran del tipo 2A y 2 clones del tipo 3A. El pH de GM17 estéril es aproximadamente 6,8. El pH en medio GM17 inoculado con Lactococcus lactis ssp. lactis e incubado durante una noche es aproximadamente 5,0. Sin embargo, el pH en M17 suplementado con glucosa al 0,1% y arginina al 0,5% inoculado con Lactococcus lactis ssp. lactis y cultivado durante una noche supera los 9,0. Por consiguiente, la expresión de lacZ regulada observada es una función de la concentración de arginina y/o el pH en el medio.

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Regulación de NaCl/resistencia iónica de la expresión de lacZ

Cada clon del grupo PFC-1 se sembró en estrías en un lote de placas GM17 suplementadas con 1 \mug/ml de eritromicina, 320 \mug/ml de X-gal y 2% de NaCl y en un lote de placas con el mismo medio pero sin NaCl usando el mismo patrón de estrías definido anteriormente. Ambos lotes de placas se incubaron a 30ºC durante aproximadamente 30 horas. Se observaron dos tipos principales de expresión de lacZ:

(i)

El tipo 1S que muestra alta expresión de lacZ en placas sin NaCl y baja o ninguna expresión de lacZ en placas suplementadas con NaCl.

(ii)

El tipo 2S que muestra expresión de lacZ similar en ambos tipos de placas.

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De los 242 clones ensayados, 87 eran del tipo 1S y 155 del tipo 2S.

Cuando se ha demostrado que un clon de PFC-1 tiene expresión de lacZ regulable, se define un punto de inserción o un intervalo en el cromosoma de Lactococcus lactis ssp. lactis donde un gen insertado estará expresado de manera regulable en Lactococcus. Por ejemplo, el clon denominado P139-170 de PFC-1 es del tipo 3T, tipo 1A y tipo 2S que indica que el gen lacZ se encuentra en una posición donde la expresión de un gen insertado se suprime parcial o totalmente a 30ºC y en placas M17 suplementadas con arginina. Sin embargo, la expresión génica en esta posición es alta a 15ºC en placas GM17. El nivel de expresión génica en placas GM17 no está afectado por la concentración ensayada de NaCl.

Investigación fisiológica de la expresión regulable de lacZ del clon P139-170

Se demostró que P139-170 era del tipo 1A. El siguiente preexperimento se realizó para estudiar la dependencia de la expresión de lacZ al pH en este clon:

Se ajustaron seis fermentadores, conteniendo cada uno 1 litro de medio GM17 suplementado con 1 \mug/ml de eritromicina, para funcionar a 30ºC. Los fermentadores se ajustaron por duplicado para funcionar a pH 5,5, 6,5 y 7,5, usando respectivamente ácido sulfúrico 5 M o hidróxido sódico 5 M. Uno de los fermentadores duplicados se inoculó con cultivo de H25A al 1% durante una noche (cepa MG1614 que contiene una inserción de LTV1 en el cromosoma y puede expresar \beta-galactosidasa en agar GM17 independientemente de la arginina o NaCl añadido) y los otros fermentadores duplicados se inocularon con un 1% de un cultivo de P139-170 durante una noche.

El crecimiento de los clones en los fermentadores se siguió midiendo DO_{600} y cultivando en placas GM17 +/- 1 \mug/ml de eritromicina. La curva de crecimiento [log (DO_{600}) frente a tiempo] era casi similar para los clones en los seis fermentadores. A una DO_{600} de 2,0, se concentraron 10 veces 40 ml de cultivo de cada fermentador y se trataron dos veces en una prensa French. Las soluciones lisadas se sometieron al procedimiento de medición de la actividad de \beta-galactosidasa como se describe por Miller, 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. Desafortunadamente, falló un procedimiento para almacenar las soluciones sin pérdida de la actividad de \beta-galactosidasa. Por lo tanto, sólo estuvieron disponibles los resultados de las inspecciones visuales del desarrollo de color en la medición de la actividad de \beta-galactosidasa:

8

En función de este experimento se concluyó que la expresión de lacZ en P139-170 era una función de pH en el medio de cultivo. Sin embargo, no se puede excluir que el contenido de arginina en el medio también pueda tener un efecto regulador en la función del promotor.

De los clones PCF-1 integrantes seleccionados, donde se identificó la expresión de \beta-galactosidasa, se clonó el ADN adyacente al extremo proximal de erm (o lacZ), usando el siguiente procedimiento:

El ADN total se extrajo de un clon de acuerdo con el procedimiento definido en el Ejemplo 2. Se digirió aproximadamente 1 \mug de ADN con 50 unidades de EcoRI y se incubó durante dos horas a 37ºC. Se realizó una extracción y ligación con fenol y cloroformo en 200 \mul de tampón de ligación que contenía 50 unidades de ligasa como se describe por Maniatis (referencia 34). El ADN se precipitó añadiendo tres volúmenes de etanol enfriado con hielo y 1 /10 volúmenes de acetato sódico, seguido por centrifugación a 10,000 x g durante 30 minutos. El ADN se resuspendió en 20 \mul de TE (EDTA 1 mM, Tris clorhidrato 10 mM [pH 8,0]). Se usaron 10 \mul de solución de ADN ligado para la transformación con CaCl_{2}, como se describe en la referencia 17, de DH5\alpha de E. coli (F-, endA1, hsdR17 (r_{k}-, m_{k}+), supE44, thi-1, lac\DeltaU169, recA1, gyrA96, relA1, \Phi80 dlacZ\DeltaM15). Se obtuvieron aproximadamente 1,5 x 10^{3} transformantes por \mug de ADN.

Ejemplo 6 La construcción de un vector de sonda de promotor para bacterias ácido lácticas

Una herramienta útil para analizar las condiciones que activan un gen y para medir el nivel de expresión es una sonda de promotor. Para Lactococcus, pGKV210, se ha construido un vector de sonda de promotor basado en cloranfenicol acetil transferasa y dirigido por el replicón pWVO1 (van der Vossen y col., 1985). Desafortunadamente, este vector sólo proporciona una resistencia a cloranfenicol ligeramente mejorada cuando los promotores se clonan en éste (van der Vossen y col., 1987). La traducción del ARNm que contiene el gen cat-86 se activa por cloranfenicol (Alexieva y col., 1988) de modo que el nivel enzimático medido depende de dos factores, la resistencia del promotor y la eficacia de activación. Además, el replicón pWVO1 se replica por replicación de círculo rodante, y, por lo tanto, es susceptible a la inestabilidad segregacional (Kiewiet y col. 1993).

Se construyó un vector de sonda de promotor para Lactococcus y supuestamente otras bacterias ácido lácticas en función de los genes de \beta-galactosidasa de Leuconostoc mesenteroides subespecie cremoris, el replicón plasmídico de citrato de Lactococcus lactis subespecie lactis biovariedad diacetylactis y un marcador de resistencia a eritromicina. Este vector se denomina pAK80. La clonación del promotor para el grupo de ARNt adyacente al gen tma de CHCC285 demostró que este vector funciona. La construcción resultante, pAK90, produce niveles extremadamente altos de \beta-galactosidasa en MG1363.

Los genes de \beta-galactosidasa de Leuconostos mesenteroides subespecie cremoris se clonaron y se descubrió que son casi idénticos al gen de \beta-galactosidasa de Leuconostoc lactis (David y col., 1992). Ambos genes han demostrado expresarse en Escherichia coli y en la cepa MG1363 de Lactococcus lactis. El promotor del gen de \beta-galactosidasa se eliminó por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se reemplazó con un poliengarce, permitiendo la clonación de diversos fragmentos de ADN y el ensayo de la actividad promotora. Esta construcción se clonó en un vector lanzadera que contenía el replicón plasmídico de citrato de Lactococcus lactis subespecie lactis biovariedad diacetylactis, el replicón pACYC184 para E. coli y un marcador de selección (resistencia a eritromicina) para ambos organismos. La clonación de un promotor de ARNt en el poliengarce dio altos niveles de \beta-galactosidasa en MG1363, a condición de que el vector funcione como se planea.

A. Materiales y procedimientos 1. Cepas bacterianas, plásmidos y medios

MG1363 que es una cepa de Lactococcus lactis sin plásmido (Gasson, 1983). Se usó para clonación DH5\alpha de E. coli [supE44 lacAU169 hsdR17 recAI endAI gyrA96 thi-1 relAI \Phi80 lacZ\DeltaM15] (Hanahan, 1983).

Los vectores de clonación y los marcadores relevantes que se usaron fueron: pVA891 [resistencia a eritromicina; Em^{R}] (Macrina y col., 1983), y pIC19H [resistencia a ampicilina; Amp^{R}] (Marsh y col., 1983). Los diversos plásmidos construidos durante la construcción del vector de sonda de promotor se describen más adelante.

Se cultivaron cepas de Lactococcus a 30ºC en medio GM17. Se cultivaron cepas de E. coli en medio LB a 37ºC. Se usaron antibióticos en las siguientes concentraciones: para E. coli; eritromicina, 250 \mug/ml; y ampicilina, 50 \mug/ml; para Lactococcus; eritromicina, 1 \mug/ml.

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2. Preparaciones y transformaciones plasmídicas

Se preparó ADN plasmídico para secuenciación y electroporaciones con el kit de plásmido Qiagen (Diagen, Dusseldorf, Alemania).

Se hicieron preparaciones plasmídicas a pequeña escala a partir de Lactococcus de acuerdo esencialmente con Israelsen y col. 1993.

Los plásmidos se introdujeron en MG1363 por electroporación de células competentes cultivadas en glicina de acuerdo esencialmente con Holo y Nes, 1989.

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3. Ensayos de \beta-galactosidasa

La actividad promotora se determinó realizando ensayos de \beta-galactosidasa en cultivos durante una noche cultivados en medio G1.5M17. Se centrifugó 1 ml de cultivo a 10.000 x g durante 10 minutos. El sedimento se resuspendió en 500 \mul de tampón Z (Miller, 1972). Se mezclaron 100 \mul de suspensión celular con 400 \mul de tampón Z, 12,5 \mul de SDS al 0,1% y 25 \mul de CHCl3 en un mezclador Vortex durante 10 segundos. Después de la mezcla en Vortex, la suspensión se trató como se describe en el Ejemplo 7. Los resultados se muestran en la Tabla 7.

Los resultados de ensayo se dan como unidades Miller. Una unidad Miller = (1000 x A_{420}) / (tiempo x volumen x A_{600}) (donde el tiempo está en minutos y el volumen en ml).

B. Construcción de pAK696

Se obtuvieron dos cebadores de PCR que permitieron la amplificación de toda la región de replicación del plásmido de citrato. Estos tuvieron las siguientes secuencias:

Cebador 1

5' TGAATTCAGAGGTTTGATGACTTTGACC 3'

Cebador 4

5' GGAATTCCTAACAAAAGACTATTAACGC 3'

El Cebador 1 corresponde a los nucleótidos 610-621 y el Cebador 4 es complementario a los nucleótidos 2340-2361 de la región de replicación del plásmido de citrato (Jahns y col., 1991). Ambos contienen sitios de EcoRI en su extremo 5' para facilitar la clonación. El producto de amplificación de 1,7 kb se clonó como un fragmento de EcoRI en pIC19H para producir pKR41. Después, este fragmento de EcoRI se introdujo en el sitio único para EcoRI de pVA891 para producir el vector lanzadera pAK66 que se replica en E. coli y MG1363 de L. lactis. La construcción de pKR41 se ha descrito en un manuscrito presentado para publicación (Pedersen y col., 1993).

C. Clonación del gen de \beta-galactosidasa de Leuconostoc mesenteroides subespecie cremoris

Durante el transcurso de la clonación y lde a secuenciación de IS1165 de la cepa DB1165 de Leuconostoc mesenteroides subespecie cremoris se obtuvo un clon llamado pSB1 (Johansen y Kibenish, 1992). Este clon contenía un inserto de 5,8 kb en el poliengarce de pIC19H. Normalmente, la clonación en pIC19H destruye la actividad de \beta-galactosidasa y las colonias con insertos son blancas en X-gal. pSB1 era extraño en el sentido de que daba colonias azules en X-gal. El análisis de secuencia de ADN reveló que el inserto en pSB1 contenía el gen de \beta-galactosidasa de Leuconostoc mesenteroides subespecie cremoris y que era casi idéntico al de Leuconostos lactis (David y col., 1992). Sólo se detectaron 3 diferencias en 830 pb secuenciadas.

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D. Construcción de pAK67.7

Esta construcción implicó el reemplazamiento del promotor de \beta-galactosidasa con un poliengarce y la inserción de codones finalizadores en las tres fases de lectura de avance y se ilustra en la Figura 8. El promotor se retiró por PCR usando dos cebadores:

lac-1

ATAGATCTGCAGGATCCCGG\underbar{GTAACTTTGAAAGGATATTCCTC}

lac-2

ATTGAGGGTATACGGTGGGCG

La parte subrayada de lac-1 es idéntica al inicio del gen de \beta-galactosidasa y contiene el sitio de unión a ribosoma. La secuencia que queda contiene diversos sitios de restricción incluyendo BglII. El cebador lac-2 se hibrida con el gen de \beta-galactosidasa, 20 pb cadena abajo del único sitio NcoI. La amplificación por PCR con estos cebadores se amplificará a partir del sitio de unión con el ribosoma hasta más allá del sitio NcoI y producirá un fragmento de 360 pb que contiene varios sitios de restricción en un extremo, un sitio NcoI en el otro extremo y sin promotor u otras secuencias reguladoras del gen de \beta-galactosidasa. Este fragmento de 360 pb se purificó, se digirió con BglIII y NcoI y se clonó en pSB1 digerido con BglIII/NcoI. El plásmido resultante se llamó pAK67 y tenía el siguiente poliengarce precediendo el gen de \beta-galactosidasa:

9

El análisis de secuencia de ADN reveló que este poliengarce estaba presente y que no se habían introducido alteraciones en el gen de \beta-galactosidasa por errores durante la PCR.

Como puede verse antes, hay dos fases de lectura abierta que atraviesan el poliengarce en el gen de \beta-galactosidasa. Como podrían interferir potencialmente con la expresión de \beta-galactosidasa a partir de promotores insertados en el poliengarce, se decidió introducir codones finalizadores en las tres fases de lectura de avance. Esto se hizo obteniendo dos oligonucleótidos con la siguiente secuencia:

Parada-1

GGGTCTAGATTA

Parada-2

TAATCTAGACCC

Estos oligonucleótidos son complementarios y se hibridarán para dar un trozo de 12 pb de ADN de doble cadena que contiene un sitio de restricción XbaI. Este pequeño fragmento se clonó en el sitio SmaI de pAK67. Estos oligonucleótidos se diseñaron de modo que el sitio SmaI pudiera retenerse, estaría presente un nuevo sitio XbaI en plásmidos con este pequeño inserto y se introducirían codones finalizadores en las dos fases de lectura abierta. La clonación se hizo digiriendo pAK67 con SmaI, tratando y ligando la fosfatasa con una mezcla de los dos oligonucleótidos que se habían tratado con quinasa y que permitían hibridarse entre sí. Los transformantes se purificaron y aquellos en los que el plásmido había ganado un sitio XbaI se analizaron adicionalmente. El análisis de secuencia de ADN reveló que un clon, pAK67.7 tenía la estructura deseada:

10

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E. Construcción de pAK80

La etapa final en la producción del vector de sonda de promotor fue la combinación del gen de \beta-galactosidasa manipulado con un replicón y un marcador de selección para Lactococcus. Esto se consiguió digiriendo pAK67.7 con HindIII y SalI y ligándolo en pAK66, también digerido con HindIII y SalI. Entre los plásmidos producidos, pAK80 fue el que era el vector de sonda de promotor exactamente como se diseñó en un principio.

El plásmido pAK80 que lleva MG1363 de Lactococcus lactis ssp. lactis se depositó con el documento DSM-Deutsche Sammlung von Mikrooganismen und Cellkulturen GMBH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania el 27 de agosto de 1993 con el número de acceso DSM 8496.

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F. Ensayo de pAK80 usando dos promotores regulables de ARNt

Se ha aislado un fragmento de ADN de Lactococcus lactis ssp. lactis adyacente al gen tma de CHCC285 y se ha descubierto que contiene un grupo de genes de ARNt precedido por una región promotora (Figuras 11 y 12) que comprende dos promotores potenciales (PI, nucleótidos 107-134; PII, nucleótidos 215-242). Los promotores PI y PII, contenidos en un fragmento HindIII-ScaI de 501 pb aislado a partir del clon pLN39, se clonaron insertándolos en pAK80 digerido con HidIII y SmaI, delante del gen de \beta-galactosidasa de Leuconostoc mesenteroides subespecie cremoris sin promotor. Después de la ligación, MG1363 se sometió a electroporación y las células se cultivaron en placas en medio de regeneración (Holo y Nes, 1989) que contenía eritromicina y X-gal. Se obtuvo un total de siete colonias azules. El análisis plasmídico reveló que las siete tenían plásmidos idénticos y que cada una contenía la inserción deseada en pAK80. Se aisló un plásmido y se denominó pAK90. Los ensayos de \beta-galactosidasa revelaron que MG1363/pAK90 produjo 5000 unidades Miller de enzima, mientras que MG1363/pAK80 produjo 1 unidad Miller. De este modo, la región que precede los genes de ARNt contienen un promotor muy fuerte.

La búsqueda de secuencias con similitud a la secuencia de la región promotora anterior (Figura 13) reveló una secuencia consenso de promotores que precedían a operones de ARNr y operones de ARNt de la especie Lactococcus incluyendo una secuencia conservada no descrita previamente (motivo), AGTT. Esta secuencia termina 5 pb cadena arriba de la región - 35 y no está conservada en promotores de ARNt y ARNr de Escherichia coli o Bacillus subtilis. En todas las especies de Lactococcus donde se descubrió que el motivo AGTT precedía a los promotores potenciales de ARNr o ARNt, estos promotores se habían aislado todos a partir de plásmidos donde los promotores estaban insertados delante del gen cat-86 que codifica cloranfenicol acetiltransferasa. Como esta enzima se expresa pobremente en Lactococcus lactis, la resistencia a cloranfenicol sólo se puede obtener en este organismo clonando promotores fuertes delante del gen cat-86. Por lo tanto, parece que el motivo AGTT sólo se encuentra en promotores fuertes de Lactococcus lactis.

Los anteriores promotores PI y PII contienen ambos secuencias conservadas supuestamente implicadas en control estricto (Figura 13) y por consiguiente, estos promotores parece que son promotores regulables.

Se insertó un fragmento HindIII-EcoRI de 1,0 kb de pLN39 en el plásmido pCI3340 digerido con HindIII y EcoRI, y el plásmido resultante pLN40 se introdujo en MG1363 de Lactococcus lactis. pLN40/MG1363 se depositó con el documento DSM-Deutsche Sammlung von Mokroorganismen und Cellkulturen GMBH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania el 22 de diciembre de 1993 con el número de acceso DSM 8858.

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G. Conclusiones

Este Ejemplo describe la construcción de un nuevo vector de sonda de promotor para Lactococcus y supuestamente otras bacterias ácido lácticas. Este vector tiene varias ventajas sobre vectores descritos previamente. Se basa en el replicón plasmídico de citrato de Lactococcus lactis ssp. lactis biovariedad diacetylactis, un plásmido theta replicante, y de este modo es más estable. El gen informador elegido no se somete a control post-transcripcional, de modo que los niveles enzimáticos pueden medirse sin la presencia de ningún inductor. Esto está en contraste con los plásmidos basados en el gen cat-86 donde el cloranfenicol realmente activa la traducción del ARNm (Alexieva y col., 1988). Los ensayos enzimáticos y los ensayos de placa para el gen informador son procedimientos sencillos y convencionales en la mayoría de los laboratorios.

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Ejemplo 7 Mediciones de la expresión de \beta-galactosidas en integrantes PFC-1 cultivados en medio líquido en condiciones controladas

Normalmente, los clones de PFC-1 en MG1363 de Lactococcus lactis ssp. lactis (integrantes LTV1) como se definen en el Ejemplo 4 se denominan P139- seguido de un número de indicación, por ejemplo, P139-170. Sin embargo, a continuación los integrantes PFC-1 se denominan sólo por su número, por ejemplo, 170. En este estudio también se incluye el integrante LTV1 en MG1614 de Lactococcus lactis ssp. lactis, mencionado en el Ejemplo 5 con la denominación H25A. Sin embargo, a continuación, este integrante se denominado SB.

El siguiente experimento se realizó con el propósito de estudiar la dependencia al pH de la expresión de lacZ de los dos integrantes 170 y SB.

Se demostró que el integrante 170 era del tipo 1A mientras que el integrante SB aparentemente no pertenecía a este grupo. Ambos integrantes son del tipo 2S que significa que la expresión de \beta-galactosidasa en placas GM17 no se ve afectada por NaCl al 2%.

Se ajustaron cuatro fermentadores que contenían cada uno 1 litro de medio G1.5M17, es decir, 1,5 x caldo M17 (Sigma Chemical Co.) que contenía glucosa al 0,5% y suplementado con 1 mg/l de eritromicina, para funcionar a 30ºC. La agitación se mantuvo a 150 rpm sin suministro activo de aire/O_{2}. Los fermentadores se ajustaron por duplicado para funcionar a pH 5,2 y 7,0, respectivamente usando clorhidrato 5 M e hidróxido sódico 5 M. Uno de los duplicados del fermentador se inoculó con un 1% de un cultivo de integrante SB durante una noche y el otro duplicado se inoculó con un 1% de un cultivo de integrante 170 durante una noche.

Las fermentaciones tuvieron lugar durante 45 horas y el cultivo se siguió por la medición de DO_{600}. A valores de DO_{600} seleccionados e intervalos de tiempo, se midió la actividad de \beta-galactosidasa como se explica a continuación: se centrifugaron alícuotas de 10 ml de cada fermentador a 10.000 x g a 4ºC durante 5 minutos. El sedimento se resuspendió en 1 ml de tampón Z (Miller, 1972) y 0,4 ml de la suspensión bacteriana y se mezclaron 0,1 ml de tampón Z con 12,5 \mul de SDS al 0,1% y 25 \mul de CHCl_{3} por medio de un mezclador Vortex durante 10 segundos. La suspensión agitada vorticialmente se colocó en un baño de agua a 30ºC durante 5 minutos y se añadieron 100 \mul de una solución que contenía 4 mg/ml de o-nitrofenil-\beta-D-galactopiranósido (ONPG) en medio A (Miller, 1972). La suspensión se agitó vorticialmente durante 2 segundos y se colocó en un baño de agua a 30ºC.

Se tomó nota del tiempo en la adición de ONPG y otra vez cuando se interrumpió la reacción enzimática por la adición de 250 \mul de Na_{2}CO_{3} seguido de la mezcla con Vortex y de la colocación de la suspensión en hielo. Después de centrifugación a 10.000 x g a 4ºC durante diez minutos, se midieron la DO_{420} y DO_{550} del sobrenadante. Si los valores de DO_{550} superaban 0,050, la suspensión se volvió a centrifugar y se midieron la DO_{420} y DO_{550} de este sobrenadante. La actividad de \beta-galactosidasa se calculó usando la siguiente fórmula:

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En la Fig. 9 la DO_{600} y la actividad de \beta-galactosidasa frente al tiempo se muestran para el integrante 170 a pH 5,2 y pH 7,0. En la Fig. 10 se muestran los datos correspondientes para el integrante SB. Se demuestra claramente por los datos en estas dos figuras que la expresión de \beta-galactosidasa de los integrantes 170 y SB está regulada de manera contraria por el pH. El integrante 170 desactiva la expresión de \beta-galactosidasa a pH 7,0. En ambos integrantes, la expresión de \beta-galactosidasa también está influida por la fase de cultivo. Este experimento no excluye que la concentración de arginina en el medio también pueda tener un efecto regulador en la expresión de \beta-galactosidasa en los dos integrantes estudiados.

Ejemplo 8 Clonación de fragmentos de ADN que contienen un promotor de bacterias ácido lácticas y evaluación de la actividad promotora en Lactococcus lactis A. Clonación en E. coli de fragmentos EcoRI que contienen ADN de Lactococcus lactis y el replicón ColE1 de integrantes Tn917-LTV1

Se prepararon fragmentos EcoRI cromosómicos que contenían ADN de lactococcus, lacZ, cat, bla y el replicón ColE1, de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 5 a partir de los integrantes Tn917-LTV1 indicados en la Tabla 5 que se muestra más adelante. Los fragmentos se religaron posteriormente y se introdujeron en DH5\alpha de E. coli por transformación como se describe en Maniatis 1982.

Los plásmidos del fragmento integrante Tn917-LTV1 se denominaron p[Nº integrante], por ejemplo, p86, p143 y pSB. Todos los integrantes Tn917-LTV1 de los que se aislaron los fragmentos están en MG1363 de Lactococcus lactis excepto SB que es Tn917-LTV1 en MG1614 de Lactococcus lactis.

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TABLA 5

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B. Subclonación de plásmidos de fragmentos integrantes de Tn917-LTV1 en el vector de selección de promotor pGKV210

pGKV210 es un vector de selección de promotor que contiene un gen erm como marcador de selección y un gen cat-86 sin promotor precedido por un poliengarce (van der Vpssen y col, 1987). El gen cat-86 se expresa si el fragmento de ADN que lleva un promotor se inserta en la orientación adecuada en el poliengarce. El nivel de resistencia a cloranfenicol conferido al huésped depende de la resistencia del promotor.

Todos los plásmidos de fragmentos integrantes tienen un sitio ClaI localizado en el ADN que se origina a partir de la parte lacZ de Tn917-LTV1. Para clonar los fragmentos EcoRI-ClaI de los plásmidos, se introdujo primero un sitio CLAI en el poliengarce de pGKV210 del siguiente modo: El engarce de ADN sintético

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5' GATCGCCATCGATGGC 3'

3' CGGTAGCTACCGCTAG 5'

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que contiene un sitio CLAI se clonó en el único sitio BamHI de pGKV210 como se describe por Maniatis, 1982. El plásmido obtenido se denominó pGKV210 (CLAI). Se mezclaron 50 ng de pGKV210 (CLAI) digeridos con ClaI y EcoRI y se ligaron con 200 ng de fragmento ClaI-EcoRI purificado como se ha definido anteriormente. Esto se hizo con los fragmentos ClaI-EcoRI de los siguientes plásmidos de fragmentos integrantes: p143, p162, p163, p170, p172, p224, p237, p242 y pSB.

p162 contiene un sitio ClaI adicional localizado en el ADN de lactococcus. El fragmento desde el sitio EcoRI de este plásmido al sitio ClaI adicional se insertó en pGKV210 (ClaI). Todo el trabajo de recombinación de ADN en este Ejemplo se realizó de acuerdo con Maniatis, 1982.

Las construcciones derivadas de pGKV210 resultantes se denominaron pGKV210: [Nº integrante], por ejemplo, pGKV210: 143, pGKV210: 162 y pGKV210: SB. Los derivados de pGKV210 se introdujeron en MC1000 de E. coli (F-, araD139 (\Deltaara-leu)7679, galU, galK(\Deltalac)X74, rpsL(Strr), thi) de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 5. Los derivados de pGKV210 se extrajeron como se describe en Maniatis, 1982 de la cepa huésped transformada. Por cada derivado de pGKV extraído, se introdujo 1 \mug de ADN en MG1363 de Lactococcus lactis de acuerdo con el procedimiento que se describe en el Ejemplo 1. Los transformantes resultantes (derivados de pGKV/MG1363) se denominaron pGKV210: [Nº integrante]/MG1363, por ejemplo, pGKV210: 143/MG1363.

Se determinó la actividad promotora de los fragmentos clonados anteriormente y de los derivados de pGKV210 publicados previamente en IL1403 Lactococcus lactis (van der Vossen y col., 1987) cultivando en placas durante una noche un cultivo de los derivados pGKV/MG1363 en placas GM17 suplementadas con 5 mg/l de eritromicina y aumentando las concentraciones de cloranfenicol. Las concentraciones de cloranfenicol fueron 4, 6, 8, 12, 16, y 20 mg/l, respectivamente. Se cultivaron en placas con 4-8 mg/l de cloranfenicol 50 \mul de un cultivo diluido 10^{4} veces en una suspensión acuosa de NaCl al 0,9%. Se cultivaron en placas que contenían 12-20 mg/l de cloranfenicol 100 \mul de un cultivo diluido 10^{4} veces en NaCl al 0,9%. Las placas se incubaron a 30ºC durante aproximadamente 80 horas y se determinó la concentración máxima de cloranfenicol que aun permitía el cultivo. Los resultados se muestran en la Tabla 6 que se muestra más adelante.

Sólo dos derivados pGKV/MG1363 fueron resistentes a más de 4 mg/l de cloranfenicol. Sin embargo, se encontraron dificultades en la interpretación de los resultados debido, por ejemplo, a la aparición de pequeñas colonias, y este ensayo parece ser inadecuado para promotores de resistencia media o escasa. pGKV244/IL1403 y pGKV259/IL1403 producen 0,2 y 5,1 unidades, respectivamente, cuando se ensayan con respecto a la actividad de cloranfenicol acetiltransferasa (van der Vossen y col, 1987).

TABLA 6

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C. Subclonación de plásmidos de fragmentos integrantes Tn917-LTV1 en el vector de selección de promotor pAK80

pAK80 es un vector de selección de promotor que contiene un gen erm como marcador de selección y un gen de \beta-galactosidasa sin promotor precedido por un poliengarce. La construcción de pAK80 se describe en el Ejemplo 6.

Las siguientes operaciones y transformaciones de ADN se realizaron de acuerdo con Maniatis, 1982. Los plásmidos de fragmentos integrantes descritos anteriormente se subclonaron primero en el vector de clonación pGEM-7Zf (+) (Promega) debido a la falta de sitios de restricción apropiados en pAK80. Se mezclaron 50 ng de pGEM-7Zf (+) digerido con ClaI y EcoRI en condiciones de ligamiento con 200 ng de fragmentos ClaI-EcoRI purificados que contenían ADN de lactococos de un plásmido de fragmentos integrantes. Esto se hizo con fragmentos ClaI-EcoRI de los siguientes plásmidos: p143, p162, p163, p224, p242 y pSB, respectivamente.

p170 contiene un sitio SalI localizado en el ADN de lactococos. El fragmento desde el sitio ClaI a este sitio SalI se insertó en el vector de clonación pBluescript II KS (Statagene) que se digirió con ClaI y SalI. Esta construcción se denominó pBluescript:170. El ADN plasmídico extraído de esta construcción se digirió con XhoI y ClaI y se ligó a pGEM-7Zf (+) digerido con XhoI y ClaI. Las construcciones pGEM-7Zf (+) se denominaron pGEM:[Nº integrante], por ejemplo, pGEM:143 y pGEM:170 y se denominaron colectivamente derivados de pGEM. Los derivados de pGEM se introdujeron en la cepa DH5\alpha de E. coli como se ha descrito en el Ejemplo 5. Los transformantes DH5\alpha se denominaron derivados de pGEM/DH5\alpha.

Se extrajo ADN plasmídico de los derivados de pGEM/DH5\alpha, se digirió con XhoI y BamHI y se ligó a pAK80 digerido con XhoI y BamHI. Las construcciones resultantes se denominaron pAK80:[Nº integrante], por ejemplo, pAK80:143 y pAK80:170 y denominaron colectivamente derivados de pAK80. Los derivados de pAK80 se introdujeron en MC1000 de E. coli como se ha descrito en el Ejemplo 5. Los transformantes MC1000 se denominaron derivados de pAK80/MC1000. Los derivados de pAK80 se extrajeron de los derivados de pAK80/MC1000. Para cada derivado de pAK80 extraído, se introdujo 1 \mug de ADN en MG1363 de Lactococcus lactis como se ha descrito en el Ejemplo 5. Los transformantes resultantes se denominaron pAK80:[Nº integrante]/MG1363, por ejemplo, pAK80:143/MG1363 y pAK80: 170/MG1363 y se denominaron colectivamente derivados de pAK80/MG1363.

La actividad promotora de los fragmentos clonados se determinó realizando ensayos de \beta-galactosidasa en cultivos durante una noche de los derivados de pAK80/MG1363 cultivados en medio G1.5M17. Se centrifugó 1 ml de cultivo a 10.000 x g durante 10 minutos. El sedimento se resuspendió en 500 \mul de tampón Z (Miller, 1972). Se mezclaron 100 \mul de suspensión celular con 400 \mul de tampón Z, 12,5 \mul de SDS al 0,1% y 25 \mul de CHCl_{3} en un mezclador Vortex durante 10 segundos. Después de la mezcla con Vortex, la suspensión se trató como se ha descrito en el Ejemplo 7. Los resultados se muestran en la Tabla 7.

TABLA 7

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A partir de los resultados anteriores se demuestra claramente que el vector de selección de promotor pAK80 es capaz de discriminar incluso promotores débiles, ya que pAK80: 163/MG1363, pAK80:170/MG1363, pAK80:224/
MG1363 y pAK80:242/MG1363 parece que están sin actividad promotora cuando se ensayan con respecto a la resistencia a cloranfenicol, pero cuando se ensayan con respecto a la actividad de \beta-galactosidasa es evidente que pAK80:170/MG1363, en contraste con los otros tres derivados de pAK80/MG1363, tiene actividad promotora.

Los siguientes derivados de pAK80/MG1363: pAK80:SB/MG1363, pAK80:143/MG1363, pAK80: 162/MG1363, pAK80:163/MG1363, pAK80:170/MG1363, se depositaron respectivamente con el DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Cellkulturen GMBH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania el 27 de agosto de 1993 con los números de acceso DSM 8495, DSM 8497, DSM 8498, DSM 8499 y DSM 8500, respectivamente.

Los fragmentos ClaI-EcoRI de p172 y p215, respectivamente, que contenían el ADN de lactococos, se clonaron en pGEM-7Zf (+). Las construcciones de pGEM-7Zf (+) se denominaron como se ha descrito anteriormente en este Ejemplo.

Las construcciones de pGEM-7Zf (+) se digirieron con BamHI y XhoI y se ligaron a pAK80, también digerido con BamHI y XhoI. Los detalles de los experimentos de clonación fueron como los descritos anteriormente. pGEM:172 digirió con XhoI y BamHI. La mezcla de ligación se introdujo en DH5\alpha de E. coli, y el plásmido resultante, pAK80:172, se introdujo en MG1363 de Lactococcus lactis. pAK80:172/MG1363 es azul en GM17 que contiene X-gal, lo que demuestra la presencia de un promotor en el fragmento ClaI-EcoRI de p172 de 4,5 kb.

El segmento den ADN de lactococos de pGEM:215 contiene un sitio BamHI interno. El fragmento BamHI-XhoI distal de pGEM:215 se ligó a pAK80 digerido con BamHI y XhoI, y el fragmento BamHI-BamHI de lactococos se ligó a pAK80 digerido con BamHI. Cada mezcla de ligación se introdujo en DH5\alpha de E. coli. Los plásmidos resultantes se denominaron pAK80:215A y pAK80:215B, respectivamente. La orientación correcta del fragmento BamHI en pAK80:215B se verificó por análisis de mapeo de restricción. Una introducción posterior de pAK80:215A y pAK80:215B, respectivamente, en Lactococcus lactis reveló que ninguno de los plásmidos llevaba un promotor. Este resultado sugiere que se ha inactivado un promotor potencial en fragmentos ClaI-EcoRI a partir de p215 durante la clonación de los dos subfragmentos, o que el promotor responsable de la expresión de \beta-galactosidasa en el Integrante 215 está localizado cadena abajo del sitio EcoRI.

Las mediciones de cultivos de una noche de MG1363 de Lactococcus lactis que contienen los plásmidos pAK80:
SB, pAK80:143, pAK80:162, pAK80:170 y pAK80:172, respectivamente, se describen más adelante en el Ejemplo 13. Sin embargo, en el Ejemplo 13 estos plásmidos se denominan pSMA332, pSMA337, pSMA338, pSMA339 y pSMA345, respectivamente.

Ejemplo 9 Caracterización de un promotor de Lacrococcus lactis regulado por compuestos de purina externos

La síntesis de novo de nucleótidos de purina a partir de pequeños precursores requiere, en general, 10 reacciones enzimáticas que conducen a monofosfato de inosina (IMP). IMP se usa en la síntesis de tanto AMP como GMP. Las bases y nucleósidos de purina, que se originan por vía intracelular o a partir de fuentes externas, se convierten en nucleótidos por medio de rutas de recuperación, que ha demostrado ser distintas entre diferentes organismos (véase para revisión: Nygaard, 1983). No se sabe prácticamente nada acerca del metabolismo de la purina en la bacteria anaeróbica Gram-positiva Lactococcus lactis distinta de las descritas (Nilsson y Lauridsen, 1992).

Los medios usados para el cultivo de bacterias ácido lácticas pueden contener compuestos de purina. Tales medios reprimen la síntesis de enzimas usadas en la formación de nucleótidos de purina. Cuando los productos lácteos inoculan los cultivos en la leche sin purina, se disipa esa represión. Este patrón de regulación de la síntesis de enzimas usado en la vía de síntesis de novo de purina puede usarse en el mercado. Puede haber varios genes que codifican enzimas que es deseable para que se tengan alta expresión en productos lácteos, pero que no se desea durante la fabricación de cultivos lácteos de partida que comprenden tales genes, principalmente debido a los efectos secundarios de inhibición del crecimiento causados por la alta expresión. Por lo tanto, se buscó un promotor regulado por purina en Lactococcus lactis y se aisló la región promotora a partir de la cual se inicia la expresión de purD. El gen purD codifica una enzima de la vía de síntesis de novo de purina.

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Cepas bacterianas y medios de cultivo

La cepa MG1363 de Lactococcus lactis se cultivó en medio M17 (Oxoid) o en medio definido, medio-DN. Este medio está compuesto de lo siguiente (por litro): 100 ml de un tampón salino al 10% con la siguiente composición: 10 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}, Na_{2}HPO_{4}, 33,2 g de 2H_{2}O, 15 g de KH_{2}PO_{4}, 5 g de NaCl, NaAcetato, 10 g de 3H_{2}O, agua sometida a intercambio iónico hasta 500 ml; 900 ml de medio básico que contiene 10 ml de MgCl_{2} 1,0 M, 1,0 ml de CaCl_{2} 0,5 M, 1,5 ml de FeCl3 0,01 M, agua sometida a intercambio iónico hasta 4500 ml, 15 g de agar por litro; 25 ml de fuente de carbono al 20%; 25 ml de ácidos casamino, 20% (Difco); 10 ml de solución de vitamina y 10 ml de una solución de asparagina al 0,8%.

Se usó glucosa como fuente de carbono en medio M17 y medio DN. Los antibióticos usados para Lactococcus lactis: eritromicina, 1 mg/l. Se añadieron compuestos de purina como suplementos, cuando fue necesario, por litro: adenina e hipoxantina, 15 mg; guanosina, 30 mg).

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Manipulación de ADN

Se aisló el ADN plasmídico de Lactococcus lactis de acuerdo con Johansen y Kibenich (1992). Lactococcus lactis se transformó por electroporación como se recomienda por Holo y Nes (1989). El uso del plásmido de sonda de promotor de Lactococcus lactis pAK80 se describió en el Ejemplo 6.

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Resultados

Un fragmento de ADN de 846 pb (Figura 14) contiene la región promotora de purD completa, así como un promotor adyacente de inicio de la transcripción en dirección contraria. Esta región se fusionó al gen informador (que codifica \beta-galactosidasa) en el plásmido de sonda de promotor pAK80 dando pLN71 (expresión del promotor purD) y pLN72 (expresión del promotor en dirección contraria). La transformación de pLN71 en la cepa MG1363 de Lactococcus lactis dio la posibilidad de medir la expresión del gen informador iniciado a partir del promotor de purD. Los resultados se muestran en la Tabla 8.

El plásmido pLN71 en la cepa MG1363 de Lactococcus lactis se depositó el 22 de diciembre de 1993 con el DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Cellkulturen GMBH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania, con el número de acceso DSM 8859.

TABLA 8

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Estos resultados demuestran que la expresión del gen informador que codifica \beta-galactosidasa se regula mediante compuestos de purina en los medios, y que la diferencia es tan grande como 60 veces en este experimento.

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Ejemplo 10 Medida de la expresión del gen de \beta-galactosidasa en pSMA311/MG1363 cultivado en medio líquido en condiciones controladas

El plásmido pSMA344 consta del fragmento EcoRI-ClaI de 9,7 kb de p170 (véase Ejemplo 8) insertado en el vector de clonación de promotor pAK80. Se ha demostrado que en el Integrante 170, la expresión del gen de \beta-galactosidasa insertado está regulada por el pH y la fase de cultivo (Ejemplo 7). El siguiente experimento se realizó para investigar si el fragmento de ADN clonado contiene las secuencias que son necesarias para la expresión regulada por pH de genes cadena abajo.

Se cultivó MG1363 de Lactococcus lactis que lleva el plásmido pCMA344 en dos fermentadores que contienen cada uno 1 litro de medio. Los fermentadores se ajustaron para funcionar a pH 7,0 y 5,2, respectivamente, por adición automática de hidróxido sódico 5 M y ácido clorhídrico 5 M. Cualquier otro parámetro (composición del medio, tamaño del inóculo, velocidad de agitación, temperatura etc.) fue como se describe en el Ejemplo 7. Los fermentadores se hicieron funcionar durante 45 horas y el cultivo se continuó midiendo la DO_{600} en muestras de cultivo. El muestreo y la recogida de alícuotas de cultivo así como la medición de la actividad de \beta-galactosidasa se realizaron como se describe en el Ejemplo 5, excepto en que el volumen de cultivo recogido y el volumen de suspensión celular añadido al ensayo se variaron de acuerdo con la densidad celular y la actividad de \beta-galactosidasa esperada. La Figura 15 muestra la DO_{600} y la actividad de \beta-galactosidasa frente al tiempo que dura la fermentación. A partir de los resultados, está claro que la expresión a partir del promotor contenido en pSMA344 está controlada del mismo modo que el observado en el Integrante 170. En el cultivo cultivado a pH 7,0, la actividad de \beta-galactosidasa por DO_{600} fue menor de 1,0 unidades Miller durante toda la fermentación excepto en la primera muestra donde se esperará que quede algo de actividad del precultivo. En el cultivo cultivado a pH 5,2, la actividad de \beta-galactosidasa por DO_{600} aumentó durante el crecimiento logarítmico y continuó aumentando durante las primeras 14-20 horas de la fase estacionaria. Tanto los niveles inducidos como los reprimidos fueron de 5 a 10 veces más altos que los valores obtenidos en el Integrante 170 en las mismas condiciones de cultivo. Esto se esperaba, porque el gen que lleva el plásmido está presente en un número de copias más alto, y porque las dos enzimas \beta-galactosidasa codificadas por el gen lacZ (en TN917-LTV1) y por los genes lacL-lacM (en pAK80) pueden tener diferentes actividades específicas.

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Ejemplo 11 Mediciones de la actividad de \beta-galactosidasa en integrantes PFC-1 seleccionados cultivados en medio líquido por un procedimiento estandarizado

Como se ha descrito en el Ejemplo 5, se descubrió que varios integrantes mostraban expresión regulada de \beta-galactosidasa cuando se cultivaban en placas en diversas condiciones de cultivo y composiciones de medio.

Los experimentos descritos a continuación se realizaron para analizar la regulación de la expresión del gen de \beta-galactosidasa en 25 integrantes seleccionados cultivados durante una noche en cultivo líquido. Los parámetros de regulación analizados incluían pH y/o concentración de arginina, concentración de cloruro sódico, y temperatura de cultivo.

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Medios y procedimientos de cultivo

Los medios usados para cultivos líquidos se indican en la siguiente tabla. El medio básico para todos los experimentos fue caldo M17 1,5 x (Oxoid, Unipath Ltd., UK) que contenía 1 mg/l de eritromicina.

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TABLA 9

17

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Todos los cultivos se incubaron a 30ºC excepto en el experimento para la investigación del efecto de la temperatura en la expresión de \beta-galactosidasa, donde se incubó una serie de cultivos a 15ºC. En el último caso se prolongó la incubación para compensar la velocidad más baja de cultivo.

Para asegurar condiciones de partida uniformes en todos los cultivos, se inocularon 5-10 ml de precultivo de cada integrante en G1.5M17 líquido con una única colonia de agar GM17 (véase Ejemplo 15 más adelante) y se cultivó a la fase estacionaria por incubación durante 12-18 horas a 30ºC. A partir de los precultivos se inocularon 10 \mul de cada cepa en 10 ml de cada medio, y los cultivos se incubaron a 30ºC durante 20 horas o a 15ºC durante 165 horas. Se tomó una muestra de cada cultivo para la medición de DO_{600} inmediatamente antes de recogerlo. Las células se recogieron por centrifugación (10 minutos a 10.000 x g, 4ºC) y se lavaron una vez en 1 ml de NaCl 0,15 M enfriado con hielo. El pH se midió en el sobrenadante del medio. En el caso de los cultivos duplicados cultivados a diferentes temperaturas donde los cultivos se recogieron en días distintos, los sedimentos celulares se congelaron a -20ºC y se descongelaron después para el ensayo de actividad de \beta-galactosidasa. Todas las células se resuspendieron en 1,0 ml de tampón Z (Miller, 1972), y posteriormente la suspensión celular se usó para ensayos de actividad de \beta-galactosidasa como se ha descrito en el Ejemplo 7, excepto en que la proporción entre la suspensión celular y el tampón Z usada en el ensayo se ajustó de acuerdo con la actividad enzimática para mantener la velocidad de reacción en límites
razonables.

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Resultados de ensayos de \beta-galactosidasa en integrantes seleccionados cultivados en cultivo líquido

La actividad encontrada en la misma cepa en diferentes días varió hasta cierto punto. En diez cultivos G1.5M17 independientes del Integrante SB, las actividades medidas estaban entre 3,9 y 8,0 con una media de 6,3 y una desviación estándar de 1,4. Cinco cultivos independientes de 170 en el mismo medio dieron resultados entre 0,9 y 2,8 con una media de 1,7 y una desviación estándar de 0,7. La variación observada puede estar causada por alguna influencia en la expresión del gen o la estabilidad enzimática de diferencias no detectadas entre los lotes de medio. Sin embargo, en cada uno de estos casos la diferencia de actividades a bajo y alto pH fue obviamente significativo (Tabla 10). Las actividades por debajo de 0,1 no se determinaron con exactitud por el procedimiento usado.

La Tabla 10 muestra las actividades de \beta-galactosidasa medidas en cultivos de cepas de 17 integrantes diferentes en medios con y sin arginina. Se han identificado la mayoría de los integrantes que muestran expresión de \beta-galactosidasa regulada por pH y/o arginina por ensayos de placas. En los Integrantes 237, 241 y SB tal control de expresión no se ha observado claramente por inspección de las placas. Una posible razón es que por encima de un cierto nivel de actividad es difícil distinguir entre diferentes actividades mediante el ensayo de placas.

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TABLA 10

18

Un espacio en blanco indica que esta combinación particular de cepa y medio no se ha ensayado.

Se cultivaron diez cepas en las que la actividad de \beta-galactosidasa durante el cultivo en placas de agar GM17 varió con la temperatura hasta la fase estacionaria en cultivos duplicados en G1.5M17 a 30ºC y a 15ºC. Las actividades medidas en las células se muestran en la Tabla 11.

TABLA 11

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19

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Los Integrantes 170 y 192 mostraron la regulación de la expresión del gen de \beta-galactosidasa también encontrado en la placa, dando ambos mayor actividad a baja temperatura. Para los Integrantes SB, 143 y 159, el efecto de la temperatura en la expresión del gen de \beta-galactosidasa fue opuesto al que se esperaba de los resultados de los ensayos de placa, y para los Integrantes 172, 187, 188, y 201, el efecto fue más débil que el anticipado. Debe tenerse en cuanta que las células de los cultivos líquidos se recogieron en fase estacionaria, mientras que la actividad de \beta-galactosidasa detectada en el ensayo de placa se acumula tanto a partir de la fase de cultivo como de la fase estacionaria.

Los ensayos de placa de los integrantes PFC-1 han revelado disminución de la expresión del gen de \beta-galactosidasa o sin cambios en la respuesta a la adición de NaCl al medio de cultivo. Los resultados de la medición de la actividad en cultivos cultivados en medio líquido que contenían NaCl al 1% o al 2% se muestran en la Tabla 12. Para los integrantes 179, 199, 230, y 241 se esperaba de los ensayos de placa que el NaCl redujera la actividad de \beta-galactosidasa. En este experimento se incluyeron varios integrantes que no habían mostrado ninguna influencia de NaCl en la actividad de \beta-galactosidasa en ensayos de placa, y los resultados de tres de estos, concretamente 224, 229 y SB, también se presentan en la Tabla.

En todas las cepas las actividades ensayadas habían disminuido por un factor de 3-30 en medios que contienen NaCl extra, y aparentemente el efecto más fuerte estuvo en la actividad en SB. Como se ha mencionado antes, el pH final de los cultivos en medios que contienen NaCl fue ligeramente más bajo que en cultivos cultivados sin NaCl adicional. Sin embargo, esta diferencia de pH puede que no sea suficientemente grande para explicar el efecto evidente en la expresión génica de SB, y probablemente tampoco lo sea para explicar la similitud del efecto en todas las cepas ensayadas. Se necesitan experimentos más controlados para aclarar la contradicción aparente entre los resultados del ensayo de placa y la actividad medida en cultivos líquidos de una noche.

TABLA 12

20

Los siguientes integrantes (organismo huésped: MG1363 de Lactococcus lactis): SB, P139-86, P139-142, P139-143, P139-159, P139-162, P139-163, P139-168, P139-172, P139-179, P139-187, P139-188, P139-192, P139-193, P139-199, P139-201, P139-203, P139-222, P139-224, P139-229, P139-230, P139-237, P139-241, y P139-242 se depositaron con el DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Cellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Alemania el 22 de diciembre de 1993 con los números de acceso DSM 8834, DSM 8835, DSM 8836, DSM 8837, DSM 8838, DSM 8839, DSM 8840, DSM 8841, DSM 8842, DSM 8843, DSM 8844, DSM 8845, DSM 8846, DSM 8847, DSM 8848, DSM 8849, DSM 8850, DSM 8851, DSM 8852, DSM 8853, DSM 8854, DSM 8855, DSM 8856 y DSM 8857, respectivamente.

Ejemplo 12 Secuenciación del ADN cromosómico de Lactococcus cadena abajo y cadena arriba de la inserción de Tn917 en integrantes de fusión de promotor Tn917-LTV1 seleccionados

Se determinó la secuencia cromosómica de aproximadamente 200 pb a 1500 pb cadena arriba de la inserción de Tn917 en seis integrantes de fusión de promotor de Lactococcus lactis de Tn917-LTV1 seleccionados. También se determinó la secuencia cadena debajo de la inserción del transposón en uno de los integrantes seleccionados. La secuenciación se realizó para mostrar ejemplos de sitios y regiones en el cromosoma de Lactococcus lactis que muestran expresión regulada de un gen o genes sin promotor insertado. La secuenciación se realizó en ambas cadenas esencialmente como se describe en el manual para Sequenasa Versión 2.0 DNA Sequencing Kit de USB, Cleaveland, Ohio, Estados Unidos, usando los plásmidos de fragmentos integrantes (véase Ejemplo 8) pSB, p170, p143, p242, p224, y p163, como moldes y cebadores como se describe más adelante. Se determinó el ADN de Lactococcus localizado al lado del extremo proximal de lacZ de Tn917-LTV1 para estar cadena arriba de la inserción del transposón. Independientemente de qué cadena se está mencionado, alejarse del extremo de lacZ es moverse cadena arriba del ADN de Lactococcus. La estrategia para secuenciar cadena arriba en cada molde fue del siguiente modo:

1. La primera reacción de secuencia se realizó usando el cebador pp1 (5' GTTAAATGTACAAAATAACAGCG 3') (DNA Technology, Arhus, Dinamarca). pp1 es homólogo a una secuencia en el extremo proximal de Tn917-LTV1. Si el primer pb cadena arriba de Tn917-LTV1 se denomina Nº 1, la secuencia complementaria a pp1 se localiza en el pb Nº -58 a Nº -80. La secuencia obtenida, denominada secuencia pp1, constaba de aproximadamente 20 pb del extremo proximal de lacZ de Tn917-LTV1 seguido por 200 a 300 pb de la secuencia adyacente, cadena arriba de ADN de Lactococcus lactis.

2. Basado en la secuencia pp1, se sintetizó el cebador p1 (DNA Technology). p1 es homólogo a una secuencia de 20 a 24 pb localizada aproximadamente 60 pb del extremo 3' de la secuencia pp1. La segunda reacción de secuencia se realizó usando el cebador p1. La secuencia obtenida, denominada secuencia p1, era un solapamiento de aproximadamente 20 pb del extremo 3' de la secuencia pp1 y se extiende de 200 a 300 pb adicionales cadena arriba del ADN de Lactococcus lactis.

3. Basado la secuencia p1 se sintetizaron dos cebadores, p2 y p1r (DNA Technology). p2 es homólogo a una secuencia de 20 a 24 pb localizada aproximadamente 60 pb del extremo 3' de la secuencia p1 y p1r es homólogo a la secuencia de ADN de Lactococcus lactis complementaria localizada aproximadamente 250 pb cadena arriba de la inserción del transposón. La tercera y cuarta reacción de secuencia se realizaron usando los cebadores p2 y p1r, respectivamente. Usando el cebador p2, la secuencia obtenida, denominada secuencia p2, fue un solapamiento de aproximadamente 20 pb del extremo 3' de la secuencia pl y 200 a 300 pb adicionales cadena arriba del ADN de Lactococcus lactis.
Usando el cebador p1r, la secuencia obtenida, denominada secuencia p1 r, fue complementaria a la secuencia pp1.

4. Las reacciones adicionales de secuencia se realizaron usando los cebadores p3, p4, etc., cada cebador homólogo a una secuencia localizada aproximadamente 300 pb cadena arriba del cebador usado previamente. Las reacciones de secuencia también se realizaron usando los cebadores p2r, p3r, etc., cada uno de los cuales es homólogo a una secuencia localizada aproximadamente 300 pb cadena arriba del cebador usado previamente.

5. Clonación de la secuencia localizada cadena abajo de la inserción de Tn917-LTV1 en el Integrante SB: Cuando el derivado de Tn917, Tn917-LTV1 se usa para mutagénesis por transposón, el ADN localizado cadena arriba del punto de inserción puede clonarse fácilmente en E. coli como se ha descrito en el Ejemplo 5. Sin embargo, este procedimiento de clonación no puede usarse para la clonación de ADN localizado cadena abajo de la inserción de Tn917-LTV1. Sin embargo, usando la estrategia de Reacción en Cadena de la Polimerasa Inversa (Ochman y col. 1988) el ADN
localizado cadena abajo del transposón en el Integrante SB se amplificó y se clonó en E. coli de la siguiente manera:

Se digirieron completamente 60 ng de ADN de MG1614 de Lactococcus lactis cromosómico con EcoRI. El ADN digerido se extrajo con fenol/cloranfenicol y se precipitó con NaAc y EtOH. Posteriormente el ADN se ligó a un volumen total de 20 \mul. Esta concentración diluida favorece la formación de círculos monoméricos. De esta mezcla de ligación, se tomó una muestra de 5 \mul y se realizó una amplificación por PCR en un volumen total de 100 \mul. Los dos cebadores BA24: (5' CCAGTCAACTTTAAAACATAACC 3') y BA21: (5' CTCACTGGTCACCTTTATCC 3') se usaron para la amplificación por PCR. Se usó un kit GeneAmp DNA Amplification Reagent Kit de Perkin Elmer Cetus, 761 Main Ave., Norwalk, CT 06859. La concentración de tampón de reacción, dNTP y Taq polimerasa fue como se describió en el protocolo del fabricante. La concentración final de los cebadores en la mezcla de reacción fue de 10 ng/\mul. Se usó el siguiente perfil de temperatura: desnaturalización a 94ºC, 1 minuto; hibridación a 53ºC, 1 minuto; extensión a 72ºC, 2 minutos. El número total de ciclos de PCR fue 40.

Cuando se analizaron 10 \mul del producto de reacción en un gel de agarosa, se observó una banda específica a aproximadamente 1400 pb, indicando la clonación de aproximadamente 1100 pb cadena abajo de la inserción de Tn917 en el Integrante SB.

El fragmento de 1400 pb de la reacción por PCR se ligó al vector pT7Blue (R) (Novagen, Madison, Wisconsin, Estados Unidos) en condiciones convencionales de ligación como se describe por Maniatis y col. 1982. La mezcla de ligación se introdujo en DH5\alpha de E. coli. El plásmido resultante se denominó pSBC1.

Las posteriores reacciones de secuencia se realizaron usando la misma estrategia mencionada anteriormente en párrafos 2, 3 y 4.

A continuación se muestran las secuencias de ADN cadena arriba de la inserción de Tn917-LTV en los Integrantes SB, 170, 143, 242, 224, y 163, respectivamente [(i) - (vi)]. Para el Integrante SB también se da una secuencia cadena abajo de la inserción de Tn917-LTV1 en el Integrante SB. El sitio de inserción del transposón y la orientación de Tn917-LTV1 se muestran por [lacZ-Tn917-LTV1-] insertado en las secuencias.

(i) La secuencia de ADN de 117 nucleótidos cadena arriba del extremo proximal de lacZ de Tn917-LTV1 y una secuencia de ADN de 1.083 nucleótidos cadena abajo del extremo distal de lacZ de Tn917-LTV1 en el Integrante SB

Un supuesto terminador de la transcripción se indica con letras minúsculas y las secuencias consenso -35 y -10 del promotor, PSB están subrayadas.

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(ii) La secuencia de ADN de 1.430 nucleótidos cadena arriba del extremo proximal de lacZ de Tn917-LTV1 en el Integrante 143

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(iii) La secuencia de ADN de 994 nucleótidos cadena arriba del extremo proximal de lacZ de Tn917-LTV1 en el Integrante 163

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(iv) La secuencia de ADN de 1.120 nucleótidos cadena arriba del extremo proximal de lacZ de Tn917-LTV1 en el Integrante 170

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(v) La secuencia de ADN de 480 nucleótidos cadena arriba del extremo proximal de lacZ de Tn917-LTV1 en el Integrante 224

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(vi) La secuencia de ADN de 853 nucleótidos cadena arriba del extremo proximal de lacZ de Tn917-LTV1 en el Integrante 242

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Ejemplo 13 Mapeo del promotor P170 en el fragmento de ADN EcoRI-ClaI de 9,7 kb de p170

Los siguientes experimentos se realizaron para mapear la localización del promotor P170 regulado por pH/fase de cultivo en el fragmento de ADN EcoRI-ClaI de 9,7 kb de p170.

El fragmento de ADN EcoRI-ClaI de 9,7 kb de p170 se escindió en subfragmentos y se creó un mapa de restricción (véase Figura 16). Posteriormente se clonaron subfragmentos apropiados en el vector de sonda de promotor pAK80. Sin embargo, primero fue necesario crear sitios de restricción compatibles en los subfragmentos y pAK80.

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(i) Construcción de pSMA344

La clonación del fragmento EcoRI-ClaI grande de 9,7 kb de p170 en pGEM-7Zf (+) se hizo digiriendo p170 con ClaI y EcoRI seguido de ligación del fragmento de 9,7 kb a pGEM-7Zf (+) digerido con ClaI y EcoRI. La mezcla de ligación se introdujo en DH5\alpha de E. coli y el plásmido resultante se denominó pSMA212. pSMA212 se digirió con XhoI y BamHI y se ligó a pAK80 también digerido con XhoI y BamHI. La mezcla de ligación se introdujo en DH5\alpha de E. coli. El plásmido resultante, pSMA344, se introdujo posteriormente en MG1363 de Lactococcus lactis.

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(ii) Construcción y clonación de derivados de deleción del fragmento EcoRI-ClaI de 9,7 kb de p170

El plásmido pSMA342 se construyó de la siguiente manera: se digirió pSMA212 con ClaI y NdeI, los extremos cohesivos se completaron por el uso de la polimerasa Klenow como se describe por Maniatis y col. 1982. El fragmento grande de 8,7 kb [3 kb de pGEM-7Zf (+) y 5,7 kb del cromosoma de Lactococcus lactis] se purificó, se religó, y se introdujo en DH5\alpha de E. coli. El plásmido resultante, pSMA213, se digirió con XhoI y BamHI y el fragmento de 5,7 kb purificado se ligó a pAK80 también digerido con XhoI y BamHI. La mezcla de ligación se introdujo en DH5\alpha de E. coli y el plásmido resultante, pSMA342, se introdujo posteriormente en MG1363 de Lactococcus lactis.

El plásmido pSMA343 se construyó de la siguiente manera: se digirió pSMA212 con ClaI y SalI, los extremos cohesivos se completaron por el uso de la polimerasa Klenow. El fragmento de 6,2 kb [3 kb de pGEM-7Zf (+) y 3,2 kb del cromosoma de Lactococcus lactis] se purificó, se religó, y se introdujo en DH5\alpha de E. coli. El plásmido resultante, pSMA214, se digirió con XhoI y BamHI y el fragmento de 3,2 kb de lactococos se ligó a pAK80 digerido con XhoI y BamHI. El plásmido resultante, pSMA343, se introdujo posteriormente en MG1363 de Lactococcus lactis.

El plásmido pAK80:170 (DSM 8500) como se describe en el Ejemplo 8 se denomina a continuación pSMA339.

El plásmido pSMA340 se construyó de la siguiente manera: en el Ejemplo 8 se describe la clonación del fragmento de lactococos ClaI-SalI de 6,5 kb de p170 en el vector de clonación pBluescript II KS. Esta construcción llamada pBluescript:170 en el Ejemplo 8 se denomina pSMA201 a continuación. Se digirió pSMA201 con NdeI y SalI y se trató con la polimerasa Klenow para rellenar en los extremos cohesivos. El fragmento grande de 7 kb [3 kb de pGEM-7Zf (+) y 4 kb del cromosoma de lactococos] se purificó, se religó, y se introdujo en DH5\alpha de E. coli. El plásmido resultante se denominó pSMA202.

pSMA202 se digirió con XhoI y BamHI, y el fragmento de 4 kb de lactococos se purificó y se ligó a pAK80, también digerido con XhoI y BamHI. La mezcla de ligación se introdujo en DH5\alpha de E. coli y el plásmido resultante, pSMA340, se introdujo posteriormente en MG1363 de Lactococcus lactis.

El plásmido pSMA341 se construyó de la siguiente manera: se digirió pSMA202 con NdeI y EcoRI y se trató con la polimerasa Klenow para rellenar en los extremos cohesivos. El fragmento grande de 5,5 kb [3 kb de pGEM-7Zf (+) y 2,5 kb del cromosoma de lactococos] se purificó, se religó, y se introdujo en DH5\alpha de E. coli. El plásmido resultante, pSMA208, se digirió con XhoI y BamHI y el fragmento de 2,5 kb de lactococos se ligó a pAK80, también digerido con XhoI y BamHI. El plásmido resultante, pSMA341, se introdujo en DH5\alpha de E. coli y posteriormente en MG1363 de Lactococcus lactis.

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(iii) Evaluación de la actividad promotora de Lactococcus lactis en los subfragmentos del fragmentos de 9,7 kb de p170

Se realizó un ensayo de placas para la determinación de la actividad promotora de los fragmentos de lactococos clonados cultivando en placas de una noche cultivos de Lactococcus lactis que contenían los plásmidos pSMA339, pSMA340, pSMA341, pSMA342, pSMA343 y pSMA344, respectivamente, en GM17 suplementado con 1 \mug/ml de Em y 160 \mug/ml de X-gal. Sorprendentemente, todos los cultivos salieron azules en estas placas, demostrando la existencia de al menos un promotor funcional en todos los plásmidos. De estos resultados es evidente que al menos tres promotores están localizados en el fragmento de lactococos de 9,7 kb de p170.

La cepas MG1363 de Lactococcus lactis que contienen pSMA339, pSMA340, pSMA341, pSMA342, pSMA343 y pSMA344, respectivamente, se sembraron en estrías en placas GM17 y en placas ArgM17, respectivamente. Ambos tipos de placas contenían 1 \mug/ml de Em y 160 \mug/ml de X-gal. Los cultivos en placas se realizaron para identificar el promotor o promotores regulados por pH entre los tres promotores. En función de estos ensayos, se descubrió que la expresión de \beta-galactosidasa que resulta de pSMA339, pSMA340 y pSMA344, respectivamente, está regulada por pH/arginina. La expresión de \beta-galactosidasa que resulta de pSMA342 estaba débilmente regulada por pH/arginina, mientras que la expresión a partir de pSMA341 y pSMA343 no estaba afectada por estos factores.

Los resultados demuestran que el promotor localizado en el fragmento ClaI-NdeI de 4 kb proximal al gen informador de \beta-galactosidasa, está regulado por pH. Este promotor se menciona en adelante como P170. El plásmido pSMA342, que contiene el fragmento de lactococos de 5,7 kb que se extiende desde el sitio NdeI hasta el sitio EcoRI, muy probablemente contiene dos promotores, de los que uno se localiza de manera proximal al gen informador que también parece estar regulado por el pH. Sin embargo, esta regulación parece depender del fragmento EcoRI-SalI de 3,2 kb localizado cadena arriba. Esta conclusión está basada en la observación de que el promotor contenido en pSMA341 que carece del fragmento EcoRI-SalI de 3,2 kb, no está regulado por pH/arginina.

Se realizaron mediciones de expresión de \beta-galactosidasa en cultivos de una noche de la cepa MG1363 que contenían pSMA339, pSMA340, pSMA341, pSMA342, pSMA343 y pSMA344, respectivamente, como se ha descrito en el Ejemplo 7. Todos los cultivos se cultivaron en medio GM17 y en medio ArgM17, respectivamente. Ambos medios estaban suplementados con 1 \mug/ml de Em. Como control de la expresión de \beta-galactosidasa regulada, en el experimento se incluyó el Integrante 170. Los resultados se muestran en la Tabla 13:

TABLA 13

29

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Los Lactococcus lactis que contienen pSMA339, pSMA340 o pSMA144, muestran la misma expresión regulada de \beta-galactosidasa que el Integrante 170. Esto demuestra que el promotor P170 también se regula cuando está situado en un plásmido multicopia como pAK80. En contraste, el promotor llevado en pSMA342 no muestra una expresión regulada. El promotor contenido en pSMA343 está regulado por pH y arginina. Esta regulación no se detectó en el ensayo de placa. Esto puede deberse a las diferencias en el cultivo en placas y en el medio líquido. La regulación observada en el promotor contenido en pSMA343 no es tan estricta como la regulación de P170.

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Mapeo fino del promotor P170 localizado en el fragmento ClaI-NdeI de 4 kb de p170

Antes del mapeo fino de P170 localizado en el fragmento ClaI-NdeI de 4 kb de p170, se produjo un mapeo de restricción más detallado del fragmento ClaI-NdeI de 4 kb (Figura 17).

El fragmento ClaI-NdeI de 4 kb de lactococos de p170 está contenido en pSMA202. pSMA202 contiene tres sitios HindIII, de los que dos están situados en el ADN de lactococos y uno en la región de poliengarce. La inserción en pAK80 del fragmento HindIII de 1,3 kb, que se extiende desde el sitio HindIII en el poliengarce hasta el sitio HindIII en el ADN de lactococos, dio como resultado el plásmido pSMA357. El inserto en pSMA357 no contenía actividad promotora cuando se introdujo en MG1363 de Lactococcus lactis.

El fragmento HindIII de 2,3 kb en el fragmento ClaI-NdeI de 4 kb se clonó en pAK80 digerido con HindIII. El plásmido resultante, pSMA348, se introdujo en MG1363 de Lactococcus. Se expresó \beta-galactosidasa a partir de este plásmido, lo que demuestra la existencia de un promotor funcional en este fragmento HindIII. Se insertó un fragmento de 1,5 kb en el sitio SmaI de pAK80 y el plásmido resultante, pSMA358, se introdujo en MG1363 de Lactococcus lactis. \beta-galactosidasa se expresó a partir de pSMA358. El fragmento HindIII de 1,5 kb incluye la mayor parte del fragmento HindIII de 1,3 kb y tiene un solapamiento de 400 pb con el fragmento HindIII de 2,6 kb adyacente. En función de las evaluaciones de la actividad promotora en los insertos en los plásmidos pSMA348, pSMA357 y pSMA358, el promotor P170 se mapeó en un fragmento HindII-HindIII localizado aproximadamente 1,3 kb cadena arriba de la inserción de Tn917 en el Integrante 170.

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(iv) Mapeo del promotor PSB

De la secuenciación del ADN localizado cadena arriba de SB, se identificó un promotor consenso [véase el Ejemplo 12 (i)] en un fragmento HpaI-ClaI de 190 pb. pSB se digirió con HpaI y ClaI y el fragmento se ligó a pNZ336 (Simons y col. 1990) digerido con HpaI y ClaI. El plásmido resultante, pNZ336:SB, se digirió con SalI y BamHI. El fragmento de 190 pb se ligó a pAK80, digerido con XhoI y BamHI. La mezcla de ligación se introdujo en DH5\alpha de E. coli, y el plásmido resultante, pSMa347, se introdujo posteriormente en MG1363 de Lactococcus lactis. La cepa MG1363/pSMA347 expresa \beta-galactosidasa, que demuestra la existencia de un promotor funcional en el fragmento de 190 pb.

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(v) Mediciones en cultivos de una noche inducidos o no inducidos de MG1363 de Lacotoccus lactis que contiene derivados de pAK80 que llevan promotor

En la Tabla 14 se dan actividades de \beta-galactosidasa en cultivos de una noche cultivados en condiciones inducidas y no inducidas, respectivamente. Las diferentes condiciones de cultivo son variaciones de temperatura y variación de pH/concentración de arginina en el medio de cultivo, respectivamente. Las cepas analizadas incluyen tanto derivados de pAK80 que contienen fragmentos EcoRI-ClaI de los plásmidos rescatados como, en función de los análisis de mapeo anteriores, derivados de pAK80 que contienen deleciones de los fragmentos EcoRI-ClaI. El cultivo de los cultivos así como el ensayo de \beta-galactosidasa se realizaron como se ha descrito en el Ejemplo 11. En este ejemplo 5Arg1.5M17 se denomina 5ArgM17.

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TABLA 14a

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30

TABLA 14b

31

Los resultados muestran que el promotor de pSB no está regulado por el pH cuando está contenido en pAK80. Este resultado se observa tanto con pSMA332 como con pSMA347. La regulación por la temperatura del promotor de pSB se invierte cuando se sitúa en pAK80. El promotor de p162 sigue regulándose cuando se sitúa en pAK80. Sin embargo, la expresión total de \beta-galactosidasa a partir del promotor contenido en el plásmido no es tan alta como se esperaba del alto número de copias de pAK80. La regulación por pH de P170 se ha descrito antes. La regulación por la temperatura de P170 se conserva, aunque en menor medida, cuando se localiza en pAK80. El promotor de p143 se regula cuando se localiza en pAK80. Sin embargo, esta regulación es opuesta a la regulación observada cuando el promotor se localiza de manera cromosómica. La resistencia del promotor en p143 aumenta de manera drástica cuando se localiza en el plásmido. La expresión de \beta-galactosidasa a partir del promotor en p172 está ligeramente influida por la temperatura cuando se localiza en el cromosoma. Esta regulación llega a ser mucho más pronunciada cuando el promotor se localiza en el plásmido.

Los resultados demuestran claramente que la regulación de un promotor cromosómico depende en general de la localización, es decir, si está localizado de manera cromosómica o de manera extracromosómica en multicopias. Se considera que si se hubiera usado una estrategia de clonación de promotor convencional que incluyera clonación al azar en un vector de clonación de promotor, los resultados con respecto a la regulación en muchos casos podrían haber sido bastante diferentes de los obtenidos usando la estrategia anterior que incluía estudios de la regulación directamente en promotores situados de manera cromosómica.

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Ejemplo 14 La construcción de un vector, pSMA500, que no se replica en Lactococcus lactis

Se ha demostrado que para varios microorganismos, incluyendo Lactococcus, se puede integrar un vector no replicante en el cromosoma, si el vector lleva ADN homólogo (Leenhouts y col. 1989). El mecanismo de integración implicado es un único evento de entrecruzamiento (integración tipo Campbell) entre el ADN homólogo contenido en el vector y en el cromosoma. El resultado de esta integración de tipo Campbell es un conjunto duplicado de ADN homólogo en el cromosoma y entre el conjunto duplicado de ADN homólogo. se localiza el vector no replicante.

En contraste a la inserción de Tn917, esta integración de tipo Campbell da como resultado una inserción no destructiva, si se usa un vector integrable apropiado.

Se construyó un vector no replicante, pSMA500, basado en el plásmido pVA891 de E. coli (Macrina y col. 1983) que llevaba un marcador de resistencia a eritromicina y, como gen informador, los genes de \beta-galactosidasa sin promotor obtenidos de Leuconostoc mesenteroides subespecie cremoris.

El poliengarce y los genes de \beta-galactosidasa sin promotor del plásmido pAK80 se clonaron en el plásmido pVA891, que no es capaz de replicarse en bacterias ácido lácticas. pAK80 se digirió con HindIII y SalI. El fragmento de 4,1 kb que contenía el poliengarce y los genes de \beta-galactosidasa se purificó y se ligó a pVA891 también digerido con HindIII y SalI. La mezcla de ligación se introdujo en MC1000 de E. coli, seleccionando la resistencia a eritromicina (Em^{r}) (250 \mug/ml). El plásmido resultante se denominó pSMA500. Este vector no es capaz de replicarse en bacterias ácido lácticas. Sin embargo, si el plásmido se inserta en el cromosoma bacteriano, el gen de resistencia a eritromicina se expresa en la mayoría de bacterias ácido lácticas. Cuando se clona un promotor funcional en el poliengarce de pSMA500, la bacteria huésped expresará adicionalmente los genes de \beta-galactosidasa.

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Ejemplo 15 Inserción de un promotor regulado en pSMA500 e integración en el cromosoma de Lactococcus (i) Inserción de promotores en pSMA500

La regulación de los promotores de p170 y pSB se ha descrito en el Ejemplo 8. En el presente Ejemplo, el ADN de Lactococcus de p170 que contiene el promotor regulado P170 se insertó en pSMA500, y esta construcción se integró posteriormente en el cromosoma de MG1363 de Lactococcus lactis. Paralelamente, el ADN de Lactococcus de pSB, que contenía el promotor regulable PSB, se insertó en pSMA500, y esta construcción se integró posteriormente en el cromosoma de MG1614 de Lactococcus lactis.

Este experimento se realizó para examinar si un promotor regulable y un gen de \beta-galactosidasa insertados en el cromosoma mediante integración tipo de Campbell seguiría mostrando expresión de \beta-galactosidasa regulada.

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(ii) Construcción de los vectores integrables pSMA501 y pSMA502

pSMA212 como se ha descrito en el Ejemplo 13, contiene un fragmento XhoI-BamHI de 9,7 kb. Este fragmento es esencialmente el mismo que el segmento de ADN de Lactococcus de 9,7 kb de p170, que lleva el promotor regulado P170. El fragmento de 9,7 kb de pSMA212se clonó en pSMA500 también digerido con XhoI y BamHI. El plásmido resultante, pSMA501, se introdujo en MC1000 de E. coli y los transformantes se seleccionaron por Em^{r} (250 \mug/ml).

Paralelamente, el fragmento de ADN XhoI-BamHI de Lactococcus de pGEM:SB (véase Ejemplo 8), que lleva el promotor regulado PSB, se clonó en pSMA500. El plásmido resultante, pSMA502, se introdujo en MC1000 de E. coli y los transformantes se seleccionaron por Em^{r}(250 \mug/ml). Las manipulaciones y transformaciones convencionales de ADN se realizaron de acuerdo con Maniatis y col. 1982.

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(iii) Integración de pSMA501 y pSMA502 en el cromosoma de Lactococcus

Se introdujeron aproximadamente 2 \mug de ADN purificado con Qiagen (Qiagen Plasmid Kit, Diagen, Dusseldorf, Alemania) de pSMA501 en MG1363 de Lactococcus lactis. Paralelamente, se introdujeron 2 \mug de ADN purificado con Qiagen de pSMA502 en MG1614 de Lactococcus lactis. La transformación de Lactococcus lactis fue como se ha descrito en el Ejemplo 1. Los transformantes se cultivaron en placas SGM17 que contenían 1 \mug/ml de Em y 160 \mug/ml de X-gal. Después del cultivo a 30ºC durante 48 horas, sólo aparecieron transformantes azules en ambos conjuntos de placas paralelas. Estos resultados indicaron que pSMA501 se había integrado en el cromosoma de la cepa MG1363 y que pSMA502 se había integrado en el cromosoma de la cepa MG11614. También, los resultados demostraron que los promotores en pSMA501 y pSMA502, respectivamente, fueron funcionales cuando se integraron en el cromosoma. Se obtuvieron aproximadamente 5000 unidades formadoras de colonias/\mug de ADN usando la construcción pSMA501 y se obtuvieron aproximadamente 500 CFU/\mug de ADN usando pSMA502. Usando el plásmido replicante pAK80, la eficacia de la transformación fue 1 x 10EE7 CFU/\mug en ambas cepas. La transformación de la cepa MG1363 y la cepa MG1614 con pSMA500 mostró menos de 5 CFU/\mug de ADN, que demostró claramente que la integración de pSMA501 y pSMA502 estaba mediada por el inserto de Lactococcus cromosómico en estos vectores. Se sembraron en estrías diez transformantes primarios, cogidos aleatoriamente de cada conjunto paralelo de placas en placas GM17 que contenían 1 \mug/ml de Em y 160 \mug/ml de X-gal. Todas las colonias que aparecieron después de esta siembra en estrías eran homogéneas y azules. Las extracciones de ADN plasmídico de los transformantes no reveló ADN plasmídico extracromosómico detectable en la célula bacteriana. Esto indica claramente que los plásmidos pSMA501 y pSMA502 habían llegado a integrarse en el cromosoma de las cepas receptoras. En la Figura 18 se ilustra la integración de tipo Campbell de los plásmidos no replicantes.

Para estudiar la estabilidad de los plásmidos integrados, se cultivaron ambos integrantes en ausencia de selección por Em durante aproximadamente 20 generaciones. Las diluciones apropiadas del cultivo resultante se cultivaron en placas GM17 con X-gal y se replicaron posteriormente a placas selectivas, GM17 + X-gal + 1 \mug/ml de Em. En este ensayo de placa no se detectó pérdida de actividad de \beta-galactosidasa y resistencia a Em.

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(iv) Análisis de la expresión de \beta-galactosidasa regulada en cepas de Lactococcus que albergan vectores integrables en el cromosoma

Los siguientes experimentos se realizaron para analizar si la expresión de \beta-galactosidasa está regulada en la cepa MG1363 que lleva pSMA501 integrado de manera cromosómica (cepa MG1363::pSMA501) y la cepa MG1614 que lleva pSMA502 integrado de manera cromosómica (cepa MG1614::pSMa502).

Se sembraron en estrías seis reaislados de la cepa MG1363::pSMA501 cogidos aleatoriamente en placas GM17 (agar-M17 1,2 x y glucosa al 0,5%) y en placas ArgM17 (agar-M17 1,2 x, glucosa al 0,1% y arginina al 0,1%). Ambos tipos de placas contenían 1 \mug/ml de Em y 160 \mug/ml de X-gal. Los aislados Nº 6, 9, 10, 14 y 21 eran todos azules en placas GM17 y blancos en placas ArgM17. Este resultado muestra que la expresión de \beta-galactosidasa en estos aislados, como el Integrante 170 (véase Ejemplo 7), aún está regulada de un modo dependiente de pH. El aislado Nº 3 era azul en placas GM17 y azul pálido en placas ArgM17. El mayor nivel de expresión de \beta-galactosidasa de este aislado en ambos tipos de placas posiblemente es una consecuencia de la integración de varias copias del vector integrable en el cromosoma o de una amplificación de la secuencia de ADN cromosómica no repetida en tándem.

Se sembraron en estrías ocho reaislados de la cepa MG1614::pSMA502 cogidos aleatoriamente en placas GM17 y en placas ArgM17. Ambos tipos de placas contenían 1 \mug/ml de Em y 160 \mug/ml de X-gal. Todos los aislados de la cepa MG1614::pSMA502, es decir, los aislados Nº 7, 8, 10, 13, 14, 17, 18 y 22 eran azules en placas GM17 y ligeramente más azules en placas ArgM17. Este resultado indicó al menos un cierto nivel de expresión de \beta-galactosidasa dependiente de pH en la cepa Mg1614::pSMA502. Sin embargo, en este ensayo de placa no fue posible comparar los niveles de expresión de \beta-galactosidasa y, por lo tanto, la rigidez de la regulación en la cepa Mg1614::pSMA502 y el Integrante SB.

En los Ejemplos 7 y 11, los medios que constan de 1,5 x M17 suplementado con glucosa al 0,5% y 1,5 x M17 suplementado con glucosa al 0,1% y arginina al 0,1%, se mencionan como G1.5M17 y Arg1.5M17, respectivamente. A continuación estos medios se denominan GM17 y ArgM17, respectivamente.

La actividad de \beta-galactosidasa se midió en cultivos cultivado durante 17-18 horas a 30ºC en medio GM17 (pH 5,6 después del crecimiento) y en medio ArgM17 (pH 6,7 después del crecimiento), respectivamente. Tanto el medio GM17 como el medio ArgM17 contenían 1 \mug/ml de eritromicina. Tres reaislados de la cepa MG1363::pSMA501 y dos reaislados de la cepa MG1614::pSMA502 se ensayaron cada uno para la actividad \beta-galactosidasa. Como control de la expresión de \beta-galactosidasa regulada se incluyeron respectivamente los Integrantes 170 y SB en el experimento. Los resultados se muestran en las Tablas 15a y 15b a continuación:

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TABLA 15a

33

TABLA 15b

34

Se demuestra claramente que la expresión del gen de \beta-galactosidasa está regulada en los tres aislados de la cepa MG1363::pSMA501. La regulación en cada aislado es similar a la regulación observada en el Integrante 170. Las diferencias en los niveles de actividad \beta-galactosidasa se deben posiblemente a las diferencias en el número de copias de pSMA501 en el cromosoma. Sin embargo, es difícil concluir de estos resultados mostrados en la Tabla 15b, si hay un expresión de \beta-galactosidasa regulada o no regulada en los dos aislados de MG1614::pSMA502.

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Ejemplo 16 Transformación de Lactobacillus helveticus con pTV32 y pLTV1

Cada uno de los vectores de transposición, pTV32 y pLTV1, se sometió a electroporación en CNZ32 de Lactobacillus helveticus de acuerdo con el procedimiento descrito por Bhowmik y col. 1993. El vector pNZ18 (NIZO, BA Ede, Holanda), que confiere resistencia a Cm al hospedador, también se introdujo en la cepa CNZR32 como control de eficacia de transformación.

Después de la electroporación, las células transformadas se cultivaron en placas en agar MRS (Oxoid) que contenían CaCl_{2} 10 mM y un antibiótico dependiendo del vector usado para la transformación. El antibiótico y la concentración usada para la selección de transformantes se dan en la Tabla 16 que se muestra a continuación. También se dan en la Tabla 16 los resultados de las transformaciones. Un espacio en blanco en la Tabla indica que este experimento no se ha realizado.

TABLA 16

35

Se sembraron en estrías 10 transformantes pTV32 y 10 transformantes pLTV1 en agar MRS que contenía 10 \mug/ml de Em. Se inoculó una colonia reaislada de cada uno de los 20 transformantes en caldo MRS (Oxoid) que contenía 5 \mug/ml de Em y se realizó la extracción del plásmido de acuerdo con O'Sullivan y col. 1993. Las preparaciones de extracción del plásmido se digirieron con EcoRI y después se sometieron a un análisis de electroforesis en gel de agarosa.

No se detectó ADN plasmídico en ninguna de estas extracciones de plásmido. Como aparece en la Tabla anterior, se obtuvieron respectivamente 130 y 140 transformantes por \mug de ADN plasmídico en los que los transformantes expresaron resistencia a eritromicina. La única conclusión que puede sacarse del hecho de que el ADN plasmídico no se detectara en ninguno de los transformantes ensayados que expresan resistencia a eritromicina, es que el ADN introducido en los transformantes hubiera llegado a integrarse en el cromosoma de Lactobacillus helveticus.

Por lo tanto los resultados anteriores proporcionan un fuerte indicio de que los derivados de Tn917 anteriores pueden usarse de acuerdo con la invención también en Lactobacillus ssp.

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Claims (10)

1. Un Lactococcus spp. recombinante que comprende un gen que codifica un producto génico deseado y unido operativamente al mismo un promotor que se selecciona entre P170 y el promotor cadena arriba del extremo proximal LacZ de Tn917-LTV1 en uno de los integrantes depositado como DSM 8834, DSM 8835, DSM 8836, DSM 8837, DSM 8838, DSM 8839, DSM 8840, DSM 8841, DSM 8842, DSM 8843, DSM 8844, DSM 8845, DSM 8846, DSM 8847, DSM 8848, DSM 8849, DSM 8850, DSM 8851, DSM 8852, DSM 8853, DSM 8854, DSM 8855, DSM 8856, DSM 8857, DSM 8858 o DSM 8859, la presencia de dicho promotor dando como resultado la expresión del gen que se está alterando en comparación con la expresión del gen cuando está unido operativamente a su promotor nativo.

2. Una bacteria de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicho promotor se selecciona entre SB, P170, P143, P242, P224 y P163.

3. Una bacteria de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicho promotor es P170.

4. Una bacteria de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el gen que codifica un producto génico deseado es un gen cromosómico.

5. Una bacteria de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el gen que codifica un producto génico deseado es un gen extracromosómico.

6. Una bacteria de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el gen que codifica un producto génico deseado es un gen nativo.

7. Una bacteria de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el gen que codifica un producto génico deseado es un gen heterólogo.

8. Una bacteria de acuerdo con la reivindicación 7, en la que el gen heterólogo se obtiene de una bacteria láctica.

9. Una bacteria de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el gen que codifica un producto génico deseado se selecciona entre un gen que codifica una lipasa, un gen que codifica una peptidasa, un gen que codifica una proteasa, un gen que codifica un producto génico implicado en el metabolismo de carbohidratos, un gen que codifica un producto génico implicado en el metabolismo del citrato, un gen que codifica un producto génico implicado en el metabolismo de purinas, un gen que codifica un producto génico implicado en la resistencia a bacteriófagos, un gen que codifica una enzima lítica y un gen que codifica una bacteriocina.

10. Un fragmento de ADN aislado que comprende el promotor regulado contenido en el clon integrante de Lactococcus lactis ssp. lactis MG1363 depositado con un número de acceso seleccionado entre DSM 7360, DSM 8834, DSM 8835, DSM 8836, DSM 8837, DSM 8838, DSM 8839, DSM 8840, DSM 8841, DSM 8842, DSM 8843, DSM 8844, DSM 8845, DSM 8846, DSM 8847, DSM 8848, DSM 8849, DSM 8850, DSM 8851, DSM 8852, DSM 8853, DSM 8854, DSM 8855, DSM 8856, DSM 8857, DSM 8858 o DSM 8859 y unido operativamente al mismo, un gen que codifica un producto génico deseado, siendo dicho promotor uno que no está asociado de forma natural con el gen.