PT985043E - Culturas iniciadoras bacterianas do ácido láctico e suas composições - Google Patents

Description

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Ο-ΟΧΟη./ :/.3. . V" V a presente invenção refere-se ao campo das culturas iniciadoras bacterianas do ácido láctico e em particular esta é provida com meios para aumentar o índice de e/co controlar a actividade metabólica das bddtèdids do ácido láctico cultivando as bactérias do ácido Metido em associação com y® organismo auxiliar bacteriano do ácido láctico ;.|οο no o to tb&iàkKÚi.&iiD pltird. .00 ê defeituoso. Este organismo auxiliar ê cambem utilizado como meio para melhorar 0 tempo de conservação e/ou a qualidade doo produtos alimentares. i'd·: ;:·γ& do booi.éobod do ácido láctico são muito utilizadas na Indústria áliou::0t.s:o: como culturas iniciadoras para a produção de produtos fermentados incluindo os orodutos lácteos conto por exemplo 0 iogurte e ígottiòOí produtos â base de carne, produtos de puni fb.oaçáo itltito e produtos vegetais. · .-.···.·.· ·>.··.·> luwbu ata oro000to i.ovoo 3:3 o. .0 dtli.qooet da-sot/ K3 eo O: b.0: iâcilord ; e ie-..---33- bcctèrlod godo 0 i '0 ivódf mi to. 0torto ttono oor otuo^roor íJOO: :.0::.0 torottoooo·: OÇO.iO-0 O omít O òtoduptri do ártidoo inolad tdC: : 0 ácido l-ltdio -.0-:-1-/ ft 3 /-/ /X\- ,i. ..Ãi./ - /·;· ·;···. -3V3 fe.ts oodticts /*: *: /í:·:·; fAv:-vv;: -· :;··· ·:·. ·.·::·.·.·. ?·.·:··:·.· ; o ioi.do ;podoIdf;l,OOo d.» .000 t SM'::. 00 ao: 0::::.:.:3 X ái ;>/·>'· ·: ' ·/·/··.- ·:· :·:· ·:···:··-· i-dXv :,>· o:pl:il;ro:d:t:;; :ou loddtdaiu tã 0 0 0 ΟΐΟΓ; 1 :::!30Í00 r Γ as espécies Lactococcus, como por exemplo Lactococcus - ' , espécies nárdfitddobopaió

espécies Leuconostoc, espécies e cepécieB '.ti uir. Ta.a ínua os anaeróbios uua r1aou a·": fènoro t.riam são nuni.tuniaaaí-tu nrnpo :·ρ,ο nauuu.riua do ássiass i. ácasov· pwttmmênti i r:.···': -:\i ^vVíí; >

QcBcdo caso eeitera imoioaóõra bâct.01: iã.áa do âaãido ; oc i eo é ussc :.os. :oo ao xósusa -.o.; a ipsauspiiru aasoisa n;ptasa.ioppiPum:.K alimentar e se dão as condições apropriadas para c iCroooiidíOjXtd e para a actividade metabólica da cidltssra; iniciadora, as bactérias começam a propõgar-se após um certo tempo, conhecido como a fase de latência, doraots a qual as bactérias se adaptam às novas condições. Assim que a propagação das bactérias é iniciada esta é rfpZtiã com a conversão oíHíoooí! tonto do citrato, lactose o outros açúcares oa ácido :lnio:ttçn/ltctata como o metabolito acídico mais importante, e possivelmente outros ácidos incluindo o acetato, sendo obtido como resultado uma redução ao pH. .Mieicioolmeofco, durante g crescimento das bactérias do âciao láctico são produzidos outros metabolitos como por exemplo o acetaldeído, α—scetolactato, acetoína, diacetilo o 2, tpntãntpinó] ·.

Geralmente, O índice de crescimento e a actividade tt;nafeôlnca das culturas Iticiadcran bacterianas do ácido láctico podem ser controladas seleccionando as condições de crescimento apropriadas para as cepas da cultura iniciadora específica ua s 1 incón como por assisaimlo uma neapunutarn da

Ciaa uci o-arO: : anupijunaf a r :ÇS::p antrian'iuu:sn hvuian uai Jaaa àutid.u do uniu; ruma. aço.a ; das ; :'-ca dai o. ;x:.n.:PdUd,ó:.C Q.l m-mlt&rà nuas uraiuuliaairit: ,··· v:\s> :: t:·: é' v.· ·.. .'.V.· ·,.:. %> í''':í;í::U S i 0,- ’ ; saco pa u oidosl sabua 4 sabido nua uo

Habitualmente acídificação mais rápida do iaita laaaaladOv aata aaãaçáa a a trar da oaiaaaia a raal irada aaaaaanda o ^ ^ z s -5. '··',! ' , . ' . . ' a . . ou por um tratamento de aspersão. Os meios alternativos da raddçla da taor da aaiadaiiS iaaiaaa a .scpçda da aaapaatvt para a eliminação do oxigénio.

As culturas i:::'a:iaiada':saa B&oXMriar&á da áaida iàrtici rir dad 110:0 rtcrita ai:. 11 i pr:Pr: c a Iddaátrisi ldla-rh Par aramo culturas de cepos misturadas compreendendo uma ou rfortao aapàcias. Para várias culturas de cepas misturadas cama; par exemplo culturas iniciadoras do iogurte que normalmente compreendem cepas de Lactobacillus bulgaricus e

Streptococcus ráP forrem. PP foi detectada uma relação simbiótica entre os espécies, supostamente devido â actividade proteolítica de pelo menos una das cepas (Rajagopal et ai. J. [ )airy Sei., , 1990 73:894-899}. Foi também referido que nestas culturas mistas do iogurte, a a.::aaiaaj.i.âçlo do crescimento do componente Lactobacillus é devido â inerente do ácido fórmíco pelo

StBÉPiPPiBimÍB termofilus {Suzuki et ai,, 1986). No Pedido de Patente europeia EP 0 111 392 A2 é descrito outro exemplo da asalaçáó simbiótica entre as copas numa cultura mista na aual foi o que as cepas de Streptococcus thermophilus tipo selvagem seleccionadas têm uma capacidade relativamente alta de consumir o px.iípáílió que melhora a ísrb;.t€v.lrêacia da uma a,saánr.ca ck· Bi fiPohii c ar ri um estritamente aPáPádáira paamdo é combinada com a cepa de Streptococcus. a tdcrdáa at-iariáM aro rafara m&Mbm ar síí.: ·:·ίϊ.!:.:ΐ:η ·,ΐ L-muava; -ãa··· occpppprr qaa aPrafmarfa papsa sa:r aplraÉarl r:aa;a,í aumentadas. um objectivo prlnmnpim::. da pbbdèttb invenção é o de prover esse método. .;m prmcao ro nsperc - da presente iaaaoçia refere-se a um método para aumentar o tmcliet de crescimento e/aa aaat aatar a cctlvidecm aataPóiics do uma capa necmerdan-s de íPida ilmticcò morn eomccmedòe a eeltumis da cepa em associação tom um organismo auxiliar bacterianc do ácido láctico que no seu metabolismo de pivurato é defeituoso.

Noutro aspecto a invenção provê um método para melhorar o tempo de conservação e/ou a qualidade de um produto alimentar que compreende a adição ao produto de ama cepa bacteriana do ácido láctico que no seu metabolismo de pivurato é defeituoso, e ainda noutro aspecto a invenção refere-se a uma composição da cultura iniciadora que compreende uma bactéria do ácido láctica e um organismo occtluclccr bacteríano do ácido láctico que no seu metabolismo de pivurato é defeituoso, sendo o dito organismo auxiliar rapaz do aumentar o índice de crescimento e/ou de controlar b·; t· ''·-· .b: ·: o x -:,-C:.y; cccPCicctA de e meter ca eo uer A.·.CCS mc-ctrc O vç .-·:·- .···.- :: ·' -xá ··: v :·!·:· %v· ’·’** "*; '** '-· ··»*· .·. .·. v u cm qdm A ore TvmCC aí àd dm 1 :á :.vt. i Co em cu o emim rm c o z uma ene λ Ts-Ãi ?;.0 metabolismo de pivurato é defeituosa c na qual um gene capaz de regenerar o nadt è sobre-expresso.

mêt .···' vu:· ir-;·;·:-. ·ύ· :;···.··:\ <·;· ê d'-·;'·: ·:·.· :··: :·.···.· '·:· .·: ·.···-.>:· . - -:s ;.v >> :>-:· -5' · x,Vv,v-u v . í dado o d d : ·. ·... dd XI íftfí: \/οχ .X X.X·: X iX X.·:· 1 X- X· XX iXXç X-dX i X X:- iX Xxx t'. L -· x À.viX·· X-KX íi/¥;..·. 5: ·;;,·.:> i : : X Cu r :hxa x a ιχ-χΧΐΐ: acra PP v:Ò.Ç:

Sirgar: d ρηρρ dti<I I Isr b:uafcarlana <jo. âcadd lêAíiCú íp<s 0.0 ada ma t.Í5&:)1 i «o de diadaaiat O * 0¾.¾.1 td&SS .> BZKZmú&t^Súr-à que a melhoria do índice de crescimento refere-se o

Oito do aêldlda da caiipre iniciadora no aoio apôs: um certo período de tempo, isto ê as c&lstls-s bacterianas do ácido láctico propagam-se com um índice mais alto do que e obtido sem o organismo auxiliar, ou as células começam a propagar-se mia: ponto anterior no tempo com um Índice igual ou superior quando comparadas com a propdduçdo das bactérias do ácido láctico sem o organismo auxiliar.

Como é utilizada na presente invenção, a expressão "controlar a actividade metabólica" refere-se à maior ou menor ; . ; :: de qualquer metabolito produzido pela Ca*. X crc XXX- C X .eda.ia,· iccdu indo a prodadlía de á eidos, como por exemplo o ácido láctico, o ácido acd". ia Cy o doida fórmico e/ou o ácido atoai dcicc. Exemplos o CD •cs utros metabolitos d Θ à ·Λ·V 4. çi 1, g. -ç:: ^ cuja produção pode ser controlada, incluem compostos aromáticos como por exemplo, d: ataidIdabdaf *.......èttmcç.dcti:U.Cy ddctçipd, diãcçddld a 1,1- ¥ . O! snop 1 ioiil CDU tãdC-diól } ·, iP;: d'íX,À.IÀr\A;;Í d-.-ã :· vepçddj.. o ç rgprii apíd ddioidda X*' ' *X :X : ··· rd aac da :Xχ·:'.· d::;· xáxxX 10 : toa: nçíaldíbiVi iliap;. pirátu.ad i : diiddíl ' CfíiS d è atdido iida i raaiaiadia a . , a ida bja ::íai taaaaa d d dd i X-Xi: Ϊ. -:¾ £0 i. .L ii Xu<> p ç V. v Ç ç adldta' : d,d õ 00 'íidiLbmd anaoso. XÇ,X:X :d: :XX'X :;X'Q-X':XX:;X:X'-Xi<X: > dia* P Ai ia. da x :χ·χχ·; a aa : tm ÍÍÍÍíC pítúMm· aitídca:: :0: ^ t :χ: ç d.; -:¾ unis; diái úil χρρ rxvlP mxxtOCx m mriv m bstO :PPt:PPP dl .;Ps p. p:n:í:Pífpp Ç ΧΧΟΧΧΡΡΧΧ PXX Pp. Cbf P CCCx XtCdP is que o P;:'·cxccci ρρρ ρρη;·Χ ': \ '1 :d Y' •u: d· : 4 V; :; r'*-:··^:·:··*·:· :··.:« é:,; t: v/ww' IPOci beco para expressar pelo menos uma enzima seleccionada do grego composto por pirijmst .p; Ϊ/ · /.T:λ’ο:Ò i. piruvato desidrogenase, cp-p-p -····: desidrogenase, p pp f bbxptofcp S X P X P X XXP P , O X X p.;,PPtatP a iiçfPtPPP PPP cbiPrlcp cpçt cXpccCfP Χ^ΡΡΧΡΟΡΡΧΟΡΟ íi : pí::pc@p11 «bicxtspec ií. ti b .> > - CtP:CÇ Cp CXPPXPXX.P 1 nvprppPv P tçvpxpééap v * t,i ·: fà.i. :t .-i .·: PC PPP capacidade de expressar qualquer uma das enzimas anteriores" ir .dica que o organismo auxiliar quando eppparpda com a cepa de origem da cg a; á oriunda tem :;:?c mencr produção 34 enzima ou que a enzima de nenhuma maneira é expressa, independentemente das condições de crescimento. bxppxplPS de organismos auxiliares bacterianos do ácido liotict qusf são dxc.b:: xpopoc na sua capacidade para expressar pelo uma das enzimas anteriormente mencionadas incluem a cepa Lactococcus lactis subespécie Isczià IM213 mm é érntmiimmã po ρρχρρρχ xxnsxxpPtrD $ r-c; liase (Pfl) como na cítricó: lactato desidrogenase |1#Ί e a copa lè-&túú&££V$ lactis lactis DN224 que ê defeituosa em Ldh.

454 v;,y·;, ;··χ g ,:^. /0 ,:¾ . r ao;';;: 0 organismo ~ ;' aaa maaa a a arreuau apenas a asiarra irui:.:a,u:a . A inôdaiadc; acra apenas % mlt ccua-aama com a aaltura ar praarSCiCr: inveabáu da da r, ba iaaaáaia 0 essMaPa da prcamsr ça.ií':- macír -5 Cd 03 após 3 horas cr css baB pala manar 0 F1 aam aru': uiaara io cara àpH de pelo ao ílá ar ibcar i,: como por exemplo ui 3 h a mar c íc mis de j menos 1,0 após 3 horas ou mais Em formas úteis de realizar a de acordo cora a meio inoculado com ::¾ o meio denominada por exemplo urra àpB de pelo iniciadora bacteríana do áiriaa Láctico ê uma cultura de cepas misturadas que compreende pelo menos duas cepas de bactérias do ácido láctico. Nos exemplos que abaixo são descritos são dados exemplos deste tipo de culturas com cepas misturadas, Assim, em formas particularmente proferidas de realizar a ácaacqio o organismo auxiliar é capaz de aumentar ο irailca de .unmlmd o de pelo menos uma das cepas da cultura das cepas misturadas e/ou é capaz de vi uearviuraa m&tsbdlibb da pa.b uepas ao oaiPrrc a r·: cepas baal:si:ia:ri.au do ácido láctico· p°de que não sejam cumpridas em rodos os aspectos - .· caias as rsaaPrbi ÇÇ. rpm: ' aba mosca Cita irisai á ceara t.caas P:; -o; rcaç cassas cari? raie' uu scascas Pâirt@:ciaca:B miscerMas Cia riba lictccm acu mu rccs ici^aaacpaj, s sisisbblisB ac ::: ··:::< .··'. ·. y ···.·>:. ,.···:!·ίή '-..ma rcac ccirrrjy;;;p.p:y *vi pode MO saiaai ieva-rr: aa que bacaçs ca na piaca-apao esc r;afab-alrraá baaspadea; ocra ama ou ras cssbabas 7/54 lUÇtíSçfOç· ':0- 10 : :S|:: í :> :::,11-1 .·'>::- :.-.1: ··ρ '·.·.·'·.<.·' -·· ·· di o oioltbo: ot :,000: ilbbbiCro 00 lOlpsiO Oii A ao .0.1 ί·:·:·'·ν· -0; wv 0‘ >·:-vd.-d· oò ···: :··: ''d.v 5 lobiiboioi oco: iib iatai.ma.mm 0O10 i.l. .ior do. dorredo CiM -:d: io:o^íiiiçdo ο ·ψΜΐϊόίϊ· oco:. id v'ç; λ λ/Α; Xi -A. ί νώ· b/:db'q,x:: 0 d'd'Ot.O'íi::. 0 0,00 ;S!:ÍPt.d:té;do.O d:S •bOlCO s-OO <b :; o o di.ibi. íoíOíIo- β d.i:iii d;·: iOi :3500 .110 íptOOOb) OO: 0:0.1:11:10, idis oo 0.0 qõodoçic; 0·; y W& vU sosio cotocoilitorií ·:' ·:·'· .····· .· ·.· h :···;:··.·.. Λ. ·:··.-·.·· d \Ç..· dí dy .;d d;·:· ·.. OÕ t OfOiOiOStOO 0.0 ...odo.-d·. ·... d,. o r 0:1 :.oos i-iorocçoo· 1 o f oro cor ' ΙΟ OÍO o oo.io O0'i:OtíOild r

Habitualmente, a produção industrial dos produtos alimentares inclui fases do processo como por exemplo a mistura, o bombeio ou arrefecimento com às quais se aumenta o grau de stttr&ção de ddigénlo no prcoioto alimentar e, como resultado, a matéria-prima do produto alimentar pode ter um teor inicial de oxigénio relativamente alto (grau elevado de saturação de oxigénio) que é i, para as culturas iniciadoras bacterianas dc ácido lácticoo Acabamos de descobrir surpreendentemer.ee que quando a cultura iniciadora é cultivada numa matéria prima do produto alimentar com um grau inicial de saturação de CòolpêniD do obl ou mo.is coro por 201 ou otuo em associação com um organismo auxiliar de acordo com a invenção, c soo índice de crescimento é substancialmente tltlbdr udo s/oo o o* rr i iloidod® mor ορό bico é controlada quando comparada coo. a cultura sem o organismo auxiliar sob as mesmas condições. ido fiorio o ritrOio db: obdibodict o inoçovolo o ordSddoito

'·:} lO::S 0O 1 1 :':V.: O 00 01 .:. 0:0: l OO- O l OO 1' :: 1.1 '1 OO Λ ::;1:;1 O quantidade de oxigénio existente no meio. &s#iís* em formas õ..icoò,oo:o>orrr-o oc ã.dddõly 1.00: lOnbLiioro a 0 0 ::0.00 :000: ο.ο·ο: ί : i é redu z ir o 15110:1:.:1:11011:01 i do qéo.lo oi:;oi:.s:toooç 00: 0:0 ic oo όοιΙ'Ο ίοοοοο 11 por òinoo peio 101 por hora, assim como 201 por hora, por exemplo pelo menos 30% por hora. Inclusivamente, a rM&ã-ç&Q pode ser pelo menos 40% per hora ainda pelo menos 50% por hora, como por de pelo menos 60% por r , goo οχΟο:ρ.ιο de pe’ o menos 70% por hora, como por exemplo de pelo menos 90% por hora de pelo 90% por hora, 0 mioiodo para aumentar o fmiím de o;:ooooi:oootii p/od para controlar a actividade metabólica de acordo com a .ííãwrçSíO Idp.líoa que m maior índice de crescimento pode ser obtido s/pp o cdoOiPd.lo Pd actividade tiêosddl .lei dá edilo ;o« iniciadora bacteriana do ácido láctico inclusivamente oioo meio que tenho ooi grau baixo de saturação de oxigénio, como por exemplo na margem de 1 a 101. No entanto, o método pode ser partícula "e útil quando a cultura iniciadora bacteriana do ácido láctico é cultivada numa oiodâoda prima do produto alimentar com uma saturação inicial de oxigénio de 101: oo mais, por οοοορίο 20% ou mais, coco por çxáffidlc 40% ou mais, por exemplo 50% eu mais, ' ' ' como 60% ou :c;dmp por exemplo 70% ou mais, como por exemplo 80% ou mais, e por exemplo 90% eu mais, címc por exemplo uma saturação de oxigénio inicial de 95% ou mais. ioicglppioo^í u .C. oo-g amiidço OdX:i 1 pop; i iPO OO r:dpp:dip d<s : baiPidrdo OO áílidc·· d .4:1’"'t i Õ'i idílio rodo roo p:roooi.odO' •1 \··ν > '>λ';0'·, ·'··: :·Χ -:···. ,χ. 10 c dcoU· ·;,,. Λ> p oioproo PlSOl: ' Ol cr iv o do dá OSOS ido C t lOilO; 001 iOX(ÍP ιροοο; iiOíd*' í ΡόΟΙΡΟΡΟού i:m. no. O · 10:"·':" Ç 1'ço di,:0.ç::d;::d:P:Pi-Cipo;:''idi;g; duo É dOSidÇiSii: )i::do:|c CC iS C. t O: ή. -d Pidod t; Γ: ;·; rd· dtd d j iddío :-d .xo oo xi dijlC ppii.Çíi odpi diO; ui cm duiod iclc ddçác: .ido I|0 01.00: dOO lid POPOO oo ooioogo11 0s .f COO 0 11 dm.i.idúd-y PP ΟΡΡΡΡΟίΟ CO OOIO OSOO ΟΟΟΟΟ^ίΧ'Χρίρρ 'áé liO;p:;kl ld;C CiÇO iClpÇ: 0 :pdt Çpii';diiϊι úu p.:pp: :110.;·.X1 p; OOl.i o .1. ..pOsí; 0 OS) OlOOΙΟΟΡΟ: < 10 d->S OOPOPí: Ud;did o ::>de POP PO OOS IPlidlOOtOPildO '1:10:0 CllOPO: d Piddl.d'0 ÍC:; OíPOP, do o o i .;po o-i ;> dd o d o o o i o· o o 1

id-íiÇíSC incluindo o tratamento com iuulqqotuoo sads'·. fuodóu ser nut por OOOOí. our ou Uc: :'>.··--:¾

M ΟΟΟΟί UOU ;· ρΓ-ν; 0,- „ ' ' Estas modificações genéticas podem ser obtidas por técnicas conhecidas ta especialidade

DttO iíti £' tt;d:ltÍCSÇ:õat iucO' o tipo, ÍtCtlt:d¥dO íH técnicas de recombinação de ADN, a dirigida ao sitio, técnicas de reacçâo em cadeia da polimerase, mutagénese aleatória ou quase-aleatória utilizando qualquer uuboupiotfiu mutagénese ín uliro ou qualquer outro m&toéo conhecido para introduzir mttittlcsçqci genéticas uo substâncias que compreendem ou são derivadas de ácidos nucleicos de origem natural ou de aminoácidos. De acordo com a invenção, o derivado de uma bactéria de ácido láctico pode por exemplo uou a sua origem numa espécie Lactococcus, como por exemplo Lactococcus lactís, uma espécie >c „ 1 uma espécie Streptococcus, uma espécie

Leuconostoc, mm. espécie Pediococcus, uma espécie Propionibacteríum ou uma espécie Bifidobacterium.

Neste contexto, uma eu piuto t preferida ê a Lactococcus imatím itttdttiudo Lactococcus lactis subespécie lactís a variante Pictruittcú diaceylactis. Exemplos de organismos auxiliares são a cepa de Lactococcus lactis íiubtdfçésit iaótiiu íMiiij que fui depositada com o ncouto de ti tititO O ÇOUO OU Lactococcus lactís subespécie PP q..:.. tot uoúusttaf 1·:\ν U'.ti O 00 <m mcicio dm ... ... · --·: .. xcxcct· ···· x Χ;.·'Ϊ::.;::.-.·:ΧΪ .'.1 ;ΐχ x.· ixç'á.0·: 0 0 c 0 0 uo 0 01 · x q:: ·-'>p:- ^-Λ .s v : vai ç;í xt.Xxtc iúlui do ou o ouèuui.u uuguittto: 0¾ para q iU0U:UUuOU:.: 0 bustão cepas. que os derivados, como por exemplo as cepas o datei mctai têm; em relação às da sua origem, voa pandic;;!::::: rtídii tilda; íis ÉtidOí são part icularmente 0 ãutuÊflto do índice Se crescimento e/ou da actividade :;ν':ώ· n ivitd;; :: a t:;.* fgtiiiãvf :·;'; ·: .¾ d-i obtida pelo método anterior pode ser idv!; C:Ú 11 LW&úÊO a cultura iniciadora em qçs: suporte o crescimento de bactérias do dalífc lácticít, Assim, o efeito pode ser obtido numa variedade de componentes de produtos ou ingredientes alimentares como - 1 exemplo o . a i. c a , a carne, farinha de maaaaa alimentícias, oicta frutas ou cereais. .< e matérias vegetais, oomo hortaliças, & cultura iniciadora e o organismo auxiliar são adicionados em quantidades para produzir um número de células viáveis de cada componente que é pelo menos 10J unidades formadoras de colónias (CFU) por grama de matéria prima ao produto s-iiaectar, como por exemplo pelo menos líl ccai/g itai/iaiada pelo menos 10* to Π/g, cama por exemplo pelo menos b;t" t?\ por exemplo pelo menos 107 como por exemplo pelo menos dre ggf por οχοίϊφίο pelo menos 1G9 Ciat/gg como: pot tiamplo t íêio caacaa IO10 Cali/a.f por aaaigto palco menos 1QU C:FÍlt;| dag ; matérias primas do produto alimentar. dà au Λοο-οί-ϊ taccoris ma da acama láctica aa-tla na aacaaa da lOítn a laitp.. COM ç oor a. -= t . ' a l;5Ca cor exemplo ria aaiac; gat de 20:1 a iaat;f ~ a n C: aaaanla a a margem do 10:1 a 1:10 ou na margem de 5:1 a 1:5 como por exemplo na margem de 2:1 a 1:2, regenerar o Ebif, Párias das enzimas iitbol.vi4ai no a Ldh são rapazes desta regeneração convertendo c oiroorde em lactato, no seu metabolismo pirúvico tenha um defeito que implique que a capacidade da cepa para regenerar NAD+ seja reduzida, e portanto h& a necessidade de formas alternativas para provei a quantidade requerida deste composto essencial. Uma destas zarmas sb zsruuo : ··:, ^ que ddritá disptttiçel de forma ííãtttâl nas bâccêrido do ávido liótiob g a regeneração por meio das NADH oxidases das quais foram referidos três tipos (Condon, 1987). As duas primeiras são flavoproteínas na-hemo, uma das quais cataliza a redução de Cg em ddb:í e a outra a redução de cg em H20. Um exemplo deste Ãltimo tipo de enzima, isto é uma NADH oxídase forma H20 é a enzima codificada pelo gene nox. Esta enzima regenera dois equivalentes do dMd sob o consumo de oxigénio.

Consequentemente foi ; . que o efeito do aumento de um organismo aotltiar de acordo com a il:baggç:Ío pode ser adicionalmente melhorada com a sobre-expressão de uma eciiíM de rgdoçáo dg cg ;;x:gçg è de consumo dó 02) incluindo a enzima codificada por gg gene nox existente no organismo. noutra forma de realizar presente do uma erctimg ψιο é capaz de regenerar ei Mb que sobre-expressa c gene. Assim, um organismo auxiliar que é capaz de sobre-expressar s gere que codifica a enzima que ···':: o preferenciaImente expressa o gene a o.m nível que é palu caco a: 10% ícrn n.cínç do ooot s nivísl a otoo; 3 gene é expresso na origem como por exemplo pelo menos 25% maior, por exemplo pelo o> 50% maior. É particularmente preferido que o nível de expressar; seja pelo menos 100% maior do que o de erigsmu A sobre-expressas do gene pode ser provida por métodos que sdu conhecidos na técnica como por exemplo ludrííddo.ir tio organismo auxiliar várias céliiao do gene no cromossoma e/ou coo elementos extracromossómicos lootoiacd) os plasmídeos, fagos ou cosmídeos.

Alternativamente, a sobre-expressão é 0 resultado de ligar funcionalemnte um gene ou genes de origem natural cem o organismo auxiliar ou cm gene/genes gue é/são insertado(s) no organismo para uma sequência reguladora que aumente a expressão a nível transcripcional assim como a nível translacional. Neste contexto, as técnica et .1.1 é a £on§f®nalmente ligar o gene a um promotor homólogo ou heterólogo forte que opcional mente seja um regulável. Os promotores interessantes são os promotores ARNt e ARNr incluindo os promotores PI e PII e a promotor descrito no referido Pedido de Patente WO <

Cio ccoooocou:' mm .lixo 1 que regule a cocço; 0.0:00.0; dc gene do codificação d-i; \iíM :Ví.C.Ol.?Ot de .50 0.::0000: Οός áo d;S llold pode 1 Ο·'0:·0:::?ΓΟ··: ϊ i··· ser regulada 00 0 os factor seleccionado de oodea 0 pH, ϊ :í: ::0p«;t;i;OCLòI:S O-S tttt ocoa oorcl dçãii do t oodct ttt ota: que 00 :..1.1.-.: 0 CACOÓl: tios de genes de otoop-o· térmico, o tetç-t :·:···:· *:*·· :::r:-*·**. :··<:·:-··:· »\·:·:·;·ί ·:··. :“···.:·: .··· ·<·.··.: ······. ·.·.· 0 13 54 precursores de udid crescimento/índice de o.i sos de tcsc imolo purma, c da bactéria. a fase de èisbéic possível obter om íccscímsss asxili» com cm mio- ccrdl dado c®sstctsss.;

UO llCll S-I C COr;$ i.CC sciccsiscs ds enzima modificando por exemplo a s&gsêssiá de esclicicsçc: SíCíclssiccsisccts por c#C:Msc cm etc sccSsciccc ser se. No presente contexto, um smefrio de uma smim regeneradora de NAD+ adequada é a NADH oxidase codificada pelo gene nox.

De acordo com o presente método, c organismo auxiliar capaz de sobre-expressar t« enzima regeneradora da Isis' inclui um organismo onde c: enzima cataliza a ιοιοιρόο de Oo em H2 ou em Hm.? çsc exemplo a enzima que tem a ÇEQ ID N°: 2 como a abaixo mostrada. Em formas de realização úteis o organismo auxiliar é oroo cepa Ldh~.

Como c anteríormente descrito, as cepas bacterianas do ácido láctico que são defeituosas no seu metabolismo pirúvico incluem cepas que são capazes de num meio reduzir a quantidade de oxigénio. Foi descoberto que as cepas deste <. :.ptu quando cio utilizadas sozinhas, isto é mm a adição ante de una cepa da c-.;d li ico iniciadora, podem o míope· de dcn.oo.t ooqÓO dos o imolo:! a 1 ine n t a re s. • ' · f d dcl.ro : 01;':-101 OVO: cio iiicócpoo or ovoo um D d 1. d úVloP :o OOtOl o t empo de conservação e/ou a :0 dC 00; í Γ P ‘j: *: : y- <V: yd d·· 1V:>V' < o.,,:··-.,-·: ·: o.-.os.-v- .? 0.0001:00:0110000 0 imolgoc 0;í:;> Ce CCC OOpO 000 0011 lo OOí CU ; mdeo lloiívc çm ro :cd;clicmc: Po 1Ρ-1ν:ν· Λ .·.< <” ·:ν. ·ό <::· V.-íA-S;:: ή ;o dppnp: CfWkò 0 ··$C' .iS > / pi ", na presente invenção, o deo 1 coo odo 1 g':i ;iç:·'>'/> *·v> OC. D P άθ PplOll: m ' «;·; esoxo tm caioRus.: ::.0.0 > ouoa 10 rua PP sas I vx·'·..· x. Po .lâotlao oXoXçi ooO à-dúo IPosioa los li, U InOçd uma psoPoos c âcláo iáati αα. íz&çào. útil, a cepa bacteriana Soo 000 oroPupta reduzida de cepa que essencialmente não 0* ai y. :ç":. pto, !ívi vi¥ «:·.· .· ·, v.» 1» v!! psr:Poic:s alimentares inciin uma cepa como a anteriormente descrita onde à sobre-expresso um gene de codificação de obs osus:oau ato è capaz do regenerar UMf incluindo as NADH oxidases anteriores. C efeito de aumento do tempo de conservação pode ser obtido nww variedade de componentes ou ingredientes de produtos como por otiompio o leite incluindo o leite não pasteurizado (cru), carne, farinha de massas alimentícias, vinho e matérias vegetais, c-mo por exemplo hortaliças, frutas ou cereais. tomo é utilizada na presente, a designação "leite" será entendida que significa qualquer tipo de Leite ou componente do leite incluindo por ooomplo. Leite de vaca, leite humano, leite de búfalo, leite de cabra, leite de ovelha, produtos lácteos feitos com o leite deste tipo, ou coro: Pa leite. 0 iPdP cP a s Pa a referida remove por exemplo a componentes ou 00:00.¾ IrPmriooas culfpsa rzoto:: (asa do IciPo Isosioo suara o uxipduio depende das condições do meio, temperatura. Sendo as temperaturas Pus sasroa.tusso::.' do prssjotó oiisoiiSss sssitss â taspáratríPS sssPisõta* asso par osospio por r xoop: a oasiso d® S*ç'.f a iadiaa soo o Círa s õ ·. X·. v a ê i' ·; , e iaf φΐίύΛ •Oví: ia ao p f :': j: : : no ) soas sas tão Po loa a soa II por popoa pa adau o; as na

Quando é utilizada de acordo com o dldodlo ao i>a;tiedJ a

Ι^ΟΟ'Α'Η .OOK à.i*< · !::· v<";: .·.·.,·.·, .¾-S :*.··.. 1.0:: f-4 .,·' ::·:·>· .:\'·:νί·":: A · . . ·' ·· · ·· ···· .‘· ··· · ···.·. ·.·.· ·χ..\ν x--.-y·.,·' :., ., ·.. ο: . ; . .sο.ί..-i. · χο,;' Sx preferencialmente misturada com o produto alimentar no idd&r de produção. Assim, a fltnio do exemplo, muaMo o iiiódot·::.: á,iííM's::jiar ó leito cru não p.a;ç:t:0:í;;::jt1iiusdo f a od.it d ta dt: d o ,1 <1 o lâcíolco: pode ser míichmiMM e.o Isito na exploração produtora de leite depois da ordenha. o cultors é õiii'00:000:0:0 ao leite tranco num tanque do arrefecimento na exploração produtora de leite eu num tanque de armazenagem numa fábrica de lacticínios.

De acordo com o método da presente invenção é também possível obter ao aumento do rendimento da biomassa durante a po-ooiapât da cultura iniciadora num determinado período de tempo. Assim, este efeito pode ser obtido quando o ml-êm® da cultura iniciadora é aumentado gradualmente, ao que também na técnica d denominado como "sistemas iniciadores de fermentos".

Como foi anteriormente mencionado, a invenção noutro aspecto provê uma composição da citltaci iniciadora que compreende pelo menos oca cepa ds uma bactéria do ácido lâot:ioo ig um (sr-|d.n As??to surdi ia.: bat:tardatu) do itoidio .1001:.:1.0:0 no modo descrito anteriormente que no seu metabolismo qi. +MÍ oo é defeituoso ogíoo tonÉíêO: j 0 descrito anteriormente, incluindo um organismo ao.x.11 lar que tem ss :o:o"doodo terõ::; rodã do ácido .: 1..·.....00 oo:oo 001: imocnpoo uma oo:o-';- CIO :Oa:SOxriO.Ísold«int« olo p.ood0:0 :0::::100 100::.00 .· daélsdiddíiidf 0:¾ tO.OiÇO .· .-Ο --: . V.- '-x-tC: Os tido sOOOOt ::00:: 00) oascoa tioo; 00.::0 fo.ota 7' 0 0 0 0: : : 000 iácluiado 0: Οο-Α'χΚί : vhiáx:- :i.CxõxX:'AÍÍ- v l.S * -dia o 0 I lofl .Ll;s.odd.s A.:xç'- :p:.v·;.:x • :;:px·: :··.Α· A:·· A :>-.Λ: ς À: / ç 0 j .:--0':i ·:: : .ss-O Is 1:011:::) oAaoo exemplo pelo menos por o rama: da crimpóai cáco 00¾¾¾ por ílillifg iw:ilPi:o.úo 'mio ooomo 2O7 Ciolisq por omamplo peio menos 108 Põr/o, por exemplo pelo menos lOi0 CFU/g, como por aossmplo ροΑο menos IO11 CPU/q f como por , pelo menos luSv CFU/g, como por exemplo como pelo menos 10iJ CFu/§ da oompssiçllo A composição pode conter como dofpppoppfps aiilcl 000 1 s 00 i op r orteoáoo· oo 0 / oó adi t 1 voo convencionais ].AAlcic:do nutrientes como por exemplo 0 extracto de levedura, açúcares c vitaminas.

De acordo com a invenção A ainda provida uma bactéria do ácido láctico que á defeituosa em pelo menos uma enzima envolvida no metabolismo pirúvico como o anteriormente descrito e na qual 0.0 gene capaz de regenerar IMd é sobre-crprcccfd incluindo um gene de codificação de uma enzima oco cataliza a redução de Cd para H20 ou para ipCq como por exemplo uma ' ; \ oxidase incluindo a enzima que tem a SEQ ID N°: 2.

Gomo foi anteriormente mencionado, a invenção provê ainda um fragmento de MM isolado derivado de uma bactéria do ácido láctico que compreende ca gene de coiflItcaçSo de um exemplo um íicaaaaata de ADN que é seleccionado do grupo composto pela sequência mostrada na SEQ ID N°: 1 e uma variante ou derivada desta que é polo menos 50% p-oo λ.V, eOqÇ.Ç ; r..-: 0 :Λ::::.' .:..¾¾... U- :: 0 .. ν.·':; 'V::‘:-.·Ό compreendendo ίοηοο fragmento de MiL No contexto da p ro 0: o o l.a oo o <; á o a o xp o o o xâ(:; ” xo.:. l o ot o o s.; derivado” :::: :. ::V '' .'! : ' . ; ’ ·. J ’’ :::. Z. : , ' Z U C::¾ Z: Z. :¾ U: :: .V: Z.:: : ;; :..¾¾ '. .. : Z ... ZZ: ουΙ'Οΐ; iltoiiçlíc., oúi.ção ou carlaogáz; oo cm oo maia ÍS4 a .1 aumoatlio ê liar zoada mais detalhadamente aos s^uimt-ss ooaoioloo de referência, e deoeaOoa em que: ÁÁ ίΟΟοοΠΙ: 1 iHuít.OS O ítlOZOO OD3 OoCU.COU dO açldlíIõOUy&O: da cultura

Oo ; 1 CU ItlUZSdO ÍUUríUdtO UO I ditU I.OZOZ. to OOUCO pastoarirddd a 3Q°c OOoOlú em peso) e em associação com a cepa de

Lactococcus lactis subespécies lactis ddldd e DN224, respectivamente, nas seguintes i 0,005% em peso, 0,01% em peso a 0,02% a-o p®oo, ò. figura 0 ilustra o efeito noa iMtiv€& de adioilÁlisavlo da cultura iniciadora bacteriana do ácido láctico mesofílico lo-õi cultivado sozinho no leite inteiro οορο.ΟοοΙοο pouco p«á-t'$m:l£sd!b a 30°C )0:,011 em peso) e em associação com a cepa de Lactococcus lactis ^ammpécim lactis DN223 e DN224, respectivamente, nas seguintes concentrações: 0,005% em peso; l em peso a 0, 028 cio peso. A figura 3 ilustra o efeito nos índices de acidificação da cultura iniciadora bacteriana do ácido láctico mesofílico B-ll cultivado sozinho no Leite desnatado :mito piOfouf 1 taoio a 30°C (0,01% em peso) e em associação com a cepa de l&cti.s subespécies lactis 1:1)223 e respectivamente, nas seguintes concentrações: 0, 005% em peso; 0,011 cm peso a 0,02% em peso, ã. figura 4 Ilustra a pu mo flcaçoo do leite inteiro pooto

poot oorluaòa: to 1 r í ····.; : · . ··. v.v.·.·.· lOÇOU ... O .. ,:V:Z: 0 OáCu'· or .0300 òo ácido; làzt > hl Ροή;;;·') Of i f gvç): uimOOO:' (ίΙ,ΟΙί'ϊ 03O DO:tO ' , : : :.0. OtÇO 1. OÇO UV O-C:;. .. ... :p; p v -·>·; Vp p .% /·;- 01 ' > Çíp:.· U:'ÇCp':.:..Ç à >' ··-:··:·:···:·· 1 OO; O-OSOí ·.: ΪΟ- 3 00 t;.o 0.00 oo toaC:: oo; • ·. .>. .·:·;· :···.· Ò d;, f '· 3). ,·:·\ 2:023 3 03 00 33 ota PO : : roO : :·>·· Çt | OÒÓíOii i 1 O 3-' 5 ; = ί :¾v ?·) a αο raatsuaiaaito 1))333.).33)3 coai .loato inlmiro a c-uoi&s da iogurte YS-460 0, 023 em 33.32 33 1 33 3'.: á :.3.33 láctlci 3«3:;33>12 1Í33 peso), c 333331,)333 auxiliar DN224 (0,003% u;” peso) e 20.-3 61 (3,020 3333 33.3-3,) 3:3 3 ii: :333:.),33.2 :3 33:3) DN224 33 03)33): í respectivamente. 3, flqm: tido 3.0 pilo t poiitd ,::113 33 3 333:112:1))3:223 3)3 ipl 33:3 tfô;,.·: .i. ):::333 .') 333::.) .Í.lidíi: 33)2 3 .ti): igtMm iogurte iniciador bacteriano do ácido láctico termofílico Ύ:· i';'.:;’.': i. o * tôt 300 03v:)3:3 ,· 3) :3)3:3): :s 1,))::33.:: ,::.:. .:.:. .:7,1) ))3 1123 l);:lr10l3Í: 33: 3330) O ::00-2 61 ::11,,0211 -3 1)3:3:3): 33) 2:3lií::::0::1:3:):2 ã 3 CM 1)212211 .33 a O'S;v, y ·.·.«: ·:· . ::·??'.· 3 3.1:, ·;? .··. - xd '.·.·:··.;· ··.·:' 33.5Íp2)2t::Í 3:32)23211,, 3. figura 6B li-ú&t. 33 o efeito na concentração de oxigénio do leite inteiro ecológico pouco pasteurizado inoculado com a cultura de iogurte Iniciador bacieriano do ácido láctico taimitfllldCí YC-460 (0,02% em peso), o organismo auxiliar HídOc (0,0032 om peso) o YC-460 (0,028 em peso) em associação com DN223 10,0031 em peso), respectivamente. is figura 7A ilustra a acídificação do leite inteiro ecológico pouco pasteurizado inoculado οο-ι a cultura de iogurte iniciador bacteriano do ácido láctico bii-iid OOvIiil. em peso), o 333331.335:0 3 3))1 ll.®) 33121 em pGilol; s iC-ito ollOol gd. piíiil sm asscclall

OliOt em pmso);, respectivamente. .Ilidi::))!) 1B .2 :).:.¾\..iV m: 11 0::1.:.ai.;. 13 3:3 3 3))333133333 íid ítlilO): 1 .·)·. .-.- .x-;-: ·-.··· li), )':): ),)53.3.5): 'o eColDíji-Dv·: ΪΚ :li:. !\s iv.·.·; * i 3 3 3,31 3 333 333353)33.3 .13:") 3 3 11 3.))3 : ll): Í3 li 333 3 13:1:):13 •o tia? Bcí* )t 3 )1:3):3 33 lá 3 Idl 13 :)3 1 33: v-vj;::": )3 ): ): Vtt„ x. x; çi. 1 pç -1 '·.. xlàl v'0' .,\· Ο d:·:;: 33) , 3 3333):133¾) 3)):3 .11133 l'l:.:;3l' ίΤΐ,ΙΟί Ι) 1 .« V(\v. .:.······*·. /·:··. mcolY' •1 ·: 1 ·ν·; 1 v·' .» ;·; )v. 11 Yl 31. ..:-.2¾ :'· lá :·. 1 /.vy.·.; s pw;;;:4 ipppp í 0) iç'a'1: i·· 333 5 33333311 33)33333 Λ a. ftdooo: 00! 20 outro :¾ O ) f í,;' '··»-· 0 :)-.:0 -lo) p-OUOO :)0-0-: mi 00::)0 )o \X.Xi: .i.UtOO··.! Í:::ÒoO:o:d)):)ò dâtt€::f ):000: Cx*'< Ottdao ; láctico imx isvioiro cultura )2,21¾ em peso), 2022.0 (22 201¾¾ e. peso) o Iml p%ml em associação com * , em peso) ·

λ o/noto aís iiomtoo ;) ííDsitP do concentração 22 οοοοςροοο cm

CttKuxa iniciadora bacteriana do ácido láctico mesofílico o...:.)· (2,211 em peso), DN223 (.0/2015¾ em peso) o B-il (0,01% íSft peso) set a.ãi;;:íÇÍ:;S:iÇlo cot: 0:02:2)¾ ίΟ,ΟΟΟίο! om posto . A figura 9A ilustra a acidificação do leite inteiro õCQl.ôdióò pouco pasteurizado inoculado com a cultura iniciadora bacteriana do ácido lâotlco II co B-ll (2/211¾ em po-so);,. DN224 (2),2)0121 em pooo) e 0-· i(0,21® oo peso) em associação rem DN224 (2/00.121 em peso). A figura 9B ilustra o efeito da concentração de oxigénio do leite inteiro ecológico pouco pasteurizado inoculado com a caltopo iniciadora bacteriana do ácido láctico mesofílico E-il :0,00.¾ em peso), DN224 (2)0000/00. em peso) e B-J.l (0,000! em peso) em apsOAlaçOo com DN224 ::0,0)0(:2% em peso).

O . a. v

i a! a n rnO çOoo de crescimento 1λ 0 .c.imt ))c : .:':c:n meios a

do® oossoiplo·:?:; do r:of:ffi:olo:.::.:.:io (íotOíS :mm m od:.mp ).4.:::)2O idOt)).: . >.·‘ 0 «V. :: :ϊ: ç lá:: /"/ ’ 0 ç'/(

Foram utilizados uaizo inalou da oruas (i; siti.it M17 (Terzaghí et al. 1975); ti 17 O ííssio :ÍSS. t Π1 ilsí Ui':: fU.l!Íp«U: OOÍli tUiíi 1U 0 U 10! p"U: -UsSÍS j 1’ &> Ui, 1995) UiiVUii P':.i OUU; iíMêtãtú do 0:Χΐί.:0 lOO OU ifiopU;:, respectivamente) . 0 oaós DN não contém, ácido 1 ipòim; mas foi couplotiodo com formato de Na a uma aòáxaátrÃç&d de D,€i.; w (iii) ueite desnatado . , RSM, contendo 9,5% de leite desnatado em pó com tratamento térmico a baixa temperatura ) 240 lh, ME Foods, Dinamarca).

As coças foram cultivadas a 30°C o o crescimento foi controlado com a medição da densidade óptica (QD) a 600 nm o pH. As condições anaeróbicas para o crescimento em placas de agar tuúuu: obtidas por incubação num recipiente οοιοιόοΐοο com a utilização do sistema Anaerocult© A (Merck, Darmstadt, Alemanha) . Daqui para a frente, ooialiçoos de ooaxolioooto UTtiurdd^Iouo paru cafitioosa no oaio liauiõo significará ciill-atas oao aqitaçdo o ouliisras aeróbicas ®1¾¾ificará que estas crescem sob agitação. , ill U agáoifM oa aeu:,.va Pçdjxi;:; ‘ZQ Ι&ηΐΆ Ίϋάί- (vídoal Ou I, lê&tiê dal Irioanoouòa oo 11 uso. Od ou 1¾ 00 Ui iouoiíodo -a.: loito lo ioaas soo api.rapao ··::·· :: ·:·; V · v·· · v ·:-:·· SS>: 0: COO't :oxa ooooiilOo foi osici-osofio lai al 00 afio OU 11 í':Ua lo : ; :···χ;.: , ; ··;:;··;.··: ': a. 10O:·;; foi lUlOO ixOá oob IO OOioiOO ai, faòioooa d laioirs 11 ooooo; oooo.s nido 0000- um 3 ml de meio DN foram inoculados cada um asm 0,2 mi da .......v:, < í·-síSi, nu 00.00¾ foram incubados até ao dia seguinte snU auinamam namm a áámronaim asnamuainu* Pti adicionada nliummrum m-aaámil auu ama. caiaumau. n:;n:uaa final aa 15% am/mn e as culturas dotam p^siaia m -70°6 mui serem auia:LraUam, - : a to uaaiãmíaimam.am

Una colónia íMlUld&ai Un L. iauflm foi inoculada em 10 ml de meio Ml 7 e cultivada durante toda a noite, Após o arrefecimento durante 15 minutos em gelo, as células foram recolhidas por centrifugação a 7000 rpm durante 5 minutos a 4°Cf lavadas mm 5 ml de tampão de ensaio Ldh arrefecidas em gol·::; (50 mM de Tris-acetato pH 6,0, 0,5 BM de Fructose-1, R-difosfato) e suspensas de novo em I ml de tampão de ensaio de Ldh urumfuúiUu em gelo. As células íujuuuuuuu de novo foram transferidas para um tubo de vidro de 5 ml e submetidas a ultra-sons em gelo mtil 1 íaamclo um Branson Sonifíer 250 com os seguintes parâmetros: Temporizador, 4 minutos; ciclo de funcionamento 25%, saida 4. Subsequentemente aos ultra-sons, c conteúdo do tubo foi transferido para um de Eppendorf arrefecido em gelo e centrifugado i 15,060 x g durante 5 minutos e a uma temperatura Ua 4°C. 0 sobrenadante foi ? mmrumlu'5 Uo para um novo tubo de Eppendorf arrefecido com gelo. A actividade especifica da Ldh do extracto livre das células foi medido ·$ f. uivif: /úú:· fUimfn mau mirai n ad um mxfrmu-tm alimn-a um um aas·mu ama mm aeUarnmUu a •a U.U mmsa:lm ma .UUm * :*;<·: .•''ί:····:· · n '-i Tí \·.· ;·:·· > ·:· :·.· ··.···: · v· ···: ···· ;·* :··- .··* m; u:w: ms,ma a UI mM Ux':· rmmmm >·' .···:· v m > y .·.> .. mu mmmmim muu: miurama lí>y a ;; r an ·:: ;· ..ale Um flilllm em: Unaf ínn. mm •sCU Um ήίύ:ίύ·*: ' · r :'U U:tmm?m r ai a-aam malas mor:v;rm amUm· m o·· uf.·.:*>.·-0-:2 '-m :·.·' '*· ··:· >-"-·· U'v iiZ.g: D-f S'!·: :. ·:::' ;·: -:u "l £ΰ£ΐύ , aramt ru mu-ma r mm m i c# ««iiéw® o,: uma 'U·. 1:·:.::·ο·: U: a c:aavrer aliam Um l |aami :;ia iooidsck:: Para a ria das ®Μ;Κ :0:i:;b!' rd 'χ do ΟΧοΟΟΟΟχο ΙΐΟΟί'ό òd aâlulàêc A O; específica é expressa em de proteína maodpdç iia ço:-::caat::ra^á m pmtlllXZ. do -SslsMitú .: oooaait idbdeooçç:, fáacdldrd., .A.j aoaa aldaadooa dooadaíob (Píerce) como proteína Standard. do

Acetato requerido para o crasuiPaaco d:· l. lactis laicMlaoraba as cepas da L. lactis subespécie de lactis IPHCd-i a addLMo foram testadas para e crescimento no meio DN com (DN) ou sem (DN-Ac) acetato, respectivamente. M cepas ard::.cr.iíçrr;os::!itd mencionadas ddraoo colocadas sobre placas raiadas de agar mu DN e DN-Ac, respectivamente. As placas foram Incubadas durante 24 noras em condições anaeróbicas e . , respectivamente. Os rertltadtoa estão resumidos no quadro 1 abaixo:

As cepas da L. lactis ensaiadas adao uma racaaaídada absoluta de remato em aoooddmob da dmsciomfc? aotefeloas. : ·:> OO:' .i. i x;»:·>·:·::·> ό···'>χ··»····.-·:·;< díxí-d: itl.·: r.·’ ·.% ':b: Cot. O ..· ·': m xíui aa iaoaiamab ; ('Ãí;: çx d: ; çç.o pç pç cmçç-sm aa Í Ç 0 M|jf -Ifmmdbm : tt dor i: o a to do a ao? a necessidade de acetato par* c crescimento em condições rarábirap c anaeróbicas respe ctivamente colocando uma placas com meio DP rrrlansio cada rrc maiores d® acetato de tccdc «itrr a 0 c Opdd dp)bb -

Nas condições aeróbicas foi cprccrstíc; parco aocn OíOi.% ir· Pcepato do ibkDdo o oro Dbki tcd. obíMrdaDo rc crescimento completo. Com concentrações rturioo De 0(,0054 rir acetato de rddir não í(M observado ooodooo crescimento. Fcd. observado um crescimento completo em ccTrliçder aroícrcMcás com 0-0,2% de acetato de sódio.

Nas d%dirrll:rrlrr seguintes, foi, utilizado meio DN com 0,1% dr doe tato ds? sódio (DN) ou sem mero de acetato de sodio (SDblcl.

Isolamento do mutantes defeituosos de Pfi te tadtotomco.t lactis subespécie lactis OPllCoFiD e Lactococcus lactís subespécie Μϋ'ϋ'Β variedade biológica diacetylactis DB1341 e as suas caracterizações d.i, (rçd ooooc :···· d® o ro:· o o forpreparados caldos mutagenizados das cepas CHCC373 e roc 341 D® occlc artrr i vrmortm dpcotbcrri e c o i. :o c Fíoccík colocados nas placas com õiidtçd®;? sobre pi acro de agar com rcic DD pua foram . 24 c 48 doutro, Drsutda oicmras pod . · <:: t :·. dc n ot ca do caca tdcusd acrrdiri.ct:aòct o coiccadoá :»dr® plucots do apor cot DD o DN-do „· utdoo ct i 700:00 d® o ot coo oil ®or>® durcur i.tco SíCCCíc d® rcrdr® 24 dor®® sob cdcdicdcc a®adr6M.ddtD Foram seleccionadas duas cepas DN220 e DN221, respectivamente da PI e uma cepa designada DN227 da cepa jsutaiieniiiada: DB1341 oue foram incapazes da crescer sem O RSu 1',V ···': .VÓO ΟΟκΟΐ odiar uOOdabbòma.u.. respectivamente e foi digerido com EcoRI, e os modelos do fragmento forãSi comparados com a utilização de electroforese em gel de agarose. Os modelos do fragmento que DM220 e DN221 eram oriundos de CHCC373. DN221 foi seleccionado para outras experiências.

Uma amostra de íMltOt DN221 e ÍM221,t respectivamente foram depositadas no Deutsche Smmãttxhq von ' und

Zeilkulturen GmbH, Mascheroder Weg ib, D-38124

Braunschweig, Germany em 26 de Junho de 1996 com os

respectivos íiúmâzos do regioto DdM 11033, DSM 11034 e DSM ;sí ; CHCC373 e WMl lidroí:; inoculadas aos Fdi? e ao caitur-as foram sob cDraligdad aeróbicas e respectivamente. Com as condições de crescimento aeróbicas, DN221 e ClbC373 cresceram de forma idêntica assim como o

F de FdlFl Rb coso idsfbmslbofrdb s n f sara •λ*; < i :j. ) :¾ f ·.;*··: >” :: ^ ãii3 do amofOSSa 00; O Ζ::Λθ: .00 O : : : ; O D ti > MI? dob iO;!:;dFv:õos ábaoròdi omo fob. o.r as da ílaCCdF?d a daclboacao a ama oaiaso resultados mostraram que a Ml 7 asso aoai a: a.aoso; aia indic® de d a ma s a a a a a ia as π t a o rasa; s; d d s, co aaa o Fida c ompar a da são consistentes com a vÇ V - a\ ::Ç;j Ç- v< :·'··: suposição de que DN221 tem um defeito na eae uct:ieidade Pfl ruuí;:· de ueo necessidade de acetato o um isodlcd da crescimento inferior dob cmãiQ&ím i&q&droMdâd quanbe comparado em €bbCJ.e:'q lddld:t'Sq.tc ciq bditsdtdd ddidididDddq da afl a Ldh

Um caldo de DN221 foi mutagenizado como o acima descrito em Materiais e Métodos, e as células aatagaoizadaa foram colocadas sobre placas em diluições sobre placas de agar com meio DN que foram incubadas aerobicamente entre 24 e 48 i-oras. Destas placas foram seleccionaram 980 colónias e cada colónia foi colocada sobre duas placas com DN e incubadas 24 horas sob condições anaeróbicas e aerédicdé, respectivamente. Foram seieccionadas cepas (DN222 e DN223) que foram incapazes de crescer sob condições anaeróbicas. d And ê% DN222, DbelD a CbvDVdd foi ϊ·®0ΐ&ά& rmpmztíVMmritm e foi digerido com EcoRI. Os modelos do fragmento foram comparados utilizando electroforese em gol de agarose. Os modelos do &§«&£ o mostraram que DN222 e L’: -·:'·!; .110111qôçd-ô do- dbddb 0 do didE 2:3,: y’ ;f N '· ·. :’> o ·' ·" ·:·\ ,0v .%·: ·· y,. D, οχ·ν>;0:·. :· ;d umtmâm il llird-d. : XH y n -.y. λ·.-·.-.·::·. ep/m:Ls:eed l-içllbínlfano;::: Μόρο;;:?·:! * iissq 'iíiq Λ.Ο .y ox:3íXíOò:Çf:yo;;;:g C dO ΟΟΟόΟ íi bb de * 50: Iddfc OSír; oe ode o o A eegiíboo 0 id tiOi-l d d: : 3 f:· v I :¾¾ f ?.í.í':;í;5 bd bis nt lt s Ti t ó c b tTKbi t bo iso J d d 1’it;’2 d d 2f>: feita apria cultora líquida m tao cól&nic iítliciUtidbi de DS 1' /'' 1 O Opf 0 1"·:":'. 1tO-tllbC KCCí COTid 1 adiífi iaSlT'dd:Íq.::;: ::i d': : r';i a noite. âsirddlTiiadd.ídgTít'íi nb células foram transferidas para placas de agar com meio DN que t%rm incubadas arb coiiíiiçbaa idMi>Tbò.blcd.íSu frio cepas designadas DN224, DN225 e DN226 foram isoladas, tendo como base a sua capacidade de crescer em condições As três ofpds eram rudaobíst ou variantes de DN223 tendo recuperado a capacidade do bbTbt&ff&f ãbdlil em NAD+ "e,n condições anaeróbicas por mutilações cm sistemas secundários de Ldh e Pfl assim rota por reversão do defeito do Pfl ou Ldh. respectivamente foi isolado o digerido 0¾ brafbb Os modelos do fragmento foram comparados com a utilização de electroforese em gel de agarose. Os modelos do fragmento

Oco amestra de DN224, DN225 e DN226, respectivamente foi depositada no Deutsche . o von Mikroorgariismen und & 11 fui ttroc GmbH, Mas crie rodei Weg d:Ç D-38124 Braunschwei g, AIemanba em 26 de Junho do 1996 com os dtop-Cot 1 oSb tf ss00 a ds ídSd ia to bfd í td; a .1 i 0 c :S ® ur is 11039. ta. t tiita::b:0 Uí/íí';;: ; tr «?;í 2:1254 8$ :¾ : ;;>xi .1 iÇU-JU UíU tomo uai u sumi :! '.i 'V -.J Cepa U ata (OittOO açii-á. 0(Φθ0ρίθ · d ::: :U .:·'·: í Ç;: ' EUI ' m :;|UU: U .-··· ;··;· <··'·:··. E v -:·· /.·, px ‘ U"·'· " fX; xxtuâtd: líOMO pf Ί ) m utu U:dU 1UU roaansBíí' fpdb 1''

Estas foram dPpmdltmlia « té Φ& Junho de 1-96 c-nm o nlPíuro úo rapiUtUb M 11036 „ . s :· a .,va . . it > ' Ldh a Saí depositada a 26 de Junho de 1996 uso: c uldEtuo de registo Sdd 11033 ^ M C.tU tosam Ut OUU.m 1 tttt u.C UtuXu.xux COO Ou prcoodinxontíaa uxmhu-----1 doo o a ndoo too ·> uuxs.anatrtussu 20 autua antes de serem congeladas. As contagens totais das células do concentrado congelado foram aproximadamente 3 x Ua CFU/mL. IKJlhJddl 1 C efeito do orpo:oio!aox auxiliar no índice de acidificação das culturas iniciadoras dos produtos lácteos mesofílicos no leite pouco pasteurizado

Um concentrado congelado de adição directa (F-DVS do inglês direct vat M:) de uma i mesofílica comercializada por Chr. Hansen M.B* Horsholm, Dinamarca, foi cultivada sozinha e ati associação com os tepiMsíi&s auxiliares. A cultura rntai uda-.su mcuxuflliuu utilitadu tui designada Jl-J 19. CH-N 19 é uma cultura l&ittimduxm com uma contagem total de ooooim âo polo asutasa 1 x 1 h: ' CFU/g uns auxamxPs uma adausaa de Lactococcus lactís io&oomoio cremoris, Lactococcus U-SítS IO ΟΟΡΟΟΡΡίΟίΟ 10 C ti .ÍX:lttttXÚ^ÍI;S\U tU:S tStxtítíí tOlOO). Xíft.íí auluíxtpéuiu ít:rutului.u U I;^UÍ:WOU'CUã Ijutlu uxtbuupiuiu (00 U ÇS t. V'U ít x í U ·. 161--:6 19 foi O : i Anuío COO um sióól 0·': InsXSUlÃóâo ífc Cç61:l em Os oxgnuMÉúSí auxiliares foram inoculados com um nível de 0*0014 em peso. As experiências foram realizadas com leite inteiro pouco pasteurizada a 30°C com o registo do pH de hora sso hora durante 6 horas. 0 do pH no io.lio Irstulio pouco pasteurizado inoculado oo-o CH-N 19 sozinho e CH-N 19 em associação com DN223 e DN224, respectivamente, é mostrado abaixo no quadro

Quadro 1.1. C desenvolvimento do pH em leite inoculado com CH-N 19 sozinho e em associação com DN223 e DN224

Horas desde a : 6-9: IA··; . ’ | - . 1 ldt.„ ' 1 d ' ' " · ' 99,6:1 | 9o-61 j 6p9d J·. ........ j Ó, 11 6,.10- 6 j: -6:,1:6 • .... 6 61 | 9,9! 6 | spSP é.i-M l $*· 10· ; y.......................................................

Quando foi cuArloicso om associação com esta cultura mesofílica o efeito dos organismos auxiliares DN223 e DN224 no índice de acidificação passadas 5 horas de cultura foi um ΔρΗ de 0,i2 e 0,14, respectivamente. 0 efeito dos organismos auxiliares foi adicionalmente aumentado passadas 6 horas dó cultura a um ΔρΗ de C,16 e 0,20 unidades de pH, 5,8 ds ó 16 tUisO/iCU; OOiOdO Ció-ll 16 fól ósditloudo O:··; aÇíOòOÍ:Oç6o os us 1:99:123: o 061:69, osoípoot: Aóójoosisss, Pio ou o Oisosslsi foi íOi 111 OOdG ood 1 06 o, *:«·:>* ν;·ν·. é ooldor.so o oo st luud cu do ··..·>.“ \ ·.··! v ·»* ·.· .**.-·χ .· ·.' *.*!* poro ;,· í. . d..:U ct 16: ,1 Oiói çlÀliso .2 :660:6. 6;: i;:: sss o ;v.;;A ;>-· ;.v y,;v .v.sv. Sissoooirooaií nsr 9> 6 6'9;· :99:9.^6:9 i; 9Α9:Ϊ::;;: DN223 e auxiliares

CCOCo por omd-dplo DN223 e sendo OS o.rc.::oj. msíliãzm utilizados como: concentração de j x 1¾6 CBI/g de .rcito e sendo a cultura Li-η;. i :.i.rodo a ccc concentração de aproximadamente i 10" CFll/lo dc leite. Foi tibocrdocte um orooiU; írcicr <>0 D11FF4 quando experimentais W-Yí* ' ormiproo máim taxa dd ç-dioM f 1 bdidro comparado com idOFlO em equivalentes. O efeito dos organismos auxiliares no índice de iàciáXf.ícMçã.Q das culturas iniciadoras bacterianas do ácido láctico termofílico

Três concentrados F-DVS de culturas iniciadoras bacterianas de ácido láctico termofílico comercialmente disponíveis por Chr, Hansen foram cultivados sozinhos (controlo negativo) e em associação com DN223 e DN224, respectivamente. As culturas termofíiicas utilizadas são designadas TCC-20, YC-460 e YC-470, respectivamente, TCC-20 d uma cultura iniciadora com oro. contagem' popcdg contendo Streptococcus mmófilm e Lactobacillus helveticus. A cultura d principalmente aplicada ca §:u:c#0d30 de caco. V:s> por exemplo ropco de oueijc dítíyO* ticoc d* queijo italiano, tipos ' ' . . pizas.

&tlQ tú. v:sl dê sabor vàSGOsiítedíg dO KiGlO S ao >4' iogurte o ) &rodi.i2 uma

Ita viscosidade do YC-460 .u.;uo d, TCQ“2ò foi coo·: s :55iddd. da l&bcul&dio de P, 01% v;"í pma % o ump tpmpzmtuzê do 37'd;:o YCeêdD s YC-470 mimem G:tiil.2adG« axm dm odíM::. de instvi*I$ç$d dd 0,031 ©o peso Θ & ymâ Põgòò10 535:05:3.::3: 202 do 022222221:0.0:.5273 0::31:0. .:. Ιΐιό'Οΐ; foram inoculados co;:?, 00 221¾ 1 se 0,0:.0:,¾ mn. peso. 0 do peso entre as culturas iniciadores e DN223 e DN224, respectivamente, foi 1:10 no caso de TCC-20 e 1:20 no caso das culturas do iogurte. Todas as experiências foram realizadas em 200 ml de leite inteiro pouco pasteurizado com registo do pH de hora em hora durante 5 horas. 2.1 Kíjii:::5sdoc, ubtidei com a cultura para produtos 155-:-21::055. Tdd·--20. A acidificação do leite inteiro pouco pasteurizado inoculado com TCC-20 sozinho e m associação com DN223 e DN224, respectivamente, é mostrada abaixo no quadro 2.1.

Quadro 2.1. O desenvolvimento do p¥, no leite inoculado com tCPPPêu sozinho e em associação com DN223 e DN224, .respectivamente.

de 0,20 e 0,33, respectivamente. Passadas apenas 5 horas da - ' - - para uma ΔρΗ de 0,67 e 0,81, Foi obtido um pH de 6.2 no loiro 02 ® 66 ouruoo® sbo.® rápido o-bb-bo a cultura OVO-lo bei. í ' ' ", írpipOíctiobboo.1.¾ fj:o o:®.® νΐνοί® o·®r®. tinOlB *i:dí) coioiiori® o o;ol olos * 2.2 Resultados obtidos com a ΦΐϊΧύΤΒ. iniciadora dos produtos lácteos 3C~ Π t:. O desenvolvimento do pH no I&MB como resultado de cultivar YC-470 sozinho e em com DN223 e DN224, respectivamente, é mostrado no quadro 2.2.

Quadro 2.2. 0 desenvolvimento do pH em leite Inoculado com YC-470 sozinho e ον associação com DN223 e DN224, OBCCCCOΙΟΒΟΒΠ t C o

! OBCCBteçísO' í 22;··'· 210 ; ·.>··.·.· Λ-νλΑ. . : Λ.·. . . v . . · .ον-'· 7—-> * | .......................................?' 3, ®0 i ___......................i.. :: 1 .................11.11_______..............j.......... ÇM i ----- ...--------------- v- · ·:· >y :· v »-···' -i 0,:30: j 0,33 2 j ......íii.............L tira j 3,03 1 .................................·'—.......t 2 i :· -· v : •:ví'> 5 ......................................... 21 . ::'Ò.V ·.· >· ·.·: v ; | ,· i ' ·· · :· ! ® i- 3® ? sbcb cuitero botOXÍCÍOv o imí τ · ^Γν;ί^ί;:Γ .··.··, ·:;- '••vÇ.- p;-·;:. ò;' a. :OH200I., ó COOC.OO Co. soi.dlf t CC C-OC .·λ-·*.-1->3* <-<··>.-'-2·.·'*.-.'·-·.-!* ·:··’.··. ·' ·'·. · . :· -:··< .-··.· ·-.···:.········;·:· •i-.>;<· 1:-23:--2í- ·:· ·.·.'·.·.·· . Φ 0,g|: Ç ¢,:30:, CÍ:B j,?®·:..: v®;®:··®· 0. ®® P^MIíSm 4 h#rã$ ¢::3::- BC® ·:. 3p3 <3:>: 2 , 2 3 B O* 0 , ®0S:p®®:V 0 ®®U v>Í : : V.· ;-:l ^ V·- ·!>· V;i i-*V VV 3 Y j . 13 tssi Qm>. to® Λ®-® 3® Õ* 23 0- 1, 33., 3 aumento no índice de sumi fi; á<; tuupQ rana.:orl-do paru ara a çlo., que expressa a radapào ".aii ara iáit- OD r r ·:· ο ·:· ro:..=a o leite a ar pH 6,0 foi 49 e 51 minutos, asaríer:·; a ·· . ; . · , DN223 e liariivj, respectivamente, quando naarrnada ram cansado > J ;í: , ·:, .h: >

Saí :i;a:iviasdarã οΟ fa 0 desenvolvimento do pH no leite inoculado com YC-460 sozinho e em associação com DN223 e DN224, respectivamente, é mostrado no Quadro 2.3 abaixo,

Quadro 2.3. 0 desenvolvimento do pH no leite inoculado com YC-460 sozinho e em associação com. DN223 e DN224, respectivamente. | Horas após a ! .............:...................2.0.............. í í iaocaloada Y'C Λν£:Μ£ } À ‘:.:. 'Λ'3ν 33 :.· *' ί.:Υ·3.·Ηai .o í dli-iia ;· IdOid 1 l ! ! , :: ........1. T 1 í .............................................. ------- Í; J d ; ... .......I............. ·:.·ί· ·: i 3 '1' 3 .....:..... o 5·.·. p: ·.· ·· · í · * i 3 pi 3 •v.v.v,.W>v-«ww--------- "f .....i :

Quando é cultivada em associação com os organismos - '. efeito ao indico da acidificação aaona de passadas 3 horas do cultura coa ooo ΛρΗ d« ‘3: 3i ^ .χ:;. íS f <ó X 't :D ma. ia η::-'.·::·····..-····' ·.·>. .·.·:· v·:·. v. -·- ·-·: :·*· ·" ·-· 'pi··''· V o i- ·:; .... nnnooo·. sipifI:Gèt ioo oaoitdo ae-: i |n •ÍOvi ida ô;da •í 4 J1 passadas 5 horas com sisa ΔρΗ de I, "M DN224, respectivamente. e 1,42 para DN223 e 0 aaísartd ííq inalcu de dvldil.icaçts, acss etereao® * redução da aeepo -orv; ; -;o rara caa a cdItera IfCHfeO acldlhiquo o leite a um pH 6,0 foi 78 e 83 %>írmZo$t respectivamente, „ - com DN223 e DN224, respectivamente, quando νσζφ&ΖΕάό·® com as

Γ;.:μνη rar que tinham sido cultivadas sem organismos ,:::0.1 ' : ;S::U

Como com as culturas mesofílicos, foi observado um efeito maior cultlairedo as culturas iniciadoras termofílicas em associação com DN224 melhor que com DN223. A diferença entre os dois organismos auxiliares não foi tão pronunciada dtttdo estes foram utilizados em associação ss culturas liças. 0 efeito dos organismos auxiliares medido pelo maior índice de aci.di ficação foi signifi cativamente superior quando foi utilizado em associação com ceifaras termofílicas. Das culturas testadas c crescimento associativo com DN223 e DN224, respectivamente, foi o de maior benefício para as reiterar do lagarta YC 4 60 e YC-470, sendo o aumento do índice de acidificação passadas 5 horas de aproximadamente 1 unidade de pH com um râoio Se peso de 1:20 entre as culturas do iogurte e DN223 e DN224, respeclivamente. Os dois organismos auxiliares foram capazes do rodkssi.r a 1 a .UI aer r vlatarir o · requerido para acidificar o leite a um determinado pH quando este foi Iroce::Udd a aa alas! da Caidl! !e p® de aabdtratau aaava Ti':: 34154 láctico que contém as cepas mesofilica o termofílica foi o ufuitu dos ubpuvbaoou &uMa:ilajía?s DN223 o misturadas destinadas à produção de cpoito sPuCubouPu contêm cepas bacterianas e tentofiltíus do ácido láctico. As culturas iniciadoras foram inoculadas como PIS congeladas. Foram utilizadas as seguintes culturas iniciadoras: YY-62 e YY-63 Pso culturas iniciadoras que consistem numa mistura das duas cepas bacterianas mesofilica e termofílica do ácido láctico. TH4 é uma cultura iniciadora comercial que contém una cepa bacteriana termofílica :jo láctico. B-il é utio cultura iniciadora mesofilica comercial misturada que contém cepas de Lactococcus lactis subespécie cremoris, Lactococcus lactis subespécie lactis, Leuconostoc mesenteroides subespécie cremoris e lãctwmúacus lactis subespécie didUPipIadti·#, A cultura tem mm ooaixupm total imiolmkmm i&m cm teor de Lmíóúms too imom tmmíóéã òççmãpêcíç mmmúmix cm mmimmm do 1 a 51 tendo como base a ccmtçnam total das diluído e de Lactococcus lactic de ifuldl fiUiUpfo fui realizada iniciadoras mo luPus ooocoou 1 35/54 foi

inteiro. A temperatura is^S(^àC:.Xo:;u geriu® ®' perfil de incxÈz&á&B sem ®« níveis indicados nos quadros abaixo. 0 que não estavam tapadas para assegurar em todas as garrafas 0 déoutvolv ;çu:"u a do pH foi medido quase o durante as 16 horas de incubação pelo burdouru Sd de Intab A/B. As curvas de acidificaçào foram geradas pela pacote de software Easyview versão 3.2.0.4. Os valores de pH que foram medidos passadas 5 e 6 bosi de ircuoação são mostrados abaixo nos quadros. 3.1 0 efeito de adicionar organismos * - ou q ,v,;,,í;. YY-62. 0 nível de inoculação da cultura iniciadora YY-62 e/ou dos organismos auxiliares DN223 e DN224 é mostrado no ψιΜτο 3.1:

Quadro 3.1. Nível de inoculação (¾ em peso de leite) de YY-62, DN223 o DM224

íU:í:go::otÀU:t;lo com os organismos aual 1 .Ltusot respectivamente, é mostrado no qiadío 3,2:

Quadro 3.2. pH passadas d e 6 horas do leite pasteurizado r-r* ter sido inoculado com YY-62 sozinho -oo em

3.2 0 efeito do «òioio:oat 111223 ou 242224 à cultura 2 ;χόϊ: x>

Quadro 3.3. Nível de inoculação {I em peso do leite) de

0 pH passadas 5 e 6 horas do leite pasteurizado ists-lro tem sido inoculado iruxcrlado com o odoturs iniciadora sozinha e em associação com os organismos auxiliares DN223 e DN224, respectivamente, d mostrado no quadro 3.4:

37/54 o 0 ísioslt;:;;:·:. /óo -όηΐοοο/όοοοο/ St όό o i 00:::¾.¾ ooo/pi 1 i0 r oo DO D ,· n ii::"; 'd 3 1 -íOD-ito/ooo 332:'·'·'43,: :.100:: odMtooo ss o·;; Y· ·'' v::: "ÍSii C ia*r» P-M « « b:.í,::.uí:s 11::.10:1,0-:::30:00. Til4* ;’j. . ;·,.· ··'··', ·;, 0¾ i :: .. ::.ò:-v' :.i .:, -:3 oí; o. o.o o o: o :o .::. :0 ο-οοοοοοίοο o: :o~- Ç 0: f ΟΟΟΐ; O uma cultura 10: 0: o i o 0.0 OOs 0: 10 r o contendo o: 0:00.1.0.0¾ xooco. :;:S -v>··;:;< B-ll 0 0 OOIOO.OO InlcioSO/O TDll, -:0/0::0 SOOxll o..o ro o': 3 € o/dlll é roo··: o. ;:oOo no goodoo 3.5: 3- x E:. ?o v.-o do : 0:0.0:2 o< âo rl o;o ροοη -io isolo:: do:: T0--ODD, Ο ρΗ passadas 5 e 6 horas do leite pasteurizado inteiro inoculado com a cultura iniciadora sozinho e em com os organismos auxiliares DN223 e DN224, respectivamente, d sostr&ds no quadro 3.6:

Quadro 3.6. pH passadas 5 e 6 horas do leite pasteurizado inteiro ter sido Inoculado com YY-62 sozinho ou em osooaiaçlí com DN223 e DN224

: ... . όοοϊΐ,ί. r í.;;.ça O- acidificação das t ;í â :§ c d I d a rc e . a i ai «a a. ·; a a a d: e tctri a a a c diaa:raí;".aa: da ácida láctKm (3-1, 3.2 e 3.3). Assim, passadas 6 horas c pH foi reduzido a 0,- íá~á.f 35 %mtéàúm d® pH para as culturas idiciadcraa i;ár~ãã;f mc-dá a li"-4 1, lisa® dadddta do ladiac da acidificação das cclicra.» idác-iâác:rcd implica que a ciai.Ida acc a atlMccçSd de 50% „ ' ' ' m : iaiaiadacd para obter ama acidi álceçâo ca ai acia:-; a a cddddd este nível reduzido de cultura iniciadora d acdçiamada coe um a:aasa;ai:6CÇ:a m.oei.Íidr da invenção.

Resposta da dosagem dos organismos auxiliares 4.1 Efeito de aumentar a dosagem dos organismos auxiliares na acidificação de B-ll nos diferentes substratos do leite O efeito dc acaaaaiad a quantidade do organismo auxiliar no índice de acidificação de uma cultura iniciadora de produtos lácteos foi avaliado com a utilização da cultura mesoíílica designada por B-ll cultivada cm associação com DN223 e DN224, respectivamente. R·;"·· % dá· cin iidiaéQd·^· ρ®:;Ρο41Π.:1 c®. ccomid V* ttrçd c

FcdáCí utilizados três substratos: Leite inteire pecco i-mocr:leite .icccidc ácciáftco mmo pãstmxizam e uíi.it: ociScmc-aíto Ccci-to ecst.eydo dacte O cdc?®:.;. oe cím-um .imçcc da cultucè 9-11 foram temccdcd ccçcc G.> CilS! c resmoPi cmccr: te

;:R :¾ : i í 0% em peso; Cçíil! cm peso o Cp cã! em peso, realizadas e o pB de substrato foi medido depois de s horas de

Os rs-MlbsdcíP mostrados nas f» j. » | ff:;»»:': par» cada um dos substratos anteriores são f iram»» I, 2 e 3, e»x»:.»» i ·;»η»»»»^ P» três mostraram que a acidificaçao dos substratos 11 va.cT.>v::f»: me 1.» t rud» du»:dfo B~ 11 t V. X suilt 1 mSdPd »» com DN223 e DN224, respectivamente, Sendo habitualmente o efeito de DN224 ftlMt do que o de DN223. Somente foram observadas pequenos desvios no efeito entre os diferentes substratos de leite. No leite inteiro houve uma grande tedupâs) Po pH de 5,97 a 5,58 e 5,55 quando B-ll :p:i cultivado em associação com 0,005% em peso de DN22.3 o DN-224, respect;l;v»m:'»»to» A redução do pH aumentou ainda mais quando foi utilizado DN223 e DN224 a um nível de inoculação de CQPflf em peso dando como resultado um pH de 5,53 e 5,48, respectivamente.

Quando o nível de inoculação do organismo auxiliar foi aumentado para 0,02% em peso não foi observado um aumento maior no índice de acidificaçao.

Quando a cultura iniciadora B-ll foi bmocpXMla » 0/Ulf um peso e cultivada em associação ·;-χ Q. ·· \::λ :U:d»U» » dP».»P>· ívrpsívtlvavrjp;»·, foi o btido um í .... mifm OO»· o»:»· quantidade de organismo auxiliar de '7. »0 Uf U::S\>S peso, sendo somente o efeito Pope »de P ·.:.·« em memrr ar»:·» úú QP: ·;; ·:·> ο'···ρ··· · ·.··: ·: .:¾ V -:¾ 4,2 0 efeito de aumentar a d» .¾ :p: :p: do»; or:pS»n:US»Ux» P: :.ΐ.Λa. P. .1 :V: ndt 7» p.Q r.pl ·ρΡ:'θ Γρίρ » CÍ.:P i. f L ih ,2; ), fovd ff OO Is»»»

Inteiro

Ma figura 4 é mostrado o desenvolvimento do pH em 1000 ml do Isito inteiro pouco pooimerimodo tpouuispo ce:m 0,02% em peso de YC-460, CifO-oo':;; em peso de DN223 e cuuuu em peso de YC-4 60 em uusncíCUvOvâs oom 0,003¾ o;n nu to 0% UllllBo r 5 para :ac i.αι f ic-ar reduzido em aproximadamente 92 e 96 mlíunios qumnclo foi oultimmào com YC-460 em associação com DN223 e DN224, respectivamente, quando comparado com quando este tinha clno cultivado sozinho.

Em ocoparoçoo com os resultados obtidos no exemplo 2.3 foi observado um aumento no índice de acidificaçâo quando o oiou.1 de imncOlondO' do organismo auxiliar foi aumentado de OvoCdl em peso para ÍMlfdl em peso. 0 tempo requerido pela cultura YC-460 pcuc acidificar o leite com um pH 6,Ç foi adieíonalmente reduzido em 13-14 minutos quando a quantidade do organismo auxiliar foi aumentado de % 90X& em peso para 0,003% em peso.

Foi obtido um pH de 4,5 no leite após 6 horas e 52 minutos quando c leite foi inoculado com YC-460 :m:d!ôndo e após 4 horas e 44 minutos e 3 horas e 45 minutos quando o leite foi inoculado com YC-460 em associação com DN223 e DN224, 0 desenvolvimento do ρΗ e a cone;:::èott:í:á.çl.v de oxigénio foi > ·· rCvC:; leite com

Icpo 0:0000-, ,1,1.0¾ ;o t.%OSSOci 11 co o COO: OS iOcIt 0:000 ΙΙΐΙκή,ίίϊάο em associação com DN223 e DM224, respectivamente. C mH foi medroso com a utilização de um amplificador de pH Chemap e ® ícièctrudo Moroi.cr Tonosd-r MA tlll-cO-r-f ··" o a -:0:0eectrrei·:.; do r>'.ic:rn.:0 foi oedidO: coo: a ..fiitoo:cAo do oso amplificador de 0¾ Chemap e cr; eléctrodo pQ:> lAgrior Como controlos negativos o leite foi 1 no crledo com DN223 e !3M22i, respectivamente. As culturas foram realizadas em cubas de fermentação de 40 litros com mistura moderada e utilizando como substrato 30 litros de leite inteiro ecológico pouca pasteurizado.

Nas 3 cubas de ΰΑΡ:θό;';θ:ΐορ1ο foram realizadas ro paralelo quatro grupos de experiências com as seguintes adições de culturas iniciadoras e/ou organismos auxiliares:

Experiência lê 0,02% em peso de YC-460, A: ii) Oídoçf: em peso de DN223 e ili) idâoo em peço de YC-460 em com OídOcf em peso de DN223.

Experiência i) 0,02% em peso de YC-460, a: -±) 0, 003% ο-r posso dn proco o- .11.1; 0,02% em ~ o s ~r yc-460 e~~:srA:tcin;iòo :.:,.--.::.-00 ': S’:::, CÔÍ \ ' -.::::: :.:0:: O C Ο λ dooe oièro::: .1 o 1 ] , ", , - : . · DM223 o ii.ii Oj-Qri soí odioe o d S'-11 ora com d., QúíB% em peso de DN223. :3:sODiaga;:

Exporifecia II 0,011 em peso de 3-11, D: ri) Cp ·:. o .d.;? em peso de ndfdi e ilis 0*011 em poso de B-ll com 0,0015% em poso de DN224. de B-ll em associação A temperatura foi mantida a 431C quando a cultura termofílica YC-460 foi cultivada e a 30°C quando a cultura mescfílica B-ll foi cultivada. 8 do s a pom-ido;!. 1:¾¾¾¾ de oxigénio foram medidos e registados de meia em meia hora. Os resultados obtidos na experiência A são mostrados nas figurat 6A e 6B, respectivamente, e os resultados cor. irooo na experiência B são moafmdos nas liguras -m e 7B, respectivamente.

Nau figuras 6A e 6B pode ser observado que quando YC-460 foi conraéixao o umr: velocidade ' 4.5 tordo oíi fitim a.ivrr de oxi aio oo, A do ierao foi irroir

XdYldld:; goi >fei Um ο ρΗ :10:0:1 OS: Ç 4 roidor:, f,·, ! 4 i · . .. i si- d.·:,, ΐ ,, ·ί ··. .... ' · i.>:.¥,:, :,::.:.s j..^i ,, , ,. -...... olo ιοο:.;·: do 0íK:lg#ol,ò ιοί Ιρροιο. ododO o io<fg'd:0:io; ιοιο ιιοίΓϊΐο: 4.rmf removido passadas 2,5 horas. Substancialmente nenhuma leite, rardo o drigérla tat&Xmnt® ptitaPar Pp.p horas. 0 foi lento tom concentrações altas da oPipttlt no leite, mas acelerada a um ponto anterior que quando YC-460 foi inoculado sozinho, isto é, o pH era inferior a 6 passadas apenas 2,5 horas.

Quando comparados com os resultados correspondentes mostrados nas figuras 6A e 6B 4 evidente que a acidifieação dt itift por #6-460 está correlacionada com a concentração de oxigénio, A cultura iniciadora YC-460 foi capaz de remover o oxigénio do meio por si mesma mas fazendo-o lentamente.

Quando o teor de oxigénio esteve na margem de 0 a 3 ppm a acidifieação do meio por YC-460 foi significativo. A presença de DN223 em som YC-460 melhorou a eliminação de oxigénio e deste modo diminuiu o tempo até à aparipPt da acidifitáçlfev A aparição mais rápida da ttxtiificápp;;; não ílri devida à acidifieação do meio por DN223. ;P :’· aaa tbr i dos ritiXttdti i fíi“i pi s i-Pttij aarrr a- v. ή li ; -- V- : ·. )' do leite com .·.·> :: ·?-:>·· *· ·; · ·. 1·:- . .. ; · ;χ. ·.< p. % rititt da atar meio litro liePittt com ctltura attcatast.1 ti rada nas figuras ti a 7B. 1 DN224 sozinho, produziu uma : .. 'V::. ::. ' : ' .:. V.'.; , .:.V ; :..·· passada apenas horas,

aproximadamente 6 Μ 4,5-5 horas e este pH foi obtido com a CUltUO κ&ΖΟΟί&ΐ/Ιψΰ du 20)~4 2d o DN224 pUUUmdUS d.|;:í't>xi'ddid.:sít^nts apenas 3 horas. 11udu uuurm ut >04 remove o oxigénio no meio mais roDidtuutuvta: p.® o ppdOo ® índice de acidificação melhorado de YC-460 em associação com DN224 foi essencialmente o mesmo que o obtido com DN223. isto indica que a concentração de oxigénio no meio é um factor coa um efeito na ; do leite com culturas termofílícas.

Os resultados âã experiência C são mostrados nas figuras Oâ e YE, e os resultados da experiência D são mostrados nas figuras 9A e 9B.

Nas figuras pode ser observado que a iPPtlaçdu do leite uo® 0,0015% em peço de DN223 e DN224 fez com que o oxigénio fosse totalmente removido passadas 315 horas para os dois organismos auxiliares. Isto corresponde com- os resultados obtidos quando c Itit® foi inoculado com 0,003% em peso dm DN223. Passadas 2 horas de incubação o nível maior de inoculação de OM223 reduziu a concentração de oxigénio em 2 ppm enquanto tp® o nível inferior de iippsldpisb d® ))320)3 c d® udlt-t urubu ui® um ulvu.l d® oxigénio du aproximadamente 3 ppm. dum 02)031 em peso de ))0020 o oxigénio foi uuPuPdo puuPdbs 2 Omrub , , passada 1,5 horas a concentração de oxigénio foi aoroximadamente 2,5 ppm.

45)14 iv ’ melhorados foram quase os cnosmo de quando tinham sido UUCi. .:.0000 0 ·:·.·; ·.'· ·· :· ·:·*·: ·* > ..... V ·'λ ..'· t:': .<.·'<·'·>.<ν·.·:', ·:·' o Os tt 1 :',r dd pH Pt 5 f Cd 1 > & pio obtidos pa 5 oo ·:·;> s cio : iaomtaçOo com 2-11 associação com T0N223 Θ C.t: uii. respectivamente, podem ser CCCtOpotCidOO ãtt: „ 05 e 5,54 ;1:0« ft» ÍÇU0":p:I:O 3 :. .vou 0, 5 em peso de DN223 e DN224 , respectivamente. 0 efeito de atjsúíjt Mt O qaâPt ittCt! do c Ν' ^ι.Ρ; PÇ 7 atOa aut-ci 1 iu r 0:t c 'h 00151 OVi t ' peso á c; ataua uma cita i n a i c do pH 5 horas de 5,88 a 5,58 com DN223 e de 5, ,97 a 5 ,54 com DN224. Na figura 8: 8 pode ser observado que foi obtido um pH de 5,2 no i aitt passadas 7 horas e 24 minutos quando o leite foi inoculado com B-il sozinho c passadas 6 horas e 22 minutos quando o leite foi inoculado com B-ll e DN223 em associação. Da figura 9A pode ser observado cpo foi obtido um pH 5,2 após Ί horas e 48 minutos quando o leite foi inoculado com B-ll sozinho e apôs 6 horas e 39 minutos ípatuo o leite foi inoculado com E-ll em associação com DN224. 1. S . 196? piCUí., FSSS h •O S.S ...M. W.iv; s. 196?. Responses of lactic acid bactéria to • o -V * · · ;· ímç Cu, liSíCCtCín s-Ou-, f -OP&SpPíPV a íp ui Mõtóooooíi.y Cluuiit mgptzsmm and U um í:st: a qÇ.c>n:lsp'· cmmiçn.. Moljta M:aÇÇ:ttOOtO:,,, C.sou 1í\<á ?tl, íÇ t ;Cm m·: a a tt" 64'

Yano, N, 6 Morichi, T.

Kitada, T. 4. Suzuki, I., Kato, S., 1986. Growth of Lactobacillus bulgaricus ín uíilk., 1.

Sci-> 69, miudoiO, 5. Terzaghi, B.u & Sandíne, ku,?k. 1975. Iniproved médium for the iãmi.fu and their bacteriophages. Appl, Mícrobíol., 1 Número de referência do expediente do Titular ; N° de Regtsto Internacional agente 19556 PC 1 10 INDICAÇÕES REFERENTES A UM MICRORGANISMO DEPOSITADO (Regra 13bis PCT) | A As indicações abaixo indicadas referem-se ao microrganismo referido na descrição | sa .................||.............Jinhs..................

Outros depósitos são identificados nas folhas _ B. IDENTIFICAÇÃO DO DEPOSITO § adicionais ; fksms da instituição depositária

f DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH

Direcção da instituição depositaria (incluindo o cõdigo postal e pais) MascheroderWeg 1B D-38124 Braunschweig Germany__ Data do depósito ( Numero de registo

I 26 de Junho de 1996 DSM'i1035 C. INDICAÇÕES ADICIONAIS (deixar em branco caso não seja aplicável)

Esta informação continua numa folha separada §§ No que se refere as Oficinas de Patentes respectivas dos respectivos Estados designados, os Titulares requerem que uma amostra dos microrganismos depositados sejam dísponíbilizados somente a um técnico nomeado pelo requerente até a data em que a Patente seja concedida ou até a data em que o registo seja rejeitado ou retirado ou considerado retirado. I D. ESTADOS DESIGNADOS INDICADOS (no caso denáo serem indicados todos os Estados designados) j E. APRESENTAÇÃO SEPARADA DAS INDICAÇÕES (deixar em branco caso não seja aplicável) ' ; As indicações abaixo listadas serão apresentadas a Oficina Internacional mais tarde (especificar a j natureza geral das indicações por exemplo, “Número de registo do Depósito")

i I

Somente para uso da Oficina Receptora K esta folha foi recebida com o registo internacional

Somente para uso da Oficina Internacional π Esta folha foi recebida pela Oficina Internacional mi

Qftcíaf autorizado (assinatura ilegível) i

I

Oficial autorizado descrição, os seguintes microrganismos foram depositados no v--:·; d; l. ®: r-: .g,® j o®.®®

Ma:;tc.b.w;todt aoa IB, ίο· J® ®rn:.io.®nn®r a O ,·: ®ϊ® ΐ.ΐϋί» ίΐ V nas datas e com os números de registo abaixo indicados: Íaiíníía aa r®····®;· pagina Casa a ;.aaa Linha

Data de depósito registo si·. N°. DSM 11033 26 de Junho 1996 21 6 DSM 11034 26 de Junho 1996 21 6 DSM 11036 2 6 de Junho 1996 2% 11 DSM -1037 26 de Junho 1996 23 * .1038 26 de ,. ·.. . ‘ -.·; 23 3 DSM 11039 26 de Ν'-; Ç-. J V d f 23 3 DSM 11040 26 ae Junho 1996 21 S Para todos os microrganismos acima identificados depositados, foram aplicadas as seguintes indicações adicionais: do qc® s® refere a Is; respectivas Cdddci®®® de Latentes I;®® respectivos estados sks®:!®nados, ss Titulares requerem que uma amostra d®·*; miebsdípriiss;®* depositados acima d®;.®;®srsda® cç '·; :T: Γν; '1 d: q ζ a am d® pelo :S: d i-múo considerado MJ TITULAR:

7-. '·:·''···'": Chr. Hansen A/S (B) RUA: Boege Allé 10-12

a eficácia láctico e

Ui) TITULO DA IFvEdqÃDs Método para melhorar das culturas iniciadoras bacterianas do âcidc composições da cultura iniciadora melhorada TL TIPO DE TolICu Disquete (D) SOFTWARE: FastSEQ para Windows versão 2.0 : 1638 a~de base (C) TIFO DE CADEIA: d 1DJ TOPOLOGIA: Linear d:lf.:|;Çi;3;ÇÍ|.íí: .1582 f&, \ 55DML ISHíllíllí $·ϊ\ί·ί?ίί&ϊ35'.ν (B) LSC&LX&MÍMS; 255 . . rpÇ QíUTKkB ΤΜ€^ΜΜβιΒ$ á £E£R· vssmfàMf mmmfCA? SMm^c tgcgggtaca ssemsifcyr çasamsta? a^esswo? siwamsfcM · ?*rr<KK***fc mm ssacímsí#*? frtfâfaascscttac M^C&CW Μ3£ΤΑΑΑ£Ϊ íSMfAATSm MAASAAm MmrmAA ββΑΒΜΚΤΑΤ TAGT ATC AÍ& ATC GTA GTT RFC ®CT ACA MS CAC &0& «5 Met Lys Ile Vai Vai Ile Gly The Asn His Ala Gly 15 10 %&*&

Aca GCG MT ASA TTA CTT OAA CAA TAT ccc GGG CA? CM Mf Ile Ala Tfcr M* Asft Thr Lati l&y Glu 5ln fyr Pra SIv KÍ3 GlU lie 15 10 25 gíc A?G ATT &c CST AAT AGC MS ATG AGT TAT em GGT T5T CGC ACA Vai 11* Asp Arç Asn Ser As* Ser fyt teu Gly Cys Gly Thr 30 35 40 GÇA ATT TCG CTT GGA ÃSA CAA *.»VS>Vi *** λ 3M Ml sm GAT GAA TTR TTT TAT Aia Ué Trp VaI Gly Arg Gin Ilt Glu hys Bro Asp Glu Leu Phe Tyr 4â 50 55 ea scc AAA SCA GAG GAT #|vp»|í GAC GCA AAA GGG GTA AAA ATT TTG ACT GAA Ala Lys Ala SI a Aíp phe Glu Ala Ly* Gly Vftl Ly® lis Leu The GlU &$ 70 75 M? SM «ff m? GCA MA $n Asn Lys Lys Vai Tye Ala Lys 90 TAC GAC AAG CTT GTT TTA M s. Tyr Asp ly* !&& Vsl Leu 105 M? CTA CCA $GC MA CAC CTT Asn teu Pco Gly Lys Asp 120 Leu CM «s. Sí^jí· CAA OCA ftSf GAC Pi Gin Glu Gly Gin Ala 11® A*P 135 CGT ATG ST? ATT GG? SCA 'iáí Arg m Ha Ala Vai ne Glv * í. s, M.í? &I-& GCA GCT SM CGT CGS GGT MA Ala Ala Lys Arg Arg Gly Ly* 170 ACT TCA CTT SCA TCA TM TM SJÍ Thr Ser Ia* Ala Ser Tyr Tyr 185 MA Mffi ST? SCT CAA GAT GOA Glu As & A1& G1r Sis Gly 200 AM GAA TTT AM GCG MT CWF M4 Lys Glu Phe Lys A1 a Asn Glu 215 220 MC AAG SCO ACT TAT GAT GTT Asn Lys Ala Thr Tyr Asp Vai 230 23S ACT GCC AAC AST GCC TTG SCA Thr Ala Asn ser Ala Leu Ala 25 Ú GSC CCA AT'? MG CTG GAT AAG iSM Gly &Ls Ile Ly* %£ Mp Lys 2m TAC Λ'ΛΛ \S6W'«i GTA mr Φί" ctt ccc nos Tyr Mi Vai Gly Asp Vai Aia 280 TTS ACT m? ATC GCT CTT- GCC mi Phe Thr Tyr Ile Ais SkS&í Ala tu 300 GCA CAC MT ATT SGT Ala Gly Asn Ile Gly Gly 310 315 GCT TCT MT GCT ATT fCG ATT 12¾^ Gly Ser Asn Gly Ile Ser He 330 CTT Λίν.Χ Síf t :í AM GCT M? AAA Leu 3«r Lys Ala Ala Lys -TCA SM ®

Thr Glu VM Ser Glu $;te Aso Phe Ala 8Ô ‘ 85

ACT Mk TCT GAT M? GAA M& ATf SM

Thr Lya Ser Asp Asp Glu li* He Glu 95 100

SCft ACA CGT TSÂ C»'T SM ATT ATT CCT

Ala Thr Gly Ser Arg Prο II* II* ?ro 110 115

MG GGA MT ®ϊ ffl CTC M CTT fTT

Lys Gly Ile His Phe Leu Lys Ls& Pha 125 130

GCA SM fft GCC AM. « MA GTC MG

Ala Glu Phe Ms Lys Glu Lys Vfcl ly#

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Gly Tyr Ile Gly Thr Glu 11« Ala GiU ISS 1«

GAA GTT CTT CTC TTT GfiÇ ÇCT CAA MT

Glu Vai Leu Leu Phe Asp Ais Glu A*n Π5 180

GAT » » ® SCC M fiBfc ATG GAT

Asp Giu Glu Phe Ala lys Gly Mst Asp 190 191

ATT GAA ÇTT TTT GGA £M CTG GCC

He Glu teu Ria Phe Gly Gin leu Ala 205 210

GAA GGT TAT GTA TCA CM AfC GTA ACC

Glu Gly Tyr Vsl Ser Gin He Vai Thr 225

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Asp 1--¾¾ lia Asn cys ile Gly Phe 240 245

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Hi* Glft Gin Ser S*x »ss ?co Asp Vai

270 ' 2?S

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Thr IM Tyr Ser Aan Aia Leu Gin Asp 385 aoo K& MC GCT ST? CGG TCA GGA ATT GTC Ser A3fj Ale Vai Arg £*f Gly lie Vai 305

AM TTA SM TCT GTT GGT GTT CAA

Lys Glu Mià Glu Sei Vsi Gly Vsl Gin 320 325

TTT GGT TAC AAT ATG ACT TCT ACA GGA

Phe Gly Tyr Asn Met Thr Ser Thr Gly 345 ΑΜ tua sf?' fm rm act mt str &U. * MA ·£Μ MA ' Hí hys t«>.i Gly Leu €iu Vai ;S«.í Phe Ser Kap Phe Glu Aap í.yss Gin Lys *“* 350 355 360 S£f TGG TTT SfT CWT SM AAC jlM GAT AST SfG AM *W CÊ? ATC GTA 1394

Ala Trp Phe Leis His Glu &S8 hsn Asp Ser Vai Lys lie Arg He Vai 365 370 . 375 380 TAT &AS ACA AAA AST CSC .¾ ATT ATT Mk GCA SR* gfT GCT AST AAA 1442

Tyr Glu Thr Lye Ser Arg Arg Ile Ile Sly Ala Sln hm Mm $&£ Lys 315 350 395 mu m* s® w* mm mt .mi tf® -M *** àí*$ m< ;hs«. *«k tks ti* Π* Ai*..· Ms lis ·Μ&. W*% $]&« tó &U li* osm

«5 4« IIP ®M MA AM ASA ATT GAT SA& STA GCT fT^ CTT GAT TTR TTC TTT CfC 1$3*

Glu Ly* Lys Thr Ile Asp Glu Leu AM Leu Leu Asp Leu Phe Phe Leu 415 ISO 425 CSC CAC TTC AAC AST ©S& TAT AM TAT ATS ACA GTT OCA GCT TT MATSC UCt

Pro His Fhe Asn Scr Peo Tyr Ass Tyr Met Thr Vai Ala Ala Leu 43Õ 435 440

MgMm tmmnn tm í 2) imrORffiÇl.ô DA SEQ ID N°: 2: (i) CAÍiACtnSRtSTIt^D DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 443 amínoácidos (B) TIPO: Aminoácido (C) TIRO DE CADEIA: única D.i TOPOLOGIA: Linear lij TILO UI ΤόΙΕίΤΤΟο Proteína ;- m. .? ·: TIRO CE FRAGMENTO: Interno

Met Lys ile Vai Vtò Ile Gly Thr Asn Xis Ala Gly Ile M* Thr Mss 1 5 ia. 15 A* 53 Thr Leu Glu Gin fye Pro Gly Mis Φΐΐί Ile Vai Met Ile Asp 20 25 30 Arg Asn Ser Asn Met Stó Tyr Leu Gly cys Gly Thr Ala Ile Trp Vsl 35 40 45 Gly Arg Gin ÍU Glu Lys fXO A#p Glu í&a Phe Tyr Ma Lys Ais Glu 50 55 m Asp Phe Glu Ala Lys Glv Vai Lys Ile teu Thr Slu Thr Glu Vel Ser 65 70 75 10 Glu Ile Asp PJhe Má Asn Lys Lys Vai Tyr M« Lys Thr Lys Ser Asp 35 90 95 Asp Glu He Ile Glu Ala Tyr Asp Lys Vai Ma Thr síy 100 105 110 Arg Pro Ile ria Pro Asn Leu Pro Gly Lys Asp teu Lys Gly 11« ti* 115 120 125 Phe Leu Lys Leu Phe Gin Glu Gly Gla Ai* ile Asp Ais Glu Phe Aia 130 135 140 Lys Glu Lys V*1 Lys Arg Ile Aia Vai Ile Gly Ala Gly Tyc lie Gly 145 150 155 t ϊν*·: .UH Thr Glu Ile Ala Glu Ala Ala Lys Arg Aro Gly Lys Glu vai Leu Leu 165 170 175 Phe Asp Ai* Glu AS o Thr Sèç l-SU &l* s«r Tyr Tyr Aâp Glu Glu Phe 180 185 190 &l* Lys 51 y Met Asp Glu Asn Leu Ais Gin Hás Gly 11« Glu Leu Kis 195 200 205 Phe Gly Gin L«'Si Ala Lys Glu Phe Lys Ala Asn Glu Glu Gly Tyr Vai 210 215 220

Ser Gin He Vai Thr As» Lys Ala Thr Tyr Asp Vai Aap leu vai li« 225 230 235 240

Asn Cys XI· Gly Phe Thi Ala Àsn Ser M& Leu Ala Ser Asp Lys Leu 245 ' 250 255

Ala Thr Phe lys Asn Gly Ala Ile Lys Vai Aap Lys &á* Gin Gin Ser 2S0 265 270

Ser Asp Pro Asp Vai Tyr M* Vai 31 y Asp Vai *1« Thr Ile Tyr 1« 275 280 Z95

Asn M* Leu Gin Asp Fhe Thr fyr II· Ala Leu Ala Ssr Asn &U Vai 290 255 300

Arg Ser Gly Ile Vai Ala Gly flis Asn lie Gly Gly Lys Glu Leis Siu 305 310 315 320

Ser Vai Gly Vai Gin Gly Ser Asn Gly lie 11® Phe Gly Tyr Asn 325 3-18 335

Met Thr Ser The Gly Leu Ser vai Lys Ala Mi Lys Lys Leu Gly Leu 340 345 350

Glu Vai §«£ Phe Ser Asp Phe Glu Asp Lys Gin Lys &1« Trp Phe Leu 355 360 365

Hls Slu Asa Mn Asp Ms Vai Lys Ile Arg Ile Vai Tyr Glu Thr Lys 370 375 380

Ser Arg Arg Ile Ile Ala Gin Leu Ai·* Ser Lys Ser Glu Ile Ile 365 330 395 400

Ai*. Gly Asn lie Asn Met ph« $«*· Leu Ala He Gin Glu Lys Lys Thr 465 410 415

Ile Asp Glu L#$£ Ala Leu Leu Phe Phe Paro fêi# Phe Asn 420 ' 425 430

Ser Pro Tyr Ms it*i Thr Vai Ais Mm Leu 435 440 54-54

Claims (21)

1. Mé;$viíiClt.O:;r^v'5©;5 Mé;$viíiClt.O:;r^v'5©;5 1. Método pora: aumentar o índice de crescimento e/ou όο;:ο "atolar ά àcx:.aolcOrda lauOaraadiaoa da aaa ctp oaoa.ariiona dm sol® xgfiifio, compreendendo cultivar a cepa em associação cca ara -a aao nm··; amUss badddia.odo do ácido Mcti-mo* carmaacitérirrado por: o dita oagaolooo oaailiar P«ooppiao.o do acida;; laruttoo asr: Φϊ:ί<!Ϊ%\·ί<Μ·ϊ Cd aí 07; Kaiõa.bml.lsoíO; plrííodzoo t
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por bactatriama; rio desato Xátodoto que conduz a um aumento da produção dos ácidos ser aumentada.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 2 caracterizado por a maior |oar>docd:a do ácido corresponder a uma ΔρΗ de pelo menos 0,05 passadas 3 ou mais horas após a cultura.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1 par a cepa ser cultivada num meio com um grau inicial saturação de oxigénio de 10% ou mais.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 4 caracterizado por c meio ter um grau intototo de saturação da oxigénio de 20% ou mais. to ΒΰόίΟ: adaaaòa aas a 0O:ça;rda: ...o:·: ... 3 .......... .·., .! ,t y-toto à o.:. ,· 7 á. to i: iaCÇl.Sa ' :···-· 07 :.., .0.. ;,\·,ν ·,; -ν 'Λ·. ;·: ·: a;· .s','.νΟν.;u ia ;òa ;·\\νν :···ί:;:ο.·;··; d ti p.tottototo í Oid od l o d t :a i.a c:i '· Τ' Γ:;: :· i'' . · ? a Data oas oo. cão a. oas: da? ouauo .; Ο;:.;:d ao; i.iC ootoootoo ao: dtiidar ;aoa 1.7.00.:3.:¾ ada: ia; odltivsdoa, 7, MÉ 1.0; da -¾ (;';: iv \vQ' a;;· a .tatiat. 7 F a: oraaaaa: a «o otao .^uui; aoa ,aa.xiii.a r çt õv;·· Γίΐίί'· r toístoatoto do; todí Oioa a a ο ;·ν :··: g xo Zt: essencialmente não produzir aCIQO láctico. 9. Mêtoúú de acordo com a gmivinci pungis o 1 coT&ci&citMâo ροζ s ορρορρβρρ pupp:l = ser defeituoso na sua capacidade pmrg expressar pàlú menos uma enzima seleccionada do grupo composto por ' r formato liase, piruvato desidrogenase, desidrogenase, acetolactato sintetase, acetolactato síntetase secundário, acetolactato decarboxílase e diacetíl reductase.
6. 10. Método de acordo com a rcivigdicov^v 9 caracterizado por o organismo auxiliar ser uma cepa de Lactococcus lactie subespécie iPriir DN223 depositado com o número de registo .036.
7. 11. Método de acordo com a reiPdBdidtíçSo 9 caracterizada por o organismo auxiliar ser uma cepa de Lactococcus lactis subespécie lactis DN224 depositado com o número de registo 12. Mètpzfc de acordo com a reivindicação i, caracterizado Brr a cepa Mrfpriarp do âclsfo láctico ser cultivada num moio que foi seleccionado do grupo composto por leite, ctttppf fttr iodos para ·. t e r·;·: material vegetal.
8. 14. Método de acordo som quaisquer uma 0¾¾ reivindicações de I a 13 caracterizado por um gene de codificação de uma enzima ser capaz de catalizar a redução de CP estar sobre-expressa no organismo -:vuuL';bdr,
9. 15. Hotíxfc: de acordo com quaisquer uma das rtiulorilasoôsu* d-:V; 1 a 14 dmrmct&rloádo por um gene dm codificmedo dm ursa enzima ser capaz de catalizar a rouPopdo dm Cd o rouoo-irror NAD+ esrar sobre-expressa no organismo auxiliar.
10. 16. Método de acordo com a rma:vlo.dloupio 15 caracterizado por a enzima catalizar a redução de 02 em H20 ou Mpgq 17. ddto;d:u do acordo com a reivindicação 16 caracterizado por a enzima ser iiOoCPPipuu oxidase iouluPobo a enzima que tem a SEQ ID N°: 2. 18. fclttuid de acordo com a reivindicação 14 caracterizado por o organismo auxiliar ser orno cepa Ldh".
11. 19. Composição da cultura iniciadora que compreende uma buosniim do roído , m um oronuooo áouiirmr do doido; Xouáiuoo caracterizada por o dito organismo auxiliar do ácido l.âooiod ser defeituoso n·.; oou vonoPouXoo:o pvumoicoc Composição de acordo com a reivindicação 19 ooráoforisuoou cor o ru-íporiurue; auxiliar essencialmente oâo ou PU :>oo no enzima li ase,
12. 21. Comoo:mbç!o dm uocodo coo: -a roici odicoçio: lo cco-moO-cr irado por o orgooiorG '' ’ oor dofoot: sua capacidade para produzir pelo ooooo uma sólodoiOíOsOdu do ocupo composto puo: oiruvato formato u desidrogenase, t u to sintetase, acetolactato síntetase secundário, acctoi.actaic decarboxílase e diacetíl reductase,
13. 22. Composição de acordo com a reivindicação 19 caracteri zada por o 00:¾¾ a iroso suxíísm- ser uma cepa de Lactococcus lactis subespécie lactis DN223 depositada com o
14. 25. Cd^poolçdo de acordo com a IS caracterizada por o organismo auxiliar ser sa como d;o lactis subespécie lactis DN224 depositado com o número de registo DSM 11037. . de scormo com quaisquer u m das mraitáiCMÇúaa 19 a 2,; caracterizada por um gene de codificação de mm ssorroo ser capaz de catalizar a redução de 02 estar sobre-expressa no currcmoisoo; auxiliar.
15. 25. Composição de acordo com quaisquer uma das reivindicações de 19 a 24 caracterizada por um gene de oodifi.ompio de uma enzima ser capaz de catalizar a redução do O2 e regenerar ddld estar sobre-expresso no organismo auxiliar. 0« ::v mmP cu rd, ri rgdrptr do & st 0,0
16. 27. Coíiposlçâo do íoocsscoj 000 o rodolrbiuoçdo 26 Gâr«òT.r.rl^rdã por 0 oíordos soo ImMIddO osddooo lioul-riodo a enzima que tem a SEQ ID N°: 2.
17. 29. Composição de acordo com a reivindicação 19 caracterizada por esta duas ou ímís cepas deríoâtUDcâ em pelo tntímís uma enzima dídnmiolds no metabolismo pírúvico e na qual um gene de codificação de uma enzima ser capaz de catalizar a redução de Cu estiar sobre-expresso.
18. 31. Bactéria de acordo com a reivindicação 30 caracterizada por esta mx defeituosa em pelo menos uma enzima envolvida no metabolismo pírúvico, e na qual um gene de codificação de una enzima ser capaz de catalizar a teduçâo de 02 e regenerar NAD+ estar sobre-expresso.
19. 32. Bactéria de acordo com a reivindicação 31 caracterizada por o gene de codificação de uma enzima ser capaz de regenerar PASc estar sobre-expresso para codificar uma enzima que cataliza a fddcção de (¾ em ou 5-¾¾.
20. 33. Bactéria de acordo com a reivindicação 32 caracterizada por a enzima ser itãidHí-HuD oxidase incluindo a enzima que tem a SEQ !D N°: 2. sintetase
21. 34. Bactéria do acordo com a reivindicação 30 caracterizada por esta ser defeituosa ria sua capacidade para expressar pelo ' 3 uma enzima seleccionada do grupo composto por oiruvato formato liase, desidrogenase, lactato desidrogenase, 35 por esta compreender um fragmento de ADN isolado derivado de com bactéria do ácido láctico, e cot o dito foocpmnto de ADN CoSSO 00000000' um gotA de COd po.í'0 Oí;; poòip^pfi-dsao por c fragmento de Alft ser seleccionado do gopoo composto por a sequência mostrada na SEC ID N°: 1 e por uma variante ou derivada desta ser ptò-O menos 50% igual à dita sequência, e ter a mesma foo-gdcm Lisboa