JPH08500739A

JPH08500739A - 挿入プロモーター含有の組換え乳酸菌とその構築方法

Info

Publication number: JPH08500739A
Application number: JP6515600A
Authority: JP
Inventors: イスラエルセン，ハンス; ハンセン，エゴン，ベク; ヨハンセン，エリック; マドセン，ショレン，ミカエル; ニルソン，ダン; ブラング，アストリド
Original assignee: Chr Hansen AS; Bioteknologisk Institut
Current assignee: Chr Hansen AS; Bioteknologisk Institut
Priority date: 1992-12-30
Filing date: 1994-01-03
Publication date: 1996-01-30
Anticipated expiration: 2019-08-11
Also published as: WO1994016086A1; AU5832594A; DE69434196T2; PT677110E; CA2152898C; ES2235159T5; AU675821B2; EP0677110A1; DE69434196T3; JP3553065B2; EP0677110B2; NZ286635A; NZ259510A; EP0677110B1; ATE285476T1; ES2235159T3; DK0677110T3; DK0677110T4; CA2152898A1; DE69434196D1

Abstract

(57)【要約】プロモータープローブ遺伝子としてプロモーターレス構造遺伝子からなる転位因子を含むＤＮＡ分子を乳酸菌の集団中に導入することからなる、プロモーターからなる乳酸菌ＤＮＡフラグメントの単離方法、上記方法を用いることによる調節可能なプロモーターからなる組換え乳酸菌の構築方法、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子と、それらに作動的に結合された、その遺伝子に天然では関連していない調節可能な乳酸菌プロモーターからなる組換え乳酸菌、そのような組換え乳酸菌の用途、および調節可能な乳酸菌プロモーターからなる組換えプラスミド。

Description

【発明の詳細な説明】挿入プロモーター含有の組換え乳酸菌とその構築方法＜発明の分野＞この発明は遺伝子的に改良された食品グレードの乳酸菌の分野に関する。特に、有用な乳酸菌プロモーターの単離方法と組換え乳酸菌の構築方法を提供し、そのプロモーターは、食品、動物用飼料や原生物的に（probiotically）活性な組成物の製造に有用である改良乳酸菌を得るのに利用される。＜技術的背景と従来技術＞古くから、乳酸菌培養物は、糖を、発酵により保存性の有機酸、主に乳酸および望ましい味とフレーバーを有する発酵食品の開発に関連した各種の代謝物へ変換する能力があるため、食品生産に用いられてきた。いくつかの乳酸菌は、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、脂肪分解酵素を含む加水分解酵素を産生し、その産生は、例えばチーズで望みのフレーバーを与えるのに寄与することができる。しかし、ヨーグルト、アシドフィルス乳（acidphilus milk）、バターおよびチーズを含む公知の伝統的な乳製品、発酵野菜、発酵肉製品および動物用飼料のような幅広い発酵食品を工業的に生産するには、各々が特定タイプの食品に適合する広い範囲の乳酸菌スターター培養物が必要とされる。このような培養物は、乳酸菌の天然種から、発酵される食品に存在する糖を発酵する能力、特異的な生育温度要件、所望のフレーバー物質の産生のような特性に基づき現在選択されているが、その特性の特異的な組合せにより、特別の食品の産生に有用ではあるが他の産生には通常あまり有用でない特異的に選択された野生型培養物が与えられる。天然種を選択することによる、有用な乳酸菌培養物を開発するための現在用いられている手法が、面倒で高価であることは明白である。その上、最適レベルで所望の特性を全て有するスターター培養種を提供することが難しいことが判明している。現在、この問題は、各々が特別の食品に望まれる特性の１つまたはいくつかを有する複数の選択された乳酸菌種からなるスターター培養物を用いることによって、通常解決されている。このような混合培養物を使用することの必要性が、乳酸菌スターター培養物の製造コストを上げることは当然であろう。乳酸菌が食品製造において伝統的に長期間応用され、かつ非病原性と考えられている事実から、乳酸菌は、発酵食品中に生菌として非常に多数、例えば１０⁸ 〜１０⁹／ｇ含まれていても、一般に安全（ＧＲＡＳ）な食品成分として認められている。最近、経済的かつ技術的にスターター培養物の開発をより可能にする方法を見出すことが重要な産業上の必要として広く認められている。遺伝子工学がこのニーズに合致する手段を与えることは明らかである。これに関連して、遺伝子工学を用いて所望の遺伝子を導入することによって開発される食品製造用乳酸菌が、なおかつ消費上安全なものとして認められることが重要である。従って、組換え乳酸菌が、スターター培養物菌株によく見出される野生型の染色体外プラスミドからのＤＮＡを含む乳酸菌源のＤＮＡのみか、または組換え菌株に有害な発現型特徴を与えない非乳酸菌ＤＮＡを含むことが必須であると産業上考えられる。遺伝子的に改良した乳酸菌を提供するいくつかの試みがなされている。この試みの殆どは、所望の遺伝子産物をコードし、かつ乳酸菌中で複製しうる組換え発現ベクターの構築に向けられている。しかし、これらの試みの中でごく少数が、乳酸菌ＤＮＡのみからなるベクターを得ている。乳酸菌を改良する他のアプローチは、有用な遺伝子を細菌の染色体に挿入するか、または所望の遺伝子産物をコードする染色体遺伝子の発現を増強することである。もし、この試みが成功すれば、新しい遺伝子がプラスミドに導入された際によくみられる問題、すなわちプラスミドの固有の不安定性のため、または異なる不和合性グループに属する他のプラスミドの存在の結果としてのプラスミドの損失をさけることができる。それに対して、染色体に組込まれたことになる導入遺伝子は、一般的に娘細胞に安定に遺伝する。しかし、この最後の試みは、乳酸菌の染色体の詳細な知見がなく、かつ異種ＤＮＡの染色体組込みを得る安定な方法がないために、乳酸菌ではまだ十分に研究されていない。なお、最近の刊行物では、いわゆる組込みベクターによりラクトコッカスラクチスssp．ラクチスでこのような染色体組込みが報告されている（文献46）。相同または異種遺伝子の発現は、例えばその遺伝子と天然で（naturally）関連したプロモーター配列を、転写レベルで遺伝子の増強した発現に導くより強いプロモーター配列で置換することにより増強することができることが知られている。かくして、ＤＤ228564は、イー．コリおよび／またはビー．ズブチリス中で複製することができる発現ベクターの製法を開示し、その方法は、構造遺伝子からなるプロモーターレスの基本イー．コリおよび／またはビー．ズブチリスプラスミドのユニーク制限部位に、基本プラスミドのユニーク制限部位に対応する制限酵素での制限によりストレプトコッカス種から単離されたプロモーター担持ＤＮＡフラグメントを挿入し、ベクターで形質転換されかつ構造遺伝子を発現するイー．コリおよび／またはビーズブチリスから組換えベクターを単離することからなる。ヤングマンら｛Youngman et al（1987）｝は、トランスポゾンＴｎ917を用いて、バシラス種（spp.）のプロモーターを単離する方法を開示している。しかしながら、この方法は、バシラス種の３７℃以上の温度で生育する能力によるものであり、さらに、このバシラス種における転位方法により、トラスポゾンが優性のホットスポットに組込まれ、それによって単一の優性組込み体（dominant int egrant）が生ずる結果になることが見出されている。最近、乳酸菌のラクトコッカスラクチスにおいて、イー．コリ遺伝子産物即ちβ−ラクタマーゼのより効果的な発現と分泌を得るために、乳酸菌プロモーターからなる配列および／またはプロモーターシグナルペプチド配列が、プラスミド中の弱い天然のプロモーターおよび／またはプロモーターシグナルペプチド配列を置換するのに用いることができることが示唆されている（文献28）。これらの著者らは、イー．コリおよび／またはビー．ズブチリス（B.subtilis）中で複製でき、かつプロモーターレスcat遺伝子と適切な制限部位とからなるプロモータープローブベクターを用いて、ラクトコッカス染色体のフラグメントを挿入し、イー．コリまたはビー．ズブチリスから単離されかつcat遺伝子を発現する組換えプラスミドをスクリーニングすることによって、ラクトコッカスプロモーター配列を同定した。しかしながら、乳酸菌源のものではなく非乳酸菌中で複製されるベクターにおける乳酸菌プロモーターの挿入を、非乳酸菌においてスクリーニングすることに関しているこのような方法では、源である乳酸菌中で機能する、有用な乳酸菌プロモーターの直接的な原位置（insitu）の同定はできない。そのような直接的な方法は、この発明によって提供される。＜発明の要約＞１つの観点において、この発明は、ｉ）（ａ）プロモータープローブ遺伝子としてプロモーターレス（promoterless ）構造遺伝子からなる転位因子、（ｂ）検出可能な選択マーカー遺伝子、および（ｃ）乳酸菌中で機能的である複製起点からなる、乳酸菌中で複製するＤＮＡ分子を選択し、 ii）そのＤＮＡ分子を乳酸菌の集団に導入し、その集団を転位因子の転位を起こさせる条件下に置き、 iii）プロモーターレス遺伝子が発現される乳酸菌集団の細胞を選択し、 iv）その細胞をクローニングし、そのクローンから、原プロモーターレス遺伝子（originally promoterless gene）に作動的に結合した乳酸菌プロモーターと、おそらくそのプロモーターの機能を制御する配列とからなるＤＮＡフラグメントを単離する工程からなる、プロモーターからなる乳酸菌ＤＮＡフラグメントの単離方法に関する。さらなる観点において、この発明は、ｉ．）上記方法に従って、調節可能な乳酸菌プロモーターからなるＤＮＡフラグメントを単離し、 ii）そのプロモーターからなる単離したフラグメントを、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子の上流で乳酸菌中に挿入し、それによって挿入したプロモーターを前記遺伝子と作動的に結合させる工程からなる組換え乳酸菌の構築方法、またはｉ）請求項１の方法に従って、調節可能な乳酸菌プロモーターからなるＤＮＡフラグメントを単離し、 ii）所望の遺伝子産物をコードする遺伝子を乳酸菌中に挿入し、 iii）前記プロモーターからなる単離したフラグメントを、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子の上流で工程ii）で得られる乳酸菌中に挿入し、それによって挿入したプロモーターを前記遺伝子と作動的に結合させる工程からなる組換え乳酸菌の構築方法を提供する。さらに、さらなる観点によれば、この発明は、ｉ）（ａ）プロモータープローブ遺伝子としてプロモーターレス構造遺伝子からなる転位因子、（ｂ）検出可能な選択マーカー遺伝子、および（ｃ）乳酸菌中で機能的である複製起点からなる、乳酸菌中で複製するＤＮＡ分子を選択し、 ii）転位因子の転位を起こさせる条件下で、工程ｉ）のＤＮＡ分子を乳酸菌の集団中に導入し、 iii）プロモーターレス構造遺伝子が、乳酸菌細胞の天然の調節可能なプロモーターに作動的に結合した結果として調節可能に発現されている乳酸菌集団の細胞を選択し、 iv）工程iii）の乳酸菌細胞のレプリコンにおける、転位因子が組込まれることが可能な部位を同定し、ｖ）工程iv）で同定した部位または機能的に同等の部位で、乳酸菌集団の非組込み細胞中に、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子を挿入し、それによってその遺伝子を前記天然の乳酸菌プロモーターに作動的に結合させる工程からなり、ここで挿入した遺伝子の発現が、天然プロモーターに作動的に結合したときの遺伝子の発現と比較すると変化している組換え乳酸菌の構築方法に関する。他のさらなる観点によれば、この発明は、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子と、それらに作動的に結合された、その遺伝子に天然では関連していない調節可能な乳酸菌プロモーターからなり、前記プロモーターの存在によって、その遺伝子の発現が、その天然のプロモーターに作動的に結合したときの遺伝子の発現に比べると変化されている組換え乳酸菌、および乳酸菌中で機能的である乳酸菌プロモーターと、それらに作動的に結合された所望の遺伝子産物をコードする遺伝子からなり、そのプロモーターが、前記遺伝子と天然では関連していないものである単離ＤＮＡフラグメントに関する。この発明はまた、食品の製造、動物用飼料の保存および原生物的に活性な組成物の製造における、ここで定義した組換え乳酸菌の使用に関する。さらに他の観点によれば、この発明は、調節可能な乳酸菌プロモーターからなるＤＮＡ配列、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子、乳酸菌中で機能的である乳酸菌レプリコン、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子がプロモーターに作動的に結合され、それによってプラスミドが乳酸菌中に存在するときにその遺伝子が転写されうるようにＤＮＡ配列を挿入させる挿入部位からなる組換えプラスミドを提供する。なおさらなる観点によれば、この発明は、所望の遺伝子産物をコードするプロモーターレス遺伝子からなるベクター、乳酸菌中で機能的であるシータ（θ）複製乳酸菌レプリコンおよびＤＮＡ配列を挿入させる挿入部位からなり、その挿入部位に調節可能な乳酸菌プロモーターからなるＤＮＡ配列が挿入されており、その挿入によって所望の遺伝子産物をコードする遺伝子がプロモーターに作動的に結合されて、その遺伝子が転写されるようになる組換えプラスミドに関する。かくして、このようなプラスミドは、ベクターとしてのプラスミドｐＡＫ80からなる。＜発明の詳細な説明＞この発明の主な目的は、改良乳酸菌が乳酸菌種由来のＤＮＡまたは非乳酸菌種からのＤＮＡのみを含有する意味で食品グレードであり、その存在が一般に安全と認められうる改良乳酸菌を構築する手段を提供することである。ここで用いた用語“乳酸菌（lactic acidbacterium）は、糖を発酵して、主に産生される酸としての乳酸、酢酸およびプロピオン酸を含む酸類を産生する、グラム陽性、微好気性または嫌気性細菌を示す。工業的に最も有用な乳酸菌は、ラクトコッカス種（Lactococcus spp.）、ストレプトコツカス種（Streptococcusspp.）、ラクトバシラス種（Lactobacillus spp.）、ロイコノストック種（Leuconostoc spp.）、ペデイオコッカス種（Pediococcus spp.）、ブレビバクテリウム種（Brevibac terium spp.）、プロピオニバクテリウム種（Propionibacterium spp.）およびビフィドバクテリウム種（Bifidobacterium spp.）のなかに見出される。上記のように、この発明は、１つの観点において、プロモーターからなる乳酸菌ＤＮＡフラグメントの単離方法を提供する。この方法の第１工程では、乳酸菌中で複製することができ、転位因子、プロモータープローブ遺伝子としてのプロモーターレス構造遺伝子、検出可能な選択マーカー遺伝子および乳酸菌中で機能的である複製起点からなるＤＮＡ分子が提供される。このようなフラグメントを乳酸菌中に導入し、続いて転位イベントの結果として宿主細胞レプリコン（宿主によって担持された染色体および／またはプラスミドを含む）に組み込むことができると、宿主細胞プロモーターは、組込まれたＤＮＡフラグメントのプロモーターレス構造遺伝子の宿主細胞における発現を検出することによって同定することができる。これは、分裂レプリコン分子に存在するプロモーター領域が遺伝子に作動的に結合するようになるレプリコンの部位で転位因子の挿入が起こらないかぎり、プロモーター領域を欠く構造遺伝子は発現できないからである。この明細書において、用語「転位因子（transposable element）」は、それ自体を他のＤＮＡ分子に挿入できる能力を有する二本鎖ＤＮＡ分子を示すために用いられる。転位因子自体を挿入する方法は、「転位（transposition）」と命名され、この方法は、「トランスポザーゼ（transposase）」として知られる蛋白を必要とする（詳細な説明については文献３参照）。転位方法は、転位因子を第２ＤＮＡ分子の特定部位に挿入することに起因する。この挿入は、いくつかの意味のある結果を有する。第１に、第２（レシピエント）ＤＮＡ分子の原ＤＮＡ配列が、物理的かつ機能的に分解される。第２に、転位は、新しいＤＮＡを第２ＤＮＡ分子に導入することに起因するので、相同または異種ＤＮＡを特定のＤＮＡ配列に導入する手段が提供される。第３は、転位因子のＤＮＡ配列への挿入が、挿入部位の側面に位置するＤＮＡ配列の発現と体制に関する情報を与えうるように転位因子を処理することができる。例えば、転位因子の末端近くに、非発現または非分泌遺伝子産物をエンコードする遺伝子を挿入することができ、従ってこのような転位因子は、プロモーターおよび分泌シグナルペプチドのプローブを与える。この発明に従って使用できる転位因子は、サイズと機能体制の両者が多様である。かくして、「挿入配列」と称する簡単な転位因子は、因子自身の動きに無関係な機能をエンコードせず、一般に２kbより短い。全ての転位因子と同様に、挿入配列は、互いに逆向きの繰返しである相補的配列を含む特殊化された末端を有する。このような逆向きの繰返し配列の存在が、転位に必須とみられる。トランスポザーゼ酵素は、転位因子の両端でＤＮＡ配列に結合することによって転位を媒介すると考えられる。有用な転位因子には、トランスポゾンが含まれる。用語「トランスポゾン（tr ansposons）」は、挿入配列より大きく、かつトランスポザーゼ系に加えて抗生物質または他の選択可能な決定因子に対する細胞耐性を与える蛋白のようないくつかの遺伝子産物をエンコードする転位因子を意味する。遺伝子工学の道具としての転位因子の開発に関する殆どの研究は、グラム陰性菌種でなされているが、グラム陽性菌種中で機能的であるいくつかのトランスポゾンが単離され、主にバシラス（Bacillus）種、リステリア（Listeria）種およびコリネバクテリウム（Corynebacterium）種において、また少ないけれども乳酸菌においても研究されている。乳酸菌で使用できるトランスポゾンの例には、ストレプトコッカスから単離され、ことにリステリア（Listeria）種、マイコプラズマ（Mycoplasma）種、スタフィロコッカス（Staphylococcus）種において機能的なＴｎ916；ストレプトコッカスサングイス（Streptococcus sanguis）から単離され、乳酸菌種であるラクトバシラスプランタルム（Lactobacillus plantarum）、ロイコノストツククレモリス（Leuconostoc cremoris）およびラクトコツカスラクチス（Lactococcus lact is）において転位することが示されているＴｎ919、バシラス種とリステリア種において転位することが知られているストレプトコツカスファエカリス（Stre ptococcusfaecalis）から単離されたＴｎ917がある。この発明の目的に関して、有用な転位因子は、オペロン融合と転写融合を媒介するものである。従って、上記のグラム陽性トランスポゾンの誘導体を含む、標的として乳酸菌ＤＮＡ分子を有するそのようなトランポゾンの融合発生誘導体を、この発明の方法に使用することができる。例えば、融合発生トランスポゾン誘導体（fusion-generatingtransposon derivatives）は、その発現を容易に検出することができるプロモーターレス構造遺伝子からなる。このようなプロモーターレス構造遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を与える遺伝子産物をコードする遺伝子、栄養要求性欠失を補足する遺伝子産物をコードする遺伝子、または適当な固体もしくは液体培地で着色反応する物質のような容易に検出することができる最終産物を有する酵素をコードする遺伝子から選択することができる。例えば、プロモーターレスlacZ遺伝子を、転位媒介融合を得るのに適切な配向でトランスポゾンからなるプラスミドに挿入することにより、それを含有する細菌を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ x-gal）を含むプレートで増殖させると、β−ガラクトシダーゼの発現の結果として青色に変わるプラスミドベクターが得られる。このようなベクターで生じた染色体またはプラスミドへの転位挿入は、その挿入が機能性プロモーターの下流でかつ転写融合をもたらす右配向に起こらなければ、白色コロニーを産生する。このように、プロモーターレス遺伝子は、プロモーターおよび／またはオペロンプローブ遺伝子として働く。別の例として、適切な融合発生トランスポゾン誘導体は、プロモーターレス遺伝子cat-86遺伝子からなり、その遺伝子産物はフロラムフェニコール耐性を媒介する。この明細書において、適切な転位因子の本質的な特徴は、高度のランダムさで転位する能力があることである。転位因子は、標的特異性において大きく変化し、その挿入部位は、因子配列に殆どもしくは全く類似性を示さない。完全にランダムに挿入する因子は見出されていないけれども、ある因子は、何れかの遺伝子において、２〜３から何百もの標的部位を有しているであろう。他の因子は、単一の染色体部位のみに挿入する高い部位特異性を示している。なお他の因子は、ある種において擬似ランダムに挿入するとみられるが、ＤＮＡの特定領域またはＤＮＡ分子のある領域を好む。この発明の目的のためには、ランダムかまたは少なくとも擬似ランダムに組込まれる転位因子が好ましい。用語「擬似ランダム（ quasi-randomly）」は、このＤＮＡフラグメントにおいて予想される挿入割合に対する公知サイズの標的ＤＮＡフラグメントにおいて観察される挿入イベントの総数の割合に関して、組込みランダムの程度としてここで定義され、最大５、好ましくは最大４、より好ましくは最大３、特に最大2.5である。有用な具体例では、染色体ＤＮＡ対する優先性を有する転位因子が好ましい。ある好ましい具体例では、乳酸菌中で複製することができかつＴｎ917トランスポゾンの融合発生誘導体からなるＤＮＡ分子を、この発明の方法のために選択することができる。このような誘導体には、ＰＴＶ32、ｐＬＴＶ 1、ｐＬＴＶ3、ｐＴＶ51、ｐＴＶ52およびｐＴＶ53を含むｐＴＶシリーズのプラスミドが包含される。これらの中で、ｐＴＶ32およびｐＬＴＶ1が特に有用である。その上、この発明の方法の工程（ｉ）で得られるようなＤＮＡ分子は、ＤＮＡフラグメントが導入された細胞を選択させる検出可能な選択マーカー遺伝子からなる。これに関連して、便利なマーカー遺伝子には、例えばエリスロマイシンやリンコマイシンのようなマクロライド抗生物質、テトラサイクリン、β−ラクタム抗生物質およびクロラムフエニコールのような抗生物質に耐性を与える遺伝子産物をコードするものがある。他の例として、マーカー遺伝子は、ＤＮＡフラグメントが導入される宿主細胞における栄養要求の相補性をコードしていてもよく、または上記のLacZ遺伝子のような容易に検出することができる最終産物を発生しうる酵素をコードする遺伝子であってもよい。この方法の第２工程では、上記定義のＤＮＡ分子が、乳酸菌の細胞集団中に導入される。このような導入は、ＤＮＡを宿主細胞に導入する公知技術に従って行うことができ、それには、プロトプラスト細胞の形質転換、エレクトロポレーシヨンによる形質転換、またはＤＮＡフラグメントが接合性因子の場合には接合による形質転換が含まれる。選択した方法は、少なくともＤＮＡのμｇ当り５×１０⁴、例えばＤＮＡのμｇ当り少なくとも１０⁵のようなＤＮＡμｇ当り少なくとも１０⁴組換え細胞のＤＮＡ導入頻度になるのが好ましい。転位因子の宿主細胞ＤＮＡへの高い確立での組込みを得るのを確実にするためには、ＤＮＡ分子が宿主細胞中で複製できるものであることが必須である。従って、工程（ii）は、導入したレプリコンを複製させるサブ工程を含め、どの程度の複製が、形質転換細胞または接合完了体に起ったかを調べる方法を伴うことができる。この明細書において、複製の適切な程度は、細胞当り５〜20 の範囲のコピー数と考えられる。この範囲を実質的に越えるコピー数は、次の転位が起こるための本質的前提条件であるレプリコンのキュアリングをより達成困難にするであろう。さらなるサブ工程では、工程（ii）は、形質転換細胞または接合完了体細胞を、転位を生じさせる条件下に付すことからなる。非乳酸菌での転位は、細胞の環境条件下で１以上のシフトによって誘発することができる。その例として、ビー．ズブチリスにおけるｐＴＶ−ベースのＴｎ917突然変異誘発の方法には、温度アップシフトと組合せた抗生物質スイッチを含む工程が含まれる。Ｔｎ917erm遺伝子発現と転位は、共に、ビー．ズブチリス中でエリスロマイシンにより誘発される（文献57）。ビー．ズブチリス中では、ｐＥ194Ts-repの複製活性が、37℃ 以上の温度でブロックされる（文献56）。結果として、ｐＴＶプラスミドのキュアリング、転位の誘発および選択は、エリスロマイシンの存在下、42℃を越える温度で、ビー．ズブチリスを増殖させることによって行われる。しかしながら、この発明に至る実験中、ビー．ズブチリスで用いた上記手順は、例示したラクトコッカスラクチス亜種ラクチスＭＧ1614およびＭＧ1363のような乳酸菌に適用できないことを見出した。しかし、ｐＴＶ32もｐＬＴＶ1も、エリスロマイシンの存在下30℃で生育させたとき、これらのプラスミドで形質転換したラクトコッカス細胞から抽出することができないことを意外にも見出した。このことは、プラスミドの不随した損失をともなうＴｎ917誘導体の染色体への転位（組込み）が、これらの条件下で起こったことを示した。従って、この発明の１つの有用な具体例では、この方法の工程（ii）は、フリーの転位因子含有ＤＮＡ分子の形質転換乳酸菌における転位が、転位因子が耐性を与える抗生物質の存在下20〜35℃の範囲、例えば30℃の温度で形質転換細胞を増殖させることによって、このようなフリー分子の付随するキュアリングをともなって誘発されるサブ工程を含んでいる。この方法の次の工程（iii）では、組込み体細胞がクローン化され、転位因子のプロモーターレス遺伝子を発現することができる組込み体細胞を検出する選択手順に付される。この選択手順は、ブロモーターレス遺伝子のタイプに依存するであろう。例えば、プロモーターレスlacZ遺伝子が用いられるとき、選択は、クローン化された組込み体を、色の展開をともなうβ−ガラクトシダーゼによって分解しうる物質を含有する培地で培養することによって行うことができるか、または抗生物質耐性遺伝子が用いられるときには、その組込み体を、対応する抗生物質を補った培地で選択することができる。この方法の工程（iv）では、プロモーターレス構造遺伝子を発現する選択組込み体がクローン化され、原プロモーターレス遺伝子と作動的に結合されるプロモーターと、おそらくプロモーター機能を調整する配列とを含む乳酸菌レプリコン領域が、適当な制限酵素を用いてクローン化細胞から単離される。得られる一次プロモーター含有ＤＮＡ配列は、選択した酵素（酵素類）に関する制限部位の位置に依存して変動するサイズを有することができる。単離されたプロモーター含有ＤＮＡ配列／フラグメントのさらなる応用として、単離したプロモーターとおそらくプロモーターの機能を調節する配列とからなるより小さなフラグメントを得るために、これらの一次配列のサブ配列を作るのが有利であろう。一次プロモーター含有フラグメントは、例えば40〜600kbの範囲のサイズを有することができるため、プロモーターとおそらくその調整に必要とされる他の配列とからなるサブ配列は、50〜10,000塩基対の範囲内にあるサイズを有するのがより適切であろう。この発明によれば、上記定義の工程（ii）において転位因子からなるＤＮＡフラグメントが導入されている乳酸菌の細胞の集団は、ラクトコッカス種、ストレプトコッカス種、ラクトバシラス種、ロイコノストック種、ペディオコッカス種、ブレビバクテリウム種、プロピオニバクテリウム種およびビフィドバクテリウム種から選択するのが好ましい。１つの特に好ましい具体例では、乳酸菌は、ラクトコッカスラクチス亜種ラクチス種ＭＧ1614およびＭＧ1363のようなラクトコツカスラクチス亜種ラクチス（Lactoccus lactis snbspecies lactis）から選択される。ここで定義したような遺伝子的に改良した乳酸菌の食品製造への工業的使用の中で、乳酸菌スターター培養物の特異的発現型形質が表われるかもしくは失うか（turn on or switch off）、またはその形質の発現率が成熟工程を含む製造工程の特定期間中に増強もしくは減少するように、細菌の機能を調節できることが有利であろう。例えば、チーズ製造においては、凝固工程中高度に蛋白分解的もしくは脂肪分解的に活性ではないが、チーズの成熟中はそうである培養物を使用することが望ましいであろう。従って、１つの有利な具体例では、この方法は、単離されかつ選択されたＤＮＡフラグメント中に含まれたプロモーターが、調節可能なプロモーターである方法であろう。このような方法は、調節配列をおそらく含む単離プロモーター含有配列が、調節の様式でスクリーニングされる工程を含むものである。この明細書において、調節可能なプロモーターは、ｐＨおよび／または環境中のアルギニン含量、生育温度、熱ショック遺伝子の発現を引き出す温度シフト、イオン強度／ＮａＣｌ含量を含む増殖培地組成、およびプロモーターからなるＤＮＡ分子が導入されている乳酸菌の発育相／成長速度から選択される因子によって調節することができる。プロモーターの調節の様式の１例は、緊縮調節の現象であり、それによって、ある細胞のＲＮＡ合成が、その細胞がアミノ酸のような必須栄養素を渇望する場合に中断されることが理解される。従って、この発明による適切な調節可能なプロモーターは、緊縮調節下にあるものである。プロモーターを調節する有用な様式の他の例は、その前駆体から、プリンヌクレオチドの新規合成（de novo合成）に関連する酵素をコードする遺伝子を調節するプロモーターを選択することである。プリン化合物の存在下で抑制されることにより調節されるそのようなプロモーターを、発現が調節されるべき遺伝子の前で乳酸菌中に挿入することにより、この遺伝子は、その細菌がプリン化合物前駆体を含まない培地で生育するときのみ発現されるであろう。このような調節プロモーターの例は、以下に記載するようなラクトコッカルpurＤプロモーターである。プロモーター調節の様式をスクリーニングする１つの例として、遺伝子産物をコードする遺伝子に作動的に結合しており、その発現が容易に検出できるプロモーターが転位によって導入されている細胞を、適切な培地上で培養し、このプレートを10〜30℃の範囲内の異なる温度のような温度変化でインキュベートし、温度依存遺伝子発現を観察することにより、単離プロモーターを、温度／発育相調節に関してスクリーニングすることができる。しかしながら、組込み体細胞（integrants cells）の成長速度は生育温度に依存するので、観察された明らかな温度依存発現が直接的な温度調節の結果であるのか、またはその依存が発育相調節によるのかどうかを決定することはできない。同様に、遺伝子発現の可能なｐＨおよび／またはアルギニン依存調節を、上記の組込み体細胞をその組込み体細胞培養物の増殖後にｐＨ値が変動する結果となる異なる組成を有する培地で培養することによってスクリーニングすることができる。その例として、細胞は、最終ｐＨが約５である修飾ＧＭ17培地および通常のグルコース含量の１／５を有し、0.5％アルギニンを補った修飾ＧＭ17培地で生育することができる。上記のようなラクトコッカスラクチス組込み体細胞の培養物の増殖後のこのような培地のｐＨは、約９であろう。単離遺伝子の制御下での遺伝子の発現が、２つのｐＨ値の１つでのみ観察されるとき、ｐＨおよび／またはアルギニン依存調節が論証される。この発明の１つの目的は、所望の遺伝子産物をコードする乳酸菌遺伝子の発現を増強させるプロモーター含有配列を挿入することによって、改良した組換え乳酸菌を構築する手段を提供することであるので、プロモーター配列の強さをスクリーニングすることは、この発明の１部である。このスクリーニングは、それ自体公知の方法に従って行われる。上記したように、さらなる観点によれば、この発明は、所望の遺伝子産物をコードする乳酸菌遺伝子を含有する組換え乳酸菌の構築方法に関し、その方法は、第１工程として、適当な場合に追加の調節配列を含む乳酸菌プロモーターからなるＤＮＡ配列を上記方法に従って単離することからなっている。この方法は、第２工程では、こうして単離したＤＮＡ配列を、所望の遺伝子産物をコードする乳酸菌遺伝子の上流で乳酸菌に挿入することからなり、それによって、挿入プロモーターとおそらく上記の調節配列が、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子と作動的に結合されるようになる。所望の遺伝子産物をコードする遺伝子は、この発明によれば、相同遺伝子であるか、または乳酸菌由来の遺伝子を含む挿入された異種遺伝子であろう。遺伝子が挿入遺伝子のとき、プロモーター配列からなるものと同じＤＮＡ配列に挿入することができるか、または異なるＤＮＡ配列に挿入することができる。１つの有用な具体例では、上記の単離プロモーター含有配列の挿入は、乳酸菌の染色体に行うことができ、他の有用な具体例では、その配列は、染色体外的に、例えばその細菌が保有するプラスミドに挿入することができる。上記したように、プロモーター含有配列を染色体に組込むのが有利であろう。これは、その配列と染色体に作動的に結合される遺伝子が、染色体外成分の位置と比べてより安定に含まれるからである。プロモーター含有配列の挿入は、それ自体公知の遺伝子工学の方法、例えば、通常の制限および連結法によるプラスミドへの挿入、またはトランスホゾンもしくはバクテリオファージを用いるかまたは通常の組換え技術による染色体への組込みに従って行われる。１つの興味ある具体例によれば、単離したプロモーター含有配列は、さらなる配列からなり、それによって、単離したプロモーターは、確立事象によって調節されるようになる。このような調節は、例えば、挿入したプロモーター含有配列の制御下で、徐々に減少する遺伝子活性を持たすのが有利な、乳酸培養に有用である。このようなさらなる配列は、例えば、プロモーターまたはプロモーター機能に実際的に必要とされる物質をコードする遺伝子を組換え除去させる配列であることができる。プロモーター機能の確率調節は、プロモーターの機能を阻害する調節配列を組換え除去する形態でもあり、それによつて、徐々に増加するプロモーター活性を、組換え細胞集団レベルで得ることができる。上記のように、この発明は、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子からなり、その発現が、天然プロモーターに作動的に結合したときの遺伝子の発現に比較して変更されている、組換え乳酸菌を構築するさらなる方法を提供する。この方法では、上記で定義されかつプロモータープローブ遺伝子を有する転位因子からなるＤＮＡ分子は、乳酸菌レプリコン（染色体またはプラスミド）における部位または複数の部位を同定するのに利用され、そこでは、転位因子が組込まれ、プロモーターレスプローブ遺伝子がレプリコンに存在するプロモーター配列に作動的に結合されるようになり、次いで所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が、その部位もしくはそれらの部位、またはそれらに機能的に等価である部位もしくは複数の部位で非組込み乳酸菌細胞に挿入され、それによってこの遺伝子が同定されたプロモーター配列に作動的に結合するようになる。転位因子は２つの塩基対の間に挿入されるので、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子は、それらの２つの塩基対間に挿入する外に、同定プロモーター配列に挿入遺伝子の転写を調節させる特異的な挿入（組込み）部位から距離を置いて位置する近傍部位にも挿入することができることが理解されよう。この明細書で、このような近傍部位を機能的な等価部位として言及する。このような機能的に等価な部位が見出される特異的なトランスポゾン組込み部位からの距離は、1〜2000塩基対の範囲内であると考えられる。この発明によれば、上記定義の部位に挿入される所望の遺伝子産物をコードする遺伝子は、乳酸菌由来の遺伝子を含む相同もしくは異種遺伝子である。さらなる観点によれば、この発明は、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子と、それらに作動的に結合された、その遺伝子とは天然では関連していない乳酸菌プロモーターからなり、そのプロモーターの存在によって、その遺伝子の発現が、その天然のプロモーターに作動的に結合されたときの遺伝子の発現と比較して変化されている、組換え乳酸菌を提供する。ここで使用されるとき、用語「変えられた発現（alteredexpression）」は、遺伝子の発現の調節が、その天然のプロモーターに作動的に結合されたときの遺伝子の調節とは量的または質的に異なることを示すために用いられる。量的に異なる発現は、遺伝子産物の発現の増加レベル、例えば少なくとも10％増加した発現として認識することができる。例えば、発現は、少なくとも２５％、例えば少なくとも50％まで増加されるのが有利である。ある具体例では、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子の発現が、天然のプロモーターの制御下にあるときの遺伝子の発現より低い組換え乳酸菌を提供するのが有利である。従って、有用な組換え細菌は、少なくとも10％減少、好ましくは少なくとも25％、またはより好ましくは少なくとも５０％減少した発現レベルを有するであろう。質的には、その天然のプロモーターが本質的なプロモーターである所望の遺伝子産物をコードする遺伝子の発現は、それを調節可能なプロモーターに作動的に結合することによって変えることができ、また天然の調節可能なプロモーターを有する遺伝子の発現は、それを本質的なプロモーターに結合することによって変えることができる。さらなる具体例では、天然の調節可能なプロモーターを有する遺伝子の発現は、それを異なる様式の調節を有する調節可能なプロモーターに結合することによって、質的に変えることができる。１つの有用な具体例では、この発明は、上記で定義したような挿入された乳酸プロモーターを含むＤＮＡ配列からなるものとして、組換え乳酸菌を提供し、その乳酸菌プロモーターは、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子に作動的に結合されている。この発明による所望の遺伝子産物をコードする遺伝子は、染色体遺伝子または染色体外に位置した遺伝子である。ある好ましい具体例では、上記の所望の遺伝子産物をコードする遺伝子は、染色体または特定の乳酸菌において天然に生じるプラスミド上の天然の位置に存在する相同遺伝子としてこの明細書において定義される天然の遺伝子であるか、または天然の位置から単離され、同じ乳酸菌菌株の他の位置に再挿入された相同遺伝子である。さらに他の有用な具体例では、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子は、非乳酸菌種または他の乳酸菌種から単離される異種遺伝子である。ある具体例においては、挿入プロモーターが調節可能なプロモーターであるのが好ましいけれども、他の有用な具体例では、また、挿入プロモーターが本質的なプロモーターである組換え乳酸菌を提供するのが有利である。挿入される選択プロモーターが調節可能なプロモーターであるとき、調節の様式は、確立事象による調節を含む、上記定義の要因から選択することができる。この発明による乳酸菌は、乳酸菌プロモーターからなる挿入ＤＮＡ配列がプラスミドに挿入されているものとして提供されるのが有利であろう。ある好ましい具体例では、そのようなプラスミドは、さらに、ここで定義した所望の遺伝子産物をコードする遺伝子、乳酸菌中で機能的である乳酸菌レプリコン、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子がプロモーターに作動的に結合されてそのプラスミドが乳酸菌中に存在するとき遺伝子の転写が可能となるようにＤＮＡ配列を挿入させる挿入部位からなるものである。プラスミドに挿入されるプロモーターは、ここで記載したように調節可能であるプロモーターが好ましい。これに関連して、適切な乳酸菌は、以下に記載されているプラスミドｐＡＫ80 またはｐＡＫ80：ＳＢ、ｐＡＫ80：143、ｐＡＫ80：162、ｐＡＫ80：163、ｐＡＫ80：170、ｐＡＫ80：224およびｐＡＫ80：242を含むこれらの誘導体を保有するものである。興味深い具体例では、この発明により組換えられる乳酸菌は、条件的複製挙動を有するプラスミド上に、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子を担持することができ、それによって、ある条件下でプラスミドコピー数は、例えば数百もしくは数千まで実質的に増加される。そのような複製挙動を有するプラスミドは、ランナウエイプラスミドとも称される。ここで定義した組換え乳酸菌は、ラクトコッカスラクチス亜種ラクチス、ラクトコッカスラクチス亜種ディアセチラクチス（diacetylactis）およびラクトコッカスラクチス亜種クレモリス（cremoris）を含むラクトコッカス種、ストレプトコッカスサリバリウス（St reptococcus salivarius）亜種サーモフィラス（thermophilus）を含むストレプトコッカス種、ラクトバシラスアシドフィラス（Lactobacillus acidophilus ）、ラクトバシラスプランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバシラスデルブラキイ（Lactobacillus dclbruckii）亜種ブルガリクス（bulgaric us）、ラクトバシラスヘルベティクス（Lactobacillus helveticus）を含むラクトバシラス種、ロイコノストックオエノス（Leuconostoc oenos）を含むロイコノストック種、ペデイオコッカス（Pediococcus）種、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）種、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）種、およびビフィドバクテリウムビフィダム（Bifidobacterium bifidum）を含むビフィドバクテリウム種から選択されるものであることができる。好ましい具体例では、組換え乳酸菌は、ここで定義したような挿入プロモーター含有配列が、ラクトコッカスラクチス亜種ラクチスのようなラクトコッカス種、ストレプトコッカス種、ラクトバシラス種、ロイコノストック種、ペディオコッカス種、ブレビバクテリウム種、プロピオニバクテリウム種、およびビフィドバクテリウム種から由来するものである。ある特別な具体例では、挿入プロモーターは、ラクトコッカスラクチス亜種ラクチス菌株ＭＧ1614、ＭＧ1363またはＣＨＣＣ285 （Chr.Hansens Laboratorium A/S）から単離することができる。挿入するプロモーターは、PIおよびPIIプロモーターを含むｔＲＮＡおよびｒＲＮＡプロモーター、および以下に記載するようなラクトコッカスラクチス亜種ラクチスからのpurＤプローターである。特に興味深いプロモーターは、保存配列（モティーフ）ＡＧＴＴからなるｔＲＮＡまたはｒＲＮＡプロモーターのような強力なプロモーターである。この組換え乳酸菌は、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が、リパーゼをコードする遺伝子、ヌクレアーゼをコードする遺伝子、アミノペプチダーゼのようなペプチダーゼをコードする遺伝子、プロテアーゼをコードする遺伝子、炭水化物代謝に関連した遺伝子産物をコードする遺伝子、クエン酸代謝に関連した遺伝子産物をコードする遺伝子、バクテリオファージ耐性に関連した遺伝子産物をコードする遺伝子、リゾチームのような溶菌酵素またはファージ溶菌酵素をコードする遺伝子、およびナイシンを含むバクテリオシンをコードする遺伝子から選択されるものであるのが好ましい。興味深い観点では、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子は、その遺伝子産物がナイシンのようなバクテリオシン、またはペディオシン（pediocin）に対する耐性を付与するものであろう。所望の遺伝子産物をコードする上記遺伝子は、乳酸菌由来の遺伝子であるか、またはそれらは、非乳酸菌微生物種または植物細胞およびヒトもしくは動物細胞を含む真核細胞由来の遺伝子であるのが適切であろう。真核細胞由来の有用な遺伝子の１つの例として、プラスミノーゲンが述べられるであろう。この発明の１つの特に好ましい具体例では、遺伝子は、ロイコノストック種の lacL遺伝子、ロイコノストック種のlacM遺伝子およびリジンアミノペプチダーゼのようなペプチダーゼをコードするラクトコッカスラクチス亜種ラクチス遺伝子から選択される。この発明によれば、ここで定義した組換え乳酸菌は、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が、レプリコンに存在するプロモーターの制御下にあるレプリコンの部位に挿入され、その部位での遺伝子の挿入により、その遺伝子がレプリコンに存在するプロモーターに作動的に結合されるようになるものであるのが適切であり、その部位は、プロモーターレス構造遺伝子からなる転位因子を用いてプロモーターレス構造遺伝子を挿入し、それにより原プロモーターレス遺伝子が、上記レプリコンに存在するプロモーターに作動的に結合されることによって発現可能になることにより同定可能である。所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が挿入される部位は、転位因子の挿入によって同定されるような２つの塩基対間の特定の部位に限定されず、転位因子のプロモーターレス遺伝子が作動的に結合するようになる乳酸菌プロモーターが、挿入遺伝子の発現を制御することができる、この特定部位からの距離以内のいずれの部位であってもよい。この明細書において、特別に同定された部位からこのような距離にある挿入部位を、機能的に等価な挿入部位と言及する。この発明によれば、上記定義のような所望の遺伝子産物をコードする遺伝子とともに上記定義のようなプロモーターからなる配列が挿入された組換え乳酸菌も提供される。上述のように、なおさらなる観点によれば、この発明は、（i）乳酸菌中で機能的である調節可能な乳酸菌プロモーターと、（ii）それらに作動的に結合された所望の遺伝子産物をコードする遺伝子からなり、そのプロモーターが、遺伝子と天然では関連がなく、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子に上で定義したような変えられた発現を付与するものである、単離ＤＮＡフラグメントを提供する。このようなＤＮＡフラグメントは、ここで定義した方法に従って単離することができる。１つの有用な具体例では、ＤＮＡフラグメントは、さらに少なくとも１つの転写ターミネーターを含むものである。このＤＮＡフラグメントは、100〜10000塩基対の範囲の大きさ、例えば200〜5000塩基対の範囲の大きさを有するフラグメントであるのが好ましい。この発明によれば、ＤＮＡフラグメントは、さらにプロモーターの調節に関連した遺伝子産物をコードする配列を含むものであってもよい。有用な具体例では、ＤＮＡフラグメントは、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が、リパーゼをコードする遺伝子、ペプチダーゼをコードする遺伝子、プロテアーゼをコードする遺伝子、炭水化物代謝に関連した遺伝子産物をコードする遺伝子、クエン酸代謝に関連した遺伝子産物をコードする遺伝子、バクテリオファージ耐性に関連した遺伝子産物をコードする遺伝子、溶菌酵素をコードする遺伝子、およびバクテリオシンをコードする遺伝子から選択されるものである。その遺伝子は、抗生物質または例えばナイシンもしくはペディオシンのようなバクテリオシンに対する耐性を付与する遺伝子産物をコードするものであってもよい。上記定義のようなＤＮＡフラグメントは、乳酸菌由来の遺伝子を含む相同もしくは異種遺伝子である、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子からなっていてもよい。従って、ある好ましい具体例では、遺伝子は、ロイコノストック種のlacL 遺伝子、ロイコノストック種のlacM遺伝子およびリジンアミノペプチダーゼをコードするラクトコッカスラクチス亜種ラクチス遺伝子から選択されるものである。ＤＮＡフラグメント中に含まれる乳酸菌プロモーターは、ここで述べたようなあらゆる乳酸菌種から単離することができ、上記定義のような本質的なまたは調節可能なプロモーターであることができる。この発明の特別な具体例では、プロモーターは、受託番号ＤＳＭ7360として寄託されたラクトコッカスラクチス亜種ラクチスＭＧ1363組込み体クローンP139-170 に含まれる調節可能なプロモーター、および受託番号ＤＳＭ7361として寄託されたラクトコッカスラクチス亜種ラクチスＭＧ1614組込み体クローン63bに含まれるプロモーターから選択される。この発明によれば、組換え細菌は、調節可能な乳酸菌プロモーターからなる挿入ＤＮＡ配列が、所望の遺伝子産物をコードするプロモーターレス遺伝子、細菌中で機能的であるθ複製する乳酸菌レプリコン、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子がプロモーターに作動的に結合されて遺伝子が転写されるようにＤＮＡ配列を挿入させる挿入部位からなるベクター中に挿入されているものであることができる。１つの具体例では、そのような細菌は、挿入ＤＮＡ配列が挿入されているベクターとして、プラスミドｐＡＫ80を含むであろう。ここで提供される組換え乳酸菌は、乳製品、肉製品および野菜製品を含む食品製造用のスターター培養物、および動物用飼料の保存に有用である。後者に関連して、この組換え細菌は、サイロに貯蔵される農作物の接種物として特に興味深いものである。細菌がこれらの目的に用いられるとき、それらは、例えば濃縮物のグラム（ｇ）当たり１０¹⁰〜１０¹²コロニー形成単位（CFUs）を含む、乾燥もしくは凍結細菌濃縮物の形態で便利に提供することができる。ここで定義したような組換え乳酸菌の興味深い用途は、原生物的に（probioti cally）活性な組成物の製造におけるものである。用語「原生物的に活性」とは、この目的のために選択される細菌が、胃腸管にコロニーを作ることができ、その結果この環境における微生物叢（microbial fl ora）に対する正の調節作用を発揮する特徴を有していることを示している。このような作用は、細菌が投与されるヒトもしくは動物における改良食品もしくは飼料転換として、または侵入する病原性微生物に対する増加した耐性として認めることができる。さらに、この組換え乳酸菌は、抗原決定基をコードする１以上の遺伝子が挿入される組換えワクチン菌株の製造に有用であることが予測される。この発明による組換えプラスミドは、乳酸菌プロモーターが上記に定義したような方法で調節可能なプロモーターであるものが好ましい。これに関連して、有用なプラスミドは、プラスミドｐＡＫ８０、またはｐＡＫ80:SB、ｐＡＫ80:143 、ｐＡＫ80:162、ｐＡＫ80:163、ｐＡＫ80:170、ｐＡＫ80:224およびｐＡＫ80:2 42を含むこれらの誘導体から選択することができる。この発明を、以下の実施例および図面でさらに例証する。図１は、ｐＴＶ32の地図である。以下の略語は、制限酵素部位SalIEcoRI、Pst I、XbaI、KnpIおよびSmaIを示している。Ｔｎ917はトランスポゾン部分を示し、 ermはエリスロマイシン耐性をコードする遺伝子を示し、blaはβ−ラクタマーゼをコードする遺伝子を示し、ColEI repはColEIプラスミドの複製起点を示し、ca tはクロラムフェニコールに対する耐性を仲介するクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を示し、lacZはイー．コリのプロモーターレスβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を示し、tetはテトラサイクリン耐性をコードする遺伝子を示し、ｐＥ194 Ts repはプラスミドｐＥ194由来の温度感受性の複製起点を示す。図２は、ｐＬＴＶ1の地図である（略語は図１の記号参照）。図３は、12の独立したエル．ラクチス亜種ラクチスＴＶ32組込み体のサザンハイブリダイゼーション分析（Southern hybridizationanalysls）を例証している。各々のレーンの頂上に示されている組込み体からのＤＮＡは、EcoRIで消化され、アガロースゲルを通して電気泳動にかけられ、ナイロン膜に移され、かつA: 32^Pで標識化されたｐＬＴＶ1、B:32^Pで標識化されたｐＥ194レプリコン特異的プローブを用いてハイブリッド形成されたものである。サイズマーカーは、キロベースペアーで与えられている。図４は、エル．ラクチス亜種ラクチスＴＶ３２組込み体からのSmal消化ＤＮＡのパルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）を示している。組込み体番号は、レーンの頂上に示されている。A:48.5kb、97.0kb、145.5kb等で下から始まるラムダラダー（lambda ladder）（Promega,Madison,USA）である。B:39.0kb、78.0kb、117k b等で下から始まるデルタ39ラムダラダー（Promega）である。Ｍは、エル．ラクチス亜種ラクチスＭＧ1614からのSmaI消化ＤＮＡである。図５は、優性のＴＶ３２組込み体からなるラクトコッカスラクチス亜種ラクチスＭＧ1614の培養物から採取された19のクローン（E1ーE19）のパルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）を例証している。Ａ、ＢおよびＭで示されているレーンは、上記図５で示されたとおりである。クローンE5の消化により、分離したバンドとして明視化することができないフラグメントが得られた。図６は、ラクトコッカスラクチス亜種ラクチスＭＧ1614 ＴＶ32 組込み体のプールされた培養物からランダムに採取された18のクローン（K1-K2, K4-K14,K16-K20）のパルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）を例証している。Ａ、ＢおよびＭで示されているレーンは、上記図５で示されたとおりである。図７は、プロモーター融合クローンコレクション番号１における調節されたIa cZ発現の調査のためのストリークパターンを示している。各々のクローンは、約 0.5cmの直線で、１μｇ／ｍｌのエリスロマイシンおよびX-galの320μｇ／ｍｌを含むプレート上にストリークされた。図８は、実施６に記載したようなｐＡＫ67.7の構築を例証している。Ｐは、ロイコノストックメセンテロイデス（Leuconostocmcsenteroides）亜種クレモリス（cremorjs）のβ−ガラクトシダーゼプロモーターを示し、rbsは、リボソーム結合部位を示す。プライマーlac-1およびlac-2に相同の部位は、小さい矢印で示されている。リボソーム結合部位は、ｐＡＫ67.7にも存在している。図９は、ｐＨ5.5および7.0で生育するLTV1組込み体170の成長とβ−ガラクトシダーゼ活性を例証している。図１０は、ｐＨ5.5および7.0で生育するLTV1組込み体SBの成長とβ−ガラクトシダーゼ活性を例証している。図１１は、２つのプロモーターと２つの推定の転写ターミネーターを含む単一オペロン中に配列された７つのｔＲＮＡ遺伝子と１つの5SｒＲＮＡ遺伝子を含むラクトコッカスラクチス亜種ラクチス菌株ＣＨＣＣ285からのＤＮＡフラグメントを例証している。図１２は、trnAの遺伝子体制およびヌクレオチド配列を示している。'tmaの導き出されたアミノ酸配列は、以下の１文字コードで示されている。停止コドンは星印で示されている。推定の−３５および−１０プロモーター配列（PI,PII）、−４４領域における保存モティーフ（motif）および緊縮調節に関連すると思われる保存配列（Chiaruttini＆Ｍilet，1993；Ogasawara et al.,1983）は、二重下線がひかれている。ｔＲＮＡ遺伝子およびrrfUの解読領域は下線がひかれている。推定の転写ターミネーターは、配列の上の矢印で示されている。クローニングおよびプロモータークローニングに用いられるScaIおよびSpeIの制限酵素部位の位置は、配列の上に示されている。図１３は、ラクトコッカスラクチス及びラクトコッカスクレモリスからのｔＲＮＡおよびｒＲＮＡプロモーター配列の比較を示している。保存−４４領域、−３５領域、ダブレットＴＧ（文献１９参照）、−１０およびバシラスズブチリス（Bacillus subtilis）の緊縮応答中の発現の調節に関連すると示唆されている保存配列（Ogasawara etal.,1983）は、下線がひかれている。Ａ：trnＡのＰＩ；Ｂ：trnＡのPII；Ｃ：ラクトコッカスクレモリスｔＲＮＡ^leu遺伝子からのP21（van der Ｖossen etal.,1987;この研究）；Ｄ：ラクトコツカスラクチスからのP2（Koivula et al.,1991）；Ｅ：ラクトコッカスラグチスオーカーサプレッサー遺伝子の前のプロモーター領域（F.Dickely ＆E.Bech Hansen, personal communication）;Ｆ:ラクトコッカスラクチスｔＲＮＡ^arg遺伝子からのP10（Koivula et al.,1991;この研究）;Ｇ:ラクトコッカスラクチスｒＲＮＡオペロンのプロモーター（Chiaruttlni＆Ｍilet,1993） ;Ｈ:ラクトコッカスラクチスｒＲＮＡオペロンからのＰ２（Beresford ＆ Condon，1993）；Ｉ：ラクトコッカスラクチスアンバーサプレッサー遺伝子の前の推定プロモ-ター（E．Johansen，未公開の結果）；Ｊ：ラクトコッカスラクチスからのP21（Koivula et al.,1991）。Con.は、整列された配列Ａ〜Ｈにおける同一のヌクレオチドを示している。図１４は、逆方向に転写を開始する近接したプロモーターとともに全purDプロモーター領域を含むラクトコッカスラクチスからの846 bp ＤＮＡフラグメントである。図１５は、調節された条件下での液体培地におけるpSMA344/ＭＧ-1363の発酵槽成長中の、時間に対するＯＤ₆₀₀およびβ−ガラクトシダーゼ活性を例証している。図１６は、ｐ170からの9.7 kbラクトコッカル（lactococcal）EcoRI-CｌaＩラグメントおよび欠失誘導体の制限地図である。図１７は、ｐ170の4.0 kbラクトコッカル（lactococcal） NdeＩ-ClaＩフラグメントおよび欠失誘導体の制限地図である。図１８は、乳酸菌染色体中への非複製プラスミドのキャンベル様組込み（Camp bell-like integration）を例証している。Ｐはプロモーターを示し、Ermはエリスロマイシン耐性遺伝子を示している。リポーター遺伝子は、ロイコノストックメセンテロイデスからのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子であり、イー．コリレプリコンは、ｐＶＡ891からのｐＡＣＹＣレプリコンである。黒領域は、プラスミドと染色体の間のＤＮＡ相同の領域を例証し、矢印は、プロモーターＰからの転写の方向を示している。実施例１ラクトコッカスラクチス亜種ラクチスＭＧ1614のｐＴＶ32およびｐＬＴＶ１での形質転換と、これらのプラスミドの複製の論証乳酸菌種ストレプトコッカスフアェカリス（Streptococcusfaecalis）からのトランスポゾンＴｎ917の誘導体を含むいくつかのベクター（ｐＴＶプラスミド）を、バシラスズブチリスおよび他のグラム陽性細菌（文献１０、５５および５７）に用いるために構築した。ｐＴＶプラスミドシリーズの２つの誘導体、ｐＴＶ32 （文献５７）およびｐＬＴＶ1 （文献５５）を、このためおよび以下の実験のために選択した。ｐＴＶ32 （15.6 kb）およびｐＬＴＶ1 （20.6 kb）は、（ｉ）プラスミドE19 4からの温度感受性レプリコン（ｐＥ194Ts-rep）、 (ii)そのプラスミドのレプリコン部分上の、クロラムフェニコール耐性（Ｃｍ^r）を付与するcat遺伝子（ｐＴＶ32）またはテトラサイクリン耐性（Tc^r）遺伝子(ｐＬＴＶ1）、 (（iii)エリスロマイシン耐性（Em^r）を付与するerm遺伝子を保有するＴｎ917、および（i v）ermに近接する末端で非必須のＴｎ917ＤＮＡに挿入されたバシラスズブチリスからのリボソーム結合部位を有するプロモーターレスイー．コリlacZ遺伝子（図１および２）を含んでいる。ｐＴＶ32およびｐＬＴＶ1は、各々イー．コリＰＹ1173およびバシラスズブチリスＰＹ258から単離された。これらの菌株は、ペンシルバニアの大学のP.Youngmanから得られた。菌株ＮＣＤＯ 712のプロファージフリーで、プラスミドフリーで、ストレプトマイシンおよびリファンピシン耐性の誘導体であるラクトコッカスラクチス亜種ラクチスＭＧ1614を、HoloおよびNessによって記載されたエレクトロポレーション法を用いて、ｐＴＶ32またはｐＬＴＶ1で形質転換し（文献２０）、一次形質転換細胞を、０.５Ｍスクロース、2mM CaCｌ₂（ＳＧＭ17，Ｃａ培地）および適当な選択抗生物質（エリスロマイシンまたはクロラムフェニコール）が補われた0.5％グルコース（ＧＭ17培地）を含むＭ17培地（Sigma ChemicalＣo.)にプレーティングし、30℃でインキュベートすることによって選択した。抗生物質は、シグマから購入し、以下の濃度で用いられた：エリスロマイシン，1.0μｇ／ｍｌ；クロラムフェニコール，5.0μｇ／ｍｌ。どちらのプラスミドでも、形質転換効率は、Ｃｍ^rまたはＥｍ^rに関して選択するとき、ＤＮＡのμｇ当たり10⁴〜５×10⁴形質転換細胞であった。選択した一次形質転換細胞コロニーを、5.0μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが補われたＧＭ17液体培地に移し、形質転換細胞を、多くの世代が10 〜 50の範囲になるまで増殖させた。次いで、プラスミドＤＮＡを、以下に示すような変形を行い実質的にはBirnboimらによって記載された方法（文献６）に従って細胞のアルカリ溶解を行うことによって、これらの形質転換細胞から抽出した。細胞を、0.3のＡ₆₀₀まで指数関数的に増殖させ、５ｍｌの培養物を、4000×ｇで遠心分離することによって採取した。ペレットを、ＴＳバッファー（25％スクロース、50ｍＭトリス塩酸塩、ｐＨ8.0）で洗浄し、10ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む0 .25ｍｌS1溶液（５ｍＭＥＤＴＡ、50ｍＭＮａＣｌ、25％スクロース、50ｍＭトリス塩酸塩、ｐＨ8.0）中に再懸濁し、30℃で３０分間インキュベートした。0 .5ｍｌのＳ２溶液（0.2ＭＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）を静かに加え、懸濁液を５分間氷上に保持した。次いで、0.4ｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ4.8を加え、懸濁液を５分間氷上に保持した。懸濁液を10000×ｇで遠心分離した後、Birnboimら記載の方法（文献６）に従ってプラスミドを上清から抽出した。こうして抽出したプラスミドＤＮＡの部分と各々イー．コリＰＹ1173およびバシラスズブチリスＰＹ258から単離されたプラスミドｐＴＶ32およびｐＬＴＶ1 を、標準条件下で制限酵素EcoRI、 SalIおよびHindIIIでの処理に付した。次いで、制限酵素で処理されたプラスミドＤＮＡととともに、ラクトコッカスラクチス亜種ラクチスＭＧ1616、およびイー．コリＰＹ1173およびバシラスズブチリスＰＹ258から単離した未消化の抽出プラスミドＤＮＡを、アガロースゲル電気泳動分析に付した。制限酵素部位EcoRI、 SalIおよびHindIII と同様に形質転換されたラクトコッカスラクチス亜種ラクチスＭＧ1614から抽出されたｐＴＶ32 とｐＬＴＶ1のサイズが、最初のプラスミドと比較して保持されていることがわかった。上記プラスミド製造手順における回収レベルが100％であると想定することによって、形質転換されたラクトコッカスラクチス亜種ラクチスＭＧ1614 における両プラスミドの平均コピー数は、HindIIIで消化された公知濃度の標準ファージラムダ（phage lambda）ＤＮＡを用いて、アガロースゲル上での比較を行うことによって、細胞当たり６〜12コピーであると評価された。従って、乳酸菌が高い効率でｐＴＶ32およびpLTV1で形質転換されること、およびこれらのプラスミドが乳酸菌中で複製できることを、この実験から結論づけることができた。実施例２ラクトコッカスラタチス亜種ラクチスおけるＴｎ917転位の誘発、およびｐＴＶ−プラスミドのためのキュアリングラクトコッカスラクチス亜種ラクチスＭＧ1614は、37℃を越える温度で、0. 5％グルコースを含むM17肉汁（broth）（SigmaChemicalCo.）中で増殖を終える。ｐＴＶ32またはｐＬＴＶ1は、これらのプラスミドで形質転換されかつＣｍ^ｒに関する選択下37℃で生育するラクトコッカスラクチス亜種ラクチスＭＧ1614 から抽出することができる。ビー．ズブチリスに関して行われた温度キュアリング手順は、ラクトコッカス菌株に用いることはできない。しかしながら、ｐＴＶ32ＤＮＡもｐＬＴＶ1ＤＮＡも、Ｅｍ^rに関する選択で30 ℃で生育するラクトコッカス形質転換細胞からは抽出することができないことが論証された。このことは、プラスミドの付随したロスをともなうＴｎ917の染色体への転位（組込み）を示した。個々の培養物からの独立したラクトコッカスラクチス亜種ラクチスＴｎ917 組込み体の製造は、以下の手順に従って行われた。実施例１に記載されたように作成された初代形質転換細胞を、エリスロマイシンを含むＳＧＭ17，Caアガーにプレーティングし、30℃で約40時間インキュベートした。12の単一コロニーを、Ｅｍ^rを選択するＭ17肉汁培地で２回継代培養した。単一のコロニーを得るために、各々の培養物を、エリスロマイシンを含むＧＭ17アガー上に線状に塗り（ストリークし）、各々の培養物からの単一のコロニーを、一回再ストリークした。全てのインキュベーションは、30℃で行われた。これらの推定独立組込み体が、フリー分子としてプラスミドを損失しており、染色体に挿入されたＴｎ917を有していることを証明するために、最初にｐＴＶ3 2で形質転換してEm^rを選択する液体培地で２回継代培養した12の独立したＥｍ^ｒＭＧ1614からのＤＮＡに関して、サザンハイブリダイゼーションを行った。単離物から、総ＤＮＡ内容を、7000rpmで10分間の遠心分離によって細胞を収集することにより、100mlの培養物から抽出した。細胞を、ＴＥバッファー（10ｍトリス塩酸塩、１ｍＭＥＤＴＡｐＨ 7.5）で洗浄し、収集した。ペレットを−２０℃で凍結し、次いで３mlのSTETバッファー｛8 ｗ/ｖ％スクロース、５ｖ/ｖ％トリトンＸ-100、50ｍＭＥＤＴＡ(ｐＨ 8.0)、5 0 ｍＭトリス塩酸塩(ｐＨ8.0)｝に溶解した。750μlのリゾチーム(10 mg／ml)を加え、溶液を37℃で１時間インキュベートした。750μlの10％ＳＤＳを加え、37 ℃で0.5時間インキュートを続け、次いで65℃で0.5時間インキュベートした。2 mlのＴＥバッファーを加え、水溶液を、5 mlのフェノール：クロロホルム（１：１）で３回抽出した。懸濁液に、1／10容量の5ＭＮａＣｌおよび１容量のイソプロパノールを加えた。溶液を、ＤＮＡが長い白色の糸として沈澱するまで非常に注意深く混合した。ＤＮＡを接種針で傷つけ、エッペンドルフチューブに移し、 70％エタノールで３回洗浄した。ＤＮＡを、500mlのＴＥバッファーに溶解した。こうして調製された各々の単離物からのＤＮＡ1μｇを、EcoRIで消化し、1.0 ％アガロースゲルを通して電気泳動によって分離し、ハイボンド−Ｎ膜（Hybond -Nmembranes）（Amersham，ＵＫ）に移し、２つの³²ｐでラベル化されたＤＮＡプローブ、即ちｐＬＴＶ1およびｐＥ194レプリコンを含むｐＬＴＶ1の４ｋｂ E coRIフラグメントを用いてハイブリッド形成に付した。4ｋｂフラグメントを、透析バッグ中への電気溶出によってアガロースゲルから単離した。プローブは、［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰで翻訳されたニック(nick)であった（Amersham，ＵＫ）。制限酵素消化、電気泳動、ＤＮＡ転移、ニックトランスレーションおよびハイブリッド形成は、Maniatisらによって記載されたように行った（文献３４）。組込み体（integrant）クローンは、図３に例証されるような³²ｐでラベル化されたｐＬＴＶ1および／またはｐＴＶレプリコン特異的プローブでハイブリッド形成した。ｐＴＶ32は15.6kbであり、プラスミドのレプリコン部分に位置するユニークEcoRI部位を有している。ｐＴＶ32のＴｎ917部分は、8ｋｂである。12 のＴＶ32組込み体のうち８つから、単一のシグナルが、プローブとしてｐＬＴＶ 1を用いて検出され（図３Ａ）、一方ｐＴＶレプリコン特異的プローブではシグナルは見られなかった（図３Ｂ）。これらの８つの組込み体は、ＴＶ32が染色体に転位し、ｐＴＶ32が失われたとき予測されるように、Ｅｍ^ｒおよびＣｍ^Sであった。残りの4つの組込み体（番号27、33および39）から、2つのシグナルが、プローブとしてｐＬＴＶ1を用いて検出された（図３Ａ）。同じ２つのバンドがレプリコン特異的プローブとハイブリッド形成し、フリーに複製するｐＴＶ32において予測されるサイズのシグナルは観察されなかった（図３Ｂ）。従って、これらの４つの菌株は、トランスポゾンＴＶ32とともに染色体に組込まれたｐＴＶ32 のレプリコン部分からのＤＮＡを有している。４つの組込み体の各々において、４つ全てがＣｍ^rであったので、レプリコン部分からのＤＮＡは、cat遺伝子を含んでいた。実施例３ラクトコッカスラクチス亜種ラクチスＭＧ1614染色体へのＴｎ917挿入の疑似ランダムさの論証Ｔｎ917がラクトコッカスラクチス亜種ラクチスにおける有効な突然変異誘発手段として用いられるために、トランスポゾンの挿入は、ランダムであるべきである。転位ランダムさの分析は、実施例２に記載したような方法に従って作成された61の独立したＭＧ1614ＴＶ32組込み体の染色体SmaIフラグメント上のＴＶ 32の物理的(physical)な位置の決定によって行われた。ゲノムＤＮＡの作成およびSmaI原位置(in situ)制限酵素消化は、Tanskanenらによって記載されたように行われた（文献５２）。これらの組込み体の中で、10個が、Ｘ-galの160μｇ／ｍｌが補われたＧＭアガーにプレーティングすることによって示されるように、 β−ガラクトシダーゼを発現した。 SmaI制限フラグメントを、モデルＣＨＥＦ-ＤＲＩＩ装置（Bio RadLaboratori es,Richmond,California)を用いてパルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)によって分離した。ゲルは、0.5×ＴＢＥ｛89ｍＭほう酸中の１×ＴＢＥ、２ｍＭＥＤＴＡおよび89ｍＭトリスほう酸塩（ｐＨ8.3）｝中の1.5％アガロースゲルであった。電気泳動パラメーターは以下のようであった：１〜70秒間勾配したパルス時間で175Ｖ、14℃20時間。ゲルを、0.5×ＴＢＥ中のエチジウムブロマイド溶液(1 ｍｇ／ｍl)で30分間染色し、0.5×ＴＢＥ中で4時間脱色し、ＵＶトランスイルミネーター（transilluminator）を用いて写真に写した。 SmaIで消化したＭＧ1614染色体は、45ｋｂより大きい以下の10個のフラグメントを生じた（図４、レーン３）：600、310、280、200、 175、175、140、120、105および65ｋｂ。ＴＶ32は、ユニークSmaI部位を含んでいる。従って、ＴＶ32の10個の大きいSmaIフラグメントのいずれかへの挿入は、その挿入がフラグメントの末端近くに位置しないならば、パルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)で検出することができる。 61の組込み体のSmaIフラグメント上のＴＶ32位置は、表１に与えられている。表１：染色体SmaIフラグメント上のＴＶ32の物理的な位置に基づくグループに分類されたランダムなラクトコッカスラクチス亜種ラクMチスＴＶ32組み込み体ａｘはＰＦＧＥゲル上で検出することができないフラを示すｂ名称がｂで終わっているクローンは、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドル −β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含むプレート上で青色である。ｃ二重組み込み体ｄＮＤ検出されない SmaIフラグメント上のＴＶ32の物理的位置に基づいて、６１の組込み体を38 のグループに分類することができた。図４は、表１に列挙されている各々のグループに相当する組込み体のPFGEを示している。１つのグループ(30番)は4つの組込み体を含み、5つのグループ（3、8、10、16および29番）は3つの組込み体を含み、10のグループ（2、4、 6、 9、 12、 15、 18、 120、 28および33番）は２つの組込み体を含んでいた。しかしながら、同じ組込み体グループのメンバーは、必ずしもフラグメントの同じ位置にＴＶ32を有していない。フラグメント上の対称的に位置した挿入は、PFGEゲル上で区別がつかず、分析の限界は、フラグメントの長さに依存して２〜10kbまで変化する。 600、 310、 200、 175、 140および120ｋｂ染色体SmaIフラグメントは、全てＴＶ32によって標的にされた（表１および図４）。明らかに、どの組込み体も、 280、105および65kbフラグメントにおける挿入物を有していなかった。しかし、組込み体46におけるＴＶ32が、サイズで45 kbより大きいフラグメントの末端あるいは65 kbより小さいフラグメントのいずれかの位置において存在したかどうか、PFGEデータから立証することはできなかった。組込み体19は、二重挿入を含んでいた（図４）。2つのＴＶ32コピーが、各々200 kbおよび600kbフラグメントに保有されている。これらの二重挿入は、この研究における挿入事象の総数を62にする。ラクトコッカスラクチス亜種ラクチス染色体における62のＴＶ32の挿入は、染色体にそって一様に配置されなかった。このことは、カイ二乗検定によって示され、それによって、ＳmaIフラグメントへの挿入の確立がフラグメントの長さにのみ依存するかどうか試験された（表２）。表２は、フラグメントへの挿入の確立がフラグメントの長さにのみ依存すると仮定して予測される組込み体の数とともに、各々のフラグメントにおいて得られた組込み体の数を示している。カイ二乗検定は、この仮定を試験するために用いられた。カイ二乗検定は、得られる挿入が、染色体上に絶対的にランダムに分配されないことを示した（Ｐ＜0.005）。この不均一への主な貢献は、600kbフラグメントへの挿入物の2.5倍の過度の代表（2.5-fold overrepresentation）と280k bフラグメントへの挿入物の欠如から生じた。600kbフラグメントへの37の挿入物は、同じ位置でのわずか３つの挿入物を含めて少なくとも21の異なる位置に配置された。これらの結果は、上記過度の代表が、単一の優性ホットスポットによるものではないことを示している。280kbフラグメントは、ＴＶ32挿入物に対して全く不応ではない。それは、このような組込み体が、平行実験において得られたからである。従って、この明細書では、ラクトコッカスラクチス亜種ラクチス菌株ＭＧ1614において得られるようなＴＶ32挿入物分配パターンを、疑似ランダムと称す。以下の要因が観察された挿入物の不均一分配に貢献しているであろう：（１）染色体の複製起点近くのフラグメントが、末端近くのフラグメントより高いコピー数を有している；（２）必須遺伝子が、不均一に分配されている；（３）Ｔｎ917が、特別な特徴を有する領域に優先的に挿入されるようになった。表２染色体のラクトコッカスラクチス亜種ラクチスSmaIフラグメントにおけるＴＶ32の配分ａ）染色体SmaIフラグメントのトータルサイズは、2500kbであった。ｂ）観察された挿入の総数は、６２であった。ｃ）挿入の確立つは、染色体サイズに対するフラグメントサイズに等しいと仮定された。予測さえる挿入の総数は、62.1であった。ｄ）値は、位下のようにして計算された：（観察された挿入の数−予測された挿入の数 ²/予測された挿入の数。カイ二乗検定は、各核々のクラスの予測された数が５を越えるかまたは５に等しいことが必要である；従って、205kbより小さいフラグメントにおける挿入は、１として処理された。総カイ二乗値は、49.5であった。自由度5を有するカイ二乗検定において、16.7を越える確立は、仮設が正しいならば0.005(0.5％）である。ｅ）菌株ＭＧ1614は、ＰＥＧＥゲル上で区別することができない2つの175kbフラグメントを有していた。従ってこれらのフラグメントへの挿入は、１クラスとして処理された。ラクトコッカスラクチス亜種ラクチスＭＧ1614染色体へのＴＶ32挿入物のやや不均一な分配にもかかわらず、Ｔｎ917誘導体は、乳酸菌の遺伝学的分析の非常に有用な手段であると結論づけられた。それは、上述のものに加えて多くの数の挿入部位を、これらのトランスポゾン誘導体で見いだすことができることが、さらなる実験においてわかったからである。 63bで示される上記ラクトコッカスラクチス亜種ラクチスＭＧ1614クローンは、ＤＳＭ-Deutsche Sammlung von Ｍikroorganismen und Cellkulturen GmbH，Mascheroder Weg lb,D-38124 Braun schweig，Germanyに、受託番号ＤＳＭ7361として、1992年12月21日に寄託された。実施例４ラクトコッカスラクチスにおける１コレクシヨンのＴｎ917挿入物の製造ラクトコッカスラクチスにおける１コレクシヨンのＴｎ917挿入物を製造するために、以下の手順が行われた。ｐＴＶ32含有のラクトコッカスラクチス亜種ラクチス菌株ＭＧ1614の単一コロニーを、ＧＭ17培地に接種し、Ｃｍ^rに関する選択で８〜１０世代まで増殖させた。これらの細胞の１パーセントを、Ｅｍ^rに関する選択を有するＧＭ17培地で８〜10世代まで増殖させた。温度を30℃に維持した。得られた細胞を、Ｅｍ^r に関する選択を有するＧＭ17寒天平板上にプレーティングした。19のコロニーをランダムに選択し、アガロースブロックでのゲノムＤＮＡのin situにおける作成および消化を、実施例３に記載したように行った。図５および表３は、18 （１クローンの消化は、分離したバンドとして明視化することができるフラグメントを生じた）のクローンのうち12が、染色体の同じ位置に挿入されたトランスポゾンを有しており、このことは、その培養物が、単一の組込み体によって優先的に占められたことを示している。表３優性組込み体を含む培養物からのラクトコッカスラクチス亜種ラクチスＭＧ1614ＹＶ32組込み体ａ）は、ＰＦＧＥゲル上で検出することができないフラグメントを示す。ｂ）二重組込み体培養物における優性組込み体を回避するために、以下の手順が選択された。菌株ＭＧ1614を実施例１に記載したようにｐＴＶ32で形質転換した。形質転換細胞を１μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含むＳＧＭ17寒天平板にプレーティングした。30℃で４８時間インキュベートした後、各々およそ100コロニーを含む２０のプレートを、Ｅｍ^rに関する選択を有するＧＭ17寒天のプレート上に再プレーテイングした。複製(replicated)プレートを、 30℃で30時間インキュベートした。複製工程を繰返し、コロニーを洗浄してプールした。プールした培養物から、18の組込み体がランダムに選択され、上記のようにＰＦＧＥによって分析された。染色体SmaIフラグメント上のＴｎ917挿入物の位置に基づいて、18の組込み体を13のグループに分類し、そのどれもが、２より多い挿入物を含んでいなかった（図６および表４）。従って、プールされた培養物は、菌株ＭＧ1614中に１コレクシヨンのトランスポゾンＴＶ32−挿入物を疑似ランダムに含んでいたと結論づけられた。表４疑以ランダムなＴＶ32挿入物を含む培養物からのラクトコッカスラクチス亜種ラクチスＭＧ1614ＴＶ32組込み体ａ）は、ＰＦＧＥゲル上で検出することができないフラグメントを示す。滅菌したグリセロールを、25％までの濃度でプールした培養物に加え、この混合物を−80℃で保存した。ラクトコッカスラクチス亜種ラクチスＭＧ1363に１コレクションの疑似ランダムなＬＴＶ１挿入物を含むプールされた培養物を、本質的に上記のようにして作成した。しかしながら、コロニーを洗浄してプールする前に、以下のことが行われた。 320μｇ／ｍｌのＸ-gａｌを第２の複製に使用したプレートに加えた。種々の青色強度を有する242のコロニーが、第２の複製プレート上で見られた。対照的に、これらのコロニーの５％より少ないものが、48時間より長くインキュベートされた40μｇ／ｍｌのＸ-gａｌを含むＧＭ17寒天平板上で青色であった。（Ｘ- ｇａｌの40μｇ／ｍｌは、イー．コリにおけるlacＺ発現を同定するための標準濃度である。）320μｇ／ｍｌのＸ-galを含むプレート上に現れる242の青色コロニーの各々を、１μｇ／ｍｌのエリスロマイシンと320μｇ／ｍｌのＸ-galを含むＧＭ17上で単一コロニーを得るために再ストリークし、次いで同じ培地で一回再ストリークした。これらの継代培養物の各々からの単一コロニーを、１μｇ／ｍｌのエリスロマイシンが補われたＧＭ17液体培地に接種し、30℃で一晩インキュベートし、滅菌したグリセロールを−80℃で保存するためにこれらの継代培養物の各々に25％の濃度で加えた。これらの242のコロニーを、以下プロモーター融合コレクシヨンナンバー１(ＰＦＣ-１)と称す。名称Ｐ139-170を有するラクトコッカスラクチス亜種ラクチスＭＧ1363 ＰＦＣ-１クローンの１つは、ＤＳＭ-Deutsche Sammlung vonＭikroorganismen und Cellkulturen GmbH，Mascheroder Weg lb，Ｄ-38124 Braunschweig,Germanyに、受託番号ＤＳＭ 7360として、1992年12月21日に寄託された。実施例５ラクトコッカスラクチス亜種ラクチス染色体からの調節可能なプロモーターの同定およびクローニング実施例４に記載されたように作成されたラクトコッカスラクチス亜種ラクチスＭＧ1363染色体における疑似ランダムなＴｎ917挿入物のコレクション(PFC-1) を、この実験に用いた。この実験は、これらのフラグメントにおける調節可能なプローターの存在のスクリーニングとして設計された。温度／発育相調節1acＺ発現ＰＦＣ-１からの各々のクローンを、１μｇ／ｍｌのエリスロマイシンと320μ ｇ／ｍｌのＸ-galを含む２セットのＧＭ17プレート上にストリークした。ストリークパターンを図７に示す。１セットのプレート上に、クローンをストリークし、15℃で１日インキュベートした。第２セットのプレート上に、クローンをストリークし、30℃で４日インキュベートした。５日めに、両セットのプレトートを検査した。３つの主要なタイプの1acＺ発現が、 PFC-1クローンにおいて観察された：（ｉ）30℃で高い1acＺ発現を示し（暗い青色ストリーク）、15℃で低い1acＺ発現を示すかまたは1acＺ発現を示さない（うすい青色もしくは白色ストリーク）タイプ１Ｔ、 (ii) ２つの温度で同程度の1acＺ発現を示すタイプ２Ｔ、 (iii)30℃で低い1acＺ発現を示すかまたはlacＺ発現を示さず、15℃で高い1acＺ発現を示すタイプ３Ｔ。試験された全242クローンのうち、23がＩＴタイプであり、215が２-Ｔタイプであり、４クローンが３Ｔタイプであった。15℃で延長された成長期のために、調節されたlacＺ発現が、発育相／発育速度および／または温度の作用であるかどうか決定することはできない。アルギニン／ｐＨ調節lacＺ発現ＰＦＣ-１の各々のクローンを、上記と同じストリークパターンを用いて、0.1 ％のグルコース、0.5％のアルギニン、１μｇ／ｍｌのエリスロマイシンおよび3 20μｇ／ｍｌのＸ-galを含む１セットのＭ17プレート上、および１μｇ／ｍｌのエリスロマイシンと320μｇ／ｍｌのＸ-galを含む１セットのＧＭ17プレート上にストリークした。両セットのプレートを、30℃で約30時間インキュベートした。３つの主要なタイプの1acＺ発現が、インキュベートしたプレート上で観察された：（ｉ）アルギニンが補われていないプレート上で高いlacＺ発現を示し、アルギニンが補われているプレート上で低いlacＺ発現を示すかまたは1acＺ発現を示さないタイプ１Ａ、 (ii)アルギニンの補足にかかわらず、同様の1acZ発現を示すタイプ２Ａ、 (iii)アルギニンのないプレート上で低い1acＺ発現を示すかまたは1acＺ発現を示さず、アルギニンが補われているプレート上で高いlacＺ発現を示すタイプ３Ａ。試験された242クローンのうち、21が１Ａタイプであり、219が２Ａタイプであり、２クローンが３Ａタイプであった。滅菌したＧＭ17のｐＨは、約6.8である。ラクトコッカスラクチス亜種ラクチスが接種されかつ一晩インキュベートされたＧＭ17培地のｐＨは、約5.0である。しかしながら、ラクトコッカスラクチス亜種ラクチスが接種されかつ一晩増殖させた、0.1％グルコースと0.5％アルギニンが補われているＭ17のｐＨは、9.0を越えている。従って、観察された調節lacＺ発現は、培地のアルギニン濃度および／またはｐＨの作用である。 lacＺ発現のＮaＣl／イオン強度調節ＰＦＣ-１コレクシヨンの各々のクローンを、上記と同じストリークパターンを用いて、１μｇ／ｍｌのエリスロマイシン、320μｇ／ｍｌのＸ-galおよび２％のＮaＣlが補われている１セットのＧＭ17プレート上、およびＮaＣlのない同じ培地を含む１セットのプレート上にストリークした。両セットのプレートを、 30℃で約30時間インキュベートした。２つの主要なタイプのlacＺ発現が観察された：（ｉ）ＮaＣlのないプレート上で高いlacＺ発現を示し、ＮaＣlが補われているプレート上で低いlacＺ発現を示すかまたはlacＺ発現を示さないタイプＩＳ、（ii）両タイプのプレートで同様のlacＺ発現を示すタイプ２Ｓ。試験された242クローンのうち、87がＩＳタイプであり、155が２Ｓタイプであった。ＰＦＣ-１からのクローンが調節されたlacＺ発現を有することが示されたとき、ラクトコッカス染色体上の挿入点または挿入範囲は、挿入遺伝子がラクトコッカスにおいて調節可能に発現される場所であると定義される。例えば、ＰＦＣ- １のＰ139-170と称するクローンは、タイプ３Ｔ、タイプ１Ａおよびタイプ２Ｓであり、lacＺ遺伝子が、挿入遺伝子の発現が30℃かつアルギニンが補われているＭ17プレート上で部分的にまたは全体的に抑制される部位に存在していることを示している。しかしながら、この部位での遺伝子の発現は、ＧＭ17プレート上 15℃で高い。ＧＭ17プレー卜上での遺伝子発現レベルは、試験されたＮaＣl濃度によって影響を受けない。P139-170クローンの調節可能なlacＺ発現の生理学的研究 P139-170は、タイプ１Ａであることが示された。このクローンにおけるlacＺ発現のｐＨ依存を研究するために、以下の実験を行った。各々１μｇ／ｍｌのエリスロマイシンが補われている１リットルのＧＭ17培地を含む６つの発酵槽を、30℃で操作するためにセットした。二倍（duplicate）の発酵槽を、５Ｍ硫酸または５Ｍ水酸化ナトリウムを用いて、各々ｐＨ5.5、6.5および7.5で操作するためにセットした。二倍の発酵槽のうちの一つに、Ｈ25Ａ（染色体上にＬＴＶ１挿入物を含み、添加するアルギニンもしくはＮaＣlにかかわらずＧＭ17寒天上でβ−ガラクトシダーゼを発現することができる菌株ＭＧ1614）の１％オーバーナイト培養物を接種し、二倍発酵槽の他方に、P139-170の１％オーバーナイト培養物を接種した。発酵槽でクローンを増殖させ、ＯＤ₆₀₀を測定し、ＧＭ17プレート＋／−１μ ｇ／ｍｌエリスロマイシン上にプレーティングした。成長曲線｛log（ＯＤ₆₀₀）対時間｝は、６つの発酵槽の全てのクローンでほとんど同じであった。2.0のＯＤ₆₀₀で、各々の発酵槽からの40ｍlの培養物を、10倍濃縮し、フレンチプレスで２回処理した。溶解させた溶液を、Ｍiller，1972，Ｅxperiments in Ｍolecula r Ｇenetics，ＣoldＳpring Ｈarbor Ｌaboratory,Ｃold Ｓpring Ｈarbor,Ｎ. Ｙ.によって記載されたβ−ガラクトシダーゼ活性測定手順に付した。残念ながら、β−ガラクトシダーゼ活性を失うことなく溶液を保存する手順は、失敗した。従って、β−ガラクトシダーゼ活性測定において着色を目で見る検査からの結果のみ得ることができた。この実験に基づいて、P139-170におけるlacＺ発現は、増殖培地のｐＨの作用であると結論づけられた。しかしながら、培地のアルギニン濃度も、プロモーター機能に対する調節作用を有するかもしれないことを、除外することはできない。調節されたβ−ガラクトシダーゼ発現が同定された選択組込み体ＰＦＣ-１クローンから、erm（またはlacＺ）近位末端に近接するＤＮＡを、以下の手順を用いてクローン化した：実施例２に記載の方法に従って、総ＤＮＡをクローンから抽出した。約１μｇＤＮＡを50単位のEcoRIで消化し、37℃で２時間インキュベートした。フェノールおよびクロロホルム抽出と、50単位のリガーゼを含む連鎖反応用バッフアーでの連鎖反応を、Ｍaniatis（文献３４）によって記載されたように行った。ＤＮＡを、３容量の氷冷エタノールと１／10容量の酢酸ナトリウムを加えることによって沈澱させ、10000Xｇで30分間遠心分離した。ＤＮＡを、20μｌのＴＥ｛１ｍＭＥＤＴＡ，10ｍＭトリス塩酸塩（ｐＨ8.0）｝中に再懸濁した。10μｌの結合したＤＮＡ溶液を、イー．コリＤＨ５ａにおける、文献１７に記載されているようなＣaＣl₂形質転換に用いた｛Ｆ-，endＡ1，hsdＲ17 （ｒ_k-，ｍ_k ⁺）,supE44,thi-1,lac△U169,recA1,gyrA96,relA1,φ80dlacＺ△Ｍ1 5）｝。ＤＮＡμｇ当たり約1.5×10³形質転換細胞が観察された。実施例６乳酸菌用のプロモータープローブベタターの構築遺伝子を表現する条件を分析し、かつ発現のレベルを測定する有用な手段は、プロモータープローブである。ラクトコッカスについて、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼに基づき、かつｐＷＶ01レプリコンによって動因（ driven）されるｐＧＫＶ210プロモータープローブベクターが構築された（van d er Ｖossen et al.,1985）。残念ながら、このベクターは、プロモーターがその中にクローン化されたとき、わずかに増強されたクロラムフェニコール耐性を与えるだけである（van der Ｖ ossen et al.,1987）。cat-86遺伝子を含むｍＲＮＡの翻訳は、クロラムフェニコールによって活性化され（Ａlexievaet al.,1988）、測定した酵素のレベルは、２つの因子、即ちプロモーター強度と活性化効率に依存する。また、ｐＷＶ01 レプリコンは、ローリングサークル複製によって複製し、従って、サイズ依存分離不安定性（size-dependent segregational instability）（Ｋiewiet et al., 1993）に影響されやすい。ラクトコッカスおよび他の乳酸菌用のプロモータープローブベクターを、ロイコノストックメセンテロイデス亜種クレモリス、ラクトコッカスラクチス亜種ラクチス次亜種ジアセチルアクティス（diacetylactis）クエン酸プラスミドレプリコンおよびエリスロマイシン耐性マーカーに基づいて、構築した。このベクターを、ｐＡＫ80と命名する。ＣＨＣＣ285のtma遺伝子に近接するｔＲＮＡクラスター用のプロモーターのクローニングは、このベクターが機能することを示した。得られた構築物ｐＡＫ90 は、ＭＧ1363中で非常に高レベルのβ−ガラクトシダーゼを産生する。ロイコノストックメセンテロイデス亜種クレモリスからのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をクローン化し、それが、ロイコノストックラクチスからのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子にほとんど同一であることが見い出された（Ｄavid et al., 1992）。両遺伝子は、エシエリヒアコリおよびラクトコッカスラクチス菌株ＭＧ1363において発現することが示された。β−ガラクトシダーゼ遺伝子のプロモーターを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって除去し、ポリリンカーで置換した。これは、種々のＤＮＡフラグメントのクローニングと、プロモーター活性の試験を可能にする。この構築物を、ラクトコッカスラクチス亜種ラクチス次亜種ジアセチルアクティスクエン酸プラスミドレプリコン、イー．コリのｐＡＣＹＣ184レプリコンおよび両微生物の選択マーカー（エリスロマイシン耐性）を含むシャトルベクター中にクローン化した。ポリリンカー中へのｔＲＮＡプロモーターのクローニングは、ＭＧ1363において高レベルのβ−ガラクトシダーゼを与えた。このことは、そのベクターが計画したように作用することを証明している。Ａ材料および方法１．細菌菌株、プラスミドおよび培地プラスミドフリーのラクトコッカスラクチス菌株（Ｇasson,1983）、エシエリヒアコリＤＨ５ａ（supE44 lac△U169 hsdR17 recA1 endＡ1 gyrＡ96 thi-1 rclＡ1 φ80 lacＺ△Ｍ15）（Ｈanahan,1983）を、クローニングに使用した。使用したクローニングベクターおよび関連するマーカーは：ｐＶＡ891 （エリスロマイシン耐性；Ｅｍ^Ｒ）（Ｍacrina et al., 1983）、およびｐＩＣ19Ｈ（アンピシリン耐性；Ａｍｐ^Ｒ）（Ｍsrsh et al., 1983）。プロモータープローブベクターの構築の間に構築された種々のプラスミドは、以下に記載されている。ラクトコッカス菌株を、ＧＭ17培地で30℃で増殖させた。イー．コリ菌株は、ＬＢ培地で37℃で増殖させた。抗生物質を以下の濃度で使用した。イー．コリに対して；エリスロマイシン250μｇ／ｍｌ；およびアンピシリン50μｇ／ｍｌ；ラクトコッカスに対して；エリスロマイシン１μｇ／ｍｌ。２．プラスミドの作成と形質転換配列決定およびエレクトロポレーション用のプラスミドＤＮＡを、キアゲンプラスミドキット（Ｑiagen plasmid kit）（Ｄiagen，Ｄusseldorf,Ｇermany）を用いて作成した。ラクトコッカスからの小スケールのプラスミド作成は、本質的にＩsraelsen ら、1993に従って行われた。プラスミドを、本質的にＨoloおよびＮes,1989に従って、グリシンによって生育する感応細胞のエレクトロポレーションによってＭＧ1363 中に導入した。３．β−ガラクトシダーゼ分析プロモーター活性を、Ｇ1.5Ｍ17 培地で生育するオーバーナイト培養物に関するβ−ガラクトシダーゼ分析を行うことによって決定した。１ｍl の培養物を、10000×ｇで10分間遠心分離した。ペレットを、500μｌのＺバッファー（Ｍiller,1972）中に再懸濁した。ボルテックスミキサーを用いて、 100μｌの細胞懸濁液を、400μｌのＺバッファー、12.5 μｌの0.1％ＳＤＳおよび25 μｌのＣＨＣｌ_３と10秒間混合した。ボルテックスにより混合した後、懸濁液を実施例７に記載したように処理した。結果を表７に示す。分析結果は、ミラー単位（Ｍiller units）で示されている。１ミラー単位＝（1000×Ａ₄₂₀）／（時間×容量×Ａ₆₀₀）（時間は分で、容量はｍlである。）Ｂ．ｐＡＫ66の構築クエン酸プラスミドの全複製領域の増幅をする２つのＰＣＲプライマーを得た。これらは、以下の配列を有している：プライマー１は、ヌクレオチド610−621に対応し、プライマー４は、クエン酸プラスミド複製領域のヌクレオチド2340−2361に相補的である（Ｊahns et al., 1991）。両方ともが、クローニングを促進するために、その５’末端にＥcoＲＩ部位を含んでいる。1.7 kbの増幅産物を、ｐＩＣ19Ｈ中にＥcoＲＩフラグメントとしてクローン化し、ｐＫＲ41を製造した。次いで、このＥcoＲＩフラグメントを、ｐＶＡ891のユニークＥcoＲＩ部位中に移動させて、イー．コリ及びエル．ラクチスＭＧ1363中で複製するシャトルベクターｐＡＫ66を製造した。ｐＫＲ41 の構築は、発表するために提出された原稿に記載されている（Pedersen et al., 1993）。Ｃ．ロイコノストックメセンテロイデス亜種クレモリスのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のクローニングロイコノストックメセンテロイデス亜種クレモリス菌株ＤＢ1165からＩＳ11 65をクローニングしかつ配列決定する過程中に、ｐＳＢ１と称するクローンを得た（ＪohansenおよびＫibenich,1992）。このクローンは、ｐＩＣ19Ｈのポリリンカー中に5.8 kbの挿入物を含んでいた。通常、ｐＩＣ19Ｈにおけるクローニングは、β−ガラクトシダーゼ活性を破壊し、挿入物を有するコロニーは、Ｘ-gal 上で白色である。ｐＳＢ１は、Ｘ-gal上で青色のコロニーを与えた点で予想外であった。ＤＮＡ配列分析は、ｐＳＢ１における挿入物がロイコノストックメセンテロイデス亜種クレモリスのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含んでいること、およびそれがロイコノストックラクチスのものとほとんど同一であること（Ｄ avid et al.,1992）を示した。３つの違いのみが、配列決定された830 bpにおいて検出された。Ｄ．Ｂ．ｐＡＫ67.7の構築この構築は、ポリリンカーでのβ−ガラクトシダーゼプロモーターの置換と、全３つの前進読み枠（forward reading frames）における停止コドンの挿入を含むもので、図８に例証されている。プロモーターを、２つのプライマーを用いてＰＣＲによって除去した： lac-1の下線部分は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の始めと同一であり、リボソーム結合部位を含んでいる。残りの配列は、ＢglIIを含む種々の制限部位を含んでいる。lac-２プライマーは、ユニークＮcoI 部位の20bp下流のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子にアニールする。これらのプライマーを用いてのＰＣＲ増幅は、リボソーム結合部位からＮcoI 部位を越えるまで増幅し、１末端にいくつかの制限部位を、他の末端にＮcoI 部位を含み、かつβ−ガラクトシダーゼ遺伝子からのプロモーターまたは他の調節配列を含まない360 bpフラグメントを産生するであろう。この360 bpフラグメントを精製し、ＢglIIおよびＮcoIで消化し、ＢglII ／ＮcoI消化ｐＳＢ１中にクローン化した。得られたプラスミドを、ｐＡＫ67と命名した。このプラスミドは、β− ガラクトシダーゼ遺伝子に先行する以下のポリリンカーを有している：ＤＮＡ配列分析は、このポリリンカーが存在すること、およびＰＣＲ中のエラーによる変更がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子中に導入されなかったことを示した。上記からみることができるように、ポリリンカーを横切ってβ−ガラクトシダーゼ遺伝子中にいく、２つのオープンリーディングフレームがある。これらは、ポリリンカーに挿入されたプロモーターからのβ−ガラクトシダーゼの発現を潜在的に干渉するので、全３つの前進読み枠に停止コドンを導入することを決心した。これは、以下の配列を有する２つのオリゴヌクレオチドを得ることによってなされた：これらのオリゴヌクレオチドは、相補的であり、ＸbaI 制限部位を含む一組の 12 bpの二本鎖ＤＮＡを得るためにアニールするであろう。この小さいフラグメントをｐＡＫ67のＳmaI 部位にクローン化した。これらのオリゴヌクレオチドを、ＳmaI 部位が保持され、新しいＸbaI 部位がこの小さな挿入物を含むプラスミドに存在し、かつ停止コドンが２つのオープンリーディングフレーム中に導入されるような方法で消化した。クローニングは、ｐＡＫ67をＳmaI で消化し、フォスファターゼ処理し、キナーゼで処理されかつ互いにアニールさせる２つのオリゴヌクレオチドの混合物と結合させることによって、行われた。形質転換細胞を精製し、プラスミドがＸbaI 部位を獲得したものについて、さらに分析を行った。ＤＮＡ配列分析は、１つのクローン、ｐＡＫ67.7が所望の構造を有していることを示した：Ｅ．ｐＡＫ80 の構築プロモータープローブベクターの作成における最終工程は、操作したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をラクトコッカスのレプリコンおよび選択マーカーと結合させることであった。これは、ｐＡＫ67.7をＨindIIIおよびＳalI で消化し、ｐＡＫ66 中に結合させ、またＨindIIIおよびＳalI で消化することによって達成された。産生されたプラスミドの中で、ｐＡＫ80 は、まさに最初に設計されたプロモータープローブベクターであった。ラクトコッカスラクチス亜種ラクチスＭＧ1363 によって保有されているプラスミドｐＡＫ80 は、ＤＳＭ-Ｄeutsche Ｓammlung vonＭikroorganismen und Ｃellkulturen ＧmbＨ，Ｍascheroder Ｗeg 1b，Ｄ-38124 Ｂraunschweig，Ｇer manyに、受託番号ＤＳＭ 8496として、1993年 8 月 27 日に寄託された。Ｆ．調節可能なｔＲＮＡプロモーターを用いるｐＡＫ80 の試験ＣＨＣＣ285のtma 遺伝子に近接するラクトコッカスラクチス亜種ラクチスからのＤＮＡフラグメントを単離し、それが、２つの潜在的なプロモーター（PI 、ヌクレオチド107−134 ；PII、ヌクレオチド215−242）からなるプロモーター領域（図１１および１２）によって先行されるｔＲＮＡ遺伝子のクラスターを含んでいることを見い出した。クローンｐＬＮ39から単離された501 bp ＨindlII −Ｓcal フラグメント上に含まれているPIおよびPIIプロモーターは、それを、プロモーターレスロイコノストックメセンテロイデス亜種クレモリスのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の前で、ＨindIII およびＳmaI で消化ざれたｐＡＫ80 中に挿入することによってクローン化された。リゲーション後、ＭＧ1363 を電気さく孔（electroporated）し、細胞を、エリスロマイシンとＸ-gal を含む再生培地（ＨoloおよびＮes,1989）上にプレーティングした。全部で７つの青色コロニーが得られた。プラスミド分析は、７つ全てが同一のプラスミドを有すること、および各々がｐＡＫ80 中に所望の挿入物含んでいることを示した。１つのプラスミドを単離し、ｐＡＫ90 と称した。 β−ガラクトシダーゼ分析は、ＭＧ1363 ／ｐＡＫ90 が5000 ミラー単位の酵素を産生し、一方ＭＧ1363 ／ｐＡＫ80 が１ミラー単位の酵素を産生することを示した。従って、ｔＲＮＡ遺伝子に先行する領域は、非常に強いプロモーターを含んでいる。上記プロモーター領域の配列に類似する配列の検索（図１３）は、先に記載されていない保存配列（モティーフ）、ＡＧＴＴを含むラクトコッカス種からのｒＲＮＡオペロンおよびｔＲＮＡオペロンに先行するプロモーターの共通配列を示した。この配列は、−35領域の5bp上流で終わり、エシエリヒアコリまたはバシラスズブチリスのｔＲＮＡおよびｒＲＮＡプロモーターに保存されない。このＡＧＴＴモティーフが潜在的なｒＲＮＡまたはｔＲＮＡプロモーターに先行することが見いだされた全ラクトコッカス種において、これらのプロモーターはすべて、そのプロモーターがクロラムフェニコールアセチルトランスフエラーゼをコードするcat-86遺伝子の前に挿入されたプラスミドから単離された。この酵素は、ラクトコッカスラクチスにおいて不十分に発現されるので、クロラムフェニコールに対する耐性は、cat-86遺伝子の前に強力なプロモーターをクローニングすることによって、この生物において得ることができるだけである。従って、このモティーフＡＧＴＴがラクトコッカスラクチスの強力なプロモーターにおいてのみ見られることは明白である。上記プロモーターPIおよびPIIの両方は、おそらく緊縮調節に関連する保存配列を含み（図１３）、従って、これらのプロモーターは、調節可能なプロモーターであると思われる。ｐＬＮ39からの1.0 kb ＨindIII−ＥcoＲIフラグメントを、ＨindIIIおよびＥ coＲI で消化されたプラスミドｐＣＩ3340中に挿入し、得られたプラスミドｐＬＮ40を、ラクトコッカスラクチスＭＧ1363 中に導入した。ｐＬＮ40／ＭＧ136 3 は、ＤＳＭ-Ｄeutsche Ｓammlung vonＭikroorganismen und Ｃellkulturen ＧmbＨ，Ｍascheroder Ｗeg 1b，Ｄ-38124 Ｂraunschweig，Ｇermanyに、受託番号ＤＳＭ 8858として、1993年12月22日に寄託された。Ｇ．結論この実施例は、ラクトコッカスとおそらく他の乳酸菌用の新規なプロモータープローブベクターの構築を記載している。このベクターは、先に記載したベクターに対していくつかの利点を有している。それは、ラクトコッカスラクチス亜種ラクチス次亜種ジアセチルアクティスクエン酸プラスミドレプリコン、θ複製プラスミドに基づき、より安定なことである。選択したリポーター遺伝子は、ポスト転写調節を受けないので、いずれかの誘導物質の存在なしで酵素レベルを測定することはできない。このことは、クロラムフェニコールが実際にｍＲＮＡの翻訳を活性化するcat-86遺伝子に基づくプラスミドとは対照的である（Ａlexiev a et al.,1988）。リポーター遺伝子についての酵素アッセイとプレートアッセイは、単純で、かつたいていの実験室での標準手順である。実施例７制御された条件下液体培地で増殖させたＰＦＣ-１絹込み体におけるβ−ガラクトシダーゼ発現の測定実施例４で定義したラクトコッカスラクチス亜種ラクチスＭＧ1363 ＰＦＣ- １クローン（ＬＴＶ１組込み体）は、通常P139-とその後に続く番号表示、例えばP139-170で示される。しかしながら以下においては、ＰＦＣ-１組込み体は、それらの番号、例えば170のみによって呼ばれる。この研究には、実施例５で表示Ｈ25Ａとして述べられたラクトコッカスラクチス亜種ラクチスＭＧ1614におけるＬＴＶ１組込み体も含まれる。しかしながら以下においては、この組込み体は、ＳＢと称した。以下の実験は、２つの組込み体170とＳＢにおけるlacＺ発現のｐＨ依存を研究する目的で行われた。組込み体170は、タイプ１Ａであることが示されており、一方組込み体ＳＢは、明らかにこのグループに属さなかった。両組込み体は、ＧＭ17プレト卜上での β−ガラクトシダーゼの発現が２％ＮaＣl によって影響を受けないことを意味するタイプ２Ｓである。各々１リットルのＧ1.5Ｍ17培地、即ち0.5％グルコースを含みかつ１ｍｇ／ｌエリスロマイシンが補われている1.5×Ｍ17肉汁（Ｓigma Ｃhemical Ｃo.）を含む４つの発酵槽を、30℃で操作するためにセットした。撹拌を、空気／酸素の活性供給なしで150 rpmで続けた。二倍の発酵槽を、５Ｍ塩酸塩と５Ｍ水酸化ナトリウムを用いて、各々ｐＨ 5.2 と 7.0 で操作するためにセットした。二倍の発酵槽のうちの一つに、組込み体ＳＢの１％のオーバーナイト培養物を接種し、二倍発酵槽の他方に、組込み体170の１％のオーバーナイト培養物を接種した。発酵槽を45時間作動させ、増殖させ、ＯＤ₆₀₀を測定した。選択したＯＤ₆₀₀値と時間間隔で、β−ガラクトシダーゼ活性を以下のようにして測定した：各々の発酵槽からの10 ｍlのアリコー卜を10000×ｇで４℃で５分間遠心分離した。ペレットを、１ｍlのＺバッファー（Ｍiller,1972）に再懸濁し、ボルテックスミキサーを用いて、0.4ｍlの細菌懸濁液および0.1ｍlのＺバッファーを、12.5μｌの0.1％ＳＤＳおよび25μｌのＣＨＣl_３と10秒間混合した。ボルテックスにより混合した懸濁液を、30℃の水浴中に５分間置き、Ａ−培地（Ｍiller，1972）中に 4 ｍｇ／ｍlのｏ−ニトロフェニルーβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を含む100μｌの溶液を加えた。懸濁液を２秒間ボルテックスにより混合し、3 0℃の水浴中に置いた。時間は、ＯＮＰＧを添加した時点と、250μｌの１ＭＮa_２ＣＯ_３を添加し、ボルテックスを用いて混合し、懸濁液を氷上に置くことによって酵素反応を停止したときに再び書き留められた。10000×ｇで４℃で10分間遠心分離した後、上清のＯＤ₄₂₀とＯＤ₅₅₀を測定した。ＯＤ₅₅₀値が0.050を越えたとき、懸濁液を再び遠心分離し、この上清のＯＤ₄₂₀とＯＤ₅₅₀を測定した。β−ガラクトシダーゼ活性は、以下の式を用いて評価された：図９には、ｐＨ 5.2とｐＨ 7.0での組込み体170についての時間に対するＯＤ₆ ₀₀ とβ−ガラクトシダーゼ活性が示されている。図１０には、組込み体ＳＢについての対応するデータが示されている。これらの２つの図におけるデータによって、組込み体170とＳＢにおけるβ−ガラクトシダーゼの発現がｐＨによって逆に調節されることが明らかに論証される。組込み体170は、ｐＨ 7.0でβ−ガラクトシダーゼの発現を止める。両組込み体において、β−ガラクトシダーゼの発現は、発育相によっても影響される。この実験は、培地のアルギニン濃度も、研究した２つの組込み体におけるβ−ガラクトシダーゼの発現に対する調節作用を有するかもしれないことを除外するものではない。実施例８乳酸菌プロモーターを含有するＤＮＡフラグメントのクローニングお上びラクトコッカスラクチスにおけるプロモーター活性の評価Ａ．ラクトコッカスラクチスＤＮＡとＴn917-ＬＴＶ１組込み体からのＣolＥ1 レプリコンを含むＥcoＲ I フラグメントのイー．コリにおけるクローニンラクトコッカルＤＮＡ、lacＺ、cat、blaおよびＣolＥ1 レプリコンを含む染色体ＥcoＲI フラグメントを、以下の表５に列挙されたＴn917-ＬＴＶ1 組込み体から実施例５に記載の方法に従って作成した。フラグメントを連続的に再結合し、Ｍaniatis 1982に記載の形質転換によってイー．コリＤＨ５ａ中に導入した。得られたＴn917-ＬＴＶ１組込み体フラグメントプラスミドを、ｐ（組込み体番号）、例えばｐ86、ｐ143およびｐＳＢと称した。フラグメントが単離された全Ｔn917-ＬＴＶ１組込み体は、ラクトコッカスラクチスＭＧ1614におけるＴｎ９１７-ＬＴＶＩであるＳＢを除いて、ラクトコッカスラクチスＭＧ1363 に存在する。表５選択した組込み体におけるβ−ガラクトシダーゼ発現の調節パラメータ。パラメータは、プレートアッセイから導き出される。組込み体番号パラメーター８６アルギニン／ｐＨ１４３温度／成長速度１５９温度／成長速度１６２アルギニン／ｐＨ１６３アルギニン／ｐＨ；ｐＯ₂ １７０温度／成長速度；アルギニン／ｐＨ１７２温度／成長速度１７９アルギニン／ｐＨ；ＮａＣｌ／イオン強度１８７温度／成長速度１８８温度／成長速度１８９ＮａＣｌ／イオン強度１９２温度／成長速度；アルギニン／ｐＨ１９９ＮａＣｌ／イオン強度；アルギニン／ｐＨ２０１温度／成長速度２０２温度／成長速度２２２アルギニン／ｐＨ２２４アルギニン／ｐＨ２４１ＮａＣｌ／イオン強度２４２アルギニン／ｐＨＳＢ温度／成長速度；アルギニン／ｐＨＢ．プロモーター選択ベクターｐＧＫＶ210中へのＴｎ917-ＬＴＶ1組込み体フラグメントプラスミドのサブクローニングｐＧＫＶ210は、選択マーカーとしての erm遺伝子、およびポリリンカーによって先行されるプロモーターレスcat-86遺伝子を含むプロモーター選択ベクターである（van der Vossen et al., 1987）。 cat-86遺伝子は、プロモーターを有するＤＮＡフラグメントがポリリンカー中に右方向に挿入される場合に発現される。宿主に与えられるクロラムフェニコール耐性の程度は、プロモーターの強度に依存する。組込み体フラグメントプラスミドは全て、Tn917-LTV1のlacZ部分から生じるＤＮＡに位置したClaI部位を有している。プラスミドからEcoRI−ClaIフラグメントをクローン化するために、ClaI部位を、以下の方法でｐＧＫＶ210のポリリンカー中にまず導入した：ClaI部位を含む合成ＤＮＡリンカーを、Maniatis,1982によって記載されたようにしてｐＧＫＶ210のユニークBamHI 部位中にクローン化した。得られたプラスミドを、ｐＧＫＶ210 （ClaI）と称した。ClaIとEcoRIで消化された50ngのｐＧＫＶ210 （ClaI）を混合し、上記のように200ngの精製したClaI−EcoRIフラグメントで結合した。これは、以下の組込み体フラグメントプラスミド：p143、p162、p163、p170、p172、p224、p237、p2 42およびｐＳＢからのClaI−EcoRIフラグメントでなされた。 p162は、ラクトコッカルＤＮＡに位置した追加のClaI部位を含んでいる。このプラスミドのEcoRＩ部位から追加のClaI部位までのフラグメントを、ｐＧＫＶ21 0（ClaI）中に挿入した。この実施例における全てのＤＮＡ組換え操作は、Mania tis,1982に従って行われた。得られたｐＧＫＶ210誘導体構築物を、ｐＧＫＶ210：（組込み体番号）、例えばｐＧＫＶ210 ：143、ｐＧＫＶ210 ：162およびｐＧＫＶ210 ：ＳＢと称した。ｐＧＫＶ210誘導体を、実施例５に記載の方法に従って、イー．コリＭＣ1 000｛Ｆ-，araD139（△ara-leu）7679，galU，galK（△lac）×74，rpsL（Strr ），thi｝中に導入した。ｐＧＫＶ210誘導体を、形質転換された宿主菌株から、 Maniatis,1982に記載されたようにして抽出した。各々の抽出されたｐＧＫＶ誘導体について、１μｇのＤＮＡを、実施例１に記載の方法に従ってラクトコッカスラクチスＭＧ1363中に導入した。得られた形質転換細胞（ｐＧＫＶ／ＭＧ13 63誘導体）を、ｐＧＫＶ210：（組込み体番号）／ＭＧ1363、例えばｐＧＫＶ210 ：143／ＭＧ1363と称した。上記クローン化したフラグメントおよび先に発表されたラクトコッカスラクチスＩＬ1403におけるｐＧＫＶ210誘導体（van derVossen et al.,1987）のプロモーター活性を、ｐＧＫＶ／ＭＧ1363誘導体のオーバーナイト培養物を５mg／１エリスロマイシンと増加する濃度のクロラムフェニコールが補われているＧＭ17 プレート上にプレーティングすることによって測定した。クロラムフェニコールの濃度は、各々４、６、８、１２、１６および20mg／１であった。0.9％NaCl水性懸濁液中に10⁴倍希釈された培養物の50μｌを、４〜８mg／lのクロラムフェニコールを含むプレート上にプレーティングした。0.9％NaCl中に10^４倍希釈された培養物の100μｌを、12〜20 mg／lのクロラムフエニコールを含むプレート上にプレーティングした。そのプートを、30℃で約80時間インキュベートし、増殖させることができるクロラムフェニコールの最大濃度を決定した。結果を以下の表６に示す。２つのｐＧＫＶ／ＭＧ1363誘導体のみが、４mg／ｌ以上のクロラムフェニコールに対して耐性であった。しかしながら、結果の解釈は、例えば小さいコロニーの出現のために、困難性になった。この分析は、培地のプロモーターまたは弱い強度のプロモーターに関して不適当であるように思われる。ｐＧＫＶ244／ＩＬ1 403およびｐＧＫＶ259／ＩＬ1403は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ活性を測定するとき、各々0.2および5.1単位を産生する（van derVosse n et al.,1987）。表６ｐＧＫＶ２１０およびｐＧＫＶ２１０誘導体を保有する菌株ＭＧ１３６３を増殖させる最大クロラムフェニコール（Ｃｍ）レベルＣ．Ｔｎ917-ＬＴＶ１組み込み体フラグメントプラスミドのプロモーター選択ベクターｐＡＫ80中へのサブクローニングｐＡＫ80は、選択マーカーとしてのerm遺伝子、およびポリリンカーによって先行されるプロモーターレスβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むプロモーター選択ベクターである。ｐＡＫ80の構築は、実施例６に記載されている。以下のＤＮＡ操作および形質転換は、Maniatis,1982に従って行われた。上記の組込み体フラグメントプラスミドを、ｐＡＫ80における適当な制限部位の欠如のために、クローニングベクターｐＧＥＭ-7Ｚf（＋）（プロメガ）中にまずサブクローン化した。ClaIとEcoRIで消化された50ngのｐＧＥＭ-7Ｚf（＋）を、連鎖反応条件下で、組込み体フラグメントプラスミドからのラクトコッカルＤＮＡを含む200ngの精製したClaI−EcoRIフラグメントと混合した。これは、各々以下のプラスミド：p143、p162、p163、p224、p242およびｐＳＢからのClaI−EcoR Iフラグメントでなされた。 p170は、ラクトコッカルＤＮＡに位置したSalI部位を含んでいる。ClaI部位からこのSalI部位までのフラグメントを、ClaIおよびSalIで消化されたクローニングベクター pBluescript II KS（Strategene）中に挿入した。この構築物を、p Bluescript :170と称した。この構築物からの抽出プラスミドＤＮＡを、XhoIおよびClaIで消化し、XhoIおよびClaIで消化されたｐＧＥＭ-7Ｚf（＋）に結合させた。ｐＧＥＭ-7Ｚf（＋）構築物を、ｐＧＥＭ：（組込み体番号）、例えばｐＧＥＭ：143およびｐＧＥＭ：170と称し、集合的にｐＧＥＭ誘導体と称した。ｐＧＥＭ誘導体を、実施例５に記載したようにしてイー．コリ菌株ＤＨ５α中に導入した。ＤＨ５α形質転換細胞を、ｐＧＥＭ／ＤＨ５α誘導体と称した。ｐＧＥＭ／ＤＨ５α誘導体からのプラスミドＤＮＡを抽出し、XhoIおよびBamH Iで消化し、XhoIおよびBamHIで消化されたｐＡＫ80に結合させた。得られた構築物を、ｐＡＫ80：（組込み体番号）、例えばｐＡＫ80：143およびｐＡＫ80：170 と称し、集合的にｐＡＫ80誘導体と称した。ｐＡＫ80誘導体を、実施例５に記載したようにしてイー．コリＭ1000中に導入した。ＭＣ1000形質転換細胞を、ｐＡＫ80／ＭＣ1000誘導体と称した。ｐＡＫ80誘導体を、ｐＡＫ80／ＭＣ1000誘導体から抽出した。各々の抽出されたｐＡＫ80誘導体について、１μｇのＤＮＡを、実施例５に記載したようにしてラクトコッカスラクチスＭＧ1363中に導入した。得られた形質転換細胞を、ｐＡＫ80：（組込み体番号）／ＭＧ1363、例えばｐＡＫ80：143／ＭＧ1363およびｐＡＫ80：170／ＭＧ1363と称し、集合的にｐＡＫ80／ＭＧ1363誘導体と称した。クローン化したフラグメントのプロモーター活性を、Ｇ1.5Ｍ17培地で増殖させたｐＡＫ80／ＭＧ1363誘導体ののオーバーナイト培養物に関するβ−ガラクトシダーゼ分析を行うことによって決定した。１mlの培養物を、10000×ｇで１０分間遠心分離した。ペレットを500μｌのＺバッファー（Miller,1972）中に再懸濁した。ボルテックスミキサーを用いて、100μｌの細胞懸濁液を、400μｌのＺバッファー、12.5μｌの0.1％ＳＤＳおよび25μｌのCHCl₃と10秒間混合した。ボルテックスにより混合した後、懸濁液を実施例７に記載したように処理した。結果を表７に示す。表７ｐＡＫ80およびｐＡＫ80誘導体を保有する菌株ＭＧ1363のβ− ガラクトシダーゼ活性上記結果から、プロモーター選択ベクターｐＡＫ80が、弱いプロモーターでさえも識別することができることが明らかに論証される。それは、ｐＡＫ80 ：163 ／ＭＧ1363、ｐＡＫ80 ：170／ＭＧ1363、ｐＡＫ80：224／ＭＧ1363およびｐＡＫ80 ：242／ＭＧ1363が、クロラムフェニコール耐性に関して分析するときプロモーター活性がないように思われるが、β−ガラクトシダーゼ活性に関して分析するとき、３つの他のｐＡＫ80／ＭＧ1363誘導体とは対照的にｐＡＫ80 ：170 ／ＭＧ1363が、プロモーター活性を有していることが明白であるからである。以下のｐＡＫ80／ＭＧ1363誘導体：ｐＡＫ80：ＳＢ／ＭＧ1363、ｐＡＫ80 :14 3／ＭＧ1363、ｐＡＫ80 :162／ＭＧ1363、ｐＡＫ80：163／ＭＧ1363、ｐＡＫ80：170／ＭＧ1363の各々は、DSM-DeutscheSammlung von Mikr oorganismen und Cellkulturen GmbH,Mascheroder Weg lb,D-38124 Braunschwei g,Germanyに、各々受託番号ＤＳＭ 8495、DSM 8497、DSM 8498、DSM 8499およびＤＳＭ 8500として、1993年８月２７日に寄託された。ラクトコッカルＤＮＡを含む各々p172およびp215からのClaI−EcoRIフラグメントを、ｐＧＥＭ-7Ｚf（＋）中にクローン化した。ｐＧＥＭ-7Ｚf（＋）構築物を、この実施例で上記のように称した。ｐＧＥＭ-7Ｚf（＋）構築物を、BamHIおよびXhoIで消化し、BamHIおよびXhoI で消化されたｐＡＫ80に結合した。クローニング実験の詳細は、上記のとおりである。ｐＧＥＭ：172をXhoIおよびBamHIで消化した。連鎖反応混合物を、イー．コリＤＨ５α中に導入し、得られたプラスミドｐＡＫ80：172をラクトコッカスラクチスＭＧ1363中に導入した。ｐＡＫ80：172／ＧＭ1363は、Ｘ-galを含むＧＭ17上で青色であり、このことは、ｐ172の4.5kb ClaI−EcoRIフラグメント上のプロモーターの存在を論証している。ｐＧＥＭ：215のラクトコッカルＤＮＡセグメントは、内部BamHI部位を含んでいる。ｐＧＥＭ：215の末端のBamHI−Xholフラグメントを、BamHIおよびXhoIで消化されたｐＡＫ80に結合し、ラクトコッカルBamHI−BamHIフラグメントを、Ba mHIで消化されたｐＡＫ80に結合した。各々の連鎖反応混合物を、イー．コリＤＨ５α中に導入した。得られたプラスミドを、各々ｐＡＫ80：215ＡおよびｐＡＫ80：215Ｂと称した。ｐＡＫ80：215ＢにおけるBamHIフラグメントの正確な方向は、制限地図分析によって証明された。ｐＡＫ80： 215ＡおよびｐＡＫ80：215Ｂの各々のラクトコツカスラクチス中ヘの連続的な導入は、プラスミドのどれもがプロモーターを保有していないことを示した。この結果は、p125からのClaI−EcoRIフラグメント上の潜在的なプロモーターが、２つのサブフラグメントのクローニング中に不活性化されたこと、または組込み体215におけるβ−ガラクトシダーゼ発現を行うプロモーターが、Eco RI部位の上流に位置していることを示唆している。各々プラスミドｐＡＫ80：ＳＢ、ｐＡＫ80：143、ｐＡＫ80：162、ｐＡＫ80： 170およびｐＡＫ80：172を含むラクトコッカスラクチスＭＧ1363のオーバーナイト培養物に関する測定は、以下の実施例１３に記載されている。しかしながら、実施例１３においては、これらのプラスミドは、各々ｐＳＭＡ332、ｐＳＭＡ3 37、ｐＳＭＡ338、ｐＳＭＡ339およびｐＳＭＡ345と称されている。実施例９外部プリン化合物によって調節されるラクトコッカスラクチスプロモーターの特徴小さい前駆体からのプリンヌクレオチドの新規合成は、一般的に、イノシンフォスファターゼ（ＩＭＰ）に導く10の酵素反応を必要とする。ＩＭＰは、ＡＭＰおよびＧＭＰの両方の合成に用いられる。細胞内に生じるかまたは外因性の源から生じるプリン塩基とヌクレオチドは、異なる生物の間で異なることが示されているサルベージ経路を介してヌクレオチドに変換する（レビューのためにNygaar d 1983参照）。実際には、記載されたこと以外は、嫌気性グラム陽性細菌であるラクトコッカスラクチスにおけるプリン代謝については何も知られていない（ NilssonおよびLauridsen,1992）。乳酸菌の生育に使用する培地は、プリン化合物を含むことができる。このような培地は、プリンヌクレオチドの形成に使用される酵素の合成を抑制する。牛乳をプリンフリーミルクの培養物に接種するとき、この抑制は、軽減される。このプリンde novo経路に用いる酵素の合成の調節パターンは、商業的に用いることができる。ミルク中で高く発現することが望まれる酵素をエンコードするいくつかの遺伝子があるかもしれない。しかし、そのような酵素は、高い発現によって引き起こされる生育を阻害する二次作用のために、主としてそのような遺伝子からなる牛乳スターター培養物の製造中には望まれない。従って、プリン調節プロモーターをラクトコッカスラクチスにおいて検索し、purDの発現が開始されるプロモーター領域を単離した。purD遺伝子は、プリンde novo経路の酵素をエンコードしている。細菌菌株および増殖培地ラクトコッカスラクチス菌株ＭＧ1363をＭ17培地｛オキソイド（Oxoid）｝もしくは定義した培地、即ちＤＮ−培地中で増殖させた。この培地は、以下のように構成されている（リットル当たり）：以下の組成を有する100mlの10％塩バッファー：（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ 10 g，Ｎａ₂ＨＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ 33.2g，ＫＨ₂ＰＯ₄ １５g，ＮａＣｌ５ｇ，酢酸ナトリウム３水和物10ｇ，イオン交換水で500ｍｌに調製したもの；1.0ＭＭｇＣｌ₂１０ml，0.5 ＭＣａＣｌ₂ 1.0ml，0.01 ＭＦｅＣｌ₃ 1.5 ml，イオン交換水で4500ｍｌに調製したものと、１リットル当たり１５ｇの寒天を含む900mlの基本培地；25mlの20％炭素源； 25mlのカザアミノ酸20％（ディフコ）：10mlのビタミン溶液および10mlの0.8％アスパラギン溶液。グルコースを、Ｍ17培地およびＤＮ−培地の炭素源として用いた。ラクトコッカスラクチス用に用いた抗生物質：エリスロマイシン１ｍｇ／ｌ。必要な場合、補足物としてプリン化合物を加えた；１当たり：アデニンおよびヒポキサンチン15ｍｇ；グアノシン30ｍｇ。ＤＮＡ操作ラクトコッカスラクチスプラスミドＤＮＡを、JohansenおよびKibenich(199 2)に従って単離した。ラクトコッカスラクチスを、HoloおよびNes (1989)によって勧められたように、エレクトロポレーションによって形質転換した。ラクトコッカスラクチスプロモータープローブプラスミドpAK80の使用は、実施例６に記載されている。結果 846bpDNAフラグメント（図１４）は、逆方向に転写を開始する隣接したプロモーターとともに全purＤプロモーター領域を含んでいる。この領域を、ｐＬＮ71 （purＤプロモーター発現）およびｐＬＮ72（逆方向のプロモーター発現）を与えるプロモータープローブプラスミドｐＡＫ80中の（β−ガラクトシダーゼをエンコードする）リポーター遺伝子に融合させた。ラクトコッカスラクチス菌株ＭＧ1363中に形質転換するｐＬＮ71は、purＤプロモーターから開始されるリポーター遺伝子の発現を測定する可能性を我々に与える。結果を表８に示す。ラクトコッカスラクチス菌株ＭＧ1363中のプラスミドｐＬＮ71は、ＤＳＭ− Deutsche Sammlung von ikroorganismen und CellkulturenＧｍｂＨ，Mascherod er Weg lb,D-38124 Braunschweig,Germanyに、受託番号ＤＳＭ8859として、1993 年12月22日に寄託された。表８ｐＬＮ71のおけるβ−ガラクトシダーゼの発現ａ：細胞を、プリンを含むＤＮ−倍地で30℃で指数関数的に増殖させ、収穫し、洗浄し、プリンフリーのＤＮ−培地に再懸濁させ、さらに1.5時間インキュベートした。各々のプロモーターから発現されるβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。ｂ：細胞を、プリンを含む定義した培地で指数関数的に増殖された。各々のプロモーターから発現されるβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。ｃ：Ａ、アデニン；Ｈｘ、ヒポキサンチン；ＧＲ、グアノシン。これらの結果は、β−ガラクトシダーゼをエンコードするリポーター遺伝子の発現が、培地のプリン化合物によって調節されること、およびその違いが、この実験では60倍くらい大きいことを示している。実施例１０制御された条件下、液体培地で増殖させた_ＰSMA344/MG1363におけるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子発現の測定プラスミドｐＳＭＡ344は、プロモータークローニングベクターｐＡＫ80中に挿入されたｐ170（実施例８参照）からの9.7kbEcoRI−ClaIフラグメントからなっている。組込み体170において、挿入したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現は、ｐＨおよび発育相によって調節されることが論証されている（実施例７）。クローン化したＤＮＡフラグメントが下流の遺伝子のｐＨ調節発現に必要とされる配列を含むかどうかを調査するために、以下の実験をおこなった。プラスミドｐＳＭＡ344を保有するラクトコッカスラクチスＭＧ1363を、各々１リットルの培地を含む２つの発酵槽で培養した。発酵槽は、自動的に５Ｍの水酸化ナトリウムおよび５Ｍの塩酸を加えることによって、それぞれｐＨ7.0および5.2で操作するためにセットされた。他の全てのパラメーター（培地組成、接種物のサイズ、撹拌速度、温度等）は、実施例７に記載のとおりであった。発酵を45時間行い、増殖させ、培養物サンプルのＯＤ₆₀₀を測定した。培養物アリコートのサンプリングおよび収穫並びにβ−ガラクトシダーゼ活性の測定は、収穫した培養物の容量および分析に加えた細胞懸濁液の容量を細胞密度および予測されるβ−ガラクトシダーゼ活性に応じて変化させたことを除いて、実施例５に記載のとおり行った。図１５は、発酵中の時間に対するＯＤ₆₀₀およびβ−ガラクトシダーゼ活性を示している。その結果から、ｐＳＭＡ₃₄₄上に保有されたプロモーターからの発現が、組込み体170で観察された様式と同じ様式で制御されることが明らかである。ｐＨ7.0で増殖させた培養物において、ＯＤ₆₀₀当たりの β−ガラクトシダーゼ活性は、いくらかの活性が前培養物から残存することが予測される最初のサンプルを除いて、発酵中1.0 ミラー単位より低かった。ｐＨ5．2で増殖させた培養物においては、ＯＤ₆₀₀当たりのβ− ガラクトシダーゼ活性は、対数成長中増加し、定常期の最初の１４〜２０時間の間増加し続けた。誘発されたレベルおよび抑制されたレベルとも、同じ培養条件下で組込み体170で観察された値より５〜10倍高かった。このことは、プラスミドによって担持された遺伝子が、より高いコピー数で存在しているので、および（Tn917−ＬＴＶ１中の）lacＺ遺伝子および（ｐＡＫ80中の）1acＬ−1acＭ．遺伝子によってエンコードされた２つのβ−ガラクトシダーゼ酵素が、異なる特異活性を有しているかもしれないので、予測された。実施例１１標準化された手順による、液体培地で増殖させた撰択PFC-1組込み体におけるβ −ガラクトシダーゼ活性の測定実施例５に記載したように、いくらかの組込み体が、種々の増殖条件および培地組成下でプレートで増殖させたとき、β−ガラクトシダーゼの調節された発現を示すことが見い出された。液体培養で一晩増殖させた25の選択した組込み体におけるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子発現の調節を分析するために、以下の実験を行った。分析した調節パラメーターには、ｐＨおよび／またはアルギニン濃度、塩化ナトリウム濃度、および生育温度が含まれる。増殖培地および方法液体培養に用いた培地は、以下の表に列挙されている。全実験用の基本培地は、ｌｍｇ／ｌのエリスロマイシンを含む1.5×Ｍ17肉汁（Ｏxoid,Ｕnipath Ｌtd. ,ＵＫ）あった。表９組込み体の液体培養二用いた培地全培養物を、β−ガラクトシダーゼ発現に関する温度効果の研究のための実験（１セットの培養物を15℃でインキュベートした）を除いて、30℃でインキュベートした。β−ガラクトシダーゼ発現に関する温度効果の研究においては、より低い成長速度を補償するために、インキュベーションを延長した。全培養物における均一な開始条件を確保するために、液体Ｇ1.5Ｍ17中の各々の組込み体の５〜10ｍｌの前培養物に、ＧＭ17寒天からの単一のコロニーを接種し（以下の実施例１５参照）、30℃で12〜18時間インキュベートすることによって、定常期まで増殖させた。前培養物から、各々の菌株の10μｌを、10ｍｌの各々の培地に接種し、培養物を、30℃で20時間または15℃で165時間インキュベートした。ＯＤ₆₀₀測定用のサンプルを、収穫前直ちに各々の培養物から採取した。細胞を、遠心分離（10000×ｇ、４℃で10分間）することによって収穫し、１ｍｌの氷冷した0.15MNaClで一回洗浄した。培養上清のｐＨを測定した。培養物を異なる日に収穫した、異なる温度で増殖させた二倍の培養物（duplicate cultures）、の場合には、細胞ペレットを−20℃で凍結し、β−ガラクトシダーゼ活性を分析するために後ほど解凍した。細胞を、1. 0ｍｌのＺ−バッファー（Ｍiller,1972）中に再懸濁し、次いで細胞懸濁液を、妥当な限界内の反応速度を維持するために細胞懸濁液と分析に用いるＺ−バッファーとの間の割合を酵素活性に応じて調製したことを除いて、実施例７に記載のようにして、β−ガラクトシダーゼ活性の分析に用いた。液体培養で増殖させた選択組込み体に関するβ−ガラクトシダーゼ分析の結果異なる日に同じ菌株で見られた活性は、ある程度変化していた。組込み体ＳＢにおける10の独立したＧ1.5Ｍ17培養物において、測定された活性は、3.9〜8.0 で、平均6.3および標準偏差1.4であった。同じ培地における170の５つの独立した培養物は、0.9〜2.8で、平均1.7および標準偏差0.7の結果を与えた。観察された偏差は、遺伝子発現または培地のバッチ間の検出されない違いによる酵素安定性に関するなんらかの影響によって引き起こされるであろう。しかしながら、これらの場合の各々において、低いｐＨでの活性と高いｐＨでの活性間の違いは、明らかに有意であった（表１０）。0.1以下の活性は、実際に用いた方法では測定されなかった。表10は、アルギニンを含む培地およびアルギニンを含まない培地における17の異なる組込み体菌株の培養物で測定されたβ−ガラクトシダーゼ活性を示している。ｐＨおよび／またはアルギニンによって調節されるβ−ガラクトシダーゼ発現を示すほとんどの組込み体は、プレート分析によって同定された。組込み体23 7、241およびＳＢでは、明らかに、このような発現の制御は、プレートの検査によって観察されなかった。可能性のある理由としては、ある活性レベルを越えると、プレート分析によって異なる活性間の区別をすることは困難であることが挙げられる。表１０１：1000接種物から30℃で20時間増殖させた選択ＰＦＣ-組み込みの液体培養からの細胞活性として、アルギニンおよび／または培地のｐＨによって制御されたβ−ガラクトシダーゼの発現ブランクスペースは、菌株と培地のこの特別な組合せが試験されなかったことを示している。ＧＭ17寒天平板上で増殖中のβ−ガラクトシダーゼ活性が温度で変化した10の菌株を、30℃および15℃でＧ1.5Ｍ17の二倍培養で定常期まで増殖させた。細胞で測定した活性を、表１１に示す。表１１１：1000接種物からＧ1.5Ｍ17中でそれぞれ30℃で20時間および15℃で1 65時間増殖させた後測定した、液体培養で増殖させた選択ＰＦＣ-１組み込み体において発現されたβ−ガラクトシダーゼ活性の温度依存組込み体170および192は、プレートでも見られたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子発現の調節を示し、両方とも低温でより高い活性を与えた。組込み体ＳＢ、143 および159に関しては、β−ガラクトシダーゼ発現に対する温度の効果は、プレート分析の結果から予測されるものとは逆であった。組込み体172、187、188および201に関しては、その効果は予想より弱かった。液体培養からの細胞は定常期で収穫され、一方プレート分析で検出されたβ −ガラクトシダーゼ活性は、発育相と定常期の両方から累積されていることを考慮しなければならない。 PFC-1組込み体のプレート分析は、減少する遺伝子発現かまたは増殖培地へのN aClの添加に対する応答で変化しないことを示した。１％または２％NaClを含む液体培地で増殖させた培養物における活性測定の結果を、表１２に示す。組込み体179、199、230および241に関しては、NaClがβ−ガラクトシダーゼ活性を減少させることが、プレート分析から予測された。プレート分析においてβ−ガラクトシダーゼ活性に対するNaClのなんの影響も示さなかったいくつかの組込み体が、これらの実験に含まれており、これらの３つ、即ち224、229およびＳＢからの結果も表に表されている。全菌株において、試験された活性は、余分のNaClを含む培地で３〜30のファクターで減少し、明らかに最も強い効果はＳＢにおける活性に対するものであった。ずっと先に述べたように、NaClを含む培地における培養物の最終ｐＨは、追加のNaClなしで増殖させた培養物におけるものよりわずかに低かった。しかしながら、このｐＨの違いは、ＳＢの遺伝子発現に対する明らかな効果を説明するには十分大きいものではなく、また試験された全菌株に対する効果の類似性を説明するのに適当でもない。プレート分析の結果とオーバーナイト液体培養で測定した活性との間の明らかな矛盾を解明するために、より制御された実験が必要である。表１２１：1000接種物から30℃20時間増殖させた選択ＰＦＣ-１組み込み体の培養物においてβガラクトシダーゼ活性に対する培地のＮａＣｌの効果以下の組込み体（宿主生物：ラクトコッカスラクチスＭＧ1363）：ＳＢ、P139-86、P139-142、P139-143、P139-159、 P139-162、P139-163、P139-168、P139-172、P139-179、P139-187、 P139-188、P139-192、P139-193、P139-199、P139-201, P139-203、P139-222、P139-224、 P139-229、P139-230、P139-237、P139-241 およびＰ139-242は、ＤＳＭ−Ｄeutsche Ｓammlung von Ｍikroorganismen und Ｃellkulturen ＧmbＨ,Ｍascheroder Ｗeg 1b,Ｄ−38124 Braunschweig,Germa
n yに、各々受託番号ＤＳＭ8834、ＤＳＭ8835、ＤＳＭ8836、ＤＳＭ 8837、ＤＳＭ88 38、ＤＳＭ8839、ＤＳＭ8840、ＤＳＭ8841、ＤＳＭ8842、ＤＳＭ8843、ＤＳＭ8844、ＤＳＭ8845、ＤＳＭ8846、ＤＳＭ8847、ＤＳＭ8848、ＤＳＭ8849、ＤＳＭ8850、ＤＳＭ8851、ＤＳＭ8852、ＤＳＭ8853、ＤＳＭ8854、ＤＳＭ8855、ＤＳＭ8856およびＤＳＭ8857として、1993年12月22日に寄託された。実施例１２選択したTn917-ＬＴＶＩプロモーター融合組込み体におけるTn917挿入物の上流および下流のラクトコッカスラクチス染色体ＤＮＡの配列決定６つの選択したTn917-ＬＴＶ１ラクトコッカスラクチスプロモーター融合組込み体において、Tn917挿入物の約200ｂｐ〜1500ｂｐ上流の染色体配列を決定した。１つの選択組込み体では、トランスポゾン挿入物の下流の配列も決定した。配列決定は、挿入プロモーターレス遺伝子（複数の遺伝子）の調節された発現を示すラクトコッカスラクチスの染色体上のこの例の部位および領域に対してなされた。配列決定は、鋳型としての組込み体フラグメントプラスミド（実施例８参照）ｐＳＢ、ｐ170、ｐ143、ｐ242、ｐ224およびｐ163と以下に記載のプライマーを用いて、本質的にＵＳＢ，クリーブランド、オハイオ、アメリカからのシークエナーゼバージョン2.0ＤＮＡ配列決定キット用のマニュアルに記載のようにして、両方の鎖に対して行われた。我々は、Tn917-ＬＴＶ１の1acＺ近位末端の隣に位置したラクトコッカスＤＮＡを、トランスポゾン挿入物の上流にあると定義した。どちらの鎖が述べられたとしてもとにかく、1acＺ末端から遠く動かすことは、ラクトコッカスＤＮＡ上の上流に動かすことである。各々の鋳型に関する上流の配列決定の戦略は、以下のようである。１．第一の配列反応を、プライマーppl（５’ＧＴＴＡＡＡＴＧＴＡＣＡＡＡＡＴＡＡＣＡＧＣＧ’３）（ＤＮＡテクノロジー，Ａrhus，Denmark）を用いて行った。pplは、Tn917-ＬＴＶ１のlacＺ近位末端の配列に相同である。Tn917-ＬＴＶ１の上流の最初のbpを１番と称すならば、pplに相補的な配列は、bp番号−58 〜−80に位置している。ppl配列と称せられる得られた配列は、Tn917-ＬＴＶ１の1acＺ近位末端の約20bpとそれに続く200〜300bpの隣接した上流のラクトコッカスラクチスＤＮＡ配列からなっている。２．ppl配列に基づいて、プライマーplを合成した（ＤＮＡテクノロジー）。pl は、ppl配列の３’末端から約60bpに位置する20〜24bp配列に相同である。第２の配列反応を、プライマーplを用いて行った。p1配列と称せられる得られた配列は、ppl配列の３’末端の約20bpと重複しており、ラクトコッカスラクチスＤＮＡ上の200〜300bpさらに上流に延びていた。３．pl配列に基づいて、２つのプライマーp2およびplrを合成した（ＤＮＡテクノロジー）。p2は、pl配列の３’末端から約60bpに位置する20〜24bp配列に相同であり、plrは、トランスポゾン挿入物の約250bp上流に位置する相補的なラクトコッカスラクチスＤＮＡ配列に相同である。第３および第４の配列反応を、それぞれプライマーp2およびplrを用いて行った。プライマーp2を用いて得られたp 2配列と称せられる配列は、p1配列の３’末端の約20bpおよびラクトコッカスラクチスＤＮＡ上のさらに上流の200〜300bpと重複していた。プライマーplrを用いて得られたplr配列と称せられる配列は、ppl配列に相補的である。４．追加の配列反応を、プライマーp3、p4等を用いて行った。各々のプライマーは、先に用いたプライマーの約300bp上流に位置する配列に相同であった。また、プライマーp2r、p3r等を用いて、配列反応を行った。その各々は、先に用いたプライマーの約300bp上流に位置する配列に相同である。５．組込み体ＳＢにおけるTn917-ＬＴＶ１挿入物から下流に位置する配列のクローニング：Tn917誘導体Tn917-ＬＴＶ１をトランスポゾン突然変異誘発に用いるとき、挿入点の上流に位置するＤＮＡは、実施例５に記載したようにイー．コリ中に容易にクローン化することができる。しかしながら、このクローニング方法は、Tn917-ＬＴＶ１挿入物の下流に位置するＤＮＡをクローン化するのに用いることはできない。しかしながら、インバースポリメラーゼチェンリアクション（ InverseＰolymerase Ｃhain Ｒeaction）戦略（Ｏchman et al.,1988）を用いて、組込み体ＳＢにおけるトランスポゾンの下流に位置するＤＮＡは、増幅され、かつ以下の方法でイー．コリ中にクローン化された： 60ｎｇの染色体ラクトコッカスラクチスＭＧ1614ＤＮＡを、ＥcoRIで完全に消化した。消化したＤＮＡを、フェノール／クロロホルム抽出し、酢酸ナトリウムとエタノールで沈澱させた。次いで、ＤＮＡを、総容量２０μｌ中で結合させた。この希釈された濃度は、単量体の円を形成するのに有利である。この連鎖反応混合物から５μｌのサンプルを採取し、総容量１００μｌ中でＰＣＲ増幅を行った。２つのプライマーＢＡ24：（５’ＣＣＡＧＴＣＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡＣＡＴＡＡＣＣ３’）およびＢＡ21：（５’ＣＴＣＡＣＴＧＧＴＣＡＣＣＴＴＴＡＴＣＣ３’）をＰＣＲ増幅に用いた。Ｐerkin Ｅlmer Ｃetus,761 Ｍain Ave.,Ｎorwalk,ＣＴ 06859からのＧeneAmp ＤＮＡ増幅試薬キットを用いた。反応バッフアー、dNTPs およびTsqポリメラーゼの濃度は、製造業者からのプロトコールに記載のとおりである。反応混合物中のプライマーの終濃度は、10ｎｇ／μｌであった。以下の温度プロファイルを用いた：変性、94℃、１分；アニーリング、53℃、１分；伸長、７２℃、２分。ＰＣＲサイクルの総数は、40であった。 10μｌのＰＣＲ反応産物を、アガロースゲル上で分析したとき、約1400bpの特異的な１つのバンドが観察された。このことは、組込み体ＳＢにおけるTn917挿入物の下流の約1100bpのクローニングを示している。ＰＣＲ反応からの1400bpフラグメントを、Ｍanlatis et al.,1982によって記載されたような標準連鎖反応条件下で、pT7Ｂlue(R)ベクター（Ｎovagen,Ｍadison ,Ｗisconsin,ＵＳＡ）に結合させた。連鎖反応混合物を、イー．コリＤＨ５α中に導入した。得られたプラスミドをpSBC1と称した。次の配列反応を、上記パラグラフ２、３および４で述べた同じ戦略を用いて行った。以下に、それぞれ組込み体ＳＢ、170、143、242、224および163におけるTn917-ＬＴＶ１挿入物の上流のＤＮＡ配列を示す｛（ｉ）(vi)｝。組込み体ＳＢについては、組込み体ＳＢにおけるTn917ーＬＴＶ１挿入物の下流のＤＮＡ配列も与えられている。トランスポゾン挿入物の部位とTn917-ＬＴＶ１の方向は、配列中に挿入された（lacＺ−−Tn917-ＬＴＶ１−）によって示されている。(i)Tn917-ＬＴＶ１のlacＺ近位末端の上流の117ヌクレオチドのＤＮＡ配列および組込み体ＳＢにおけるTn917-ＬＴＶ１の1acＺ遠位末端から下流の1.083ヌクレオチドのＤＮＡ配列推定の転写ターミネーターは、小さいケース番号で示されており、プロモーターＰＳＢの−35および−10共通配列は、下線が引かれている。（ii）組込み体１４３におけるＴｎ９１７−ＬＴＶ１のｌａｃＺ近位末端の上流の1.430ヌクレオチドのＤＮＡ配列 (iii)組込み体163におけるTn917-ＬＴＶ１の1acＺ近位末端の上流の994ヌクレオチドのＤＮＡ配列 (iV)組込み体170におけるTn917-ＬＴＶ１の1acＺ近位末端の上流の1.120ヌタレオチドのＤＮＡ配列 (v)組込み体224におけるるTn917-ＬＴＶ１の1acＺ近位末端の上流の 480ヌタレオチドのＤＮＡ配列（vi）組込み体における242Tn917-ＬＴＶＩの1acＺ近位末端の上流の853ヌクレオチドのＤＮＡ配列実施例１３ｐ170からの9.7ｋｂＥcoRI−ＣlaiIＤＮＡフラグメント上のプロモーターＰ170 のマッピンｐ170の9.7kbＣlaI−ＥcoRIフラグメント上のｐＨ／発育相調節プローターＰ1 70の位置を位置づけるために、以下の実験を行った。ｐ170の9.7kbＣlaI−ＥcoRIフラグメントをサブフラグメントに開裂し、制限地図を作った（図１６参照）。次いで、適当なサブフラグメントを、プロータープローブベクターｐＡＫ80中にクローン化した。しかしながら、まず、サブフラグメントおよびｐＡＫ80上の和合性制限部位を作ることが必要であった。(i)ｐＳＭＡ344の構築ｐ170からの大きい9.7kbＣlaI−ＥcoRIフラグメントのｐＧＥＭー７Ｚf(＋)中へのクローニングを、ＣlaIおよびＥcoRIでｐ170を消化し、ＣlaIおよびＥcoRI で消化されたｐＧＥＭ-７Ｚf(＋)に9.7kbフラグメントを結合させることによって行った。連鎖反応混合物を、イー．コリＤＨ５α中に導入し、得られたプラスミドを、ｐＳＭＡ212と称した。ｐＳＭＡ212を、ＸhoIおよびＢamＨＩで消化し、ＸhoIおよびＢamＨＩ消化されたｐＡＫ80に結合させた。連鎖反応混合物を、イー．コリＤＨ５α中に導入した。次いで、得られたプラスミドｐＳＭＡ344を、ラクトコッカスラクチスＭＧ1363中に導入した。(ii)ｐ170からの9.7kbＣlaI−ＥcoRIフラグメントの欠失誘導体の構築およびクローニングプラスミドｐＳＭＡ342を以下の方法で構築した：ｐＳＭＡ212を、ＣlaIおよびＮdelで消化し、スティッキーエンド（付着末端）を、Maniatis et al.,1982によって記載されたように、クレノウポリメラーゼを用いて満たした。大きい8.7kbフラグメント（ｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）からの3 kbおよびラクトコッカス染色体からの5.7kb）を精製し、再結合させ、イー．コリＤＨ５α中に導入した。得られたプラスミドｐＳＭＡ213 をXhoIおよびBamHIで消化し、精製した5.7kbフラグメントを、XhoIおよびBamHI で消化されたｐＡＫ80に結合させた。連鎖反応混合物をイー．コリＤＨ５α中に導入し、次いで、得られたプラスミドｐＳＭＡ342を、ラクトコッカスラクチスＭＧ1363中に導入した。プラスミドｐＳＭＡ343を以下の方法で構築した：ｐＳＭＡ212を、ClaIおよびSalIで消化し、スティッキーエンド（付着末端）を、クレノウポリメラーゼによって満たした。6.2kbフラグメント（ｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）からの3kbおよびラクトコッカス染色体からの3.2kb）を精製し、再結合させ、イー．コリＤＨ５α中に導入した。得られたプラスミドｐＳＭＡ214をX hoIおよびBamHIで消化し、3.2kbラクトコッカルフラグメントを、XhoIおよびBam HIで消化されたｐＡＫ80に結合させた。得られたプラスミドｐＳＭＡ343をイー．コリＤＨ５α中に導入し、次いでラクトコッカスラクチスＭＧ1363中に導入した。実施例８に記載したようなプラスミドｐＡＫ80：170（ＤＳＭ8500）を、以下ではｐＳＭＡ339と称す。プラスミドｐＳＭＡ340を以下の方法で構築した：ｐ170からの6.5kb ClaI−SalIラクトコッカルフラグメントのクローニングベクターpBluescript II KSへのクローニングは、実施例８に記載されている。実施例８においてpBluescript :170と呼ばれたこの構築物を、以下ではｐＳＭＡ201 と称す。ｐＳＭＡ201をNdeIおよび SalIで消化し、スティッキーエンドを満たすために、クレノウポリメラーゼで処理した。大きい7kbフラグメント（ｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）からの3kbおよびラクトコッカス染色体からの4kb）を精製し、再結合させ、イー．コリＤＨ５α中に導入した。得られたプラスミドを、ｐＳＭＡ202と称す。ｐＳＭＡ202をXhoIおよびBamHIで消化し、4kbラクトコッカルフラグメントを精製し、XhoIおよびBamHIで消化されたｐＡＫ80に結合させた。速鎖反応混合物をイー．コリＤＨ５α中に導入し、次いで得られたプラスミドｐＳＭＡ340を、ラクトコッカスラクチスＭＧ1363中に導入した。プラスミドｐＳＭＡ341を以下の方法で構築した：ｐＳＭＡ202をNdeIおよびBcoRIで消化し、スティッキーエンドを満たすために、クレノウポリメラーゼで処理した。大きい5.5kbフラグメント（ｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）からの3kbおよびラクトコッカス染色体からの2.5kb）を精製し、再結合させ、イー．コリＤＨ５α中に導入した。得られたプラスミドｐＳＭＡ208をXho IおよびBamHIで消化し、2.5kbラクトコッカルフラグメントを、XhoIおよびBamHI で消化されたｐＡＫ80に結合させた。得られたプラスミドｐＳＭＡ341をイー．コリＤＨ５α中に導入し、次いでラクトコッカスラクチスＭＧ1363中に導入した。（iii）ｐ170からの9.7kbフラグメントのサブフラグメントに関するプロモーター活性のラクトコッカスラクチスにおける評価クローン化されたラクトコッカルフラグメントのプロモーター活性を測定するためのプレート分析を、１μｇ／ｍｌのＥｍおよび160μｇ／ｍｌのX-galが補われたＧＭ17上に、それぞれプラスミドｐＳＭＡ399、ｐＳＭＡ340、ｐＳＭＡ341、ｐＳＭＡ342、ｐＳＭＡ343およびｐＳＭＡ344を含むラクトコッカスラクチスのオーバーナイト培養物をプレーティングすることによって行った。驚くべきことに、全培養物がこれらのプレート上で青く現れ、このことは、全プラスミド上に少なくとも１つの機能的なプロモーターが存在していることを示している。これらの結果から、少なくとも３つのプロモーターがｐ170からの9.7kbラクトコッカルフラグメント内に位置していることが明白である。それぞれｐＳＭＡ399、ｐＳＭＡ340、ｐＳＭＡ341、ｐＳＭＡ342、ｐＳＭＡ34 3およびｐＳＭＡ344を含むラクトコッカスラクチスＭＧ1363菌株を、各々ＧＭ 17プレートおよびArgM17プレート上にストリークした。両タイプのプレートは、１μｇ／ｍｌのＥｍと160μｇ／ｍｌのX-galを含んでいた。３つのプロモーターのなかで、ｐＨ調節プロモーターを同定するために、プレーティングを行った。これらの分析に基づいて、それぞれｐＳＭＡ399、ｐＳＭＡ340およびｐＳＭＡ34 4から生じるβ−ガラクトシダーゼ発現が、ｐＨ／アルギニンによって調節されることが見い出された。ｐＳＭＡ342から生じるβ−ガラクトシダーゼ発現は、ｐＨ／アルギニンによって弱く調節され、一方ｐＳＭＡ341およびｐＳＭＡ343からの発現は、これらの要因によって影響されなかった。その結果は、β−ガラクトシダーゼリポーター遺伝子に近位の4kbClaI−NdeI フラグメント上に位置するプロモーターが、ｐＨ調節されることを論証している。このプロモーターを、以下P170と称す。NdeI部位からEcoRI部位に延びる5.7kb ラクトコッカルフラグメントを含むプラスミドｐＳＭＡ342は、おそらく２つのプロモーターを含み、リポーター遺伝子に隣接して位置する一方も、ｐＨ調節されるように思われる。しかしながら、この調節は、上流に位置する3.2kbEcoRI−SalIフラグメントに依存するように思われる。この結諭は、3.2kb EcoRI−SalIフラグメントを欠くｐＳＭＡ341に保有されたプロモーターが、ｐＨ／アルギニンによって調節されないという観察に基づいている。それぞれｐＳＭＡ399、ｐＳＭＡ340、ｐＳＭＡ341、ｐＳＭＡ342、ｐＳＭＡ34 3およびｐＳＭＡ344を含む菌株ＭＧ1363のオーバーナイト培養物におけるβ−ガラクトシダーゼ発現の測定を、実施例７に記載したようにして行った。全培養物を、各々ＧＭ17培地およびArgM17培地で増殖させた。両培地は、１μｇ／ｍｌのＥｍが補われている。調節されたβ−ガラクトシダーゼ発現の対照として、組込み体170を実験に含めた。結果を表１３に示す。表１３ｐ170の9.7ＣｌａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントの欠失誘導体におけるβ −ガラクトシダーゼ発現ｐＳＭＡ399、ｐＳＭＡ340またはｐＳＭＡ344を含むラクトコッカスラクチスは、組込み体170と同じ調節されたβ−ガラクトシダーゼ発現を示す。このことは、プロモーターP170が、マルチコピープラスミド様ｐＡＫ80上に位置するときも調節されることを示している。対照的に、ｐＳＭＡ342に担持されたプロモーターは、調節発現を示さない。、ｐＳＭＡ343に保有されたプロモーターは、ｐＨまたはアルギニンによって調節される。この調節は、プレート分析で検出されなかった。このことは、プレートと液体培地での生育の違いによるのであろう。ｐＳＭＡ343に保有されたプロモーターで観察された調節は、P170の調節ほどきびしいものではない。p170の4kb ClaI−NdeIフラグメント上に位置したプロモーターP170の高精度マッピング p170の4kb ClaI−NdeIフラグメント上に位置したP170の高精度マッピングの前に、4kb ClaI−NdeIフラグメントのより詳細な制限地図を製造した（図１７）。 p170の4kb ClaI−NdeIエラクトコッカルフラグメントは、ｐＳＭＡ202に保有されている。ｐＳＭＡ202は、３つのHindIII部位を含み、そのなかの２つはラクトコッカルＤＮＡ内に位置し、１つはポリリンカー領域に位置している。ポリリンカーのHindIII部位からラクトコッカスＤＮＡのHindIII部位に延びる、1.3kb HindIIIフラグメントをｐＡＫ80中に挿入することにより、プラスミドｐＳＭＡ3 57が得られる。ｐＳＭＡ357における挿入物は、ラクトコッカスラクチスＭＧ1 363中に導入されたとき、プロモーター活性を含んでいなかった。 4kb ClaI−NdeIフラグメント上の2.3kb HindIIIフラグメントを、HindIIIで消化されたｐＡＫ80にクローン化した。得られたプラスミドｐＳＭＡ348をラクトコッカスラクチスＭＧ1363中に導入した。このプラスミドから、β−ガラクトシダーゼが発現され、このことは、このHindIIIフラグメント内の機能的なプロモーターの存在を例証している。1.5kb HincIIフラグメントをｐＡＫ80のSmaI部位に挿入し、得られたプラスミドｐＳＭＡ358を、ラクトコッカスラクチスＭＧ1363中に導入した。ｐＳＭＡ358から、β−ガラクトシダーゼが発現された。1 .5kb HincIIフラグメントは、1.3kb HindIIIフラグメントのほとんどをカバーし、隣接した2.3kb HindIIIフラグメントと400bpの重複を有している。プラスミドｐＳＭＡ348、ｐＳＭＡ357 およびｐＳＭＡ358における挿入物に関するプロモーター活性評価に基づいて、プロモーターP170を、組込み体170におけるTn917−LTV1挿入物の約1.3kb上流に位置する400bp HincII−HindIIIフラグメントに位置づけた。（iv）プロモーターPSBのマッピングＳＢの上流に位置したＤＮＡの配列決定から、共通プロモーターを190bp HpaI −ClaIフラグメント内に同定した｛実施例１２（ｉ）参照｝。pSBをHpaIおよびC laIで消化し、フラグメントを、HpaIおよびClaIで消化されたｐＮＺ336 （Simo ns et al.,1990）に結合させた。得られたプラスミドｐＮＺ336：ＳＢを、SalI およびBamHIで消化した。190bpフラグメントを、XhoIおよびBamHIで消化されたｐＡＫ80に結合させた。連鎖反応混合物を、イー．コリＤＨ５α中に導入した。次いで、得られたプラスミドｐＳＭＡ347を、ラクトコッカスラクチスＭＧ136 3中に導入した。菌株ＭＧ1363／ｐＳＭＡ347は、β−ガラクトシダーゼを発現し、このことは、190bpフラグメント上の機能的なプロモーターの存在を例証している。（ｖ）プロモーターを保有するｐＡＫ80誘導体を含有するラクトコッカスラクチスＭＧ1363の誘発および非誘発オーバーナイト培養物に関する測定表１４には、各々誘発および非誘発条件下で増殖させたオーバーナイト培養物に関するβ−ガラクトシダーゼ活性が与えられている。異なる増殖条件は、それぞれ温度の多様化と増殖培地のｐＨ／アルギニン濃度の多様化である。分析した菌株は、レスキュープラスミド（rescue plasmids）からのEcoRI−ClaIフラグメントを含むｐＡＫ80誘導体と、上記マッピング分析に基づいて、EcoRI−ClaIフラグメントの欠失を含むｐＡＫ80誘導体の両方を含んでいる。培養物の増殖並びにβ−ガラクトシダーゼの分析を、実施例１１に記載したようにして行った。この実施例では、5Arg1.5M17を5ArgM17と称す。表１４ａ誘導体および非誘発条件で増殖させたオーバーナイト培養物における β−ガラクトシダーゼ活性。アルギニンおよび／または培地ｐＨ（30℃）によって制御される発現。表１４ｂ誘発および非誘発条件で増殖されたオーバーナイト培養物におけるβ −ガラクシダーゼ活性。温度（Ｇ1.5Ｍ17培地）によって制御去れる発現。結果は、ｐＳＢからのプロモーターがｐＡＫ80に保有されるときｐＨ調節されないことを示している。この結果は、ｐＳＭＡ332およびｐＳＭＡ347の両方で見られる。ｐＳＢからのプロモーターの温度調節は、ｐＡＫ80上に位置するとき逆転される。ｐ162からのプロモーターは、ｐＡＫ80上に位置するとき、まだ調節される。しかしながら、プラスミド保有プロモーターからのβ−ガラクトシダーゼの全発現は、ｐＡＫ80の高いコピー数から予測されるほど高くない。P170のｐＨ調節は、上記されている。P170の温度調節は、ｐＡＫ80上に位置するとき、より小さい程度ではあるけれども保存される。ｐ143からのプロモーターは、ｐＡＫ80上に位置するとき調節される。しかしながら、この調節は、プロモーターが染色体に位置するとき観察される調節とは逆である。p143上のプロモーターの強さは、プラスミドに位置するとき劇的に増加する。p172上のプロモーターからのβ−ガラクトシダーゼ発現は、染色体に位置するとき温度によってわずかに影響される。この調節は、プロモーターがプラスミドに位置するとき非常に明白となる。結果は明らかに、染色体プロモーターの調節が、一般的に位置、即ちそれが染色体に位置するかまたはマルチコピー染色体外に位置するかどうかに依存することを論証している。プロモータークローニングベクターでのシヨットガンクローニングを含む従来のプロモータークローニング戦略が用いられたならば、調節に関する結果は、たいていの場合、直接的に染色体に位置するプロモーターに関する調節についての研究を含む上記戦略を用いて得られた結果と全く異なったであろうと予想される。実施例１４ラクトコッカスラクチス中で複製しないべクターｐＳＭＡ500の構築ラクトコッカスを含むいくつかの微生物に関して、非複製ベクターは、相同ＤＮＡを有するならば、染色体中に組込むことができることが示されている（Leen houts et al.,1989）。関連する組込みのメカニズムは、ベクターおよび染色体に含まれる相同ＤＮＡ間のシングルクロスオーバーイベント（single cross-ove r event）（キヤンベル様組込み）である。このキャンベル様組込みの結果は、染色体上のうりふたつの１セットの相同ＤＮＡであり、うりふたつの１セットの相同ＤＮＡ間に、非複製ベクターは位置する。 Tn917挿入物とは対照的に、このキャンベル様組込みは、適当な組込み可能なベクターが用いられるならば、非分解挿入となる。非複製ベクターｐＳＭＡ500を、エリスロマイシン耐性マーカーと、リポーター遺伝子としてロイコノストックメセンテロイデス亜種クレモリス由来のプロモーターレスβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を担持するイー．コリプラスミドｐＶＡ891（Macrina et al.,1983）に基づいて構築した。ポリリンカーとプラスミドｐＡＫ80からのプロモーターレスβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、乳酸菌中で複製することができないプラスミドｐＶＡ891中にクローン化した。ｐＡＫ80をHindIIIおよびSalIで消化した。ポリリンカーとβ− ガラクトシダーゼ遺伝子を含む4.1kbフラグメントを精製し、HindIIIおよびSalI で消化されたｐＶＡ891に結合させた。連鎖反応混合物を、エリスロマイシン耐性（Ｅｍ^r）（250μｇ／ｍｌ）を選択するイー．コリＭＣ1000中に導入した。得られたプラスミドをｐＳＭＡ500と称した。このベクターは、乳酸菌中で複製することができない。しかしながら、そのプラスミドが細菌の染色体中に挿入されるならば、エリスロマイシン耐性遺伝子が、ほとんどの乳酸菌で発現される。機能的なプロモーターがｐＳＭＡ500のポリリンカー中にクローン化されるとき、宿主細菌は、付加的にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現するであろう。実施例１５調節プロモーターのｐＳＭＡ500中への挿入およびラクトコッカス染色体中への組込み（ｉ）プロモーターのｐＳＭＡ500中への挿入 p170およびｐＳＢからのプロモーターの調節は、実施例８に記載されている。この実施例では、調節プロモーターP170を含むp170からのラクトコッカスＤＮＡを、ｐＳＭＡ500中に挿入し、次いでこの構築時をラクトコッカスラクチスＭＧ1363の染色体中に組込んだ。同時に、調節プロモーターＰＳＢを含むｐＳＢからのラクトコッカスＤＮＡを、ｐＳＭＡ500中に挿入し、次いでこの構築物をラクトコッカスラクチスＭＧ1614の染色体中に組込んだ。この実験は、キャンベル様組込みを通して染色体中に挿入された調節可能なプロモーターとβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が、なおβ−ガラクトシダーゼの調節発現を示すかどうか試験するために行われた。（ii）組込み可能ベクターｐＳＭＡ501およびＤＳＭＡ502の構築実施例１３に記載のｐＳＭＡ212は、9.7kb XhoI−BamHIフラグメントを含んでいる。このフラグメントは、調節プロモーターP170を保有するp170の9.7kbラクトコッカスＤＮＡセグメントと本質的に同じである。ｐＳＭＡ212からの9.7kbフラグメントをXhoIおよびBamHIで消化されたｐＳＭＡ500中にクローン化した。得られたプラスミドｐＳＭＡ501をイー．コリＭＣ1000中に導入し、形質転換細胞を、Ｅｍ^r（250μｇ／ｍｌ）に関して選択した。同時に、調節プロモーターＰＳＢを保有するｐＧＥＭ：ＳＢ（実施例８参照）からの1.8kb XhoI−BamHIラクトコッカスＤＮＡフラグメントを、ｐＳＭＡ500中にクローン化した。得られたプラスミドｐＳＭＡ502をイー．コリＭＣ1000中に導入し、形質転換細胞を、Ｅｍ^r（250μｇ／ｍｌ）に関して選択した。標準ＤＮＡ操作および形質転換は、Maniatis et al.,1982に従った。（iii）ｐＳＭＡ501およびｐＳＭＡ502のラクトコッカス染色体中への組込み約２μｇのｐＳＭＡ501のキアゲン（Qiagen）（Qiagen PlasmidKit,Diagen,Du sseldorf,Germany）精製ＤＮＡをラクトコッカスラクチスＭＧ1363中に導入した。同時に、約２μｇのｐＳＭＡ502のキアゲン精製ＤＮＡをラクトコッカスラクチスＭＧ1614中に導入した。ラクトコッカスラクチスの形質転換は、実施例１に記載のとおりであった。形質転換細胞を、１μｇ／ｍｌのＥｍと１６０μｇ／ｍｌのX-galを含むＳＧＭ17プレート上にプレーティングした。30℃で48時間増殖させた後、青色の形質転換細胞のみが両方の同時セットのプレート上に現れた。これらの結果は、ｐＳＭＡ501が菌株ＭＧ1363の染色体中に組込まれたこと、およびｐＳＭＡ502が菌株ＭＧ1614の染色体中に組込まれたことを示した。また、その結果は、各々ｐＳＭＡ501およびｐＳＭＡ502上のプロモーターが、染色体中に組込まれたとき機能的であることを示した。約5000コロニー形成単位（ＣＦＵ）／μｇＤＮＡがｐＳＭＡ501構築物を用いて得られ、約500ＣＦＵ／μｇＤＮＡがｐＳＭＡ502を用いて得られた。複製プラスミドｐＡＫ80を用いて、形質転換効率は、両方の菌株で１×10ＥＥ7ＣＦＵ／μｇであった。菌株ＭＧ1363および菌株ＭＧ1614のｐＳＭＡ500での形質転換は、５ＣＦＵ／μｇＤＮＡより低く、このことから、ｐＳＭＡ501およびｐＳＭＡ502の組込みが、これらのベクター上の染色体ラクトコッカス挿入物によって媒介されることが明らかに論証された。それぞれの同時セットのプレートからの10の初代のランダムに採取された形質転換細胞を、１μｇ／ｍｌのＥｍと160μｇ／ｍｌのX-galを含むＧＭ17プレート上にストリークした。このストリーク後に現れる全コロニーは、均一でかつ青色であった。形質転換細胞からのプラスミドＤＮＡ抽出は、細菌細胞中に染色体外的に検出可能なプラスミドＤＮＡがないことを示した。このことは、プラスミドｐＳＭＡ501およびｐＳＭＡ502が、受容株の染色体中に組込まれたことを強く示した。図１８は、非複製プラスミドのキャンベル様組込み（Campbell-like integration）を例証している。組込まれたプラスミドの安定性を研究するために、両タイプの組込み体を、約 20世代の間Ｅｍ選択なしで増殖させた。得られた培養物の適槻な希釈物を、X-ga lを含むＭＧ17プレート上にプレーティングし、次いで選択プレートＧＭ17＋X-g al＋１μｇ／ｍｌエリスロマイシンに複製した。このプレート分析では、β−ガラクトシダーゼ活性の損失は検出されず、Ｅｍ耐性が検出された。（iv）染色体上に組込み可能なベクターを保有するラクトコッカス菌株に関する調節されたＢ−ガラクトシダーゼ発現の分折 β−ガラクトシダーゼの発現が、染色体に組込まれたｐＳＭＡ501を保有する菌株ＭＧ1363（菌株ＭＧ1363：：ｐＳＭＡ501）および染色体に組込まれたｐＳＭＡ502を保有する菌株ＭＧ1614（菌株ＭＧ1614：：ｐＳＭＡ502）において調節されるかどうか分析するために、以下の実験を行った。６つのランダムに採取された菌株ＭＧ1363：：ｐＳＭＡ501の再単離物を、ＧＭ17プレート上（1.2×Ｍ17寒天および0.5％グルコース）およびArgM17プレート（1.2×Ｍ17寒天、0.1％グルコースおよび0.1％アルギニン）上にストリークした。両タイプのプレートは、１μｇ／ｍｌのＥｍと160μｇ／ｍｌのX-galを含んでいた。単離物番号6、9、10、14および21は全て、ＧＭ17プレート上で青色であり、ArgM17プレート上で白色であった。この結果は、これらの単離物におけるβ −ガラクトシダーゼ発現が、組込み体170（実施例７参照）におけるように、なおｐＨ依存様式で調節されることを示している。単離物番号３は、ＧＭ17プレート上で青色であり、ArgM17プレート上で淡青色であった。両タイプのプレート上でのこの単離物のより高レベルのβ−ガラクトシダーゼ発現は、おそらく、染色体中への組込み可能なベクターの数コピーの組込みの結果か、または縦一列に並んでいない（non-tandem）反復染色体ＤＮＡ配列の増幅の結果である。８つのランダムに採取された菌株ＭＧ1614：：ｐＳＭＡ502の再単離物を、ＧＭ17プレート上およびArgM17プレート上にストリークした。両タイプのプレートは、１μｇ／ｍｌのＥｍと160μｇ／ｍｌのX-galを含んでいた。菌株ＭＧ1614：：ｐＳＭＡ502の全単離物、即ち単離物番号7、8、10、13、14、17、18および22 は全て、ＧＭ17プレート上で青色であり、ArgM17プレート上でわずかにより青色であった。この結果は、菌株ＭＧ1614：：ｐＳＭＡ502における少なくともあるレベルのｐＨ依存β−ガラクトシダーゼ発現を示している。しかしながら、このプレート分析では、β−ガラクトシダーゼ発現のレべル、従って菌株ＭＧ1614：：ｐＳＭＡ502と組込み体ＳＢにおける調節の強さを比較することはできない。実施例７および１１では、0.5％グルコースが補われた1.5×Ｍ17および0.1％グルコースと0.1％アルギニンが補われた1.5×Ｍ17からなる培地は、それぞれＧ 1.5Ｍ17およびArg1.5M17と言及された。以下では、これらの培地を、それぞれＧＭ17およびArgM17と称す。β−ガラクトシダーゼの活性を、それぞれＧＭ17培地（増殖後のｐＨ5.6）およびArgM17培地（増殖後のｐＨ6.7）で30℃17〜18時間増殖させた培養物で測定した。ＧＭ17培地およびArgM17培地の両方とも、１μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含んでいた。菌株ＭＧ1363：：ｐＳＭＡ501の３つの再単離物および菌株ＭＧ1614：：ｐＳＭＡ502の２つの再単離物（reisolates）を、それぞれβ−ガラクトシダーゼ活性に関して分析した。調節されたβ−ガラクトシダーゼ発現の対照として、それぞれ組込み体170およびＳＢを実験に含めた。結果を以下の表１５ａおよび１５ｂに示す。表１５ａｍｇ1316：：ｐＳＭＡ501のβ−ガラクトシダーゼ活性表１５ａｍｇ1614：：ｐＳＭＡ502のβ−ガラクトシダーゼ活性 β−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現が菌株ＭＧ1363：：ｐＳＭＡ501の全３つの単離物で調節されることが、明らかに論証される。各々の単離物における調節は、組込み体170で観察される調節と同様である。 β−ガラクトシダーゼ活性レベルの違いは、おそらく、染色体上のｐＳＭＡ501のコピー数の違いによる。しかしながら、表１５ｂに示された結果から、ＭＧ1614：：ｐＳＭＡ502の２つの単離物において調節もしくは非調節β−ガラクトシダーゼ発現があるかどうか結論づけることは困難である。実施例１６ｐＴＶ32およびｐＬＴＶ１でのラクトバシラスヘルベティクス（Lactobacillu s helvｅticus）の形質転換転位ベクターｐＴＶ32およびｐＬＴＶ１の各々を、Bhowmik et al.,1993によって記載された方法に従って、ラクトバシラスヘルベティクスＣＮＲＺ32中に電気さく孔（electroporated）した。宿主にＣｍ耐性を付与するベクタ−ｐＮＺ18（ＮＩＺＯ，ＢＡＥｄｅ，オランダ）も、形質転換効率の対照として菌株ＣＮＲＺ32中に導入した。エレクトロポレーション後、形質転換した細胞を、10ｍＭＣａＣｌ₂と形質転換に用いたベクターに依存する抗生物質を含むＭＲＳ寒天（Oxoid）上にプレーティングした。形質転換細胞の選択に用いた抗生物質とその濃度は、以下の表１６に与えられている。表１６には、形質転換からの結果も与えられている。表中の空白スペースは、この実験が行われなかったことを示す。表１６ラクトバシラスヘルベティクスＣＮＲＺ32中へのｐＴＶ32およびｐＬＴＶ1の形質転換 10のｐＴＶ32形質転換細胞と10のｐＬＴＶ１形質転換細胞を、10μｇ／ｍｌのＥｍを含むＭＲＳ寒天上にストリークした。20の形質転換細胞の各々からの再単離したコロニーを、５μｇ／ｍｌのＥｍを含むＭＲＳ肉汁（Oxoid）に接種し、O 'Sullivan et al.,1993に従って、プラスミド抽出を行った。プラスミド抽出調製物を、EcoRIで消化し、次いでアガロースゲル電気泳動分析に付した。プラスミドＤＮＡは、これらのプラスミド抽出物のいずれにおいても検出されなかった。上記表から、プラスミドＤＮＡのμｇ当たり、それぞれエリスロマイシン耐性を発現する130および140の形質転換細胞が得られたことが明らかであるので、エリスロマイシン耐性を発現する試験された形質転換細胞のいずれにおいてもプラスミドＤＮＡが検出されなかったという事実から導き出せる唯一の結論は、形質転換細胞中に導入されたＤＮＡが、ラクトバシラスヘルベティクスの染色体に組込まれたということである。従って、上記結果は、上記Tn917誘導体が、この発明に従ってラクトバシラス種においても用いることができるという強い指示を提供する。参考文献寄託された微生物に関する表示（PCT Rule 12bis）追加のシート明細書の129頁に示した微生物に加えて、以下の微生物が、DSM-Deutsche Sammlu ng von Mikroorganismen und CellkulturenGmbH,Mascheroder Weg 1b,D-38124 B raunschweig,Germanyに、以下に記載の日および受託番号で寄託されている。上記寄託された全微生物に関して、以下の追加の表示を与える。各々の指定国の各々の特許庁に関して、出願人は、上記寄託された微生物のサンプルを、特許が許可される日または出願が拒絶もしくは取り下げもしくは取り下げとみなされた日まで、要求者によって指名された専門家に対して入手可能にすることを要求する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年２月２０日【補正内容】請求の範囲１．（ｉ）（ａ）プロモータープローブ遺伝子としてブロモーターレス構造遺伝子からなる転位因子、（ｂ）検出可能な選択マーカー遺伝子、および（ｃ）乳酸菌中で機能的である複製起点からなる乳酸菌中で複製するＤＮＡ分子を選択し、（ii）そのＤＮＡ分子を乳酸菌の集団に導入し、その集団を転位因子の転位を起こさせる条件下に置き、（iii）プロモーターレス遺伝子が発現される乳酸菌集団の細胞を選択し、（iv）その細胞をクローニングし、そのクローンから、原プロモーターレス遺伝子に作動的に結合した乳酸菌プロモーターからなるＤＮＡフラグメントを単離する工程からなる、プロモーターからなる乳酸菌ＤＮＡフラグメントの単離方法。２．工程（iv）において単離されるＤＮＡフラグメントから、さらにプロモーターからなる乳酸菌ＤＮＡサブフラグメントを単離する請求項１記載の方法。３．転位因子が、少なくとも擬似ランダムに乳酸菌レプリコン中に組込まれるようになるものである請求項１記載の方法。４．乳酸菌レプリコンが、染色体である請求項３記載の方法。５．転位因子が、トランスポゾンTn917である請求項１記載の方法。６．工程（ｉ）のＤＮＡ分子が、ｐＴＶプラスミドである請求項１記載の方法。７．ＤＮＡ分子が、ｐＴＶ32およびｐＬＴＶ１から選択される請求項６記載の方法。８．プロモーターレス構造遺伝子が、抗生物質耐性を与える遺伝子産物をコードする遺伝子、栄養要求性欠失を補足する遺伝子産物をコードする遺伝子および検出可能な最終産物を有する酵素をコードする遺伝子から選択される請求項１記載の方法。９．プロモーターレス構造遺伝子が、β−ガラクトシダーゼをエンコードする遺伝子である請求項８記載の方法。 10．ＤＮＡ分子が導入される乳酸菌の集団が、ラクトコッカス種、ストレプトコッカス種、ラクトバシラス種、ロイコノストック種、ペデイオコッカス種、ブレビバクテリウム種、プロピオニバクテリウム種およびビフィドバクテリウム種から選択される請求項１記載の方法。 11．集団が、ラクトコッカスラクチスから選択される乳酸菌である請求項10記載の方法。 12．乳酸菌が、菌株ＭＧ1614およびＭＧ1363から選択されるラクトコッカスラクチス亜種ラクチス菌株である請求項11記載の方法。 13．単離プロモーターが、調節可能なプロモーターである請求項１記載の方法。 14．単離調節可能プロモーターが、ｐＨ、生育温度、熱ショック遺伝子の発現を引き出す温度シフト、イオン強度／ＮａＣｌ含量を含む増殖培地組成およびプリンヌクレオチド前駆体の存在／欠如、およびプロモーターからなるＤＮＡ分子が導入されている乳酸菌の発育相／成長速度から選択される因子によって調節可能である請求項13記載の方法。 15．（ｉ）請求項１の方法に従って、調節可能な乳酸菌プロモーターからなるＤＮＡフラグメントを単離し、（ii）そのプロモーターからなる単離したフラグメントを、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子の上流で乳酸菌中に挿入し、それによって挿入したプロモーターを前記遺伝子と作動的に結合させる工程からなる組換え乳酸菌の構築方法。 16．（ｉ）請求項１の方法に従って、調節可能な乳酸菌プロモーターからなるＤＮＡフラグメントを単離し、（ii）所望の遺伝子産物をコードする遺伝子を乳酸菌中に挿入し、（iii）プロモーターからなる単離したフラグメントを、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子の上流で工程（ii）から得られる乳酸菌中に挿入し、それによって挿入したプロモーターを前記遺伝子と作動的に結合させる工程からなる組換え乳酸菌の構築方法。 17．所望の遺伝子産物をコードする挿入遺伝子が、異種遺伝子である請求項16記載の方法。 18．挿入遺伝子が、乳酸菌由来のものである請求項16記載の方法。 19．所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が、プロモーターからなる単離フラグメントと同じＤＮＡフラグメント上に挿入される請求項16記載の方法。 20．プロモーターからなる単離フラグメントが、乳酸菌の染色体中に挿入される請求項15または16記載の方法。 21．プロモーターからなる単離フラグメントが、染色体外的に挿入される請求項 15または16記載の方法。 22．プロモーターからなる単離フラグメントが、さらなるＤＮＡフラグメントからなり、それによって単離プロモーターが、プロモーターの組換え除去、プロモーター機能に実際的に必要とされる物質をコードする遺伝子の組換え除去、およびプロモーターの機能を阻害する調節ＤＮＡフラグメントの組換え除去から選択される確率事象によって調節されるようになる請求項15または16記載の方法。 23．さらなるフラグメントが、プロモーターの機能を阻害する調節配列を組換え除去するものである請求項22記載の方法。 24．（ｉ）（ａ）プロモータープローブ遺伝子としてプロモーターレス構造遺伝子からなる転位因子、（ｂ）検出可能な選択マーカー遺伝子、および（ｃ）乳酸菌中で機能的である複製起点からなる乳酸菌中で複製するＤＮＡ分子を選択し、（ii）転位因子の転位を起こさせる条件下で、工程（ｉ）のＤＮＡ分子を乳酸菌の集団中に導入し、（iii）プロモーターレス構造遺伝子が、乳酸菌細胞の天然の調節可能なプロモーターに作動的に結合した結果として調節可能に発現されている乳酸菌集団の細胞を選択し、（iv）工程（iii）の乳酸菌細胞のレプリコンにおける、転位因子の組込みが可能な部位を同定し、（ｖ）工程（iv）で同定したレプリコンの部位または機能的に同等の部位で、乳酸菌集団の非組込み細胞中に、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子を挿入し、それによってその遺伝子を前記天然の乳酸菌プロモーターに作動的に結合させる工程からなり、ここで挿入した遺伝子の発現が、その天然のプロモーターに作動的に結合したときの遺伝子の発現と比較すると変化している組換え乳酸菌の構築方法。 25．所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が、異種遺伝子である請求項24記載の方法。 26．遺伝子が、乳酸菌由来のものである請求項25記載の方法。 27．工程（ｉ）のＤＮＡ分子が、乳酸菌の染色体中に転位する請求項24記載の方法。 28．工程（ｉ）のＤＮＡ分子が、染色体外レプリコン中に転位する請求項24記載の方法。 29．所望の遺伝子産物をコードする遺伝子と、それらに作動的に結合された、その遺伝子に天然では関連していない乳酸菌種に由来する調節プロモーターからなり、前記プロモーターの存在によって、その遺伝子の発現が、その天然のプロモーターに作動的に結合したときの遺伝子の発現に比べると変化されている組換え乳酸菌。 30．所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が、天然で発現されるレベルとは少なくとも10％異なるレベルで発現される請求項29記載の細菌。 31．所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が、天然で発現されるレベルとは少なくとも25％異なるレベルで発現される請求項30記載の細菌。 32．所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が、染色体遺伝子である請求項29記載の細菌。 33．所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が、染色体外遺伝子である請求項29記載の細菌。 34．所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が、天然の遺伝子である請求項29記載の細菌。 35．所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が、異種遺伝子である請求項29記載の細菌。 36．異種遺伝子でが、乳酸菌由来のものである請求項35記載の細菌。 37．所望の遺伝子産物をコードする遺伝子と天然では関連していないプロモーターが、ｐＨ、生育温度、熱シヨック遺伝子の発現を引き出す温度シフト、イオン強度／ＮａＣｌ含量を含む増殖培地組成およびプリンヌクレオチド前駆体の存在／欠如、および細菌の発育相／成長速度から選択される因子によって調節可能である請求項29記載の細菌。 38．さらなるＤＮＡ配列からなり、それによってプロモーターが確率事象により調節されるようになる請求項29記載の細菌。 39．さらなる配列が、プロモーターの機能を阻害する調節配列を組換え除去するものである請求項38記載の細菌。 40．プロモーターが、ランナウェイ挙動を有するプラスミド上に位置する請求項 29記載の細菌。 41．ラクトコッカス種、ストレプトコッカス種、ラクトバシラス種、ロイコノストック種、ペディオコッカス種、ブレビバクテリウム種、プロピオニバクテリウム種およびビフィドバクテリウム種から選択されるものである請求項29記載の細菌。 42．プロモーターが、ラクトコッカス種、ストレプトコッカス種、ラクトバシラス種、ロイコノストック種、ペディオコッカス種、ブレビバクテリウム種、ブロピオニバクテリウム種およびビフィドバクテリウム種由来のものである請求項32 記載の細菌。 43．プロモーターが、ラクトコッカスラクチス由来のものである請求項42記載の細菌。 44．プロモーターが、菌株ＭＧ1614および菌株ＭＧ1363から単離されるプロモーターから選択されるプロモーターである請求項43記載の細菌。 45．所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が、レプリコンに存在するプロモーターの制御下にあるレプリコンの部位に挿入され、その部位は、プロモーターレス構造遺伝子からなる転位因子を用いてプロモーターレス構造遺伝子を挿入しそれによって原プロモーターレス遺伝子がレプリコンに存在するプロモーターに作動的に結合されることにより発現可能になることによって同定可能であり、前記遺伝子の前記部位での挿入により、前記遺伝子がレプリコンに存在するプロモーターに作動的に結合されるようになる請求項29記載の細菌。 46．挿入遺伝子が、乳酸菌由来のものである請求項45記載の細菌。 47．遺伝子が、乳酸菌の染色体中に挿入される請求項45記載の細菌。 48．遺伝子が、染色体外レプリコン中に挿入される請求項45記載の細菌。 49．挿入遺伝子が、相同遺伝子である請求項45記載の細菌。 50．挿入遺伝子が、異種遺伝子である請求項45記載の細菌。 51．挿入異種遺伝子が、乳酸菌由来のものである請求項50記載の細菌。 52．所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が、リパーゼをコードする遺伝子、ペプチダーゼをコードする遺伝子、プロテアーゼをコードする遺伝子、炭水化物代謝に関連した遺伝子産物をコードする遺伝子、クエン酸代謝に関連した遺伝子産物をコードする遺伝子、プリン代謝に関連した遺伝子産物をコードする遺伝子、バクテリオフアージ耐性に関連した遺伝子産物をコードする遺伝子、溶菌酵素をコードする遺伝子およびバクテリオシンをコードする遺伝子から選択される請求項29または45記載の細菌。 53．所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が、ロイコノストック種の lacL遺伝子、ロイコノストック種のlacM遺伝子およびリジンアミノペプチターゼをコードするラクトコッカスラクチス亜種ラクチス遺伝子から選択される請求項52記載の細菌。 54．乳酸菌中で機能的である乳酸菌種由来の調節プロモーターと、それらに作動的に結合された所望の遺伝子産物をコードする遺伝子からなり、前記プロモーターが、前記遺伝子と天然では関連していないものである単離ＤＮＡフラグメント。 55．さらに少なくとも１つの転写ターミネーターからなる請求項54記載のＤＮＡフラグメント。 56．100〜10000塩基対の範囲内のサイズを有するＤＮＡフラグメントである請求項54記載のＤＮＡフラグメント。 57．200〜5000塩基対の範囲のサイズを有するフラグメントである請求項56記載のＤＮＡフラグメント。 58．さらに、プロモーターの調節に関連した遺伝子産物をコードする配列からなる請求項54記載のＤＮＡフラグメント。 59．所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が、リパーゼをコードする遺伝子、ペプチダーゼをコードする遺伝子、プロテアーゼをコードする遺伝子、炭水化物代謝に関連した遺伝子産物をコードする遺伝子、クエン酸代謝に関連した遺伝子産物をコードする遺伝子、プリン代謝に関連した遺伝子産物をコードする遺伝子、バクテリオファージ耐性に関連した遺伝子産物をコードする遺伝子、溶菌酵素をコードする遺伝子およびバクテリオシンをコードする遺伝子から選択される請求項54記載のＤＮＡフラグメント。 60．所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が、異種遺伝子である請求項54記載のＤＮＡフラグメント。 61．遺伝子が、乳酸菌に由来する遺伝子である請求項54記載のＤＮＡフラグメント。 62．所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が、ロイコノストック種のlacL遺伝子、ロイコノストック種のlacM遺伝子およびリジンアミノペプチターゼをコードするラクトコッカスラクチス亜種ラクチス遺伝子から選択されるものである請求項61記載のＤＮＡフラグメント。 63．乳酸菌プロモーターが、受託番号ＤＳＭ 7360として寄託されたラクトコッカスラクチス亜種ラクチスＭＧ1363組込み体クローンP139-170に作動的に結合した調節プロモーターである請求項54記載のＤＮＡフラグメント。 64．乳酸菌プロモーターが、受託番号ＤＳＭ 7361として寄託されたラクトコッカスラクチス亜種ラクチスＭＧ1614組込み体クローン63ｂに作動的に結合したプロモーターである請求項54記載のＤＮＡフラグメント。 65．食品製造における請求項29に定義の組換え乳酸菌の用途。 66．動物飼料の保存における請求項29に定義の組換え乳酸菌の用途。 67．原生物的に活性な組成物の製造における請求項29に定義の組換え乳酸菌の用途。 68．調節プロモーターが、乳酸菌のｔＲＮＡプロモーター、ｒＲＮＡプロモーター、purDプロモーターおよびモティーフＡＧＴＴからなるプロモーターから選択されるプロモーターである請求項29記載の細菌。 69．調節プロモーターが、所望の遺伝子産物をコードするプロモーターレス遺伝子、細菌中で機能的であるθ複製乳酸菌レプリコン、ＤＮＡ配列を所望の遺伝子産物をコードする遺伝子がプロモーターに作動的に結合されて遺伝子が転写されるように挿入させる挿入部位からなるベクターに挿入されている請求項29記載の細菌。 70．ベクターが、受託番号ＤＳＭ8496として寄託されたプラスミドｐＡＫ80である請求項69記載の細菌。 71．（ｉ）所望の遺伝子産物をコードするプロモーターレス遺伝子からなるベクター、（ii）乳酸菌中で機能的であるθ複製乳酸菌レプリコンおよび（iii）ＤＮＡ配列を挿入させる挿入部位からなり、その挿入部位に乳酸菌種由来の調簡プロモーターからなるＤＮＡ配列が挿入されており、その挿入によって所望の遺伝子産物をコードする遺伝子がプロモーターに作動的に結合されてその遺伝子が転写されるようになる組換えプラスミド。 72．ベクターが、ｐＡＫ80である請求項71記載のプラスミド。 73．挿入されている調節プロモーターが、乳酸菌のｔＲＮＡプロモーター、ｒＲＮＡプロモーター、purＤプロモーター、およびモティーフＡＧＴＴからなるプロモーターから選択される強力なプロモーターである請求項71記載のプラスミド。【手続補正書】【提出日】１９９５年６月２７日【補正内容】補正の内容１．明細書第９８頁のＤＮＡ配列の左側の塩基番号「７５１」、「８０１」、「８５１」、「９０１」、「９５１」、「１００１」、「１０５１」及び「１１０１」を、それぞれ『７０１』、『７５１』、『８０１』、『８５１』、『９０１』、『９５１』、『１００１』及び『１０５１』に補正する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:21） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01）Ｃ１２Ｒ 1:21） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＫ，ＦＩ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ハンセン，エゴン，ベクデンマーク、ディケィ―2700 ブロンショイ、ダルバンゲン 22 (72)発明者ヨハンセン，エリックデンマーク、ディケィ―2970 ホルショルム、ゴゲバング８ (72)発明者マドセン，ショレン，ミカエルデンマーク、ディケィ―2100 コペンハーゲンファイ、アルボルガード 32、５ (72)発明者ニルソン，ダンデンマーク、ディケィ―2100 コペンハーゲンファイ、ヘルムスガード７、３ (72)発明者ブラング，アストリドデンマーク、ディケィ―2800 リングビィ、ラングスヘグネト 76

Claims

【特許請求の範囲】１．（ｉ）（ａ）プロモータープローブ遺伝子としてプロモーターレス構造遺伝子からなる転位因子、（ｂ）検出可能な選択マーカー遺伝子、および（ｃ）乳酸菌中で機能的である複製起点からなる乳酸菌中で複製するＤＮＡ分子を選択し、（ii）そのＤＮＡ分子を乳酸菌の集団に導入し、その集団を転位因子の転位を起こさせる条件下に置き、（iii）プロモーターレス遺伝子が発現される乳酸菌集団の細胞を選択し、（iv）その細胞をクローニングし、そのクローンから、原プロモーターレス遺伝子に作動的に結合した乳酸菌プロモーターからなるＤＮＡフラグメントを単離する工程からなる、プロモーターからなる乳酸菌ＤＮＡフラグメントの単離方法。２．工程（iv）において単離されるＤＮＡフラグメントから、さらにプロモーターからなる乳酸菌ＤＮＡサブフラグメントを単離する請求項１記載の方法。３．転位因子が、少なくとも擬似ランダムに乳酸菌レプリコン中に組込まれるようになるものである請求項１記載の方法。４．乳酸菌レプリコンが、染色体である請求項３記載の方法。５．転位因子が、トランスポゾンＴｎ917である請求項１記載の方法。６．工程（ｉ）のＤＮＡ分子が、ｐＴＶプラスミドである請求項１記載の方法。７．ＤＮＡ分子が、ｐＴＶ32およびｐＬＴＶ1から選択される請求項６記載の方法。８．プロモーターレス構造遺伝子が、抗生物質耐性を与える遺伝子産物をコードする遺伝子、栄養要求性欠失を補足する遺伝子産物をコードする遺伝子および検出可能な最終産物を有する酵素をコードする遺伝子から選択される請求項１記載の方法。９．プロモーターレス構造遺伝子が、β−ガラクトシダーゼをエンコードする遺伝子である請求項８記載の方法。 10．ＤＮＡ分子が導入される乳酸菌の集団が、ラクトコッカス種、ストレプトコッカス種、ラクトバシラス種、ロイコノストック種、ペディオコッカス種、ブレビバクテリウム種、プロピオニバクテリウム種およびビフィドバクテリウム種から選択される請求項１記載の方法。 11．集団が、ラクトコッカスラクチスから選択される乳酸菌である請求項10記載の方法。 12．乳酸菌が、菌株ＭＧ1614およびＭＧ1363から選択されるラクトコツカスラクチス亜種ラクチス菌株である請求項11記載の方法。 13．単離プロモーターが、調節可能なプロモーターである請求項１記載の方法。 14．単離調節可能プロモーターが、ｐＨ、生育温度、熱ショック遺伝子の発現を引き出す温度シフト、イオン強度／ＮａＣｌ含量を含む増殖培地組成およびプリンヌクレオチド前駆体の存在／欠如、およびプロモーターからなるＤＮＡ分子が導入されている乳酸菌の発育相／成長速度から選択される因子によって調節可能である請求項13記載の方法。 15．（ｉ）請求項１の方法に従って、調節可能な乳酸菌プロモーターからなるＤＮＡフラグメントを単離し、（ii）そのプロモーターからなる単離したフラグメントを、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子の上流で乳酸菌中に挿入し、それによって挿入したプロモーターを前記遺伝子と作動的に結合させる工程からなる組換え乳酸菌の構築方法。 16．（ｉ）請求項１の方法に従って、調節可能な乳酸菌プロモーターからなるＤＮＡフラグメントを単離し、（ii）所望の遺伝子産物をコードする遺伝子を乳酸菌中に挿入し、（iii）プロモーターからなる単離したフラグメントを、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子の上流で工程（ii）から得られる乳酸菌中に挿入し、それによって挿入したプロモーターを前記遺伝子と作動的に結合させる工程からなる組換え乳酸菌の構築方法。 17．所望の遺伝子産物をコードする挿入遺伝子が、異種遺伝子である請求項16記載の方法。 18．挿入遺伝子が、乳酸菌由来のものである請求項16記載の方法。 19．所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が、プロモーターからなる単離フラグメントと同じＤＮＡフラグメント上に挿入される請求項16記載の方法。 20．プロモーターからなる単離フラグメントが、乳酸菌の染色体中に挿入される請求項15または16記載の方法。 21．プロモーターからなる単離フラグメントが、染色体外的に挿入される請求項 15または16載の方法。 22．プロモーターからなる単離フラグメントが、さらなるＤＮＡフラグメントからなり、それによって単離プロモーターが、プロモーターの組換え除去、プロモーター機能に実際的に必要とされる物質をコードする遺伝子の組換え除去、およびプロモーターの機能を阻害する調節ＤＮＡフラグメントの組換え除去から選択される確率事象によって調節されるようになる請求項15または16記載の方法。 23．さらなるフラグメントが、プロモーターの機能を阻害する調節配列を組換え除去するものである請求項22記載の方法。 24．（ｉ）（ａ）プロモータープローブ遺伝子としてプロモーターレス構造遺伝子からなる転位因子、（ｂ）検出可能な選択マーカー遺伝子、および（ｃ）乳酸菌中で機能的である複製起点からなる乳酸菌中で複製するＤＮＡ分子を選択し、（ii）転位因子の転位を起こさせる条件下で、工程（ｉ）のＤＮＡ分子を乳酸菌の集団中に導入し、（iii）プロモーターレス構造遺伝子が、乳酸菌細胞の天然の調節可能なプロモーターに作動的に結合した結果として調節可能に発現されている乳酸菌集団の細胞を選択し、（iv）工程（iii）の乳酸菌細胞のレプリコンにおける、転位因子の組込みが可能な部位を同定し、（ｖ）工程（iv）で同定したレプリコンの部位または機能的に同等の部位で、乳酸菌集団の非組込み細胞中に、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子を挿入し、それによってその遺伝子を前記天然の乳酸菌プロモーターに作動的に結合させる工程からなり、ここで挿入した遺伝子の発現が、その天然のプロモーターに作動的に結合したときの遺伝子の発現と比較すると変化している組換え乳酸菌の構築方法。 25．所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が、異種遺伝子である請求項24記載の方法。 26．遺伝子が、乳酸菌由来のものである請求項25記載の方法。 27．工程（ｉ）のＤＮＡ分子が、乳酸菌の染色体中に転位する請求項24記載の方法。 28．工程（ｉ）のＤＮＡ分子が、染色体外レプリコン中に転位する請求項24記載の方法。 29．所望の遺伝子産物をコードする遺伝子と、それらに作動的に結合された、その遺伝子に天然では関連していない調節可能な乳酸菌プロモーターからなり、前記プロモーターの存在によって、その遺伝子の発現が、その天然のプロモーターに作動的に結合したときの遺伝子の発現に比べると変化されている組換え乳酸菌。 30．所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が、天然で発現されるレベルとは少なくとも10％異なるレベルで発現される請求項29記載の細菌。 31．所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が、天然で発現されるレベルとは少なくとも25％異なるレベルで発現される請求項30記載の細菌。 32．所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が、染色体遺伝子である請求項29記載の細菌。 33．所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が、染色体外遺伝子である請求項29記載の細菌。 34．所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が、天然の遺伝子である請求項29記載の細菌。 35．所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が、異種遺伝子である請求項29記載の細菌。 36．異種遺伝子でが、乳酸菌由来のものである請求項35記載の細菌。 37．挿入される調節可能なプロモーターが、ｐＨ、生育温度、熱ショック遺伝子の発現を引き出す温度シフト、イオン強度／ＮａＣｌ含量を含む増殖培地組成およびプリンヌクレオチド前駆体の存在／欠如、および細菌の発育相／成長速度から選択される因子によって調節可能である請求項29記載の細菌。 38．プロモーターからなる単離配列が、さらなる配列からなり、それによってプロモーターが確率事象により調節されるようになる請求項29記載の細菌。 39．さらなる配列が、プロモーターの機能を阻害する調節配列を組換え除去するものである請求項38記載の細菌。 40．プロモーターが、ランナウェイ挙動を有するプラスミド上に位置する請求項 29記載の細菌。 41．ラクトコッカス種、ストレプトコッカス種、ラクトバシラス種、ロイコノストック種、ペディオコッカス種、ブレビバクテリウム種、プロピオニバクテリウム種およびビフィドバクテリウム種から選択されるものである請求項29記載の細菌。 42．プロモーターが、ラクトコッカス種、ストレプトコッカス種、ラクトバシラス種、ロイコノストック種、ペディオコッカス種、ブレビバクテリウム種、プロピオニバクテリウム種およびビフィドバクテリウム種由来のものである請求項32 記載の細菌。 43．プロモーターが、ラクトコッカスラクチス由来のものである請求項42記載の細菌。 44．プロモーターが、菌株ＭＧ1614および菌株ＭＧ1363から単離されるプロモーターから選択されるプロモーターである請求項43記載の細菌。 45．所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が、レプリコンに存在するプロモーターの制御下にあるレプリコンの部位に挿入され、その部位は、プロモーターレス構造遺伝子からなる転位因子を用いてプロモーターレス構造遺伝子を挿入しそれによって原プロモーターレス遺伝子がレプリコンに存在するプロモーターに作動的に結合されることにより発現可能になることによって同定可能であり、前記遺伝子の前記部位での挿入により、前記遺伝子がレプリコンに存在するプロモーターに作動的に結合されるようになる請求項29記載の細菌。 46．挿入遺伝子が、乳酸菌由来のものである請求項45記載の細菌。 47．遺伝子が、乳酸菌の染色体中に挿入される請求項45記載の細菌。 48．遺伝子が、染色体外レプリコン中に挿入される請求項45記載の細菌。 49．挿入遺伝子が、相同遺伝子である請求項45記載の細菌。 50．挿入遺伝子が、異種遺伝子である請求項45記載の細菌。 51．挿入異種遺伝子が、乳酸菌由来のものである請求項50記載の細菌。 52．所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が、リパーゼをコードする遺伝子、ペプチダーゼをコードする遺伝子、プロテアーゼをコードする遺伝子、炭水化物代謝に関連した遺伝子産物をコードする遺伝子、クエン酸代謝に関連した遺伝子産物をコードする遺伝子、プリン代謝に関連した遺伝子産物をコードする遺伝子、バクテリオファージ耐性に関連した遺伝子産物をコードする遺伝子、溶菌酵素をコードする遺伝子およびバクテリオシンをコードする遺伝子から選択される請求項29または45記載の細菌。 53．所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が、ロイコノストック種の lacL遺伝子、ロイコノストック種のlacM遺伝子およびリジンアミノペプチターゼをコードするラクトコッカスラクチス亜種ラクチス遺伝子から選択される請求項52記載の細菌。 54．乳酸菌中で機能的である乳酸菌プロモーターと、それらに作動的に結合された所望の遺伝子産物をコードする遺伝子からなり、前記プロモーターが、前記遺伝子と天然では関連していないものである単離ＤＮＡフラグメント。 55．さらに少なくとも１つの転写ターミネーターからなる請求項54記載のＤＮＡフラグメント。 56．100〜10000塩基対の範囲内のサイズを有するＤＮＡフラグメントである請求項54記載のＤＮＡフラグメント。 57．200〜5000塩基対の範囲のサイズを有するフラグメントである請求項56記載のＤＮＡフラグメント。 58．さらに、プロモーターの調節に関連した遺伝子産物をコードする配列からなる請求項54記載のＤＮＡフラグメント。 59．所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が、リパーゼをコードする遺伝子、ペプチダーゼをコードする遺伝子、プロテアーゼをコードする遺伝子、炭水化物代謝に関連した遺伝子産物をコードする遺伝子、クエン酸代謝に関連した遺伝子産物をコードする遺伝子、プリン代謝に関連した遺伝子産物をコードする遺伝子、バクテリオファージ耐性に関連した遺伝子産物をコードする遺伝子、溶菌酵素をコードする遺伝子およびバクテリオシンをコードする遺伝子から選択される請求項54記載のＤＮＡフラグメント。 60．所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が、異種遺伝子である請求項54記載のＤＮＡフラグメント。 61．遺伝子が、乳酸菌に由来する遺伝子である請求項54記載のＤＮＡフラグメント。 62．所望の遺伝子産物をコードする遺伝子が、ロイコノストック種のlacL遺伝子、ロイコノストック種のlacM遺伝子およびリジンアミノペプチターゼをコードするラクトコッカスラクチス亜種ラクチス遺伝子から選択されるものである請求項61記載のＤＮＡフラグメント。 63．乳酸菌プロモーターが、受託番号ＤＳＭ7360として寄託されたラクトコツカスラクチス亜種ラクチスＭＧ1363組込み体クローンＰ139−170中に含まれる調節可能なプロモーターである請求項54記載のＤＮＡフラグメント。 64．乳酸菌プロモーターが、受託番号ＤＳＭ7361として寄託されたラクトコッカスラクチス亜種ラクチスＭＧ1614組込み体クローン63b中に含まれるプロモーターである請求項54記載のＤＮＡフラグメント。 65．食品製造における請求項29に定義の組換え乳酸菌の用途。 66．動物飼料の保存における請求項29に定義の組換え乳酸菌の用途。 67．原生物的に活性な組成物の製造における請求項29に定義の組換え乳酸菌の用途。 68．調節可能なプロモーターが、乳酸菌のｔＲＮＡプロモーター、ｒＲＮＡプロモーター、purＤプロモーターおよびモティーフＡＧＴＴからなるプロモーターから選択されるプロモーターである請求項29記載の細菌。 69．調節可能な乳酸菌プロモーターが、所望の遺伝子産物をコードするプロモーターレス遺伝子、細菌中で機能的であるθ複製乳酸菌レプリコン、ＤＮＡ配列を所望の遺伝子産物をコードする遺伝子がプロモーターに作動的に結合されて遺伝子が転写されるように挿入させる挿入部位からなるベクター中に挿入されている請求項29記載の細菌。 70．ベクターが、受託番号ＤＳＭ8496として寄託されたプラスミドｐＡＫ80である請求項69記載の細菌。 71．（ｉ）所望の遺伝子産物をコードするプロモーターレス遺伝子からなるベクター、（ii）乳酸菌中で機能的であるθ複製乳酸菌レプリコンおよび（iii）ＤＮＡ配列を挿入させる挿入部位からなり、その挿入部位に調節可能な乳酸菌プロモーターからなるＤＮＡ配列が挿入されており、その挿入によって所望の遺伝子産物をコードする遺伝子がプロモーターに作動的に結合されてその遺伝子が転写されるようになる組換えプラスミド。 72．ベクターが、ｐＡＫ80である請求項71記載のプラスミド。 73．挿入されている調節可能なプロモーターが、乳酸菌のｔＲＮＡプロモーター、ｒＲＮＡプロモーター、purＤプロモーター、およびモティーフＡＧＴＴからなるプロモーターから選択される強力なプロモーターである請求項71記載のプラスミド。