JPH0970292A

JPH0970292A - 食品微生物染色体へ外来遺伝子を導入する方法、外来遺伝子導入用ベクターおよび外来遺伝子が導入された形質転換体

Info

Publication number: JPH0970292A
Application number: JP8173585A
Authority: JP
Inventors: Takashi Sasaki; 隆佐々木; Yasuko Sasaki; 泰子佐々木; Yoshiyuki Ito; 喜之伊藤; Kimiyoshi Matsuo; 公美松尾
Original assignee: Meiji Milk Products Co Ltd
Current assignee: Meiji Dairies Corp
Priority date: 1995-07-04
Filing date: 1996-07-03
Publication date: 1997-03-18

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、食品微生物染色体へ外来遺伝子を
導入する方法、外来遺伝子導入用ベクターおよび外来遺
伝子が導入された形質転換体を提供することを課題とす
る。【解決手段】食品微生物の栄養素合成遺伝子領域に相
同的組換えによる二重交叉方法を用いて遺伝子を導入す
ることにより該遺伝子領域を失活させる。これにより、
該微生物の栄養要求性の変化に基づいて目的の遺伝子が
組込まれた形質転換体を簡便かつ正確に選択できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、食品産業等で有用
な微生物の染色体へ外来遺伝子を導入する方法、外来遺
伝子導入用ベクターおよび外来遺伝子が導入された形質
転換体に関する。また、本発明は、外来遺伝子が導入さ
れた形質転換体の選択に用いられるマーカーに関する。

【０００２】

【従来の技術】人類は長い歴史の中で、乳酸菌、枯草
菌、酢酸菌、酵母、糸状菌等多くの微生物が各種食品を
発酵して保存性を高め、香味を改良し、消化を良くし、
更には人間にとって有益な栄養生理効果をもたらすこと
を学んできた。

【０００３】これらの微生物を単離して効率良く食品を
製造する努力は古くから行なわれ、また、自然界に存在
する、好ましい性質を有する菌株を求めて選抜が繰り返
されてきた。

【０００４】近年のバイオテクノロジー、特に遺伝子操
作の進展によって、食品製造などに係る多くの遺伝子の
解明が進み、また、食品微生物へ遺伝子を導入する各種
の方法が開発された。これらの技術的進展を背景とし
て、従来の育種技術では不可能であった新しい育種の可
能性が生まれてきた。そして、この新しい技術を用い
て、より効率の高い生産、より美味しい食品の製造、人
の健康増進作用が高い食品等新しい食品の開発を目指す
研究が盛んになってきた。

【０００５】概括的に述べると、食品微生物の遺伝子操
作は、近年の研究によって大きく進展し、技術的には上
記の応用が夢物語ではなく、近い将来必ず実現できるだ
ろうと考えられるまでに至っている。

【０００６】遺伝子操作を食品分野で応用しようとする
場合、何よりも安全性が重要であり、技術開発の大前提
である。また、産業的応用のためには安定性も必須であ
る。しかし、目的の食品微生物を遺伝子操作で改良し、
同時に安全性と安定性を確実に保証する方法論は今のと
ころ必ずしも充分には確立していない。

【０００７】この分野の従来技術を考えるにあたって、
遺伝子操作の本質的な問題点は乳酸菌、枯草菌、酢酸
菌、酵母、糸状菌等で同じであるが、ここでは、最近の
技術的な進歩が著しく、しかも最終製品（食品）に最も
多くの生菌が残存する乳酸菌について以下特に詳しく述
べる。

【０００８】乳酸菌の育種技術を振り返ると、古くは専
ら「選抜」と「突然変異の利用」のみであったが、１９
６０年代以降、ファージを介した「形質導入」や「接合
伝達」を利用して、遺伝子を一部の乳酸菌に導入するこ
とが可能になった。（Sandine,W.E.,FEMS Microbial. R
ev., 46,205-220 (1987)）。しかし、本格的に乳酸菌の
育種技術が発展したのは１９８０年以降である。まず、
ラクトコッカス（Lactococcus）属乳酸菌等でプロトプ
ラストを用いる形質転換法が開発され（Kondo,J.F. and
L.L. McKay.,Appl. Environ. Microbiol., 43, 1213-1
215, (1982)）、１９８０年代後半には、高電圧電気パ
ルスを利用したエレクトロポレーション法による形質転
換が報告された（Harlander, S.K.,In: Streptococcal
Genetics, Ferretti, J. and Curtiss, R.(eds.), Amer
ican Society for Microbiology,Washington, D. C., p
p.229-233(1987)／Chassy, B.M. and J.L. Flickinge
r.,FEMS Microbiol. Lett., 44, 173-177 (1987)）。こ
の方法はほとんどの乳酸菌に適用でき再現性が良い上、
多くの場合高い形質転換頻度が得られる。今のところラ
クトコッカス属やラクトバチルス（Lactobacillus）属
乳酸菌等の一部の菌種に限られるが、プラスミド DNA 1
μg 当り10⁵から10⁷もの形質転換体が得られるものがあ
る（Holo, H. and I.F. Nes.,Appl. Environ. Microbio
l., 55, 3119-3123 (1989)）。また、乳酸菌で用いる各
種のベクターが開発され、プロモーターやターミネータ
ー、更には使用コドン等も研究され、同種または異種の
遺伝子を導入して効率良く発現させることも広く行なわ
れるようになってきた。更に、宿主遺伝子由来のプロモ
ーターや分泌シグナルなどを用いて、外来遺伝子を乳酸
菌で分泌させる研究も盛んになってきている（Gasson,
M.J.,FEMS Microbial. Rev.,12, 3-20 (1993)）。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】このように、食品微生
物の育種に利用できる遺伝学的技術は豊富になってき
た。しかし、従来盛んに報告されている「目的の遺伝子
をプラスミドとして宿主に導入して複製する方法」は、
産業的に食品微生物の利用を行なう場合にはいくつかの
問題点が指摘される。

【００１０】これまで多くの場合、形質転換の選択マー
カーは抗生物質耐性遺伝子であるが、プラスミドの複製
が必要な場合には、この「耐性遺伝子」が形質転換体に
残ってしまう。従って、安全性の点で食品などへの応用
には不適当なことが、第一の問題点である。尚、安全な
選択マーカー遺伝子の開発も試みられているが（MacKor
mick, C.A.,H.G. Griffin and M.J. Gasson.,FEMS Micr
obiol. Lett., 127, 105-109 (1995)など）、選択効率
が必ずしも良くなく、また、使用できる宿主等が限られ
ている等、今のところ実用レベルで完成されたものはな
い。第２の問題点としては、プラスミドが宿主の中で不
安定であることが挙げられる。導入したプラスミドは、
一般に非選択条件下では不安定で、継代培養によって自
然に脱落する事が多い。また、プラスミドによっては継
代培養中に構造が変化する等の現象が知られているた
め、産業的有用性に欠けると言わざるを得ない。

【００１１】これらの欠点を克服する方法として、「食
品微生物染色体への遺伝子組込み」が検討され、最近十
年位の間にいくつかの報告が行なわれてきた。その概要
は以下の通りである。まず、宿主では複製できないベク
ターに、目的の遺伝子と、組込みのための相同配列（宿
主の染色体の一部等）とを挿入して、「組込み用ベクタ
ー」を構築する。なお、一般に「ベクター」とは、宿主
内に特定の遺伝子を導入するためのＤＮＡ、または特定
の遺伝子と該ＤＮＡとが結合されたＤＮＡを意味する
が、本明細書においては主に後者を意味する。このベク
ターを形質転換法などによって宿主細胞に導入し、相同
組み換えで染色体に組込まれたものを選択する。更に、
宿主菌中での「二重交叉」（double crossing over）を
利用して、目的遺伝子のみを染色体へ挿入し、マーカー
遺伝子等不要な（場合によっては有害な）外来配列が残
らないようにする方法も工夫されている（Leenhouts,
K.J.,J. Gietema, J. Kok and G. Venema.,Appl. Envir
on. Microbiol., 57, 2568-2575 (1991)／Scheirlinck,
T., J. Mahillon, H. Joos, P. Dhaese and F. Michie
ls.,Appl. Environ. Microbiol., 55, 2130-2137(198
9)）。今までにこれらの方法によって、食品微生物染色
体に遺伝子の挿入、増幅、置換及び欠失等の変異を導入
することが報告されている。これらの方法は、外来遺伝
子をプラスミド上に載せて複製させる場合の欠点であ
る、前述の「安全性」や「安定性」の問題を克服できる
可能性があるため、産業上の大きな技術的進歩であり、
今後更に研究開発が進むことが期待される。

【００１２】しかし、依然としていくつかの問題点があ
り、今後の応用に向けて更なる技術改良が必要である。
第一の問題点としては、一般に、食品微生物（特に産業
的に用いられている株）染色体への遺伝子組込みが極め
て困難であることが挙げられる。

【００１３】第二の問題点として、「二重交叉」によっ
て得られるものが、「目的の遺伝子組込み体」であるか
どうかを、簡便かつ正確に確認する方法が確立していな
いことが挙げられる。育種された株の安全性を考える
と、「目的の遺伝子組込み体」が導入したい遺伝子のみ
を含み、選択マーカーなど他の余分な外来性の塩基配列
を含まないことが望ましい。これを実現するため、「二
重交叉」の利用が有望であり、最近いくつかの報告が行
なわれた。しかし、産業的応用のために食品微生物中に
導入する遺伝子そのものは、一般に選択マーカーとして
の働きが期待できない。そのため、染色体への最初の相
同組換えを何らかの（例えば抗生物質耐性等の）選択マ
ーカーを用いて行なって組込み体を得た後、それらの組
込み体を非選択条件下で継代培養して二度目の相同組み
換えを起こさせ、この二段階の反応における「二重交
叉」によって得られた遺伝子組込み体の中から、目的の
遺伝子のみが挿入された「目的の遺伝子組込み体」を
「目的の遺伝子の活性を同定する」ことによって選別す
るという戦略が取られてきた。しかし、この方法は、目
的遺伝子の活性の測定が容易であるという極めて例外的
な場合にしか適用できない。従って、「二重交叉」によ
って得られた遺伝子組込み体が「目的の遺伝子組込み
体」であるかどうかを、目的遺伝子にかかわらず簡便且
つ正確に確認できる方法が強く求められていた。

【００１４】以上のことから、食品微生物染色体へ遺伝
子を導入し産業的に有用な株を育種する場合、次の条件
を満たす方法の確立が求められることが理解できる。１）形質転換効率の悪い食品微生物株にも適用できる。２）目的の遺伝子のみを宿主染色体に組込んで安定化す
る際に、選択マーカー遺伝子等の余計な外来性の塩基配
列が、「育種株」の染色体中に残存しない。３）「二重交叉」によって得られた相同組換え体の中か
ら、「目的の遺伝子組込み体」を選別する際に、目的遺
伝子に関係なく簡便かつ正確に確認できる。

【００１５】これらの全ての条件を満足する方法、特に
３）の条件を満足する方法は全く報告されていない。従
って、前記条件を全てを満足する遺伝子導入方法を確立
することが、本発明の解決すべき中心的課題である。

【００１６】即ち、食品微生物の遺伝子組込み体を育種
するには、前述の条件全てを満たすことが望ましいが、
１）、２）については部分的ではあるが解決方法が示さ
れている。従って、前記１）、２）の条件を損なうこと
なく、３）の条件を同時に満たす方法が特に求められて
いる。即ち、ほとんどの場合は、導入しようとする遺伝
子（目的の遺伝子）は「選択マーカー」として利用する
ことが困難であるので、「二重交叉」によって得られた
相同組換え体の中から、いかにして目的の遺伝子の種
類、性質に依存せず「目的の遺伝子が組み込まれた形質
転換体」を選別することができるかが本発明の課題であ
る。

【００１７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を克服するために鋭意研究を重ねた結果、「目的の遺伝
子が組み込まれた形質転換体」を選別するために、「宿
主微生物の生育に必須な化合物の合成に必要な遺伝子領
域」（以下「栄養素合成遺伝子領域」と称する）を標的
として遺伝子の導入を行う」ことによって上記課題が克
服できることを見いだし、本発明を完成した。即ち、本
発明者らは、栄養素合成遺伝子領域を標的として遺伝子
の導入を行い、遺伝子が導入された株の栄養要求性を調
べることによって、前記１）２）の条件を損なうことな
く、また目的の遺伝子の種類、性質に依存せず「目的の
遺伝子組込み体」を選別することが可能であることを見
いだし、本発明を完成した。

【００１８】即ち、本発明は、食品微生物の染色体中に
外来遺伝子を導入する方法において、「ベクター中に存
在する該外来遺伝子の挿入によって不活化された該微生
物由来の栄養素合成遺伝子領域」と「該微生物の染色体
上の栄養素合成遺伝子領域」との間の相同的組換えによ
って、外来遺伝子を該微生物の染色体中に導入すること
を特徴とする方法に関する。また本発明は、該方法にお
いて、外来遺伝子が染色体中に導入された微生物を、栄
養要求性に基づいて選択することを特徴とする方法に関
する。

【００１９】

【発明の実施の形態】本発明の実施にあたって、一般に
用いられる方法の例を以下に示すと同時に、図１及び図
２に図解する。まず、宿主微生物の栄養素合成遺伝子領域を、宿主
染色体よりクローニングする。クローニングの方法に特
に制限はないが、例えば、大腸菌の栄養要求性変異を相
補するＤＮＡ断片としてクローニングする方法が挙げら
れる。もちろん、あらかじめクローニングされた栄養素
合成遺伝子領域を用いてもよい。のＤＮＡ断片に「宿主染色体に導入したい遺伝子
（目的の遺伝子）」を挿入して、栄養素合成遺伝子領域
を失活させる。挿入失活は、例えば大腸菌の該栄養要求
性変異を相補しないことで確認することができる。（図
１の１）および２）の過程）次に、「目的の遺伝子」の挿入によって失活した栄
養素合成遺伝子領域を含むＤＮＡ断片全体を、目的の宿
主で用いる組込みベクターに挿入して、「組込み用ベク
ター」を構築する。（図１の３）の過程）この「組込み用ベクター」を目的の宿主微生物に導
入し、ベクター上の栄養素合成遺伝子領域と染色体上の
栄養素合成遺伝子領域とで相同的組換えを起こした組込
み体（以後、「第１回目の相同組換え体」と呼ぶ）を得
る（図１の４）の過程）。

【００２０】該ベクターの導入方法と、「第１回目の相
同組換え体」の選択方法には、特に制限はない。一般的
には、ベクターは形質転換法によって導入されるが、一
部の微生物では接合伝達法も利用できる。特にラクトバ
チルス・デルブルエキ種の染色体へ遺伝子を組み込む場
合には、既に本発明者らによって出願された方法（特開
平６−３０７８１号）は形質転換頻度にかかわらず適用
できるため、本方法を利用することによって極めて応用
性の高い「育種株」が作成できると期待される。このと
き、接合伝達用のベクターとしては、pAMβ1（Clewell,
D.B., Y. Yagi,G.M. Dunny and S.K. Schultz.,J.Bacte
riol., 117, 283-285 (1974)）由来のベクターを用いる
ことができる。

【００２１】また、選択条件としては抗生物質耐性を用
いることができる。この場合においても、「二重交叉」
によって最終的には該耐性遺伝子を除去することが可能
であるため、このような選択マーカー遺伝子を育種の途
中で利用しても、産業的な実用性を損なうことにはなら
ない。なお、該「組込み用ベクター」が染色体の該栄養
素合成遺伝子領域に組込まれたことは、該ベクターが導
入された宿主の染色体ＤＮＡを制限酵素で切断した後、
サザンハイブリダイゼーション法で確認したり、適当な
プライマーを用いて宿主染色体に対してＰＣＲ法で確認
することができる。次に、染色体の栄養素合成遺伝子領域に「組込み用
ベクター」が挿入された上記の「第１回目の相同組換え
体」を、非選択条件下で培養して継代を重ねる。ある回
数継代培養した後、非選択プレート上で単一コロニーを
多数分離し、その中から、ベクター由来の選択マーカー
の有無による表現型の違いで２回目の相同組み換えが起
こったと思われる株を選別する。例えば、マーカーが抗
生物質耐性遺伝子の場合には、耐性から感受性に戻った
クローンがその候補である（図２の５）の過程）。２回目の相同組み換えを起こした株には、相同組換
えが１度目の相同組換え部位とは異なる部位で起こった
「目的の遺伝子組込み体」と、２度とも同じ部位で組み
換えが起こったために完全に元の微生物に戻ったものと
がある。これらの中から「目的の遺伝子組込み体」のみ
を簡便に且つ確実に選別する方法として、本発明では
「栄養要求性」を判断材料とすることができる。

【００２２】即ち、「目的の遺伝子組込み体」では、染
色体上の栄養素合成遺伝子が失活しているため、生育に
その栄養素が必要である。これに対して、２度目の組み
換えで完全に元の微生物に戻ったものは、該栄養素合成
遺伝子が失活していないため、栄養要求性を示さない。
（図２の５）の過程）従って、該栄養素を含有する合成
（最少）培地と含有しない合成（最少）培地で、候補と
なる微生物の生育を比較するという簡便な方法で、「目
的の遺伝子組込み体」であるかどうかを判定することが
できる。勿論、「目的の遺伝子組込み体」であること
は、通常の微生物学試験や染色体ＤＮＡのサザンハイブ
リダイゼーション法等でさらに確認することができる。

【００２３】なお、上記の方法の他に、以下のような方
法によっても本発明を実施できることは、当業者にとっ
て自明である。例えば、抗生物質存在下などの選択条件
下で「第１回目の相同組換え体」を分離した後に継代培
養を行わず、非選択条件下でペニシリンスクリーニング
（または、ナイスタチンスクリーニング）を行い、該栄
養素を要求するクローンを濃縮することによっても、
「目的の遺伝子組込み体」の単離が可能である。

【００２４】また、他の方法として、「宿主染色体に導
入したい遺伝子（目的の遺伝子）」と「選択マーカー
Ｍ」とを予めタンデムに結合した後、この結合体を栄養
素合成遺伝子ＤＮＡ断片内に挿入して該遺伝子を失活さ
せ、その全体を組込みベクターに結合する。このように
して構築されたベクターを宿主微生物に導入すれば、
「選択マーカーＭ」に関する選択条件で生育するクロー
ンについて、失活させた栄養素遺伝子に依存する栄養要
求性を調べるだけで、「目的遺伝子の遺伝子組込み体」
であるかどうかを、一段階で判定することが可能であ
る。なお、食品工業への応用という本発明の趣旨からす
ると、用いる「選択マーカーＭ」は、食品として安全で
あることが望ましい。食品として安全なマーカーとして
は、例えば、乳糖資化遺伝子、キシロース資化遺伝子、
ナイシン等の乳酸菌由来のバクテリオリシン耐性遺伝子
があげられる。更に、この方法においても、「選択マー
カーＭ」に関する選択条件下でペニシリンスクリーニン
グを行うことにより、更に効率よく「目的の遺伝子組込
み体」を単離することが可能である。

【００２５】本発明において、組換え部位または選択マ
ーカーとして利用される栄養素合成遺伝子は、機能的な
該遺伝子が存在する微生物と存在しない微生物とが識別
可能なものであれば、いかなるものでも使用可能であ
る。例えば、宿主微生物の生育に必須なアミノ酸、核酸
またはビタミンの合成に必要な酵素をコードする遺伝子
が挙げられる。

【００２６】なお、本発明者らは、組換え部位または選
択マーカーとして、本発明の実施に特に好適な栄養素合
成遺伝子として、ラクトバチルス・デルブルエキ由来の
チミジン合成遺伝子およびストレプトコッカス・サーモ
フィラス（Streptococcus thermophilus）由来のチミジ
ン合成遺伝子を新たにクローニングし、塩基配列を決定
した。ラクトバチルス・デルブルエキ由来のチミジン合
成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片の制限酵素地図を図３
に、該遺伝子の塩基配列を配列番号：１に示す。また、
配列番号：１の塩基配列から推定されるアミノ酸配列を
配列番号：１に並記する。さらに、ストレプトコッカ
ス・サーモフィラス由来のチミジン合成酵素遺伝子を含
むＤＮＡ断片の制限酵素地図を図４に,該遺伝子の塩基
配列を配列番号：２に示す。また、配列番号：２の塩基
配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号：２に並記
する。これらの遺伝子を含むプラスミドを保持する大腸
菌は、ラクトバチルス・デルブルエキ由来のチミジン合
成酵素遺伝子に関してはＦＥＲＭＰ−１５０１９号とし
て、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来のチミジ
ン合成酵素遺伝子に関してはＦＥＲＭＰ−１５０２０号
として、それぞれ工業技術院生命工学工業技術研究所に
寄託されている。なお、本発明において、該寄託された
それぞれの遺伝子の他に、該寄託されたそれぞれの遺伝
子がコードするアミノ酸配列に対して１または複数個の
アミノ酸の置換、欠失または挿入変異を加えたアミノ酸
配列を有しかつ該タンパク質と同等の生理活性を有する
タンパク質をコードする遺伝子も、該寄託されたそれぞ
れの遺伝子と同様に、組換え部位または選択マーカーと
して利用できることはいうまでもない。

【００２７】食品微生物に導入する遺伝子は特に限定は
ない。産業的に有用であると考えられる遺伝子は多数有
るが、その一部を例示すると以下のようなものが挙げら
れる。例えば、プラスミドにコードされていて不安定な
遺伝子（チーズ用乳酸菌の乳糖資化、蛋白質分解に関与
する遺伝子など：染色体へ組込み安定化する）、食品の
保存性を高めるための抗菌物質（安全なバクテリオシン
等）産生遺伝子、安定した生産を可能にするためのファ
ージ耐性遺伝子、好ましい香味成分を生産する遺伝子、
また、逆に食品にとって不都合な香味成分（苦味や異
臭、異味）を生産しないようにするためのアンチセンス
遺伝子（または当該遺伝子の破壊）、より広い条件で培
養できるようにするための多糖・蛋白質・核酸などを分
解する分泌酵素遺伝子、当該食品で不足する栄養素を合
成する遺伝子、当該微生物の生育にとって律速段階とな
る酵素遺伝子の増幅、更に、食品の消化性を高めるため
の蛋白質・脂質等の分解酵素遺伝子、各種の病原微生物
やウィルスに対する抗原蛋白質遺伝子（食品微生物を利
用した経口ワクチン製造のため）等である。

【００２８】また、本発明において宿主微生物は、宿主
内で相同的組換えが起こる食品微生物であればいかなる
ものでもよいが、好適な微生物として、乳酸菌、枯草
菌、酢酸菌、酵母または糸状菌が挙げられる。なお、本
発明において「食品微生物」とは、食品工業、畜産・水
産分野（飼料等）に応用される微生物のことを意味し、
特に食用となる微生物が含まれる。

【００２９】得られた「目的の遺伝子組込み体」を産業
的に利用する場合、目的とする遺伝子が導入されている
ことの他に、栄養素合成遺伝子が失活しているので該栄
養素に対する要求性を示すことが親株とは異なる。しか
し、該栄養素が産業的に用いられる食品微生物用の培地
に充分量存在する場合には何ら問題は生じない。仮に、
該栄養素が産業用培地中に充分量は存在せず、食品微生
物「育種株」の生育にとって不十分な場合であっても、
該栄養素を培地に添加すればよい。この場合、これらの
栄養素はそもそも栄養となるものであるので安全性につ
いては全く問題がないことは明らかであり、この発明を
食品へ応用する場合に考えられる不都合な点は存在しな
い。従って、本発明は産業的に利用価値の高いものであ
ることは明らかである。

【００３０】なお、最近ラクトバチルス・プランタルム
（Lactobacillus plantarum）の「抱合胆汁酸加水分解
酵素（conjugated bile acid hydrolase遺伝子／cbh遺
伝子）」部位に外来α−アミラーゼ遺伝子を挿入した例
が報告された（Hols, P., T.Ferain, D. Garmyn, N. Be
rnard and J. Delcour.,Appl. Environ. Microbiol., 6
0, 1401-1413 (1994)）。しかし、この報告において用
いられている「cbh遺伝子」は該乳酸菌の生育には不要
のものであり、しかも「cbh 遺伝子」は導入しようとす
る遺伝子を挿入するための単なる標的部位としてのみ用
いられており、「目的の遺伝子組込み体」を選別（確
認）するための機能は全く果たしていない点で、本発明
とは、その本質を全く異にするものである。

【００３１】以下本発明を実施例によって説明するが、
本発明はこれらの実施例に限定されない。

【００３２】

【実施例】

［実施例１］thyA 遺伝子のクローニング乳酸菌（ラクトバチルス・デルブルエキ・亜種ブルガリ
カス(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus M
-878 株)／明治乳業ヘルスサイエンス研究所所有株。特
開平６−３０７８１号公報参照。以後「ラクトバチルス
・ブルガリカスM-878 株」と省略することがある。）の
染色体 DNA を調製し、大腸菌の thyA変異を相補する方
法で本遺伝子のクローニングを行なった。その詳細を以
下に示す。

【００３３】ラクトバチルス・ブルガリカス M-878
株染色体 DNA の調製 MRS 培地 100 ml で 37 ℃１５時間培養したラクトバチ
ルス・ブルガリカス M-878 株菌体を、集菌洗浄後、高
張緩衝液（PB:0.3 M ラフィノース（raffinose）,5 mM
MgCl₂, 5 mM CaCl₂, 20mM Tris-HCl(pH=7.0)）10 mlに
懸濁した後、懸濁液量の５０分の１容の溶菌酵素混合液
（1ml中 5 mg リゾチーム及び50 μg ムタノリシン(mut
anolysin)を含む）を加え 37 ℃で１０分間反応させ、
反応液を遠心した。以後の沈殿菌体の溶菌、及び染色体
DNA の調製はSaitoらの方法（Saito, H. and K. Miur
a.,Biochim. Biophys. Acta, 72, 619-629 (1963)）に
従った。得られた粗精製染色体DNAをエチジウムブロマ
イド存在下での塩化セシウム密度勾配超遠心（CsCl-EtB
r 超遠心法）によって精製した。

【００３４】挿入 DNA 断片及びベクターの調製と
ライゲーション反応精製した染色体 DNA 約 2 μg を、制限酵素 MboI で部
分分解しアガロースゲル電気泳動にかけ、約 2 〜 4 kb
の長さを示す DNA 断片を含むゲルを切り出し、GENECL
EAN IIキット (BIO 101 社) を用いて DNA を回収精製
した。

【００３５】ベクターの pBR322 DNA 約 100 ng を制限
酵素 BamHI で完全分解後、BAP (bacterial alkaline p
hosphatase: 宝酒造社) で脱リン酸基処理し、前記の挿
入 DNA断片とライゲーション反応を行なった。

【００３６】形質転換前項で調製したライゲーション反応液を用いて、大腸菌
(E. coli)の thyA遺伝子欠損株である ATCC33678 株
を、塩化カルシウム法で形質転換した。大腸菌の形質転
換、及びプラスミドの調製等は、常法（Maniatis, T.,
E.F. Fritsch andJ. Sambrook.(1989) Molecular cloni
ng: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harb
or Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）に
従った。

【００３７】形質転換体は、アンピシリン(Ap) 50 μg/
ml を添加した M9 最少培地プレートに生育する株とし
て選択した。選択培養２日目までに、１個のコロニーが
出現した。このコロニーよりプラスミドを調製した結
果、約 2 kb の DNA 断片がベクター pBR322 に挿入さ
れていることが判明した。このプラスミドを pBBTS1 と
命名した。図３にその制限酵素地図を示す。

【００３８】本プラスミドを保持する大腸菌の形質転換
株を E. coli 33678 (pBBTS1) #1株と呼ぶが、この株
は、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＰ
−１５０１９として寄託されている。

【００３９】挿入断片が thyA 変異を相補すること
の証明 pBBTS1 が大腸菌の thyA 変異を相補できるかどうかを
再確認した。LB 培地 1l で培養した E. coli 33678 (p
BBTS1) #1 菌体より pBBTS1 プラスミドを調製し CsCl-
EtBr 超遠心法で精製した。E. coli ATCC33678 株、並
びに、E. coli HB101 株と TG1 株より得られたthyA欠
損株（各々、HB101thy1 及び TG1thy2 と命名）を宿主
として形質転換した。（尚、後者２株は、常法通りトリ
メトプリム耐性コロニーとして取得し、チミジン要求性
を確認した。）pBBTS1 DNA を用いると、アンピシリン5
0 μg/ml 添加 M9 最少培地プレートに生育する形質転
換体が多数得られた。調べた各々４株ずつ合計１２株の
形質転換体は、全て pBBTS1と同一の制限地図を有する
プラスミドを保持していた。尚、対照として、これらの
宿主をベクター pBR322 で形質転換すると、アンピシリ
ン50 μg/ml 耐性株は得られたが、M9 最少培地プレー
トに生育する形質転換体は全く得られなかった。従っ
て、pBBTS1 プラスミド上の約 2 kb の DNA 断片が、大
腸菌の thyA 変異を相補すると結論した。

【００４０】尚、pBBTS1 の約 2 kb の挿入 DNA 断片の
一部をプローブとして、ラクトバチルス・ブルガリカス
M-878（ラクトバチルス・ブルガリカス M-878）株染色
体 DNA のサザンハイブリダイゼーション（Maniatis,
T., E.F. Fritsch and J. Sambrook.(1989) Molecular
cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.
Y.）を行なった結果、明瞭な陽性シグナルが検出され
た。

【００４１】以上の結果より、クローニングした約 2 k
b の DNA 断片にラクトバチルス・ブルガリカスM-878株
染色体由来のチミジン合成酵素遺伝子 (thyA) が存在す
ると結論した。

【００４２】［実施例２］ラクトバチルス・ブルガリカ
ス M-878 株の thyA 遺伝子塩基配列の決定ラクトバチルス・ブルガリカス M-878 株の thyA 遺伝
子をコードすると考えられる pBBTS1 プラスミドの Eco
RV 断片 2.1 kb （図３）の塩基配列決定を試みた。

【００４３】pBBTS1 プラスミドの各種制限酵素断片
を、E. coli TG1 株を宿主として常法通り pBluescript
SK(+) (Stratagene 社) にサブクローニングした。得
られたプラスミドから２本鎖、及び１本鎖の DNA を調
製した。１本鎖 DNA の調製は、E. coli MV1184 株とヘ
ルパーファージ M13K07 を用いて行なった。

【００４４】ジデオキシ法による塩基配列の決定は、Pe
rkin-Elmer 社製の Dye Primer Cycle Sequencing kit
を用い、DNA sequencer (Perkin-Elmer 社製) による蛍
光色素標識法で行なった。プライマーとして、-21M13
及び M13RP1 を用い、両方向から塩基配列を決定した。

【００４５】決定した配列の一部（EcoRV - PstI 断片
1426 bp）を配列番号：１に示す。

【００４６】また、この配列に存在するオープン・リー
ディング・フレーム（塩基番号 226〜 1185 まで）から
推定されるアミノ酸配列（３２０アミノ酸残基）を配列
番号：１の塩基配列に並記する。このアミノ酸配列につ
いて、 GENETYX-MAC によるホモロジー検索を行なった
結果、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus case
i）の thyA と 68.7％のホモロジーが存在することが
判明した。

【００４７】従って、pBBTS1 プラスミドの EcoRV 断片
2.1 kb の中に thyA 遺伝子が存在する事が示された。

【００４８】［実施例３］ストレプトコッカス・サーモ
フィラス ATCC 19258 株 thyA geneのクローニングと塩
基配列決定次に、実施例１と同様の方法で、ストレプトコッカス・
サーモフィラス ATCC19258 株染色体のthyA gene のク
ローニングを行なった。即ち、ストレプトコッカス・サ
ーモフィラス ATCC 19258 株染色体 DNA を HindIII で
完全分解した後、約 2 〜 4 kb の DNA 断片を調製し
た。これを、HindIII で切断したベクターpBR322 とラ
イゲーションし、大腸菌 E. coli TG1thy2 株を宿主と
して形質転換した結果、Ap 50μg/mlを含有する M9 最
少培地で生育する形質転換体が６個得られた。これらの
形質転換体のプラスミドを調べると、約 3.6 kb の DNA
断片が挿入されたプラスミドを保持していた。このプ
ラスミドを pBSTS1 と命名した（制限酵素地図を図４に
示す）。

【００４９】本プラスミドによって E. coli TG1thy2
株、及び HB101thy1 株を宿主として形質転換した結
果、Ap 50μg/mlを含有する M9 最少培地で生育する形
質転換体が多数得られた。

【００５０】従って、pBSTS1 プラスミドの挿入 DNA 断
片（約 3.6 kb の HindIII 断片）の中にストレプトコ
ッカス・サーモフィラス ATCC 19258 株染色体由来の t
hyAgene が存在していることが判明した。

【００５１】本プラスミドを保持する大腸菌の形質転換
株のうち１株を E. coli TG1thy2(pBSTS1) #4B 株と呼
ぶが、この株は工業技術院生命工学工業技術研究所に、
FERMP-15020 として寄託されている。

【００５２】pBSTS1 プラスミドを各種制限酵素で切断
して得られた断片を pUC118 にサブクローニングし、大
腸菌の thyA 変異を相補するかどうかを予備的に調べ
た。その結果、AccI- HindIII 断片約 2 kb （但し Stu
I 及び XhoI 切断部位を有する断片：図４参照）が thy
A 変異を相補する事が判明した。即ち、ストレプトコッ
カス・サーモフィラス ATCC 19258 株の thyA gene が
この断片中に存在することが推定された。

【００５３】更に、実施例２と同様の方法で本株の thy
A gene の塩基配列を決定した。得られた塩基配列（Eco
RV - AccI 断片；1760 塩基対）を配列番号：２に、ま
た、推定される本株の thyA 遺伝子のオープンリーディ
ングフレーム（塩基番号475〜1332）のアミノ酸配列（2
86 アミノ酸）を配列番号：２の塩基配列に並記する。
得られた本アミノ酸配列について、 GENETYX-MAC によ
るホモロジー検索を行なった結果、ラクトコッカス・ラ
クチス・亜種ラクチス（Lactococcus lactissubsp. lac
tis）の thyA と 74.9％のホモロジーが存在すること
が判明した。従って、pBSTS1 プラスミドの HindIII 断
片 3.6 kb の中に thyA 遺伝子が存在する事が示された
（図５）。

【００５４】［実施例４］「bsr カセット」による thy
A 遺伝子の挿入失活「bsr カセット」の作成ラクトバチルス・ブルガリカス染色体 thyA 遺伝子を
組込みの標的部位とする遺伝子導入法を検討しようとし
たが、本菌ではエリスロマイシン耐性遺伝子以外に効率
良く選択できるマーカー遺伝子が知られていない。そこ
で、新しいマーカーとして pSV2bsr プラスミド（フナ
コシ）の「ブラストサイジンＳ（Blasticidin Sまたは
BS）耐性遺伝子」（bsr）の利用を試みた。pSV2bsr の
bsr には原核生物で働くプロモーターが付いていないの
で、pAMβ1 由来のエリスロマイシン耐性遺伝子のプロ
ーモーターを利用した。pSYE2 プラスミド（特開平５−
１７６７７６号公報）ScaI 断片のうち大きい方の断片
に bsr DNA 断片（pSV2bsrプラスミドの HindIII 断片
約 450 bp を平滑末端処理をしたもの）を挿入して、プ
ラスミド pSYBS1 （図６）を構築した。このプラスミド
でラクトバチルス・ブルガリカス T-11 株（特開平６
−３０７８１号参照）を形質転換した結果、bsr 遺伝子
が本菌の選択マーカーとして使用できることが判明し
た。即ち、宿主T-11 株の生育は培地に 50 μg/mlのブ
ラストサイジンＳを添加すると完全に抑えられるが、形
質転換体をこの培地で選択した結果、本培地に生育する
ものが得られた。これらの形質転換体のプラスミドを調
べると pSYBS1 と同じ制限地図を有していた。次に、図
７に示す方法によって、bsr の両端に pUC プラスミド
のマルチクローニングサイト（multiple cloning site
(MCS)）を有し、いくつかの制限酵素で切り出すことが
可能なプラスミドとして p8BS1 を構築した（図７）。

【００５５】 pBBTS1 プラスミドへの bsr の挿入：
thyA 遺伝子の挿入失活 p8BS1を SmaI で切断した DNA 断片（約 0.85 kb）と S
maI で切断したベクター pBBTS1（図３）とをライゲー
ションし、大腸菌 HB101 株を形質転換した。ブラスト
サイジンＳ及びアンピシリンの両耐性（BS 100 μg + A
p 50 μg/ml LBagar）で選択した形質転換体より、図８
に示すプラスミド（pTSbsr1 及び pTSbsr2：なお図８に
はpTSbsr1のみ示すが、pTSbsr2はbsr断片が逆向きに挿
入されたものである）を保持する形質転換体を取得し
た。

【００５６】これらのプラスミドを用いて、HB101thy1
及び TG1thy2 株（実施例１参照）の形質転換を行なっ
た。アンピシリン 50 μg/ml を含有する LB 寒天プレ
ートで選択した形質転換体は、pTSbsr1 （または pTSbs
r2）と同じ制限酵素地図を有するプラスミドを保持して
いたが、M9 最少培地プレートには生育しなかった。ま
た、対照として M9 最少培地プレート（またはアンピ
シリン 50 μg/ml を含有するM9最少培地プレート）で
選択したが、形質転換体は全く得られなかった。従っ
て、bsrカセットが pBBTS1 へ挿入した pTSbsr1 及び p
TSbsr2 プラスミドでは thyA遺伝子が挿入失活したため
に、大腸菌の thyA 変異を相補できなくなったと結論し
た。

【００５７】［実施例５］接合伝達性「組込みプラスミ
ド」の構築プラスミド pAMβ1 は多くのグラム陽性菌で複製が可能
であるが、ラクトバチルス・デルブルエキ（Lactobacil
lus delbrueckii (Lb. delbrueckii )）種では例外的に
複製できない。この現象を利用して本発明者らは既に、
pAMβ1 をベクターにすると、接合伝達法によって外来
遺伝子を本菌種染色体に組込むことができることを報告
している（特開平６−３０７８１号）。次に、これを発
展させ、染色体の組込み標的部位として「thyA 遺伝
子」を利用し、pAMβ1 をベクターとする、汎用性のあ
る新しい「組込みプラスミド」の構築を試みた。

【００５８】ベクターの pAMβ1 は、制限酵素 AvaI で
切断し BAP 処理を行なった。挿入DNA 断片は、pTSbsr1
プラスミドを制限酵素 EcoRV で切断した後、アガロー
スゲル電気泳動にかけ、約 3 kb の DNA 断片を GENECL
EAN (BIO 101) で回収・精製したものを用いた。（この
EcoRV 切断 DNA 断片には bsr 遺伝子の挿入によって
失活した thyA 遺伝子が含まれている。）これらをライ
ゲーション反応した後、特開平６−３０７８１号公報に
示したのと同じ条件で、枯草菌（Bacillus subtilis
(B. subtilis)）207-25 株を形質転換し、ブラストサイ
ジンＳ(100 μg/ml)耐性と同時にエリスロマイシン（E
m）(25 μg/ml)耐性を示す形質転換体を選択した。全体
で約 0.5 μg のライゲーション反応液分のDNA を用い
たところ１個の形質転換体が得られた。この形質転換体
からプラスミドを調製して調べると、図９に示す構造を
有していた。本プラスミドを pβ1-TB1R と命名した。

【００５９】本プラスミドを保持する枯草菌207-25(pβ
1-TB1R)株から、接合伝達法によって直接ラクトバチル
ス・デルブルエキ種へプラスミドを導入することはでき
なかった。そこでラクトコッカス・ラクチス(Lc. lacti
s)OLL3024 株（明治乳業株式会社中央研究所保有株）を
受容菌として、特開平6-30781号公報に示したものと同
じ条件で枯草菌207-25 (pβ1-TB1R) 株からプラスミド
の接合伝達を行なった結果、ブラストサイジンＳと同
時にエリスロマイシン耐性を示す接合伝達株が得られ
た。（従って、プラスミド pβ1-TB1R は接合伝達能を
保持していることが示された。）得られた接合伝達株の
１株をラクトコッカス・ラクチスOLL3024 (pβ1-TB1R)
1A株と命名した。

【００６０】［実施例６］ラクトバチルス・デルブルエ
キ種への pβ1-TB1R の接合伝達と接合伝達株の性質次に、ラクトコッカス・ラクチスOLL3024 (pβ1-TB1R)
1A 株を供与菌とし接合伝達法によって、ラクトバチル
ス・デルブルエキ種へ本プラスミドを導入することを試
みた。特開平６−３０７８１号公報と同じ方法で接合伝
達しエリスロマイシン(25 μg/ml) 耐性で選択した結
果、ラクトバチルス・ブルガリカスTS株（明治乳業株式
会社中央研究所保有株）を受容菌として、接合伝達株が
得られた。これらの接合伝達株は、前述の「第１回目の
相同組換え体」に相当するが、これらを調べると、明瞭
なエリスロマイシン耐性(25 μg/ml)を示した。しかし
予想に反してブラストサイジンＳ (50 μg/ml) 耐性は
示さなかった。（この理由は実施例９で推定する。）
尚、他の性質、即ち、菌の形態、糖の資化性、生成乳酸
の旋光性（100% D-型）、生育限界温度など、調べた性
質は、親株の TS 株と同一であった。得られた接合伝達
株のうちの６株をラクトバチルス・ブルガリカス TS::
pβ1-TB1R 4A〜F 株（Int-4A〜F 株と略す）と呼ぶ。

【００６１】ラクトバチルス・ブルガリカスのチミジ
ン要求性を調べるために各種の培地組成について検討し
た結果、表１の組成を持つ「合成（最少）培地」（MMBG
培地と命名）が良好であることが判明した。予備実験
として、MMBG 寒天 (1.5% agar)プレート上に大腸菌 HB
101 及び TG1 株を塗布培養すると生育したが、チミジ
ン要求変異株 HB101thy1 及び TG1thy2 株は生育せず、
チミジン 20μg/ml を添加すると生育した。従って、MM
BG 寒天プレートでチミジン要求性を判定できることが
示された。

【００６２】

【表１】そこで、「課題を解決するための手段」で述べた「第１
回目の相同組換え体」である上記の乳酸菌を、MMBG 寒
天プレート上に塗布し、 GasPak ジャー（BBL）で嫌気
培養（４２℃２日間）した。プレートにチミジン (20μ
g/ml) を添加した場合もしない場合も同様に生育し、各
々の親株と比べて生育に差はなかった。従って、これら
の接合伝達株は、親株と同様にチミジン要求性を示さな
いことが判明した。また、接合伝達株はどれもプラスミ
ドを保持していなかった。これは、接合伝達法によって
導入されたプラスミド pβ1-TB1R がラクトバチルス・
ブルガリカス TS 株染色体に組込まれた、即ち、「第１
回目の相同組換え体」が取得できたことが判明した。

【００６３】［実施例７］形質転換法による結果実施例６では接合伝達法による結果を示したが、「第１
回目の相同組換え体」を得るには、この他に形質転換法
でも可能であった。

【００６４】pAMβ1 は大きいプラスミド (26.5 kb)
であるので、ベクターとして用いる場合、ライゲーショ
ン反応によるプラスミド構築が一般に困難である。そこ
でまず、pAMβ1 を制限酵素で切断して小型化し、より
形質転換効率の良いラクトバチルス・デルブルエキ用組
み込みベクターを作成した。 pβd3 の構築 pAMβ1 を AvaI と BstEII で切断し平滑末端処理をし
た後、ライゲーション反応を行ない、枯草菌207-25 株
を形質転換した。その結果、エリスロマイシン(25 μg/
ml) 耐性を示す形質転換体が取得できた。これらが保持
するプラスミドを調製して調べると、約 11 kb の長さ
で、図１０の制限地図を有することが判明したので、こ
のプラスミドを pβd3 と命名した。 pβd3 をベクターとする「組込みプラスミド」の構
築次に、ベクターである pβd3 を KpnI で切断した後、
平滑末端処理をした。挿入 DNA は、pTSbsr1 プラスミ
ドを制限酵素 EcoRV で切断した後、アガロースゲル電
気泳動にかけ、約 3 kb の DNA 断片を回収・精製した
ものを用いた（実施例５参照）。これらをライゲーシ
ョンし、エリスロマイシン耐性(25 μg/ml)と同時にブ
ラストサイジンＳ(100 μg/ml) 耐性を示す枯草菌207-2
5 株の形質転換体を取得した。ランダムに選んだ３個の
形質転換体よりプラスミドを調製して調べると、全て図
１１に示す制限地図を有していた。このプラスミドを p
βd3-TB1R と命名した。ラクトバチルス・ブルガリカス T-11 株の形質転換
体＝「第１回目の相同組換え体」の取得本 pβd3-TB1R プラスミドを大量に調製し、ラクトバチ
ルス・ブルガリカス T-11 株をエレクトロポレーション
法で形質転換した（特開平６−３０７８１号公報文献１
６参照）。エリスロマイシン(25 μg/ml) 耐性で選択し
た結果、約 2μg の pβd3-TB1R プラスミド DNA を用
いて、合計１２個の形質転換体が得られた。しかし、こ
れらのエリスロマイシン耐性株はプラスミドを保持して
いなかったため、pβd3-TB1R プラスミドは染色体へ組
込まれている（即ち、「第１回目の相同組換え体」が得
られた）と推定された。このうちの４株を、ラクトバチ
ルス・ブルガリカス T-11::pβd3-TB1R 7A〜D 株（Int-
7A〜D 株と略す）と呼ぶ。［実施例８］二重交差による「目的の遺伝子組込み体」
の取得次に、実施例６及び７で得られた「第１回目の相同組換
え体」（Int-4A〜F 株、及びInt-7A〜D 株）を非選択条
件（即ち、抗生物質エリスロマイシンを添加しない）培
地で継代し、細胞の中で自然に第２回目の相同組み換え
を起こし、thyA遺伝子の中に bsr 遺伝子が挿入された
株、即ち、「目的の遺伝子組込み体」を取得しようとし
た。

【００６５】その原理は、図１及び図２に示すように、
「２箇所ある相同部位のうちどちらかで２回目の相同組
換えが起こり、その間に存在するエリスロマイシン耐性
遺伝子を含むベクター DNA 配列が染色体より脱落す
る。この場合、相同組み換えが、最初にプラスミドが挿
入した部位と異なる部位であれば、染色体の thyA 遺伝
子の中に bsr 遺伝子が挿入され、該遺伝子が失活しチ
ミジンを要求するようになる。」というものである。
（勿論、最初と同じ位置で相同組換えが起こる可能性も
あるが、この場合には染色体構造は元の親株と同じもの
に戻り、チミジンを要求しない。）この戦略で実験を進めた。即ち、エリスロマイシン (2
5 μg/ml) を添加したスキムミルク培地で 42 ℃で一晩
培養した「第１回目の相同組換え体」の培養液5 μl を
1 mlのスキムミルク培地（エリスロマイシンを含まな
い）に植菌し、45 ℃で培養した。以後、同様の方法
（培養液 5 μlをエリスロマイシンを含まない 1 ml の
スキムミルク培地に植菌）で継代培養を行なった。

【００６６】非選択条件で数回以上継代を重ねた後、MR
S 寒天プレート上に培養液を塗布し、GasPak で嫌気培
養して単一コロニーを多数得た。これらのうち約２５個
のコロニーを１個ずつ、エリスロマイシン(25 μg/ml)
を添加した MRS 寒天プレートとエリスロマイシンを含
まないプレートに串で植菌し、２日間培養して、エリス
ロマイシン耐性か感受性かを調べた。結果の１例を表２
に示すが、継代したコロニーによってエリスロマイシン
耐性が殆ど脱落しないものもあるが、比較的早くエリス
ロマイシン耐性から感受性に変わって行くクローンもあ
った。

【００６７】次に、エリスロマイシン感受性に変わった
クローンについてチミジンの要求性を調べたが、その結
果を表２に示す。（方法は実施例６と同じ。）継代によ
って出現したエリスロマイシン感受性クローンには、明
確にチミジン要求性を示すものと要求性を示さないもの
とがあった。

【００６８】

【表２】エリスロマイシン感受性と同時にチミジン要求性を示
すものは、「目的の遺伝子組込み体」であると推定され
た。これらのうち、Int-4A 株由来の１株を TSΔthy 4D
-4 株、Int-7A 株由来の１株を T-11Δthy #1 株と命名
した。［実施例９］サザンハイブリダイゼーションによる「目
的の遺伝子組込み体」染色体 DNA の解析次に、実施例６、７、８で得られた「第１回目の相同組
換え体」、「遺伝子組込み体」及び、各々の親株の、チ
ミジン合成酵素遺伝子近傍の染色体構造を比較した。実
施例１と同じ方法で各株の染色体 DNA を調製し、制限
酵素 EcoRI で切断した後、アガロースゲル電気泳動に
かけた。サザンハイブリダイゼーションのプローブとし
て４種類の DNA 断片を用いた。即ち、thyA 遺伝子の一
部を含む２断片、プラスミド pTSbsr1 の制限酵素
PvuII 切断断片（約 0.4 kb; T1 と略す）及び pTSbs
r1 の制限酵素 HindIII 切断断片（約 0.5 kb; T2 と略
す）エリスロマイシン耐性遺伝子の一部（プラスミ
ド pSYE2 の制限酵素 ScaI-EcoRI 切断断片約 0.4 k
b） bsr 遺伝子の一部（プラスミド p8BS1 の制限酵
素 BglII-EcoRI 切断断片約 0.4 kb）の合計４ DNA 断
片を精製した。これらのDNA 断片を放射能（³²P）ラベ
ルした後、プローブとして用いてサザンハイブリダイゼ
ーションを行った。陽性シグナルを示す DNA 断片の長
さを解析したが、その結果を表３に示す。

【００６９】

【表３】これらの結果から、まず、親株のラクトバチルス・ブ
ルガリカス TS 株では、thyA 遺伝子は約 11 kb の Eco
RI 断片中に存在することが推定された。親株では、エ
リスロマイシン遺伝子、及びbsr遺伝子は存在しないこ
とが確認された。

【００７０】次に、「第１回目の相同組換え体」 Int-4
A 株では、エリスロマイシン遺伝子、及びbsr遺伝子が
各々１コピーずつ存在し、且つ、元々の thyA 遺伝子の
他にプラスミド由来の thyA 遺伝子も存在することか
ら、１コピーの pβ1-TB1R プラスミドが染色体 thyA
遺伝子部位に組込まれていることが分かった。（尚、こ
れらの株はエリスロマイシン耐性を示すが、bsr 遺伝子
が存在するにも拘らず明確なブラストサイジンＳ耐性は
示さない。これは、pSYBS1 プラスミドで複数コピーの
bsr遺伝子を導入した時とは異なる結果である。従っ
て、bsr遺伝子が明確な耐性を発現するのには、エリス
ロマイシン耐性遺伝子と異なり、１コピーでは十分では
ないことが示唆された。）更に、「目的の遺伝子組込み体」 TSΔthy 4D-4 株に
は、エリスロマイシン耐性遺伝子が存在せず、thyA 遺
伝子の中にbsr遺伝子のみが挿入されていることが判明
した。EcoRI で切断した各断片の長さを計算すると、こ
れらの株の染色体では、thyA 遺伝子の中にbsr遺伝子の
みが挿入され、組み込みプラスミド由来のベクター部分
は脱落していることが判明した。即ち、組み込みの標的
部位である thyA 遺伝子に、挿入を計画したbsr遺伝子
のみを組込むことに成功したことになる。

【００７１】以上の結果より推定される、各株の thyA
遺伝子近傍の染色体構造を図１２に示した。（尚、実施
例７で記載した形質転換法によって得られた「第１回目
の相同組換え体」Int-7A 株及び、それを継代培養して
得られた「目的の遺伝子組込み体」 T-11Δthy#1 株のt
hyA 遺伝子近傍の染色体構造を同様の方法で比較した。
その結果、Int-7A 株の染色体には、pβd3-TB1R プラス
ミドが１コピー thyA部位に組込まれており、 T-11Δth
y#1 株染色体では、エリスロマイシン耐性遺伝子が存在
せず、thyA 遺伝子の中にbsr遺伝子のみが挿入されてい
ることが判明し、基本的に同一の結果となった。）以上、チミジン合成酵素遺伝子を例として実施例を示し
たが、本発明即ち、「栄養素合成酵素遺伝子を標的部位
とする乳酸菌染色体への遺伝子組込み法」によって、容
易に且つ確実に、「目的の遺伝子組込み体」を選別する
ことが可能であることが示された。

【００７２】尚、pβ1-TB1R 及び pβd3-TB1R を SmaI
で切断すると、挿入した bsr 遺伝子のみが完全に切り
出される。従って、ここに他の外来遺伝子を挿入する
と、実施例で示したのと同じ過程で、その遺伝子のみを
染色体のチミジン合成酵素遺伝子部位に組み込むことが
できる。

【００７３】

【発明の効果】本発明では、食品微生物の栄養素合成素
遺伝子領域に相同組換えによる二重交叉方法を用いて遺
伝子を導入することにより、該遺伝子領域を失活させ、
該微生物の栄養要求性の変化に基づいて、目的の遺伝子
が組込まれ、かつベクター由来の他の外来遺伝子や選択
マーカーを含まない形質転換体を簡便かつ正確に選別で
きる。

【００７４】この方法によれば、導入しようとする遺伝
子を産業目的に応じて選択することにより、食品・飼料
はもちろん医薬品などの生産に応用することも可能であ
り、また微生物をより良い形質を持つよう育種すること
も可能である。

【００７５】

【配列表】

配列番号 : 1 配列の長さ : 1426 配列の型 : 核酸鎖の数 : 二本鎖トポロジー : 直鎖状配列の種類 : Genomic DNA 起源生物名：Lactobacillus delbrueckii subsp. b
ulgaricus 株名：M-878 配列 GATATCGAGC GGACCCTGTC CGGGAAAAAA GGCCTTTTTC AAGGTGAATT AGCGAAAAAG 60 CAGTAAAATA AAGCGAAAAA TGAAGAACAT AGACAAGCAC TGGCAGGCTA ATCCTGCCGG 120 GGCTTTTTCC ATCTGTTAAG CTTTTTGTAA AGATTAACAC CCGGTAAAAA AATCTGTTAG 180 ACTTAAGGTG AACTGAAGTA AAAAGTTTTT GCAAAGGACA AGGAA ATG GCA AAT CAA 237 Met Ala Asn Gln 1 GAC CAA GCA TAT TTA GAT TTA CTG AAA AAG ATC ATG ACG GAA GGC AAT 285 Asp Gln Ala Tyr Leu Asp Leu Leu Lys Lys Ile Met Thr Glu Gly Asn 5 10 15 20 GAC AAA AAT GCT CCG GCC CGG ACC GGG ACG GGG ACC AGA AGC CTC TTT 333 Asp Lys Asn Ala Pro Ala Arg Thr Gly Thr Gly Thr Arg Ser Leu Phe 25 30 35 GGG GCC CAG ATG CGC TTT GAC TTA AGC CAG GGC TTC CCG ATC TTG ACG 381 Gly Ala Gln Met Arg Phe Asp Leu Ser Gln Gly Phe Pro Ile Leu Thr 40 45 50 ACC AAG AGG GTG CCT TTC GGC CTG ATC AAG AGC GAG CTT TTG TGG TTC 429 Thr Lys Arg Val Pro Phe Gly Leu Ile Lys Ser Glu Leu Leu Trp Phe 55 60 65 TTG CGG GGG GAC ACC AAC ATC CGT TTC TTG CTT GAA CAT AAA AAC CAC 477 Leu Arg Gly Asp Thr Asn Ile Arg Phe Leu Leu Glu His Lys Asn His 70 75 80 ATT TGG GAC GAA TGG GCC TTT AAA AAT TGG GTG ACC AGC CCG GAA TAC 525 Ile Trp Asp Glu Trp Ala Phe Lys Asn Trp Val Thr Ser Pro Glu Tyr 85 90 95 100 CAG GGC CCG GAC ATG ACT GAT TTT GGC CTT AGG AGT CAA AAG GAC CCA 573 Gln Gly Pro Asp Met Thr Asp Phe Gly Leu Arg Ser Gln Lys Asp Pro 105 110 115 GGG TTT AAG GCA GTC TAT GAC GAA GAA ATG CAA AAG TTC TGC CAG CGG 621 Gly Phe Lys Ala Val Tyr Asp Glu Glu Met Gln Lys Phe Cys Gln Arg 120 125 130 ATT TTG GAT GAT GAA GCT TTT GCC CAA AAA TAC GGC AAC CTG GGC GAT 669 Ile Leu Asp Asp Glu Ala Phe Ala Gln Lys Tyr Gly Asn Leu Gly Asp 135 140 145 GTC TAT GGG GCC CAG TGC GGC ACT GGG GTA AGC GGG ACG GCG GCT TTA 717 Val Tyr Gly Ala Gln Cys Gly Thr Gly Val Ser Gly Thr Ala Ala Leu 150 155 160 TCG ACC AGA TCG CGG ACT GTG ATT GAG CAG ATC AAG ACC AAT CCC GAC 765 Ser Thr Arg Ser Arg Thr Val Ile Glu Gln Ile Lys Thr Asn Pro Asp 165 170 175 180 TCC CGC CGC TTG ATC GTA ACG GCA TGG AAC CCG GAA GAC GTT CCT TCC 813 Ser Arg Arg Leu Ile Val Thr Ala Trp Asn Pro Glu Asp Val Pro Ser 185 190 195 AGC GCC CTG CCG CCG TGC CAT GTC CTC TTC CAG TTT TAC GTG GCT GAC 861 Ser Ala Leu Pro Pro Cys His Val Leu Phe Gln Phe Tyr Val Ala Asp 200 205 210 GGC AAG CTC AGC TTG CAG CTT TAC CAG CGC TCA GGC GAC ATG TTC TTA 909 Gly Lys Leu Ser Leu Gln Leu Tyr Gln Arg Ser Gly Asp Met Phe Leu 215 220 225 GGC GTG CCC TTC AAC ATT GCC AGC TAC TCT TTG CTC TTG TCC TTG ATT 957 Gly Val Pro Phe Asn Ile Ala Ser Tyr Ser Leu Leu Leu Ser Leu Ile 230 235 240 GCC CGG GAG ACC GGC CTG GAA GTG GGC GAG TTT GTG CAT ACT ATT GGG 1005 Ala Arg Glu Thr Gly Leu Glu Val Gly Glu Phe Val His Thr Ile Gly 245 250 255 260 GAT GCC CAC ATT TAC AAG AAC CAC TTT GCC CAA GTG GAA GAG CAG CTG 1053 Asp Ala His Ile Tyr Lys Asn His Phe Ala Gln Val Glu Glu Gln Leu 265 270 275 AAA AGA AAG CCG TTT GAC GCG CCA ACT TTG TGG CTG AAT CCA GGG AAG 1101 Lys Arg Lys Pro Phe Asp Ala Pro Thr Leu Trp Leu Asn Pro Gly Lys 280 285 290 AAA AAA GTA GCT GAT TTT GAA ATG GCT GAT ATT AAA TTG GTC AAC TAC 1149 Lys Lys Val Ala Asp Phe Glu Met Ala Asp Ile Lys Leu Val Asn Tyr 295 300 305 CAG CAC GGG TCT ACA ATC AAG GCC CCG GTT GCC GTT TAGAAAGGGT 1195 Gln His Gly Ser Thr Ile Lys Ala Pro Val Ala Val 310 315 320 GAAGAAATGC TTAGCTACGT TTGGGCAGAA GATGAAAAAG GCGCCATTGG CTACCAGGGC 1255 CGCCTGCCCT GGCACCTGCC GGCAGATTTA GCCCATTTTA AGGCAAAAAC CATGGGCCAC 1315 CCCATGCTGA TGGGAAGAAA GACTTTTGAG TCCTTGCCGG GCCTGTTGCC TGGCCGGCAG 1375 CATGTCGTCC TTTCCACCAG GAAATTAGAC CTGCCAGCTG GGGTTCTGCA G 1426 配列番号 : ２配列の長さ : 1760 配列の型 : 核酸鎖の数 : 二本鎖トポロジー : 直鎖状配列の種類 : Genomic DNA 起源生物名：Streptococcus thermophilus 株名：ATCC 19258 配列 GATATCTTCT GTAATTGGTG TAATGCTGGT TGCATCAAGC ATCAGCCCCT TGCTGAATTT 60 TTCAGGATCC ACCCCTCGAG CAAGAGCAAG ATCCGCCATG TTTAGAACAT ATTGACTGGT 120 CGCAAACCCA ATCTTGTCAA TTCCAATAGA CATATGATGT TTCCTTTTAT TCTTCATTGT 180 AAAGTATCCA GAGGATACTA ATATATAGTG ATTTTACCAT AAAAAAGAGC TTTCGCCTTG 240 AAAAAAACTC TGATAGTTAG TAACACTTTA TTTTTTGATA TGAACTAGAG GATTTCAAAA 300 GATGTAGTTT TGGTAATCCC ATAGCTTTTA GTTCTCATTT GCACCAGAAT AAGGTAAAAT 360 AAAAATGAAA AGCAACATTA TTTACAGCTA TAATTAGATA AGCAAAGTTA TTTCCATCTA 420 TATGTTACGA GTATTAAGTG AGACTTTGTT TTCAATGGAA TAAAGAGGAA AATC ATG 477 Met 1 ACG AAA GCA GAC ACT ATT TTT AAA GAA AAT ATC ACT AAA ATC ATG GAA 525 Thr Lys Ala Asp Thr Ile Phe Lys Glu Asn Ile Thr Lys Ile Met Glu 5 10 15 GAG GGA GTT TGG TCA GAG CAA GCA CGT CCT AAA TAC AAG GAT GGC ACA 573 Glu Gly Val Trp Ser Glu Gln Ala Arg Pro Lys Tyr Lys Asp Gly Thr 20 25 30 ACA GCC AAT TCC AAA TAC ATC ACA GGG TCT TTT GCA GAA TAT GAT TTG 621 Thr Ala Asn Ser Lys Tyr Ile Thr Gly Ser Phe Ala Glu Tyr Asp Leu 35 40 45 AGC AAG GGA GAG TTT CCA ATT ACG ACT CTG CGT CCC ATT GCT ATC AAA 669 Ser Lys Gly Glu Phe Pro Ile Thr Thr Leu Arg Pro Ile Ala Ile Lys 50 55 60 65 TCT GCC ATC AAA GAA GTG TTC TGG ATC TAT CAA GAC CAG ACA AAT AGC 717 Ser Ala Ile Lys Glu Val Phe Trp Ile Tyr Gln Asp Gln Thr Asn Ser 70 75 80 CTA GAT GTG CTT GAA GAT AAG TAT AAT GTT CAT TAT TGG AAT GAC TGG 765 Leu Asp Val Leu Glu Asp Lys Tyr Asn Val His Tyr Trp Asn Asp Trp 85 90 95 GAA GTT GAA GGC GTC CCT GCT AAT AAT GGG GAC AAG CGT TCA ATC GGT 813 Glu Val Glu Gly Val Pro Ala Asn Asn Gly Asp Lys Arg Ser Ile Gly 100 105 110 CAG CGT TAT GGG GCA GTC GTT AAG AAG CAC GAT ATT ATT AAT CGT TTG 861 Gln Arg Tyr Gly Ala Val Val Lys Lys His Asp Ile Ile Asn Arg Leu 115 120 125 TTA GCA CAG TTA GAA GCC AAT CCT TGG AAT CGC CGT AAT GTC ATT TCC 909 Leu Ala Gln Leu Glu Ala Asn Pro Trp Asn Arg Arg Asn Val Ile Ser 130 135 140 145 CTT TGG GAT TAC GAG GCC TTC GAG GAG ACA GCT GGA CTT CAG CCT TGC 957 Leu Trp Asp Tyr Glu Ala Phe Glu Glu Thr Ala Gly Leu Gln Pro Cys 150 155 160 GCC TTC CAG ACC ATG TTT GAT GTT CGT CGT GTG GGT GAG GAC GTT TAT 1005 Ala Phe Gln Thr Met Phe Asp Val Arg Arg Val Gly Glu Asp Val Tyr 165 170 175 TTG GAT GCC ACT TTG ACG CAG CGC TCA AAC GAT ATG TTG GTG GCC CAT 1053 Leu Asp Ala Thr Leu Thr Gln Arg Ser Asn Asp Met Leu Val Ala His 180 185 190 CAC ATT AAT GCT ATG CAG TAT GTG GCA CTT CAG ATG ATG ATT GCC AAG 1101 His Ile Asn Ala Met Gln Tyr Val Ala Leu Gln Met Met Ile Ala Lys 195 200 205 CAT TTT GGT TGG AAA GTT GGT AAA TTC TTT TAT TTC ATC AAC AAC CTC 1149 His Phe Gly Trp Lys Val Gly Lys Phe Phe Tyr Phe Ile Asn Asn Leu 210 215 220 225 CAT ATC TAT GAC AAT CAA TTT GAA CAA GCT GAG GAA CTC CTC AAG CGT 1197 His Ile Tyr Asp Asn Gln Phe Glu Gln Ala Glu Glu Leu Leu Lys Arg 230 235 240 CAG CCG TCT GAT TGT CAA CCA CGC TTG GTC CTC AAT GTT CCT GAT GAA 1245 Gln Pro Ser Asp Cys Gln Pro Arg Leu Val Leu Asn Val Pro Asp Glu 245 250 255 ACT AAT TTC TTT GAT ATC AAA CCA GAA GAT TTT GAA TTG GTG GAC TAT 1293 Thr Asn Phe Phe Asp Ile Lys Pro Glu Asp Phe Glu Leu Val Asp Tyr 260 265 270 TAT CCT GTT AAA CCT CAA CTC AAA TTT GAC TTA GCA ATT TAA 1335 Tyr Pro Val Lys Pro Gln Leu Lys Phe Asp Leu Ala Ile 275 280 285 TAAATGCTTA TGATTTAAGC CCATAAAGAG CTGGCAAAGT TTTTCCAAGC TCTTTTTGTC 1395 TTTTTTTGTT AGAATGGATT GTAAACTTAT AAAGAAAAGG AAATACCGTG TCTAAACAAA 1455 TCATTGCTAT TTGGGCGGAA GCTCGTAACC ATGTTATTGG GAAGAATCAC ACCATGCCGT 1515 GGCACTTGCC TGCTGAACTG GCACATTTCA AGAAAACGAC CATGGGTTCA GCAATTCTTA 1575 TGGGACGTGT GACCTTTGAT GGCATGAACC GTCGTTGCCT CCCAGGACGT GAAACCTTAA 1635 TTCTAACACG AGACAAGGAC TTCGACTGTG AGGAAGTAAC GACCGTTACG AGTGTTGAGG 1695 AAGCTCTAGC TTGGTTTGAA CAGCAAGATA AGGATCTCTA TATTGCTGGT GGTGCTAGTG 1755 TCTAC 1760

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の概略を示す図である。１）２）：導入しようとする「目的の遺伝子」を、栄養
素合成遺伝子に挿入して、該合成活性を失活した DNA
断片を取得する。３）：上記該 DNA 断片を、組込みベクターに挿入して
「組込みプラスミド」を構築する。４）：該「組込みプラスミド」を宿主食品微生物に導入
する。（導入方法は、宿主の菌株に最適な方法、例え
ば、形質転換法、接合伝達法などで行なう。）「第１回
目の相同組み換え体」は、プラスミド上の選択マーカー
遺伝子の発現により選択する。宿主染色体と「組込みプ
ラスミド」には２箇所の相同部位が存在するので、図の
様に、２種類の染色体構造を有する「第１回目の相同組
み換え体」が生成すると考えられる。

【図２】本発明の概略を示す図である。なお、図２は図
１の続きの図である。５）：非選択条件下での培養によって、２回目の相同組
み換えが生じる。 (1). １回目と同じ部位で２回目の相同組み換えが生じ
ると、染色体構造が宿主（親株）と同一（復帰株）とな
る。 (2). １回目と異なる部位で２回目の相同組み換えが生
じると、導入しようとした「目的の遺伝子」のみが、染
色体の該栄養素合成酵素遺伝子の中に挿入されて、「目
的の遺伝子組込み体」が得られる。

【図３】pBBTS1の構造を示す図である。なお、図中「A
p」はβ−ラクタマーゼ遺伝子（beta-lactamase gene）
即ちアンピシリン耐性遺伝子を、「ORI」はプラスミド
の複製起点を、「thyA」はチミジン合成遺伝子（thymid
ylate synthase gene）を示す。pBBTS1はラクトバチル
ス・ブルガリカス M-878 株染色体 DNA を MboI で部分
分解し、得られた約 2kb断片をpBR322 に挿入して構築
したプラスミドであり、大腸菌の thyA 変異を相補す
る。

【図４】pBSTS1の構造を示す図である。なお、図中「A
p」はβ−ラクタマーゼ遺伝子（beta-lactamase gene）
即ちアンピシリン耐性遺伝子を、「ORI」はプラスミド
の複製起点を、「thyA」はチミジン合成遺伝子（thymid
ylate synthase gene）を示す。pBSTS1 は、ストレプト
コッカス・サーモフィラス (S. thermophilus) ATCC 19
258 株染色体 DNA を HindIII で分解し、得られた約 4
kb 断片をpBR322 に挿入して構築したプラスミドであ
る。大腸菌の thyA 変異を相補する。

【図５】ストレプトコッカス・サーモフィラス(S. ther
mophilus) ATCC 19258 株染色体 thyA 遺伝子近傍の制
限酵素地図を示す。塩基配列決定によって解明した制限
酵素地図、および thyA 遺伝子（ST thyA）の位置と転
写方向を太矢印で示す。

【図６】pSYBS1の構造を示す図である。なお、図中
「（erm）」はエリスロマイシン耐性遺伝子（erythrom
ycin resistance gene）のプロモーターを含む配列を、
「bsr」はブラストサイジンＳ耐性遺伝子（blasticidin
S resistance gene）を示す。pSYBS1は、pSV2bsr プラ
スミドの HindIII 断片約 450 bp を平滑末端処理した
後、pSYE2プラスミド ScaI 断片約 3.2 kb に挿入して
構築したプラスミドである。ブラストサイジンＳ耐性
を示す。

【図７】p8BS1の構築過程を示す図である。なお、図
中、「bsr」はブラストサイジンＳ耐性遺伝子（blasti
cidin S resistance gene）を、「MCS」はマルチクロー
ニングサイトを、「Ap」はβ−ラクタマーゼ遺伝子（be
ta-lactamase gene）即ちアンピシリン耐性遺伝子を、
「ori」はプラスミドの複製起点を示す。 pSYBS1プラ
スミドを鋳型として、両端に HindIII 及び EcoRI 認識
部位が存在するように Blasticidin S (BS) 耐性遺伝
子 (bsr) を含む約 0.8 kb の DNA 断片を PCR (polyme
rase chain reaction)法で増幅した。一方、pUC118 プ
ラスミドを、HindIII と ScaI、及び、EcoRI と ScaI
で double digestion した DNA 断片を各々調製した。
これら３ DNA 断片をライゲーションした後、ブラスト
サイジンＳ (100 μg/ml) とアンピシリン(50 μg/ml)
を添加した LB 寒天培地プレート上で生育する大腸菌
の形質転換体を取得した。これらの形質転換体が保持す
るプラスミドの制限地図を調べた結果、ブラストサイジ
ンＳ耐性遺伝子 (bsr) の両端に pUC118 由来の MCS
(multiple cloning site) が、同一方向に結合した構
造を示すことが判明した。この「bsr カセット」プラス
ミドを p8BS1 と命名した。

【図８】pTSbsr1の構造を示す図である。なお、図中、
「bsr」はブラストサイジンＳ耐性遺伝子（blasticidi
n S resistance gene）を、「Ap」はβ−ラクタマーゼ
遺伝子（beta-lactamase gene）即ちアンピシリン耐性
遺伝子を、「ori」はプラスミドの複製起点を示す。pTS
bsr1は、pBBTS1 プラスミド（図３）の SmaI 部位に、p
8BS1 プラスミドをSmaI で切断した得られた bsr カセ
ット（約 0.8 kb）を挿入して得られたプラスミドであ
る。大腸菌の thyA 変異を相補する活性は無い。

【図９】pβ1-TB1Rの構造を示す図である。なお、図中
「erm」はエリスロマイシン耐性遺伝子（erythromycin
resistance gene）を「bsr」はブラストサイジンＳ耐
性遺伝子（blasticidin S resistance gene）を示す。p
β1-TB1Rは、pTSbsr1 プラスミドの EcoRV 切断断片
（約 3 kb）を、AvaI 切断後平滑末端処理した pAMβ1
プラスミドに挿入して構築した「組込みプラスミド」で
ある。

【図１０】pβd3の構造を示す図である。なお、図中「e
rm」はエリスロマイシン耐性遺伝子（erythromycin re
sistance gene）を示す。pβd3は、pAMβ1 プラスミド
を AvaI と BstEII で切断した後、約 11 kb のDNA 断
片を分離調製し、平滑末端処理した後、自己環状化して
構築したプラスミドである。

【図１１】pβd3-TB1Rの構造を示す図である。なお、図
中「erm」はエリスロマイシン耐性遺伝子（erythromyc
in resistance gene）を、「bsr」はブラストサイジン
Ｓ耐性遺伝子（blasticidin S resistance gene）を示
す。pβd3-TB1Rは、pTSbsr1 プラスミドの EcoRV 切断
断片（約 3 kb）を、KpnI切断後平滑末端処理した pβd
3 プラスミドに挿入して構築した「組込みプラスミド」
である。

【図１２】推定される染色体構造を示す図である。な
お、図中「erm」はエリスロマイシン耐性遺伝子（eryt
hromycin resistance gene）を、「bsr」はブラストサ
イジンＳ耐性遺伝子（blasticidin S resistance gen
e）を、「thyA」はチミジン合成遺伝子（thymidylate
synthase gene）を示す。pβ1-TB1R プラスミドの接合
伝達によってラクトバチルス・ブルガリカス TS 株
（親株）から得られた「第１回目の相同組換え体」と、
更にそれから得られた「遺伝子組込み体」染色体の推定
構造を示す。サザンハイブリダイゼーションの結果（表
３）から、ハイブリダイゼーション陽性の EcoRI 切断
断片の長さをもとに推定した。「第１回目の相同組換え
体」 (Int-4) 染色体には１コピーのpβ1-TB1R プラス
ミドが thyA 部位に組込まれ、２度目の相同組換えによ
って「遺伝子組込み体」 (4D-A) 染色体では bsr のみ
が thyA に挿入されて thyA を切断しているが、ベクタ
ーは残存していない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｎ 9/88 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:225） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:225） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:46） (72)発明者松尾公美東京都東村山市栄町１丁目21番３号明治乳業株式会社中央研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】食品微生物の染色体中に外来遺伝子を導
入する方法において、「ベクター中に存在する該外来遺
伝子の挿入によって不活化された該微生物由来の栄養素
合成遺伝子領域」と「該微生物の染色体上の栄養素合成
遺伝子領域」との間の相同的組換えによって、外来遺伝
子を該微生物の染色体中に導入することを特徴とする方
法。
【請求項２】請求項１に記載の方法において、外来遺
伝子が染色体中に導入された微生物を、栄養要求性に基
づいて選択することを特徴とする方法。
【請求項３】請求項１または２に記載の方法におい
て、「ベクター中に存在する外来遺伝子の挿入によって
不活化された栄養素合成遺伝子領域」と「染色体上の栄
養素合成遺伝子領域」との間の第１回目の相同的組換え
によって生じた組換え体を選択したのち、「染色体中に
組み込まれた栄養素合成遺伝子領域」と「もともと染色
体上に存在していた栄養素合成遺伝子領域」との間の第
２回目の相同的組換えによって生じた組換え体のうち外
来遺伝子が染色体上に残存しているものを栄養要求性を
指標に選択することを特徴とする方法。
【請求項４】請求項３に記載の方法において、第１回
目の相同的組換えによって生じた組換え体を選択し、選
択した組換え体をベクター中の選択マーカー遺伝子の発
現を要しない培養条件下で継代培養したのちに、第２回
目の相同的組換えによって生じた組換え体の選択を行う
ことを特徴とする方法。
【請求項５】食品微生物が、乳酸菌、枯草菌、酢酸
菌、酵母または糸状菌のいずれかである、請求項１〜４
のいずれかに記載の方法。
【請求項６】食品微生物が乳酸菌である、請求項１〜
４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】栄養素合成遺伝子がチミジン合成酵素遺
伝子であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか
に記載の方法。
【請求項８】チミジン合成酵素遺伝子が、ラクトバチ
ルス・デルブルエキ（Lactobacillus delbrueckii）ま
たはストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococ
cus thermpohilus）由来である、請求項７記載の方法。
【請求項９】ベクターとして接合伝達性プラスミドを
用いることを特徴とする請求項１〜８いずれかに記載の
方法。
【請求項１０】抗生物質耐性遺伝子以外の外来遺伝子
の挿入によって不活化された食品微生物由来の栄養素合
成遺伝子領域を含むことを特徴とするベクター。
【請求項１１】栄養素合成遺伝子がチミジン合成酵素
遺伝子であることを特徴とする請求項１０記載のベクタ
ー。
【請求項１２】チミジン合成酵素遺伝子が、ラクトバ
チルス・デルブルエキ（Lactobacillus delbrueckii）
またはストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptoc
occus thermophilus）由来であることを特徴とする、請
求項１１記載のベクター。
【請求項１３】請求項１０〜１２のいずれかに記載の
ベクターを食品微生物に導入することによって起きる、
ベクターと該微生物染色体との間の相同的組換えの結果
得られる形質転換体。
【請求項１４】食品微生物が、乳酸菌、枯草菌、酢酸
菌、酵母または糸状菌のいずれかである、請求項１３に
記載の形質転換体。
【請求項１５】ラクトバチルス・デルブルエキ（Lact
obacillus delbrueckii）由来のチミジン合成酵素遺伝
子からなる選択マーカー。
【請求項１６】ストレプトコッカス・サーモフィラス
（Streptococcus thermophilus）由来のチミジン合成酵
素遺伝子からなる選択マーカー。