JPH10262670A - ビフィズス菌用シャトルベクター及びビフィズス菌プラスミドの複製タンパク質遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ビフィズス菌の広範囲の種において発現可能
であり、操作時の取り扱いも容易な新規なビフィズス菌
用シャトルベクターを得る。 【解決手段】 ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifi
dobacterium breve ）ATCC 15698株のプラスミドｐＮＢ
ｂ１由来の複製必須領域と、大腸菌（Escherichia col
i）のプラスミド由来の複製必須領域と、大腸菌（Esche
richia coli）のプラスミド由来の抗生物質耐性遺伝子
と、ビフィズス菌で機能する抗生物質耐性遺伝子とを備
えたもの。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ビフィズス菌と大
腸菌とにおいて複製可能な新規のビフィズス菌用シャト
ルベクター及びビフィズス菌プラスミドの複製タンパク
質遺伝子に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】一般に、インビトロ（in vitro）の遺伝
子操作においては、所望の外来遺伝子を宿主細胞内に移
入させ、その遺伝子情報を発現させることのできる、宿
主細胞に適合したベクターを使用することが必要とされ
る。

【０００３】遺伝的な知見が集積していた大腸菌や枯草
菌、酵母などでは、早くからベクターの開発が進めら
れ、今日では一般的な遺伝子クローニングシステムとし
て確立されている。これら以外にも放線菌、動植物の培
養細胞、乳酸菌等で各種のベクターが実用化されている
が、ビフィズス菌のように開発の遅れているものもあ
る。

【０００４】ところで、ベクターとしての必須条件が、
次の(1) 及び(2) の存在であることが知られている。 (1) 自己複製に必要な遺伝子配列、(2) 外来遺伝子を挿
入するための制限酵素の認識切断部位、

【０００５】更に実用化のためには、例えば遺伝子操作
を可能にし、且つ容易にするために、次の(3) 〜(8) 等
の種々の条件を全て満たすような厳しい特性が要請され
ている。(3) 形質転換体の検出等に必要なマーカー遺伝
子の存在、(4) 利用可能な制限酵素の種類とその認識切
断部位の多様性、(5) 形質発現の高効率性、(6) 宿主細
胞との適合性と宿主域、(7) 宿主細胞内での安定性、
(8) 仮想される生物封じ込めに対する適応性、

【０００６】前記のような特性を有する遺伝子操作にお
けるベクターに関しては、前述のように研究例の多い大
腸菌（E.coli）の宿主−ベクター系にて最もよく開発さ
れているが、大腸菌以外の微生物、例えば工業的に有用
な微生物である枯草菌、抗生物質の生産菌である放線
菌、醸造分野で広く利用されている酵母等に関しても、
宿主−ベクター系の開発研究が活発に行われているとこ
ろである。

【０００７】しかしながら、食品，医薬品，飼料等に利
用されているビフィズス菌においての宿主−ベクター系
の研究開発は依然として遅れているのが現状である。こ
れは、ビフィズス菌が嫌気性菌であるために取り扱いが
煩雑なこと、遺伝子組換え操作に使用することができる
ビフィズス菌由来のプラスミドや選択マーカーとして利
用できる遺伝子の研究が少ないためである。

【０００８】一方、微生物に外来ＤＮＡを導入する方法
については、エンテロコッカス・フェカリス由来で広宿
主域で接合伝達可能な公知のプラスミドｐＡＭβ１がビ
フィドバクテリウム属に属する１菌株に導入され、導入
されたｐＡＭβ１のエリスロマイシン耐性遺伝子が、こ
のビフィドバクテリウム属に属する微生物で発現すると
の報告がある（特開平２−１０７１９２号公報）。しか
し、ｐＡＭβ１自身のＤＮＡサイズが２６．５ｋｂと大
きく、導入頻度が著しく低いため、そのままではプラス
ミドベクターとしての使用が難しいという欠点があっ
た。

【０００９】また、近年になって、僅かであるがビフィ
ズス菌のプラスミドの検索が進み、特開昭６３−１２３
３８４号公報、特開平５−１３０８７６号公報、特開平
７−２５５４８１号公報等でプラスミドベクターが作成
されている。

【００１０】しかしながら、これらはビフィズス菌ベク
ターとしての構造体を形作ってはいるものの、実際にビ
フィズス菌に導入が報告されているプラスミドベクター
としては、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidoba
cterium longum）Ｂ2577から分離されたｐＭＢ１（Joun
al of General Microbiology,128,2121-2131,1982 ）を
材料として作成されたｐＤＧ７（Letters in Applied M
icrobiology,11,220-223,1990 ）と、ｐＲＭ２（Plasmi
d,32,208-211,1994 ）との報告だけである。

【００１１】最初にビフィズス菌の形質転換に成功した
のは、ｐＲＭ２であるが、ビフィドバクテリウム・ロン
ガムに１μｇＤＮＡあたり、３．８×１０² という低頻
度であった。また、ｐＤＧ７については、作成された当
初は、これを用いてビフィズス菌を形質転換することは
できなかった。しかし、その後、形質転換に使用するビ
フィズス菌を４℃の特定のバッファー中で長時間インキ
ュベーションした後に、エレクトロポレーションを行う
ことで、ｐＤＧ７でビフィズス菌が形質転換できること
が報告された（ＥＰ−９４２０１７４６，Microbiolog
y,142,109-114,1996 ）。ｐＤＧ７を用いたこの形質転
換法は、種々のビフィズス菌を形質転換できるが、エレ
クトロポレーションに用いるビフィズス菌細胞の調製に
時間と手間とが必要である等の欠点もある。

【００１２】一方、この他にもビフィズス菌からの単離
されているプラスミドとして、文献（Letters in Appli
ed Microbiology,9,165-168,1989）のものや、更には、
FEMSMicrobiology Letters 110,11-20,1993) において
開示されているビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.br
eve ）由来のプラスミドｐＮＢｂ１等があるが、これら
を材料として未だ好適な宿主−ベクター系を構築した例
はない。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明はビフ
ィズス菌の広範囲の種において発現可能であり、操作時
の取り扱いも容易な新規なビフィズス菌用シャトルベク
ターを得ることを目的とし、更にベクターをビフィズス
菌で複製させるビフィズス菌プラスミドの複製タンパク
質遺伝子を得ることを目的とする。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本請求項１に記載された
発明に係るビフィズス菌用シャトルベクターでは、ビフ
ィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve
）ATCC 15698株のプラスミドｐＮＢｂ１由来の複製必
須領域と、大腸菌（Escherichia coli）のプラスミド由
来の複製必須領域と、大腸菌（Escherichia coli）のプ
ラスミド由来の抗生物質耐性遺伝子と、ビフィズス菌で
機能する抗生物質耐性遺伝子とを備えたものである。

【００１５】本請求項２に記載された発明に係るビフィ
ズス菌用シャトルベクターでは、請求項１に記載された
大腸菌（E.coli）由来のプラスミドが、ｐＡＣＹＣ１１
７又はｐＵＣ１１８である。

【００１６】本請求項３に記載された発明に係るビフィ
ズス菌用シャトルベクターでは、請求項１に記載された
ビフィズス菌で機能する抗生物質耐性遺伝子が、サッカ
ロポリスポラ・エリスレア（S.erythraea ）JCM 4748(A
TCC 11635)株のエリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍ
Ｅ）又はエンテロコッカス・フェカーリス（E.faecali
s）のエリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＡＭ）であ
る。

【００１７】本請求項４に記載された発明に係るビフィ
ズス菌用シャトルベクターでは、次の化６〜化１０の何
れかの制限酵素地図で表わされたものである。

【化６】

【化７】

【化８】

【化９】

【化１０】

【００１８】本請求項５に記載されたビフィズス菌プラ
スミドの複製タンパク質遺伝子は、次のアミノ酸配列を
コードする遺伝子である。 Met-Ser-Val-Pro-Thr-Gln-Gly-Thr-Lys-Trp-Asn-Pro-Me
t-Gly-Val-Pro-Ser-Pro-Ser-Gln-His-Gln-Thr-Ala-Glu-
Arg-Leu-His-Ala-Ala-Val-Ala-Ala-Lys-Pro-Gln-Gly-Va
l-Ala-Ala-Glu-Ala-Ala-Ser-Gly-Ala-Arg-Ser-Gly-Pro-
Pro-Trp-Glu-Lys-Thr-Asn-Lys-Ile-Thr-Pro-Ser-Leu-Se
r-Arg-Thr-Asp-Leu-Arg-Arg-Leu-Ala-Tyr-Gly-Arg-Arg-
Ala-Glu-Ser-Arg-Lys-Ile-Leu-Val-Arg-His-Ala-Gly-Gl
y-Glu-Thr-Leu-Gly-Phe-Glu-Pro-Ile-Lys-Leu-Pro-Arg-
Cys-Ala-Arg-Cys-Gly-Gln-Pro-Val-Asp-Thr-Gly-Val-Gl
y-Val-Met-Thr-Asn-Gly-Glu-Lys-Ala-Arg-Phe-Thr-Gly-
Thr-Met-Leu-Cys-Gly-Ser-Ile-Trp-Ala-Cys-Pro-Thr-Cy
s-Ser-Ala-Ile-Ile-Arg-His-Glu-Arg-Ala-His-Glu-Val-
Ala-Leu-Ala-Ile-Gly-Asn-His-Ala-Glu-Lys-Leu-Arg-Ly
s-Ala-Ala-Ala-Asp-Gln-Trp-Gln-Ala-Glu-His-Glu-Gly-
Gln-Arg-Leu-Pro-Pro-Glu-Leu-Met-Val-Ser-Asp-Ser-Ph
e-Gly-Asn-Tyr-Ile-Phe-Gly-Thr-Leu-Thr-Leu-Arg-His-
Asp-Arg-Thr-Met-Pro-Leu-Ala-Met-Thr-Leu-Asp-Ala-Il
e-Leu-Lys-Gly-Trp-Thr-Lys-Met-Ile-Asn-Gly-Ser-Pro-
Trp-Gln-Arg-Ala-Ser-Glu-Arg-Trp-Lys-Ile-Arg-Gly-Ph
e-Val-Arg-Ala-Ile-Glu-Ile-Thr-Tyr-Gly-Val-Asn-Gly-
Trp-His-Pro-His-Ile-His-Phe-Val-Met-Phe-Leu-Asp-Gl
y-Asp-Leu-Asp-Asp-Gly-Gln-Arg-Glu-Ala-Met-Gln-Gln-
Trp-Leu-Leu-Asp-Arg-Trp-Lys-Thr-Met-Val-Lys-Arg-Va
l-Ala-Lys-Ala-Tyr-Lys-Lys-Lys-Asp-Gly-Asn-Pro-Tyr-
Asn-Val-Ala-Pro-Asn-Asp-Glu-His-Gly-Ile-Asp-Leu-Gl
n-Phe-Lys-Ser-Gly-Lys-Asp-Ala-Gly-Thr-Ala-Ala-Ala-
Glu-Tyr-Ile-Thr-Lys-Ile-Gln-Gly-Asp-Lys-Gly-Gly-Va
l-Thr-Leu-Ala-Gln-Glu-Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Ile-Lys-
Asn-Gly-Arg-Met-Gly-Ser-Val-Asn-Pro-Phe-Gln-Leu-Le
u-Asp-Ser-Gly-Cys-Leu-Gly-Leu-Ser-Asp-Phe-Gln-Arg-
Glu-Asp-Leu-Trp-Leu-Glu-Tyr-Trp-Gln-Ala-Thr-Leu-Ar
g-Arg-Arg-Cys-Ile-Thr-Trp-Ser-Arg-Gly-Leu-Lys-Glu-
Asp-Met-Glu-Val-Glu-Glu-Leu-Glu-Asp-Glu-Glu-Leu-Al
a-Glu-Lys-Ala-Asp-Glu-Leu-Pro-Gly-Leu-Val-Gly-Tyr-
Val-Val-Pro-Asn-Arg-Val-Tyr-Lys-Asp-Ile-Arg-Lys-Se
r-Ala-Pro-Glu-Thr-Leu-Ala-Asp-Ala-Leu-Asp-Ala-Ala-
Glu-Arg-Glu-Asp-Trp-Gln-Glu-Val-Ala-Arg-Leu-Leu-Pr
o-Gly-Gly-Val-Ile-Leu-Thr-Asp-Glu-Gln-Gln-Asp-Ala-
Ile-Ala-Asp-Gly-Glu-Ala-Lys-Pro-Gly-Asp-Tyr-Leu-Pr
o-Thr-Met-Ser-Val-Met-Val

【００１９】

【発明の実施の形態】本発明においては、ビフィドバク
テリウム・ブレーベ（B.breve ）ATCC 15698株のプラス
ミドｐＮＢｂ１由来の複製必須領域と、大腸菌（E.col
i）のプラスミド由来の複製必須領域と、大腸菌（E.col
i）のプラスミド由来の抗生物質耐性遺伝子と、ビフィ
ズス菌で機能する抗生物質耐性遺伝子とを備えたもので
あるため、大腸菌及びビフィズス菌で発現可能なシャト
ルベクターとして用いることができる。尚、本発明のシ
ャトルベクターは当然ではあるが、外来遺伝子を挿入す
るための制限酵素の認識切断部位を一つ以上有する。

【００２０】本発明のシャトルベクターを構成する成分
の中のベクターをビフィズス菌で複製させるための複製
開始点及び複製タンパク質を含む複製必須領域は、公知
のものであるビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.brev
e ）ATCC 15698株のプラスミドｐＮＢｂ１に由来する
（FEMS Microbiology Letters,110,11-20(1993) ）。

【００２１】更に、本発明では、このプラスミドｐＮＢ
ｂ１由来の複製必須領域の塩基配列を決定し、複製タン
パク質遺伝子を得た。具体的には後述する配列表の配列
番号１に示された2997bpの遺伝子配列のうち、539bp か
ら2020bpに示されたアミノ酸配列をコードする遺伝子で
ある。

【００２２】また、本発明のベクターについて、ビフィ
ズス菌に移入し組換え体を選択する際の選択マーカーと
しては、ビフィズス菌で機能する抗生物質耐性遺伝子が
用いられる。この抗生物質耐性遺伝子としては、ビフィ
ズス菌で機能するものであればよく、グラム陽性菌由来
のもの、放線菌又は乳酸菌又は乳酸球菌に由来のものか
ら選ばれる。具体的には、放線菌サッカロポリスポラ・
エリスレア（S.erythraea ）JCM4748(ATCC 11635) 株由
来のエリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＥ）を用い
た。このエリスロマイシン耐性遺伝子は塩基配列が公知
となっており、遺伝子のＧＣ含量がビフィズス菌のそれ
に近いことが判明している（Gene,38,103-110(1985)
）。

【００２３】従って、本抗生物質耐性遺伝子はビフィズ
ス菌内で発現する可能性が高いと考えられ、実際にビフ
ィズス菌にこのエリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍ
Ｅ）を用いて作出したプラスミドベクターｐＢＥ１をビ
フィズス菌内に移入した際には、組換え体の選択につい
て、好適な結果が得られた。このプラスミドベクターｐ
ＢＥ１は、9.05ｋｂの大きさを有し、前述の化６に示さ
れた制限酵素切断部位を有する。

【００２４】しかしながら、ビフィズス菌での組換え体
の選択マーカーは放線菌由来のエリスロマイシン耐性遺
伝子（ｅｒｍＥ）に限定したものではなく、エンテロコ
ッカス・フェカリス（E.faecalis）由来のｐＡＭβ１の
エリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＡＭ）(J.Bacteri
ol.157,445-453,1984)をこのエリスロマイシン耐性遺伝
子（ｅｒｍＥ）と入替えたベクターｐＢＥ１βでも可能
であった。このプラスミドベクターｐＢＥ１βは、9.35
ｋｂの大きさを有し、前述の化７に示された制限酵素切
断部位を有する。

【００２５】また、このシャトルベクターを大腸菌（E.
coli）に導入し、ベクターＤＮＡを増幅する際に必要と
なる大腸菌（E.coli）のプラスミド由来の複製必須領域
と、大腸菌（E.coli）のプラスミド由来の抗生物質耐性
遺伝子とは、公知の大腸菌プラスミドから選択すること
ができる。具体的には、大腸菌の複製必須領域及び選択
マーカーとしてのアンピシリン耐性遺伝子（Ａｐ^r ）
は、公知の大腸菌プラスミドｐＡＣＹＣ 177由来のもの
が利用できる。更に、大腸菌を宿主とした時に高いプラ
スミドＤＮＡの収率が望めるｐＵＣ 118由来の複製必須
領域を使用したシャトルベクターも作出できる。尚、ｐ
ＵＣ 118を用いたものとしては、具体的にはｐＢＥΔＨ
Ｃが作出された。このｐＢＥΔＨＣは、7.15ｋｂの大き
さを有し、前述の化１０に示された制限酵素切断部位を
有する。

【００２６】本発明のシャトルベクターの構築に際して
は、先ず、放線菌サッカロポリスポラ・エリスレア（S.
erythraea）JCM 4748株の染色体ＤＮＡを BamHIとKpnI
で切断し、エリスロマイシン耐性遺伝子を含む 1.4ｋｂ
の切断断片を公知の方法（Gene,38,103-110,1985）に従
い単離した。次に、この遺伝子に化学合成したＳＤ配列
を付加し、選択マーカーとしての機能発現がより確実な
ものとした。

【００２７】更に、ＳＤ配列の直前にエリスロマイシン
耐性遺伝子をビフィズス菌内で発現させるためのプロモ
ータ配列として、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.
breve ）の染色体に由来するプロモータ配列、もしく
は、ビフィズス菌と同じグラム陽性菌であるところの枯
草菌のファージＳＰＯ２に由来するプロモータ配列を連
結した。

【００２８】ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.brev
e ）に由来するプロモータ配列は例えば特開平５−１４
６２９６号公報に開示されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子を含むＤＮＡ断片上の配列でよく、ここに示されてい
るｐＴＩ−ＢＢＩ−３．８上の挿入ＤＮＡ断片をHaeIII
で切断し、 318塩基対のＤＮＡ断片を分離することで得
られる。

【００２９】一方、枯草菌ファージＳＰＯ２のプロモー
タ配列は、ファージＤＮＡを EcoRIで切断した時に生じ
る 0.3ｋｂのＤＮＡ断片を分離することで得られるが、
このＤＮＡ断片を組込んだプラスミドであるｐＰＬ６０
８の構造並びに、このプロモータを含む 0.3ｋｂのＤＮ
Ａ断片の塩基配列は公知のものであり（Gene,22,45-57,
1983）、また、ｐＰＬ６０８はアメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション（ATCC）からATCC 37108番の分
譲を受ければよい。

【００３０】一方、シャトルベクターの本体となる大腸
菌プラスミドベクターとｐＮＢｂ１の複合体はｐＮＢｂ
１上に１カ所のみの切断点を持つ制限酵素サイトを用い
て両者を連結すればよい。即ち、大腸菌プラスミドベク
ター上のScaIサイトとｐＮＢｂ１上のScaIサイトを用い
て両者をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結した。

【００３１】このようにして作成した大腸菌プラスミド
ベクターとｐＮＢｂ１の複合体にプロモータ配列、ＳＤ
配列等を付加したエリスロマイシン耐性遺伝子を更に連
結し、前述のシャトルベクターｐＢＥ１を構築した。

【００３２】本発明では、シャトルベクターｐＢＥ１の
ビフィズス菌（B.breve ）への移入には、エレクトロポ
レーション法を用いた。

【００３３】また、ベクターを使用する場合には、一般
に同じ構築要素からなるベクターであれば、そのベクタ
ーの大きさが小さいほど、形質転換頻度は高い。ｐＢＥ
１は9.05ｋｂであり、宿主に移入するには多少大きい。
このため、本発明では、更に形質転換頻度の高いベクタ
ーを構築するため、宿主内での複製に必要なプラスミド
の領域を決定し、数種類のサイズのベクターを作成し
た。こうして作成されたベクター中で、最も形質転換頻
度が高かったのは、ｐＢＥΔ４、ｐＢＥΔ５であり、プ
ラスミドＤＮＡ重量あたりで、ｐＢＥ１より約５倍頻度
は上昇した。このプラスミドｐＢＥΔ４及びｐＢＥΔ５
は各々 5.7ｋｂの大きさを有し、前述の化８及び化９に
示された制限酵素切断部位を有する。

【００３４】ｐＢＥΔ５はまた、広範囲のビフィズス菌
において発現可能であり、少なくともビフィドバクテリ
ウム・ブレーベ（B.breve ）、ビフィドバクテリウム・
ロンガム（B.longum）、ビフィドバクテリウム・インフ
ァンティス（B.infantis）、ビフィドバクテリウム・シ
ュードロンガム（B.pseudolongum）に対して、１μｇＤ
ＮＡあたり１０² 〜１０⁴ の頻度で導入できることが確
認された。

【００３５】また、本発明ではシャトルベクターをビフ
ィズス菌に移入する際に、宿主であるビフィズス菌の菌
株によってプラスミドＤＮＡのメチル化の有無が、導入
頻度に大きく影響することを明らかにした。即ち、ビフ
ィズス菌シャトルベクターを大腸菌中で増幅する際に、
ＤａｍメチレースとＤｃｍメチレースの活性を有する大
腸菌を用いるか、ＤａｍメチレースとＤｃｍメチレース
の活性を失った大腸菌を使い分けることによって、各種
ビフィズス菌への導入効率をより上昇させることができ
る。尚、このメチレースの欠損大腸菌は、これらの遺伝
子（ｄａｍ、ｄｃｍ）に欠損があり、各メチレース活性
がないものであれば、何れの大腸菌を用いてもよく、分
譲機関や商業的に容易に入手できる。

【００３６】尚、今回作成した新規シャトルベクターｐ
ＢＥ１は生命工学研究所に菌寄第１６０７５号（平成０
９年０２月１０日付け寄託）として、ｐＢＥ１βは同じ
く菌寄第１６０７６号（平成０９年０２月１０日付け寄
託）として、ｐＢＥΔ５は同じく菌寄第１６０７７号
（平成０９年０２月１０日付け寄託）として、ｐＢＥΔ
ＨＣは同じく菌寄第１６０７８号（平成０９年０２月１
０日付け寄託）として既に寄託されている。尚、ｐＢＥ
Δ４とｐＢＥΔ５とは、プラスミドｐＮＢｂ１由来の複
製必須領域の連結の方向のみが相違するため、ｐＢＥΔ
５のみ寄託し、ｐＢＥΔ４の寄託は行わなかった。

【００３７】

【実施例】以下に、上記シャトルベクターの作成につい
て、実施例を示し、詳述する。 実施例１（プラスミドｐＮＢｂ１の分離） 下記の表１に示す組成を有するＭＩＬＳ培地（Letters
in Applied Microbiology,9,165-168,1989）を用いてビ
フィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve ）ATCC 15698
株を培養した。

【００３８】

【表１】

【００３９】ＭＩＬＳ培地 100mlを 120℃で15分間滅菌
し、室温まで冷やした後、ビフィドバクテリウム・ブレ
ーベ（B.breve ）ATCC 15698株の培養液を１％（ｖ／
ｖ）接種し、密栓し、37℃で16時間静置培養した。培養
終了後、遠心分離（6,000rpm，15分）によって菌体を集
めた。次いで、プラスミドを以下の方法により単離し
た。回収した菌体を２mlのソリューションＩ（50mM Tri
s-HCl ，ｐＨ 7.5、10mM EDTA 、 100μg/ml RNaseA ）
に懸濁した後、 200μg/mlとなるようにリゾチームを加
え、更に50μg/mlとなるように、Ｍ−アセチルムラミダ
ーゼＳＧ（生化学工業社製）を加え37℃で20分間保温し
た。

【００４０】遠心分離（15,000rpm ，５分間）により、
再び菌体を回収し、これを 0.4mlのソリューションＩに
懸濁した。この菌体懸濁液に、 0.4mlのソリューション
II（0.2N NaOH 、１％ SDS）を加え、穏やかに混合し、
溶菌させた。更に、 2.55Mの酢酸カリウム溶液を 0.4ml
加え、よく混合した。遠心分離（15,000rpm 、10分間）
にかけ、上清を分取した。

【００４１】この上清に等量のフェノール（ＴＥバッフ
ァーで飽和したもの）を加え、タンパク質の抽出を２度
行った後、水層を分取し、1/10量の３Ｍ−酢酸ナトリウ
ム溶液と、 2.5倍量のエタノールを加え、 -80℃で１０
分間冷却した。これを遠心分離（15,000rpm ，10分間）
し、沈殿を回収し、80％エタノールで洗浄後、真空乾燥
した。沈殿を再びＴＥバッファー（10mM Tris-HCl ｐＨ
8.0、１mM EDTA ）２mlに溶解し、 1.9ｇの塩化セシウ
ムと40μｌの臭化エチジウム溶液（10ｍg/ml）を加え、
塩化セシウム／臭化エチジウムの濃度勾配遠心法により
プラスミドＤＮＡの精製を行った。これにより得られた
ｐＮＢｂ１のプラスミドＤＮＡは約２μｇであった。

【００４２】図１は得られたプラスミドｐＮＢｂ１の制
限酵素切断地図である。本プラスミドは既報（FEMS Mic
robiology Letter,110,11-20,1993 ）の通り、 5.6ｋｂ
で、図１に示す制限酵素断片部位が存在した。また、既
報に示されていた制限酵素切断部位以外に、AccI，Sac
I，SmaIの切断部位が各１カ所、KpnI，XbaI，SalI，Pst
Iの切断部位は存在しないことが新たに確認された。

【００４３】実施例２（放線菌エリスロマイシン耐性遺
伝子の単離とＳＤ配列、プロモータ配列の付加） (1) 放線菌染色体ＤＮＡの調製 放線菌サッカロポリスポラ・エリスレア（S.erythraea
）JCM 4748株はペプトン・コーン培地（Japan collect
ion of microorganisms,Catalogue of Streins,5th edi
tion,1992）を用いて28℃、４日間、振盪培養した。

【００４４】培養液より菌体を遠心分離によって集め、
ＴＥバッファで洗浄後、Ａバッファ（２μg/mlリゾチー
ム、10％グルコース、50mM Tris-HCl ，ｐＨ 8.0，１mM
EDTA ）に懸濁し、37℃で15分間保温した。10％ SDS溶
液を1/10量加え、穏やかに混合し、溶菌させた。65℃、
１時間保温した後、プロテネースＫ（終濃度 200μg/m
l）を加え、37℃で３時間保温した。

【００４５】保温後、ＴＥバッファーで飽和したフェノ
ールを当量加え、15分間、ゆっくりと混合して、タンパ
ク質を抽出した。遠心分離により水層を回収し、フェノ
ール抽出を繰返す操作を３回行った。分取した水層に２
倍量のエタノールを重層し、境界面に凝集したＤＮＡを
ガラス棒で巻取った。再びこのＤＮＡを少量のＴＥバッ
ファーに溶解し、エタノールを重層してＤＮＡを巻取る
操作を３回繰返した。少量のＴＥに巻取ったＤＮＡを溶
解し、ＲＮａｓｅＡ（終濃度50μg/ml）を加え、37℃で
30分間保温した。再びエタノールの重層とガラス棒によ
る巻取り操作を３回繰返した。巻取ったＤＮＡは風乾し
た後、少量のＴＥバッファーに溶解した。

【００４６】(2) エリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍ
Ｅ）の単離 放線菌（S.erythraea ）JCM 4748株のエリスロマイシン
耐性遺伝子（ｅｒｍＥ）は、染色体ＤＮＡの BamHI切断
とKpnI切断により生じる 1.4ｋｂのＤＮＡ断片に存在
し、この部分の塩基配列は公知のものとなっている（Ge
ne,38,103-110,1985）。

【００４７】そこで、染色体ＤＮＡを BamHIとKpnIで消
化し、アガロースゲル電気泳動法により、 1.4ｋｂに相
当するＤＮＡ画分を得た。アガロースゲルからのＤＮＡ
の抽出はジーン・クリーン（ＢＩＯ１０１，ＵＳＡ）を
用いた。抽出したＤＮＡと、BamHIとKpnIで切断してア
ルカリホスファターゼ処理した大腸菌プラスミドベクタ
ーｐＵＣ１１９とを混合し、ＤＮＡリガーゼを用い、ラ
イゲーションを行った。ライゲーション後、大腸菌ＪＭ
１０８をハナハン（Hanahan ）の方法により形質転換
し、 100μg/mlのアンピシリンと 500μg/mlのエリスロ
マイシンを添加したＬＢ培地（塩化ナトリウム 0.5％，
トリプトン１％，酵母エキス 0.5％）の寒天平板培地に
塗抹し、37℃で16時間培養し、生じたコロニーを選択し
た。

【００４８】コロニーをアンピシリンとエリスロマイシ
ンとを添加したＬＢ培地３mlに接種し、37℃16時間振盪
培養し、遠心分離により菌体を集め、アルカリ溶菌法に
よりプラスミドＤＮＡを抽出した。

【００４９】プラスミドＤＮＡを BamHI、KpnI等の制限
酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動法により解析し
たところ、挿入されたＤＮＡ断片はエリスロマイシン耐
性遺伝子（ｅｒｍＥ）であることが確認された。得られ
たプラスミドをｐＵＣＥｍと命名した。図２は得られた
プラスミドｐＵＣＥｍの構造を示す説明図である。

【００５０】(3) エリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍ
Ｅ）へのＳＤ配列の付加 1.4ｋｂのＤＮＡ断片上でｅｒｍＥは BamHIサイトの直
後が開始コドンとなっていることが判っている（Gene,3
8,103-110,1985）。このため、ｅｒｍＥの選択マーカー
遺伝子としての機能発現をより確実とする目的で、化学
合成したＳＤ配列をｅｒｍＥの直前に付加した。

【００５１】図３はプラスミドｐＵＣＥｍ上のｅｒｍＥ
のＳＤ配列を合成ＤＮＡの挿入による変化した過程を示
す説明図である。ｐＵＣＥｍをプラスミドベクター側の
ポリリンカー上の制限酵素サイトであるXbaIとｅｒｍＥ
のクローニングサイトであるBamHIで切断した後、５’
末端をリン酸化した５’−ＣＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧ−
３’と、５’−ＧＡＴＣＣＴＣＣＴＴＴ−３’という２
本の相補的な配列をもつ合成ＤＮＡを２つのサイトの間
に挿入し、Ｔ４リガーゼによりライゲーションし、ｐＵ
ＣＳＤＥｍを作成した（図３参照）。

【００５２】(4) エリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍ
Ｅ）へのプロモータ配列の付加 前項までに作成したプラスミドであるｐＵＣＥｍや、ｐ
ＵＣＳＤＥｍは大腸菌を宿主とした場合、プラスミドベ
クター上のｌａｃプロモータによりｅｒｍＥは発現して
いる。ビフィズス菌中でグラム陰性である大腸菌のプロ
モータが機能するという知見はないので、ビフィズス菌
自身のプロモータ又はビフィズス菌と同じくグラム陽性
菌である枯草菌のプロモーターをｐＵＣＳＤＥｍに挿入
する操作を行った。

【００５３】ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.brev
e ）より既に単離され、塩基配列の決定されたβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片（特開平５−１４
６２９６号公報）からプロモーター類似の塩基配列の認
められる部分を取出し使用した。このＤＮＡ断片は特開
平５−１４６２９６号の配列表１における塩基番号2267
から2584までで、この公報に開示されたプラスミドｐＴ
Ｉ−ＢＢＩ−３．８をHaeIIIで切断し 318塩基対のＤＮ
Ａ断片を分離することで得た。

【００５４】この断片のプラスミドへの挿入は次の手順
で行った。即ち、ｐＵＣＳＤＥｍをXbaIで切断した後、
切断末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端
とし、末端をアルカリホスファターゼ処理した後、分離
した 318塩基対の大きさを持つＤＮＡ断片を加え、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを加えて連結させた。この反応をハナハ
ン（Hanahan ）の方法により、大腸菌ＪＭ１０８に形質
転換し、アンピシリン（ 100μg/ml）とエリスロマイシ
ン（ 500μg/ml）を加えたＬＢ寒天平板培地に塗抹し、
37℃で一晩培養した。

【００５５】平板上に生じたコロニーは大きいものと小
さいものが認められたので、このうち大きなコロニーよ
り、アンピシリンとエリスロマイシンとを含む３mlのＬ
Ｂ培地に菌を接種、培養し、アルカリ法でプラスミドを
精製した。このプラスミドを複数の制限酵素で切断後、
アガロースゲル電気泳動法により解析したところ、目的
の部位に約 300塩基対のＤＮＡ断片が挿入されているこ
とを確認した。本プラスミドをｐＵＣＰ１ＳＤＥｍと命
名した。図４はプラスミドｐＵＣＰ１ＳＤＥｍの構造を
示す説明図である。

【００５６】一方、ビフィズス菌と同じグラム陽性菌の
枯草菌では強いプロモーターであることが知られている
枯草菌溶源化ファージＳＰ０２のプロモータをｐＵＣＳ
ＤＥｍに挿入したプラスミドｐＵＣＰ２ＳＤＥｍは以下
の手順で構築した。

【００５７】ファージＳＰ０２のプロモーターは EcoRI
の切断により生じる約 0.3ｋｂのＤＮＡ断片上にあるこ
とが知られているが、この断片を含む公知の枯草菌プラ
スミドベクターｐＰＬ６０８（Gene,22,45-57,1983）を
EcoRIで切断し、アガロースゲル電気泳動法で分離する
ことにより本断片を得た。ｐＵＣＳＤＥｍはXbaIで切断
し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで末端を平滑化した後、ア
ルカリホスファターゼ処理を行った。プロモーター断片
はＴ４ＤＮＡポリメラーゼで末端を平滑化した。両ＤＮ
Ａを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、プロモーター
の連結を行った。この反応液を大腸菌ＪＭ１０８に形質
転換し、アンピシリン（ 100μg/ml）とエリスロマイシ
ン（ 500μg/ml）を添加したＬＢ寒天平板培地に塗抹
し、37℃で一晩培養した。

【００５８】平板上に生じたコロニーは大きなものと小
さなものとが認められたので、大きなコロニーからプラ
スミドＤＮＡを抽出し、複数の制限酵素で切断し解析し
た。その結果、本実験で得たｐＵＣＰ１ＳＤＥｍは、目
的のプロモータを含むＤＮＡ断片を連結する過程で行っ
たＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理において、プロモータ断
片とプラスミドとの連結部位の EcoRIとXbaI切断点は消
失していたが、目的のプロモーターＤＮＡ断片はプラス
ミド上に挿入されていることが確認された。

【００５９】実施例３（シャトルベクターｐＢＥ１の構
築） (1) 大腸菌プラスミドｐＡＣＹＣ１７７の小型化とポリ
リンカーの付与 図５はプラスミドｐＡＣＹＣ１７７の小型化とポリリン
カーの付与を説明する説明図であり、ａ図は各操作を示
す工程図、ｂ図はポリリンカーＤＮＡの塩基配列と制限
酵素切断部位とを示す説明図である。ａ図に示す通り、
ｐＡＣＹＣ１７７（3.94ｋｂ）をEco47IIIで切断し、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼを用いセルフライゲーションすること
で、1.43ｋｂのEco47III断片を除去したｐＡＣＹＣΔ１
（2.51ｋｂ）を得た。次に SacII切断し、末端をＴ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼで処理し、平滑化した後、末端をリン
酸化した８ｂａｓｅの HindIIIリンカー（５’−ＣＡＡ
ＧＣＴＴＧ−３’）をこの部分に挿入し、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼで連結することで SacII切断部位を HindIII切断
部位に変えた。

【００６０】HindIIIとEco47IIIでこれを切断し、0.25
ｋｂのＤＮＡ断片を除去した後、プラスミド部分の末端
をアルカリホスファターゼで処理した。末端をリン酸化
したｂ図に示すポリリンカーＤＮＡをこれに加え、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼで先のプラスミドに挿入した（ｐＡＣＹ
ＣΔ２ＰＬ；2.31ｋｂ）。ｐＡＣＹＣΔ２ＰＬをEco47I
IIとＡａｔIIとで切断し、末端をＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼで平滑化した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでセルフライゲ
ーションし、約1.75ｋｂのプラスミドｐＡＣＹＣΔＰＬ
を得た（図５ａ図）。

【００６１】(2) ｐＡＣＹＣΔＰＬへのｐＮＢｂ１のク
ローニング 図６はｐＮＢｂ１のｐＡＣＹＣΔＰＬへのクローニング
操作を示す工程図である。図に示す通り、(1) で得たｐ
ＡＣＹＣΔＰＬをポリリンカー内のSacI切断部位におい
て切断した後、アルカリホスファターゼ処理を行った。
これに対し、ｐＮＢｂ１を同じくSacIで切断したものを
加え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、ｐＡＣＰＮＢ
（7.35ｋｂ）を得た（図６中段）。

【００６２】(3) ｐＡＣＰＮＢへのｅｒｍＥのクローニ
ング 実施例２により得たｐＵＣＰ２ＳＤＥｍをPstIとKpnIと
で切断し、アガロースゲル電気泳動法により分画し、プ
ロモーター，ＳＤ配列，ｅｒｍＥが含まれる約1.65ｋｂ
のＤＮＡ断片を分離した。一方、ｐＡＣＰＮＢをPstIと
KpnIで切断し、アルカリホスファターゼ処理した。これ
ら２つのＤＮＡを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、
両者を連結し、ｐＢＥ１（9.05ｋｂ）を得た（図６後
段）。

【００６３】実施例４（シャトルベクターｐＢＥ１βの
作製） ビフィズス菌のＧＣ含量が６０％前後であるのに対し、
ｐＢＥ１の作製にはＧＣ含量が約70％のｅｒｍＥをその
選択マーカー遺伝子として使用した。ビフィズス菌中で
遺伝子発現の有無がＧＣ含量に依存するか否か明らかに
する目的でｅｒｍＥ部分を低いＧＣ含量のエリスロマイ
シン耐性遺伝子であるｅｒｍＡＭ（ＧＣ含量約33％）(N
ucleic Acid Res.,15,3177,1987)と入れ換えたｐＢＥ１
βを以下の手順で作製した。

【００６４】エンテロコッカス・フェカリスのプラスミ
ドｐＡＭβ１のエリスロマイシン耐性遺伝子ｅｒｍＡＭ
が組込まれているプラスミドｐＶＡ８３８（ATCCNo.371
60）をAvaIと HindIIIで切断し、ｅｒｍＡＭを含む 1.7
ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片の末端を
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理により平滑化し、ｐＵＣ１
１９のSmaI切断部位に一度連結した。これを BamHIとKp
nIで切断し、末端に BamHIとKpnI切断部位を持つｅｒｍ
ＡＭのＤＮＡ断片を分離・精製した。

【００６５】一方、ｐＢＥ１を BamHIとKpnIで切断し、
ｅｒｍＥを含むＤＮＡ断片を除去した後、アルカリホス
ファターゼ処理し、先に分離・精製したｅｒｍＡＭを含
む 1.7ｋｂのＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、
これを連結した。得られたプラスミドをｐＢＥ１βとし
た。

【００６６】実施例５．（ビフィドバクテリウム・ブレ
ーベ（B.breve ）のエレクトロポレーション用細胞の調
製） １％のグルコース又はラクトースを含むＭＩＬＳ培地に
て一昼夜37℃で、嫌気培養したビフィドバクテリウム・
ブレーベ（B.breve ）培養菌液を同じ組成の新しい培地
に1/50接種し、37℃で嫌気培養した。培養液の濁度が 6
60ｎｍの波長で約 0.2になったところで集菌し、もとの
液量と同量の０℃に冷却したグリセリン溶液（10％）で
洗浄した。更に 1/2量のグリセリン溶液（10％）で２度
洗浄した後、菌体を 0.4mlのグリセリン溶液（10％）に
懸濁した。この菌体懸濁液は小分けにし、エタノール／
ドライアイス上で凍結した後、 -80℃で保存した。本凍
結菌体をエレクトロポレーションに使用したが、少なく
とも２週間は使用可能であった。

【００６７】実施例６（ｐＢＥ１及びｐＢＥ１βのビフ
ィズス菌へのエレクトロポレーション） エレクトロポレーションには、ジーンパルサーとパルス
コントローラー（Bio-Rad Laboratories,USA）を使用し
た。この際、機械の内部抵抗２００Ω、コンデンサー容
量２５μＦで固定し、電圧に関しては適宜変更した。実
際の操作は以下の通り行った。実施例５により調製した
ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve ）の凍結菌
液を氷の上で溶解し、40μｌずつをマイクロ遠心チュー
ブに分取した。１μｌ（１μg/μｌ）のプラスミドＤＮ
Ａを加えて混合した後、氷上で冷却した専用キュベット
（電極間 0.1ｃｍ幅）に40μｌを移し、電気パルスをか
けた。パルス後は直ちに、菌液を小試験管内の窒素置換
したＭＩＬＳ培地（細胞を調製したときと同じ糖を含
む）３mlに懸濁した。37℃で３時間嫌気培養した後、選
択用の薬剤を添加したＭＩＬＳ寒天培地（細胞を調製し
たときと同じ糖を含む）と混合し、混釈法により寒天平
板上にまいた。この寒天平板をアネロパック（住友ガス
化学社製）を用いて37℃で嫌気的に３〜４日間培養し
た。

【００６８】先ず、ｐＢＥ１を用いてビフィドバクテリ
ウム・ブレーベ（B.breve ）YIT4065 とビフィドバクテ
リウム・ブレーベ（B.breve ）YIT4064 に対するエレク
トロポレーションの至適電圧を調べた。12ＫＶ／ｃｍか
ら２ＫＶ刻みで24ＫＶ／ｃｍまで７点の電圧を取り、形
質転換対数を計測したところ、YIT4064 は20ＫＶ／ｃｍ
で最高値が得られ、このときの形質転換体数は１μｇＤ
ＮＡあたり 365個であった。一方、ｐＢＥ１βでは同条
件で92個の形質転換体を得た。

【００６９】これらの形質転換体より、実施例１に従っ
てプラスミドＤＮＡを抽出し、アガロースゲル電気泳動
法により大きさを調べたところ、用いたｐＢＥ１並びに
ｐＢＥ１βと一致することが判った。一方、何れの場合
もビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve ）YIT406
5 を宿主として、形質転換体は得られなかった。

【００７０】実施例７（ｐＢＥ１の小型化による形質転
換頻度の上昇） ビフィズス菌シャトルベクターｐＢＥ１の小型化を図っ
た。図７はプラスミドｐＢＥ１より小型化したプラスミ
ドベクターにおける欠失領域を示す説明図である。ｐＢ
Ｅ１を材料にして、図７に示したｐＮＢｂ１に由来する
部分に欠失を持つ４種類のプラスミドを作製した。尚、
図７では欠失部分を細線で残した部分を太線で示した。

【００７１】これらプラスミドがビフィドバクテリウム
・ブレーベ（B.breve ）YIT4064 を形質転換できるか否
かを調べた。その結果、 1.4ｋｂのClaI−SacI領域を欠
失したｐＢＥΔ１、 2.4ｋｂのClaI−BstXI 領域を欠失
したｐＢＥΔ２、3.35ｋｂのClaI−BglI領域を欠失した
ｐＢＥΔ４では、各々形質転換体が得られたが、 2.8ｋ
ｂの PvuII− BstXI領域を欠失したｐＢＥΔ３では得ら
れなかった。

【００７２】形質転換体の得られたもののうち最小のプ
ラスミドは前述の化８及び化９の制限酵素地図に示すｐ
ＢＥΔ４並びにｐＢＥΔ５であった。また、ｐＢＥΔ３
やｐＢＥ１２（ｐＮＢｂ１を BglIIで切断することによ
って得られる 4.7ｋｂの BglII断片を、ｐＢＥ１のｐＮ
Ｂｂ１部分と入れ換えたもの）では、形質転換体が得ら
れなかった点を考慮すると、ビフィズス菌中での複製に
必要な領域はｐＮＢｂ１由来の2.25ｋｂのClaI−BglI断
片上に存在し、且つ、断片上の制限酵素サイトである P
vuII並びに BglIIサイト上に少なくともその一部が存在
していると考えられる。

【００７３】小型化した各プラスミドベクターの大きさ
並びに形質転換効率を次の表２にまとめた。図８はプラ
スミドｐＢＥ１とｐＢＥΔ４及びｐＢＥΔ５との関係を
示す説明図である。得られた最小のプラスミドベクター
ｐＢＥΔ４及びｐＢＥΔ５は、 5.7ｋｂの大きさで、当
初のベクターであるｐＢＥ１の63％の大きさまで小型化
できた（図８参照）。また、形質転換効率も１μｇＤＮ
Ａあたりで最高2500まで上昇し、この場合、もとのｐＢ
Ｅ１より 5.3倍高い値を得ることができた。

【００７４】

【表２】

【００７５】実施例８（ｐＢＥΔＨＣの作製とエレクト
ロポレーションによるビフィドバクテリウム・ブレーベ
（B.breve ）への導入） 先の実施例で述べたｐＢＥ１，ｐＢＥ１β，ｐＢＥΔ
４，ｐＢＥΔ５等は、大腸菌ベクター部分としてｐＡＣ
ＹＣ１７７を使用している。ｐＡＣＹＣ１７７は大腸菌
中でのコピー数がｐＵＣ１１８等に比べて低いため、大
腸菌部分にｐＵＣ１１８を用いることで、大腸菌を宿主
とした時に高いプラスミドＤＮＡの収率が望めるｐＢＥ
ΔＨＣを作製した。

【００７６】図９はプラスミドｐＢＥΔＨＣの作製を説
明する説明図である。先ず、ｐＢＥΔ５をPstIと EcoRI
で切断し、ｐＡＣＹＣ１７７に由来する部分を除き、ｅ
ｒｍＥ領域とビフィズス菌複製領域とを備えたＤＮＡ断
片を得た。これにPstIと EcoRIで切断したｐＵＣ１１８
を加え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、ｐＢＥΔＨ
Ｃを得た。

【００７７】大腸菌（E.coli）ＪＭ１０９中で増幅した
ｐＢＥΔＨＣを用い、ビフィドバクテリウム・ブレーベ
（B.breve ）YIT4064 に先と同様の条件でエレクトロポ
レーションを行ったところ、コントロールに用いたｐＢ
ＥΔ５とほぼ同じ頻度で形質転換できた。

【００７８】実施例９（種々ビフィズス菌へのプラスミ
ドベクターの導入効率とプラスミドのメチル化の影響） 実施例７でビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve
）YIT4064 への導入効率が最も高かったｐＢＥΔ５を
使用して、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve
）YIT4064 以外のビフィズス菌についてその形質転換
頻度を調べた。上記の実施例ではプラスミドＤＮＡを増
幅するための大腸菌の宿主はＤＮＡメチレース遺伝子で
あるｄａｍとｄｃｍに欠損のない（ｄａｍ⁺ ，ｄｃｍ
⁺ ）のＪＭ１０８又はＪＭ１０９を使用したが、以下の
実験ではこれら２種類のＤＮＡメチレース遺伝子に欠損
のある（ｄａｍ^- ，ｄｃｍ^- ）の大腸菌であるところの
ＪＭ１１０を宿主として増幅したプラスミドについても
その形質転換頻度を検討した。

【００７９】ビフィドバクテリウム属のうち、ヒト糞便
由来の菌種とヒト以外の動物に由来する菌種について、
材料と方法の項に従って形質転換を検討した。その結果
を次の表３に示す。

【００８０】

【表３】

【００８１】表３に示す通り、ビフィドバクテリウム・
ブレーベ（B.breve ）YIT4065 ，ビフィドバクテリウム
・ブレーベ（B.breve ）YIT4064 ，ビフィドバクテリウ
ム・ブレーベ（B.breve ）ATCC15700 （基準株），ビフ
ィドバクテリウム・ロンガム（B.lomgum）ATCC15707
（基準株），ビフィドバクテリウム・インファンティス
（B.infantis）ATCC15697 （基準株），ビフィドバクテ
リウム・シュードロンガム（B.pseudolongum）ATCC2552
6 （基準株）などの菌株で、形質転換体が得られた。

【００８２】エレクトロポレーションにおける各菌株の
至適電圧は、何れも16ＫＶ／ｃｍ以上の高い電圧の領域
に存在した（表３）。ただし、ビフィドバクテリウム・
ロンガム，ビフィドバクテリウム・インファンティス，
ビフィドバクテリウム・シュードロンガムの各菌株では
検討した電圧の最高値で最高の形質転換頻度を示したの
で、装置の上限電圧（25ＫＶ／ｃｍ）より高い電圧をか
ければ更によい結果が得られるかもしれない。また、菌
株によっては使用するプラスミドＤＮＡのメチル化の有
無が形質転換頻度に影響し、ｄａｍ^- ，ｄｃｍ^- の大腸
菌で増殖したプラスミドでないと形質転換体が得られな
い菌株（B.breve YIT4065 ，B.lomgum ATCC15707，B.ps
eudolongum ATCC25526）、ｄａｍ⁺ ，ｄｃｍ⁺ の大腸菌
で増殖したプラスミドの方が高い形質転換頻度を示した
菌株（B.breve YIT4064 ，B.breve ATCC15700 ）、どち
らのＤＮＡでも殆ど差のない菌株（B.infantis ATCC156
97）に別けられた（表３参照）。

【００８３】また、形質転換の最高値は菌株によって差
があり、ｐＢＥΔ５ ＤＮＡ１μｇあたり１０² 〜１０
⁴ であった（表３参照）。

【００８４】以上のように、本研究におけるビフィズス
菌プラスミドベクターは広くビフィズス菌種に利用でき
ることが示された。また、ビフィズス菌への外来ＤＮＡ
の導入にそのＤＮＡ自身のメチル化の有無が影響し、こ
れは菌株毎に異なることが以上から明らかになった。同
様の現象は細菌では一般に制限修飾系として知られてい
るが、ビフィズス菌へのＤＮＡの導入に関して同様の系
が働くことについては、初めて見出されたものである。
将来、プラスミドベクターの導入が困難な宿主に直面し
た際、Ｄａｍメチレース，Ｄｃｍメチレースに限らず、
ＤＮＡメチル化酵素の種類や、強弱の異なる中間宿主で
ビフィズス菌用のプラスミドベクターを増幅すること
で、所望するビフィズス菌へこれを導入できる可能性を
示唆している。

【００８５】実施例１０（ｐＮＢｂ１の複製に必要な領
域の塩基配列の決定） プラスミドベクターの全塩基配列を明らかにすること
は、そのプラスミドベクターの利便性を上げるために重
要である。塩基配列が分かれば、各制限酵素サイトも明
らかとなるため、プラスミドの改良や目的遺伝子のクロ
ーニングが容易になるからである。研究において作製し
たビフィズス菌用プラスミドベクターは、その材料のう
ち大腸菌複製必須領域と薬剤耐性遺伝子は既知のもので
あるため、塩基配列の明らかでない部分はビフィズス菌
複製必須領域のみである。そこで、ビフィズス菌複製必
須領域、即ち、ｐＮＢｂ１由来の 2.3ｋｂのClaI−BglI
断片の塩基配列を解析した。

【００８６】プラスミドベクターｐＢＥΔ５より、 2.3
ｋｂのＤＮＡ断片をその連結に用いたリンカーのサイト
SacIで切り出し、ｐＵＣ１１８のSacIサイトにクローニ
ングした。ＤＮＡ断片の挿入方向が互いに逆向きのプラ
スミドを選び、各々Ｋｉｌｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ用Ｄｅ
ｌｅｔｉｏｎＫｉｔ（宝酒造社製）を使用して挿入ＤＮ
Ａ部分の段階的欠失を作製した。常法に従ってこれらか
ら１本鎖ＤＮＡを調製し、蛍光色素プライマーとＰＣＲ
を用いたサイクルシークエンス法により塩基配列を決定
した。耐熱製ポリメラーゼはＴａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａ
ｑ（宝酒造）を使用した。ＰＣＲ反応はアプライドバイ
オシステムズ（ＡＢＩ）社製のマニュアルに従い、解析
にはＡＢＩ社製３７３Ａ型シークエンサーを使用した。

【００８７】決定した塩基配列は、後述する配列表の配
列番号１に示した。決定された塩基配列の長さは2297ｂ
ｐで、この領域内には1482ｂｐのオープンリーディング
フレーム（ＯＲＦ）が見出された。このＯＲＦの直前に
はビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve ）の１６
Ｓ ｒＲＮＡの３’末端付近の配列５’ＡＵＣＡＣＣＵ
ＣＣＵＵＵＣＵ３’と相補する配列、所謂ＳＤ配列が認
められ、更に上流にはプロモータ様配列も認められた。
このことから、見出されたＯＲＦは何らかのポリペプチ
ドをコードすると考えられた。また、ＯＲＦにコードさ
れるポリペプチドの分子量は 54860と算出された。

【００８８】先のＯＲＦの塩基配列をアミノ酸配列に翻
訳し、「ＧＥＮＥＴＹＸ−ＣＤのＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓ
ｅＶｅｒ．１１．２０（ソフトウエア開発株式会社）」
を使用して、アミノ酸配列に相同性のあるタンパク質を
検索した。その結果、最も高い相同性を示したものとし
て、ストレプトコッカス・リビダンス（Streptomyces l
ividans ）のプラスミドｐＩＪ１０１の複製タンパク質
が見出された。

【００８９】ｐＩＪ１０１はローリングサークル方式に
よって複製するプラスミドのうち、複製タンパク質の相
同性などから、ｐＣ１９４，ｐＵＢ１１０，φＸ１７４
等と同じグループとされており、ｐＮＢｂ１の複製タン
パク質のアミノ酸配列中にもこれらのプラスミドの複製
タンパク質のアクティブサイトと高い相同性の認められ
る領域が存在した。また、周辺領域でも相同性が認めら
れた。このことから、ビフィドバクテリウム・ブレーベ
（B.breve ）のプラスミドｐＮＢｂ１はローリングサー
クル方式で複製するｐＩＪ１０１，φＸ１７４，ｐＣ１
９４，ｐＵＢ１１０等と同じグループのプラスミドであ
ることが示唆された。

【００９０】一方、この領域の塩基配列が明らかになっ
たことにより、ｐＢＥΔ４，ｐＢＥΔ５では外来ＤＮＡ
とクローニングできる１カ所切断の制限酵素サイトとし
てAccIII， EcoRI，KpnI，Sse8387I，XhoI等があること
が判った。一方、ｐＢＥΔＨＣでは EcoRI，KpnI，Pst
I，Sse8387I，XhoI等がクローニングサイトとして使用
可能であることが明らかとなった。また、これら制限酵
素を用いて各々のプラスミドＤＮＡを実際に切断し、切
断点が１カ所であることを確認した。

【００９１】

【発明の効果】以上説明したとおり、本発明によるシャ
トルベクターは、多種類のビフィズス菌を形質転換でき
るので、これを用いることにより、外来遺伝子を種々の
ビフィズス菌に導入することが可能となる。また、その
結果として、ビフィズス菌を種々の用途に利用する際
に、より有用性の高い菌株を分子育種できるという効果
がある。

【００９２】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：2997 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobact
erium breve ） 株名：ATCC15698(pNBb1) 配列の特徴 特徴を表わす記号： -35 signal 存在位置：387..392 特徴を決定した方法：S 特徴を表わす記号： -10 signal 存在位置：410..415 特徴を決定した方法：S 特徴を表わす記号：RBS 存在位置：525..530 特徴を決定した方法：S 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：539..2020 特徴を決定した方法：S 配列 CGATGAATGC CAGAGCTTCT TCAACGCCAA AGGCATACTG GGCGGCAAGC CGGCGAAAGA 60 CAAGGCCGAG GAAATCACCG CCGCCGCCAC GGAGATAGTG CAGAAAGGCC GGTCGGGAGG 120 CTTCCTCCTG TTCGCCATCA CCCAGAAACC TACCACCGAT TCGCTGCCAT CGGCACTACG 180 CGAGAACTGC GAGAACCGTA TCTGCTTCCG CGTCAAGACA CCGGAAGCAG CACGAGCCGT 240 ACTGGGCGAC ATGCCGGACG GTTCCCCCTC CCCGACCGAC ATACCACCGG CCCGTCGTGG 300 TGGCGCCATC ATCGGACTGG CCACCGGCGA AGACGTGATG TGCCGATTCG CGTACGTGAG 360 CGAAGAGGAG GCAGAAAGGG CCGTTGTTGC GAATCACAAG GGTGTAATTT AAACTGAGTC 420 ACAGCTGATA AAAGGAAACC CCCCGGGGCT GGAACCCCGG GGGGAATCTT GAAAGTCCGC 480 TAGCGGTCTA GGTCGCCAAA CTTTGCACCG CTGGCTACAA CTTTAGAAAG TCGTCACT 538 ATG AGT GTA CCA ACT CAG GGG ACG AAG TGG AAC CCG ATG GGT GTC CCT 586 Met Ser Val Pro Thr Gln Gly Thr Lys Trp Asn Pro Met Gly Val Pro TCA CCG TCC CAG CAC CAG ACC GCC GAA CGG CTG CAC GCC GCA GTA GCG 634 Ser Pro Ser Gln His Gln Thr Ala Glu Arg Leu His Ala Ala Val Ala GCG AAG CCT CAA GGC GTA GCC GCG GAA GCG GCA AGC GGG GCG CGT AGC 682 Ala Lys Pro Gln Gly Val Ala Ala Glu Ala Ala Ser Gly Ala Arg Ser GGC CCG CCT TGG GAA AAG ACG AAT AAA ATA ACC CCC TCC CTC TCC CGC 730 Gly Pro Pro Trp Glu Lys Thr Asn Lys Ile Thr Pro Ser Leu Ser Arg ACC GAT TTA CGG CGT CTG GCG TAT GGT CGC CGC GCT GAA AGC CGA AAG 778 Thr Asp Leu Arg Arg Leu Ala Tyr Gly Arg Arg Ala Glu Ser Arg Lys ATT CTC GTC CGT CAT GCC GGT GGC GAA ACG CTC GGA TTC GAG CCG ATT 826 Ile Leu Val Arg His Ala Gly Gly Glu Thr Leu Gly Phe Glu Pro Ile AAG CTG CCG CGC TGC GCA CGC TGC GGC CAA CCG GTG GAC ACC GGC GTG 874 Lys Leu Pro Arg Cys Ala Arg Cys Gly Gln Pro Val Asp Thr Gly Val GGT GTC ATG ACC AAC GGC GAG AAA GCC CGG TTT ACA GGC ACC ATG CTG 922 Gly Val Met Thr Asn Gly Glu Lys Ala Arg Phe Thr Gly Thr Met Leu TGC GGC TCG ATC TGG GCA TGC CCC ACC TGC TCG GCA ATC ATT CGC CAC 970 Cys Gly Ser Ile Trp Ala Cys Pro Thr Cys Ser Ala Ile Ile Arg His GAA CGC GCC CAC GAG GTC GCC CTC GCC ATC GGG AAC CAT GCC GAG AAA 1018 Glu Arg Ala His Glu Val Ala Leu Ala Ile Gly Asn His Ala Glu Lys CTG AGG AAA GCC GCC GCC GAC CAA TGG CAG GCA GAA CAT GAG GGG CAG 1066 Leu Arg Lys Ala Ala Ala Asp Gln Trp Gln Ala Glu His Glu Gly Gln CGT CTG CCG CCG GAA CTC ATG GTG TCC GAC AGC TTC GGA AAC TAC ATC 1114 Arg Leu Pro Pro Glu Leu Met Val Ser Asp Ser Phe Gly Asn Tyr Ile TTC GGC ACC CTC ACC CTG CGC CAT GAT CGG ACA ATG CCG CTG GCC ATG 1162 Phe Gly Thr Leu Thr Leu Arg His Asp Arg Thr Met Pro Leu Ala Met ACC CTT GAC GCA ATC CTC AAG GGC TGG ACG AAG ATG ATT AAC GGA AGC 1210 Thr Leu Asp Ala Ile Leu Lys Gly Trp Thr Lys Met Ile Asn Gly Ser CCT TGG CAA CGG GCC TCG GAA CGT TGG AAA ATC AGG GGT TTC GTC CGC 1258 Pro Trp Gln Arg Ala Ser Glu Arg Trp Lys Ile Arg Gly Phe Val Arg GCG ATT GAA ATC ACC TAC GGT GTG AAC GGC TGG CAC CCT CAC ATT CAT 1306 Ala Ile Glu Ile Thr Tyr Gly Val Asn Gly Trp His Pro His Ile His TTC GTC ATG TTT CTC GAT GGC GAT CTG GAC GAT GGG CAG CGT GAG GCA 1354 Phe Val Met Phe Leu Asp Gly Asp Leu Asp Asp Gly Gln Arg Glu Ala ATG CAG CAA TGG CTG CTC GAT CGC TGG AAA ACC ATG GTC AAG CGC GTT 1402 Met Gln Gln Trp Leu Leu Asp Arg Trp Lys Thr Met Val Lys Arg Val GCC AAG GCA TAC AAG AAA AAA GAC GGC AAC CCC TAC AAC GTC GCC CCG 1450 Ala Lys Ala Tyr Lys Lys Lys Asp Gly Asn Pro Tyr Asn Val Ala Pro AAC GAC GAA CAC GGC ATA GAT CTG CAA TTC AAG TCG GGC AAG GAC GCC 1498 Asn Asp Glu His Gly Ile Asp Leu Gln Phe Lys Ser Gly Lys Asp Ala GGA ACC GCT GCG GCC GAA TAC ATC ACC AAG ATT CAA GGC GAC AAA GGC 1546 Gly Thr Ala Ala Ala Glu Tyr Ile Thr Lys Ile Gln Gly Asp Lys Gly GGC GTC ACT CTG GCT CAG GAA ATC GCG CGC GGC GAT ATC AAG AAT GGT 1594 Gly Val Thr Leu Ala Gln Glu Ile Ala Arg Gly Asp Ile Lys Asn Gly CGT ATG GGG TCG GTT AAC CCG TTC CAA TTG CTG GAC TCC GGG TGC CTC 1642 Arg Met Gly Ser Val Asn Pro Phe Gln Leu Leu Asp Ser Gly Cys Leu GGG CTG TCC GAT TTC CAG CGC GAA GAT CTC TGG CTC GAA TAC TGG CAG 1690 Gly Leu Ser Asp Phe Gln Arg Glu Asp Leu Trp Leu Glu Tyr Trp Gln GCC ACT CTG CGC CGC CGC TGC ATA ACA TGG TCG CGT GGC CTC AAG GAA 1738 Ala Thr Leu Arg Arg Arg Cys Ile Thr Trp Ser Arg Gly Leu Lys Glu GAC ATG GAG GTC GAG GAA CTG GAA GAC GAG GAG CTG GCG GAG AAA GCC 1786 Asp Met Glu Val Glu Glu Leu Glu Asp Glu Glu Leu Ala Glu Lys Ala GAC GAA CTG CCC GGT CTG GTC GGC TAT GTC GTG CCG AAT CGG GTT TAC 1834 Asp Glu Leu Pro Gly Leu Val Gly Tyr Val Val Pro Asn Arg Val Tyr AAA GAC ATT CGC AAG AGT GCG CCT GAG ACA CTG GCC GAC GCA TTG GAT 1882 Lys Asp Ile Arg Lys Ser Ala Pro Glu Thr Leu Ala Asp Ala Leu Asp GCC GCC GAA CGC GAA GAC TGG CAG GAA GTC GCA CGG CTC TTG CCC GGT 1930 Ala Ala Glu Arg Glu Asp Trp Gln Glu Val Ala Arg Leu Leu Pro Gly GGC GTC ATA CTC ACT GAC GAA CAG CAG GAC GCC ATA GCT GAT GGC GAA 1978 Gly Val Ile Leu Thr Asp Glu Gln Gln Asp Ala Ile Ala Asp Gly Glu GCC AAA CCG GGG GAC TAT CTG CCA ACT ATG AGT GTC ATG GTG 2020 Ala Lys Pro Gly Asp Tyr Leu Pro Thr Met Ser Val Met Val TAATAGTTGA TAGTGTCATA GTTGATAGTG TCATAGTGTC ATAGTTGATA GTGTCATAGT 2080 CATTTGAGGT AGGCTTCAAG GGCTTCGTTT ACTATGCTTG AAGCCGAGGG GATTGTCCCA 2140 GATTTGGTGC GGTGTGTGAT TCGATAGGTG TCCAGCTTCT CCCAAAGGTC AAGGCGGACA 2200 CTGAAGCTGC GCACTTTCGT TTTGGAATTG TTTCGGCCCT CCTCGTCCGC GTTCTTCGTT 2260 GGCTCTTTCG GTGTCATTGA GATGTCGCCG GGTGCCT 2297

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＮＢｂ１の制限酵素切断地図であ
る。

【図２】プラスミドｐＵＣＥｍの構造を示す説明図であ
る。

【図３】プラスミドｐＵＣＥｍ上のｅｒｍＥのＳＤ配列
を合成ＤＮＡの挿入による変化した過程を示す説明図で
ある。

【図４】プラスミドｐＵＣＰ１ＳＤＥｍの構造を示す説
明図である。

【図５】プラスミドｐＡＣＹＣ１７７の小型化とポリリ
ンカーの付与を説明する説明図であり、ａ図は各操作を
示す工程図、ｂ図はポリリンカーＤＮＡの塩基配列と制
限酵素切断部位とを示す説明図である。

【図６】ｐＮＢｂ１のｐＡＣＹＣΔＰＬへのクローニン
グ操作を示す工程図である。

【図７】プラスミドｐＢＥ１より小型化したプラスミド
ベクターにおける欠失領域を示す説明図である。

【図８】プラスミドｐＢＥ１とｐＢＥΔ４及びｐＢＥΔ
５との関係を示す説明図である。

【図９】プラスミドｐＢＥΔＨＣの作製を説明する説明
図である。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifi
   dobacterium breve）ATCC 15698株のプラスミドｐＮＢ
   ｂ１由来の複製必須領域と、 大腸菌（Escherichia coli）のプラスミド由来の複製必
   須領域と、 大腸菌（Escherichia coli）のプラスミド由来の抗生物
   質耐性遺伝子と、 ビフィズス菌で機能する抗生物質耐性遺伝子とを備えた
   ことを特徴とするビフィズス菌用シャトルベクター。
2. 【請求項２】 大腸菌（Escherichia coli）由来のプラ
   スミドが、ｐＡＣＹＣ１７７又はｐＵＣ１１８であるこ
   とを特徴とする請求項１のビフィズス菌用シャトルベク
   ター。
3. 【請求項３】 ビフィズス菌で機能する抗生物質耐性遺
   伝子が、サッカロポリスポラ・エリスレア（Saccharopo
   lyspora erythraea ）JCM 4748(ATCC 11635)株のエリス
   ロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＥ）又はエンテロコッカ
   ス・フェカーリス（Enterococcus faecalis ）のエリス
   ロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＡＭ）であることを特徴
   とする請求項１に記載のビフィズス菌用シャトルベクタ
   ー。
4. 【請求項４】 次の化１〜化５の何れかの制限酵素地図
   で表わされたことを特徴とする請求項１〜３の何れかに
   記載のビフィズス菌用シャトルベクター。 【化１】 【化２】 【化３】 【化４】 【化５】
5. 【請求項５】 次のアミノ酸配列をコードするビフィズ
   ス菌プラスミドの複製タンパク質遺伝子。 Met-Ser-Val-Pro-Thr-Gln-Gly-Thr-Lys-Trp-Asn-Pro-Me
   t-Gly-Val-Pro-Ser-Pro-Ser-Gln-His-Gln-Thr-Ala-Glu-
   Arg-Leu-His-Ala-Ala-Val-Ala-Ala-Lys-Pro-Gln-Gly-Va
   l-Ala-Ala-Glu-Ala-Ala-Ser-Gly-Ala-Arg-Ser-Gly-Pro-
   Pro-Trp-Glu-Lys-Thr-Asn-Lys-Ile-Thr-Pro-Ser-Leu-Se
   r-Arg-Thr-Asp-Leu-Arg-Arg-Leu-Ala-Tyr-Gly-Arg-Arg-
   Ala-Glu-Ser-Arg-Lys-Ile-Leu-Val-Arg-His-Ala-Gly-Gl
   y-Glu-Thr-Leu-Gly-Phe-Glu-Pro-Ile-Lys-Leu-Pro-Arg-
   Cys-Ala-Arg-Cys-Gly-Gln-Pro-Val-Asp-Thr-Gly-Val-Gl
   y-Val-Met-Thr-Asn-Gly-Glu-Lys-Ala-Arg-Phe-Thr-Gly-
   Thr-Met-Leu-Cys-Gly-Ser-Ile-Trp-Ala-Cys-Pro-Thr-Cy
   s-Ser-Ala-Ile-Ile-Arg-His-Glu-Arg-Ala-His-Glu-Val-
   Ala-Leu-Ala-Ile-Gly-Asn-His-Ala-Glu-Lys-Leu-Arg-Ly
   s-Ala-Ala-Ala-Asp-Gln-Trp-Gln-Ala-Glu-His-Glu-Gly-
   Gln-Arg-Leu-Pro-Pro-Glu-Leu-Met-Val-Ser-Asp-Ser-Ph
   e-Gly-Asn-Tyr-Ile-Phe-Gly-Thr-Leu-Thr-Leu-Arg-His-
   Asp-Arg-Thr-Met-Pro-Leu-Ala-Met-Thr-Leu-Asp-Ala-Il
   e-Leu-Lys-Gly-Trp-Thr-Lys-Met-Ile-Asn-Gly-Ser-Pro-
   Trp-Gln-Arg-Ala-Ser-Glu-Arg-Trp-Lys-Ile-Arg-Gly-Ph
   e-Val-Arg-Ala-Ile-Glu-Ile-Thr-Tyr-Gly-Val-Asn-Gly-
   Trp-His-Pro-His-Ile-His-Phe-Val-Met-Phe-Leu-Asp-Gl
   y-Asp-Leu-Asp-Asp-Gly-Gln-Arg-Glu-Ala-Met-Gln-Gln-
   Trp-Leu-Leu-Asp-Arg-Trp-Lys-Thr-Met-Val-Lys-Arg-Va
   l-Ala-Lys-Ala-Tyr-Lys-Lys-Lys-Asp-Gly-Asn-Pro-Tyr-
   Asn-Val-Ala-Pro-Asn-Asp-Glu-His-Gly-Ile-Asp-Leu-Gl
   n-Phe-Lys-Ser-Gly-Lys-Asp-Ala-Gly-Thr-Ala-Ala-Ala-
   Glu-Tyr-Ile-Thr-Lys-Ile-Gln-Gly-Asp-Lys-Gly-Gly-Va
   l-Thr-Leu-Ala-Gln-Glu-Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Ile-Lys-
   Asn-Gly-Arg-Met-Gly-Ser-Val-Asn-Pro-Phe-Gln-Leu-Le
   u-Asp-Ser-Gly-Cys-Leu-Gly-Leu-Ser-Asp-Phe-Gln-Arg-
   Glu-Asp-Leu-Trp-Leu-Glu-Tyr-Trp-Gln-Ala-Thr-Leu-Ar
   g-Arg-Arg-Cys-Ile-Thr-Trp-Ser-Arg-Gly-Leu-Lys-Glu-
   Asp-Met-Glu-Val-Glu-Glu-Leu-Glu-Asp-Glu-Glu-Leu-Al
   a-Glu-Lys-Ala-Asp-Glu-Leu-Pro-Gly-Leu-Val-Gly-Tyr-
   Val-Val-Pro-Asn-Arg-Val-Tyr-Lys-Asp-Ile-Arg-Lys-Se
   r-Ala-Pro-Glu-Thr-Leu-Ala-Asp-Ala-Leu-Asp-Ala-Ala-
   Glu-Arg-Glu-Asp-Trp-Gln-Glu-Val-Ala-Arg-Leu-Leu-Pr
   o-Gly-Gly-Val-Ile-Leu-Thr-Asp-Glu-Gln-Gln-Asp-Ala-
   Ile-Ala-Asp-Gly-Glu-Ala-Lys-Pro-Gly-Asp-Tyr-Leu-Pr
   o-Thr-Met-Ser-Val-Met-Val