JPH05176777A - ラクトバチルス属乳酸桿菌の形質転換方法 及びその形質転換体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、ラクトバチルス属乳酸桿菌の形質
転換方法及びその形質転換体を示すものである。 【構成】 その要点は、ｐＨを低くし、蟻酸塩を添加
した培地で培養した菌体を用い、菌体懸濁液を例えば
４５℃で３０分の温度処理をした後、本菌で複製可能
なプラスミドとともに電気パルスをかけ（エレクトロポ
レーション法）、本菌に適する培地で発現培養した
後、選択培地で培養して形質転換株を取得するというも
のである。 【効果】乳酸桿菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌ
ｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ
は、ヨーグルトの製造等で産業上重要な乳酸菌である。
しかし、多くの研究にも拘らず今まで本菌での形質転換
は成功しておらず、本発明の方法による成功が初めての
例である。本方法を用いて異種の遣伝子（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＬ−乳酸脱水素酵素遺
伝子）を本菌に導入し発現させることにも成功したの
で、本発明の有用性が証明された。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、乳酸桿菌Ｌｂ．ｄｅｌ
ｂｒｕｅｃｋｉｉ種として分類されている（文献１）３
亜種ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ，ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ及
びｌａｃｔｉｓ全てに共通のものであるが、とりわけ産
業上有用で形質転換の報告のないＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅ
ｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの形質転
換方法及びその形質転換体に関するものである。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】乳酸菌
は多くの食品製造に用いられ、又、腸内常在細菌として
も有用な細菌であり、乳酸菌を遺伝子操作で改良するこ
とができればその有用性を一層増すことが期待される。
例えばチーズ・ヨーグルト等の発酵乳製品、漬物・ハム
・パンなど乳酸菌が重要な役割を果たす食品、家畜の飼
料（サイレージ）等の改良を科学的に進めることができ
る。

【０００３】又、乳酸菌は安全で美味しく多量の生菌を
摂取できる特徴を持っているので、乳酸菌に「健康増
進」効果を賦与して、今までにない新しい「機能性」食
品を開発することも可能である。更に将来は、腸内常在
細菌の改良による健康増進効果の発揮など、今後様々な
応用が考えられる魅力ある細菌である。

【０００４】この様な乳酸菌に、突然変異の誘起、接
合、細胞融合、遺伝子組換え操作などを行うことによっ
て、更によりよい形質を持つ優良菌株を作出することは
産業上極めて有用である。

【０００５】現在、外来遺伝子導入による乳酸菌の形質
転換には、菌体と外来遺伝子との懸濁液に高電圧のパル
スをかけ可逆的に膜破壊を起こさせ遺伝子を導入する技
術（電気穿孔法、エレクトロポレーション）が各種乳酸
菌で広く用いられている。この技術を利用した初めての
乳酸菌の形質転換の成功例としてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｌａｃｔｉｓの形質転換がある。その後乳酸桿
菌であるＬｂ．ｃａｓｅｉ、Ｌｂ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌ
ｕｓ、Ｌｂ．ｐｌａｎｔａｒｕｍやヨーグルト乳酸球菌
のＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓでも用いられて高い形
質転換頻度を得ており、応用のレベルに近づきつつある
（文献２、文献３、文献４）。しかしながらＬｂ．ｄｅ
ｌｂｒｕｅｃｋｉｉ種の形質転換については多くの研究
者が試みているにも拘らず困難を極め、ごく最近になっ
て本菌種と同一の種に属する他の亜種であるＬｂ．ｄｅ
ｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓにおい
て形質転換の報告（特願平３−１８３９２２）（文献
５）があるのみであり、ヨーグルト製造において中心的
な乳酸菌であるＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂ
ｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓでの形質転換は今まで全く
成功していない。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らはＬｂ．ｄｅ
ｌｂｒｕｅｃｋｉｉの組換えプラスミドによる形質転換
について研究を重ねてきた。その結果、Ｌｂ．ｄｅｌｂ
ｒｕｅｃｋｉｉ種で前記唯一の報告を除いてエレクトロ
ポレーション法による形質転換が全く成功しなかった理
由が、例えばＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓ
ｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの場合には通常の液体培地で
培養すると、連鎖すると同時に細胞が長くなり、細胞が
短い菌に比べると一定電圧下でのパルスによる細胞への
障害が著しく大きくなり、ＤＮＡ導入に必要なパルスに
耐えられないのが原因であると考えた。そして、細胞が
短くかつ生育が良好な培養方法を種々検討し、又、電気
パルス印加後の培養法を検討した結果、以下に記載の形
質転換方法を見い出し、Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ
形質転換に成功した。

【０００７】即ち本発明は、乳酸桿菌Ｌａｃｔｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ属に属するＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ
に、組換えプラスミドＤＮＡを導入して当該組換えプラ
スミドＤＮＡの遺伝子形質を獲得したＬｂ．ｄｅｌｂｒ
ｕｅｃｋｉｉの形質転換体を得るに際し、Ｌｂ．ｄｅｌ
ｂｒｕｅｃｋｉｉを初発ｐＨ４．５〜６．５に調整した
培地で本培養した後、Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉと
組換えプラスミドＤＮＡとの懸濁液に電気パルスを印加
し（エレクトロポレーション法）、次いで発現培養培地
で培養することにより、組換えプラスミドＤＮＡの遺伝
形質を獲得した形質転換体が得られることを特徴とする
Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの形質転換方法及びその
形質転換体である。本発明の詳細は次の通りである。

【０００８】（１）ベクターの構築 Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ種を宿主として働くベク
ターとしては、食品として安全な乳酸菌から分離したプ
ラスミドであることが望ましく、特に宿主であるＬｂ．
ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ種から分離したプラスミドがそ
の宿主の遺伝子発現系を利用でき好適である。

【０００９】例えば本発明者らはＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅ
ｃｋｉｉ約１００株をスクリーニングしてその内の１株
からＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕ
ｌｇａｒｉｃｕｓ Ｍ−８７８株（明治乳業ヘルスサイ
エンス研究所保存株；Ｍ−８７８株と略称；微工研寄託
番号ＦＥＲＭ Ｐ−１１９７８）から約８．０ｋｂのプ
ラスミドｐＢＵＬ１（特願平３−１８３９２２）を得て
いる。このＭ−８７８株の脱脂粉乳培地での継代中での
自然のプラスミドの欠落（ｃｕｒｉｎｇ）からこのｐＢ
ＵＬ１プラスミドの担う形質は不明（ｃｒｙｐｔｉｃ）
であることが判明している。

【００１０】更に本発明者らはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｌａｃｔｉｓの幾つかの株についてもその保持するプ
ラスミドの検索を行ったところ、明治乳業ヘルスサイエ
ンス研究所保存株Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉ
ｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ Ｍ−１２８Ｃ株（微工
研菌寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１２６５０；以下Ｍ−１２
８Ｃ株と言うことがある）から約２．８ｋｂという比較
的小さなサイズを持つ環状二本鎖ＤＮＡプラスミドｐＳ
Ｙ１を得ている。このｐＳＹ１は唯一の制限酵素部位と
して、ＥｃｏＲＩ、ＣｌａＩ、ＨａｅＩＩＩ及びＳｃａ
Ｉを有し、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩ、Ｓａ
ｌＩ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＫｐｎＩ及び
ＳａｃＩの制限酵素認識部位を有しない。

【００１１】これらのプラスミドに選択マーカーや乳酸
菌由来の酵素遺伝子を結合して組換えプラスミドを作製
する。例えばｐＢＵＬ１を用いた組換えプラスミドの場
合には、ｐＢＵＬ１のＸｂａＩ部位に、薬剤耐性遺伝子
としてエリスロマイシン耐性（Ｅｍ^ｒ）遺伝子を結合し
た組換えプラスミドｐＸ３や、このｐＸ３にヨーグルト
乳酸球菌であるＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＬ
−乳酸脱水素酵素（ＳＴ−ＬＤＨ）遺伝子を組込んだｐ
ＸＬ４８などがある（特願平３−１８３９２２）。ｐＳ
Ｙ１の場合は後で詳細に述べるがｐＳＹ１のＥｃｏＲＩ
部位に前記のＥｍ^ｒ遺伝子を組込んだｐＳＹＥ２や、こ
のｐＳＹＥ２をＢａｍＨＩとＫｐｎＩで切断したものと
前記ＳＴ−ＬＤＨ断片をライゲーション（ｌｉｇａｔｉ
ｏｎ）して得られるｐＳＹＥＬ２９などがある。

【００１２】更に食品として使用できる選択マーカー遺
伝子として、例えばＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓ
ｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ由来のチミジン合成酵
素遺伝子、或いはプロテアーゼ遺伝子をクローニング
し、それらを選択マーカーとして、前記のプラスミドｐ
ＢＵＬ１やｐＳＹ１に結合して組換えプラスミドを作成
し、Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕ
ｌｇａｒｉｃｕｓのチミジン或いはプロテアーゼ遺伝子
を欠損した変異株に、本発明方法を用いて導入し形質転
換することができる。

【００１３】チミジン合成酵素遺伝子の場合は大腸菌等
の該遺伝子欠損変異株（ｔｈｙＡ）を宿主とし、プロテ
アーゼ遺伝子の場合は該酵素活性を欠損しているチーズ
乳酸球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓ
ｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）等を宿主として、各々の酵素
活性を相捕するＤＮＡ断片を、常法によりＬｂ．ｄｅｌ
ｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ
の染色体ＤＮＡよりクローニングすればよい。クローニ
ングされた各々の酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を、ベク
ターのユニークな制限酵素切断部位、例えばｐＢＵＬ１
の場合はＸｂａＩ、ＢｇｌＩＩ、ＳｃａＩ、ｐＳＹ１の
場合はＥｃｏＲＩ、ＣｌａＩ、ＨａｅＩＩＩ等の部位に
挿入することにより、選択マーカー遺伝子を保持し食品
として安全なベクターが出来上がる。

【００１４】この場合、形質転換株の選択は、脱脂粉乳
培地での生育で行うことができる。即ち、本培地中には
チミジンが殆ど存在しないので、チミジン合成酵素遺伝
子を欠損している宿主に本遺伝子が導入された形質転換
株のみが生育できる。あるいは、Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅ
ｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ由来のプ
ロテアーゼ遺伝子を選択マーカーとして用いた場合も、
脱脂粉乳培地中では遊離アミノ酸が少ないので、乳蛋白
であるカゼインを分解してアミノ酸を取り込んで生育で
きるのは、プラスミドが導入された形質転換株のみであ
る。

【００１５】また、Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓ
ｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓが資化できる糖の種類
がグルコース、マンノース、フルクトース及びラクトー
スの４種類のみと極めて少ないという性質を利用する
と、食品製造に用いられる他の乳酸菌、例えば、Ｌｂ．
ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌｂ．ｃａｓｅｉ、Ｌｂ．ｄ
ｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ、
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等が保持するマルトー
ス、シュークロース、ソルビトール等の資化性遺伝子を
選択マーカーにすることができる。これらの乳酸菌染色
体ＤＮＡからの該糖資化性酵素遺伝子のクローニング
は、例えば、該糖資化性能が無い乳酸菌（Ｌａｃｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ
ＩＬ１４０３株）等を宿主として、常法により該糖の
資化性を獲得した形質転換株を選択することによって行
うことが出来る。該遺伝子を含むクローニングされたＤ
ＮＡ断片は、上述の様にＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ
ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓで用いることので
きる安全な選択マーカーを持つベクターとすることがで
きる。これらの場合、Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ
ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの野生株を宿主とす
ることができ、それぞれの糖を唯一の炭素源とする培地
で形質転換株を選択できる。

【００１６】更に、Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓ
ｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓが資化出来ない糖を分
解できる菌体外酵素遺伝子をマーカーとして利用するこ
とができる。例えば、納豆菌や食用酵母などのアミラー
ゼ、グルコシダーゼ等の遺伝子を用い、デンプンやマル
トースを唯一の炭素源とする培地で形質転換株を選択す
る。なお、これらの他に、乳酸菌で使用可能な他の遺伝
子を食品用の安全なマーカーとすることが出来ることは
言うまでもない。例えば、乳糖資化性遺伝子、キシロー
ス資化性遺伝子、ナイシン耐性遺伝子、バクテリオファ
ージ耐性遺伝子、アミノ酸合成遺伝子、等がある。

【００１７】（２）プラスミドＤＮＡの調製 乳酸菌由来のプラスミドＤＮＡの調整は、Ａｎｄｅｒｓ
ｏｎとＭｃＫａｙの方法（文献６）に準じて行えば良
い。例えば、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓか
らのプラスミドは、ＡｎｄｅｒｓｏｎとＭｃＫａｙの方
法の通り調製し、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）存
在下での塩化セシウム（ＣｓＣｌ）密度勾配遠心法によ
り精製する。Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓ
ｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓからのプラスミドは本発明者
ら独自の方法（特願平３−１８３９２２）、即ち洗浄菌
体を０．３Ｍラフィノース含有緩衝液に懸濁し、リゾチ
ームとムタノリシンを併用して溶菌させ、遠心した後、
緩衝液を０．４Ｍシュークロースを含有するのもの（文
献６）と入れ換える。その後の溶菌以降の操作はＡｎｄ
ｅｒｓｏｎとＭｃＫａｙの方法に従って調製し、ＥｔＢ
ｒ−ＣｓＣｌ密度勾配遠心法で精製する。

【００１８】（３）宿主 形質転換に用いる宿主は一般にプラスミドを持たない株
（又はｃｕｒｉｎｇ処理によりプラスミドを除去した
株）が用いられるが、本Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ
種の場合、殆ど全ての菌株がプラスミドを持たないので
そのまま宿主となり得る。更に、Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅ
ｃｋｉｉの制限・修飾酵素が欠損した変異株を用いれば
外来ＤＮＡによる形質転換効率が上昇する利点がある。
ベクターとしてプラスミドｐＢＵＬ１を用いる場合、プ
ラスミドの複製可能性などの観点から、ｐＢＵＬ１の由
来株であるＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓ
ｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ Ｍ−８７８株より自然にプ
ラスミドｐＢＵＬ１が脱落した１株ＢＧ（−）Ａ株を宿
主として用いることが合理的である。と同時に、Ｌｂ．
ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉ
ｃｕｓの標準株であるＡＴＣＣ１１８４２株等の同亜種
に属する菌株はもとより、他の亜種であるｄｅｌｂｒｕ
ｅｃｋｉｉやｌａｃｔｉｓも宿主として用いてもよい。

【００１９】（４）形質転換 エレクトロポレーション法による形質転換は、受容菌の
培養→集菌と洗浄→菌体を緩衝液に懸濁→氷冷→組換え
プラスミドＤＮＡの添加→電気パルスを印加→発現培養
→選択培地での培養、の手順で行う。以下に記載する方
法は、Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ種のうち、Ｌｂ．
ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉ
ｃｕｓの場合に適用されるものであるが、他の亜種にも
該方法に準じて適用できる。

【００２０】（４−１）前培養 前培養に用いる培地は通常の乳酸菌培養に用いられる培
地例えばＬＣＭ培地（文献７）、又は、ＬＣＭ培地に１
％グルコースを添加し、１２１℃で１５分間オートクレ
ーブした培地（ＬＣＭＧ培地）、又はＬＣＭＧ培地に蟻
酸ナトリウムを添加した培地（Ｆ−ＬＣＭＧ培地）、例
えば蟻酸ナトリウムを５ｍｇ／ｍｌを添加し、ｐＨを
５．５に調整した後メンブレンフィルター（孔径０．４
５μｍ）で除菌した培地などが用いられる。培養温度及
び培養時間は菌株によるが、通常３７〜４２℃で１０〜
２０時間静置培養する。前培養後、菌体を遠心集菌し、
洗浄用緩衝液例えば、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝
液（ｐＨ ７．０）などで菌体を洗浄し次の本培養に移
行する。

【００２１】（４−２）本培養 本培養の培養条件に関しては、培地の種類、初発ｐＨ、
培養時間によって細胞の形態等が変化し形質転換頻度に
大きく影響を与えるので重要である。

【００２２】本培養培地には、前記ＬＣＭＧ培地又はＦ
−ＬＣＭＧ培地を使用する。培地の初発ｐＨは４．５〜
６．５の範囲内であることが必須条件である。初発ｐＨ
が６．５を越えると形質転換株を得ることは出来ない。
更に好ましくは初発ｐＨが５．０〜５．５の範囲内であ
ることが形質転換頻度を高める要因となる。前記Ｆ−Ｌ
ＣＭＧ培地の場合、ＬＣＭＧ培地よりも形質転換頻度が
格段に良い。なお、蟻酸塩の添加量は０．２〜１０ｍｇ
／ｍｌで効果があり、好ましくは２〜５ｍｇ／ｍｌであ
る。培養温度は３７〜４２℃で１〜５時間であり、好ま
しくは４２℃で２〜３時間静置培養する。

【００２３】培養後、遠心で集菌して前記洗浄用緩衝液
で丁寧に洗浄（通常３回）した後、イオン強度の低い高
張緩衝液、例えば０．３Ｍラフィノース、２ｍＭＫ_２Ｈ
ＰＯ_４（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２からなるエ
レクトロポレーション用緩衝液（以下ＥＢ）で１回洗浄
し次の工程に移行する。

【００２４】（４−３）菌体懸濁液の調製と各種温度処
理 高濃度の形質転換用菌体懸濁液（以下菌体懸濁液）を調
製する。即ち、０℃に保持した前記ＥＢ等に、菌体を高
濃度で懸濁し、０℃に保持する。更に、該菌体懸濁液を
０〜１５℃で３〜２４時間、２０〜３７℃で約３時間、
４０〜５０℃で１０〜６０分保持してから、エレクトロ
ポレーションを行うと０℃の菌体懸濁液を直ちにエレク
トロポレーションにかける場合と比較して、２〜１０倍
の形質転換頻度が認められる。従ってエレクトロポレー
ション前の菌体懸濁液の前記温度処理は、形質転換頻度
向上に有効であることが認められる（なお、該菌体懸濁
液を−８０℃で凍結保存した後、エレクトロポレーショ
ンしても形質転換頻度は低下しない）。

【００２５】（４−４）エレクトロポレーション エレクトロポレーションは、前記菌体懸濁液と、組換え
プラスミドＤＮＡ溶液とを混合したものを容器に入れ、
それに２つの電極を差込んでパルス発生装置とを連結さ
せ電気パルスを印加する。パルス発生装置として例えば
米国バイオラド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）製のジーンパル
サー（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ、登録商標）を用いた場
合、０．２ｃｍキュベットに、４０〜８０μｌの前記菌
体懸濁液と組換えプラスミドＤＮＡ溶液１〜２μｌとを
入れ、２５μＦ、１〜２ｋＶ／０．２ｃｍの電気パルス
を、例えば２００Ωの抵抗を接続して印加すれば良い。

【００２６】（４−５）発現培養 電気パルス印加後は、電気パルスによる菌体の損傷を回
復し、導入されたプラスミドにコードされた遺伝子の発
現を促すため、発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）培養を行
う。発現培養においては、本発明者らが考案した独自の
発現培養培地、例えば脱脂粉乳培地（以下ＳＭ培地と言
う；１０％脱脂粉乳、０．１％酵母エキス；１２０℃で
７分間オートクレーブ滅菌）と、０．３Ｍラフィノー
ス、２％カザミノ酸及び５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含有す
る液（孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターで除菌
濾過）とを、１：１（ｖ／ｖ）に混合した培地（ＥＸＢ
Ｇ培地）を用いるとＢＧ（−）Ａ株での電気パルスによ
る損傷の修復が促進され、形質転換効率は向上する。パ
ルス印加後、菌体懸濁液全てを発現培養培地に移して懸
濁した後、３７℃２時間程度培養する。

【００２７】発現培養培地での培養後、培養液を選択培
地に移して選択培養［ＧａｓＰａｋジャー（ＢＢＬ社
製、登録商標）嫌気培養、３７〜４２℃で２〜４日間］
し、生じたコロニーを選び、選択培地で形質転換株を純
化した後、各種の性質を調べる。

【００２８】なお、本発明の方法を用いてＬｂ．ｄｅｌ
ｂｒｕｅｃｋｉｉを形質転換可能する場合、使用可能な
プラスミドは、Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ内で複製
可能なプラスミドである必要は必ずしもない。例えば、
他の微生物で複製可能であるがＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃ
ｋｉｉ内で複製が不可能なプラスミドＤＮＡ（例えばＥ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのｐＢＲ３２２プラス
ミドなど）に、Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの染色体
の一部と乳酸菌由来の酵素遺伝子を組込んだ組換えプラ
スミドを作製し、該組換えプラスミドを本発明の形質転
換方法を用いてＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉを形質転
換してもよい。この場合、導入した組換えプラスミドが
宿主染色体に組込まれ子孫代々安定に保持される。続い
て本発明の実施例を以下に記載する。

【００２９】

【実施例】

実施例１ プラスミドｐＸ３によるＢＧ（−）Ａ株の形
質転換 プラスミドｐＢＵＬ１の保有株であるＬｂ．ｄｅｌｂｒ
ｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ Ｍ
−８７８株を、ＳＭ培地で継代培養し、自然にプラスミ
ドｐＢＵＬ１を失った株［ＢＧ（−）Ａ株と略称］を用
いた。組換えプラスミドとしては、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ ＩＬ
１４０３株（フランスＩＮＲＡのＡｌａｉｎ Ｃｈｏｐ
ｉｎ博士より分与；以下ＩＬ１４０３株）からＡｎｄｅ
ｒｓｏｎ＆Ｍｃｋａｙの方法によりプラスミドｐＸ３を
調製し（特願平３−１８３９２２）、ＥｔＢｒ−ＣｓＣ
ｌ密度勾配遠心法で精製したものを用いた。この組換え
プラスミドｐＸ３は、Ｍ−８７８株由来のプラスミドｐ
ＢＵＬ１のＸｂａＩ部位に選択マーカーとしてｐＡＭβ
１（文献９）由来のエリスロマイシン（Ｅｍと略称）耐
性遺伝子を挿入したものである（特願平３−１８３９２
２）。ＢＧ（−）Ａ株を、Ｆ−ＬＣＭＧ培地（初発ｐＨ
５．５）に０．５％（ｖ／ｖ）接種し３７℃で１５時間
静置培養（前培養という）した。

【００３０】この前培養液を遠心（３，０００ｒｐｍ、
室温、５分）し、菌体を２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．０）で１回洗浄した後、予め４２℃に保持したＦ
−ＬＣＭＧ培地に初発濁度（ＯＤ_６６０ｎｍ）が０．２
５となるように菌体を接種し、４２℃で２時間静置培養
（本培養）した。培養液を遠心（３，０００ｒｐｍ、室
温、５分）し、菌体を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．０）で３回洗浄した後、更にＥＢで１回洗浄し、
遠心（３，０００ｒｐｍ、０℃、５分）した。菌体を濁
度（ＯＤ_６６０ｎｍ）が５０となるようにＥＢに懸濁
し、エレクトロポレーションまで０℃に保持した。ＢＧ
（−）Ａ株の組換えプラスミドｐＸ３による形質転換
は、米国バイオラド社のジーンパルサーをパルス発生装
置として用い、エレクトロポレーション法により行っ
た。

【００３１】プラスミドｐＸ３（約１μｇＤＮＡ／μｌ
ＴＥ緩衝液）１〜２μｌを０．２ｃｍキュベットに入
れ、これに前記の菌体懸濁液８０μｌを加えて電気パル
ス（１．５ｋＶ／０．２ｃｍ、２５μＦ、２００Ω）を
１回印加した。次いでキュベット内の液全てを発現培養
するためのＥＸＢＧ培地２ｍｌに接種し、３７℃で２時
間静置培養して、電気パルス印加による菌体の損傷の修
復とＥｍ耐性発現を行った。

【００３２】ＥＸＢＧ培地での培養後、培養液をリトマ
スミルク（Ｄｉｆｃｏ）寒天培地に２５μｇ／ｍｌのＥ
ｍを添加した培地に混釈固化し、ＧａｓＰａｋジャーで
４２℃、２〜４日間嫌気培養した。

【００３３】この結果、１個のエリスロマイシン耐性コ
ロニーを得ることが出来た。このコロニーをエリスロマ
イシン添加（２５μｇ／ｍｌ）寒天培地で純化した後、
各種性質を調べた結果、真の形質転換株であることが判
明した。これはＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂ
ｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓでの世界で初めての形質転
換株であり、この株をＡ１−Ａ株と命名した（微工研寄
託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１２６５４）。本形質転換株はエ
リスロマイシン耐性を示し、ｐＸ３プラスミドを保持す
る点を除けば、微生物学的性質は宿主であるＢＧ（−）
Ａ株と差異が認められなかった。

【００３４】Ａ１−Ａ株の性質をまとめると、 ｉ）Ｅｍ耐性：１ｍｇＥｍ／ｍｌでも生育し、強いＥｍ
耐性を示した。 ｉｉ）プラスミド：アガロースゲル電気泳動上で用いた
ｐＸ３プラスミドと同じ移動度を示すプラスミドが検出
され、精製後調べた結果、ＩＬ１４０３株由来のｐＸ３
と同じ制限地図を示した。 ｉｉｉ）微生物学的性状：表１に示されるように宿主の
ＢＧ（−）Ａ株と同一であり、Ｅｍ耐性株がＬｂ．ｄｅ
ｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕ
ｓ株であることが確認された。

【００３５】

【表１】

【００３６】次に、この結果の再現性を前記と全く同じ
条件で試みた。パルス当たり１〜２μｇのＩＬ１４０３
株由来のｐＸ３ＤＮＡを用いると、エリスロマイシン耐
性コロニーの出現数は、実験により１μｇ当たり０〜３
個（平均で約０．５個）であり、再現性は確かめられた
ものの形質転換頻度は極めて低いことが明らかとなっ
た。

【００３７】実施例２ プラスミドｐＸ３によるＬｂ．
ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃ
ｕｓ標準株（ＡＴＣＣ１１８４２株）の形質転換 次に、実施例１の方法がＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ
ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ一般に適用出来る
かどうかを調べるため、ＢＧ（−）Ａ株の代わりにＬ
ｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａ
ｒｉｃｕｓの標準株であるＡＴＣＣ１１８４２株につい
て検討した。ＡＴＣＣ１１８４２株を、Ｆ−ＬＣＭＧ培
地ではなく、ＬＣＭＧ培地で前培養した点及び宿主とし
前記ＡＴＣＣ１１８４２株を使用した点を除いて、実施
例１と同じ材料及び方法で形質転換を行った。

【００３８】その結果、ＢＧ（−）Ａ株を用いたときと
ほぼ同等の（平均で約０．２個）形質転換頻度を得るこ
とが出来た。また、得られたコロニーはｐＸ３プラスミ
ドを保持しエリスロマイシン耐性を示し、真の形質転換
株であることが判明した。その１株であるＤ１０株（微
工研寄託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１２６５２）の性質を表
２に示す。従って、実施例１の方法がＬｂ．ｄｅｌｂｒ
ｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ一般
に適用できることが示された。

【００３９】

【表２】

【００４０】実施例３ Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ
ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ形質転換株由来の
ｐＸ３プラスミドによるＢＧ（−）Ａ株とＡＴＣＣ１１
８４２株の形質転換 実施例１及び２では形質転換頻度が極めて低かったが、
この原因の一つとして所謂「制限系」による障壁が考え
られた。即ち、宿主として用いたＢＧ（−）Ａ株とＡＴ
ＣＣ１１８４２株は、多くの細菌に認められる「制限・
修飾系」をもち、外来のＤＮＡを切断するため形質転換
頻度が低くなる可能性である。

【００４１】この「制限系」による障壁を迂回するた
め、実施例１で得られたＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ
ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの形質転換株Ａ１
−Ａ株及び、実施例２で得られたＤ１０株より各々ｐＸ
３プラスミドＤＮＡを特願平３−１８３９２２記載の方
法で調製した。ＥｔＢｒ−ＣｓＣｌ密度勾配遠心法で精
製した。得られたｐＸ３プラスミドは約１μｇＤＮＡ／
μｌの濃度でＴＥ緩衝液に溶解した。

【００４２】前記プラスミドｐＸ３を用いて、ＢＧ
（−）Ａ株及びＡＴＣＣ１１８４２株を宿主として、実
施例１及び実施例２に示した方法で形質転換した結果、
Ａ１−Ａ株由来のｐＸ３プラスミド１μｇ当りＢＧ
（−）Ａ株では平均約１，０００個、Ｄ１０株由来ｐＸ
３プラスミド１μｇ当たりＡＴＣＣ１１８４２株では平
均約２個の形質転換株が得られた。

【００４３】ＩＬ１４０３株由来のｐＸ３と比べ、形質
転換頻度が飛躍的に向上したので、ＢＧ（−）Ａ株及び
ＡＴＣＣ１１８４２株に「制限・修飾系」の存在が示さ
れ、形質転換頻度が低い理由の少なくとも一つが判明し
た。

【００４４】同時に、Ａ１−Ａ株由来のプラスミドを用
いるとＢＧ（−）Ａ株での形質転換頻度が高くなったの
で、Ａ１−Ａ株由来のｐＸ３プラスミドとＢＧ（−）Ａ
株の組合せで、形質転換頻度に関する条件検討を行うこ
とが可能となった。

【００４５】実施例４ Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ
ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの形質転換頻度に
及ぼす培養条件の検討 実施例１〜３に示したように、Ｆ−ＬＣＭＧ培地で本培
養したＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂ
ｕｌｇａｒｉｃｕｓで形質転換が成功した。しかし、Ｌ
ＣＭＧ培地、ＭＲＳ培地など通常乳酸桿菌用に用いられ
ている液体培地で本培養した細胞を用いると形質転換株
が全く得られなかった。そこで前培養及び本培養の培地
がＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌ
ｇａｒｉｃｕｓの形質転換頻度に及ぼす効果について検
討した。

【００４６】（１）前培養培地の効果 実施例１では前培養をＦ−ＬＣＭＧ培地で行ったが、前
培養の培地の効果を調べるためＢＧ（−）Ａ株をＦ−
ＬＣＭＧ培地、ＬＣＭＧ培地、ＳＭ培地（寒天培地
上に菌を塗布し、ＧａｓＰａｋジャーで嫌気培養）、の
３通りで培養（３７℃１５時間）し、菌体を洗浄後（Ｓ
Ｍ培地の場合は、滅菌水で菌体を寒天培地上に回収した
後遠心して洗浄）Ｆ−ＬＣＭＧ培地に接種して本培養
（４２℃、２時間）した。各々の菌体を集菌し洗浄した
後、Ａ１−Ａ株由来のｐＸ３プラスミドＤＮＡを用いた
以外は実施例１と同様の方法でＢＧ（−）Ａ株の形質転
換を行った。Ａ１−Ａ株由来のｐＸ３を用いた理由は、
外来（ＩＬ１４０３株由来）のｐＸ３を用いるよりも格
段に高い形質転換効率が得られるためである。

【００４７】その結果、、、のどの培地を前培養
に用いても、得られたエリスロマイシン耐性コロニーの
数は１μｇＤＮＡ当り約１，０００であったので、少な
くとも前培養の培地は形質転換頻度には殆ど無関係であ
ることが分かった。以後の実験では、ＢＧ（−）Ａ株の
前培養にはＦ−ＬＣＭＧ培地を用いている。

【００４８】（２）本培養用培地の初発ｐＨ及び蟻酸ナ
トリウムの添加効果 ＬＣＭＧ培地をオートクレーブ滅菌したのちｐＨを測定
すると約６．５である。このオートクレーブしたＬＣＭ
Ｇ培地及び、該ＬＣＭＧ培地に蟻酸ナトリウム５ｍｇ／
ｍｌ添加した培地の二種類を作成した。これらの培地に
それぞれ塩酸を添加してｐＨを４．５、５．０，５．
５、６．０、及び６．５に調整してからメンブレンフィ
ルター（孔径 ０．４５μｍ）で除菌濾過した。

【００４９】これら合計１０種の培地を予め４２℃に保
持し、これらの培地にＢＧ（−）Ａ株を初発濁度（ＯＤ
_６６０ｎｍ）が０．２５となるように接種して４２℃で
２時間本培養した（但し、ｐＨ＝４．５に調整した培地
では生育が悪かったので本培養を４時間行った）。Ａ１
−Ａ株由来のｐＸ３プラスミドＤＮＡを用いた以外は実
施例１と同じ方法でＢＧ（−）Ａ株の形質転換を行っ
た。結果を図１に示す。

【００５０】これらの結果から、以下の結論が得られ
た。 本培養培地の初発ｐＨが４．５から６．５で形質転換
株が得られた。特に５．０から５．５で形質転換効率が
高く、乳酸菌で通常用いられる培地のｐＨである６．５
以上では殆ど形質転換株が得られなかった。従って、Ｌ
ｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａ
ｒｉｃｕｓの形質転換に必須の本培養の培地の初発ｐＨ
は５．０〜５．５付近であることが明らかとなった。

【００５１】ＬＣＭＧ培地に蟻酸ナトリウムを５ｍｇ
／ｍｌ添加した培地では、無添加のＬＣＭＧ培地と比較
して、どのｐＨでも形質転換頻度が格段に高くなってい
た。従って、蟻酸塩の添加は形質転換頻度の上昇に有効
であることが判明した。また、蟻酸ナトリウムの添加量
を０．２から１０ｍｇ／ｍｌまで変化させ初発ｐＨを
５．５に調整した培地で検討した結果、２〜５ｍｇ／ｍ
ｌが形質転換頻度の向上に最も有効であった。

【００５２】従って、細胞形態が短くなる培地として
当初選択したＦ−ＬＣＭＧ培地は、同時にＬｂ．ｄｅｌ
ｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ
の形質転換のための本培養の培地としても最も良好なも
のの一つであることが判明し、この培地を用いたために
実施例１でＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ．
ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの形質転換株が初めて得られたと
考えられる。

【００５３】実施例５ 菌体懸濁液を各種温度で保持す
る効果 （１）凍結保存 実施例１と同じ方法で調製したＢＧ（−）Ａ株の菌体懸
濁液を小チューブに分注し、−８０℃フリーザーで凍結
保存（１日以上）した後、０℃で溶解しその８０μｌを
使ってＡ１−Ａ株由来のプラスミドｐＸ３を用いた以外
は実施例１と同じ方法で形質転換を行った。その結果、
調製当日の細胞で行ったのとほぼ同じかそれ以上の形質
転換頻度が得られた。

【００５４】従って、菌体懸濁液を−８０℃で凍結保存
しても形質転換頻度が低下しないので、一度菌体懸濁液
を調製しておけばいつでも同一の菌体が使用でき、菌体
調製が容易になったばかりではなく信頼性のある比較実
験が可能となった。

【００５５】（２）０℃以上での保持効果 １）次に、ＢＧ（−）Ａ株について０℃以上での保持効
果を調べた。実施例１と同じ方法で調製したＢＧ（−）
Ａ株の菌体懸濁液を小チューブに分注し、エレクトロポ
レーション前にそれぞれ０、１０、１５、２０、３０、
３７、４５℃の湯浴中に一定時間（１０分〜２４時間）
保持した後、０℃にしてからＡ１−Ａ株由来のプラスミ
ドｐＸ３を用いて実施例１と同じ方法で形質転換を行っ
た。

【００５６】その結果、菌体懸濁液を、０〜２０℃では
３〜２４時間、３０℃では約３時間、３７℃〜４５℃で
は１０分〜１時間保持することによって、無処理の細胞
と比較して２〜１０倍形質転換頻度の上昇が認められ
た。これらの効果は若干の振れがあるものの上昇効果自
体の再現性はあった。

【００５７】図２に、４５℃での保持時間を変えて形質
転換頻度を調べた結果を示した。

【００５８】なお、４５℃で１０〜６０分保持した細胞
懸濁液を−８０℃で凍結保存しても形質転換頻度は凍結
前の細胞を使った結果と大差はなかった。

【００５９】以上検討してきた結果、ＢＧ（−）Ａ株の
場合、 本培養の培地をＦ−ＬＣＭＧ（ｐＨ＝５．５、５ｍｇ
／ｍｌの蟻酸ナトリウム含有ＬＣＭＧ）培地で４２℃２
〜３時間培養し、 菌体懸濁液を、ある温度で保持（例えば、４５℃３０
分）、 Ａ１−Ａ株由来の（「制限系」による障壁の無い）プ
ラスミドｐＸ３を用いて、エレクトロポレーションを行
うと、形質転換頻度として、１μｇＤＮＡ当り最高約１
０^４個の形質転換株が得られることが明らかとなった。

【００６０】２）更に ＡＴＣＣ１１８４２株につい
て、本培養培地にＬＣＭＧ培地及びＦ−ＬＣＭＧ培地
（蟻酸ナトリウム５ｍｇ／ｍｌ添加）を用い、それぞれ
の初発ｐＨを５．５及び６．５とし、更にそれぞれの菌
体懸濁液を４５℃３０分処理した場合と無処理の場合の
形質転換頻度をＤ１０由来のｐＸ３プラスミドを用いて
検討した。

【００６１】その結果、本培養培地の初発ｐＨが６．５
では蟻酸ナトリウムの添加効果も菌体懸濁液の加温処理
効果も全く認められなかったが、ｐＨが５．５ではそれ
のみで平均０．２個の形質転換が認められ、更に蟻酸ナ
トリウムの添加及び４５℃での保持によって最高７８個
の形質転換株が得られた。

【００６２】従って、Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ
ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの標準株の場合で
も、本培養培地の初発ｐＨを５．５とすることが必須で
あり、更に蟻酸ナトリウムの添加と菌体懸濁液の４５℃
での保持が有効であることが示された（なお、本株でも
詳細に条件検討を行うことによって、形質転換頻度を飛
躍的に上昇させることが出来る）。

【００６３】実施例６ Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓ ＩＬ１４
０３株由来ｐＸ３プラスミドによるＬｂ．ｄｅｌｂｒｕ
ｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの至適
条件下での形質転換効率 実施例４及び５で、ＢＧ（−）Ａ株やＡＴＣＣ１１８４
２株の形質転換の至適条件が明らかとなった。これら
は、「制限系」の障壁の無いプラスミドを用いた結果で
あるが、次に、「制限系」の障壁のある外来（ＩＬ１４
０３株由来の）プラスミドｐＸ３による形質転換頻度
を、ＢＧ（−）Ａ株の至適条件（本培養をＦ−ＬＣＭＧ
培地で行い、菌体懸濁液を４５℃３０分保持した後エレ
クトロポレーションを行う方法）で測定した。

【００６４】その結果、１μｇＤＮＡ当り、ＢＧ
（−）Ａ株では約６０個、ＡＴＣＣ１１８４２株では
約５個の形質転換株が得られた。即ち、４５℃で３０分
の保持処理を加えることによって、「制限系」の障壁の
ある外来プラスミドｐＸ３による形質転換株が、実施例
１、２と比較すると、格段に高い頻度で得られるように
なった。

【００６５】実施例７ ｐＳＹＥ２プラスミドによるＬ
ｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａ
ｒｉｃｕｓ ＢＧ（−）Ａ株の形質転換 以上はプラスミドとしてｐＢＵＬ１を用いた結果である
が、次に、他のプラスミドでのＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃ
ｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの形質転換
可能性について検討した。

【００６６】本発明者らが構築したｐＳＹＥ２プラスミ
ドを用い、実施例６と同じ方法でＢＧ（−）Ａ株の形質
転換を行った結果、１μｇＤＮＡ当り１〜２個の形質転
換株（０−６Ａ株、微工研寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１２
６５３）が得られたので、本ｐＳＹＥ２プラスミドもＬ
ｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａ
ｒｉｃｕｓの形質転換に有効であることが判明した。

【００６７】ｐＳＹＥ２プラスミドの調製方法は以下の
通りである。

【００６８】Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ
ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ Ｍ−１２８Ｃ株よりＡｎｄ
ｅｒｓｏｎとＭｃＫａｙの方法に準じた方法でｐＳＹ１
プラスミドＤＮＡを調製した。即ち、Ｍ−１２８Ｃ株を
５００ｍｌのＬｙｓｉｓ培地に１％の初発濃度で植菌
し、３２℃で４時間培養して得られた菌体について、リ
ゾチームとＳＤＳによる溶菌からプラスミドＤＮＡの粗
精製までを行なった。

【００６９】得られた粗プラスミドＤＮＡ標品を常法
（文献８）に従ってＲＮａｓｅ処理を行なった後、アガ
ロースゲル電気泳動を行なってｐＳＹ１に相当するＤＮ
Ａバンドを切り出し、ＢＩ０１０１社のＧＥＮＥＣＬＥ
ＡＮ ＤＮＡ精製キットを用いて回収したものを精製ｐ
ＳＹ１標品（約５μｇ）とした。

【００７０】ｐＳＹ１を各種制限酵素（寳酒造社製）で
切断し、得られた切断片の塩基対の長さをアガロースゲ
ル電気泳動により求めた結果、ｐＳＹ１はＥｃｏＲＩ、
ＨａｅＩＩＩ，ＣｌａＩ及びＳｃａＩの認識部位をそれ
ぞれ１ケ所づつ持つ環状二本鎖ＤＮＡプラスミドであ
り、ｐＳＹ１全体の長さは約２，８００塩基対（ｂｐ）
であった。また、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ、Ｐｓｔ
Ｉ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、Ｋｐ
ｎＩ及びＳａｃＩの認識部位は存在しなかった。図３に
ｐＳＹ１の制限酵素地図を示す。表３の配列番号１にｐ
ＳＹ１のＤＮＡ配列を示す。

【００７１】

【表３】

【００７２】ｐＡＭβ１由来のエリスロマイシン耐性遺
伝子を約１．１ｋｂの長さのカセットとして持つプラス
ミドｐ８Ｅｍｌ（特願平３−１８３９２２参照）を、ｐ
８Ｅｍｌを含む大腸菌ＴＧ１の形質転換株から文献８に
従って調製した。ｐ８ＥｍｌをＥｃｏＲＩで切断し、ｐ
ＳＹ１をＥｃｏＲＩで切断したものとライゲーション反
応させた。ライゲーション反応後の反応液をＣｈａｎｇ
らの方法（文献１０）に従ってＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ ２０７−２５株（文献１１）の形質転換
に用い、２５μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含むＤＭ
３培地プレート（文献１０）上で選択してＥｍ耐性の形
質転換株を得た。得られた形質転換株よりプラスミドを
調製し、その制限酵素切断パターンを解析した。形質転
換株中は図４のＡ及びＢに示される制限酵素地図を有す
るプラスミドのうちいずれかを含有していた。図４のＡ
のプラスミドをｐＳＹＥ１、ＢのプラスミドをｐＳＹＥ
２と命名した。

【００７３】実施例８ ＢＧ（−）Ａ株への乳酸菌由来
の酵素遺伝子（Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子）の導入と発
現 次に、本発明の形質転換系を用いて、乳酸菌由来の酵素
の遺伝子の導入と発現が可能であることを示す。

【００７４】乳酸菌由来の酵素遺伝子として、Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｓｕｂｓ
ｐ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｍ−１９２株由来のＬ
−乳酸脱水素酵素遺伝子（特開平３−２５１１７２；Ｓ
Ｔ−ＬＤＨと略称）を選んだ。この遺伝子を含むＭ−１
９２株の染色体ＤＮＡのＳｓｐＩ断片１．１ｋｂをｐＸ
３プラスミドに挿入して得たｐＸＬ４８プラスミド（特
願平３−１８３９２２）を用い、実施例６と同じ方法で
ＢＧ（−）Ａ株を形質転換した（なお、ｐＸＬ４８プラ
スミドＤＮＡは、ＩＬ１４０３株より調製し、約１μｇ
／μｌの濃度でＴＥ緩衝液に溶解した）。

【００７５】その結果、１μｇＤＮＡ当り１〜２個のエ
リスロマイシン耐性コロニーが得られた。これらのコロ
ニー合計８個を各々純化した後、各種性質を調べると全
て同一であった。その内の１株Ｈ１１−１Ａ株（微工研
菌寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１２６５１）は、エリスロマ
イシン耐性を示し、アガロースゲル電気泳動でＩＬ１４
０３株由来のｐＸＬ４８と同一の移動度を示すプラスミ
ドを保持した。また、宿主のＢＧ（−）Ａ株が生成する
乳酸の旋光性はＤ（−）なのに対して、Ｈ１１−１Ａ株
の生成する乳酸を調べると、Ｄ（−）乳酸とともにそれ
とほぼ同量のＬ（＋）乳酸が存在していた。生成した乳
酸の合計量は、宿主のＢＧ（−）Ａ株のそれとほぼ同じ
であった。従って、形質転換株Ｈ１１−１Ａ株では、導
入されたｐＸＬ４８プラスミドに存在するＬ−乳酸脱水
素酵素遺伝子（ＳＴ−ＬＤＨ遺伝子）が発現し、Ｌ
（＋）乳酸生成能が賦与されたことが示された。

【００７６】なお、Ｈ１１−１Ａ株は、ｐＸＬ４８プラ
スミドを保持しエリスロマイシン耐性とＬ（＋）乳酸生
成能を示す点以外の微生物学的性質はＢＧ（−）Ａ株と
差異が認められなかった。

【００７７】更に、形質転換株Ｈ１１−１Ａ株よりｐＸ
Ｌ４８プラスミドＤＮＡを調製し、実施例６と同じ方法
でＢＧ（−）Ａ株を形質転換すると、１μｇＤＮＡ当り
約２００から３００個の形質転換株が得られたが、これ
らも全てｐＸＬ４８プラスミドを保持し、エリスロマイ
シン耐性とＬ（＋）乳酸生成能を示した。以上の結果か
ら、本発明の形質転換方法を用いることによって、乳酸
菌由来の酵素遺伝子を含め、他の有用な異種遺伝子の導
入と発現が可能であることが証明され、本発明の有用性
が示された。

【００７８】

【引用文献】

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ＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，７８，２０７
−２１２． ６．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．ａｎｄ Ｌ．Ｌ．ＭｃＫａ
ｙ，（１９８３）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．，４６，５４９−５５２． ７．Ｅｆｔｈｙｍｉｏｕ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，（１９６
２）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１１０，２５８−２
６７． ８．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（１９８
２）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． ９．ＬｅＢｌａｎｃ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ Ｌ．Ｎ．Ｌｅ
ｅ，（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５７
４４５−４５３． １０．Ｃｈａｎｇ，Ｓ．ａｎｄ Ｓ．Ｎ．Ｃｏｈｅｎ，
（１９７９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，
１１１−． １１．Ｙａｍａｎｅ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８
４）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９６，１８４９−１８５８．

【発明の効果】本発明により、今まで形質転換の報告が
全くなかったＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓ
ｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓで形質転換が可能になり、更
にＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの他の亜種であるｄｅ
ｌｂｒｕｅｃｋｉｉやｌａｃｔｉｓにも本発明の形質転
換方法の適用が可能となった。又、乳酸菌由来の酵素遺
伝子を含め、他の有用な異種遺伝子の発現も可能となる
ことから、本発明は乳酸菌の形質改良に広い応用が期待
できる。まず、本方法を用いてヨーグルトの改良が可能
である。例えば、実施例３で示した結果の延長線上に
は、Ｄ−乳酸を作らずＬ−乳酸１００％のヨーグルト製
造が可能となり、より人体に良いヨーグルトを製造でき
る。又、ジアセチル生成に関する酵素遺伝子等の改良に
より、香味の改良も可能となる。更に、糖の代謝に関与
する酵素遺伝子の改良により、発酵スピードの増大や酸
度のコントロール等、製造上重要な形質を改良すること
も可能となる。甘味蛋白質ソーマチン（ｔｈａｕｍａｔ
ｉｎ）合成遺伝子を導入することによって、摂食時に砂
糖を添加する必要のない、甘味を有するヨーグルトの製
造が可能になる。更に、Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ
ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓが関与するヨーグ
ルト以外のチーズ等の乳製品の改良も、本方法を応用し
て達成できる。また、本方法により新しい物性を賦与し
たＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇ
ａｒｉｃｕｓを用いて、従来知られていない食品や飲料
の製造も考えられる。Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓ
ｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ等によって作られる食
品が、広く飲食し易く美味であると認められている点を
考慮すると、人の健康に有用な各種ペプチド・蛋白質
（酵素、ホルモン、抗原など）の遺伝子をＬｂ．ｄｅｌ
ｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓに
本方法で導入し、医薬品分野で有効な飲食物の創製も可
能であろう。上記の可能性は、言うまでもなく、Ｌｂ．
ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉ
ｃｕｓへの有用遺伝子をプラスミドの形で導入し、複製
させても良いが、染色体へ組込ませることによって、安
定化をも保証することによって、より一層有用性を増す
こともできる。即ち、Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓ
ｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの染色体の一部などを
結合したプラスミドにより、宿主Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅ
ｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの染色体
へ組込ませ、有用遺伝子の安定化を図ること、及び不用
の遺伝子を失活させることもできる。

【図面の簡単な説明】

以下の図面において用いられている制限酵素の略称とそ
の正式名とを以下に示した。 Ｂｍ：ＢａｍＨＩ、Ｃｌ：ＣｌａＩ、Ｅｃ：ＥｃｏＲ
Ｉ、Ｈｄ：ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨＩＩＩ：ＨａｅＩＩＩ、
Ｋｐ：ＫｐｎＩ、Ｍｌ：ＭｌｕＩ、Ｓａ：ＳａｃＩ、Ｓ
ｃ：ＳｃａＩ、Ｓｓ：ＳｓｐＩ、Ｓｐ：ＳｐｈＩ

【図１】本培養用培地の初発ｐＨ及び蟻酸ナトリウムの
添加が形質転換効率に及ぼす効果を示すグラフである。

【図２】菌体懸濁液の４５℃での保持時間が形質転換頻
度に与える影響を示すグラフである。

【図３】ｐＳＹ１の制限酵素地図である。各制限酵素の
認識部位をＳｃａＩを基準として、ｋｂ単位で示した
（ｐＳＹ１は環状であるが、ＳｃａＩを基準として直線
状にして示した）。また、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ、
ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、Ｓｍａ
Ｉ、ＫｐｎＩ、ＳａｃＩの認識部位は存在しなかった。

【図４】ｐＳＹ１誘導体である、ｐＳＹＥ１、ｐＳＹＥ
の制限酵素地図である。図中二重線はｐＳＹ１の配列
を、太線矢印はｐＡＭβ１由来のエリスロマイシン耐性
遺伝子（およびその転写方向）を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 9/04 7823−4Ｂ 15/53 15/74 // Ａ２３Ｃ 9/123 7144−4Ｂ Ｃ１２Ｍ 1/42 9050−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:225） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:225） (Ｃ１２Ｎ 15/53 Ｃ１２Ｒ 1:46） (72)発明者 大津 公美 神奈川県小田原市成田540 明治乳業ヘル スサイエンス研究所内

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉ
   ｌｌｕｓ、以下単にＬｂ．とも言う）に属するＬｂ．ｄ
   ｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉに、組換えプラスミドＤＮＡを導
   入して当該組換えプラスミドＤＮＡの遺伝形質を獲得し
   たＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの形質転換体を得るに
   際し、Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉを初発ｐＨを４．
   ５〜６．５に調整した培地で本培養した後、Ｌｂ．ｄｅ
   ｌｂｒｕｅｃｋｉｉと組換えプラスミドＤＮＡとの懸濁
   液に電気パルスを印加し（エレクトロポレーション法）
   次いで発現培養培地で培養することにより組換えプラス
   ミドＤＮＡの遺伝形質を獲得した形質転換体を得ること
   を特徴とするＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの形質転換
   方法。
2. 【請求項２】 本培養培地に０．２〜１０ｍｇ／ｍｌと
   なるように蟻酸又は蟻酸塩を添加する請求項１記載のＬ
   ｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの形質転換方法。
3. 【請求項３】 エレクトロポレーション前のＬｂ．ｄｅ
   ｌｂｒｕｅｃｋｉｉの懸濁液を０〜５０℃で１０分〜２
   ４時間保持した後エレクトロポレーションを行う請求項
   １記載のＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの形質転換方
   法。
4. 【請求項４】 Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの懸濁液
   を０〜１５℃で３〜２４時間又は２０〜３７℃で１〜３
   時間又は４０〜５０℃で１０〜６０分保持した後、エレ
   クトロポレーションを行う請求項３記載のＬｂ．ｄｅｌ
   ｂｒｕｅｃｋｉｉの形質転換方法。
5. 【請求項５】 発現培養培地にカザミノ酸を添加した請
   求項１記載のＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの形質転換
   方法。
6. 【請求項６】 電気パルス（５．０〜１０．０ｋＶ／ｃ
   ｍ、１〜２５μＦ）を印加する請求項１若しくは請求項
   ３若しくは請求項４記載のＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉ
   ｉの形質転換方法。
7. 【請求項７】 組換えプラスミドＤＮＡが、Ｌｂ．ｄｅ
   ｌｂｒｕｅｃｋｉｉで複製可能なＬａｃｔｏｂａｃｉｌ
   ｌｕｓ属又はＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属乳酸菌由来のプ
   ラスミドに、選択マーカー遺伝子及び／又は乳酸菌由来
   の酵素遺伝子を組込んだものである請求項１記載のＬ
   ｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの形質転換方法。
8. 【請求項８】 Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ内で複製
   不可能な微生物由来プラスミドに、Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕ
   ｅｃｋｉｉの染色体ＤＮＡの一部を組込んだ組換えプラ
   スミドＤＮＡを作成し、Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ
   の染色体へ該組換えプラスミドＤＮＡを組込むことを特
   徴とする請求項１記載のＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ
   の形質転換方法。
9. 【請求項９】 選択マーカー遺伝子がエリスロマイシン
   耐性遺伝子である請求項７若しくは請求項８記載のＬ
   ｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの形質転換方法。
10. 【請求項１０】 選択マーカー遺伝子がＬｂ．ｄｅｌｂ
    ｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ由
    来のチミジン合成酵素遺伝子若しくはプロテアーゼ遺伝
    子又はＬｂ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌｂ．ｄｅｌｂ
    ｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ若しくはＳ
    ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｓ
    ｕｂｓｐ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（以下、Ｓ．ｔｈ
    ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の糖資化性遺伝子である請
    求項７若しくは請求項８記載のＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃ
    ｋｉｉの形質転換方法。
11. 【請求項１１】 乳酸菌由来の酵素遺伝子がＳ．ｔｈｅ
    ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＬ−乳酸脱水素酵素である請
    求項７若しくは請求項８記載のＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃ
    ｋｉｉの形質転換方法。
12. 【請求項１２】 組換えプラスミドＤＮＡがプラスミド
    ｐＸ３又はプラスミドｐＳＹＥ２又はプラスミドｐＸＬ
    ４８である請求項１若しくは請求項７記載のＬｂ．ｄｅ
    ｌｂｒｕｅｃｋｉｉの形質転換方法。
13. 【請求項１３】 Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉがＬ
    ｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａ
    ｒｉｃｕｓ又はＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓ
    ｐ．ｌａｃｔｉｓ又はＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ
    ｓｕｂｓｐ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉである請求項１〜
    １２記載のＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの形質転換方
    法。
14. 【請求項１４】 請求項１〜１３の方法によって形質転
    換されたＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉの形質転換体。
15. 【請求項１５】 形質転換されたＬｂ．ｄｅｌｂｒｕｅ
    ｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓが微工研
    寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１２６５１又はＦＥＲＭＰ−１
    ２６５２又はＦＥＲＭ Ｐ−１２６５３又はＦＥＲＭ
    Ｐ−１２６５４である請求項１２の形質転換体。
16. 【請求項１６】 ｐＢＵＬ１又はｐＳＹ１の複製部位を
    含むプラスミドにより形質転換されたＬｂ．ｄｅｌｂｒ
    ｕｅｃｋｉｉ形質転換体。
17. 【請求項１７】 微工研寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１２６
    ５１又はＦＥＲＭＰ−１２６５２又はＦＥＲＭ Ｐ−１
    ２６５３又はＦＥＲＭ Ｐ−１２６５４から得られた組
    換えプラスミドＤＮＡ。