JPH05176776A - 乳酸球菌由来の新規なプラスミドｐＳＹ１ 及びその誘導体 - Google Patents
乳酸球菌由来の新規なプラスミドｐＳＹ１ 及びその誘導体Info
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- JPH05176776A JPH05176776A JP35800891A JP35800891A JPH05176776A JP H05176776 A JPH05176776 A JP H05176776A JP 35800891 A JP35800891 A JP 35800891A JP 35800891 A JP35800891 A JP 35800891A JP H05176776 A JPH05176776 A JP H05176776A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 環状二本鎖ＤＮＡプラスミドｐＳＹ１及びそ
の誘導体 【効果】 本発明の環状二本鎖ＤＮＡプラスミドｐＳＹ
１はチーズ生産菌の乳酸球菌から分離されたもので、安
全性は高く、その誘導体は食品界にはきわめて有用であ
る。
の誘導体 【効果】 本発明の環状二本鎖ＤＮＡプラスミドｐＳＹ
１はチーズ生産菌の乳酸球菌から分離されたもので、安
全性は高く、その誘導体は食品界にはきわめて有用であ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、チーズ製造菌としてそ
の有用性と安全性が広く認められている、Ｌａｃｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉ
ｓ（以下、Ｌｃ． ｌａｃｔｉｓと略称することがあ
る）に由来する、新規な環状二本鎖ＤＮＡプラスミドｐ
ＳＹ１及びその誘導体並びにこれらのプラスミドで形質
転換された微生物に関するものである。
の有用性と安全性が広く認められている、Ｌａｃｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉ
ｓ（以下、Ｌｃ． ｌａｃｔｉｓと略称することがあ
る）に由来する、新規な環状二本鎖ＤＮＡプラスミドｐ
ＳＹ１及びその誘導体並びにこれらのプラスミドで形質
転換された微生物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及び本発明が解決しようとする課題】乳酸
菌は多くの発酵食品の製造などに古来用いられてきた極
めて有用な微生物である。この乳酸菌に対して、近年に
なって急速に発達してきた遺伝子組換え技術を適用する
ことが可能になれば、その有用性を一層増大させること
が期待される。実際、一部の乳酸菌、例えばＬａｃｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ（文献１）、Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｌｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（文献２）、或いはＬａｃｔ
ｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ（文献３）などでは既
にかなり効率の高い宿主・ベクター系が報告されてお
り、産業への応用の試みが行なわれようとしている段階
にある。
菌は多くの発酵食品の製造などに古来用いられてきた極
めて有用な微生物である。この乳酸菌に対して、近年に
なって急速に発達してきた遺伝子組換え技術を適用する
ことが可能になれば、その有用性を一層増大させること
が期待される。実際、一部の乳酸菌、例えばＬａｃｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ（文献１）、Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｌｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（文献２）、或いはＬａｃｔ
ｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ（文献３）などでは既
にかなり効率の高い宿主・ベクター系が報告されてお
り、産業への応用の試みが行なわれようとしている段階
にある。
【０００３】乳酸菌などの食品製造に用いられる微生物
に対して遺伝子組換え技術を適用するためには、その形
質転換に用いるベクターの安全性が確立されていること
が必要である。そのようなベクターとしては、昔から人
間によって食されてきた食品中の微生物が天然に保持し
ているもので、歴史的に安全性が確かめられているもの
が望ましい。一方チーズは発酵食品としての長い歴史を
持ち、その安全性が保証されている食品である。それ
故、チーズ製造に用いられている微生物Ｌｃ．ｌａｃｔ
ｉｓが有するプラスミドは食品製造用の微生物に用いる
ベクターとして有用である。
に対して遺伝子組換え技術を適用するためには、その形
質転換に用いるベクターの安全性が確立されていること
が必要である。そのようなベクターとしては、昔から人
間によって食されてきた食品中の微生物が天然に保持し
ているもので、歴史的に安全性が確かめられているもの
が望ましい。一方チーズは発酵食品としての長い歴史を
持ち、その安全性が保証されている食品である。それ
故、チーズ製造に用いられている微生物Ｌｃ．ｌａｃｔ
ｉｓが有するプラスミドは食品製造用の微生物に用いる
ベクターとして有用である。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、Ｌｃ．
ｌａｃｔｉｓの幾つかの株について、その保持するプラ
スミドの検索を行ったところ、明治乳業ヘルスサイエン
ス研究所所有株Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓ Ｍ−１２８Ｃ株
（微工研寄託株 寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１２６５０）
中に、約２．８ｋｂという比較的小さなサイズを持つプ
ラスミドを見いだした。このプラスミドは図１の制限酵
素地図を有し、Ｈｉｎｄ III、ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩ、Ｓ
ａｌＩ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＫｐｎＩ、
ＳａｃＩの認識部位を有しない。このプラスミドをｐＳ
Ｙ１と命名した。
ｌａｃｔｉｓの幾つかの株について、その保持するプラ
スミドの検索を行ったところ、明治乳業ヘルスサイエン
ス研究所所有株Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓ Ｍ−１２８Ｃ株
（微工研寄託株 寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１２６５０）
中に、約２．８ｋｂという比較的小さなサイズを持つプ
ラスミドを見いだした。このプラスミドは図１の制限酵
素地図を有し、Ｈｉｎｄ III、ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩ、Ｓ
ａｌＩ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＫｐｎＩ、
ＳａｃＩの認識部位を有しない。このプラスミドをｐＳ
Ｙ１と命名した。
【０００５】ｐＳＹ１が担う形質は不明（ｃｒｙｐｔｉ
ｃ）であったので、選択マーカーとしてエリスロマイシ
ン（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ；以下Ｅｍと略称するこ
とがある）耐性遺伝子を連結し、形質転換を試みたとこ
ろ、グラム陽性菌の３つの属の微生物、即ち、Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｌｃ． ｌａｃｔｉｓ、
及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋ
ｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓやＬａｃｔｏ
ｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓ
ｐ． ｌａｃｔｉｓ（以下それぞれＬｂ．ｂｕｌｇａｒ
ｉｃｕｓ、Ｌｂ．ｌａｃｔｉｓと略することがある）に
おいて前記選択マーカーを発現する形質転換株を得るこ
とに成功した。さらにグラム陰性菌である大腸菌Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいても前記選択マーカ
ーを発現する形質転換株を得ることが可能であった。
ｃ）であったので、選択マーカーとしてエリスロマイシ
ン（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ；以下Ｅｍと略称するこ
とがある）耐性遺伝子を連結し、形質転換を試みたとこ
ろ、グラム陽性菌の３つの属の微生物、即ち、Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｌｃ． ｌａｃｔｉｓ、
及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋ
ｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓやＬａｃｔｏ
ｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓ
ｐ． ｌａｃｔｉｓ（以下それぞれＬｂ．ｂｕｌｇａｒ
ｉｃｕｓ、Ｌｂ．ｌａｃｔｉｓと略することがある）に
おいて前記選択マーカーを発現する形質転換株を得るこ
とに成功した。さらにグラム陰性菌である大腸菌Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいても前記選択マーカ
ーを発現する形質転換株を得ることが可能であった。
【０００６】これは本発明プラスミドｐＳＹ１がグラム
陽性菌および陰性菌の中で広い宿主域を持つことを示す
ものである。殊に、Ｌｂ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌ
ｂ．ｌａｃｔｉｓの２亜種においては、数多くの研究者
の尽力にも拘らず、未だに形質転換の報告はなく、Ｌ
ｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ種乳酸桿菌用のベクターと
しても、本発明のｐＳＹ１が有用であることは明らかで
ある。本発明はこのような知見に基づいて完成したもの
である。
陽性菌および陰性菌の中で広い宿主域を持つことを示す
ものである。殊に、Ｌｂ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌ
ｂ．ｌａｃｔｉｓの２亜種においては、数多くの研究者
の尽力にも拘らず、未だに形質転換の報告はなく、Ｌ
ｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ種乳酸桿菌用のベクターと
しても、本発明のｐＳＹ１が有用であることは明らかで
ある。本発明はこのような知見に基づいて完成したもの
である。
【０００７】ｐＳＹ１を調製するには、文献７に示され
ているような方法にしたがって行なえばよい。すなわち
Ｍ−１２８Ｃ株をＬｙｓｉｓ培地中で培養し、次いでこ
れを集菌して、これを乳酸菌を溶菌させる公知の方法、
例えばリゾチームなどの酵素を用いて溶菌する。得られ
た溶菌物からは、例えばフェノール抽出及びエチジウム
ブロマイド存在下の塩化セシウム密度勾配遠心の如き通
常用いられる方法によって、プラスミドを分離・精製す
ることができる。
ているような方法にしたがって行なえばよい。すなわち
Ｍ−１２８Ｃ株をＬｙｓｉｓ培地中で培養し、次いでこ
れを集菌して、これを乳酸菌を溶菌させる公知の方法、
例えばリゾチームなどの酵素を用いて溶菌する。得られ
た溶菌物からは、例えばフェノール抽出及びエチジウム
ブロマイド存在下の塩化セシウム密度勾配遠心の如き通
常用いられる方法によって、プラスミドを分離・精製す
ることができる。
【０００８】ｐＳＹ１に選択マーカー遺伝子を挿入した
組換えプラスミドを導入することにより微生物を形質転
換させる方法は、対象の微生物の特性に応じて当業者に
公知の塩化カルシウム法、プロトプラスト−ポリエチレ
ングリコール法、エレクトロポレーション法などの中か
ら最善の方法を採用すれば良く、特に限定はないが、宿
主が乳酸菌の場合は、エレクトロポレーション法が好ま
しい。
組換えプラスミドを導入することにより微生物を形質転
換させる方法は、対象の微生物の特性に応じて当業者に
公知の塩化カルシウム法、プロトプラスト−ポリエチレ
ングリコール法、エレクトロポレーション法などの中か
ら最善の方法を採用すれば良く、特に限定はないが、宿
主が乳酸菌の場合は、エレクトロポレーション法が好ま
しい。
【０００９】ｐＳＹ１の自律複製能に関与する遺伝子
は、他のプラスミドと同様に、本発明プラスミドＤＮＡ
の一部に担われていると考えられるので、本発明プラス
ミドの中で複製に関与しない領域が欠失していたり、或
いは別のＤＮＡが挿入付加されたようなプラスミド誘導
体も、本発明プラスミドと同様な機能を有すると考えら
れる。例えば後述の実施例９に記載されているように、
ｐＳＹ１の一部約１７００ｂｐだけを含むプラスミドで
あっても、Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓ中での複製を行なうこと
ができる。それ故本発明は、ｐＳＹ１そのもののみに限
定されるのではなく、これを修飾して得られる誘導体プ
ラスミドや、Ｅｍ耐性などの選択マーカー遺伝子や、Ｌ
−乳酸脱水素酵素など宿主に導入すべき形質を担う遺伝
子などの配列を本発明プラスミドに挿入した組換えプラ
スミドをも包含するものである。
は、他のプラスミドと同様に、本発明プラスミドＤＮＡ
の一部に担われていると考えられるので、本発明プラス
ミドの中で複製に関与しない領域が欠失していたり、或
いは別のＤＮＡが挿入付加されたようなプラスミド誘導
体も、本発明プラスミドと同様な機能を有すると考えら
れる。例えば後述の実施例９に記載されているように、
ｐＳＹ１の一部約１７００ｂｐだけを含むプラスミドで
あっても、Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓ中での複製を行なうこと
ができる。それ故本発明は、ｐＳＹ１そのもののみに限
定されるのではなく、これを修飾して得られる誘導体プ
ラスミドや、Ｅｍ耐性などの選択マーカー遺伝子や、Ｌ
−乳酸脱水素酵素など宿主に導入すべき形質を担う遺伝
子などの配列を本発明プラスミドに挿入した組換えプラ
スミドをも包含するものである。
【００１０】形質転換された株を選択するためｐＳＹ１
に付加するマーカーは、当該分野で用いられている種々
の抗生物質耐性などの遺伝子を適宜用いれば良いが、形
質転換微生物を食品製造に用いる目的で行なう場合に
は、安全性の確かめられているマーカーを用いることが
望ましい。そうした安全なマーカーの例として、すでに
欧米では食品用添加物として認可されているＬｃ．Ｌａ
ｃｔｉｓの特定の株の生産する抗菌性ペプチドである。
ナイシン（ｎｉｓｉｎ）の生産および耐性遺伝子（文献
４）や、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ． ｌａｃｔｉｓ由来
のチミジン合成酵素遺伝子（文献５）などが挙げられ
る。
に付加するマーカーは、当該分野で用いられている種々
の抗生物質耐性などの遺伝子を適宜用いれば良いが、形
質転換微生物を食品製造に用いる目的で行なう場合に
は、安全性の確かめられているマーカーを用いることが
望ましい。そうした安全なマーカーの例として、すでに
欧米では食品用添加物として認可されているＬｃ．Ｌａ
ｃｔｉｓの特定の株の生産する抗菌性ペプチドである。
ナイシン（ｎｉｓｉｎ）の生産および耐性遺伝子（文献
４）や、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ． ｌａｃｔｉｓ由来
のチミジン合成酵素遺伝子（文献５）などが挙げられ
る。
【００１１】ｐＳＹ１をベクターとして宿主に導入でき
る新たな形質としては、例えば乳糖資化性のない宿主に
乳糖資化性遺伝子群を導入し、牛乳等の乳糖含有培地で
成育可能とする、あるいはプロテアーゼ、ペプチダーゼ
などの遺伝子を導入し、発酵製品の香味を変化させるな
どが考えられる。その他必要に応じて、プロモーター等
の発現制御に関与する塩基配列などを本発明プラスミド
に組み込んでも良い。
る新たな形質としては、例えば乳糖資化性のない宿主に
乳糖資化性遺伝子群を導入し、牛乳等の乳糖含有培地で
成育可能とする、あるいはプロテアーゼ、ペプチダーゼ
などの遺伝子を導入し、発酵製品の香味を変化させるな
どが考えられる。その他必要に応じて、プロモーター等
の発現制御に関与する塩基配列などを本発明プラスミド
に組み込んでも良い。
【００１２】
【実施例】以下本発明を実施例により説明する。
【００１３】実施例１ プラスミドｐＳＹ１の調製 Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．
ｌａｃｔｉｓ Ｍ−１２８Ｃ株（明治乳業ヘルスサイ
エンス研究所保有株；微工研寄託株寄託番号ＦＥＲＭ
Ｐ−１２６５０；以下、Ｍ−１２８Ｃ株と略称すること
がある）よりＡｎｄｅｒｓｏｎとＭｃＫａｙの方法（文
献７）に準じた方法でｐＳＹ１プラスミドＤＮＡを調製
した。すなわち、Ｍ１２８Ｃ株を５００ミリリットルの
Ｌｙｓｉｓ培地に１％の初発濃度で植菌し、３２℃で４
時間培養して得られた菌体について、リゾチームとＳＤ
Ｓによる溶菌からプラスミドＤＮＡの粗精製までを行な
った。
ｌａｃｔｉｓ Ｍ−１２８Ｃ株（明治乳業ヘルスサイ
エンス研究所保有株；微工研寄託株寄託番号ＦＥＲＭ
Ｐ−１２６５０；以下、Ｍ−１２８Ｃ株と略称すること
がある）よりＡｎｄｅｒｓｏｎとＭｃＫａｙの方法（文
献７）に準じた方法でｐＳＹ１プラスミドＤＮＡを調製
した。すなわち、Ｍ１２８Ｃ株を５００ミリリットルの
Ｌｙｓｉｓ培地に１％の初発濃度で植菌し、３２℃で４
時間培養して得られた菌体について、リゾチームとＳＤ
Ｓによる溶菌からプラスミドＤＮＡの粗精製までを行な
った。
【００１４】得られた粗プラスミドＤＮＡ標品を常法
（文献８）にしたがってＲＮａｓｅ処理を行なった後、
アガロースゲル電気泳動を行なってｐＳＹ１に相当する
ＤＮＡバンドを切り出し、ＢＩＯ１０１社のＧＥＮＥＣ
ＬＥＡＮ ＤＮＡ精製キットを用いて回収したものを精
製ｐＳＹ１標品（約５μｇ）とした。
（文献８）にしたがってＲＮａｓｅ処理を行なった後、
アガロースゲル電気泳動を行なってｐＳＹ１に相当する
ＤＮＡバンドを切り出し、ＢＩＯ１０１社のＧＥＮＥＣ
ＬＥＡＮ ＤＮＡ精製キットを用いて回収したものを精
製ｐＳＹ１標品（約５μｇ）とした。
【００１５】ｐＳＹ１を各種制限酵素（宝酒造（株））
で切断し、得られた切断片の塩基対長をアガロースゲル
電気泳動（文献８）により求めた結果、ｐＳＹ１はＥｃ
ｏＲＩ、ＨａｅIII、ＣｌａＩ、ＳｃａＩの認識部位を
それぞれ１ケ所づつ持つ環状二本鎖ＤＮＡプラスミドで
あり、ｐＳＹ１全体の長さは約２８００塩基対（ｂｐ）
であった。また、ＨｉｎｄII、ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩ、Ｓ
ａｌＩ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＫｐｎＩ、
ＳａｃＩの認識部位は存在しなかった。図１に、ｐＳＹ
１の制限酵素地図を示す。表１に常法により決定したｐ
ＳＹ１の全塩基配列を示す。
で切断し、得られた切断片の塩基対長をアガロースゲル
電気泳動（文献８）により求めた結果、ｐＳＹ１はＥｃ
ｏＲＩ、ＨａｅIII、ＣｌａＩ、ＳｃａＩの認識部位を
それぞれ１ケ所づつ持つ環状二本鎖ＤＮＡプラスミドで
あり、ｐＳＹ１全体の長さは約２８００塩基対（ｂｐ）
であった。また、ＨｉｎｄII、ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩ、Ｓ
ａｌＩ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＫｐｎＩ、
ＳａｃＩの認識部位は存在しなかった。図１に、ｐＳＹ
１の制限酵素地図を示す。表１に常法により決定したｐ
ＳＹ１の全塩基配列を示す。
【００１６】
【表１】
【００１７】実施例２ ｐＳＹ１への選択マーカーＥｍ
耐性遺伝子の付与 ｐＡＭβ１（文献９）由来のエリスロマイシン耐性遺伝
子を約１．１ｋｂの長さのカセットとして持つプラスミ
ドｐ８Ｅｍ１（特願平３−１８３９２２参照）を、ｐ８
Ｅｍ１を含む大腸菌ＴＧ１の形質転換株から文献８に従
って調製した。ｐ８Ｅｍ１をＥｃｏＲＩで切断し、ｐＳ
Ｙ１をＥｃｏＲＩで切断したものとライゲーション反応
させた。ライゲーション反応後の反応液をＣｈａｎｇら
の方法（文献１０）に従ってＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ ２０７−２５株（文献１１）の形質転換を
用い、２５μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含むＤＭ３
培地プレート上（文献１０）で選択してＥｍ耐性の形質
転換株を得た。
耐性遺伝子の付与 ｐＡＭβ１（文献９）由来のエリスロマイシン耐性遺伝
子を約１．１ｋｂの長さのカセットとして持つプラスミ
ドｐ８Ｅｍ１（特願平３−１８３９２２参照）を、ｐ８
Ｅｍ１を含む大腸菌ＴＧ１の形質転換株から文献８に従
って調製した。ｐ８Ｅｍ１をＥｃｏＲＩで切断し、ｐＳ
Ｙ１をＥｃｏＲＩで切断したものとライゲーション反応
させた。ライゲーション反応後の反応液をＣｈａｎｇら
の方法（文献１０）に従ってＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ ２０７−２５株（文献１１）の形質転換を
用い、２５μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含むＤＭ３
培地プレート上（文献１０）で選択してＥｍ耐性の形質
転換株を得た。
【００１８】得られた形質転換株よりプラスミドを調製
し、その制限酵素切断パターンを解析した。形質転換株
中は図２のＡ、及び図２のＢに示される制限酵素地図を
有するプラスミドのうちいずれかを含有していた。図２
のＡのプラスミドをｐＳＹＥ１、図２のＢのプラスミド
をｐＳＹＥ２と命名した。
し、その制限酵素切断パターンを解析した。形質転換株
中は図２のＡ、及び図２のＢに示される制限酵素地図を
有するプラスミドのうちいずれかを含有していた。図２
のＡのプラスミドをｐＳＹＥ１、図２のＢのプラスミド
をｐＳＹＥ２と命名した。
【００１９】以上のｐ８Ｅｍ１プラスミド、ｐＳＹ１及
びＥｃｏＲＩを用いてＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ ２０７−２５株を形質転換したのと同様の実験
を、制限酵素としてＨａｅIIIもしくはＣｌａＩを用い
て切断したｐＳＹ１について行ったところ、同じくＥｍ
耐性の形質転換株が得られた。
びＥｃｏＲＩを用いてＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ ２０７−２５株を形質転換したのと同様の実験
を、制限酵素としてＨａｅIIIもしくはＣｌａＩを用い
て切断したｐＳＹ１について行ったところ、同じくＥｍ
耐性の形質転換株が得られた。
【００２０】以上に示したように、ｐＳＹ１にｐＡＭβ
１由来のＥｍ耐性遺伝子を賦与した組換えプラスミドｐ
ＳＹＥ１及びｐＳＹＥ２（いずれも長さは約３．９ｋ
ｂ）を得ることが出来た。また、ｐＳＹ１は枯草菌中で
プラスミドレプリコンとして機能することが可能である
ことも示された。
１由来のＥｍ耐性遺伝子を賦与した組換えプラスミドｐ
ＳＹＥ１及びｐＳＹＥ２（いずれも長さは約３．９ｋ
ｂ）を得ることが出来た。また、ｐＳＹ１は枯草菌中で
プラスミドレプリコンとして機能することが可能である
ことも示された。
【００２１】実施例３ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａ
ｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓの形質転換 Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．
ｌａｃｔｉｓとしてＩＬ１４０３株（フランスＩＮＲ
ＡのＡｌａｉｎ Ｃｈｏｐｉｎ博士より分与；以下Ｌ
ｃ．ｌａｃｔｉｓ ＩＬ１４０３株と略称することがあ
る）を用い、これにｐＳＹ１にＥｍ耐性遺伝子が組み込
まれたｐＳＹＥ２を導入することにより、Ｅｍ耐性を示
すＬｃ．ｌａｃｔｉｓの形質転換株を得ることに成功し
た。詳細を以下に記載する。
ｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓの形質転換 Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．
ｌａｃｔｉｓとしてＩＬ１４０３株（フランスＩＮＲ
ＡのＡｌａｉｎ Ｃｈｏｐｉｎ博士より分与；以下Ｌ
ｃ．ｌａｃｔｉｓ ＩＬ１４０３株と略称することがあ
る）を用い、これにｐＳＹ１にＥｍ耐性遺伝子が組み込
まれたｐＳＹＥ２を導入することにより、Ｅｍ耐性を示
すＬｃ．ｌａｃｔｉｓの形質転換株を得ることに成功し
た。詳細を以下に記載する。
【００２２】実施例２で得られた形質転換枯草菌から、
ｐＳＹ１にＥｍ耐性遺伝子が組み込まれた組換えプラス
ミドｐＳＹＥ２を、Ａｎｄｅｒｓｏｎらの方法（文献
７）に従って調製した。
ｐＳＹ１にＥｍ耐性遺伝子が組み込まれた組換えプラス
ミドｐＳＹＥ２を、Ａｎｄｅｒｓｏｎらの方法（文献
７）に従って調製した。
【００２３】次いでｐＳＹＥ２を文献１の方法に従っ
て、Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓ ＩＬ１４０３株へ導入した。
形質転換株は２５μｇ／ｍｌのＥｍを含むＢＬ寒天培地
（栄研化学）プレート上で選択して得た。
て、Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓ ＩＬ１４０３株へ導入した。
形質転換株は２５μｇ／ｍｌのＥｍを含むＢＬ寒天培地
（栄研化学）プレート上で選択して得た。
【００２４】これらの形質転換株を２５μｇ／ｍｌのＥ
ｍを含むＬＣＭ培地（文献６）に１％（ｗ／ｖ）グルコ
ースを添加した培地（ＬＣＭＧ培地）で培養した菌体よ
りＡｎｄｅｒｓｏｎらの方法（文献７）によりプラスミ
ドを調製した。得られたプラスミドの制限酵素部位を調
べたところ、形質転換に用いたプラスミドｐＳＹＥ２と
同じ制限酵素認識部位を有していた。このことから、ｐ
ＳＹ２は枯草菌の他にＬｃ．ｌａｃｔｉｓ中でもプラス
ミドレプリコンとして機能することが可能であることが
示された。
ｍを含むＬＣＭ培地（文献６）に１％（ｗ／ｖ）グルコ
ースを添加した培地（ＬＣＭＧ培地）で培養した菌体よ
りＡｎｄｅｒｓｏｎらの方法（文献７）によりプラスミ
ドを調製した。得られたプラスミドの制限酵素部位を調
べたところ、形質転換に用いたプラスミドｐＳＹＥ２と
同じ制限酵素認識部位を有していた。このことから、ｐ
ＳＹ２は枯草菌の他にＬｃ．ｌａｃｔｉｓ中でもプラス
ミドレプリコンとして機能することが可能であることが
示された。
【００２５】実施例４ 大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉの形質転換 大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉとしてＴＧ１
株（アマシャム社）を用い、これにＥｍ耐性遺伝子が組
み込まれたｐＳＹ１を導入することにより、Ｅｍ耐性を
示す大腸菌の形質転換株を得ることに成功した。詳細を
以下に記載する。
ｃｏｌｉの形質転換 大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉとしてＴＧ１
株（アマシャム社）を用い、これにＥｍ耐性遺伝子が組
み込まれたｐＳＹ１を導入することにより、Ｅｍ耐性を
示す大腸菌の形質転換株を得ることに成功した。詳細を
以下に記載する。
【００２６】実施例３で得られたＬａｃｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ ＩＬ１４０３株の形質転換株より文献７
の方法を用いてｐＳＹＥ２プラスミドを調製した。得ら
れたｐＳＹＥ２プラスミドを用いて大腸菌ＴＧ１株を周
知の方法である塩化カルシウム法（文献８）により形質
転換し、Ｅｍ５００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地（文
献８）で選択した。
ｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ ＩＬ１４０３株の形質転換株より文献７
の方法を用いてｐＳＹＥ２プラスミドを調製した。得ら
れたｐＳＹＥ２プラスミドを用いて大腸菌ＴＧ１株を周
知の方法である塩化カルシウム法（文献８）により形質
転換し、Ｅｍ５００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地（文
献８）で選択した。
【００２７】これらの形質転換株を５００μｇ／ｍｌの
Ｅｍを含むＬＢ培地（文献８）に１％（ｗ／ｖ）グルコ
ースを添加した培地で培養した菌体より、常法にしたが
ってプラスミドを調製した。得られたプラスミドの制限
酵素認識部位を調べたところ、形質転換に用いたプラス
ミドｐＳＹＥ２と同じ制限酵素認識部位を有していた。
このことから、ｐＳＹ１はグラム陽性菌である枯草菌や
乳酸球菌はもとより、グラム陰性菌である大腸菌中でも
プラスミドレプリコンとして機能することが可能であ
り、本発明のｐＳＹ１が有用であることが示された。
Ｅｍを含むＬＢ培地（文献８）に１％（ｗ／ｖ）グルコ
ースを添加した培地で培養した菌体より、常法にしたが
ってプラスミドを調製した。得られたプラスミドの制限
酵素認識部位を調べたところ、形質転換に用いたプラス
ミドｐＳＹＥ２と同じ制限酵素認識部位を有していた。
このことから、ｐＳＹ１はグラム陽性菌である枯草菌や
乳酸球菌はもとより、グラム陰性菌である大腸菌中でも
プラスミドレプリコンとして機能することが可能であ
り、本発明のｐＳＹ１が有用であることが示された。
【００２８】実施例５ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓの
形質転換 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ
ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓとしてＡＴＣＣ １２３
１５株を用い、これにＥｍ耐性遺伝子が組み込まれたｐ
ＳＹ１を導入することにより、Ｅｍ耐性を示すＬｂ．ｌ
ａｃｔｉｓの形質転換株を得ることに成功した。詳細を
以下に記載する。
ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓの
形質転換 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ
ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓとしてＡＴＣＣ １２３
１５株を用い、これにＥｍ耐性遺伝子が組み込まれたｐ
ＳＹ１を導入することにより、Ｅｍ耐性を示すＬｂ．ｌ
ａｃｔｉｓの形質転換株を得ることに成功した。詳細を
以下に記載する。
【００２９】実施例３で得られたＬａｃｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ ＩＬ１４０３株の形質転換株より文献７
の方法を用いてｐＳＹＥ２プラスミドを調製した。得ら
れたｐＳＹＥ２プラスミドを、特願平３−１８３９２２
の方法に従いＬｂ．ｌａｃｔｉｓ ＡＴＣＣ１２３１５
株へ、エレクトロポレーション法によって形質転換し
た。形質転換株は２５μｇ／ｍｌのＥｍを含むＬＢ寒天
培地プレート上で選択した。
ｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ ＩＬ１４０３株の形質転換株より文献７
の方法を用いてｐＳＹＥ２プラスミドを調製した。得ら
れたｐＳＹＥ２プラスミドを、特願平３−１８３９２２
の方法に従いＬｂ．ｌａｃｔｉｓ ＡＴＣＣ１２３１５
株へ、エレクトロポレーション法によって形質転換し
た。形質転換株は２５μｇ／ｍｌのＥｍを含むＬＢ寒天
培地プレート上で選択した。
【００３０】これらの形質転換株をＥｍ２５μｇ／ｍｌ
を含むＬＣＭＧ培地で培養した菌体よりＡｎｄｅｒｓｏ
ｎらの方法（文献７）によりプラスミドを調製した。得
られたプラスミドの制限酵素認識部位を調べたところ、
形質転換に用いたプラスミドｐＳＹＥ２と同じ制限酵素
認識部位を有していた。このことから、ｐＳＹ１は乳酸
桿菌のＬｂ．ｌａｃｔｉｓ中でもプラスミドレプリコン
として機能することが可能であることが示された。
を含むＬＣＭＧ培地で培養した菌体よりＡｎｄｅｒｓｏ
ｎらの方法（文献７）によりプラスミドを調製した。得
られたプラスミドの制限酵素認識部位を調べたところ、
形質転換に用いたプラスミドｐＳＹＥ２と同じ制限酵素
認識部位を有していた。このことから、ｐＳＹ１は乳酸
桿菌のＬｂ．ｌａｃｔｉｓ中でもプラスミドレプリコン
として機能することが可能であることが示された。
【００３１】実施例６ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉ
ｃｕｓの形質転換 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ
ｓｕｂｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ Ｍ−８７８株
（明治乳業ヘルスサイエンス研究所保有株；微工研寄託
株 寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１１９７８）由来のＢＧ
（−）Ａ株を用い、これにＥｍ耐性遺伝子が組み込まれ
たｐＳＹ１を導入することにより、Ｅｍ耐性を示すＬ
ｂ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの形質転換株を得ることに成
功した。詳細を以下に記載する。
ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉ
ｃｕｓの形質転換 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ
ｓｕｂｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ Ｍ−８７８株
（明治乳業ヘルスサイエンス研究所保有株；微工研寄託
株 寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１１９７８）由来のＢＧ
（−）Ａ株を用い、これにＥｍ耐性遺伝子が組み込まれ
たｐＳＹ１を導入することにより、Ｅｍ耐性を示すＬ
ｂ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの形質転換株を得ることに成
功した。詳細を以下に記載する。
【００３２】組換えプラスミドベクターとして実施例３
で得られたＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ ｓｕ
ｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ ＩＬ１４０３株（以下ＩＬ１
４０３株という）の形質転換株より文献７に準じた方法
を用いて調製したｐＳＹＥ２プラスミドを用いた。すな
わち、Ｍ−１２８Ｃ株を５００ｍｌのＬｙｓｉｓ培地に
１％の初発濃度で植菌し、３２℃で４時間培養して得ら
れた菌体について、リゾチームとＳＤＳによる溶菌から
プラスミドＤＮＡの粗精製までを行った。
で得られたＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ ｓｕ
ｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ ＩＬ１４０３株（以下ＩＬ１
４０３株という）の形質転換株より文献７に準じた方法
を用いて調製したｐＳＹＥ２プラスミドを用いた。すな
わち、Ｍ−１２８Ｃ株を５００ｍｌのＬｙｓｉｓ培地に
１％の初発濃度で植菌し、３２℃で４時間培養して得ら
れた菌体について、リゾチームとＳＤＳによる溶菌から
プラスミドＤＮＡの粗精製までを行った。
【００３３】得られた粗プラスミドＤＮＡを常法に従っ
てＲ Ｎａｓｅ処理を行なった後、アカロースゲル電気
泳動を行なってｐＳＹ１に相当するＤＮＡバンドを切り
出し、ＢＩＯ１０１社のＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＤＮＡ精
製キットを用いて精製ｐＳＹ１標品を得た。
てＲ Ｎａｓｅ処理を行なった後、アカロースゲル電気
泳動を行なってｐＳＹ１に相当するＤＮＡバンドを切り
出し、ＢＩＯ１０１社のＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＤＮＡ精
製キットを用いて精製ｐＳＹ１標品を得た。
【００３４】宿主としては脱脂粉乳培地（以下ＳＭ培地
という；１０％脱脂粉乳、０．１％酵母・エキス；１２
０℃で７分間オートクレーブ滅菌）で継代中に自然にプ
ラスミドｐＢＵＬ１を失った前記Ｍ−８７８由来の１株
であるＢＧ（−）Ａ株を用いた。
という；１０％脱脂粉乳、０．１％酵母・エキス；１２
０℃で７分間オートクレーブ滅菌）で継代中に自然にプ
ラスミドｐＢＵＬ１を失った前記Ｍ−８７８由来の１株
であるＢＧ（−）Ａ株を用いた。
【００３５】ＢＧ（−）Ａ株をＦ−ＬＣＭＧ培地に植菌
し、３７℃で１５時間前培養した。Ｆ−ＬＣＭＧ培地と
は、ＬＣＭ培地に１％グルコースを添加し、１２１℃で
１５分間オートクレーブした後、蟻酸ナトリウム５ｍｇ
／ｍｌを添加し、ＨＣｌでｐＨを５．５に調整し、メン
ブレンフィルター（孔経０．０４μｍ）で除菌した培地
である。培養液を遠心（３，０００ｒｐｍ、５分間）
し、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で
１回洗浄した後、予め４２℃に保持しておいたＦ−ＬＣ
ＭＧ培地に初発濃度（ＯＤ660nm）が０．２５となるよ
うに植菌し、４２℃で２時間本培養した。
し、３７℃で１５時間前培養した。Ｆ−ＬＣＭＧ培地と
は、ＬＣＭ培地に１％グルコースを添加し、１２１℃で
１５分間オートクレーブした後、蟻酸ナトリウム５ｍｇ
／ｍｌを添加し、ＨＣｌでｐＨを５．５に調整し、メン
ブレンフィルター（孔経０．０４μｍ）で除菌した培地
である。培養液を遠心（３，０００ｒｐｍ、５分間）
し、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で
１回洗浄した後、予め４２℃に保持しておいたＦ−ＬＣ
ＭＧ培地に初発濃度（ＯＤ660nm）が０．２５となるよ
うに植菌し、４２℃で２時間本培養した。
【００３６】培養液を前記と同様に遠心し、２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗った
後、エレクトロポレーション緩衝液（以下ＥＢという；
０．３Ｍラフィノース、２ｍＭＫ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．
０）、１ｍＭＭｇＣｌ2含有）で１回洗浄した後、濁度
（ＯＤ660nm）が５０となるようにＥＢに懸濁した。こ
の懸濁液（菌体懸濁液という）をエレクトロポレーショ
ン前に４５℃で３０分間保持した。
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗った
後、エレクトロポレーション緩衝液（以下ＥＢという；
０．３Ｍラフィノース、２ｍＭＫ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．
０）、１ｍＭＭｇＣｌ2含有）で１回洗浄した後、濁度
（ＯＤ660nm）が５０となるようにＥＢに懸濁した。こ
の懸濁液（菌体懸濁液という）をエレクトロポレーショ
ン前に４５℃で３０分間保持した。
【００３７】エレクトロポレーション法による形質転換
は、米国バイオラド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）製のジーン
パルサー（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ、登録商標）を用い
て行った。前記ＩＬ１４０３由来の組換えプラスミドｐ
ＳＹＥ２（約１μｇ／ｍｌＴＥ緩衝液）１〜２μｌを
０．２ｃｍキュベットに入れ、これに前記菌体懸濁液８
０μｌを加え、電気パルス（１．５ｋＶ／０．２ｃｍ、
２５μＦ、２００Ω）を１回印加した。
は、米国バイオラド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）製のジーン
パルサー（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ、登録商標）を用い
て行った。前記ＩＬ１４０３由来の組換えプラスミドｐ
ＳＹＥ２（約１μｇ／ｍｌＴＥ緩衝液）１〜２μｌを
０．２ｃｍキュベットに入れ、これに前記菌体懸濁液８
０μｌを加え、電気パルス（１．５ｋＶ／０．２ｃｍ、
２５μＦ、２００Ω）を１回印加した。
【００３８】電気パルスを印加後、キュベット内の菌体
懸濁液全てを発現培養培地（ＥＸＢＧという）に接種
し、３７℃で２時間培養し、電気パルスによる菌体の損
傷の回復を行った。ＥＸＢＧ培地は、０．３Ｍラフィノ
ース、２％カザミノ酸及び５０ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有
する液（孔経０．４５μｍのメンブレンフィルターで除
菌濾過）とＳＭ培地とを１対１（ｖ／ｖ）に混合した培
地である。
懸濁液全てを発現培養培地（ＥＸＢＧという）に接種
し、３７℃で２時間培養し、電気パルスによる菌体の損
傷の回復を行った。ＥＸＢＧ培地は、０．３Ｍラフィノ
ース、２％カザミノ酸及び５０ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有
する液（孔経０．４５μｍのメンブレンフィルターで除
菌濾過）とＳＭ培地とを１対１（ｖ／ｖ）に混合した培
地である。
【００３９】ＥＸＢＧ培地での培養後、形質転換株は２
５μｇ／ｍｌのＥｍを含むリトマスミルク（Ｄｉｆｃｏ
社）プレート上で選択した。
５μｇ／ｍｌのＥｍを含むリトマスミルク（Ｄｉｆｃｏ
社）プレート上で選択した。
【００４０】これらの形質転換株をＥｍ２５μｇ／ｍｌ
を含むＬＣＭＧ培地で培養した菌体よりＡｎｄｅｒｓｏ
ｎらの方法（文献７）によりプラスミドを調製したとこ
ろ、形質転換に用いたプラスミドｐＳＹＥ２と同じ電気
泳動移動度を示すプラスミドが得られた。このことから
Ｌｂ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ中でもプラスミドレプリ
コンとして機能することが可能であることが示された。
Ｌｂ． ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ種乳酸桿菌用のベクタ
ーとして、本発明のｐＳＹ１が有用であることは明らか
である。
を含むＬＣＭＧ培地で培養した菌体よりＡｎｄｅｒｓｏ
ｎらの方法（文献７）によりプラスミドを調製したとこ
ろ、形質転換に用いたプラスミドｐＳＹＥ２と同じ電気
泳動移動度を示すプラスミドが得られた。このことから
Ｌｂ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ中でもプラスミドレプリ
コンとして機能することが可能であることが示された。
Ｌｂ． ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ種乳酸桿菌用のベクタ
ーとして、本発明のｐＳＹ１が有用であることは明らか
である。
【００４１】実施例７ Ｌｂ．ｌａｃｔｉｓへのＬ−乳
酸脱水素酵素遺伝子組み込みｐＳＹ１の導入と形質転換 乳酸球菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒ
ｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｍ−
１９２株（明治乳業ヘルスサイエンス研究所保有株）由
来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（特開平３
−２５１１７２参照；以下ＳＴ−ＬＤＨという）を含む
制限酵素ＳｓｐＩ断片（約１．２ｋｂ）を、ｐＵＣ１１
８プラスミド（寳酒造（株））のＨｉｎｃＩＩ認識部位
に挿入して得られたｐＵ８ＳＴ９プラスミド（特願平３
−１８３９２２参照）を制限酵素ＢａｍＨＩとＫｐｎＩ
とで切断してアガロースゲル電気泳動にかけ、ＳＴ−Ｌ
ＤＨを含むＤＮＡ断片が含まれる部分を切り出し、次い
でＧＥＮＥＣＬＥＡＮＤＮＡ精製キットを用いて単離し
た。このＤＮＡと、実施例２で得られたｐＳＹＥ２をＢ
ａｍＨＩとＫｐｎＩとで切断したものをライゲーション
させた。この反応液を用いてＬｃ．ｌａｃｔｉｓ ＩＬ
１４０３株の形質転換を行ったところ、図３に示される
ようなプラスミドｐＳＹＥＬ２９を保持する形質転換株
が得られた。
酸脱水素酵素遺伝子組み込みｐＳＹ１の導入と形質転換 乳酸球菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒ
ｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｍ−
１９２株（明治乳業ヘルスサイエンス研究所保有株）由
来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（特開平３
−２５１１７２参照；以下ＳＴ−ＬＤＨという）を含む
制限酵素ＳｓｐＩ断片（約１．２ｋｂ）を、ｐＵＣ１１
８プラスミド（寳酒造（株））のＨｉｎｃＩＩ認識部位
に挿入して得られたｐＵ８ＳＴ９プラスミド（特願平３
−１８３９２２参照）を制限酵素ＢａｍＨＩとＫｐｎＩ
とで切断してアガロースゲル電気泳動にかけ、ＳＴ−Ｌ
ＤＨを含むＤＮＡ断片が含まれる部分を切り出し、次い
でＧＥＮＥＣＬＥＡＮＤＮＡ精製キットを用いて単離し
た。このＤＮＡと、実施例２で得られたｐＳＹＥ２をＢ
ａｍＨＩとＫｐｎＩとで切断したものをライゲーション
させた。この反応液を用いてＬｃ．ｌａｃｔｉｓ ＩＬ
１４０３株の形質転換を行ったところ、図３に示される
ようなプラスミドｐＳＹＥＬ２９を保持する形質転換株
が得られた。
【００４２】ｐＳＹＥＬ２９プラスミドを文献７の方法
で調製し、実施例５で示したのと同じ方法でＬｂ．ｌａ
ｃｔｉｓ ＡＴＣＣ１２３１５株への形質転換に用い
た。その結果、Ｅｍ耐性を示す形質転換株が得られた
が、これらは導入したプラスミドと同じ制限酵素地図を
有するプラスミドを保持していた。
で調製し、実施例５で示したのと同じ方法でＬｂ．ｌａ
ｃｔｉｓ ＡＴＣＣ１２３１５株への形質転換に用い
た。その結果、Ｅｍ耐性を示す形質転換株が得られた
が、これらは導入したプラスミドと同じ制限酵素地図を
有するプラスミドを保持していた。
【００４３】これらの形質転換株を脱脂粉乳培地で培養
し、培養液を蒸留水で希釈した後、その遠心上清中の乳
酸を乳酸測定キット（ＦキットＬ−乳酸；ベーリンガー
社）で測定したところ、本宿主菌が本来は全く生産しな
いＬ−乳酸がＤ−乳酸とほぼ等量検出された。
し、培養液を蒸留水で希釈した後、その遠心上清中の乳
酸を乳酸測定キット（ＦキットＬ−乳酸；ベーリンガー
社）で測定したところ、本宿主菌が本来は全く生産しな
いＬ−乳酸がＤ−乳酸とほぼ等量検出された。
【００４４】更に、形質転換株を破砕してその細胞抽出
液を調べたところ、本宿主菌で検出されないＬ−乳酸脱
水素酵素活性が検出された。このＬ−乳酸脱水素酵素を
精製してＮ末端アミノ酸を調べたところ、ＳＴ−ＬＤＨ
と同じであった。以上の結果から、ｐＳＹ１をレプリコ
ンとしてＬｂ．ｌａｃｔｉｓに異種遺伝子ＳＴ−ＬＤＨ
を発現させることが可能であることが示された。
液を調べたところ、本宿主菌で検出されないＬ−乳酸脱
水素酵素活性が検出された。このＬ−乳酸脱水素酵素を
精製してＮ末端アミノ酸を調べたところ、ＳＴ−ＬＤＨ
と同じであった。以上の結果から、ｐＳＹ１をレプリコ
ンとしてＬｂ．ｌａｃｔｉｓに異種遺伝子ＳＴ−ＬＤＨ
を発現させることが可能であることが示された。
【００４５】実施例８ ｐＳＹ１と大腸菌プラスミドと
の結合 実施例２と同様に調製したｐ８Ｅｍ１プラスミドを制限
酵素ＨｉｎｄIIIで切断後、Ｅｍ耐性遺伝子に相当する
１．１ｋｂのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動後の
ゲルから切り出し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＤＮＡ精製キ
ットを用いて単離した。その断片をＤＮＡプランティン
グキット（宝酒造（株））を用いて末端を平滑化したも
のと、ｐＵＣ１１８を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｈＩと
で切断後、同様に末端平滑化したものとをライゲーショ
ンした反応液を用いて大腸菌ＴＧ１株を形質転換し、Ｅ
ｍ５００μｇ／ｍｌで選択することにより、図４Ａに示
したプラスミドｐ８Ｅｍ３を作製した。同様に、ｐ８Ｅ
ｍ１を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後平滑化したものと、
ｐＵＣ１１８を制限酵素ＨｉｎｄIIIとＳａｃＩで切断
後平滑したものを用いることにより、図４Ｂに示したプ
ラスミドｐ８Ｅｍ５を作製した。
の結合 実施例２と同様に調製したｐ８Ｅｍ１プラスミドを制限
酵素ＨｉｎｄIIIで切断後、Ｅｍ耐性遺伝子に相当する
１．１ｋｂのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動後の
ゲルから切り出し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＤＮＡ精製キ
ットを用いて単離した。その断片をＤＮＡプランティン
グキット（宝酒造（株））を用いて末端を平滑化したも
のと、ｐＵＣ１１８を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｈＩと
で切断後、同様に末端平滑化したものとをライゲーショ
ンした反応液を用いて大腸菌ＴＧ１株を形質転換し、Ｅ
ｍ５００μｇ／ｍｌで選択することにより、図４Ａに示
したプラスミドｐ８Ｅｍ３を作製した。同様に、ｐ８Ｅ
ｍ１を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後平滑化したものと、
ｐＵＣ１１８を制限酵素ＨｉｎｄIIIとＳａｃＩで切断
後平滑したものを用いることにより、図４Ｂに示したプ
ラスミドｐ８Ｅｍ５を作製した。
【００４６】ｐ８Ｅｍ３およびｐ８Ｅｍ５を、それぞれ
のプラスミドを含むＴＧ１形質転換株より、常法にした
がって調製した。実施例１に示した方法で調製したｐＳ
Ｙ１プラスミドを制限酵素ＳｃａＩで切断し、ｐ８Ｅｍ
３を制限酵素ＳｍａＩで切断したものとライゲーション
を行なった後、反応液を実施例４と同様の方法によりＴ
Ｇ１株に形質転換し、形質転換株をアンピシリン（以
下、Ａｐと省略することがある）５０μｇ／ｍｌを含む
ＬＢ寒天培地で選択した。得られた形質転換株は、図４
Ｃに示されるようなプラスミドｐＥ３ＳＹ１を有してい
た。同様にｐＳＹ１プラスミドを制限酵素ＳｃａＩで切
断したものとｐ８Ｅｍ５を制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断
した後、末端を平滑化したものとライゲーションを行な
い、図４Ｄに示されるようなプラスミドｐＥ５ＳＹ１を
作製した。これらの形質転換株は、Ｅｍ耐性（５００μ
ｇ／ｍｌ）も有していた。
のプラスミドを含むＴＧ１形質転換株より、常法にした
がって調製した。実施例１に示した方法で調製したｐＳ
Ｙ１プラスミドを制限酵素ＳｃａＩで切断し、ｐ８Ｅｍ
３を制限酵素ＳｍａＩで切断したものとライゲーション
を行なった後、反応液を実施例４と同様の方法によりＴ
Ｇ１株に形質転換し、形質転換株をアンピシリン（以
下、Ａｐと省略することがある）５０μｇ／ｍｌを含む
ＬＢ寒天培地で選択した。得られた形質転換株は、図４
Ｃに示されるようなプラスミドｐＥ３ＳＹ１を有してい
た。同様にｐＳＹ１プラスミドを制限酵素ＳｃａＩで切
断したものとｐ８Ｅｍ５を制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断
した後、末端を平滑化したものとライゲーションを行な
い、図４Ｄに示されるようなプラスミドｐＥ５ＳＹ１を
作製した。これらの形質転換株は、Ｅｍ耐性（５００μ
ｇ／ｍｌ）も有していた。
【００４７】ｐＥ３ＳＹ１およびｐＥ５ＳＹ１プラスミ
ドを、ＴＧ１形質転換株から常法（文献８）にしたがっ
て調製し、実施例３にしたがってＬｃ．ｌａｃｔｉｓ
ＩＬ１４０３株への形質転換を行ない、形質転換株をＥ
ｍ２５μｇ／ｍｌを含むＢＬ寒天培地プレートで選択し
た。得られた形質転換株が保持していたプラスミドは、
全てＴＧ１から調製したプラスミドと同じ制限酵素地図
を有していた。以上より、ｐＳＹ１を大腸菌プラスミド
と結合させることにより、大腸菌をＡｐ及びＥｍで、ま
た乳酸球菌をＥｍでそれぞれ選択可能なシャトルベクタ
ーとして利用できることが判明した。
ドを、ＴＧ１形質転換株から常法（文献８）にしたがっ
て調製し、実施例３にしたがってＬｃ．ｌａｃｔｉｓ
ＩＬ１４０３株への形質転換を行ない、形質転換株をＥ
ｍ２５μｇ／ｍｌを含むＢＬ寒天培地プレートで選択し
た。得られた形質転換株が保持していたプラスミドは、
全てＴＧ１から調製したプラスミドと同じ制限酵素地図
を有していた。以上より、ｐＳＹ１を大腸菌プラスミド
と結合させることにより、大腸菌をＡｐ及びＥｍで、ま
た乳酸球菌をＥｍでそれぞれ選択可能なシャトルベクタ
ーとして利用できることが判明した。
【００４８】実施例９ ｐＳＹ１の複製に必要な領域の
デリーション法による推定 実施例９において得られたｐＥ３ＳＹ１プラスミドを制
限酵素ＢａｍＨＩとＰｓｔＩで切断し、キロシークエン
ス用ＤＮＡデリーションキット（宝酒造（株））を用い
て、欠失を行なった。反応液を実施例４と同様に大腸菌
ＴＧ１株に形質転換し、ｐＳＹ１部分が様々な長さにま
で欠失した一連の欠失体プラスミドを得た。これらの欠
失体プラスミドをＴＧ１の形質転換株から調製し、実施
例３と同様な方法でＬｃ．ｌａｃｔｉｓ ＩＬ１４０３
株へ形質転換し、Ｅｍ２５μｇ／ｍｌを含むＢＬ寒天培
地プレートで選択した。Ｅｍ耐性を示す形質転換株が保
持しているプラスミドを調製してその制限酵素認識部位
を調べたところ、得られた最短のものでは、図５に示さ
れた位置、即ち、ユニークなＨａｅIII認識部位のごく
近傍までの欠失が起こっていた。同様に、ｐＥ５ＳＹ１
プラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩとＫｐｎＩで切断した
ものを欠失させた場合には、ＩＬ１４０３株で形質転換
体が得られる最短のものは、図５に示された、ユニーク
なＣｌａＩ認識部位から約１００ｂｐ ＥｃｏＲＩより
の位置までの欠失が起こっていた。以上から、ｐＳＹ１
の複製に必要な領域は、少なくとも図５中に太線で示さ
れる約１．７ｋｂの領域であることが判明した。
デリーション法による推定 実施例９において得られたｐＥ３ＳＹ１プラスミドを制
限酵素ＢａｍＨＩとＰｓｔＩで切断し、キロシークエン
ス用ＤＮＡデリーションキット（宝酒造（株））を用い
て、欠失を行なった。反応液を実施例４と同様に大腸菌
ＴＧ１株に形質転換し、ｐＳＹ１部分が様々な長さにま
で欠失した一連の欠失体プラスミドを得た。これらの欠
失体プラスミドをＴＧ１の形質転換株から調製し、実施
例３と同様な方法でＬｃ．ｌａｃｔｉｓ ＩＬ１４０３
株へ形質転換し、Ｅｍ２５μｇ／ｍｌを含むＢＬ寒天培
地プレートで選択した。Ｅｍ耐性を示す形質転換株が保
持しているプラスミドを調製してその制限酵素認識部位
を調べたところ、得られた最短のものでは、図５に示さ
れた位置、即ち、ユニークなＨａｅIII認識部位のごく
近傍までの欠失が起こっていた。同様に、ｐＥ５ＳＹ１
プラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩとＫｐｎＩで切断した
ものを欠失させた場合には、ＩＬ１４０３株で形質転換
体が得られる最短のものは、図５に示された、ユニーク
なＣｌａＩ認識部位から約１００ｂｐ ＥｃｏＲＩより
の位置までの欠失が起こっていた。以上から、ｐＳＹ１
の複製に必要な領域は、少なくとも図５中に太線で示さ
れる約１．７ｋｂの領域であることが判明した。
【００４９】引用文献 1. Holo, H. and I.F. Nes, (1989) Appl. Environ. Mi
crobiol., 55(12)3119-3123. 2. Mercenier, A., (1990) FEMS Microbiol. Rev., 87,
61-77. 3. Chassy, B.M. and J.L. Flickinger,(1987) FEMS Mi
crobiol. Lett.,(44) 173-177. 4. Kaletta, C. and K-D. Entian, (1989) J. Bactelio
l., 171, 1597-1601. 5. Ross, P. et al., (1990) Appl. Environ. Microbio
l., 56, 2164-2169. 6. Efthymiou, C. et al., (1962) J. Infect. Dis., 1
10, 258-267. 7. Anderson, D. and L.L.Mckay, (1983) Appl. Enviro
n. Microbiol., 46,549-552. 8. Maniatis, T, et al., (1982) Molecular Cloning:
A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold spring Harbor, New York. 9. LeBlanc, D.J. and L.N.Lee, (1984)J. Bacteriol.,
157 445-453. 10. Chang, S. and S.N.Cohen, (1979) Mol. Gen. Gene
t, 168, 111-. 11. Yamane, K. et al., (1984) J. Biochem. 96, 1849
-1858.
crobiol., 55(12)3119-3123. 2. Mercenier, A., (1990) FEMS Microbiol. Rev., 87,
61-77. 3. Chassy, B.M. and J.L. Flickinger,(1987) FEMS Mi
crobiol. Lett.,(44) 173-177. 4. Kaletta, C. and K-D. Entian, (1989) J. Bactelio
l., 171, 1597-1601. 5. Ross, P. et al., (1990) Appl. Environ. Microbio
l., 56, 2164-2169. 6. Efthymiou, C. et al., (1962) J. Infect. Dis., 1
10, 258-267. 7. Anderson, D. and L.L.Mckay, (1983) Appl. Enviro
n. Microbiol., 46,549-552. 8. Maniatis, T, et al., (1982) Molecular Cloning:
A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold spring Harbor, New York. 9. LeBlanc, D.J. and L.N.Lee, (1984)J. Bacteriol.,
157 445-453. 10. Chang, S. and S.N.Cohen, (1979) Mol. Gen. Gene
t, 168, 111-. 11. Yamane, K. et al., (1984) J. Biochem. 96, 1849
-1858.
【００５０】
【発明の効果】本発明プラスミドｐＳＹ１はチーズ生産
菌であるＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕ
ｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓの一株から分離されたものであ
るから、歴史的に安全性が確かめられているものであ
る。しかもＢａｃｉｌｌｕｓ属やＬａｃｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ属、さらに、従来形質転換が極めて困難であったＬａ
ｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ種の
２つの亜種ｌａｃｔｉｓとｂｕｌｇａｒｉｕｓなどの食
品工業等において重要な菌種のみならず、微生物宿主と
してもっとも広く利用されている大腸菌においても複製
が可能で、それらの菌を形質転換させる能力を有してい
る。また、全体のサイズは約２．８ｋｂと、比較的小型
であって、遺伝子組換えにおける種々の取り扱いを容易
に行うことができる。以上挙げられるような特色から、
本発明プラスミドは、食品製造用微生物用のベクターと
して適当であり、本発明プラスミドを利用して新規な有
用微生物を育種できることが期待される。
菌であるＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕ
ｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓの一株から分離されたものであ
るから、歴史的に安全性が確かめられているものであ
る。しかもＢａｃｉｌｌｕｓ属やＬａｃｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ属、さらに、従来形質転換が極めて困難であったＬａ
ｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ種の
２つの亜種ｌａｃｔｉｓとｂｕｌｇａｒｉｕｓなどの食
品工業等において重要な菌種のみならず、微生物宿主と
してもっとも広く利用されている大腸菌においても複製
が可能で、それらの菌を形質転換させる能力を有してい
る。また、全体のサイズは約２．８ｋｂと、比較的小型
であって、遺伝子組換えにおける種々の取り扱いを容易
に行うことができる。以上挙げられるような特色から、
本発明プラスミドは、食品製造用微生物用のベクターと
して適当であり、本発明プラスミドを利用して新規な有
用微生物を育種できることが期待される。
【００５１】
以下の図面において用いられている制限酵素の略称とそ
の正式名とを以下に示した。 Ｂｍ：ＢａｍＨＩ、Ｃｌ：ＣｌａＩ、Ｅｃ：ＥｃｏＲ
Ｉ、Ｈｄ：ＨｉｎｄIII、ＨIII：ＨａｅIII、Ｋｐ：Ｋ
ｐｎＩ、Ｍｌ：ＭｌｕＩ、Ｓａ：ＳａｃＩ、Ｓｃ：Ｓｃ
ａＩ、Ｓｓ：ＳｓｐＩ、Ｓｐ：ＳｐｈＩ
の正式名とを以下に示した。 Ｂｍ：ＢａｍＨＩ、Ｃｌ：ＣｌａＩ、Ｅｃ：ＥｃｏＲ
Ｉ、Ｈｄ：ＨｉｎｄIII、ＨIII：ＨａｅIII、Ｋｐ：Ｋ
ｐｎＩ、Ｍｌ：ＭｌｕＩ、Ｓａ：ＳａｃＩ、Ｓｃ：Ｓｃ
ａＩ、Ｓｓ：ＳｓｐＩ、Ｓｐ：ＳｐｈＩ
【図１】ｐＳＹ１の制限酵素地図である。各制限酵素の
認識部位をＳｃａＩを基準として、ｋｂ単位で示した
（ｐＳＹ１は環状であるが、ＳｃａＩを基準として直線
状に示した）。また、ＨｉｎｄIII、ＳｐｈＩ、Ｐｓｔ
Ｉ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、Ｋｐ
ｎＩ、ＳａｃＩの認識部位は存在しなかった。
認識部位をＳｃａＩを基準として、ｋｂ単位で示した
（ｐＳＹ１は環状であるが、ＳｃａＩを基準として直線
状に示した）。また、ＨｉｎｄIII、ＳｐｈＩ、Ｐｓｔ
Ｉ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、Ｋｐ
ｎＩ、ＳａｃＩの認識部位は存在しなかった。
【図２】ｐＳＹ１誘導体である、ｐＳＹＥ１（図２の
Ａ）、ｐＳＹＥ２（図２のＢ）の制限酵素地図である。
図中二重線はｐＳＹ１の配列を、太線矢印はｐＡＭβ１
由来のエリスロマイシン耐性遺伝子（およびその転写方
向）を示す。
Ａ）、ｐＳＹＥ２（図２のＢ）の制限酵素地図である。
図中二重線はｐＳＹ１の配列を、太線矢印はｐＡＭβ１
由来のエリスロマイシン耐性遺伝子（およびその転写方
向）を示す。
【図３】プラスミドｐＳＹＥＬ２９の制限酵素地図であ
る。図中の縦縞矢印はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓ
ａｌｉｖａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ Ｍ−１９２株のＬ−乳酸脱水素酵素（ＳＴ−
ＬＤＨ）遺伝子（およびその転写方向）を示す。
る。図中の縦縞矢印はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓ
ａｌｉｖａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ Ｍ−１９２株のＬ−乳酸脱水素酵素（ＳＴ−
ＬＤＨ）遺伝子（およびその転写方向）を示す。
【図４】プラスミドｐ８Ｅｍ３、ｐ８Ｅｍ５、ｐＥ３Ｓ
Ｙ１及びｐＥ５ＳＹ１の制限酵素地図を表す（なおこれ
らはいずれも環状であるが、ｐＵＣ１１８中のＴＣＧＣ
ＧＣＧＴＴＣの最初のＴを基準として直線状にして示し
た）。図中実線部はｐＵＣ１１８由来の配列、二重線は
ｐＳＹ１の配列、太線矢印はｐＡＭβ１由来のエリスロ
マイシン耐性遺伝子（およびその転写方向）、細線矢印
はｐＵＣ１１８由来のアンピシリン耐性遺伝子（および
その転写方向）を示す。
Ｙ１及びｐＥ５ＳＹ１の制限酵素地図を表す（なおこれ
らはいずれも環状であるが、ｐＵＣ１１８中のＴＣＧＣ
ＧＣＧＴＴＣの最初のＴを基準として直線状にして示し
た）。図中実線部はｐＵＣ１１８由来の配列、二重線は
ｐＳＹ１の配列、太線矢印はｐＡＭβ１由来のエリスロ
マイシン耐性遺伝子（およびその転写方向）、細線矢印
はｐＵＣ１１８由来のアンピシリン耐性遺伝子（および
その転写方向）を示す。
【図５】ｐＳＹ１の複製必須領域の推定である。図中矢
印は欠失方向、太線は複製必須領域と推定される範囲を
示す。なおｐＳＹ１は環状であるが、ＳｃａＩを基準と
して直線状にして示した。
印は欠失方向、太線は複製必須領域と推定される範囲を
示す。なおｐＳＹ１は環状であるが、ＳｃａＩを基準と
して直線状にして示した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:225） (Ｃ１２Ｎ 15/75 Ｃ１２Ｒ 1:01 1:19 1:125）
Claims (12)
- 【請求項１】 約２．８ｋｂの長さを持ち、図１の制限
酵素地図を有することを特徴とする環状二本鎖ＤＮＡプ
ラスミドｓＰＹ１。 - 【請求項２】 請求項１の環状二本鎖ＤＮＡプラスミド
ｐＳＹ１の一部が除去された環状二本鎖ＤＮＡプラスミ
ド。 - 【請求項３】 請求項１の環状二本鎖ＤＮＡプラスミド
ｐＳＹ１若しくは請求項２のプラスミドのＥｃｏＲＩ認
識部位若しくはそれ以外の部位にｐＡＭβ１由来のエリ
スロマイシン耐遺伝子が挿入されてなる環状二本鎖ＤＮ
Ａプラスミド。 - 【請求項４】 請求項１の環状二本鎖ＤＮＡプラスミド
ｐＳＹ１若しくは請求項２のプラスミド若しくは請求項
３のプラスミドに大腸菌のｐＵＣプラスミドなどのプラ
スミドを結合して得られる環状二本鎖ＤＮＡプラスミ
ド。 - 【請求項５】 請求項４の環状二本鎖ＤＮＡプラスミド
にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ
ｓｕｂｓｐ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＬ−
乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれてなる環状二本鎖Ｄ
ＮＡプラスミド。 - 【請求項６】 環状二本鎖ＤＮＡプラスミドｐＳＹ１の
複製部位を含むプラスミドにより形質転換されたＢａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ 若しくはＬａｃｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉ
ｓ 若しくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ 若し
くはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉ
ｉ ｓｕｂｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ。 - 【請求項７】 請求項３若しくは請求項４若しくは請求
項５の環状二本鎖ＤＮＡプラスミドで形質転換されたＢ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ。 - 【請求項８】 請求項３若しくは請求項４若しくは請求
項５の環状二本鎖ＤＮＡプラスミドで形質転換されたＬ
ａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．
ｌａｃｔｉｓ。 - 【請求項９】 請求項３若しくは請求項４若しくは請求
項５の環状二本鎖ＤＮＡプラスミドで形質転換されたＥ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ。 - 【請求項１０】 請求項３若しくは請求項４若しくは請
求項５の環状二本鎖ＤＮＡプラスミドで形質転換された
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ
ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ。 - 【請求項１１】 請求項３若しくは請求項４若しくは請
求項５の環状二本鎖ＤＮＡプラスミドで形質転換された
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ
ｓｕｂｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ。 - 【請求項１２】 請求項１の環状二本鎖ＤＮＡプラスミ
ドｐＳＹ１を含有し、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１２６５
０として微工研に寄託されているＬａｃｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ Ｍ−
１２８Ｃ株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35800891A JP3421357B2 (ja) | 1991-12-27 | 1991-12-27 | 乳酸球菌由来の新規なプラスミドｐＳＹ１及びその誘導体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35800891A JP3421357B2 (ja) | 1991-12-27 | 1991-12-27 | 乳酸球菌由来の新規なプラスミドｐＳＹ１及びその誘導体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05176776A true JPH05176776A (ja) | 1993-07-20 |
| JP3421357B2 JP3421357B2 (ja) | 2003-06-30 |
Family
ID=18457071
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP35800891A Expired - Lifetime JP3421357B2 (ja) | 1991-12-27 | 1991-12-27 | 乳酸球菌由来の新規なプラスミドｐＳＹ１及びその誘導体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3421357B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007034581A1 (ja) * | 2005-09-26 | 2007-03-29 | Bioleaders Japan Corporation | 乳酸菌用プラスミド |
| WO2021015267A1 (ja) | 2019-07-25 | 2021-01-28 | 株式会社ダイセル | ウロリチン類の水酸基を脱水酸化する酵素 |
| WO2022045257A1 (ja) | 2020-08-28 | 2022-03-03 | 株式会社ダイセル | ウロリチン類の９位の水酸基を脱水酸化する酵素 |
-
1991
- 1991-12-27 JP JP35800891A patent/JP3421357B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007034581A1 (ja) * | 2005-09-26 | 2007-03-29 | Bioleaders Japan Corporation | 乳酸菌用プラスミド |
| WO2021015267A1 (ja) | 2019-07-25 | 2021-01-28 | 株式会社ダイセル | ウロリチン類の水酸基を脱水酸化する酵素 |
| WO2022045257A1 (ja) | 2020-08-28 | 2022-03-03 | 株式会社ダイセル | ウロリチン類の９位の水酸基を脱水酸化する酵素 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3421357B2 (ja) | 2003-06-30 |
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