NL1012434C2 - Propionibacteriumvector. - Google Patents

Description

PROPIONIBACTERIÜMVECTOR

Deze uitvinding heeft betrekking op een endogeen plasmide van 5 Propionibacterium, vectoren die daarvan afgeleid zijn en de toepassing van deze vectoren om (heterologe) eiwitten tot expressie te brengen in bacteriën, in het bijzonder Propionibacteriën. Getransformeerde bacteriën kinnen met name gebruikt worden om, door fermentatie, vitamine B12 te produceren of bij de kaasbereiding.

10

Inleiding

Propionibacteriën zijn Gram-positieve bacteriën die verschillende bruikbare verbindingen kunnen produceren in een verscheidenheid van industriële processen. Van verschillende Propionibacterium species is 15 bijvoorbeeld bekend dat ze vitamine B12 (cobalamine) produceren in op grote schaal uitgevoerde fermentatieprocessen. Andere species worden gebruikt in zuiveltoepassingen, zoals kaasbereiding, waar zij bijdragen aan, en in vele gevallen zelfs hoofdzakelijk verantwoordelijk zijn voor, de specifieke smaak en textuur van de kaas. Veel 20 Propionibacterium species worden als veilig beschouwd voor opname, als levende organismen, in voedsel en diervoeder.

Om in staat te zijn het biotechnologische potentieel van Propionibacterium volledig te benutten, zijn efficiënte en flexibele genetische manipulatietechnieken nodig. Dergelijke technieken zijn 25 afhankelijk van de beschikbaarheid van een geschikt plasmide om een eiwit uit een heteroloog gen in Propionibacterium tot expressie te brengen.

In EP-A-0400931 (Nippon Oil) wordt verwezen naar een endogeen plasmide (pTY-1) uit Propionibacterium pentosaceum (ATCC 4875), maar de 30 sequentie ervan wordt niet beschreven en evenmin wordt met voorbeelden toegelicht hoe het gebruikt kan worden om een heteroloog gen tot expressie te brengen.

In JP 08-56673 wordt verwezen naar het plasmide pTY-1 voor het produceren van vitamine BX2, maar er wordt geen enkel bewijs geleverd 35 dat het plasmide als een vrij replicerend extrachromosomaal element in stand blijft, noch dat het plasmide stabiel is binnen de getransformeerde cellen.

1 0 124 34 2

De uitvinding beoogt daarom vectoren te verschaffen die efficiënter zijn dan die volgens de stand van de techniek, en die extrachromosomaal in stand kunnen blijven en/of stabiel zijn. In het bijzonder heeft de uitvinding tot doel een efficiënte vector te verschaffen voor het 5 kloneren of tot expressie brengen van Propionibacterium of vreemde genomische fragmenten of genen in een (Propionibacterium) gastheerstam. Dit kan het mogelijk maken om gastheer-specifieke restrictie-enzymen te ontwijken en daardoor te vermijden dat de gastheer het plasmide als een vreemd polynucleotide behandelt.

10

Samenvatting van de uitvinding

Bijgevolg verschaft de onderhavige uitvinding in een eerste aspect een polynucleotide die een sequentie omvat die selectief kan hybridiseren met 15 (a) SEQ. ID. NR. 1 of het complement daarvan; (b) een sequentie uit het plasmide van 3,6 kb van Propionibacterium freudenreichii CBS 101022; (c) een sequentie uit het plasmide van 3,6 kb van Propionibacterium freudenreichii CBS 101023; of 20 (d) een sequentie die codeert voor een polypeptide van de ^ uitvinding, zoals (ten minste een deel van) de aminozuursequentie van SEQ. ID. NR. 2 of SEQ. ID. NR. 3 of het ! complement ervan.

| SEQ. ID. NR. 1 beschrijft de DNA-sequentie van het endogene 25 plasmide van Propionibacterium LMG 16545 dat de uitvinders ontdekt hebben. De eerste coderende sequentie loopt van nucleotide 273 tot nucleotide 1184 en de voorspelde aminozuursequentie van deze coderende 'T sequentie wordt in SEQ. ID. NR. 2 weergegeven. De tweede coderende sequentie loopt van nucleotide 1181 tot 1483 en de voorspelde 30 aminozuursequentie van deze coderende sequentie wordt in SEQ. ID. NR. 3 weergegeven.

De uitvinders screenden een grote collectie Propionibacterium-isolaten en identificeerden twee stammen die beide cryptische plasmiden met een grootte van 3,6 kb herbergen. Eén van de stammen is 35 Propionibacterium freudenreichii LMG 16545, die op 19 juni 1998 onder de bepalingen van het Verdrag van Boedapest op naam van Gist-brocades B.V., Wateringseweg 1, Postbus 1, 2600 MA Delft, Nederland, gedeponeerd 1012434 3 werd bij het Centraal Bureau voor Schimmelcultures (CBS), Oosterstraat l. Postbus 273, NL-3740 AG Baam, Nederland en waaraan het toelatingsnunvmer CBS 101022 gegeven werd. De andere stam is Propionibacterium freudenreichii LMG 16546, die ook op 19 juni 1998 5 door dezelfde deposant onder de bepalingen van het Verdrag van

Boedapest gedeponeerd werd bij CBS en waaraan het toelatingsnummer CBS 101023 gegeven werd.

Door middel van volledige karakterisering en met behulp van de computer uitgevoerde analyse van de nucleotidesequentie van LMG 16545 10 waren de uitvinders in staat insertieplaatsen voor vreemde DNA- fragmenten te identificeren. Deze plaatsen maakten constructie van plasmiden mogelijk die nog steeds tot autonome replicatie in Propionibacterium in staat zijn.

Verrassenderwijs is gevonden dat een erythromycine-resistentiegen 15 uit de actinomyceet Saccharopolyspora erythraea efficiënt tot expressie gebracht wordt in Propionibacterium en dus gebruikt kan worden als selectiemerker voor getransformeerde cellen.

Ook zijn bifunctionele vectoren geconstrueerd, die stabiel te handhaven en selecteerbaar zijn in zowel E.coli als Propionibacterium. 20 Dit maakt het mogelijk E.coli te gebruiken voor vectorconstructie, alsook voor functionele expressie van homologe of heterologe genen in Propionibacterium. Vectorconstructie met behulp van E.coli is relatief gemakkelijk en kan snel uitgevoerd worden.

Het polynucleotide van de uitvinding kan autonoom replicerend zijn 25 of extrachromosomaal, bijvoorbeeld in een bacterie zoals een Propionibacterium.

Vandaar dat een ander aspect van de uitvinding is een vector te verschaffen die een polynucleotide van de uitvinding omvat.

De uitvinding verschaft ook een werkwijze voor de bereiding van een 30 polypeptide, welke werkwijze bestaat uit het kweken van een gastheercel die getransformeerd of getransfecteerd is met een vector van de uitvinding onder omstandigheden waarbij voorzien wordt in expressie van het polypeptide.

De uitvinding verschaft bovendien een polypeptide dat de sequentie 35 omvat die in SEQ. ID. NB. 2 of 3 beschreven wordt of een sequentie die in hoofdzaak homoloog aan die sequentie is, of een fragment van één van 1012434 4 beide sequenties, of een eiwit waarvoor door een polynucleotide van de uitvinding gecodeerd wordt.

Gedetailleerde beschrijving van de uityinding

Een polynucleotide van de uitvinding kan in staat zijn selectief te hybridiseren met de sequentie van SEQ. ID. NR. 1, of een gedeelte van SEQ. ID. NR. l, of met de sequentie die complementair is met die sequentie of met dat gedeelte van de sequentie. Het polynucleotide van 10 de uitvinding kan in staat zijn selectief te hybridiseren met de sequentie van het plasmide van 3,5 kb van P.freudenreichii CBS 101022 of CBS 101023, of met een gedeelte van de sequentie van één van beide plasmiden. Doorgaans is een polynucleotide van de uitvinding een opeenvolgende sequentie van nucleotiden die selectief kan hybridiseren 15 met de sequentie van SEQ. ID. NR. 1 of van één van beide plasmiden van 3,6 kb, of gedeelte van een van deze sequenties, of met het complement van deze sequenties of een gedeelte van een van deze sequenties.

Een polynucleotide van de uitvinding en de sequentie van SEQ. ID. NR. 1, of één van de beide plasmiden van 3,6 kb, of een sequentie die 20 codeert voor een polypeptide, of een gedeelte van deze sequenties, kan hybridiseren op een niveau dat belangrijk hoger ligt dan het achtergrondniveau. Achtergrondhybridisatie kan bijvoorbeeld plaatsvinden, vanwege andere polynucleotiden die in het preparaat aanwezig zijn. Het signaalniveau dat gegenereerd wordt door de j 25 interactie tussen een polynucleotide van de uitvinding en de sequentie van SEQ. ID. NR. 1 of van één van beide plasmiden van 3,6 kb, of een gedeelte van deze sequenties, is doorgaans ten minste 10 keer, bij voorkeur ten minste 100 keer, zo intens als interacties tussen andere polynucleotiden en de coderende sequentie van SEQ. ID. NR. 1 of van één 30 van beide plasmiden van 3,6 kb; of een sequentie die codeert voor het polypeptide, of een gedeelte van deze sequenties. De intensiteit van de interactie kan bijvoorbeeld gemeten worden door radioactief merken van de probe, b.v. met 32P. Selectieve hybridisatie wordt doorgaans bewerkstelligd onder omstandigheden van middelmatige stringentie (bij -35 voorbeeld 0,3 M natriumchloride en 0,03 M natriumcitraat bij ongeveer 50°C) tot hoge stringentie (dezelfde omstandigheden, maar bij ongeveer 60°C) .

1012434 5

Polynucleotiden die deel uitmaken van de uitvinding kunnen in het algemeen ten minste voor 70%, bij voorkeur ten minste 80 of 90%, met meer voorkeur ten minste 95% en optimaal ten minste 98% homoloog zijn (aan de sequenties (a) tot (d)) over een regio van ten minste 20, bij 5 voorkeur ten minste 30, bijvoorbeeld ten minste 40, 60 of 100 of meer opeenvolgende nucleotiden.

Elke combinatie van de hiervoor genoemde homologieniveaus en minimumafmetingen kan gebruikt worden om polynucleotiden van de uitvinding te definiëren, waarbij de stringentere combinaties (d.w.z.

10 hogere homologie over grotere lengtes) de voorkeur hebben. Zo vormt bijvoorbeeld een polynucleotide dat ten minste voor 80% of 90% homoloog is over 25, bij voorkeur over 30 nucleotiden een uitvoeringsvorm van de uitvinding, evenals een polynucleotide dat ten minste voor 90% of 95% homoloog is over 40 nucleotiden.

15 De gedeeltes waar hierboven naar verwezen wordt, kunnen de coderende sequenties van SEQ. ID. NR. 1 of van één_van beide plasmiden van 3,6 kb zijn. Andere gedeeltes van SEQ. ID. NR. 1 die de voorkeur hebben, zijn de replicatie-oorsprong, promotor of regulerende sequenties, of sequenties die autonome replicatie in een gastheercel, 20 zoals een Propionibacterium, kunnen bewerkstelligen of daarbij behulpzaam kunnen zijn.

Er is gevonden dat het gedeelte van het plasmide van de restrictieplaats Sail tot AZwNI de regio blijkt te zijn die nodig is voor replicatie van het plasmide. Er zijn andere delen van het plasmide 25 verwijderd en toch bleek replicatie niet nadelig beïnvloed te zijn. Daarom kunnen in de uitvinding de sequenties (b) en (c) de door de restrictieplaatsen Sail en AlwNI afgebakende regio zijn. Deze heeft ongeveer een lengte van 1,7 b. Het is ook mogelijk dat de sequenties (b) of (c) vervangen worden door de sequentie die overeenkomt met de 30 nucleotiden 1 tot 1800, zoals 100 tot 1700, geschikt 150 tot 1500, met voordeel 200 tot 1300 en optimaal 250 tot 1200 van SEQ. ID. NR. 1.

Van de eiwitten (SEQ. ID. NR. 2 en 3) gecodeerd door respectievelijk ORFl en ORF2 wordt gemeend dat ze beide het plasmide helpen te repliceren. De plasmiden repliceren door de bekende rollende 35 cirkel replicatiemethode, waarbij het oorspronkelijke dsDNA-plasmide geknipt wordt door elk van de eiwitten die helpen bij de vorming van een kopie van de buitenstreng met behulp van de binnenstreng als 1012434 6 matrijs. De kopie van de buitenring wordt verwijderd en de uiteinden verenigd. De gastheer repliceert vervolgens een nieuwe binnenring waarbij de gegenereerde buitenring als matrijs wordt gebruikt.

De coderende sequenties van de uitvinding kunnen gemodificeerd zijn 5 door nucleotidesubstituties, bijvoorbeeld van 1, 2 of 3, tot 10, 25 of 100 substituties. De polynucleotiden van de sequenties (a) tot (d) kunnen alternatief of aanvullend gemodificeerd zijn door één of meer inserties of deleties en/of door een verlenging aan één van beide of beide uiteinden. Gedegenereerde substituties kunnen uitgevoerd worden 10 en/of er kunnen substituties uitgevoerd worden die zouden resulteren in een conservatieve aminozuursubstitutie als de gemodificeerde sequentie vertaald wordt, bijvoorbeeld zoals later besproken in verband met de polypeptiden van de uitvinding.

Polynucleotiden van de uitvinding kunnen DNA of RNA omvatten. Zij 15 kunnen ook polynucleotiden zijn die synthetische of gemodificeerde nucleotiden in zich bevatten. Een aantal verschillende types :;;:i modificaties aan polynucleotiden zijn bekend volgens de stand van de techniek. Daartoe behoren onder andere methylfosfonaat- en fosforthioaathoofketens, toevoeging van acridine- of polylysineketens 20 aan de 3'- en/of 5'-uiteinden van het molecuul. Voor de doeleinden van de onderhavige uitvinding dient duidelijk te zijn dat de hier beschreven polynucleotiden gemodificeerd kunnen worden volgens elke j volgens de stand van de techniek beschikbare methode. Dergelijke ' modificaties kunnen uitgevoerd worden teneinde de in vivo activiteit of 25 levensduur te vergroten.

Polynucleotiden van de uitvinding kunnen gebruikt worden als een primer, b.v. een PCR- (polymerase-kettingreactie) primer, een primer voor een alternatieve amplificatiereactie, een probe b.v. op gebruikelijke wijze gelabeld met een informatie verschaffend label met 30 behulp van radioactieve of niet-radioactieve labels, of de polynucleotiden kunnen opgenomen of gekloneerd worden in vectoren.

Dergelijke primers, probes en andere fragmenten zullen ten minste 15, bij voorkeur ten minste 20, bijvoorbeeld ten minste 25, 30 of 40 nucleotiden lang zijn. Zij zullen doorgaans tot 40, 50, 60, 70, 100 of 35 150 nucleotiden lang zijn. Probes en fragmenten kunnen langer zijn dan 150 nucleotiden, bijvoorbeeld tot 200, 300, 500, 1000 of 1500 1 0 124 34 7 nucleotiden lang, of zelfs tot een paar nucleotiden, zoals 5 of 10 nucleotiden, korter dan een van de sequenties (a) tot (d).

Polynucleotiden zoals een DNA-polynucleotide en primers volgens de uitvinding kunnen door recombinant DNA technieken, synthetisch of met 5 alle middelen die de vakman ter beschikking staan, geproduceerd worden. Zij kunnen ook volgens standaardtechnieken gekloneerd worden. De polynucleotiden worden doorgaans in geïsoleerde en/of gezuiverde vorm verschaft.

In het algemeen zullen de primers op synthetische wijze 10 geproduceerd worden, waarbij de gewenste nucleïnezuursequentie stapsgewijs bereid wordt, met één nucleotide tegelijk. Methodes om dit te bewerkstelligen met behulp van geautomatiseerde technieken zijn in ruime mate beschikbaar volgens de stand der techniek.

Langere polynucleotiden zullen in het algemeen geproduceerd worden 15 met behulp van recombinant DNA technieken, bijvoorbeeld met behulp van PCR-kloneringstechnieken. Hierbij zullen een paar primers gemaakt worden {b.v. van ongeveer 15-30 nucleotiden) aan de regio van SEQ. ID. NR. 1 of van één van beide plasmiden van 3,6 kb die men wil kloneren, worden de primers in contact gebracht met DNA dat uit een 20 Propionibacterium verkregen is, wordt een polymerase-kettingreactie uitgevoerd onder omstandigheden waarbij de gewenste regio geamplificeerd wordt, wordt het geamplificeerde fragment geïsoleerd (b.v. door het reactiemengsel te zuiveren op een agarosegel) en wordt het geamplificeerde DNA gewonnen. De primers kunnen zodanig 25 geconstrueerd zijn dat ze geschikte restrictie-enzymherkenningsplaatsen bevatten zodat het geamplificeerde DNA gekloneerd kan worden in een geschikte kloneringsvector. Dergelijke technieken kunnen gebruikt worden om het SEQ. ID. NR. 1 geheel of gedeeltelijk of één van beide plasmiden van 3,6 kb te verkrijgen.

30 De hier genoemde technieken zijn algemeen bekend volgens de stand van de techniek10.

Polynucleotiden die niet 100% homoloog aan SEQ. ID. NR. 1 of één van beide plasmiden van 3,6 kb zijn maar wel tot de uitvinding behoren, kunnen op een aantal wijzen verkregen worden.

35 Homologe polynucleotiden van SEQ. ID. NR. 1 of van één van beide plasmiden van 3,6 kb kunnen bijvoorbeeld verkregen worden door het proben van genomische DNA-bibliotheken die gemaakt zijn uit een reeks 1012434 8 van Propionibacteria, zoals P. freudenreichiï, P.jensenii, P.thoenii, P.acidipropionici of andere stammen van bacteriën van de klasse Actinomycetes, of andere Gram-positieve bacteriën, of die welke G:C-rijk zijn. Al deze organismen zijn geschikte bronnen van homologe of 5 heterologe genen, promotoren, enhancers, of gastheercellen, voor gebruik bij de uitvinding.

Dergelijke homologen en fragmenten daarvan zullen in het algemeen selectief kunnen hybridiseren met de coderende sequentie van SEQ. ID.

NR. 1 of het complement ervan of van één van beide plasmiden van 3,S 10 kb. Dergelijke sequenties kunnen verkregen worden door het proben van genomische DNA-bibliotheken van Propionibacterium met probes die de gehele, of een gedeelte van de, coderende sequentie SEQ. ID. NR. 1 of van één van beide plasmiden van 3,6 kb omvatten onder omstandigheden van middelmatige tot hoge stringentie (bijvoorbeeld 0,03 M 15 natriumchloride en 0,3 M natriumcitraat bij ongeveer 50 tot 60°C) .

Homologen kunnen ook verkregen worden met behulp van gedegenereerde POR waarbij primers gebruikt zullen worden die zodanig geconstrueerd zijn dat ze zich richten op geconserveerde sequenties in de homologen. Geconserveerde sequenties kunnen voorspeld worden uit het alignen van 20 SEQ. ID. NR. 1 of de sequentie van één van beide plasmiden van 3,6 kb met hun homologen. De primers zullen één of meer gedegenereerde posities bevatten en zullen gebruikt worden onder een stringentie die minder is dan die, welke gebruikt wordt voor het kloneren van sequenties met unieke sequentieprimers tegen bekende sequenties.

25 Dergelijke polynucleotiden kunnen ook verkregen worden door plaatsgerichte mutagenese van SEQ. ID. NR. 1 of van één van beide plasmiden van 3,6 kb, of hun homologen. Dit kan nuttig zijn als er bijvoorbeeld stille codonveranderingen in sequenties nodig zijn om de codonpreferenties voor een bepaalde gastheercel, waarin de 30 polynucleotidesequenties tot expressie gebracht worden, te optimaliseren. Andere sequentieveranderingen kunnen gewenst zijn teneinde restrictie-enzymherkenningsplaatsen in te brengen, of om de eigenschap of functie van de polypeptiden waarvoor de nucleotiden coderen, te veranderen.

j 35 Werkwijzen voor het meten van polynucleotidehomologie zijn algemeen I bekend volgens de stand van de techniek. Het UWGCG-pakket levert j bijvoorbeeld het BESTFIT-programma, dat gebruikt kan worden om j 1012434 9 homologie te berekenen, bijvoorbeeld met de standaard instelling7. Voor aminozuurhomologie voor wat betreft polypeptiden van de uitvinding die later besproken worden, kan men BLAST (Basic Local Alignment Search Tool1) gebruiken, dat alignments van aminozuursequenties (en indien 5 nodig nucleotidesequenties) zal produceren om te bepalen of sequenties met elkaar overeenkomen. BLAST kan dus gebruikt worden om exacte matches te bepalen of om homologen te identificeren en is bijzonder bruikbaar voor die matches welke geen tussenruimtes bevatten. De BLAST-techniek maakt gebruik van het algoritme dat gebaseerd is op het High-10 scoring Segment Pair (HSP).

De uitvinding omvat ook dubbelstrengse polynucleotiden welke een polynucleotidesequentie van de uitvinding en het complement ervan bevatten.

Polynucleotiden (b.v. probes of primers) van de uitvinding kunnen 15 een informatie verschaffend label dragen. Geschikte labels zijn onder andere radioactieve isotopen zoals 32P of 32S, enzynjlabels, of andere eiwitlabels zoals biotine. Detectietechnieken voor deze labels zijn op zichzelf bekend.

De polynucleotiden (gelabeld of ongelabeld) kunnen in op 20 nucleinezuur gebaseerde testen gebruikt worden voor het detecteren of sequencen van een ander polynucleotide van de uitvinding, in een monster.

Tot de polynucleotiden van de uitvinding behoren ook varianten van de sequentie van SEQ. ID. NR. 1 of van één van beide plasmiden van 3,6 25 kb die autonoom kunnen repliceren of die extrachromosomaal in stand kunnen blijven in een gastheercel. Dergelijke varianten kunnen stabiel zijn in een bacterie zoals Propionibacterium.

In het algemeen zal het polynucleotide de replicatie-oorsprong en/of coderende regio(s) van SEQ. ID. NR. 1 of van één van beide 30 plasmiden van 3,6 kb of homologen van deze sequenties, omvatten. Een polynucleotide van de uitvinding dat stabiel is in een gastheercel, zoals Propionibacterium of E.coli, is een polynucleotide dat niet binnen vijf generaties, zoals vijftien generaties, bij voorkeur dertig generaties, uit de gastheer verdwijnt. In het algemeen zal een derge-35 lijk polynucleotide elke generatie door beide dochtercellen overgeërfd worden.

1 0 12434 10

Het polynucleotide kan een promotor of een oorsprong van replicatie (b.v. stroomopwaarts van eventuele sequenties die voor een replicatie-eiwit coderen) omvatten.

Het polynucleotide van de uitvinding kan getransformeerd of 5 getransfecteerd zijn in een bacterie, zoals een Propionibacterium of E.coli, bijvoorbeeld door een geschikt werkwijze11. Het kan in een bacterie aanwezig zijn bij een kopie-aantal van 5 tot 500, zoals 10 tot 100.

Het polynucleotide kan in een andere bacterie dan een 10 Propionibacterium tot autonome replicatie in staat zijn. Een dergelijke bacterie kan E.coli of een Gram-positieve of G:C-rijke bacterie of één van de klasse van Actinomycetes zijn. Een dergelijk polynucleotide zal in het algemeen sequenties omvatten die het mogelijk maken dat het polynucleotide autonoom in de bacterie gerepliceerd wordt. Dergelijke 15 sequenties kunnen verkregen worden uit plasmiden die in die bacterie kunnen repliceren.

Een polynucleotide van de uitvinding kan een polynucleotide zijn dat geproduceerd is door replicatie in een Propionibacterium. Het kan ook geproduceerd zijn door replicatie in een andere bacterie zoals 20 E.coli. Het polynucleotide kan in staat zijn de gastheerrestrictiesystemen van Propionibacterium ontwijken.

Vectoren

Een tweede aspect van de uitvinding heeft betrekking op een vector 25 die een polynucleotide van het eerste aspect omvat. De vector kan in staat zijn te repliceren in een gastheercel, zoals een bacterie, j bijvoorbeeld Actinomycetes, b.v. Propionibacterium of E.coli. De vector ! kan een lineair polynucleotide of, hetgeen gebruikelijker is, een circulair polynucleotide zijn. De vector kan een hybride van het 30 polynucleotide van de uitvinding en een andere vector zijn. De andere vector kan een E. coli-vector, zoals pBR322, of een vector van de pUC-familie, Rl, ColD of RSF1010 of een daarvan afgeleide vector zijn.

Het polynucleotide of de vector van de uitvinding kan een plasmide zijn. Een dergelijk plasmide kan een restrictiekaart hebben die 35 hetzelfde of nagenoeg hetzelfde is als de restrictiekaarten die in Figuur 1, 2a of 2b weergegeven worden.

t Ü J /: ··< c 11

Het polynucleotide of de vector kan een grootte hebben van 1 kb tot 20 kb, zoals van 2 tot 10 kb, optimaal van 3 tot 7 kb.

Het polynucleotide of de vector kan meerdere functionele kloneringsplaatsen omvatten. Dergelijke kloneringsplaatsen omvatten in 5 het algemeen de herkenningssequenties van restrictie-enzymen. Het polynucleotide of de vector kan de sequentie weergegeven in SEQ. ID.

NR. 1 omvatten en/of bevat restrictie-enzymherkenningsplaatsen voor EcoRI, SacI, AlwNI, Bsml, BsaBI, Bell, ApaI, HindlII, Sail, Hpal, PstI, Sphl, BamHI, Acc65I, EcoRV en BglII. Het polynucleotide of de vector 10 kan dus één, meer dan één of al deze restrictie-enzymplaatsen omvatten, in het algemeen in de volgorde die in de Figuren weergegeven wordt.

Bij voorkeur integreert het polynucleotide of de vector van de uitvinding, wanneer aanwezig in een bacterie zoals een

Propionibacterium of E.coli, niet in het chromosoom van de bacterie. In 15 het algemeen integreert het polynucleotide of de vector niet binnen 5 generaties, bij voorkeur 20 of 30 generaties.

Het polynucleotide of de vector kan een autonoom replicerend plasmide zijn dat extrachromosomaal kan blijven binnen een gastheercel, welk plasmide afgeleid wordt uit een endogeen Propionibacterium-20 plasmide en, wanneer het een heteroloog (aan de gastheer) gen bevat, dat gen in de gastheercel tot expressie kan brengen. De uitdrukking "afgeleid uit" betekent dat het autonoom replicerende plasmide een sequentie bevat die hetzelfde is als het polynucleotide van de uitvinding.

25 De vector van de uitvinding kan een selecteerbare merker omvatten.

De selecteerbare merker kan er een zijn die antibiotische resistentie geeft, zoals ampicilline-, kanamycine- of tetracycline-resistentiegenen. De selecteerbare merker kan een erythromycine-resistentiegen zijn. Het erythromycine-resistentiegen kan afkomstig 30 zijn uit Actinomycetes, zoals Saccharopolyspora erythraea, bijvoorbeeld uit Saccharopolyspora erythraea NRRL 2338. Andere selecteerbare merkers die in de vector aanwezig kunnen zijn, zijn onder andere genen die resistentie tegen chlooramfenicol, thiostrepton, viomycine, neomycine, apramycine, hygromycine, bleomycine of streptomycine geven.

35 De vector kan een expressievector zijn, en kan dus een heteroloog gen omvatten (dat niet van nature in de gastheercel voorkomt, b.v. Propïonibacteria) of een endogeen of homoloog gen van de gastheercel, 1012434 12 b.v. Propïonibacteria. In de expressievector is het tot expressie te brengen gen gewoonlijk werkzaam gekoppeld aan een controlesequentie die voor de expressie van het gen in een gastheercel kan zorgen.

De uitdrukking "werkzaam gekoppeld" verwijst naar een juxtapositie 5 waarbij de beschreven componenten in een relatie tot elkaar staan die ze in staat stelt te functioneren zoals de bedoeling is. Een regulerende sequentie die "werkzaam gekoppeld" is aan een coderende sequentie is op een zodanige wijze geligeerd dat expressie van de coderende sequentie bewerkstelligd wordt onder omstandigheden die 10 verenigbaar zijn met de regulerende sequenties.

Het heterologe of endogene gen kan tussen de nucleotiden l en 200 of tussen de nucleotiden 1500 tot 3555 van SEQ. ID. NR. 1 ingevoegd worden of op een equivalente positie in een homoloog polynucleotide.

Dergelijke genen kunnen heterologe of endogene genen omvatten-zoals 15 voor elongatiefactoren, promotoren regulerende sequenties of elementen, en replicatie-eiwitten. Andere genen (die heteroloog aan de gastheer kunnen zijn) zijn onder andere die, welke coderen voor of helpen bij de productie van voedingsfactoren, immunomodulatoren, hormonen, eiwitten - en enzymen (b.v. proteasen, amylasen, peptidasen, lipasen), ' 20 texturerende middelen, smaakstoffen (b.v. diacetyl, aceton), genclusters, antimicrobiële middelen (b.v. nisine), stoffen voor gebruik in voedingsmiddelen (b.v. in worsten, kaas), metabolische enzymen, vitaminen (b.v. B12) uroporfyrinogeen (III), methyltransferase (UP III MT,) coJbiA, antigenen en (b.v. voor vaccins) therapeutische 25 middelen. Zoals duidelijk zal zijn, kunnen de gastheren een grote verscheidenheid van stoffen, niet alleen polypeptiden, produceren die het gewenste product kunnen zijn of die gebruikt kunnen worden om het gewenste product te produceren.

Het heterologe gen kan een therapeutisch effect op een mens of dier 30 hebben. Een dergelijk gen kan een antigeen omvatten, bijvoorbeeld uit een pathogeen organisme. De gastheer, zoals Propionibacterium, welke een polynucleotide met een dergelijk heteroloog gen omvat, kan gebruikt worden als of in een vaccin, en kan bescherming tegen de pathogenen _ geven.

35 Het heterologe antigeen kan een compleet eiwit zijn of een gedeelte van een eiwit dat een epitoop bevat. Het antigeen kan uit een bacterie, ::.=1= een virus, een gist of een schimmel afkomstig zijn.

1 0 12 4 3 4 lirrajiu· saai 13

Gastheercellen en expressie

De gastheercel vormt het derde aspect van de uitvinding en omvat 5 een polynucleotide of vector van het eerste of tweede aspect. De gastheercel kan een bacterie zijn, b.v. van de klasse Actinomycetes. De bacterie kan een Propionibacterium of E. coli zijn. De Propionibacterium kan P. freudenreïchiï, P.jensenii, P.thoenii of P.acidipropionici zijn.

10 In een vierde aspect verschaft de uitvinding een werkwijze voor het produceren van een gastheercel van het derde aspect, welke werkwijze bestaat uit het transformeren of transfecteren van een gastheercel met een polynucleotide of vector van het eerste of tweede aspect, b.v. met bekende transformatietechnieken11.

15 In een vijfde aspect verschaft de uitvinding een werkwijze voor de bereiding van een polypeptide waarvoor gecodeerd wordt door het polynucleotide of de vector van de uitvinding dat/die in de gastheer van de uitvinding aanwezig is, welke werkwijze bestaat uit het plaatsen of kweken van de gastheercel onder omstandigheden waarbij expressie van 20 het polypeptide plaatsvindt.

Dit aspect van de uitvinding verschaft dus een werkwijze voor de bereiding van een polypeptide waarvoor gecodeerd wordt door een bepaald gen, welke werkwijze bestaat uit het kweken van een gastheercel die getransformeerd of getransfecteerd is met een expressievector die het 25 gen omvat, onder omstandigheden waarbij het genoemde polypeptide tot expressie gebracht wordt, en eventueel het winnen van het tot expressie gebrachte polypeptide. De gastheercel kan van de klasse van Actinomycetes, of een Gram-positieve bacterie zoals Propionibacterium of E.coli zijn.

30 Promotoren, translatie-initiatoren, translatieterminatoren, elongatiefactorgenen, ribosomaal RNA, antibiotische resistentiegenen, synthetische promotoren(b.v. geconstrueerd op consensussequenties)tot andere expressie-regulatiesignalen die in het polynucleotide of de vector aanwezig zijn, kunnen die zijn, welke verenigbaar zijn met 35 expressie in de gastheercel. Tot promotoren behoren onder andere de promotoren van de endogene genen van de gastheercel.

1012434 14

De kweekomstandigheden kunnen aërobe of anaërobe omstandigheden zijn, afhankelijk van de gastheer. Voor een fermentatieproces zou de gastheercel onder anaërobe, en vervolgens mogelijk aërobe omstandigheden geplaatst worden. De geproduceerde verbinding, zoals een 5 tot expressie gebracht polypeptide, kan vervolgens gewonnen worden, b.v. uit de gastheercel of het fermentatiemedium. Het tot expressie gebrachte polypeptide kan uit de gastheercel uitgescheiden worden. Het is ook mogelijk dat het polypeptide niet uit de gastheercel uitgescheiden wordt. In een dergelijk geval kan het polypeptide aan het 10 oppervlak van de gastheercel tot expressie gebracht worden. Dit kan bijvoorbeeld wenselijk zijn als het polynucleotide een antigeen bevat waartegen een immuunrespons gewenst is in een mens of dier.

Een homoloog gen dat in de vector van de uitvinding aanwezig kan zijn, kan cobA zijn. Een gastheercel die deze vector omvat, kan 15 daardoor in staat zijn een verbinding zoals vitamine B12 uit een substraat te produceren of de verbinding kan het product van een enzym zijn. De uitvinding verschaft in het bijzonder een werkwijze voor de bereiding van vitamine B12 welke bestaat uit het kweken of fermenteren van een dergelijke gastheercel onder omstandigheden waarbij het 20 UP (III)MT-gen tot expressie gebracht wordt. Het tot expressie gebrachte enzym kan met een geschikt substraat in contact gebracht worden onder omstandigheden waarbij het substraat in vitamine B12 omgezet wordt. Dit kan resulteren in een verhoogde productie van vitamine Bl2. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1012434

Therapeutics 2

Zoals hierboven beschreven kan het polynucleotide van de uitvinding 3 een heteroloog gen omvatten dat een therapeutisch gen is. Tot de 4 | uitvinding behoort derhalve ook een gastheercel die een vector van de 5 I uitvinding omvat die een therapeutisch gen voor toepassing bij een 6 behandelingswijze van een mens of dier door therapie omvat. Een derge 7 lijke gastheercel kan Propionibacterium zijn. De gastheercel kan levend 8 of dood zijn.

9

De gastheercel kan voor klinische toediening geformuleerd worden 10 door ze met een farmaceutisch aanvaardbare drager of verdunningsmiddel 11 te mengen. Zij kunnen bijvoorbeeld geformuleerd worden voor plaatselijke, parenterale, intraveneuze, intramusculaire, subcutane, - orale of transdermale toediening. De gastheercel kan gemengd worden met 15 iedere drager die farmaceutisch aanvaardbaar en geschikt voor de gewenste toedieningsroute is. De farmaceutisch aanvaardbare drager of het verdunningsmiddel voor injectie kan bijvoorbeeld een steriele of isotone oplossing zijn, zoals Water voor injectie of fysiologische 5 zoutoplossing.

De dosis van de gastheercellen kan aan de hand van verschillende parameters ingesteld worden, in het bijzonder aan de hand van het type gastheercellen dat gebruikt wordt, leeftijd, gewicht en conditie van de te behandelen patiënt; de gebruikte wijze van toediening; de te 10 behandelen aandoening,· en het vereiste klinische regime. Als een leidraad bedraagt het aantal toegediende gastheercellen, bijvoorbeeld door orale toediening, 101 tot 1011 gastheercellen per dosis voor een volwassene van 70 kg.

De beschreven toedieningsroutes en doseringen zijn slechts bedoeld 15 als een leidraad aangezien een vakman gemakkelijk de optimale toedieningsroute en dosering voor een bepaalde patiënt en aandoening zal kunnen bepalen.

Polypeptiden 20 Een zesde aspect van de uitvinding verschaft een polypeptide van de uitvinding welke één van de aminozuursequenties omvat die in SEQ. ID.

NR. 2 of 3 beschreven worden of een in hoofdzaak homologe sequentie, of van een fragment van één van deze beide sequenties. Het polypeptide kan er een zijn waarvoor gecodeerd wordt door een polynucleotide van het 25 eerste aspect. In het algemeen hebben de natuurlijk voorkomende aminozuursequenties die in SEQ. ID. NR. 2 of 3 weergegeven worden de voorkeur. De polypeptiden van de uitvinding omvatten echter homologen van de natuurlijke sequenties, en fragmenten van de natuurlijke sequenties en hun homologen, die de activiteit van de natuurlijk 30 voorkomende polypeptiden hebben. Eén zo'n activiteit kan zijn het bewerkstelligen van de replicatie van het polynucleotide van de uitvinding. In het bijzonder kan een polypeptide van de uitvinding bestaan uit: (a) het eiwit van SEQ. ID. NR. 2 of 3; of 35 (b) een homoloog daarvan uit Actinomycetes, zoals Propionibac- terium freudenreichii of andere Propionibacterium-stammen; of 1012434 16 (c) een eiwit dat ten minste voor 70% homoloog aan (a) of (b) is.

Een homoloog kan van nature in een Propionibacterium voorkomen en kan op in hoofdzaak gelijke wijze functioneren als een polypeptide van 5 SEQ. ID. NR. 2 of 3. Een dergelijk homoloog kan in Actinomycetes of Gram-positieve bacteriën voorkomen.

Een eiwit dat ten minste voor 70% homoloog is aan de eiwitten van SEQ. ID. NR. 2 of 3 of een homoloog daarvan zal bij voorkeur ten minste voor 80 of 90% en met meer voorkeur ten minste 95%, 97% of 99% homoloog 10 daaraan zijn over een regio van ten minste 20, bij voorkeur ten minste 30, bijvoorbeeld ten minste 40, 60 of 100 of meer opeenvolgende aminozuren. Werkwijzen voor het meten van de eiwithomologie zijn - algemeen bekend volgens de stand van de techniek en het zal voor de vakman duidelijk zijn dat homologie in de onderhavige context berekend ; 15 wordt op basis van de aminozuuridentiteit (soms "harde homologie" : genoemd).

; De sequenties van de eiwitten van SEQ. ID. NR. 2 en 3 en van homologen kunnen dus gemodificeerd worden om andere polypeptiden van de uitvinding te verschaffen.

20 Er kunnen aminozuursubstituties uitgevoerd worden, bijvoorbeeld van i 1, 2 of 3 tot 10, 20 of 30 substituties. Het gemodificeerde polypeptide f behoudt in het algemeen zijn natuurlijke activiteit. Er kunnen conservatieve substituties uitgevoerd worden, bijvoorbeeld overeenkomstig de volgende Tabel. Aminozuren in hetzelfde blok in de tweede kolom 25 en bij voorkeur op dezelfde regel in de derde kolom kunnen door elkaar vervangen worden.

1012434 17

[ALIFATISCH niet-polair GAP

I L V

Polair - ongeladen C S T M

IN Q

Polair - geladen D E

K R

AROMATISCH H F W Y

Polypeptiden van de uitvinding omvatten ook fragmenten van de hiervoor genoemde polypeptiden met volledige lengte en varianten 5 daarvan, waaronder fragmenten van de sequenties die in SEQ. ID. NR. 2 of 3 beschreven worden. Dergelijke fragmenten kunnen de natuurlijke activiteit van de polypeptiden met de volledige lengte behouden.

Geschikte fragmenten zullen ten minste een grootte hebben van ongeveer 5, b.v. 10, 12, 15 of 20 aminozuren. Polypeptidefragmenten van 10 SEQ. ID. NR. 2 en 3 en homologen daarvan kunnen één of meer (b.v. 2, 3, 5 of 10) substituties, deleties of inserties bevatten,· waaronder geconserveerde substituties.

Polypeptiden van de uitvinding kunnen een in hoofdzaak geïsoleerde vorm hebben. Een polypeptide van de uitvinding kan ook een in hoofdzaak 15 gezuiverde vorm hebben, in welk geval het gewoonlijk het polypeptide in een preparaat zal bevatten, waarbij meer dan 90%, b.v. 95%, 98% of 99% van het polypeptide in het preparaat een polypeptide van de uitvinding is.

Een polypeptide van de uitvinding kan gelabeld zijn met een 20 informatie verschaffend label. Het informatie verschaffende label kan ieder geschikt label zijn dat het mogelijk maakt om het polypeptide te detecteren. Geschikte labels zijn onder andere radioactieve isotopen, b.v. 1J5I, 3SS, enzymen, antilichamen, polynucleotiden en linkers zoals biotine.

1012434 18

Industriële toepassingen

Zoals uit de bespreking duidelijk zal zijn, kunnen de gastheercellen van het derde aspect gebruikt worden om niet alleen de recombinante eiwitten te produceren, maar ook andere van belang zijnde 5 verbindingen, waaronder niet-eiwitten zoals organische chemicaliën, in het bijzonder vitaminen. Een zevende aspect van de onderhavige uitvinding heeft daarom betrekking op een werkwijze voor de bereiding van een verbinding, welke werkwijze bestaat uit het kweken of fermenteren van gastheercellen van het derde aspect onder omstan-10 digheden waardoor de gewenste verbinding geproduceerd wordt. Hoewel deze verbinding een polypeptide kan zijn, bijvoorbeeld een polypeptide van het zesde aspect, kan het ook één van de verbindingen zijn die in de voorgaande bespreking betreffende tot expressie te brengen genen genoemd wordt. Het is duidelijk dat organische verbindingen niet door 15 een gen tot expressie gebracht worden, maar zij kunnen door een enzym geproduceerd worden, of het polypeptide of enzym kan de gastheercel helpen bij de productie van de gewenste verbinding. Deze verbindingen kunnen in de cel geproduceerd worden, en later geïsoleerd worden, bijvoorbeeld na lysis van de gastheercel, of zij kunnen via de wand van 20 de gastheercel terechtkomen in een omringend medium, dat een fermentatiemedium kan zijn, bijvoorbeeld een waterige oplossing. Op deze wijze kunnen de gastheercellen gekweekt worden in een waterig medium dat cellen en voedingsmiddelen voor de cellen omvat, bijvoorbeeld assimileerbare bronnen van koolstof en/of stikstof.

1 25 De aldus geproduceerde polypeptiden kunnen therapeutische j toepassingen hebben. Zij kunnen geneesmiddelen zijn of andere farmacologisch actieve verbindingen, of zij kunnen antigeen of immunogeen zijn, in welk geval zij in vaccins toegepast kunnen worden.

De uitvinding omvat verder verbindingen die door deze werkwijze 30 geproduceerd worden, of het nu wel of niet een recombinant polypeptide is. Verbindingen waar in het bijzonder aan gedacht wordt, zijn vitaminen, zoals vitamine B12 (cobalamine).

In sommige gevallen hoeft de verbinding niet uit het fermentatiemedium of uit de gastheercellen geïsoleerd te worden. De 35 gastheercellen kunnen zelf in bepaalde toepassingen gebruikt worden, bijvoorbeeld in, of bij de bereiding van, voedingsmiddelen zoals worsten of bij de kaasbereiding, of de gastheercellen kunnen 1012434 19 bijvoorbeeld in een diervoeder opgenomen worden zoals wanneer de gastheercellen een door het dier in kwestie tot zich te nemen verbinding bevatten. De uitvinding omvat daarom ook de toepassing van deze verbindingen of de gastheercellen bij de productie van 5 voedingsmiddelen zoals kazen en worsten. Bij de uitvinding wordt ook gedacht aan voedingsmiddelen of diervoeder met gastheercellen of een verbinding geproduceerd door de uitvinding.

In een uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding die in het bijzonder de voorkeur heeft, kunnen de gastheercellen gebruikt worden 10 bij een kaasbereidingsproces, en dus omvat de uitvinding verder een werkwijze voor het bereiden van kaas waarbij de gebruikte micro-organismen gastheercellen van de uitvinding zijn. De gastheercellen kunnen in plaats van of naast andere bacteriën, zoals melkzuurbacteriën, gebruikt worden. Propionzuurbacteriën worden 15 momenteel gebruikt bij kaasbereidingsprocessen, bijvoorbeeld bij mesofiele cultures (Maasdam-type kaas) evenals thermofiele cultures (Emmentaler). Zowel mesofiliele als thermofiliele organismen kunnen verantwoordelijk zijn voor de verzuring van de melk of kaas. Op deze wijze kunnen de gastheercellen van de uitvinding niet alleen gebruikt 20 worden voor kaas, maar ook voor de productie van andere gefermenteerde zuivelproducten (b.v. yoghurt). Propionzuurbacteriën worden bij de kaasbereiding gebruikt vanwege hun vermogen lactaat en koolhydraten in propionzuur, azijnzuur en koolstofdioxide om te zetten. De gastheercellen van de uitvinding kunnen, in het bijzonder als ze 25 propionibacteriên zijn, gebruikt worden omdat ze minder gevoelig voor nitraten en zout kunnen zijn, waardoor het mogelijk kan zijn bactofu-gatie van de melk (gewoonlijk gebruikt om de gehaltes Clostridia te reduceren) te verminderen of achterwege te laten.

De fermentatie van de gastheercellen kan uit één of twee fasen of 30 stadia bestaan. Deze kunnen bijvoorbeeld een groei- en/of productiefase, of een anaërobe en/of aërobe fase zijn. Bij voorkeur zal er een groei- en/of anaërobe fase zijn, en geschikt ook (b.v. daarna) een productie- en/of aërobe fase.

Zowel de koolstof- als/of stikstofbronnen kunnen complexe bronnen 35 of afzonderlijke verbindingen zijn. Voor koolstof wordt de voorkeur gegeven aan glucose. Geschikte bronnen voor stikstof zijn onder andere gistextract of ammoniak of ammoniumionen.

1012434 20

Kenmerken en eigenschappen van één aspect van de uitvinding die de voorkeur hebben, zijn ook mutatis mutandis geschikt voor een ander aspect.

5 Figuren

De uitvinding wordt toegelicht aan de hand van de begeleidende tekeningen waarbij:

Figuur 1 een restrictiekaart is van een vector van de uitvinding, p545 verkregen uit P. freudenreichii IMG 16545 (CBS 101022); en 10 Figuur 2a en 2b elk twee kaarten van twee vectoren bevatten, waarbij alle vier vectoren tot de uitvinding behoren.

De uitvinding zal nu, als voorbeeld, beschreven worden onder verwijzing naar de volgende Voorbeelden, die niet als beperkend geïnterpreteerd dienen te worden.

15 i 1012434 21 VOORBEELD 1

Screening van Propionibacterium-stammen

Een collectie van 75 niet-pathogene stammen van Propionibacterium werd gescreend op de aanwezigheid van inheemse plasmiden. De 5 meerderheid van de stammen werd verkregen uit de BCCM/LMG- kweekcollectie (Gent, België), hoewel sommige stammen verkregen werden van ATCC (Rockville, Md, USA) of van DSM (Braunschweig, Duitsland). Het screenen werd uitgevoerd met behulp van een kleinschalige plasmide-isolatieprocedure. Eerst werden bacteriën 48 uur anaëroob gekweekt in 10 MRS-medium6 bij 30°C.

Vervolgens werden plasmiden uit de bacteriën gezuiverd met behulp van een plasmide-DNA-isolatieprocedure die oorspronkelijk voor E. coli4 ontwikkeld was, met enkele modificaties: cellen uit een 5 ml kweek werden in een 25%-ige saccharose, 50 mM Tris-HCl, pH 8, oplossing/ 15 gewassen, gehersuspendeerd in 250 μΐ TENS (25% saccharose + 50 mM NaCl + 50 mM Tris-HCl + 5 mM EDTA, pH 8) , met 10 mg lysozym/ml (Boehringer Mannheim) en 20-30 minuten bij 37°C geincubeerd. De bacteriecellen werden vervolgens gelyseerd in 500 μΐ 0,2 N NaOH/i% SDS (2-5 minuten incubatie op ijs). Na toevoeging van 400 μΐ 3 M NaAc, pH 4,8 (5 minuten 20 op ijs) en aansluitende extractie met fenol/chloroform werd het DNA door toevoeging van isopropanol neergeslagen.

Het DNA werd door elektroforese op 1% agarosegels geanalyseerd en door ethidiumbromide zichtbaar gemaakt. Terwijl de meeste stammen negatief waren, d.w.z. bij deze analyse niet de aanwezigheid van 25 inheemse plasmiden lieten zien, bevatte de meerderheid van de stammen die positief bleek te zijn grote (> 20 kb) plasmiden. Kleinere plasmiden werden in 6 stammen waargenomen. Hiervan bevatten P.jensenii LMG16453, P. acidipropionici ATCC4875, P.acidi-propionici LMG16447 en een niet gespecificeerde Propioni-bacterium-stam (LMG16550) een 30 plasmide met een grootte van 6-10 kb. Twee stammen (P. freudenreichii LMG16545 en P. freudenreichii LMG16546) lieten een identiek plasmapro-fiel van 2 plasmiden zien. Een plasmide was groot (grootte niet bepaald) en de ander was kleiner, in grotere hoeveelheden aanwezig en had een grootte van 3,6 kb. Deze plasmiden van 3,6 kb uit LMG16545 en 35 LMG16456 werden uitgekozen voor verdere analyse.

1012434 22 VOORBEELD 2

Analyse van een._inhaems plasmide uit de stammen LMG16545 en LMG16546 De plasmiden van 3,6 kb werden uit beide stammen geïsoleerd en verder gezuiverd door CsCl-ethidiumbromide dichtheidsgradiënt-5 ultracentrifugering11. Er werden beperkte restrictiekaarten van beide preparaten gemaakt en deze bleken identiek te zijn11. De restrictiekaart van het plasmide van 3,6 kb wordt in Fig. l weergegeven. Restrictie-enzymen en T4-ligase werden van New England Biolabs of GIBCO BRL verkregen.

10 Het plasmide van 3,6 kb uit stam LMG16545 (waarnaar vanaf hier verwezen wordt als p545) werd radioactief gelabeld en gebruikt in Southem-blot hybridisatie-experimenten. De hybridisatie-omstandigheden waren 0,2 x SSC, 65°C. Het reageerde even goed met zowel LMG16545- als LMG16546-plasmide-DNA-extracten, wat de sterke verwantschap van deze 15 stammen ondersteunt, terwijl een plasmide-DNA-extract uit P. aci- dipropionici ATCC4875, dat een plasmide van 6,6 kb. aangeduid als pTYl of pRGOl8 herbergt, niet reageerde.

De DNA-sequentie van plasmide 545 werd bepaald met met fluorescente kleurstof gelabelde dideoxyribonucleotiden in een Applied Biosystems 20 373A automatische sequencer, en is als SEQ. ID. NR. 1 in de sequentie- lijst opgenomen. Sequentie-analyse werd uitgevoerd aan plasmide-DNA dat lineair gemaakt was met EcoRI en dat ingebracht was in met EcoRI gedigesteerd pBluescript SKII+DNA (Stratagene, La Jolla, Ca., VS).

I Computer-ondersteunde analyse van de aldus verkregen sequentie met \ 25 behulp van BLAST search1 liet homologieën zien met eiwitten die

J

betrokken zijn bij replicatie van plasmiden uit verscheidene GC-rijke organismen (door pAL 5000 gecodeerd repA en repB uit Mycobacterium fortui Cum8,14, b.v., toont 28-30% identiteit en 34-38% overeenkomst met de respectieve vermoedelijke replicatie-eiwitten uit plasmide p545; 30 pXZ10142 uit Corynehacterium glutarnicum (PIR Accession Number S32701] is een ander voorbeeld van plasmiden die coderen voor replicatie-eiwitten die homoloog zijn aan de p545 vermoedelijke replicatie-eiwitten) . De gedetailleerde resultaten van de databasevergelijkingen met homologe sequenties worden gegeven in de Voorbeelden 7 en 8.

35 1012434 23 VOORBEELD 1

Constructie van E.coli/Propionibacterium shuttle vectoren E.coli-plasmide pBR322 werd gedigesteerd met EcoRI en Aval en het aldus gegenereerde kleinere fragment (1,4 kb groot en met het gen dat 5 tetracyclineresistentie geeft) werd vervangen door een synthetisch duplex-DNA. Het synthetische duplex-DNA werd zodanig geconstrueerd dat het de EcoRI- en Aval-uiteinden koppelt en een aantal unieke restrictie-enzymherkenningsplaatsen levert: 10 5'- AATTCAAGCTTGTCGACGTTAACCTGCAGGCATGCGGATCCGGTACCGATATCAGATCT - 3' (SEQ. ID. NR. 4) 3 ’ - GTTCGAACAGCTGCAATTGGACGTCCGTACGCCTAGGCCATGGCTATAGTCTAGAAGCC - 5' (SEQ.

15 ID. NR. 5)

De volgende restrictie-enzymherkenningsplaatsen werden op deze wijze geleverd: EcoRI (hersteld), HindlII, Sail, HpaI, PstI, Sphl,

BarrtHI, Acc65I, EcoRV, EglII (Aval is niet hersteld).

20 Dit synthetische DNA werd aan het grote fragment geligeerd en het ligatiemengsel terug overgebracht naar E.coli (onder toepassing van T4-ligase). Er werd een plasmide met de verwachte samenstelling verkregen (pBR322Al). De meervoudige kloneringsplaats kan gebruikt worden om een selecteerbare merker evenals plasmide p545-DNA in te brengen.

2 5 Als voorbeeld werd de constructie van een E.coli/Propionibacterium shuttle plasmide dat resistentie tegen erythromycine geeft, uitgevoerd, zoals nu beschreven zal worden.

Een Acc651-fragment van 1,7 kb uit het Saccharopolyspora erythraea NRRL2338 erythromycine biosynthesecluster en met het erythromycine-30 resistentie gevende gen 15,5 werd ingebracht in met Acc65I lineair gemaakt pBR322Al. Vervolgens werd het nieuw afgeleide construct, pBRES genaamd, lineair gemaakt met EcoRV en geligeerd aan p545-DNA dat gedigesteerd was met BsaBI. E.coli-transformanten bleken een vector te herbergen met het correcte insert, in beide oriëntaties. De 35 resulterende plasmidevectoren werden pBRESP36Bl en pBRESP36B2 genoemd (Fig. 2a en 2b).

t U t o · .· 24

Er werden ook plasmidevectorconstructen verkregen met p545-DNA dat lineair gemaakt was in een andere restrictieplaats die zich buiten de vermoedelijke replicatieregio bevindt, namelijk AlwNI. Voor deze constructie diende de pBRES-vector voorzien te worden van een geschikte 5 kloneringsplaats. Er werd een adaptor geconstrueerd die bestond uit twee complementaire oligonucleotiden met de volgende samenstelling (SEQ. ID. NR. 6 en 7): 5' GTACCGGCCGCTGCGGCCAAGCTT 3' 10 5’ GATCAAGCTTGGCCGCAGCGGCCG 3'.

Annealing van deze oligo's creëerde een dubbelstrengs DNA-fragment met respectievelijk Acc651 en BglII cohesieve uiteinden, dat bovendien een inwendige Sfil-restrictieplaats bevat, dat uiteinden oplevert die 15 compatibel zijn met het met AlwNI gedigesteerde p545-plasmide. Deze adaptor werd in pBRES tussen de BglII- en de proximale Acc65I-plaats gekloneerd. De aldus verkregen pBRES-Sfi-vector werd vervolgens door Sfil gedigesteerd en aan met AlwNI gedigesteerd p545 geligeerd. Transformatie van E.coli leverde transformanten op met de correcte 20 vector, zoals bevestigd door restrictie-enzymanalyse. De verkregen vector werd pBRESP36A {Fig. 2) genoemd. 1 131:' —; VOORBEELD 4 : Transformatie van Propionïbacterium met E.coli/Propionibacterium shuttle vectoren

De transformatie van Propionibacterium freudenreichii-stam ATCC6207 met pBRESP36Bl zal beschreven worden.

3 0 De bacteriële cellen werden bij 30°C gekweekt in SLB

(natriumlactaat-kweekvloeistof17) tot een stationaire groeifase en vervolgens 1 : 50 verdund in verse SLB. Na ongeveer 20 uur incubatie bij 30°C werden cellen (nu in de exponentiële groeifase) geoogst en uitgebreid gewassen in koude 0,5 M saccharose. Vervolgens werden cellen 35 één keer gewassen in de elektroporatiebuffer, bestaande uit 0,5 M saccharose, gebufferd met 1 mM kaliumacetaat, pH 5,5, gewassen en tenslotte gehersuspendeerd in deze elektroporatiebuffer in ongeveer 25 1/100 van het originele kweekvolume. De cellen werden gedurende de gehele procedure op ijs gehouden.

Voor de elektroporatie (apparaat van BIORAD) werd 80-100 μΐ celsuspensie in een gekoelde elektroporatiecuvette van 1 of 2 mm 5 gemengd met + 1 μg DNA (of kleinere hoeveelheden), en werd er een elektrische puls afgegeven. De optimale pulsomstandigheden bleken 25 kV/cm bij 200 Ω weerstand en 25 μΡ capaciteit te zijn. Lagere en hogere voltages (ook bij 100 Ω) leveren echter ook transformanten op.

Direct na de puls werd 900 μΐ koude SLB met 0,5 M saccharose aan de 10 gepulseerde celsuspensie toegevoegd en deze worden vervolgens gedurende 2,5 tot 3 uur bij 30°C geïncubeerd vóór het uitplaten van geschikte verdunningen op SLB/agarplaten die 0,5 M saccharose en 10 μg erythromycine/ml bevatten. Na een incubatieperiode van 5 tot 7 dagen bij 30°C onder anaërobe omstandigheden werden transformanten gede-15 tecteerd.

DNA geïsoleerd uit E. coli DH5a (Promega) levérde een transformatie-efficiêntie van 20-30 transformanten per pg DNA op. Een 10-100 maal zo hoge efficiëntie wordt verkregen wanneer DNA uit E. coli JM110 (dam', dcm'stam) wordt geïsoleerd. E. coli-transformatie werd 20 uitgevoerd overeenkomstig BIORAD-instructies.

Transformanten bevatten de authentieke vectoren, die niet te onderscheiden zijn van het oorspronkelijke plasmide-DNA dat gebruikt werd voor transformatie van ATCC6207. Dit werd aangetoond door restrictie-enzymanalyse van plasmide-DNA dat uit de transformanten 25 geïsoleerd was door de eerder vermelde kleinschalige plasmide-DNA-isolatieprocedure.

Vectoren waren uitsluitend aanwezig als autonoom replicerende plasmiden. Southem-blot hybridisatie13 met totaal DNA-isolaten liet zien dat chromosomaal DNA niet hybridiseerde met het vector-DNA dat als 30 probe gebruikt werd, wat aangeeft dat er geen chromosomale integratie van plasmide-DNA plaatsvond.

Transformatie was ook succesvol met de vectoren pBRESP36B2 en pBRESP36A, wat aangeeft dat de werkzaamheid van de vector onafhankelijk was van de oriëntatie van p545 of de gebruikte kloneringsplaats. Ook in 35 dit geval werd de authenticiteit van de vectoren bevestigd.

1012434 26

Bovendien resulteerde transformatie van P.freudenreichii-stam ATCC6207 met DNA geïsoleerd uit een Propionijbacterium-transformant in een 105-106-voudig toegenomen transformatie-efficiëntie in vergelijking met die verkregen met DNA geïsoleerd uit E.coli DH5a.

5 Transformatie van een andere P.freudenreichii-stam, LMG16545 (dezelfde stam waaruit het p545-plasmide verkregen werd) resulteerde in een transformatie-efficiëntie vergelijkbaar met die van de ATCC-stam.

De resultaten van de transformatie en het effect op de vitamine B12-productie wordt in de volgende Tabel weergegeven.

10 Acht van de 10 transformanten leverden een tot 50% hoger vitamine B12-gehalte op dan de controlestam.

Stam ID getransformeerd vitamine B12 plasmide (mg/g droge stof) COB1 pBRES36COB . 0,57 COB2 pBRES36COB 0,67 C0B3 pBRES36COB 0,83 C0B4 pBRES36COB 0,68 COB5 pBRES36COB 0,69 C0B6 pBRES36COB 0,61 C0B7 pBRES36COB 0,53 C0B8 pBRES36COB 0,64 COB9 pBRES36COB 0,50 j COB10 pBRES36COB 0,74 recATCC6207 pBRESP36B2 0,54 15 1012434 27 VOORBEELD 5

Constructie van plasmidevector die het cobA-gen bevat 5 De constructie en toepassing van een plasmidevector om het niveau van synthese van vitamine B12 (cobalamine) in P.freudenreichii-stam ATCC6207 te verhogen, zal beschreven worden.

Het promotorgebied van het gen dat erythromycine-resistentie in Saccharopolyspora erythraea2·1 geeft, werd gegenereerd door PCR met 10 behulp van de volgende primers (SEQ. ID. NR. 8 en 9): forward primer: (5 ' - 3 ')

AAACTGCAGCTGCTGGCTTGCGCCCGATGCTAGTC

15 reverse primer: (5'-3')

AAACTGCAGCAGCTGGGCAGGCCGCTGGACGGCCTGCCCTCGAGCTCGT . CTAGAATGTGCTGCCGATCCTGGTTGC

Het aldus gegeneerde PCR-fragment bevatte een A2wNl-plaats aan het 20 5'-uiteinde gevolgd door het authentieke promotorgebied en de eerste 19 aminozuren van het coderende gebied van het erythromycine-resistentiegen om een juiste transcriptie- en translatie-initiatie te garanderen. Aan het 3'-uiteinde werd voorzien in Xbal- en Xhol-plaatsen (voor insertie van het cobA-gen in een later stadium), een 25 terminatorsequentie zoals stroomafwaarts van het erythromycine-resistentiegen aanwezig, en een AlwNI-plaats.

Het PCR-product werd gedigesteerd door AlwNI en geligeerd aan gedeeltelijk met AlwNI gedigesteerd pBRESP36B2. Van de twee AlwNI-plaatsen die in pBRESP36B2 aanwezig zijn, zal alleen die in het p545 30 specifieke deel van de vector plaats bieden aan het fragment. Er werden E. coli-transformanten verkregen die het verwachte construct, pBRES36pEt genaamd, herbergen. Deze vector werd gebruikt voor verdere constructies zoals hieronder beschreven.

De coderende sequentie van cobA, het gen dat codeert voor 35 uroporfyrinogeen (III) methyltransferase, werd door PCR gegenereerd uit Propionibacterium freudenreichii-stam ATCC6207, met behulp van de volgende primers (SEQ. ID. NR. 10 en 11): 1 0 12 4 o 4 28 forward: (5'-3') CTAGTCTAGACACCGATGAGGAAACCCGATGA reverse: (5'-3')

5 CCCAAGCTTCTCGAGTCAGTGGTCGCTGGGCGCGCG

Het aldus geamplificeerde coJbA-gen draagt een Xbal-plaats het N-terminale coderende gebied en HindIII-en Xhol-plaatsen bij het C-terminale coderende gebied.

10 De functionaliteit van dit cobA-gen werd bevestigd door het PCR- product als een Xbal-HindlII-fragment in pUC18 te kloneren en aansluitende transformatie van E.coli-stam JM109. Transformanten met een functioneel cobA-gen laten een helderrode fluorescentie zien bij belichting met UV-licht. Uit een dergelijke transformant geïsoleerd 15 plasmide-DNA werd gedigesteerd met Xbal en Xhol, geligeerd aan overeenkomstig gedigesteerd pBRESP36B2-DNA en gebruikt voor transformatie van E.coli. DNA uit verscheidene transformanten werd geanalyseerd door restrictie-enzymdigestering en gelelektroforese. Transformanten bleken het juiste insert in de expressievector te 20 dragen. Deze nieuwe vector werd pBRES36COB genoemd. Deze vector werd vervolgens overgebracht naar P.freudenreichii ATCC6207 door het eerder beschreven protocol te volgen. Tien van de verkregen transformanten : "n werden geanalyseerd en bleken de pBRES36COB-vector te herbergen, die j opnieuw niet te onderscheiden was van de oorspronkelijke voor ;j 25 transformatie gebruikte vector, zoals werd aangetoond door analyse van de restrictie-enzymdigesteringen. In deze tien transformanten werd het niveau van de synthese van vitamine Bl2 als volgt bepaald.

Bevroren kweken van Propionibacteriurn-transformanten 1 tot en met 10, alsook een controlestam met alleen het vectorplasmide pBRESP36B2, 30 werden in 100 ml kolven met 50 ml BHI (Brain Heart Infusion) medium (Difco) geïnoculeerd en gedurende 72 uur bij 28°C zonder schudden geïncubeerd. Uit deze voorkweek werd 4 ml overgebracht naar 200 ml productiemedium, bestaande uit 15 g Difco gistextract/1, 30 g Na-lac-taat/1, 0,5 g KH2P04/1, 0,01 g MnS04/l en 0,005 g CoCl2/l, in een 500 ml 35 schudkolf en gedurende 56 uur bij 28°C zonder schudden geïncubeerd, gevolgd door 48 uur in een New Brunswick rotatie-schudapparaat bij 200 7" rpm.

1 0 124 34 29

Vitamine B12-titers werden gemeten met behulp van een bekende HPLC-werkwijzes. Negen van de 10 transformanten lieten een ongeveer 25% hogere vitamine B12-productie zien dan de controlestam.

5 VOORBEELD 6

Stabiliteit van de plasmiden

Alle drie de shuttle vectoren pBRESP36A, pBRESP36Bl en pBRESP36B2 werden stabiel gehandhaafd gedurende het kweken van 30 generaties van de respectieve transformanten: er werd geen verlies van erythromycine-10 resistentie waargenomen zoals bepaald door tellingen van de levensvatbaarheid op selectieve (erythromycine bevattende) en niet-selectieve agarplaten. De structurele stabiliteit van het plasmide in de transformantpopulatie na 30 generaties werd bepaald door plasmide-DNA-isolatie en karakterisering door restrictie-enzym-mapping zoals 15 hierboven beschreven: er werden alleen restrictiefragmenten waargenomen die hetzelfde waren als die van het authentieke plasmide.

VOORBEELD 7

Databasesequentiehomologie-analyse voor voorspeld polypeptide waarvoor 20 gecodeerd wordt door het eerste open, leesraam (SECL ID. NR. 2)

MDSFETLFPESWLPRKPLASAEKSGAYRHVTRQRALELPYIEANPLVMQSLVITDRDASDADWAADLAGLP SPSYVSMNRVTTTGHIVYALKNPVCLTDAARRRPINLLARVEQGLCDVLGGDASYGHRITKNPLSTAHATL WG PADALYELRALAHTLDEIHALPEAGNPRRNVTRSTVGRNVTLFDTTRMWAYRAVRHSWGGPVAEWEHTV 25 FEHIHLLNETIIAD

De hierboven beschreven sequentie van 227 aminozuren (0RF1) werd ge-aligned en vergeleken met verscheidene andere eiwitsequenties (doelwit NBRF-PIR, release PIR R52.0 maart 1997, cut-off 45, KTUP: 2). 30 Met een eiwit uit Mycobacterium fortuitum-plasmide pAL 5000 (JS0052) werd een overeenkomst van 37,1% over 194 aminozuren (INIT 167,292) gevonden. Met een eiwit uit Corynebacterium glutamicum (S32701) werd een overeenkomst van 32,0% over 125 aminozuren (INIT 125,116) gevonden. Een overeenkomst van 29,9% over 221 aminozuren (INIT 35 86,259) werd met het ColE2-eiwit uit E. coli (S04455) gevonden. Precies dezelfde overeenkomst over hetzelfde aantal aminozuren werd gevonden voor het ColE3-eiwit, ook uit E. coli (S04456).

1012434 30 VOORBEELD 8

Da t aba s e s equent iehomologie-analyse voor jyoQrspeld^DQlypeptide waarvoor gecodeerd wordt door het tweede-leesraam. (SECL ID. NR. 3 5 !

MTTRERLPRN GYSIAAAAKK LGVSESTVKR WTSEPREEFV ARVAARHARI RELRSEGQSM RAIAAEVGVS VGTVHYALNK NRTDA

Het tweede eiwit (ORF2) werd ook ge-aligned en vergeleken met een 10 ander eiwit, met behulp van dezelfde parameters en software als beschreven voor Voorbeeld 7. Deze sequentie heeft echter slechts een lengte van 85 aminozuren.

De ORF2-sequentie werd vergeleken met een eiwit uit Mycobacterium fortuitum (S32702) en er werd een overeenkomst van 53,3% over 75 15 aminozuren gevonden (INIT 207, 207) .

VOORBEELD 9

Functionele analyse van plasmide p545

Teneinde het vectorsysteem verder te verbeteren, werden de 20 plasmidefuncties die noodzakelijk zijn voor replicatie en stabiliteit nauwkeuriger afgebakend via deletie van grote regio1s van het originele I plasmide p545. Het resultaat, een kleinere kloneringsvector, zal het j mogelijk maken het op p545 gebaseerde vectorsysteem te gebruiken voor het kloneren van grotere DNA-fragmenten.

25 Hiertoe werd vector pBRESP36A (Figuur 2) met Sstll en Bell gedigesteerd, wat in een fragment van 1,7 kb en een fragment van 6,5 kb resulteerde. Het fragment van 1,7 kb, in feite het AZwNI-BclI-fragment van 1,6 kb van plasmide p545, werd vervangen door een synthetisch duplex-DNA, samengesteld uit SEQ. ID. NR. 12 en SEQ. ID. NR. 13 met 30 uiteinden die compatibel zijn met Sstll en Bell en met een aantal “ unieke restrictie-enzymherkenningsplaatsen.

SEQ. ID. NR. 12 5' GGAGATCTAGATCGATATCTCGAG 3' SEQ. ID. NR. 13 5' GATCCTCGAGATATCGATCTAGATCTCCGC 3'

De volgende restrictie-enzymherkenningsplaatsen werden op deze wijze geleverd: 1 0 124 3 4 35 31

Sstl (hersteld), BglII, Xbal, Clal, EcóRV, Xhol, (Bell is niet hersteld). Het ligatiemengsel werd naar E.coli overgebracht en er werden transformanten geselecteerd die een vector met de verwachte samenstelling bevatten. De vector werd pBRESAASB genoemd. Aansluitende 5 succesvolle transformatie van P.freudenreichii-stam ATCC6207 met deze vector gaf aan dat het gebied van 1,6 kb tussen AlwNI en Bell in p545 niet essentieel is voor replicatie van het plasmide.

Er werd een andere deletie uitgevoerd door verwijdering van de 240 bp die corresponderen met de regio tussen Sail en Bell in plasmide 10 p545. Dit werd bewerkstelligd door digestering van pBRESAAS-B met respectievelijk Sail - SstI, en Sstl - Xhol en isolatie van het Sail -Sstl-fragment van 1,3 kb, en het SstI - XhoI-fragment van 6,6 kb. De fragmenten werden geligeerd en het ligatiemengsel werd naar P. freudenreichii ATCC6207 overgebracht, hetgeen talrijke transformanten 15 opleverde. Het nieuw verkregen construct, pBRESAdS-S genaamd, werd geïsoleerd en de structuur ervan werd bevestigd dobr restrictie-enzym-mapping.

Alle essentiële informatie voor replicatie van plasmide p545 bevindt zich dus op een fragment van 1,7 kb dat begrensd wordt door de 20 restrictieplaatsen Sail en AlwNI en dat de voorspelde replicatie- eiwitten bevat waarvoor gecodeerd wordt door ORF1 en ORF2, en 1,8 kb kan verwijderd worden zonder de replicatie of stabiliteit van het plasmide duidelijk te verstoren.

1012434 32 VOORBEELD 10

Expressie van een chlooramfenicolresistentiegen uit Corvnébacterium Een chlooramfenicolresistentiegen (cml) uit CorynebacteriuiriLa is geïdentificeerd als coderend voor een chlooramfenicol-exporteiwit. Dit 5 gen werd ingevoegd in de Propionibacterium - E. coli shuttle vector pBRESP36B2. Deze vector werd respectievelijk met BglII en HindlII en met BglII en Hpal gedigesteerd. De BglII-HindlII- en BglII-Hpal-fragmenten van respectievelijk 2,9 3cb en 5,2 kb werden geïsoleerd.

Het fragment dat het cml-gen bevat, waaronder zijn eigen promotor, 10 werd verkregen door digestering met Pvull en HindlII, en het fragment van 3,3 kb dat het gen bevat, werd geïsoleerd. De twee vector specifieke fragmenten en het cml-fragment werden geligeerd: PvuII- en Hpal-uiteinden zijn stomp, waardoor dus het cml-gen ingebracht wordt alsook het ermE-gen van de oudervector hersteld wordt. Het liga-15 tiemengsel werd naar E.coli overgebracht en er werd een transformant geselecteerd, waarbij de vector het correcte cml-insert bevatte. De vector werd pBRESBCM genoemd.

Transformatie van P.freudenreichii ATCC6207 met deze vector, en selectie op platen met 10 μg erythromycine/ml of 5 μg j 20 chlooramfenicol/ml leverde respectievelijk erythromycine-resistente en chlooramfenicol-resistente kolonies op, wat aangeeft dat behalve het i erythromycineresistentiegen (eerder aangetoond met de Propionibacterium - E.coli shuttle vectoren), ook het chlooramfenicolresistentiegen in Propionibacterium tot expressie gebracht wordt. Transformanten konden 25 in vloeibaar medium met tot 20 μg chlooramfenicol/ml gekweekt worden.

VOORBEELD 11

Expressie van linase- (crehA) gen uit P.acnes

Ter illustratie van het op efficiënte wijze kloneren en tot 30 expressie brengen van een extracellulair eiwit met behulp van het onderhavige vectorsysteem, werd een lipasegen gehA uit P.acnes gebruikt19. Vector pULSOOl, die gehA op een Xhol-fragment herbergt, werd met Xhol gedigesteerd en het fragment van 2,75 kb dat het gen bevat, werd geïsoleerd. Vector pBRESAAS-B (uit Voorbeeld 9) werd lineair 35 gemaakt door Xhol en de uiteinden gedefosforyleerd met behulp van Calf Intestine Phosphatase om zelfligatie te vermijden. De lineair gemaakte vector en het gehA bevattende fragment werden geligeerd en het 1012434 33 ligatiemengsel werd overgebracht naar E.coli. Transformanten werden door restrictie-enzymanalyse geanalyseerd op de aanwezigheid van het correcte recombinant plasmide, pBRESALIP genaamd. Dit plasmide werd vervolgens overgebracht naar P.freudenreichii-stam ATCC6207.

5 Transformanten werden gescreend op de expressie van het lipasegen met behulp van agarplaten met tributyrine als de indicator voor toegenomen lipase-expressie. P.freudenreichii transformanten die pBRESALIP herbergen, vertoonden significant toegenomen ringgroottes bij deze bepalingen in vergelijking met niet-getransformeerde stammen of stammen die 10 getransformeerd waren met de oudervector.

1 0 124 34 34

REFERENTIES

1. Altschul et al., J. Mol. biol. 215: 403-410 (1990) 2. Bibb et al., Gene 38, 215 (1985) 5 3. Bibb et al., Mol. Microbiol. 14(3), 533 (1984) 4. Birnboim en Doly, Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979) 5 Blanche, Anal. Biochera. 189, 24 (1990) 6 DeMan et al.r J. Appl. Bacteriol. 36, 130 (1960) 7. Deveraux et al., Nucleic Acids research, 12: 387-395 (1984) 10 8. Labidi et al., Plasmid 27, 130 (1992) 9. Rehberger en Glatz, Appl. Environ. Microbiol. 59, 83 (1990) 10. Rossi et al., Res. Microbiol. 147, 133 (1996) 11. Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) 15 12. Sattler et al., J. Bact. 177, 1564 (1995) j 13. Southern, J. Mol. Biol. 98, 503 (1975) 14. Stolt en Stoker, Microbiol, 142, 2795 (1996) 15. Thompson et al., Gene 20, 51 (1982) 16. Uchijama en Weisblum, Gene 38, 103 (1985) j 20 17. de Vries et al., J. Gen. Microbiol. 71, 515 (1972) , 18. Tauch et al., Plasmid 40(2): 126 (1998) I 19. Miskin et al., Microbiol 143: 1745 (1997) Ï SAMENVATTING VAN SEQUENTIES 25 1. DNA-sequentie van plasmide LMG 16545 (CBS 101022), 3,6 kb.

2. aminozuur van eiwit van 0RF1 (303 residuen, basen 273-1184).

0 3. aminozuur van eiwit van 0RF2 (85 residuen, basen 1181-1438).

4-13. DNA-primers/oligonucleotiden - 1012434 35

SEOUENTIELIJST

(1) ALGEMENE INFORMATIE: 5 (i) AANVRAGER: (A) NAAM: Gist-brocades N.V.

(B) STRAAT: Wateringseweg 1 (C) PLAATS: Delft (D) LAND: Nederland

10 (E) POSTCODE: 2611 XT

{ii) TITEL VAN DE UITVINDING: Propionibacteriumvector 15 (ίϋ) AANTAL SEQUENTIES: 13 (iv) COMPUTERLEESBARE VORM: (A) MEDIUMTYPE: Floppydisc (B) COMPUTER: IBM PC Compatible

20 CC) BESTURINGSSYSTEEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versie #1.25 (EPO) (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NR 1:

25 (i) SEQUENTIEKENMERKEN

(A) LENGTE: 3555 baseparen (B) TYPE: nucleïnezuur (C) STRENGVORM: dubbel (D) TOPOLOGIE: circulair 30 (ii) MOLECUULTYPE: DNA genomisch

(iii) HYPOTHETISCH: NEE

35 (iv) ANTI-SENSE: NEE

(vi) OORSPRONKELIJKE BRON

1012434 36 (A) ORGANISME: Propionibacterium freudenreichii (3) INDIVIDUEEL ÏSOLAAT: C3S101022 LMG 1654Ξ

(ix) KENMERK

5 (A) NAAM/SLEUTEL: CDS

(B) LOCATIE: 273..1184 (D) VERDERE INFORMATIE: /gen= " ORF1"

(ix) KENMERK

10 (A) NAAM/SLEUTEL: CDS

(3) LOCATIE: 1181..1438 (D) VERDERE INFORMATIE: /gen= " ORF2" (xi) SEQUENTIE3ESCHRIJVING: SEQ ID NR 1: ; 15

~ GTCGACCCTG ACAGCCGC-CC- AGCAGTTCAC- GCGAAG.ATCG CACAGCTGCG CGAGGAACTA

SO ; GCCGCAATGC CCGAACACGC CCCAGCCATC CCTTGGAGCA CGTGCCAGCG TCAGGGGAGT - 120

CGGGGGATGT TTGGCAGGGG ATGTGGAAAG AGAGTTCGCT TTGCTCACAT GGCTCAACCG

' 2 0 180

\ GGTAACTAAC TGATATGGGG TCTTCGTCGC CCACTTTGAA CACGCCGAGG AATGGACCAC

I 240 GCTGAACGTC- ACTCGCATGC TTCACTGCAT GT ATC- GAT TCG TTC GAG ACG TTG : 233

Mer Aso Ser Phe Glu Thr Leu 25 , ' 5

; TTC CCT GAG AGC TC-G CTG CCA CGC AAC- CCG CTG GCG TCA GCC GAG AAG

341

Phe Pro Glu Ser Trp Leu Pro Arg Lys Pro Leu Ala Ser Ala Glu Lvs 10 15 20

3 0 TCT GGG GCG TAC CGG CAC GTG ACT CGG CAG AC-G GCG CTG GAG CTG CCT

333

Ser Gly Ala Tyr Arg Kis Val Thr Arg Gin Arg Ala Leu Glu Leu Pro 25 30 35

J TAC ATC GAA GCG AAC CCG TTC- GTC ATG CAC- TCC TTC- GTC ATC ACC C-A.T

' Tyr lie Glu Ala Asn Pro Leu Val Mez Gin Ser Leu Val lie Thr Asp 35 4 0 4 5 50 5 =

^; CGA GAT GCT TCC- GAT GCT GAC TGG GCC GCA GAC CTC GGT GGG CTG CCT

:: 1012^34 37 Ξ A.sp Ala Ser Asp Ala .Asp Trp A.la Ala Asp Leu Ala Giy Leu Pro 6 C 65 70 TCA CCG TCC TAC GTG TCC ATG AAC CGT GTC ACG ACC ACC GGA CAC A7C 533

Ser Pro Ser Tyr Vel Ser Meo Asn Arg Val Thr Thr Thr Gly His lie S 75 80 85

GTC TAT GCC TTG AAG AAC CCT GTG TGT CTG ACC GAT GCC GCG CGG CGA

581

Val Tyr Ala Leu Lys Asn Pro Val Cys Leu Thr Asp A.la Ala Arg Arg 90 95 100 η o CGG CCT ATC AAC CTG CTC GCC CGC GTC GAG CAG GGC CTA TGC GAC GTT 629

Arg Pro lie A.sn Leu Leu A.la Arg Val Glu Gin Gly Leu Cys Asp Val 105 110 115 CTC GGC GGC GAT GCA TCC TAC GGG CAC CGG ATC ACA AAG AAC CCG CTC 677

Leu Gly Gly Asp A.la Ser Tyr Gly His Arg lie Thr Lys A.sn Pro Leu 15 120 " 125 * 130 , 135 AGC ACC GCC CAT GCG ACC CTC TGG GGC CCC GCA GAC GCG CTC TAC GAG 725

Ser Thr Ala His A.la Thr Leu Trp Gly Pro Ala A.sp Ala Leu Tyr Glu 140 145 150

CTG CGC GCC CTC GCA CAC ACC CTC GAC GAG A.TC CAC GCA CTG CCG GAG

on 773 ^ t Arg Ala Leu A.la His Thr Leu .Asp Glu lie His .Ala Leu Pro Glu 135 160 165 GCa GGG AAC CCG CGT CGC AAC GTC ACC CGA TCA ACG GTC GGC CGC AAC 821

A1 a Gly A.sn Pro Arg Arg A.sn Val Thr Arg Ser Thr Val Giy Arg Asn 170 175 18C

25 „„C ACC CTG TTC GAC ACC ACC CGC ATG TGG GCA TAC CGG GCC GTC CGG 2 1012434 2 9

Tnr Leu ?he A.sp Thr Thr Arg Mei Trp A.la Tyr Arg Ala Val Arg 185 190 135 CAC TCC TGG GGC GGC CCG GTC GCC GAA TGG GAG CAC ACC GTA TTC GAG t n 917 3Ü Co- t-d Glv Gly Pro Val Ala Glu Tro Glu His Thr Val Phe Glu *2 00 ^ 205 ’ 210 215

r-Ar· tTC CAC CTA CTG AAC GAG ACG A.TC A.TC GCC GAC GAA TTC GCC ACA

96 5 y; s :u gis Leu Leu Asn Glu Thr ile lie .Ala Asp Glu Phe Ala Thr 220 225 230 35

GGC CCC CTC GGC TTG AAC GAA CTT AAC- CAC TTA TCT CGA TCC ATT TCC

1013 G‘v Pro Leu Gly Leu Asn Glu Leu Lys His Leu Ser Arg Ser lie Ser 235 24Ό 245 38 CGA TGG GTC TGG CGC AAC TTC ACC CCC GAA ACC TTC CGC GCA CGC CAG 1061

Arg Trp Val Trp Arc Asn Phe Thr Pro Glu Thr ?he Arg Ala Arg Gin 250 255 260

AAA GCG ATC AGC CTC CGT GGA GCA TCC AAA GGC GGC AAA GAA GGC GGC

5 1109

Lys Ala Ile Ser Leu Arg Glv Ala Ser Lys Glv Gly Lys Glu Glv Gly 265 270 275 CAC AAA GGC GGC ATT GCC AGT GGC GCA TCA CGG CGC GCC CAT ACC CGT 1157

His Lys Gly Gly lis Ala Ser Gly A.la Ser Arg Arg Ala His Thr Arg 2.0 280 285 290 295

CAA CAG TTC TTG GAG GGT CTC TCA TGACCACACG TGAACGTCTC CCCCGCAACG

1211

Gin Gin ?he Leu Glu Gly Leu Ser 300

S GCTACAGCAT CGCCGCTGCT GCGAAAAAGC TCGGTGTCTC CGAGTCCACC GTCAAGCGGT

15 1271 GGACTTCCGA GCCACGCGAC- GAGTTCG7GG CCCGCGTTGC CGCACGCCAC GCGCGGATTC 1331 GTGAGCTCCG CTCGGAGGGT CAGAGCATGC GTGCGATTGC TGCCGAGGTC GGGGTTTCCG 1391

: 20 TGGGCACCGT GCACTACGCG CTGAACAAGA ATCGAACTGA CGCATGACCG TAACGCCGCA

1451

s , CGATGAGCAT TTTCTTGATC GTGCACCGCT TGGCACTACG TTCGCGTGCG GTTGCACAGT

1511 GCGCGCCACG TTCTTATCCT GCGGCCATTG TGGCTACAGC CAATGGGGGG CATCAGCAAC 25 1571 GGACGTTGAA CCCGGTGGGC AAGTGTTACT CAGGGGGACA TGCCCAGTCT GCGGCGCTCG 1631

J GATTGACGGT ATGGCAGTCG TGCATGCGGC CCCACCGTCA AACTCATTCA GGTATCAGTG

1691

3° AGAACCCTCA TGGCACCCCC TCGTGACACG TTCTCGTTGC GATCAGCTGC TGTGCGTGCG

1751

1 GGCGTGAGCG TTTCTACGCT GCGGCGCAGG AAATCAGAGC TTGAGGCTGC CGGAGCGACG

1811 1 1012434

GTAGACCCGT CCGGTTGGGT GGTGCCACTG CGTGCACTCA AGGTCGTTTT TGGGGTGTCA

35 1871

• GATGAGACCT CGAATGCGCC CGGTCA.TGAC GCTGAGTTAC- TGGCGCAGCT GCGCTCTGAG

1S31 39

AAC3AGT777 7ACGGCGTCA GGTCGAGCAG CAGGCGCGCA CGATCGAACG GCAGGCTGAG

i = s: GCACACGCGG TGGTCTCAGC GCAGCTCACA CGGGTTGGCC AGCT7GAGGC CGGCGACGCA 2051 GCAGCACCGA CACTGGCACC CGTTGAAAGG CCGGC7CCGC GACGGCGGTG GTGGCAGCGT 5 2111 CGGTAGCGGT CAGGATCGCT CTGGCGTGAC GAGTG7G7C7 GGCAGTGCGA ACAGTTGCTC 2171 GACCAGTGGC AGCAGAAGCG AGA7CGCTGC GTGG7GC7GT TCCTCGG7CA G7TCGTCGAG 2231 10 GAC7GGCGGG TCTTGC7GCG 7CCAGCCGAT CGCCTCGGCG GCCAAGG7CA G77CCAAGC7 2251 GTGCCAACGC ACACGCCCCT CGGC7GACAG C7GAGTCTCG AACTGTGCAA CTGGACCGGC 2351 CGGAAGATGC ACG77GCCGA GG7CGTGAG7 GGCCAAGCGC ACGTCAAAGA GTGCTGC7TC 3 2411 G7AGCCGCGC AGAAATGGCA G7GC7CGG7C GAT7CGGA7C GGCCTGCCCA GG7ACA7TCC 2471 GGGCCGC77G ATGAACGCC7 CCGCG7AGAA GCGCACCG77 CTCGGCCCGG CC7CG7GATC 2531 2 0 TG7CAC7GTG CACGC7CCTC 7CGATGGT7C TCGACGCTAC CGGAGACCAC CGACGTTCA7 2591 GCCCAGCGCA GCGACC7GAA AGGACCAAGC CGAG77AGCC G7GC7AACCG 7A7AGC77GC 26 = 1 25 TCCG7CGCCT C7GAGGGCAA CCACCTGCGC AGCAGGTGGG CGGCAGCCCG CGCGCAAGCG 2711 CC7ACCGGG7 T7GGGCACAG CCC.A7AAATC AACGCCTCCG G7G77GAAGC GATCG7GTGT 2771

CACC-A7TGCT ATGCT7GCTA CCCC77CAGG GT7T7CG7AT ACACAAATCA AGTTT777CG

2 S 31 30 TA7ACGC7AA TGCCA7GAGT GAGCA7C7AC TGCACGGCAA GCCCG7CACC AACGAGCAGA 2391 TTCAGGCATG GGCAGACGAG GCCGAGGCCG GATACGACCT GCCCAAACTC CCCAAGCCAC 2951 35 GGC3CGGACG CCCGCCCGTA GGAGACGGTC CGGGCACCGT CGTACCCG7G CG7CTCGACG 3011 CGGCCACCG7 7GCCGCTCTC ACAGAACGAG CAACAGCCGA GGGCATCACG AACCG77CAG 3071 1012434 40 ACGCGATCCG AGCCGCAGTC CACGAGTGGA CACGGGTTGC CTGACCTCCA CGACTCAGCA 3121 CGCAAGCACT ACCAACGAGA CCGGCTCGAC GACACGGCCG TGCTCTACGC GGCCACCCAC 3191

5 G7TCTCAACT CCCGGCCACT CGACGACGAA GACGACCCGC GCCGCTGGCT CATGATCGGA

3251 ACCGACCCAG CAGGCCGCCT ACTCGAACTC GTCGCACTGA TCTACGACGA CGGCTACGAA 3311 CTGATCATCC ACGCAATGAA AGCCCGCACC CAATACCTCG ACGAGCTCTA ACCAAGAAAG 10 3371

GAACCTGATG AGCGACCAGC TAGACAGCGA CCGCAACTAC GACCCGATGA TCTTCGACGT

3431 GATGCGCGAG ACCGCGAACC GCGTCGTCGC CACGTACGTT GCATGGGAAG ATGAAGCCGC 3491

TGATCCCCGC GAGGCTGCGC ACTGGCAGGC CGAGCGATTC CGCACCCGGC ACGAGGTGCG

.3551 _

CC-CC

3555 20 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NR 2:

(i) SEQUENTIEKENMERKEN

(A) LENGTE: 303 aminozuren (3) TYPE: aminozuur 25 (D) TOPOLOGIE: lineair (ii) MOLECUDJLTYPE: eiwit ! (xi) SEQUENTIE3ESCHRIJVING: SEQ ID NR 2: 1 3 0 I Met Asp Ser ?he Glu Thr Leu Phe Pro Glu Ser Trp Leu Pro Arg Lys 1 5 10 15

Pro Leu Ala Ser Ala Glu Lys Ser Gly Ala Tyr Arg His Val Thr Arg 20 25 30 25 -2,“5 ^-ia ^eu du 2ieu Pro Tyr lie Glu Ala Asn Pro Leu val Met 35 40 45 -r Oln Ser Leu Val He Thr Asp Arg A.sp Ala Ser A.sp Ala A.sp Trp A.la 50 55 60 : iüt.,,, 41

Ala As o Lei: Ala Giy Leu Pro Ssr Pro Ssr Tyr Val Ssr Msr Asn Arg 65 ’ 70 75 80

Val Thr Thr Thr Gly His lie Val Tyr Ala Leu Lys Asn Pro Val Cys 35 90 95 ^ Leu Thr Asp Ala Ala Arg Arg Arg Pro He Asn Leu Leu Ala Arg Val 100 105 110

Glu Gin Gly Leu Cys Asp Val Leu Gly Gly Asp Ala Ser Tyr Gly His 115 120 125

Arg lie Thr Lys Asn Pro Leu Ser Thr Ala His Ala Thr Leu Trp Gly 10 130 135 140

Pro Ala Asp Ala Leu Tyr Glu Leu Arg A.la Leu Ala His Thr Leu Asp 145 150 155 .160

Glu He His Ala Leu Pro Glu Ala Gly Asn Pro Arg Arg Asn Val Thr 165 170 175, i 5

Arg Ser Thr Val Gly Arg Asn Val Thr Leu Pne Asp Thr Thr Arg Mec 180 IS 5 . 190

Trp Ala Tyr Arg Ala Val Arg His Ser Trp Gly Gly Pro Val Ala Glu 195 200 205

Trp Glu His Thr Val Phe Glu His He His Leu Leu Asn Glu Thr He 20 210 . 215 220

He Ala Asp Glu Phe Ala Thr Gly Pro Leu Gly Leu Asn Glu Leu Lys 225 230 235 240

His Leu Ser Arg Ser He Ser Arg Trp Val Trp Arg Asn Phe Thr Pro 245 250 255 25

Gru Thr Phe Arg Ala Arg Gin Lys Ala He Ser Leu Arg Gly A.la Ser 260 265 270

Lys Giy Gly Lys Glu Gly Gly His Lys Gly Gly He Ala Ser Gly Ala 275 280 285

Ser Arg Arg Ala His Thr Arg Gin Gin Phe Leu Glu Gly Leu Ser 30 290 295 300 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NR 3:

(i) SEQUENTIEKENMERKEN

35 (A) LENGTE: 85 aminozuren (B) TYPE: aminozuur (D) TOPOLOGIE: lineair 1012434 42 (ii) MOLECÜULTYPE: eiwit (xi) SEQUENTIE3ESCHRIJVING: SEQ ID NR 3: 5

Mee Thr Thr Arc Glu Are Leu Pro Arg Asn Gly Tyr Ser 11= Ala Ala : i 5 10 15

Ala Ala Lys Lys Leu Gly Val Ser Glu Ser Thr Val Lys Arg Trp Thr 20 25 30 10

Ser Glu Pro Arg Glu Glu Phe Val Ala Arg Val Ala Ala Arg Hls Ala 35 40 45

Are He Are Glu Leu Are Ser Glu Gly Gin Ser Met Arg A.ia Ile A.la 50 53 6 0 A.la Glu Val Gly Val Ser Val Gly Thr Val Hls Tyr A.la Leu Asn Lys ~^65 ”0 75 80

Asn Arg Thr A.sp A.ia 85 20 {2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NR 4:

(i) SEQUENTIEKENMERKEN

(A) LENGTE: 59 baseparen , (3) TYPE: nuc le Ine zuur I 25 (C) STRENGVORM: enkel (D) TOPOLOGIE: lineair (ii) MOLECUULTYPE: DNA (synthetisch) 30 (xi) SEQUENTIE3ESCHRIJVING: SEQ ID NR 4:

T AA7TCAAGCT TGTCGA.CGTT AACCTGCAGG CA.TC-CGGA.TC CGGTACCGAT A.TGA.GA.TCT

35 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NR 5:

(i) SEQUENTIEKENMERKEN

1 0 124 34 Δ (Α) LENGTE; Ξ5 baseparer.

(Bi TYPE: r.uc 1 eine ruur (C) STRENGVCRM: erJcel (D) TOPOLOGIE: lineair 5 (ii) MOLECUULTYPE: DNA (synthetisch) (xi) SEQUENTIEBESCHEIJVING: SEQ ID NE 5:

10 CCC-AAGATCT GATATCGGTA CCGGATCCGC ATGCGTGCAG GTTAACGTCG ACAAGC7TG

(2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NR δ:

15 (i) SEQUENTIEXZNMZREEN

(A) LENGTE: 2 4 baseparer.

(3) TYPE: nucleineruur (C) STRENGVORM: enkel (D) TOPOLOGIE: lineair 2 0 (ii) MOLECGULTYPE: DNA (synthetisch) (xi) SEQGENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NR δ: 25 GTACCGGCCG CTGCGGCCAA GCTT 2 4 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NR 7: 30

(i) SEQUENTIEKENMERKEN

(A) LENGTE: 2 4 baseparer.

(B) TYPE: nucleInetuur (C) STRENC'/ORM: enkel 3 5 (D) TOPOLOGIE: Irr.eair 1 1012434 MOLECGULTYPE: DNA (synthetisch) 4 4 (xi) SEQUENTIEBESCKRIJVING: SSQ ID Νκ 7: GA7CAAGCT7 GGCCGCAGCG GCCG 24 5 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NR 8:

(i) SEQUENTIEKENMERKEN

(A) LENGTE: 35 baseparen 10 (S) TYPE: nuclelnezuur (C) STRENGVORM: enkel (D) TOPOLOGIE: lineair (ii) MOLECUULTYPE: DNA (synthetisch) 15 (xi) SEQUENTIE3ESCHRIJVTNG: SEQ ID NR 8: Z; aactgcagc tgctggcttg cgcccgatgc tagtc ’ 20 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NR 9: i

! (i) SEQUENTIEKENMERKEN

(A) LENGTE: 7S baseparen (3) TYPE: nuclelnezuur 25 (C) STRENGVORM: enkel (D) TOPOLOGIE: lineair (ii) MOLECUULTYPE: DNA (synthetisch) 30 (xi) SEQUENTIE3ESCHRIJVING: SSQ ID NR 9: aaactgcagc agctgggcag gccgctggac ggcctgcccT CGAGCTCGTC tagaatgtgc 5 G 7 5 (2) INFORMATIΞ VOOR SEQ ID NR 10: 35 1012434 45

(i) SEQUENTIEKENMERKEN

(A) LENGTE: 32 baseparen (3) TYPE; nucleinezuur (C) STRENGVORM: enkel 5 (D) TOPOLOGIE: lineair (ii) MOLECUULTYPE: DNA (synthetisch) (xi) SEQUENTIE3ESCHRIJVINC-: SEQ ID NR 10: 10 CTAGTCTAGA CACCGATGAG GAAACCCGAT GA 12 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NR 11: 15

(i) SEQUENTIEKENMERKEN

(A) LENGTE: 36 baseparen (3) TYPE: nucleinezuur (C) STRENGVORM: enkel 20 (D) TOPOLOGIE: lineair (ii) MOLECUULTYPE: DNA (synthetisch) (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVTNG: SEQ ID NR 11: 25

CIIAAGCTTC TCGAGTCAG? GGTCGCTGGG CGCGCG

(2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NR 12:

30 (i) SEQUENTIEKENMERKEN

(A) LENGTE: 24 baseparen (3) TYPE: nucleinezuur (C) STRENGVORM: enkel (D) TOPOLOGIE: lineair 35 (ii) MOLECUULTYPE: DNA (synthetisch) 1 0 12434 4 6 (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NR 12: GGAGATCTAGATCGATATC7CGAG 2 4 5 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NR 13:

(i) SEQUENTlEKENMERKEN

(A) LENGTE: 30 baseparen 10 (3) TYPE: nuclelnezuur (C) STRENGVORM: enkel (D) TOPOLOGIE: lineair (ii) MOLECUULTYPS: DNA (synthetisch) : 15 (xi) SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID NR 13:

J GATC CTCGAG ATATCGATCTAGA.TCTC C GC

3 0 Ί •i i 1012434

Claims (38)

1. Polynucleotide dat een sequentie omvat die selectief kan hybridiseren met (a) SEQ. ID. NR. 1 of het complement daarvan; (b) een sequentie uit het plasmide van 3,6 kb van Propio-nibacterium freudenreichii CBS 101022; 10 (c) een sequentie uit het plasmide van 3,6 kb van Propion- ibacterium freudenreichii CBS 101023; of (d) een sequentie die codeert voor een polypeptide dat een SEQ. ID. NR. 2 of SEQ. ID. NR. 3, een aminozuursequentie die in hoofdzaak homoloog daaraan is of een fragment van één van 15 beide sequenties omvat.

2. Polynucleotide dat een autonoom replicerend plasmide is dat extrachromosomaal in een gastheercel in stand kan blijven, welk plasmide afgeleid wordt uit een endogeen Propionibacterium-plasmide, en, wanneer het een heteroloog gen omvat, dat gen in de gastheercel tot 20 expressie kan brengen.

3. Polynucleotide volgens conclusie 1 dat autonoom replicerend is in een gastheercel.

4. Polynucleotide volgens conclusie 3, waarbij de gastheercel een Propionibacterium is.

5. Polynucleotide volgens conclusie 4, waarbij de Propionibacterium Propionibacterium freudenreichii is.

6. Polynucleotide volgens één van de voorgaande conclusies dat selectief kan hybridiseren met één of meer sequentie(s) in SEQ. ID. NR. 1 die noodzakelijk is (of zijn) voor autonome replicatie in een

30 Propionibacterium.

7. Polynucleotide volgens conclusie 1 dat ofwel het fragment van 1,7 kb van SEQ. ID. NR. 1 omvat dat begrensd wordt door de restrictieplaatsen Sail en AlwNI ofwel de nucleotiden 1 tot 1750 van SEQ. ID. NR. 1.

8. Vector die een polynucleotide omvat volgens één van de voorgaande conclusies.

9. Vector volgens conclusie 8 die een plasmide is. 1012434

10. Vector volgens conclusie 8 of 9 die aanvullend een selecteerbare merker omvat.

11. Vector volgens één van de conclusies 8 tot 10 die autonoom replicerend is in E.coli.

12. Vector volgens één van de conclusies 8 tot 11 die een expressievector is.

13. Vector volgens conclusie 12 die een endogeen gen van een Propionibacterium omvat of een heteroloog gen dat werkzaam gekoppeld is aan een regulerende sequentie die het gen tot expressie kan brengen.

14. Vector volgens conclusie 13, waarbij het gen het cobA-gen is.

15. Vector volgens conclusie 13, waarbij het heterologe gen codeert voor een polynucleotide dat therapeutisch is in een mens of dier.

16. Polypeptide dat de sequentie SEQ. ID. NR. 2 of 3 omvat of een sequentie die in hoofdzaak homoloog daaraan is, of een fragment van één van beide genoemde sequenties, of gecodeerd wordt door een polynucleotide volgens één van de conclusies 1 tot 7.

17. Gastheercel die een heterogeen polynucleotide of vector 20 volgens één van de conclusies 1 tot 15 omvat of die getransformeerd of getransfecteerd kan worden met een vector volgens één van de conclusies 13 tot 15.

18. Gastheercel volgens conclusie 17 die een bacterie is. , 19. Gastheercel volgens conclusie 18 die een Propionibacterium ] 25 of E.coli is.

20. Werkwijze voor het produceren van een gastheercel volgens één van de conclusies 17 tot 19 die het transformeren of transfecteren van een gastheercel met een polynucleotide of vector volgens één van de conclusies 1 tot 15 omvat.

21. Werkwijze voor de bereiding van een polypeptide, of een andere verbinding, waarbij de werkwijze bestaat uit het kweken of fermenteren van een gastheercel volgens één van de conclusies 17 tot 19 onder omstandigheden die de expressie of productie van het polypeptide of de verbinding mogelijk maken.

22. Werkwijze volgens conclusie 21 die een fermentatieproces is, waarbij de gastheercel gekweekt wordt onder aërobe of anaërobe oms t andigheden. 1012434

23. Werkwijze volgens conclusie 21 of 22, waarbij het tot expressie gebrachte polypeptide of de geproduceerde verbinding uit de gastheercel gewonnen wordt.

24. Werkwijze volgens conclusie 23, waarbij het polypeptide een 5 protease, amylase, lipase of peptidase is of de verbinding vitamine Β12 is.

25. Werkwijze volgens één van de conclusies 22 tot 24, waarbij het polypeptide uit de gastheercel uitgescheiden wordt.

26. Werkwijze volgens conclusie 25, waarbij het polypeptide tot 10 expressie gebracht wordt aan het oppervlak van de gastheercel en/of het polypeptide een antigeen of immunogeen is.

27. Polypeptide of verbinding bereid door middel van een werkwijze volgens één van de conclusies 20 tot 26.

28. Werkwijze voor de productie van vitamine Bu (cobalamine), 15 waarbij de werkwijze bestaat uit het kweken van een gastheercel volgens één van de conclusies 17 tot 19 onder omstandigheden waarbij het vitamine geproduceerd wordt en, indien nodig, het isoleren van het vitamine.

29. Vitamine B12 geproduceerd door een werkwijze volgens 20 conclusie 28.

30. Polypeptide volgens conclusie 27 voor toepassing bij een werkwijze voor het behandelen van een mens of dier door therapie.

31. Gastheercel volgens één van de conclusies 17 tot 19 voor toepassing bij een werkwijze voor het behandelen van een mens of dier 25 door therapie of voor toepassing in een diervoeder.

32. Toepassing van een gastheercel volgens één van de conclusies 17 tot 19 of een polypeptide of verbinding volgens conclusie 27 om kaas te maken of voor toepassing bij de kaasbereiding.

33. Toepassing van een gastheercel volgens één van de conclusies 30 17 tot 19 of een polypeptide of verbinding volgens conclusie 27 bij de bereiding van een voedingsmiddel of in een diervoeder.

34. Voedingsmiddel dat een polypeptide of verbinding volgens conclusie 27 omvat of een gastheercel volgens één van de conclusies 17 tot 19.

35. Voedingsmiddel volgens conclusie 34 voor consumptie door mensen (b.v. een kaas, worst) of door een dier. 1012434

36. Werkwijze voor het bereiden van kaas of een ander gefermenteerd zuivelproduct, waarbij de werkwijze bestaat uit de toepassing van een gastheercel volgens één van de conclusies 17 tot 19.

37. Werkwijze volgens conclusie 36, waarbij de gastheercel 5 gebruikt wordt in plaats van of naast melkzuurbacteriën.

38. Werkwijze volgens conclusie 36 of 37, waarbij de gastheercel een Propionïbacterium-cel is. 4 ï p 1012434 ï’ÏKE