CZ20004842A3 - Polynukleotid, vektor a hostitelské buňky k produkci rekombinantních proteinů a k výrobě potravin - Google Patents

Polynukleotid, vektor a hostitelské buňky k produkci rekombinantních proteinů a k výrobě potravin Download PDF

Info

Publication number
CZ20004842A3
CZ20004842A3 CZ20004842A CZ20004842A CZ20004842A3 CZ 20004842 A3 CZ20004842 A3 CZ 20004842A3 CZ 20004842 A CZ20004842 A CZ 20004842A CZ 20004842 A CZ20004842 A CZ 20004842A CZ 20004842 A3 CZ20004842 A3 CZ 20004842A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
sequence
vector
polynucleotide
polypeptide
propionibacterium
Prior art date
Application number
CZ20004842A
Other languages
English (en)
Inventor
Pieter Hendrik Pouwels
Luijk Nicole Van
Johannes Petrus Maria Jore
Rudolf Gijsbertus Maria Luiten
Original Assignee
Dsm N. V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dsm N. V. filed Critical Dsm N. V.
Publication of CZ20004842A3 publication Critical patent/CZ20004842A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Dairy Products (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

?(/ tyry Polynukleotid, vektor a hostitelské buňky rékombinantních proteinů a k výrobě potravin produkci
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká endogenního Propionibacterium, vektorů odvozených z tohoto a použití těchto vektorů pro (heterologní) expresi v baktériích, zejména druhu transformované baktérie mohou být vitaminu B12 nebo při výrobě sýra.
plazmidu plazmidu proteinů Propionibacterium. Tyto pc^zity k fermentační výrobě
Dosavadní stav techniky
Baktérie rodu Propionibacterium baktérie schopné produkovat různé v různých průmyslových procesech. Tak baktérií Propionibacterium je známo tím, jsou Gram-pozitivní užitečné sloučeniny např. několik druhů že produkuje vitamín
B12 (kobalamin) při průmyslové fermentaci. Některé jiné druhy jsou užívány v mlékárenském průmyslu při výrobě sýrů, kde přispívají, a v mnohých případech jsou hlavními činidly, ke specifické chuti a textuře sýrů. Mnohé druhy Propionibacterium jsou považovány za zcela bezpečné, že jsou jakožto živé organismy přidávány do potravin pro lidi nebo potravy pro zvířata.
Pro plné využiti biotechnologického potenciálu baktérii Propionibacterium jsou potřebné účinné a flexibilní metody genového inženýrství. A takové metody jsou závislé na dostupnosti plazmidů vhodných pro expresi proteinu z heterologniho genu v Propionibacterium.
Dokument EP-A-0400931 (Nippon Oil) popisuje endogenní plazmid (pTY-1) z Propionibacterium pentosaceum (ATCC 4875), ale neuvádí jeho sekvenci ani neuvádí 'příklad, jak ho využít pro expresi heterologního genu.
Dokument JP 08-56673 popisuje plazmid pTY-1 pro produkci vitamínu B12, ale neposkytuje žádný důkaz, že plazmid zůstává volně se replikujícím extrachromozomálním elementem, ani že je plazmid stálý uvnitř transformovaných buněk.
Cílem předkládaného vynálezu je proto poskytnout vektor, které jsou účinnější než dosud známé vektory, zůstávají extrachromozomální a/nebo jsou stabilní. Cílem vynálezu je zejména poskytnout účinný vektor pro klonování a/nebo expresi cizorodých genů nebo genomových fragmentů nebo genů či fragmentů z Propionibacterium v hostitelském kmenu Propionibacterium. To by umožnilo zabránit působení specifických restrikčních enzymů.hostitele a tudíž zabránit tomu, aby hostitel vnímal plazmid jako cizorodý polynukleotid.
Podstata vynálezu
První aspekt předkládaného vynálezu poskytuje polynukleotid, který je schopen selektivně hybridizovat se
a) sekvencí id. č. 1 nebo k ní komplementární sekvencí,
b) sekvencí z plazmidu velikosti 3,6 kb z Propionibacterium freudenreichii CBS 101022,
c) sekvencí z plazmidu velikosti 3,6 kb z Propionibacterium; freudenreichii CBS 101023,
d) sekvencí kódující polypeptid podle vynálezu, jako je např. aminokyselinová sekvence id. č. 2 nebo 3 (nebo alespoň část), nebo sekvencí k ní komplementární.
Sekvence id. č. 1 popisuje DNA sekvenci endogenního plazmidu z Propionibacterium LMG 16545, který byl objeven původci. První kódující sekvence jde' od nukleotidu 273 do nukleotidu 1184 a predikovaná aminokyselinové sekvence této kódující sekvence je ukázána jako sekvence id. č. 3.
Původci, vynálezu provedli screening rozsáhlé kolekce izolátů Propionibacterium a identifikovali dva kmeny nesoucí kryptické plazmidy velikosti 3,6 kb. Jeden z těchto kmenů byl Propionibacterium freudenreichii LMG 16545, který byl deponován 19. června 1998 ve sbírce CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, Postbus 273, NL-3740 Ag Baarn, Nizozemí 101022) jménem, přihlašovatele (Gist-Brocades, B.V., Wateringsweg 1, P.O. Box 1, 2600 MA Delft, Nizozemí) v souladu s Budapešťskou smlouvou, pod přírůstkovým číslem CBS 101022. Druhý kmen Propionibacterium freudenreichii LMG 16546 byl stejným ukladatelem deponován také 19. června 1998 ve stejné sbírce (CBS) pod přírůstkovým číslem CBS 101023.
Díky úplné charakterizaci a počítačové analýze nukleotidové sekvence LMG 16545 byli původci schopni identifikovat inzerčni místa pro fragmenty cizorodé DNA. Tato místa pak umožnila konstrukci plazmidů, které jsou stále schopny autonomní replikace v Propionibacterium.
Překvapivě bylo zjištěno, že gen rezistence k erytromycinu z aktinomycety Saccharopolyspora erythraea je účinně exprimován v Propionibacterium, a může být tudíž využit jako selekční markér pro transformované buňky.
Byly také připraveny bifunkčni vektory, které mohou být trvale udržovány a selektovány jak v E. coli tak i v Propionibacterium. To umožnilo využit pro. konstrukci vektorů E. coli a současně funkční expresi homologních nebo hetrologních genů v Propionibacterium. Konstrukce vektorů pomocí E. coli je nesrovnatelně snazší a je možné ji realizovat rychle.
Polynukleotid podle předkládaného vynálezu je autonomně se replikující nebo extrachromozomálnínapř. v baktérii jako je Propionibacterium.
Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje vektor, který obsahuje polynukleotid podle vynálezu.
Předkládaný vynález dále poskytuje způsob přípravy polypeptidu, kterýžto způsob obsahuje krok kultivace hostitelských buněk transformovaných nebo transfekovaných pomoci vektoru podle vynálezu v podmínkách, které vedou k expresi polypeptidu.
Vynález dále poskytuje polypeptid, který obsahuje sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 2 nebo 3 nebo
sekvenci v podstatě s ní homologní, nebo fragment kterékoliv
z těchto sekvencí, nebo protein kódovaný polynukleotidem
podle vynálezu.
Polynukleotidy
Polynukleotidy podle vynálezu j sou schopné selektivně
hybridizovat se sekvencí id. č. 1 nebo s úsekem sekvence
id. č.l nebo sekvencí k těmto sekvencím nebo úsekům
komplementární. Polynukleotid podle vynálezu je schopen selektivně hybridizovat se sekvencí plazmidu o velikosti 3,6 kb z P. freudenreichii CBS 101022 nebo CBS 101023 nebo s úsekem těchto sekvencí. Typicky polynukleotid podle vynálezu je souvislá sekvence nukleotidů, která je schopna selektivně hybridizovat se sekvenci id. č. 1 nebo s plazmidem velikosti 3,6 kb nebo části těchto sekvenci, nebo sekvenci, která je komplementární ke kterékoliv z těchto sekvencí nebo úsekům kterýchkoliv z těchto sekvencí.
Polynukleotid podle vynálezu a sekvence id. č. 1 nebo • 4 sekvence jednoho z plazmidů velikosti 3,6 kb nebo sekvence kódující polypeptid, nebo úseky těchto sekvencí, hybridizují na hladině významně vyšší než je základní hybridizace (pozadí hybridizace). K základní hybridizaci může dojít např. v důsledku přítomnosti dalších polynukleotidů v preparátu. Hladina signálu generovaného interakcí mezi polynukleotidem podle vynálezu . a sekvencí id. č. 1 nebo jedním z plazmidů velikosti 3,6. kb nebo úseky těchto sekvencí, je typicky alespoň lOx, výhodně alespoň lOOx intenzivnější než interakce jiných polynukleotidů se sekvencí id. č.t, 1 nebo jedním z plazmidů velikosti 3,6 kb nebo úseky těchto sekvencí. Intenzita interakce se měří např. pomocí radioaktivního značení sondy užitím 32P. Selektivní hybridizace je typicky dosaženo v podmínkám střední stringence (tj. např. 0,3M chlorid sodný a 0,03M citrát sodný při 50 °C) až vysoké stringence (stejné, koncentrace, ale při 60 °C) . Polynukleotidy podle vynálezu jsou obecně ze 70 %, výhodně alespoň 80 až 90 %, výhodněji alespoň 95 . % a nejvýhodněji alespoň 98 % homologní se sekvencí podle bodů
a) až d) v úseku souvislé sekvence 'alespoň 20 nukleotidů, výhodně alespoň 30 nukleotidů, např. alespoň 40, 60 nebo 100 a více nukleotidů.
Jakákoliv kombinace výše uvedených stupňů homologie a minimální velikosti definuje polynukleotid podle vynálezu, přičemž výhodnější jsou více stringentní kombinace (tj. vyšší míra homologie na delším úseku). Tak .např. polynukleotid který je homologní alespoň z 80 až 90 % na úseku 25 nukleotidů, výhodně 30 nukleotidů je jedním provedením předkládaného vynálezu, stejně jako, polynukleotid s 90 až 95% homologií na úseku delším než 40 nukleotidů.
Úseky zmíněné výše mohou být kódující sekvence id. č. 1 nebo_ jeden z plazmidů velikosti 3,6 kb. Jinými výhodnými
Λ · ·
··· ·· «· ·«· ·· ··· úseky sekvence id. č. 1 jsou replikační počátek, promotor nebo regulační sekvence, nebo sekvence schopné zajistit nebo se alespoň podílet na autonomní replikaci v hostitelské buňce jako je např. Propionibacterium.
Bylo zjištěno, že úsek . plazmidu od restrikčního místa
Sáli' do místa AlwNI je replikaci plazmidu. Jiné úsekem, který je nezbytný pro části plazmidu byly odstraněny (deletovány) a přesto to nemělo žádný škodlivý dopad na replikaci. Tudíž sekvence podle vynálezu v bodech b) a c) mohou být úseky vymezené restrikčními místy Sáli a AiwNI. To představuje úsek asi velikosti 1,7 kb. Alternativně sekvence uvedené v bodech b) nebo c) mohou být nahrazeny sekvencí odpovídající nukleotidům 1 až 1800, např. 100 až 1700, případně 150 až 1500, výhodně 200 až 1300 a nej výhodněji 250 až 1200 ze sekvence id. č. 1.
Proteiny (sekvence id. č. 2 a ..3) kódované ORF 1 a ORF2 zřejmě napomáhají replikaci plazmidu. Plazmid se replikuje metodou tzv. otáčejícího se kruhu, kdy je původní plazmidová dsDNA rozštěpena jedním z proteinů, což napomáhá vytvoření kopie vnějšího řetězce za užití vnitřního řetězce jakožto templátu. Kopie vnějšího řetězce je pak odstraněna a konce řetězce jsou spojeny (ligovány). Hostitel pak replikuje vnitřní kruh pomocí vnějšího kruhu užitého jako templář.
Kódující sekvence podle vynálezu může být modifikována substitucí nukleotidů, např. 1, 2,3 až 10, 25, 50 nebo 100 substitucemi. Polynukleotidy sekvencí podle bodu aj až d) mohou být alternativně nebo navíc modifikovány jednou nebo několika inzercemi nebo delecemi a/nebo extenzí (prodloužením) na jednom z konců nebo na obou koncích. Mohou být . provedeny degenerované substituce a/nebo substituce, které vedou ke konzervativní aminokyselinové substituci, když je modifikovaná sekvence, translatována, jak bude pro
Φ ·· «· φ · · · • φφ φ φ · φ φ φ «·· φφφ φφφ φφφ • ΦΦ φφ φφ Φ·Φ φφ φφφ polynukleotidy podle vynálezů ještě podrobněji diskutováno dále.
Polynukleotidy podle vynálezu mohou obsahovat RNA nebo DNA. Mohou to být polynukleotidy, které obsahují syntetické nebo modifikované nukleotidy. V oboru je známa celá řada různých typů modifikací polynukleotidů. Patří sem např. methlyfosfonátová nebo fosforothioátová kostra, adice akridinového nebo polylysinového řetězce na 3'- nebo 5'-konec molekuly. Ve smyslu předkládaného vynálezu je třeba chápat, že polynukleotid podle vynálezu může být modifikován jakýmkoliv odborníkovi známým způsobem. Takové modifikace jsou prováděny s cílem zvýšit in vivo aktivitu a/nebo prodloužit životnost.
Polynukleotidy podle vynálezu se mohou užít jako primery, např. primery pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR) , primery pro alternativní amplifi.kační. reakce, jako sonda, např. jako sonda značená detekovatelnou značkou konvenčním způsobem užitím radioaktivní nebo neradioaktivní značka, nebo polynukleotid může být klonován do vektoru.
Takové primery, sondy nebo jiné fragmenty jsou dlouhé alespoň 15, výhodně alespoň 20, např. alespoň 25, 30 nebo 40 nukleotidů, typicky mají velikost do 40, 50, 60, 70, 100 nebo 150 nukleotidů. Sondy a fragmenty mohou být i delší než 150 nukleotidů, např. . až 20.0, 300, 500, 1000 nebo 1500 nukleotidů, nebo naopak krátké jen málo několik nukleotidů, jako např. 5 nebo 10 nukleotidů ze sekvence a) až d).
Polynukleotidy jako DNA polynukleotidy nebo primery podle vynálezu mohou být připraveny rekombinantní technikou, synteticky nebo jakýmkoliv jiným způsobem odborníkovi známým. Mohou být také standardním způsobem klonovány. Polynukleotidy jsou typicky připraveny v izolované a/nebo purifikované formě.
• 9 9 • 9 9 9
• · ♦ · 9 • · 9 9 • ·
• · · 9 • • 9 ·
• · · 9 « • • ·
·· 9 99 9 9 99 9 99 • ·
Obecně jsou primery připravovány synteticky, což představuje přípravu sekvence nukleové kyseliny postupným přidáváním jednoho nukleotidu. Způsoby pro takové syntézy užitím automatických zářízeni, jsou v oboru k dispozici.
Delší polynukleotidy se připravují rekombinantní technikou,, např. užitím PCR klonování. Tento způsob zahrnuje přípravu dvou oligonukleotidových primerů (např. velikosti 15 až 30 nukleotidů) pro úsek sekvence id. č. 1 nebo jeden z plazmidů velikosti 3,6 kb, který má být klonován, dále se tyto primery přivedou 'do kontaktu s DNA získanou z Propionibacterium, provede se PCR ve vhodných podmínkách, aby se amplifikoval požadovaný úsek sekvence, amplifikovaný fragment se izoluje (např. purifikaci reakční směsi elektroforézou na agarózovém gelu). Primery mohou být navrženy tak, aby obsahovaly vhodná rozpoznávací místa pro restrikční enzymy, takže amplifikovaná DNA pak . může ‘být snadno klonována do vhodného vektoru. Tento způsob může být využit k získání buďto částí nebo i celých sekvencí id. č. 1 nebo obou plazmidů velikosti 3,6 kb.
Všechny tyto uvedené metody jsou odborníkům známy10.
Polynukleotidy, které nejsou ve. 100 % homologni se sekvencí· id. č. 1 nebo jedním z plazmidů velikosti 3,6 kb .mohou být získány různými způsoby.
Polynukleotidy homologické se sekvenci id. č. 1 nebo jedním z plazmidů velikosti 3,6 kb mohou být získány např. prohledáváním knihoven genomové DNA připravených z různých druhů Propionibacterium, např. P. freudenreichii, P. jensenii, P. thoenii, P. acidipropionici nebo kmenů bakterií ze třídy Actinomycetes, nebo jiných Gram-pozitivních baktérií, nebo baktérii bohatých na G:C páry. Všechny tyto organismy jsou vhodnými zdroji homologních nebo heterologních genů, promotorů, enhancerů (zesilujících elementů) nebo.
♦ .4* ·· 4 ···
4444444444·· ♦ · 444···
404 4 444 4·
44444444« *44 44 44 444 44444
- 9 hostitelských buněk pro použiti podle vynálezu.
Takové homology a jejich fragmenty jsou obecně schopné selektivně hybridizovat s kódující sekvencí sekvence id. č. 1 nebo sekvencí k ní komplementární nebo jednou ze sekvencí plazmidů velikosti 3,6 kb.· takové sekvence lze získat prohledáváním DNA knihoven z Propionibacterium pomocí sond, které obsahují část nebo celou sekvenci id. č. 1 nebo jednoho z plazmidů velikosti 3, 6 kb v podmínkách střední až vysoké stringence (tj . např. 0,03M chlorid sodný a 0,3M citrát sodný při 50'až 60 °C).
Homology lze také získat pomocí degenerované PCR/ kdy se užijí primery zacílené na konzervativní úseky v homologu. Konzervativní sekvence lze predikovat srovnáním sekvence id. č. 1 nebo sekvence plazmidů velikosti 3,6 kb se sekvencí homologa. Primery obsahují jedno nebo několik degenerovaných míst a použijí se za podmínek nižší stringence, než když' se užívají primery s jedinečnou sekvencí pro známou sekvenci.
Alternativně lze takové polynukleotidy získat místně cílenou mutagenezí sekvence id. č. 1 nebo plazmidů velikosti 3,6 kb nebo jejich homologů. To je užitečné např. tehdy, když jsou požadovány umlčené záměny kodonů kvůli optimalizaci preference kodonů pro určitou hostitelskou buňku, . kde má být polynukleotidová sekvence exprimována. Jiné změny sekvencí jsou třeba pro vnesení rozpoznávacích míst pro restrikční enzymy nebo je-li cílem změnit vlastnosti nebo funkci polypeptidu, který je polynukleotidem kódován.
Metody stanovení homologie polynukleotidu jsou odborníkovi známy. Tak-např. soubor programů UW GCG poskytuje program BESTFIT, který lze užít pro výpočet homologie, např. se standardním nastavením parametrů7. Pro homologii aminokyselinových sekvencí týkajících se polynukleotidů podle vynálezu lze, užít program BLAST (Basic Local Alignment ··««·· «
9 · 9 9 9 9 9 9
999 99 99 999 99 999
Tool1) , který umožňuje srovnávání aminokyselinových sekvenci (a pokud je třeba i nukleotidových sekvenci) pro stanovení sekvenční podobnosti. Program BLAST může být užit ke stanoveni míry přesného párování nebo pro identifikaci homologů .a je zejména užitečný při takovém párování, které neobsahuje mezery. Metoda BLAST užívá algoritmus založený na metodě HSP (High-scoring Segment Pair).
Předmětem vynálezu jsou také dvouřetězcové polynukleotidy, které obsahují polynukleotidovou sekvenci podle vynálezu a sekvenci k ní komplementární.
Polynukleotidy (např. sondy nebo primery) podle vynálezu mohou obsahovat , detekovatelnou značku. K vhodným značkám patří radioizotopy jako např. 32P nebo 35S, enzymové značky nebo jiné proteiny jako např. biotin. Detekční metody těchto značek jsou známé.
Polynukleotidy (značené nebo neznačené) se mohou využít v testech založených na nukleových kyselinách pro detekci nebo sekvencování jiného polynukleotidu podle vynálezu.
K polynukleotidům podle vynálezu patři také varianty sekvence id. č. 1 nebo obou plazmidů velikosti 3,6 kb, které jsou schopné autonomní replikace nebo zůstávají extrachromozomálni v hostitelské buňce. Takové varianty jsou stabilní v baktérii jako je např. Propionibacterium.
Obecně polynukleotid podle vynálezu obsahuje réplikační počátek a/nebo kódující úsek (úseky) sekvence id. č. 1 nebo jednoho z plazmidů velikosti 3,6 kb, nebo homology těchto sekvencí. Polynukleotid podle vynálezu, který je stabilní v hostitelské buňce, jak' např. v Propionibacterium nebo E. coli, je takový polynukleotid, který není ztracen z hostitele v průběhu pěti generací, případně 15 generací, výhodně 30 generací. Obecně je takový polynukleotid zděděn oběma dceřinnými buňkami v každé generaci.
Polynukleotid může obsahovat promotor nebo replikační počátek (např. upstream, tj proti směru transkripce, od sekvence kódující replikační protein).
Polynukleotid podle vynálezu může být transformací nebo transfekcí vnesen do baktérie, jako je např. E. coli nebo Propionibacterium, metodou k tomu vhodnou11. Může být přítomen v baktérii v počtu 5 až 500kopií, např. 10 až 100 kopií.
Polynukleotid je schopen autonomní replikace v baktérii jiné než Propionibacterium. takovou baktérií jenapř. E. coli, nebo Gram-pozitivní, na G:C bohatá baktérie, nebo baktérie ze třídy Actinomycetes. Takový polynukleotid obecně obsahuje sekvence, které umožňují, aby byl polynukleotid v baktérii autonomně replikován. Takové sekvence mohou být odvozeny z plazmidů, které jsou schopné replikace v baktérii.
Polynukleotid podle vynálezu může být polynukleotid, který byl ' připraven replikací v Propionibacterium. Alternativně může být připraven replikací v jiné baktérii, např. v E. coli. Polynukleotid je schopen obejít restrikční systém hostitele Propionibacterium.
Vektory
Druhý aspekt předkládaného vynálezu se týká vektoru, který obsahuje polynukleotid podle vynálezu. Vektor je schopen replikace v hostitelské buňce jako je např. baktérie, např. Actinomycetes, Propionibacterium nebo E. coli. .Vektor je lineární polynukleotid nebo, což je častější, kruhový polynukleotid. Vektor může být hybridem polynukleotidu podle vynálezu a jiného vektoru. Jiným vektor v tomto případě je např. vektor E. coli jako je pBR322 nebo vektory z rodiny pUC vektorů, Rl, ColD nebo RSF1010 nebo z nich odvozené vektory.
Polynukleotid nebo vektor podle vynálezu může být plazmid. Takový plazmid má restrikčni mapu stejnou nebo v podstatě podobnou s restrikčními mapami uvedenými na obr. 1,- 2a a 2b.
Polynukleotid nebo vektor podle vynálezu má velikost 1 až 20 kb, např. 2 až 10 kb, výhodně 3 až 7 kb.
Polynukleotid nebo vektor podle vynálezu může obsahovat vícečetná funkční klonovací místa. Taková klonovací místa obecně obsahuji rozpoznávací sekvence restrikčních enzymů. Polynukleotid nebo vektor může obsahovat sekvenci ukázanou zde jako sekvence id. č. 1 a/nebo obsahuje restrikčni místa EcoRI, Sací, AlwNl, BSMI, BsaBI, Bell, Apal, HindlH, Sáli, Hpal, Pstl, Sphl, BamHI, Acc651, EcoRV a BglII. Polynukleotid nebo vektor podle vynálezu tedy obsahuje jedno, více než jedno nebo všechna tato výše uvedená restrikčni místa, obecně v pořadí, které je ukázáno na obrázcích.
Výhodně, pokud je přítomen v baktérii, jako je např. Propionibacterium nebo E. coli, se polynukleotid nebo vektor podle vynálezu neintegruje do chromozómu baktérie. Obecně neintegruje do chromozómu baktérie po 5 generací, výhodně po 20 nebo 30 generací.
Polynukleotid nebo vektor může být autonomně se replikující plazmid, který se udržuje extrachromozomálně uvnitř hostitelské buňky, přičemž plazmid je odvozen z endogenního plazmidu Propionibacterium, a když obsahuje heterologní gen (vzhledem k hostiteli) je schopen tento gen exprimovat uvnitř hostitelské buňky. Termín derivovaná forma nebo odvozená forma znamená, že autonomně se replikující plazmid obsahuje sekvenci shodnou s polynukleotidem podle vynálezu.
Vektor podle vynálezu může obsahovat selekční markér. Selekční markér může být gen poskytující rezistenci k antibiotiku, např. gen rezistence k ampicilinu, kanamycinu • · · · · · · · ·.
·· ♦ · · · ·· · · »· • ·· · · · 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 999 9 9 9 9 9' nebo tatracyklinu. Může to také být gen rezistence k erytromycinu. Gen rezistence k erytromycinu pochází z Actinomycetes jako např. Saccharopolyspora erythraea, např. Saccharopolyspora erythraea NRRL 2338. K dalším selekčním markérům, které mohou být ve vektor podle vynálezu,. patří geny rezistence ke chloramfenikólu, thiosterptonu, viomycinu, neomycinu, apramycinu, hygromycinu, bleomycinu nebo streptomycinu.
Vektor může být expresní vektor, takže Obsahuje heterologní gen (který se přirozeně nevyskytuje v hostitelské buňce, např. Propionibacterium}, nebo endogení nebo homologní gen hostitelské buňky, např. Propionibacterium. V expresním vektoru je obvykle gen, který má být exprimován, operativně spojen s kontrolní sekvencí, která je schopna exprimovat gen v hostitelské buňce.
Termín operativně spojený znamená takové vzájemné spojení (přiložení), že výše popsané složky jsou v takovém vztahu, který umožňuje zamýšlenou funkci. Kontrolní sekvence operativně spojená s kódující sekvencí je ligována takovým způsobem, že je dosaženo exprese kódující sekvence v podmínkách, které jsou kompatibilní s kontrolní sekvencí.
Heterologní nebo endogenní geny mohou být vloženy mezi nukleotidy 1 a 200 nebo mezi nukleotidy 1500 až 3555 sekvence id. č. 1 nebo do ekvivalentní pozice v homologním polynukleotidu.
Takové geny obsahují homologní nebo endogenní geny např. pro elongační faktory, promotorové regulační sekvence nebo elementy a replikační proteiny. K další genům (které mohou být vzhledem k hostiteli heterologní) patří geny, kódující přímo nebo podílející se na tvorbě výživových faktorů, imunomodulátorů, hormonů,' proteinů nebo enzymů (jako jsou např. proteázy, amylázy,_ peptidázy a lipázy) , činidla • · ·
- 14 ·♦ ovlivňující texturu, chuťové látky (např. diacetyl, aceton), genové klustry, antimikrobiálni činidla (např. nisin), látky používané v potravinách (např. v klobásách, sýrech), metabolické enzymy, vitaminy (např. Bi2), uroporfyrinogen (Ill)methyltransferáza (UP III MT) , cobA, antigeny (např. pro očkování) a terapeutická činidla. Jak se ještě objasní dále, hostitelské buňky mohou produkovat celou, řadu různých látek, nejen polypeptidů, které jsou přímo požadovaným produktem nebo se užívají k přípravě požadovaného produktu.
Heterologní gen může mít terapeutický účinek pro člověka nebo zvíře. Takový gen může být gen pro antigen, např. z patogenního organismu. Hostitel, např. Propionibacterium, obsahující polynukleotid s takovým heterologním genem se může užít jako vakcína a může poskytovat ochranu proti patogenu.
Heterologní antigen může být celý protein nebo část proteinu obsahující epitop. Antigen může pocházet z baktérie, kvasinky, viru nebo houby.
Hostitelské buňky a exprese
Třetí aspekt předkládaného vynálezu představuj i
hostitelské ,buňky, které obsahují polynukleotid nebo vektor
podle vynálezu. Hostitelské buňky jsou baktérie, např. třídy Actinomycetes. Mohou to být baktérie E. coli nebo Propionibacterium. V případě Propionibacterium jde o baktérie P. freudenreichii, P. jensenii, P. thoenii nebo P. acidopropionci .
Čtvrtý aspekt vynálezu poskytuje způsob přípravy hostitelských buněk, který obsahuje transformaci nebo transfekci hostitelských buněk polynukleotidem nebo vektorem podle vynálezu, např. způsobem transformace11, který je odborníkovi známý.
Pátý aspekt vynálezu poskytuje způsob přípravy polypeptidu kódovaného polynukleotidem nebo vektorem podle vynálezu kterýžto hostitelských buněk přítomným způsob obsahuje umístění v podmínkách, kde v hostitelské buňce
podle vynálezu,
nebo kultivaci
dojde k expresi
polypeptidu.
Tento aspekt vynálezu dále poskytuje polypeptidu kódovaného daným genem, kterýžto způsob obsahuje kultivaci způsob přípravy expresním k expresi . polypeptidu.
hostitelské buňky transformované nebo transfekované vektorem obsahujícím gen, v podmínkách, které vedou polypeptidu, a případě izolaci exprimovaného Hostitelské buňky mohou být ze
Actinomycetes, nebo Gram-pozitivní
Propionibacterium nebo E. coli.
Promotory, iniciátory translace, geny elongačních faktorů, geny rezistence k antibiotikům, syntetické promotory sekvenci) nebo třídy baktérie jako např.
terminátory translace, ribozomové RNA, geny zkonstruované na základě kanonických signály regulující expresi přítomné další v polynukleotid nebo vektor podle vynálezu jsou takové, s expresí v hostitelské že jsou kompatibilní buňce. K promotorům patří také promotory endogenních genů
Kultivační podmínky anaerobní, v závislosti na hostitelské mohou být hostiteli.
buňky.
jak aerobní tak i se umístí hostitel aerobních podmínek.
polypeptidy, se pak fermentačního izolují, např. z média. Exprimované secernovány hostitelskými buňkami do jsou polypeptidy exprimovány na povrchu hostitelských buněk.
Pro fermentační proces do anaerobních podmínek a pak případě do produkované sloučeniny, např. exprimované hostitelských buněk nebo polypeptidy mohou být média. V takovém případě
To je žádoucí např. tehdy, když polypeptid obsahuje antigen, na který má reagovat imunitní systém člověka nebo zvířete.
- 16 44 ·· · · 4 4 44 · e44 • 9 9 9 9 9 · 44 • · · · · 4 * 4· φ9
99 999999
999 99 <9 499 99999
Homologní gen přítomný ve vektoru podle vynálezu může být ccbA. Hostitelská buňky obsahujíc tento vektor je tudíž schopna produkovat ze substrátu sloučeniny jako je vitamín B12 nebo enzymový produkt. Předkládaný vynález specificky poskytuje způsob přípravy vitamínu nebo-li kultivaci fermentaci
B12, který hostitelských obsahuj e buněk .
v podmínkách, exprimovaný kde j e enzym je exprimován přiveden gen do kontaktu
Takto substrátem v podmínkách, kde je substrát přeměněn na vhodným vitamín
B12. To vede ke zvýšení produkce vitamínu B12.
Léčiva
Jak bylo již popsáno výše, polynukleotid podle vynálezu může obsahovat heterologní gen, který je terapuetickým (léčivým) genem. Takže předmětem vynálezu je i hostitelská buňky obsahující vektor podle vynálezu, který obsahuje terapeutický gen, pro použití při léčení člověk a nebo zvířete. Hostitelkou buňkou může ' být . Propionibacterium. Hostitelská buňka může být žívá nebo mrtvá.
Hostitelské buňky, jsou pro klinické podávání formulovány smícháním s farmaceuticky přijatelnými nosiči nebo rozpouštědly. Mohou být formulovány např.· pro topické, parenterální, intravenózní, intramuskulární, subkutánní, perorální nebo transdermální podávání. Hostitelské buňky mohou být smíchány s vehikulem, které musí být farmaceuticky přijatelné a vhodné pro požadovaný způsob podávání. Farmaceuticky přijatelný nosič nebo rozpouštědlo pro injekční podávání je např. sterilní isotonický roztok, např. voda pro injekce nebo fyziologický roztok.
Dávka hostitelských buněk se určí v závislosti na různých parametrech, zejména v závislosti na typu použitých buněk, věku, hmotnosti a stavu léčeného pacienta, způsobu podáváni, nemoci, která má být léčena a požadovaném klinickém režimu. Jako základní vodítko, počet podávaných hostitelských buněk při perorálním podávání je 107 až 1011 hostitelských buněk v jedné dávce pro dospělého člověka o hmotnosti 70 kg.
Způsoby podávání a popsané dávky jsou zamýšleny pouze jako vodítko1 či ilustrace, neboť zkušený odborní je schopen okamžitě určit nej vhodnější způsob podávání a optimální dávku pro určitého pacienta a určitý stav.
Polypeptidy
Šestý aspekt předkládaného vynálezu poskytuje polypeptid, který obsahuje jednu z následujících aminokyselinových sekvencí: sekvence id. č. 2 nebo 3 nebo v podstatě homologní sekvence, nebo fragment jedné z těchto sekvencí. Polypeptid podle vynálezu je polypeptid kódovaný polynukleotidem podle prvního aspektu předkládaného vynálezu.' Obecně řečeno, výhodné jsou přirozeně se vyskytující aminokyselinové sekvence uvedené zde jako sekvence id. č. 2 a 3. Avšak k polypeptidům podle vynálezu patří homology těchto přírodních sekvencí, a také fragmenty těchto sekvencí a jejich homology, které mají aktivitu přirozeně se vyskytujícího polypeptidu. Jednou takovou aktivitou je replikace polynukleotidu podle vynálezu.
Polypeptid podle vynálezu obsahuje:
a) protein se sekvencí id. č. 2 nebo 3, nebo
b) jejich homolog z Actinomycetes, jako např. z Propionibacterium freudenreichii nebo jiného kmenu Propionibacterium, nebo
c) protein s alespoň 70% homologií s a)
Homolog se může přirozeně vyskytnout v Propionibacterium a fungovat v podstatě podobně jako polypeptid se sekvenci id. č. 2 nebo 3. Takový homolog se může vyskytovat v Actinomycetes i Gram-^pozitivních baktériích.
Protein homologní alespoň v 70 % k proteinům se sekvencí id. č. 2 nebo 3 nebo jejich homologům je výhodně z 80 % nebo 90 % homologní, výhodněji z 95, 97 a 99 % homologní v úseku alespoň 20 nukleotidů, výhodně alespoň 30, např. 40, 60 nebo 100 po sobě souvisle následujících aminokyselin. Způsoby stanovení homologie proteinů jsou odborníkům známy a v kontextu popisu vynálezu je odborníkům zřejmé, že homologie je určována na základě identity aminokyselin (tato homologie je někdy označována jako tvrdá homologie).
Sekvence proteinů se sekvencí id. č. 2 nebo 3 nebo homologními mohou být modifikovány, čímž poskytnou další polypeptidy podle vynálezu.
Mohou být. provedeny substituce aminokyselin, např. 1,. 2 nebo 3 až 10, 20 nebo 30 aminokyselin. Modifikovaný peptid si uchovává svou původní aktivitu. Lze provést konzervativní substituce, např. podle následující tabulky. Aminokyseliny ve stejném bloku ve druhém sloupci a výhodně v tomtéž řádku ve třetím sloupci mohou být vzájemně substituovány.
ALIFATICKÉ Nepolární G A P
I L V
Polární-nenabité C S T M
N Q
Polární-nabité D E
K R
AROMATICKÉ H F W Y
K polypeptidům podle vynálezu patří také fragmenty výše
- 19 • 4444
4 · 44
44 44
4 4 4 44
4 4 44
444 «444
444 uvedených polypeptidů plné délky a jejich varianty, včetně fragmentů sekvencí uvedených jako sekvence id. č. 2 a 3. takové fragmenty si uchovávají přírodní aktivitu- polypeptidů plné délky.
Vhodné fragmenty jsou alespoň 5, např. 10, 12, 15 nebo 20 aminokyselin dlouhé. Fragmenty polypeptidů sekvencí id. č. 2 nebo 3 e jejich homology mohou obsahovat jednu nebo více (např. 2, 3 nebo 10) substitucí, delecí n^bo inzercí, včetně konzervativních substitucí.
Polypeptidy podle vynálezu jsou v podstatě izolované formě. Polypeptidy podle vynálezu mohou být také v podstatě purifikované formě. V takovém případě obecně polypeptid podle vynálezu představuje v polypeptidovém preparátu více než
90'%, např. 95, 98 nebo 99 %.
Polypeptidy podle det.ekovatelnou. . značkou., značka, která dovoluje vynálezu může být označen Detekovatelná značka je vhodná aby byl polypeptid detekován.
K vhodným značkám patří radioizotopy, např. 125I, 35S, enzymy, protilátky, polynukleotidy a linkery, jako např. biotin.
Průmyslová využitelnost .Hostitelské buňky podle vynálezu mohou být použity nejen pro přípravu rekombinantních proteinů, ale také jiných požadovaných sloučenin včetně sloučenin neproteinové povahy jako jsou např. anorganické sloučeniny, a zejména vitamínů.
Sedmý aspekt předkládaného, vynálezu se proto týká způsobu výroby sloučenin, který obsahuje kultivaci nebo-li fermentaci hostitelských buněk podle vynálezu v podmínkách, kde se tvoří požadovaná sloučenina. Ačkoliv sloučenina může být polypeptid, např. polypeptid podle 6. aspektu vynálezu, · ·· ·· ·9· · · · může to být také sloučenina zmíněná v diskusi týkající se exprimovaných genů. Zjevně anorganické sloučeniny nejsou exprimovány z genů, ale mohou být připraveny pomocí enzymů nebo polypeptidů, kdy enzym nebo polypeptid napomáhá hostitelské buňce ve tvorbě požadované sloučeniny. Tyto sloučeniny mohou být tvořeny uvnitř buňky a pak izolovány, např. po lýzi hostitelské'buňky, nebo mohou procházet stěnou hostitelské buňky do okolního média, což může být fermentační médium, např. vodný roztok. Takže hostitelské buňky se mohou « kultivovat ve vodném médiu, které obsahuje buňky a živiny potřebné pro buňky, např. asimilovatelné zdroje uhlíku a/nebo dusíku.
Takto vyráběné polypeptidy mohou sloužit také pro terapeutické použiti. Mohou to být léčiva nebo jiné farmakologicky účinné sloučeniny, nebo to mohou být antigenní nebo imunogenní sloučeniny,. které mohou být užity jako vakcíny.
Vynález dále zahrnuje sloučeniny vyráběné tímto způsobem, ať se jedná o.rekombinantní polypeptid nebo jinou sloučeninu. Specifickou sloučeninou podle vynálezu jsou vitamíny, zejména Bx2 (kobalamin) .
V některých případech se nemusejí sloučeniny izolovat ani z hostitelských buněk ani z fermentačního média. Hostitelské buňky samy o sobě se užívají pro speciální účely, « např. při výrobě potravin, jako jsou např. klobásy nebo sýry, nebo jsou hostitelské buňky součástí potravy pro zvířata, např. když hostitelská buňky obsahuje sloučeninu, která má být zvířetem strávena, vynález se tedy týká také použití těchto sloučenin nebo hostitelských buněk pro výrobu potravin jako jsou např. klobásy nebo sýry. Vynález také zahrnuje potraviny a krmivá pro zvířata obsahující hostitelské buňky nebo sloučeniny vyráběné způsobem podle vynálezu.
Ve zvláště výhodném provedeni, vynálezu se hostitelské buňky užívají' při výrobě sýrů, takže vynález zahrnuje i výrobu sýrů, kdy se jako mikroorganismy užívají hostitelské buňky podle vynálezu. Hostitelské buňky podle vynálezu se užijí místo a nebo navíc k obvykle užívaným baktériím, např.
. baktériím mléčného kvašení (tvořícím kyselinu mléčnou).
Baktérie tvořící kyselinu propionovou se užívají při výrobě sýrů např. s mesofilními kulturami (typ sýru Maasdam) nebo termofilními kulturami (typ sýru Emmental). Jak mesofilní t tak i termofilní kultury jsou zodpovědné za kysnutí mléka nebo sýrů. Hostitelské buňky podle vynálezu mohou být využity nejen pro výrobu sýrů, ale i jiných fermentovaných potravinářských výrobků (např. jogurtů). Baktérie tvořící kyselinu propionovou se užívají při výrobě sýrů pro. jejich schopnost přeměňovat laktát a cukry na kyselinu propionovou, . . kyselinu octovou a oxid, uhličitý. Hostitelské buňky podle vynálezu, zejména pokud jde o Propionibáctérium, mohou být .použity, neboť jsou málo citlivé k nitrátům a soli, což umožní redukci nebo vynecháni baktofugace mléka (která se užívá ke sníženi hladiny Clostridia) .
Fermentace hostitelských buněk může probíhat v jedné fázi nebo dvoufázově. To mohou být např. růstová fáze a/nebo produkční fáze, nebo anaerobní a/nebo aerobní fáze. Výhodná je růstová a/nebo anaerobní fáze a případně (např. jako následující) produkční a/nebo aerobní fáze.
Jak zdroj uhlíku tak i dusíku jsou komplexní zdroje nebo jednoduché sloučeniny. Výhodným zdrojem uhlíku je glukóza. Vhodným zdrojem dusíku je např. kvasinkový extrakt, amoniak nebo amonné ionty.
Výhodné charakteristiky jednoho aspektu vynálezu jsou vhodné pro ostatní aspekty vynálezu mutatis mutandis.
• ·· ·· -· ·· ··· « « · ·· · ·· • ·· ♦ · · · ·
- 22 Popis obrázků
Vynález je ilustrován připojenými 'obrázky.
Obr. 1 je restrikční mapa vektoru podle vynálezu, p545 byl získán z P. freudenreichii LMG 16545 (CBS 101022) .
Obr. 2a a 2b jsou mapy dvou a dvou vektorů podle vynálezu.
'» Vynález je dále podrobněji vysvětlen a ilustrován následujícími příklady, přičemž tyto příklady vynález nijak neomezují.
Příklady provedeni vynálezu
Příklad 1
Screening kmenů Propionibacterium
Soubor 75 nepatogenních kmenů Propionibacterium byl podroben screeningu na přítomnost původních plazmidů. Většina kmenů byla získána ze .sbírky BCCM/LMG (Ghent, Belgium), a některé kmeny pocházely ze sbírky ATCC (Rockville, Md., USA) nebo DSM. (Braunschweig, Německo). Screening se prováděl izolací plazmidů v malém měřítku. Baktérie byly nejprve kultivovány anaerobně v médiu MRS . po dobu 48 hodin při teplotě 30 °C.
Plazmidy pak byly purifikovány z baktérií postupem, který byl původně vypracován pro E. coli*, s určitými, modifikacemi: Buňky z 5 ml kultivačního média byly opláchnuty v roztoku 25% sacharózy v 50mM Tris-HCl, pH 8, pak « ·· ··-· ·· • ♦ · · · · · · · · ·
99 9 9 9 9 9
999 99 99 999 99 999 resuspendovány v 250 μΐ roztoku TENS (25% sacharóza + 50mM NaCl + 50 mM Tris-HCl + 5mM EDTA, pH 8), obsahujícím mg/ml lysozymu (Boehringer Mannheim), a pak inkubovány 20 až 30 minut ve 37 °C. Bakteriální buňky pak byly lyžovány v 500 μΐ 0,2N NaOH/1% SDS (2 až. 5 minut inkubovány. na ledu) . Po přidání 400 μΐ 3M NaAc, pH 4,8 (inkubace 5 minut na ledu), a následné extrakci směsí fenol/chloroform byla DNA precipitována přidáním isopropanolú.
DNA pak byla analyzována elektroforézou na 1% agarózovém gelu a vizualizována etidiumbromidem. Ačkoliv většina kmenů byla negativní, tj . neobsahovaly žádný vlastní vnitřní plazmid, z kmenů, které . byly pozitivní, většina obsahovala velký' plazmid (velikosti 20 kb nebo větší).' Menší plazmidy byly pozorovány u šesti kmenů. Z nich P. jensenii LMG16453, P. acidipropionici ATCC4875, P. acidipropionici LMG16447 a nespecifikovaný kmen Propionibacterium (LMG16550) obsahovaly plazmidy velikosti 6 až 10 kb. Dva kmeny P. freudenreichii LMG16545 a P. freudenreichii LMG16546) ukázaly identický profil dvou plazmidů. Jeden plazmid byl velký (přesná velikost nebyla určena) a druhý plazmid byl menší, přítomný ve větším počtu a měl velikost 3,6 kb. Tyto plazmidy velikosti 3,6 kb z kmenů LMG16545 a LMG16546 byly vybrány pro další analýzy.
Příklad 2
Analýza vlastních plazmidů z kmenů LMG16545 a‘LMG16546
Plazmidy velikosti 3,6 kb byly izolovány z obou kmenů a dále purifikovány pomocí centrifugace na hustotním gradientu CsCl-étidiumbromid11.. Z obou preparátů byly provedeny omezené restrikčni mapy, které se ukázaly jako shodné11. Restrikčni mapa plazmidů velikosti 3,6 kb je uvedena na obr. 1. restrikčni enzymy a T4 ligáza byly od firem New England Biolabs nebo GIBCO BRL.. Plazmid velikosti 3,6 kb z kmenu LMG16545 (dále označovaný jako p545) byl radioaktivně označen a použit v Southernově hybridizaci. Hybridizačni podmínky byly 0,2 x SSC, 65°C. Reagoval stejně dobře s DNA extrakty z obou kmenů, LMG16545 a LMG16546, což ukazuje na blízkou příbuznost těchto kmenů, zatímco extrakty plazmidové
DNA z P. acidipropionici pR501B velikosti 6,6 kb,
Sekvence
DNA dideoxyribonukleotidů pomocí autoamatického Biosystems 373A, tato uvedena jako sekvence provedena na plazmidů,
ATCC4875, nesoucí plazmid pTYI nebo nereagovaly.
plazmidů byla určena užitím
značených fluorescenčním barvivém
zařízení pro sekvéncováni Applied
sekvence je zde v seznamu sekvencí
id. .č. 1... Analýza sekvence byla
který byl linearizován EcoRI a vložen
do plazmidů pBluescript SKII + DNA (Stratagene, La Jolla, Ca., . (
USA) předtím naštěpeného také EcoRI. Počítačová analýza sekvence pomocí programu BLAST ukázala homologie s proteinem, který se účastní replikace plazmidů z několika organismů bohatých na GC (např. pAL5000 kódující repA and repB. z Mycobacterium fortuitum8' 14 vykazuje 28 až 30% identitu a 34 až 38% podobnost s předpokládaným replikačním proteinem z plazmidů p545, pXZ 10142 z Corynebacterium glutamicum [PIR S32701] je jiným. příkladem plazmidů kódujícího replikační protein homologní s předpokládaným replikačním proteinem p545). Výsledky srovnávání, homologních sekvencí a sekvencí z databází jsou podrobně shrnuty v příkladech 7
Přiklad 3
Konstrukce kyvadlového vektoru E. coli/'Propionibacterium
Plazmid pBR322 z E. coli byl štěpen EcoRI a Aval a menši fragment takto získaný (velikosti 1,4 kb a nesoucí gen rezistence k tetracyklinu) byl nahrazen syntetickou duplexní (dvouřetězcovou) DNA. Syntetické duplexy DNA byly konstruovány tak, aby spojily EcoRI a Aval konce a přitom »' poskytly řadu restrikčních míst:
5’- AATTCAAGCTTGTCGACGTTAACCTGCAGGCATGCGGATCCGGTACCGAT
ATCAGATCT - 3' (sekvence id. č. 4)
3' - GTTCGAACAGCTGCAATTGGACGTCCGTACGCCTAGGCCATGGCTATAGT
GTAGAAGCC - 5' (sekvence id. č. 5)
Tímto způsobem byla vnesena rozpoznávací místa pro následující restrikčními enzymy:
EcoRI (obnoveno), HindlII, Sáli, Hpal, Pstl, Sphl, BamHI, Acc6SI, EcoRV, BglII (Aval nebylo obnoveno).
Syntetická DNA byla ligována s velkým fragmentem a ligačni směs byla přenesena do E. coli (byla užita T4 ligáza). Byl tak získán plazmid požadovaného složení (pBR322ÁI). Vícečetné klonovací místo může být využito pro vloženi selekčního markéru a také plazmidu p545 DNA.
Dále příklad popisuje, jak byla provedena konstrukce kyvadlového plazmidu E. coli/Propionibacterium nesoucího rezistenci k erytromycinu.
Acc65I fragment velikosti 1,7 kb z klastru genů biosyntézy erytromycinu ze Saccharopolyspora erythraea NRRL2338 nesoucí gen rezsitence k erytromycinul5, 2, -byl.
• ·· 9* .« ··· • · · · 9 ··· ···· • ·· 9 9 · · ·· • 9 · Λ 9 9 9 9 9 9· • · · e · · ·> ·9 • 99 ·· «· ··· ·♦··· vložen do plazmidu pBR322Al linearizovaného Acc65I. Nově připravený konstrukt nazvaný pBRES, byl linearizován EcoRV • v a ligován s p545 DNA, která byla předtím naštěpena BsaBI. Byly pak nalezeny transformanty E. coli. nesoucí vektor se správným inzertem v obou orientacích. Výsledné plazmidové vektory byly označeny pBRESP36Bl a pBRESP36B2 (obrázky 2a a 2b) .
Konstrukty plazmidových vektorů byly také připraveny s p545 DNA linearizovanou v jiném restrikčním místě ležícím vně předpokládaného replikačního úseku, zejména AÍwNI. Pro tyto konstrukce musel být vektor pBRES opatřen vhodným klonovacím místem. Byl zkonstruován adaptor, složený ze dvou komplementárních oligonukleotidů následujících sekvencí (sekvence id. č. 6 a 7):
5'- GTACCGGCCGCTGCGGCCAAGCTT -3'
5'- GATCAAGCTTGGCCGCAGCGGCCG -3'
Nasednutí těchto oligonukleotidů vytvořilo fragment dvouřetězcové DNA· s kohezivními konci Acc65I 5 a SgTII, který navíc obsahoval vnitřní místo Sfrl, které poskytlo kompatibilitu s plazmidem p545 naštěpeným AlwNI. Tento adaptor byl klonován do pBRES mezi místo BglII a proximální místo Acc65l. Takto získaný vektor pBRES-Sfi byl pak štěpen Sfil a ligován do plazmidu p545 naštěpeného AlwNI. Transformace E. coli poskytla transformanty se správným vektorem, jak bylo potvrzeno restriční analýzou. Takto připravený vektor byl označen pBRESP36A (obr. 2).
Přiklad 4
Transformace
Propi onibact eri um
E. coli/Propionibacterium kyvadlovými vektory
Tento příklad popisuje
Propionibacterium freudenreichii transformaci bakterií kmenu
ATCC 6207 vektorem v médiu SLB (médium do stacionární fáze pBRESP36B.
Bakteriální buňky byly kultivovány obsahující laktát sodný17) při 30 °C až a pak bylo kultivační médium naředěno 1:50 SLB. Po inkubaci přibližně 20 hodin ve 30 °C v exponenciální růstové fázi sklizeny v chladném čerstvým médiem byly buňky (nyní a důkladně propláchnuty roztoku 0,5M sacharózy. elektroporačním pufrem, lmM acetátem draselným, opláchnuty pufrovaná resuspendovány v tomtéž elektroporačním původního objemu. V průběhu celého postupu
Pak byly buňky jednou což je 0,5M sacharóza pH
5,5, . a nakonec pufru v 1/100 byly buňky drženy na ledu.
Pro elektropořaci (na zařízení od firmy BIÓRAD) bylo 80 až 100 μΐ suspenze buněk smícháno s přibližně 1 μg DNA (nebo menším množstvím) v chlazené 1 nebo 2 mm elektroporačni kyvetě . a pak byly aplikovány elektrické pulzy. Optimální parametry byly 25kV/cm při rezistanci 200 Ω a kapacitanci 25 pF. Avšak i použití nižšího a vyššího napětí (také při 100 Ω) poskytlo transformanty.
Bezprostředně po aplikaci pulzu bylo k suspenzi buněk přidáno 900 μΐ SLB obsahujícího 0,5M sacharózu a buňky pak byly inkubovány 2,5 až 3 hodiny ve 30 °C ještě před tím, než byly vysety ve vhodném ředění na SLB/agarové plotny obsahující 0,5M sacharózu a 10 μg/ml erytromycinu. Po 5 až 7
«.·· 4 4 '4 4· • 44 4 4 444 4 44
4 4 4 4 4 4 4 dnech inkubace ve 30 °C v anaerobních podmínkách byly detekovány transformanty.
• *
Použití DNA izolované z E. coli DH5a (Promega) vedlo k transformační účinnosti 20 až 30 transformant na 1 μg DNA. lOx až lOOx vyšší účinnosti bylo dosaženo, když DNA byla izolována z kmenu E. coli JM110 (dam, dcm) . Transformace E. coli byla provedena podle instrukcí firmy BIORAD.
Transformanty obsahovaly autentický vektor, nerozlišitelný od původní DNA použité pro transformaci ATCC6207. To bylo prokázáno restrikční analýzou plazmidové DNA izolované z transformant preparací v malém měřítku, jak bylo již zmíněno výše.
Vektory byly přítomny výlučně jako autonomně se replikující plazmidy. Analýza celkové izolované DNA Southernovou hybridizací13 ukázala, že chromozomální DNA nehybridizovala s vektorovou DNA použitou jako sonda, což ukazuje, že nedošlo k žádné integraci plazmidové DNA do chromozómu.
Transformace byla také úspěšná s vektory pBRESP36B2 a pBRESP36A, což ukazuje, že funkčnost těchto vektorů není závislá na orientaci p545 nebo na užitém klonovacím místě. Také v tomto případě byla autenticita vektorů potvrzena.
Kromě toho transformace kmenu P. freudenreichii ATCC6207 DNA izolovanou z transformant Propionibacterium vedla k 105až 10s-násobnému zvýšení transformační účinnosti ve srovnání s transformační účinností dosaženou s DNA izolovanou z E. coli DH5a.
Transformace dalšího kmenu P.freudenreichii LMG16545 (tentýž kmen, ze kterého byl získán plazmid p545) byla se stejnou účinností jako u ATCC kmenů.
Výsledky transformací a vliv na produkci vitamínu Bi2 jsou ukázány v následující tabulce.
identifikace transformovaný vitamín Bi2
kmenu plazmid (mg/g sušiny)
COB 1 pBRES36COB 0, 57
COB2 pBRES36COB 0, 67
COB3 pBRES36COB 0, 83
COB4 pBRES36COB 0,68
COBS pBRES36COB 0,69
COB6 pBRES36COB 0,61
COB7 pBRES36COB 0, 53
COB8 pBRES36COB 0,64
COB9 pBRES36COB 0, 50
C0B10 pBRES36COB 0, 74
recATCC6207 pBRESP36B2 0.54
Osm z deseti transformant poskytlo až o 50 % vyšší obsah vitamínu BX2 než kontrolní kmen.
Příklad 5
Konstrukce plazmidového vektoru obsahujícího gen cohA
Tento příklad popisuje konstrukci a aplikaci plazmidového vektoru ke zvýšeni syntézy vitamínu Βχ2 (kobalaminu) v kmenu P. freudenreichii ATCC6207.
Promotorový úsek genu kódujícího rezistenci k erytromycinu v Saccharopolyspora erythraea2,2 byl připraven pomocí PCR užitím následujících oligonukleotidových primerů (sekvence id. č. 8 a 9):
Přímý primer: (5' - 3') AAACTGCAGCTGCTGGCTTGCGCCCGATGCTAGTC
Zpětný primer: (5' -3') AAACTGCAGCAGCTGGGCAGGCCGCTGGACGGCCTGCCCTCGAGCTCGT CTAGAATGTGCTGCCGATCCTGGTTGC
Takto připravený PCR fragment obsahoval místo AlwNI na 5'-konci následované autentickou promotorovou oblastí a úsekem prvních 19 aminokyselin kódující sekvence genu rezistence k erytromycinu, aby byla zajištěna správná iniciace transkripce a translace. Na 3'-konci jsou místa Xbal a Xhol (pro vložení genu cobA v dalším kroku), terminační sekvence downstream (po směru transkripce) od genu rezistence k erytromycinu a místo AlwNI.
PCR produkt .byl štěpen AlwNI. a klonován do pBRESP36B2 parciálně štěpeného AlwNI. Ze dvou míst AlwNI přítomných v pBRESP36B2 je pouze místo přítomné ve specifickém úseku p545 vhodné pro vložení fragmentu. Byly získány transformanty E. coli nesoucí očekávaný konstrukt označený pBRES36pEt. tento vektor byl použit pro další konstrukce, jak bude popsáno dále.
Kódující sekvence cobA, tj . genu kódujícího» uroporfyrinogen III methyltransferázu, byla připravena pomocí PCR z kmenu Propionibacterium freudenreichii ATCC6207, užitím následujících oligonukleotidóvých primerů (sekvence id. č. 10 a 11) :
Přímý: (5'- 3')
CTAGTCTAGACACCGATGAGGAAACCCGATGA • ·· 00 '· ·0 •00« 0 000 · 00
000 00 0 00 0 • 00 0 · · 0 0 · 0 00 · · 0
Zpětný: (5’- 3') 'CCCAAGCTTCTCGAGTCAGTGGTCGCTGGGCGCGCG
Amplifikovaný gen cobA nese místo Xbal na N-konci kódujícího úseku a místa HindlII a Xhol na C-konci kódujícího úseku.
Funkčnost tohoto cobA genu byla ověřena klonováním PCR produktu jakožto Xbal-HindlII fragmentu do vektoru pUC18 a následnou transformací do E. coli kmen JM109. Transfomanty s funkčním genem cobA vykazovaly jasně červenou fluorescenci při ozáření UV světlem. Plazmid izolovaný z těchto transformant byl štěpen Xbal a Xhol a ligován do stejně naštěpeného pBRESP36B2 a použit pro transformaci E. coli. DNA z několika transformant pak byla analyzována štěpením restrikčními enzymy a elektroforézou na agarózovém gelu. Bylo zjištěno, že transformanty obsahovaly. v expresním vektoru správný inzert. Tento nový vektor byl označen pBRES36COB. Tento vektor byl poté přenesen do P. freudenreichii ATCC6207 způsobem již výše popsaným. Deset transformant bylo analyzováno a bylo zjištěno, že nesou vektor pBRES36COB, který byl nerozlišitelný od původního vektoru použitého pro transformaci, jak ukázala restrikční analýza. U těchto deseti transformant byla stanovena hladina vitamínu Βχ2' následujícím způsobem:
Zmrazené kultury Propionibacterium transformant 1 až 10 a kontrolního kmenu obsahujícího pouze vektorový plazmid pBRBSP36B2 byly inokulovány do lOOml kultivačních lahví obsahujících 50 ml média BHI (Brain Heart Infusion, Difco) a inkubovány 72 hodin ve 28 QC bez třepání. Z těchto předběžných kultur byly 4 ml přeneseny do 200 ml produkčního média následujícího složení: Difco kvasničný extrakt 15 g/1, laktáf sodný 30 g/1, KH2PO4 0,5g/l, MnS04 0, 01. g/1, a CoCl2 • ·
- 32 0,005 g/1, do 500ml protřepávané kultivační lahve a inkubovalo se 56 hodin ve 28 C bez třepání a pak 48 hodin na rotační třepačce (New Brunswick) při 200 rpm.
Titry vitamínu B12 byly měřeny pomocí HPLC známým postupem. Devět z deseti transformant vykazovalo přibližně o 25 % vyšší tvorbu vitamínu Bi2 než kontrolní kmen.
Příklad 6
Stabilita plazmidů
Všechny tři. kyvadlové vektory pBRESP36A, pBRESP36B 1 a pBRESP36B2 byly stabilně udržovány po více než 30 generací kultivace příslušných transformant. Přitom,nedošlo ke ztrátě genu rezistence k ervtromycinu, jak se dá soudit z vyhodnocení porovnání životaschopnosti na selektivních (tj. obsahujících erytromycin). a neselektivních agarových plotnách. Strukturní stabilita plazmidů v transfromantách byla stanovena izolací plazmidové DNA po 30 - generacích a restrikčním mapováním jak bylo popsáno výše. Výsledkem bylo, že byly pozorovány pouze stejné fragmenty jako u autentického plazmidů.
Příklad 7
Analýza sekvenční homologie v databázi polypeptidu kódovaného prvním otevřeným pro predikci čtecím rámcem (sekvence id. č. 2) • · · 9 - · · · · • · 9 · ·· 9 999
9 9 9 9 99
9 9 9 9 9 9 99
99999 99 99999999
- 33 MDSFETLFPESWLPRKPLASAEKSGAYRHVTRQRALELPYIEANPLVMQSLV
ITDRDASDADWAADLAGLPSPSYVSMNRVTTTGHIVYALKNPVCLTDAARR
RPINLLARVEQGLCDVLGGDAS YGHRITKNPLS TAHAT L'WG PADAL YELRA
LAHTLDEIHALPEAGNPRRNVTRSTVGRNVTLFDTTRMWAYRAVRHSWGG
PVAEWEHTVFEHIHLLNETIIAD
Výše znázorněná sekvence 227 aminokyselin (ORF1) byla přiřazena a porovnána s několika dalšími proteinovými sekvencemi (cíl NBRF-PIR, verze PIR R52.0 březen 1997, parametry cut-off 45 a KTUP 2).
S proteinem z plazmidu pAL 5,000 (J50052) z Mycobacterium fortuitum byla nalezena 37,1% shoda v. úseku 194 aminokyselin (INIT 167,292). S proteinem z Corynebacterium glutamicum (532701) byla nalezena 32,0% shoda v úseku 125 aminokyselin (INIT 125, 116). S proteinem
ColE2 z E. coli (SO4455). byla nalezena 29,9% shoda v úseku 221 aminokyselin (INIT 86, 259).
Příklad 8
Analýza sekvenční homologie v databázi pro predikci
polypeptidu kódovaného druhým otevřeným čtecím rámcem
(sekvence id. č. 3)
MTTRERLPRN GYSIAAAAKK LGVSESTVKR WTSEPREEFV ARVAARHARI
RELRSEGQSM RAIAAEVGVS VGTVHYALNK NRTDA
Výše proteinu proteiny, parametrů znázorněná aminokyselinová (ORF2) byla také a sice stejným jako v předchozím porovnána programem příkladu sekvence s několika druhého dalšími stejných
7. Tato sekvence je za užiti
dlouhá pouze 85 aminokyselin.
Při srovnání sekvence 0RF2 s proteinem z Mycobacterium fortuitum (532702) byla nalezena 53)3% shoda v úseku 75 aminokyselin (INIT 207, 207).
Příklad 9
Funkční analýza plazmidu p545
Aby bylo možné další zlepšování vektorového systému, byly plazmidové funkce esenciální pro replikaci a stabilitu vymezeny podrobněji pomocí delecí rozsáhlých úseků původního plazmidu p545. Výsledkem byl menší klonovací vektor, který umožňuje použít vektorový systém založený na p545 pro klonováni větších fragmentů DNA.
Pro tento účel byl vektor pBRESP36A (Obr. 2) štěpen SstlI and Bell, což poskytlo fragmenty velikostí 1,7 a 6,5 kb. Fragment velikosti 1,7 kb, ve skutečnosti AIwNI-BciT fragment velikosti 1,6 kb z plazmidu p545 byl nahrazen syntetickým DNA duplexem (dvoušroubovicovou DNA) vytvořeným ze sekvencí id. č. 12 a 13 s kompatibilními konci SstlI a Bell a řadou rozpoznávacích míst pro restrikční enzymy.
sekvence id. č. 12: 5'- GGAGATCTAGATCGATATCTCGAG -3' sekvence id. č. 13: 5'- GGAGATCTAGATCGATATCTCGAG -3'
Tímto způsobem byla vnesena následující místa:
SstlI (obnoveno), BglII, Xbal, Clal, EcoRV, Xhol, (Bell nebylo obnoveno).
Ligační směs byla transformována do E. coli a byly • φφ · · φ φ φ φφφ · · φ φ φ · φ φ • ·· · · · · · φ φ φφφ φ φ φφ φ φφφ φφ φφ φφφ φφ φφφ selektovány transformanty obsahující vektor očekávaného složeni. Vektor byl označen pBRESAÁS-B. Následná úspěšná transformace P. freudenreichii ATCČ6207 . tímto vektorem ukázala, že úsek velikosti 1,6 kb mezi místy AlwNI a Bell v p545 není esenciální pro replikaci plazmidů. Další delece byla provedena odstraněním úseku velikosti 240 bp mezi místy Sáli a Bell v plazmidů p545. Toho bylo dosaženo štěpením pBRESAÁS-B enzymy Sáli se Sstl a Sstl s Xhol a pak izolací fragmentu Sall-Sstl velikosti 1,3 kb a fragmentu Sstl-Xhol velikosti 6,6 kb. Fragmenty pak byly ligovány a ligační směs byla transformována do P. freudenreichii ATCC6207, což poskytlo četné transformanty. Nově získaný konstrukt nazvaný pBRESAÁS-S byl izolován a jeho struktura byla potvrzena restrikčním mapováním.
Bylo tak zjištěno, že všechny esenciální- informace pro replikaci plazmidů p545 leží na' fragmentu velikosti 1,7 kb vymezeném restrikčními místy Sáli a A2wNI a zahrnujícím predikované replikační proteiny kódované ORF1 a ORF2, a že fragment velikosti 1,8 kb může být odstraněn, aniž by došlo k poškození replikace nebo stability plazmidů.
Přiklad 10
Exprese genu rezistence k chloramfenikolu z Corynebacterium
Gen rezistence k chloramfenikolu (cml) z Corynebacterium19 byl identifikován jako gen kódující protein exportující chloramfenikol. Tento gen byl vložen do kyvadlového vektoru Propionibacterium - E. coli pBRESP36B2. Vektor byl pak štěpen BglII s HindlII a BglII s Hpal. Byly izolovány fragmenty BglII - HindlII velikosti 2,9 kb a BglII-Hpal 5,2 kb. fragment obsahující gen cml včetně jeho vlastního promotoru byl získán štěpením PvuII a HindlII a izolováním fragmentu velikosti 3,3 kb. vektorově specifický fragment a fragment obsahující gen byly ligovány.. Konce PvuII a Hpal jsou tupé, takže vložení genu cml současně vedlo k obnovení genu ermE původního vektoru. Ligační směs pak byla transformována do E. coli a bylo selektováno 20 transformant, kde vektor obsahoval správný inzert cml. Vektor byl označen pBRESBCM.
Transformace P. freudenreichii ATCC6207 tímto vektorem a selekce na plotnách obsahujících 10 μg/ml· erytromycinu nebo 5 μg/ml chloramfenikolu poskytla kolonie rezistentní k erytromycinu a chloramfenikolu, což ukázalo, že kromě genu rezistence k erytromycinu (ukázaném jíž dříve v kyvadlovém Propionibacterium-Ecoli vektoru) byl v Propionibacterium exprimován také gen . rezistence k chloramfenikolu. Transformanty mohly být kultivovány v tekutém médiu obsahujícím chloramfenikol v koncentraci až 20 pg/ml.
Příklad 11
Exprese genu lipázy (gehA) z P. acnes
Pro ilustraci účinnosti. klonování a exprese extracelulárního proteinu užitím expresního systému podle předkládaného vynálezu byl vybrán gen gehA z P. acnes19.
Vektor pUL6001 nesoucí gen gehA na Xhol fragmentu byl štěpen Xhol a byl izolován fragment velikosti 2,7 kb obsahující požadovaný gen. Vektor pBRESAÁS-B (z příkladu 9) byllinearizován Xhol a konce byly defosforlyovány telecí intestinální fosfatázoů, aby se zabránilo spojení vlastních konců (selfligaci). Linearizovaný vektor a fragment obsahující gen gehA byly ligovány a ligační . směs byla transformována do E. coli. Transformanty byly analyzovány restrikčními enzymy na přítomnost správného rekombinantního plazmídu, který byl označen pBRESALIP. Tento plazmid byl pak přenesen do P. freudenreichii ATCC6207. Transformanty byly podrobeny screeningu na expresi lipázového genu, a sice na •agarových plotnách obsahujících tributyrin jakožto indikátor zvýšené exprese lipázy. Transformované P. freudenreichii nesoucí pBRESALIP ukázaly významně větší aureolu v tomto testu ve srovnání s netransformovaným kmenem nebo kmenem transformovaným původním vektorem.
Φ ·φ φφ φ φφ φ φφφ φ φ · φφ φ φ φφ φ φφ φ φ φ φ φ φ φ φφ φφ · φφ φ • ΦΦ φφ φφ φφφ φφ φφφ
CITOVANĚ PUBLIKACE
1. Altschul et al, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)
2. Bibb e/αΖ., Gene 38,215 (1985)
3. Bibb et al., Mol. Microbiol. 14(3), 533 (1984)
4. Bimboim and Doly, Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979)
5. Blanche, Anal. Biochem. 189, 24 (1990)
6. DeMan ef a/, J. Appl. Bacteriol. 36, 130 (1960)
7. Deveraux et cZ,Nucleic Acids Research. 12:387-395 (1984)
8. Labidi et al, Plasmid 27, 130 (1992)
9. Rehberger and Glatz, Appl.Envíron. Microbiol. 59, 83 (1990)
10. Rossi et al, Res. Microbiol. 147, 133 (1996)
11. Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)
12. Sattler eí aZ, J. Bací. 177, 1564 (1995)
13. Southem, J. Mol. Biol. 98, 503 (1975)
14. Stolt and Stoker, Microbiol. 142, 2795 (1996)
15. Thompson <?/aZ, Gene 20, 51 (1982)
16. Uchijama and Weisblum, Gene 38,103 (1985)
17. de Vries et al, J. Gen. Microbiol. 71,515 (1972)
18. Tauch etal, Plasmid 40(2): 126 (1998)
19. Miskin etal, Microbiol 143: 1745 (1997)
PŘEHLED UVEDENÝCH SEKVENCÍ
1. Sekvence plazmidu LMG 16545 (CBS 101022), 3,6 kb.
2. Aminokyselinová sekvence proteinu ORF1 (303 zbytků, báze
273 až 1184) .
3. Aminokyselinová sekvence proteinu ORF2 (85 zbytků, báze
181 až 1438).
4. až 13. DNA sekvence primerů/oligonukleotidů • ·· »* ·· · · ·· • ♦· · · • · · · ·· • · · ·· ··· ·· ··
- ·99'
99 • ·· * · · · • 99
99999
SEZNAM SEKVENCÍ
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 3555 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: kruhová
(li) TYP MOLEKULY: DNA (genomová)
(Iv) PŮVODNÍ ZDROJ: (A) ORGANISMUS: Propionibacterium (B) . IZOLAT: CBS 101022 LMG 16545 freudenreichii
(ix) DALŠÍ ZNAKY: (A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (C) POZICE: 273.. .1184 (D) DALŠÍ INFORMACE: gen=ORFl
(ix) DALŠÍ ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: ODS (B) POZICE: 1181...1438 (D) DALŠÍ INFORMACE: gen=0RF2 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 1:
GTCGACCCTG ACAGCCGGCG AGCAGTTCAG GCGAAGATCG CACAGCTGCG CGAGGAACTA
GCCGCAATGC 120 CCGAACACGC CCCAGCCATC CCTTGGAGCA GGTGGCAGCG TCAGGGGAGT
CGGGGGATGT TTGGCAGGGG ATGTGGAAAG AGAGTTCGCT TTGCTCACAT GGCTCAACCG
180
ggtaactaac 240 TGATATGGGG TCTTCGTCGC CCACTTTGAA CACGCCGAGG AATGGACCAC
GCTGAACGTG ACTCGCATGC TTCACTGCAT GT ATG GAT TCG TTC GAG ACG TTG
293 Met Asp Ser Phe Glu Thr Leu
1 5
TTC 341 Phe CCT GAG AGC TGG CTG CCA CGC AAG CCG CTG GCG TCA GCC GAG AAG
Pro Glu Ser Trp Leu Pro Arg Lys 10 15 Pro Leu Ala Ser Ala 20 Glu Lys
TCT GGG GCG TAC 1 CGG CAC ! GTG ACT CGG CAG AGG GCG CTG GAG CTG CCT
389
Ser Gly Ala Tyr Arg His Val Thr Arg Gin Arg Ala Leu Glu Leu Pro
25 30 35
TAC ATC GAA GCG AAC CCG TTG GTC ATG CAG TCC TTG GTC ATC ACC GAT
437
Tyr Ile Glu Ala Asn Pro Leu Val Met Gin Sér Leu Val Ile Thr Asp
40 45 50 55
CGA GAT GCT TCG GAT GCT C-AC TGG GCC GCA GAC CTC GCT GGG CTG CCT
485
Arg Asp Ala Ser Asp Ala Asp Trp Ala Ala Asp Leu Ala Gly Leu Pro
60 65 70
TCA CCG TCC TAC GTG TCC ATG AAC CGT GTC ACG ACC ACC GGA CAC ATC
533
Ser Pro Ser Tyr Val Ser Met Asn Arg Val Thr Thr Thr Gly His Ile
75 80 85
GTC TAT GCC TTG AAG AAC CCT GTG TGT CTG ACC GAT GCC GCG CGG CGA
581
Val Tyr Ala Leu Lys Asn Pro Val Cys Leu Thr Asp Ala Ala Arg Arg
90 95 100
CGG CCT ATC AAC CTG CTC GCC CGC GTC GAG CAG GGC CTA TGC GAC GTT
629
Arg Pro Ile Asn Leu Leu, Ala Arg Val Glu Gin Gly Leu Cys Asp Val
105 110 115
CTC GGC GGC GAT GCA TCC TAC GGG CAC CGG ATC ACA AAG AAC CCG CTC
677
Leu Gly Gly Asp Ala Ser Tyr Gly His Arg Ile Thr Lys Asn Pro Leu
120 125 130 135
AGC . ACC GCC CAT GCG . ACC CTC TGG GGC CCC GCA GAC GCG CTC TAC GAG
725
Ser 1 Thr . Ala i His' Ala ' Thr Leu Trp Gly Pro Ala Asp Ala Leu Tyr Glu
140 145 150
CTG CGC GCC CTC GCA CAC ACC CTC GAC GAG ATC CAC GCA CTG CCG GAG
773
Leu Arg Ala Leu Ala His Thr Leu Asp Glu Ile His Ala Leu Pro Glu
155 160 165
GCA GGG AAC CCG CGT CGC AAC GTC ACC CGA TCA ACG GTC GGC CGC AAC
821
Ala Gly Asn Pro Arg Arg Asn Val Thr Arg Ser Thr Val Gly Arg Asn
170 - 175 180
• 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 000 0 000 • 00 0 0 0 0 0 0
0 * 0 0 0 » 0 0
000 00 *0 · · · 00 0 0 0
GTC ACC 869 Val Thr CTG Leu TTC GAC ACC ACC CGC ATG TGG GCA TAC CGG GCC GTC CGG Arg
Phe Asp Thr Thr 190 Arg Met Trp Ala Tyr Arg 195 Ala Val
185
CAC TCC TGG GGC GGC CCG GTC GCC GAA TGG GAG CAC ACC GTA TTC GAG
917
His Ser 200 Trp Gly Gly Pro Val Ala 205 Glu Trp Glu His Thr Val 210 Phe Glu 215
CAC ATC CAC CTA CTG AAC GAG ACG ATC ATC GCC GAC GAA TTC GCC ACA
965
His Ile His Leu Leu Asn Glu Thr Ile Ile Ala Asp Glu Phe Ala Thr
220 225 230
GGC.CCC CTC GGC TTG AAC GAA CTT AAG CAC TTA TCT CGA TCC ATT TCC
1013
Gly Pro Leu Gly Leu Asn. Glu Leu Lys His Leu Ser Arg Ser Ile Ser
235 240 245
CGA TGG GTC TGG CGC AAC TTC ACC CCC GAA ACC TTC CGC GCA CGC CAG
1061
Arg Trp Val Trp Arg Asn Phe Thr Pro G1U Thr Phe Arg Ala Arg Gin
250 255 260
AAA GCG ATC AGC CTC CGT GGA GCA TCC AAA GGC GGC AAA GAA GGC GGC
1109
Lys Ala Ile Ser Leu Arg Gly Ala Ser Lys Gly Gly Lys Glu Gly Gly
265 270 275
CAC AAA GGC GGC ATT GCC AGT GGC GCA TCA CGG CGC GCC CAT ACC CGT
1157
His Lys Gly Gly Ile. Ala Ser Gly Ala Ser Arg Arg Ala His Thr Arg
280 285 290 295
CAA CAG TTC TTG GAG GGT CTC TCA TGACCACACG TGAACGTCTC CCCCGCAACG
1211
Gin Gin Phe : Leu Glu Gly Leu Ser
300
GCTACAGCAT CGCCGCTGCT 1271 GCGAAAAAGC TCGGTGTCTC CGAGTCCACC GTCAAGCGGT
GGACTTCCGA GCCACGCGAG GAGTTCGTGG CCCGCGTTGC CGCACGCCAC GCGCGGATTC
1331
GTGAGCTCCG CTCGGAGGGT CAGAGCATGC GTGCGATTGC TGCCGAGGTC GGGGTTTCCG
1391
TGGGCACCGT GCACTACGCG CTGAACAAGA ATCGAACTGA CGCATGACCG TAACGCCGCA
1451
CGATGAGCAT TTTCTTGATC GTGCACCGCT TGGCACTACG TTCGCGTGCG GTTGCACAGT 1511 ·.
• ·* · * · ····· * · »·· · · · ···»·· · ·
- 42 • · · ·· · · · ··· ·· · · · · » · · ·
GCGCGCCACG TTCTTATCCT GCGGCCATTG TGGCTACAGC CAATGGGGGG CATCAGCAAC 1571
GGACGTTGAA CCCGGTGGGC AAGTGTTACT CAGGGGGACA TGCCCAGTCT GCGGCGCTCG 1531
GATTGACGGT ATGGCAGTCG TGCATGCGGC CCCACCGTCA AACTCATTCA GGTATCAGTG 1591
AGAACCCTCA TGGCACCCCC TCGTGACACG TTCTCGTTGC GATCAGCTGC TGTGCGTGCG 1751
GGCGTGAGCG TTTCTACGCT GCGGCGCAGG AAATCAGAGC TTGAGGCTGC.CGGAGCGACG
1811
GTAGACCCGT CCGGTTGGGT GGTGCCACTG CGTGCACTCA AGGTCGTTTT TGGGGTGTCA 1871
GATGAGACCT CGAATGCGCC CGGTCATGAC GCTGAGTTAG TGGCGCAGCT GCGCTCTGAG
1931
AACGAGTTTT TACGGCGTCA GGTCGAGCAG CAGGCGCGCA CGATCGAACG GCAGGCTGAG
1991
GCACACGCGG TGGTCTCAGC GCAGCTCACA CGGGTTGGCC AGCTTGAGGC CGGCGACGCA
2051
GCAGCACCGA CACTGGCACC CGTTGAAAGG CČGGCTCCGC GACGGCGGTG GTGGCAGCGT
2111
CGGTAGCGGT CAGGATCGCT CTGGCGTGAC GAGTGTGTCT GGCAGTGCGA ACAGTTGCTC
2171
GACCAGTGGC AGCAGAAGCG AGATCGCTGC GTGGTGCTGT TCCTCGGTCA GTTCGTCGAG
2231
GACTGGCGGG TCTTGCTGCG TCCAGCCGAT CGCCTCGGCG GCCAAGGTCA GTTCCAAGCT
2'291
GTGCCAACGC ACACGCCCCT CGGCTGACAG CTGAGTCTCG AACTGTGCAA CTGGACCGGC
2351
CGGAAGATGC ACGTTGCCGA GGTCGTGAGT GGCCAAGCGC ACGTCAAAGA GTGCTGCTTC
2411
GTAGCCGCGC AGAAATGGCA GTGCTCGGTC GATTCGGATC GGCCTGCCCA GGTACATTCC.
2471
GGGCCGCTTG ATGAACGCCT CCGCGTAGAA GCGCACCGTT CTCGGCCCGG CCTCGTGATC
2531
TGTCACTGTG CACGCTCCTC TCGATGGTTC TCGACGCTAC CGGAGACCAC CGACGTTCAT
- 43 2591
GCCCAGCGCA GCGACCTGAA AGGACCAAGC CGAGTTAGCC GTGCTAACCG TATAGCTTGC 2651
TCCGTCGCCT CTGAGGGCAA CCACCTGCGC AGCAGGTGGG CGGCAGCCCG CGCGCAAGCG 2711
CCTACCGGGT TTGGGCACAG CCCATAAATC AACGCCTCCG GTGTTGAAGC GATCGTGTGT 2771
CACGATTGCT ATGCTTGCTA CCCCTTCAGG GTTTTCGTAT ACAČAAATCA AGTTTTTTCG 2831
TATACGCTAA TGCCATGAGT GAGCÁTCTAC TGCACGGCAA GCCCGTCACC AACGAGCAGA 2891
TTCAGGCÁTG GGCAGACGAG GCCGAGGCCG GATACGACCT GCCCAAACTC CCCAAGCCAC 2951
GGCGCGGACG CCCGCCCGTA GGAGACGGTC CGGGCACCGT CGTACCCGTG CGTCTCGACG 3011 .
CGGCCACCGT TGCCGCTCTC ACAGAACGAG CAACAGCCGA GGGCATCACG AACCGTTCAG 3071 .
ACGCGATCCG AGCCGCAGTC CACGAGTGGA CACGGGTTGC CTGACCTCCA CGACTCAGCA 3131
CGCAAGCACT ACCAACGAGA CCGGCTCGAC GACACGGCCG TGCTCTACGC GGCCACCCAC 3191
GTTCTCAACT CCCGGCCACT CGACGACGAA GACGACCCGC GCCGCTGGCT CATGATCGGA 3251
ACCGACCCAG CAGGCCGCCT ACTCGAACTC GTCGCACTGA TCTACGACGA CGGCTACGAA 3311
CTGATCATCC ACGCAATGAA AGCCCGCÁCC CAATÁCCTCG ACCAGCTCTA ACCAAGAAAG 3371
GAACCTGATG AGCGACCAGC TAGACAGCGA CCGCAACTAC GACCCGATGA TCTTCGACGT 3431
GATGCGCGAG ACCGCGAACC GCGTCGTCGC CACGTACGTT GCATGGGAAG ATGAAGCCGC 3491
TGATCCCCGC GAGGCTGCGC ACTGGCAGGC CGAGCGATTC CGCACCCGGC AČGAGGTGCG 3551
CGCC 3555
- 44 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 303 aminokyselin (B) TYP: aminokyseliny (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 2:
Met Asp Ser Phe Glu Thr Leu Phe Pro Glu Ser Trp Leu Pro Arg Lys
1 5 10 1S
Pro Leu Ala Ser Ala Glu Lys Ser Gly Ala Tyr Arg His Val Thr Arg
20 25 30
Gin Arg Ala Leu Glu Leu Pro Tyr Ile Glu Ala Asn Pro Leu Val Met
35 40 45
Gin Ser Leu Val Ile Thr Asp Arg Asp Ala Ser Asp Ala Asp Trp Ala
50 55 60
Ala Asp Leu Ala Gly Leu Pro Ser Pro Ser Tyr Val Ser Met Asn Arg
65 70 75 80
Val Thr Thr Thr Gly His Ile Val Tyr Ala Leu Lys Asn Pro Val Cys
85 90 95
Leu Thr Asp Ala Ala Arg Arg Arg Pro. Ile Asn Leu Leu Ala Arg Val
100 105 110
Glu Gin Gly Leu Cys Asp Val Leu Gly Gly Asp Ala Ser Tyr Gly His
115 120 125
Arg Ile Thr Lys Asn Pro Leu Ser Thr Ala His Ala Thr Leu Trp Gly
130 135 140
Pro 145 Ala Asp Ala Leu Tyr Glu 150 Leu -Arg Ala Leu Ala His 155 Thr Leu Asp 160
Glu Ile His Ala Leu Pro Glu Ala Gly Ásn Pro Arg Arg Asn Val Thr
165 170 175
Arg Ser Thr Val Gly Arg Asn Val Thr Leu Phe Asp Thr Thr Arg Met
180 185 190
Trp Ala Tyr Arg Ala Val Arg His Ser Trp Gly Gly Pro Val Ala Glu
195 200 205
Trp Glu His Thr Val Phe Glu His Ile His Leu Leu Asn Glu Thr Ile
210 215 220
Ile 225 Ala Asp Glu Phe Ala 230 Thr Gly Pro Leu
His Leu Ser Arg Ser Ile Ser Arg Trp Val
245 250
Glu Thr Phe Arg Ala Arg Gin Lys Ala Ile
260 265
Ser Leu Arg Gly Ala Ser
270
• • · • • • • · · 99 • · ·· • * • · 99· 9 • · · · 9 9 9 • 9 · 9 9 999 • 9 9 • 9 9 9 9 9 · • 9 9 • 9 9 9
Gly Leu Asn Glu Leu Lys
235 240
Trp Arg Asn Phe Thr Pro 255
Lys Gly Gly Lys Glu Gly Gly His Lvs Gly Gly Ile Ala Ser Gly Ala
27S 230 285
Ser Arg Arg Ala His Thr Arg Gin Gin. Phe Leu Glu Gly Leu Ser
290 295 30.0 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE':
(A) DÉLKA: 85 aminokyselin (B) TYP: aminokyseliny (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 3:
Met Thr Thr Arg Glu Arg Leu Pro Arg Asn Gly Tyr Ser Ile Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ala Lys Lys Leu Gly Val Ser Glu Ser Thr Val Lys Arg Trp Thr
20 25 30
Ser Glu Pro Arg Glu Glu Phe Val Ala Arg Val Ala Ala Arg His Ala
35 40 45
Arg Ile Arg Glu Leu Arg Ser Glu Gly Gin Ser Meť Arg Ala Ile Ala
50 55 6 0.
Ala Glu Val Gly Val Ser Val Gly Thr Val His Tyr Ala Leu Asn Lys
65 70 75 80
Asn Arg Thr Asp Ala
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 59 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (0) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (syntetická) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 4:
aattcaagct tgtcgacgtt aacctgcagg catgcggatc cggtaccgat atcagatct (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 59 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (syntetická) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 5:
CCGAAGATCT GATATCGGTA CCGGATCCGC ATGCCTGCAG GTTAACGTCG ACAAGCTTG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (syntetická) (xi). POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 4:
GTACCGGCCG CTGCGGCCAA GCTT
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 24 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (syntetická) (xi). POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 7.:
' GATCAAGCTT GGCCGCAGCG GCCG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 35 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (syntetická) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 8:
AAACTGCAGC TGCTGGCTTG CGCCCGATGC TAGTC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 76 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (syntetická) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 9:
AAACTGCAGC AGCTGGGCAG GCCGCTGGAC GGCCTGCCCT CGAGCTCGTC TAGAATGTGC
TGCCGATCCT GGTTGC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 32 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (syntetická) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 10:
CTAGTCTAGA CACCGATGAG GAAACCCGAT GA (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 36 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (syntetická) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 11:
CCCAAGCTTC TCGAGTCAGT GGTCGCTGGG CGCGCG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (syntetická) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 12:
GGAGATCTAGATCGATATCTCGAG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (syntetická) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 13:
GATCCTCGAGATATCGATCTAGATCTCCGC

Claims (36)

1. Polynukleotid obsahující sekvenci schopnou selektivně hybridizovat se
a) sekvencí id. č. 1 nebo sekvencí k ní komplementární,
b) sekvencí z plazmidu o velikosti 3,6 kb z Propionibacterium freudenreichii CBS 101022,
c) sekvencí z plazmidu o velikosti 3,6 kb z Propionibacterium freudenreichii CBS 101023, nebo
d) sekvencí kódující polypeptid, který obsahuje sekvenci id. č. 2 nebo 3, nebo aminokyselinovou sekvencí, která je v podstatě homologní k jedné z těchto sekvencí nebo je fragmentem jedné z těchto sekvenci.
2.
Polynukleotid, .kterým je autonomně se replikující plazmid, který zůstává .
extrachromo zomální uvnitř hostitelské buňky, přičemž z endogenního plazmidu tento plazmid
Propioni bacterium, je odvozen obsahuje heterologní gen schopný buňce.
exprese v který hostitelské
3. Polynukleotid podle nároku 1, replikuje v hostitelské buňce.
který se autonomně
4. Polynukleotid podle nároku 3, kde hostitelská buňka je
Propioni bacterium.
5. Polynukleotid podle nároku . 4, kde Propionibacterium je
Propionibacterium freudenreichii.
6. Polynukleotid podle kteréhokoliv z předchozích nároků, »
který je schopný selektivně hybridizovat s jednou nebo více sekvencemi ze sekvence id. č. 1, které jsou nutné pro autonomní replikaci v Propionibacterium.
7. Polynukleotid podle nároku 1, který obsahuje buďto fragment velikosti 1,7 kb ze sekvence id. č. 1 vymezený restrikčními místy Sáli a AlwNI nebo fragment vymezený nukleotidy 1 až 1750 sekvence id. č. 1.
8. Vektor, který obsahuje polynukleotid podle kteréhokoliv z předchozích nároků.
9. Vektor podle nároku 8, který je plazmid.
10. Vektor podle nároku 8 nebo 9, který navíc obsahuje selekční markér.
11. Vektor podle kteréhokoliv z nároků 8 až 10, který se autonomně replikuje v E. coli.
12. Vektor podle kteréhokoliv z nároků 8 až 11, který je expresní vektor.
13. Vektor podle nároku 12, který obsahuje endogenní gen z Propionibacterium nebo heťerologní gen operativně spojený s kontrolní sekvencí, která je schopna zajistit expresi genu.'
14. Vektor podle nároku 13, kde gen je gen cobA.
15. Vektor podle nároku 13, kde heterologni gen kóduje polypeptid, který je léčivem pro člověka nebo zvíře.
16. Polypeptid, který obsahuje sekvenci id. č. 2 nebo 3, nebo sekvenci s ní v podstatě homologní, nebo fragment jedné z těchto sekvencí, nebo je kódován polynukleotidem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7.
17. Hostitelská buňka, která obsahuje heterogenní polynukleotid nebo vektor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15, nebo která je transformována nebo transfekována vektorem podle kteréhokoliv z nároků 13 až 15.
18. Hostitelská buňka podle nároku 17, která je baktérie.
19. Hostitelská buňka podle nároku 18, která . je
Propionibacterium nebo E. coli. ·
20. Způsob přípravy hostitelské buňky podle . kteréhokoliv z nároků 17 až 19 v y z n a č u j i c i se t i m, že obsahuje krok transformace nebo transfekce hostitelské buňky polynukleotidem nebo vektorem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15.
21., Způsob přípravy polypeptidu nebo jiné sloučeniny v y z n a č1 u j i c i s e tím, že obsahuje krok, kdy se kultivují nebo fermentují hostitelské buňky podle kteréhokoliv z nároků 17 až 19 v podmínkách, které umožní expresi nebo tvorbu polypeptidu nebo jiné sloučeniny.
22. Způsob podle nároku 21 vyznačuj ící se tím, že je to fermentační. proces, kdy hostitelské buňky jsou kultivovány v aerobních nebo anaerobních podmínkách.
23. Způsob podle nároku 21 nebo 22 vyznačující se tím, že exprimovaný polypeptid nebo vytvářená sloučenina se získávají z hostitelských buněk.
24. Způsob podlé nároku 23 vyznačující se t i m, nebo že polypeptid peptidáza, a nebo je proteáza, amyláza, sloučenina je vitamin Bi2 lipáza 25. Způsob ' podle kteréhokoliv z nároků 21. > až 24 vyznačuj í c i se tím, že polypeptid je
secernován z hostitelských buněk.
26. Způsob podle nároku 25 vyznačující se tím, že polypeptid je exprimován na povrchu hostitelské buňky a/nebo polypeptid je antigen nebo imunogen.
27. Polypeptid nebo sloučenina připravená způsobem podle kteréhokoliv z nároků 20 až 26.
28. Způsob . . výroby vitaminu B12 (kobalaminu) vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se kultivují hostitelské buňky podle kteréhokoliv z nároků 17 až 19 v podmínkách, kdy se tvoří vitamín Βχ2 a případně dle potřeby krok, kdy se izoluje vitamín.
29. Vitamín Bi2 vyrobený způsobem podle nároku 28.
30. Polypeptid podle nároku 27 pro použití k léčení člověka nebo zvířete.
31. Hostitelská buňka podle kteréhokoliv z nároků 17 až 19 pro použití k léčení člověka -nebo zvířete nebo pro použiti v krmivu pro zvíře.
32. Použití hostitelských buněk podle kteréhokoliv z nároků 17 až 19 nebo polypeptidů nebo sloučenin podle nároku 27 buďto k výrobě sýra nebo v sýrařství.
33. Použití hostitelských buněk podle kteréhokoliv z nároků 17 až 19 nebo.polypeptidů nebo sloučenin podle nároku 27 k výrobě potravin nebo v krmivěch pro zvířata.
34., Potravinový výrobek vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid nebo sloučeninu podle nároku 27 nebohostitelskou buňku podle kteréhokoliv z nároků 17 až 19.
35. Potravinový výrobek podle nároku 34 v y z n a č u j i c i se t i m, že je určenke konzumaci člověkem (např. <ýn, klobása) nebo zvířetem.
36. Způsob přípravy sýra nebo jiných fermentovahých potravin, vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se použijí hostitelské buňky podle kteréhokoliv z nároků 17 až 19.
37. Způsob podle nároku 36, vyznačující se t i m, že hostitelské buňky se užívají místo a nebo navíc k užití bakterií mléčného kvašení.
38. Způsob podle nároku 36 nebo 37 v y z na č u j i c i se 'tím, že hostitelská buňka je Propionibacterium.
CZ20004842A 1998-06-25 1999-06-25 Polynukleotid, vektor a hostitelské buňky k produkci rekombinantních proteinů a k výrobě potravin CZ20004842A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP98305033 1998-06-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20004842A3 true CZ20004842A3 (cs) 2001-11-14

Family

ID=8234893

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20004842A CZ20004842A3 (cs) 1998-06-25 1999-06-25 Polynukleotid, vektor a hostitelské buňky k produkci rekombinantních proteinů a k výrobě potravin

Country Status (24)

Country Link
US (1) US6830901B1 (cs)
EP (1) EP1090120A2 (cs)
JP (1) JP2002518039A (cs)
KR (1) KR20010053141A (cs)
CN (1) CN1314941A (cs)
AU (1) AU4615899A (cs)
BG (1) BG105078A (cs)
BR (1) BR9911511A (cs)
CA (1) CA2331924A1 (cs)
CZ (1) CZ20004842A3 (cs)
FR (1) FR2780733A1 (cs)
HR (1) HRP20010017A2 (cs)
HU (1) HUP0102820A3 (cs)
ID (1) ID28046A (cs)
IL (1) IL140461A0 (cs)
IS (1) IS5783A (cs)
NL (1) NL1012434C2 (cs)
NO (1) NO20006616L (cs)
PL (1) PL345519A1 (cs)
SK (1) SK19892000A3 (cs)
TR (1) TR200100351T2 (cs)
WO (1) WO1999067356A2 (cs)
YU (1) YU82600A (cs)
ZA (1) ZA200007786B (cs)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002518039A (ja) 1998-06-25 2002-06-25 デーエスエム・ナムローゼ・フェンノートシャップ プロピオニバクテリウムベクター
US20040235120A1 (en) * 2001-08-22 2004-11-25 Andreas Kunkel Method for producing vitamin b12
TWI328612B (en) 2002-07-25 2010-08-11 Dsm Ip Assets Bv Genes and their encoded polypeptides involved in the biosynthetic pathway of vitamin b12, vectors and host cells comprising the genes, and process for producing vitamin b12
BR0314681A (pt) * 2002-09-27 2005-08-02 Dsm Ip Assets Bv Gene ativador da transcrição para genes envolvidos na sìntese da cobalamina
KR101489723B1 (ko) * 2008-03-14 2015-02-06 인하대학교 산학협력단 전기천공법을 이용한 프로피오니박테리움 아크네스의형질전환 조건의 최적화
JP2013503647A (ja) * 2009-09-09 2013-02-04 ブラスケム ソシエダッド アノニマ ｎ−プロパノールを製造するための微生物および方法
EP3158054B1 (en) 2014-06-17 2025-02-19 Crown Laboratories, Inc. Genetically modified bacteria and methods for genetic modification of bacteria
WO2017122197A1 (en) * 2016-01-11 2017-07-20 3Plw Ltd. Lactic acid-utilizing bacteria genetically modified to secrete polysaccharide-degrading enzymes
US11504404B2 (en) 2016-02-24 2022-11-22 Crown Laboratories, Inc. Skin probiotic formulation
AU2021297215A1 (en) 2020-06-23 2023-02-09 Crown Laboratories, Inc. Probiotic skin formulations

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02312590A (ja) * 1989-05-29 1990-12-27 Nippon Oil Co Ltd プラスミドｐＴＹ１
EP0647717A1 (en) * 1993-10-06 1995-04-12 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method of producing vitamin B12
JPH0856673A (ja) 1994-08-29 1996-03-05 Nippon Oil Co Ltd ウロポルフィリノーゲンｉｉｉ メチルトランスフェラーゼをコードするｄｎａ 及びこれを用いるビタミンｂ１２の生産方法
JP2002518039A (ja) 1998-06-25 2002-06-25 デーエスエム・ナムローゼ・フェンノートシャップ プロピオニバクテリウムベクター

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20010017A2 (en) 2001-12-31
SK19892000A3 (sk) 2001-07-10
TR200100351T2 (tr) 2001-07-23
ID28046A (id) 2001-05-03
YU82600A (sh) 2004-03-12
NL1012434C2 (nl) 2000-01-04
BG105078A (en) 2001-09-28
CN1314941A (zh) 2001-09-26
HUP0102820A3 (en) 2003-09-29
BR9911511A (pt) 2001-12-11
EP1090120A2 (en) 2001-04-11
CA2331924A1 (en) 1999-12-29
AU4615899A (en) 2000-01-10
IS5783A (is) 2000-12-21
IL140461A0 (en) 2002-02-10
KR20010053141A (ko) 2001-06-25
PL345519A1 (en) 2001-12-17
US6830901B1 (en) 2004-12-14
NO20006616D0 (no) 2000-12-22
WO1999067356A3 (en) 2000-02-10
HUP0102820A2 (hu) 2001-11-28
JP2002518039A (ja) 2002-06-25
FR2780733A1 (fr) 2000-01-07
NO20006616L (no) 2001-02-26
ZA200007786B (en) 2001-12-21
WO1999067356A2 (en) 1999-12-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Rajakumar et al. Use of a novel approach, termed island probing, identifies the Shigella flexneri she pathogenicity island which encodes a homolog of the immunoglobulin A protease-like family of proteins
US6100388A (en) Lactobacilli harboring aggregation gene as a vaccine delivery vehicle
AU684556B2 (en) Lactic acid bacterial suppressor mutants and their use as selective markers and as means of containment in lactic acid bacteria
CN103261213A (zh) 乳球菌CRISPR-Cas序列
JP2002511752A (ja) 生弱毒ワクチン
Fu et al. Development of a chromosome-plasmid balanced lethal system for Lactobacillus acidophilus with thyA gene as selective marker
JP3294288B2 (ja) 乳酸桿菌由来の新規なプラスミドｐＢＵＬ１ 及びその誘導体
CZ20004842A3 (cs) Polynukleotid, vektor a hostitelské buňky k produkci rekombinantních proteinů a k výrobě potravin
JP3553065B2 (ja) 挿入プロモーター含有の組換え乳酸菌とその構築方法
Dubail et al. Listeriolysin O as a reporter to identify constitutive and in vivo-inducible promoters in the pathogen Listeria monocytogenes
AU658145B2 (en) Bacteriophage resistant recombinant bacteria
Kreft et al. Virulence gene clusters and putative pathogenicity islands in listeriae
TWI221854B (en) Lac shuttle vectors, kit for expression of a heterologous gene and DNA vaccine carrier containing the same
US20040014221A1 (en) Plasmid originated from bifidobacterium, recombinant expression vector using the plasmid and transformation method
CN109735477B (zh) 单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株制备及其应用
JPWO2009150856A1 (ja) 酸素耐性付与遺伝子及びその利用
US6331140B1 (en) Mobile genetic elements as tools for genetic modification of L. delbrueckii or L. helveticus
EP0972835A1 (en) Propionibacterium vector
MXPA01000184A (en) Propionibacterium vector
CN101008014B (zh) 乳酸乳球菌食品级载体
KR20040072545A (ko) 비피도박테리움 롱검 ｍｇ1 유래 신규 플라스미드를함유하는 셔틀벡터
JPH05176776A (ja) 乳酸球菌由来の新規なプラスミドｐＳＹ１ 及びその誘導体
JP2010500884A (ja) ビフィドバクテリウム属菌における遺伝子再構築（ＧｅｎｅｔｉｃＲｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）
DHARMRAJ " MOLECULAR CLONING OF LACTOBACILLUS CRYPTIC PLASMID INE. Coir
HK1217108B (en) Methods for constructing antibiotic resistance free vaccines