CN101008014B - 乳酸乳球菌食品级载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乳酸乳球菌食品级载体pNI1，其核苷酸序列为SEQ IDNO：3；还公开了另一种乳酸乳球菌食品级载体pNI2，其核苷酸序列为SEQ IDNO：4。本发明的乳酸乳球菌食品级载体，能克服现有表达载体的抗生素抗性标记的缺点。

Description

乳酸乳球菌食品级载体

技术领域

本发明涉及乳酸乳球菌载体，尤其涉及一种本身不能产生乳链菌肽、不具有乳链菌肽抗性的乳酸乳球菌的食品级载体pNI1和pNI2。

背景技术

乳酸菌(LAB)是一类在食品中应用最广泛的重要工业菌株，它包括乳酸乳球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌等十几个属。由于它早就被人类用于制作泡菜、酱油，生产奶酪和酸奶等而家喻户晓。其被公认为是安全的(generally regardedas safe，GRAS)食品级微生物。乳酸菌在医药、工业、农业等与人类生活密切相关的重要领域有很高的应用价值，主要作用有：1)控制肠道感染；2)增加某些食物的营养价值；3)控制血清胆固醇水平；4)改善乳糖代谢；5)诱导体内特异性及非特异性免疫；6)抗肿瘤活性等。

乳酸乳球菌(Lactococcus lactis，L.lactis)是乳酸菌的模式种，是一种在食品及医药工程领域具有重要应用前景的食品级微生物。近年来，乳酸乳球菌的基因克隆和表达系统引起了人们的广泛注意，这不仅是因为其可以作为奶类工业发酵的菌母培养物，具有商业价值，还由于以下原因使其具有重要的理论研究意义和实际应用潜力。首先，乳酸乳球菌中存在大量的染色体外因子，如质粒和噬菌体，尤其可在许多乳酸菌和其他宿主中都具有功能的自动传播的接合质粒复制子，这为发展乳酸乳球菌基因克隆和载体系统提供了极好的材料。其次，乳酸乳球菌很容易在实验室中生长和操作，对营养及环境要求不高，适合工业化发酵生产的要求，可用现代发酵技术在廉价的培养基中进行大规模的培养。再次，乳酸乳球菌具有分泌外源蛋白的能力，使许多异源的酶和蛋白质可表面表达或分泌出胞外，易于纯化，适合用作蛋白质或初级和次级代谢产物表达的宿主。而且由于乳酸乳球菌本身是一种有益菌，其产品可不经过纯化直接食用而不会对人体产生毒害。要实现基因工程生物制品的产业化，其表达系统须具备二个条件，易纯化和表达量高，乳酸乳球菌表达系统具备这二个条件。

依靠乳酸乳球菌内源性质粒开发了大量的克隆载体、整合载体和表达载体，实现了益生元等有益健康的外源物质在乳酸菌中的表达。但同几乎所有的表达系统一样，利用乳酸乳球菌等食品级微生物构建的克隆及表达载体也往往含有一个或多个抗生素抗性筛选标记，如氯霉素、红霉素、四环霉素等。这些标记对在基因工程中筛选合适的转化子并保持改良基因的选择压力相当重要，但抗生素基因的可转移性将危害生物安全，限制了乳酸乳球菌基因表达系统在食品及医药等工业的应用。而目前研究较多的诱导型基因表达载体系统也存在诱导信号往往是不安全的环境刺激因子，如丝霉素C等不安全问题，有效解决这些问题成为利用微生物基因工程安全、高效的表达药物、疫苗、激素、生长因子和酶等生物活性物质的关键。

现在国内外越来越多的将解决方法集中于构建食品级基因表达系统，尤其是高效表达的诱导性基因表达系统。其一般要求如下：(1)载体必须是食品级的，不得含有非食品级功能性DNA片段；即食品级载体必须由来自同源宿主或密切相关的GRAS微生物的DNA组成。(2)表达宿主必须是安全的、特性清楚而稳定的食品级微生物，如乳酸球菌、乳酸杆菌及其它已在食品工业中得到长期而广泛应用的菌株。必须用先进的分类方法去鉴定宿主菌，用适当的分子生物学技术，如DNA序列分析、PCR扩增，DNA杂交等手段去确认表达宿主的遗传组成。此外，食品级系统的宿主菌在生产状况下，在食品中和进人人的肠胃及消化道后必须是足够稳定的。(3)诱导物必须是食品级的，如乳糖、蔗糖，嘌呤、嘧啶、nisin等可被人食用的物质。

目前，已从乳酸菌和其它在食品工业中具有很长安全利用时间的细菌中成功发展了许多食品级乳酸菌选择标记基因。根据选择方法的不同，可将食品级选择标记分为糖类利用标记、营养缺陷型的标记和具有抗性或是免疫性的标记。其中，具有抗性或免疫性的标记，是利用宿主菌本身对某种蛋白没有抗性或免疫性，在载体上携带该抗性/免疫性基因，可以实现重组表达子的筛选。目前研究前景较好的是利用乳酸乳球菌对乳链菌肽(nisin)、Lactacin F、Acidocin A和Acidocin B等细菌素的免疫性特征作为特定宿主的选择标记，其中，又以nisin研究的最多。

Nisin是乳酸乳球菌乳酸亚种(L.lactis subsp.lactis)某些菌株在生长过程中产生的一种羊毛硫细菌素。其能有效地抑制许多引起食品腐败的革兰氏阳性菌(Gram positive，G⁺)，尤其对芽孢的萌发有强烈的抑制作用，对食品的防腐保鲜有重要意义。Nisin是世界上公认的无毒的天然食品防腐剂，英国Aplin公司从9个国家251份牛奶样品中检测到其中109份样品中含有可产生nisin的乳酸链球菌。说明这种物质早就天然存在于人们日常饮用的牛奶中。而且几十年来，其随着食品被人们摄入，并没发现毒性问题。Nisin是一种多肽物质，食后在消化道中很快被α-胰蛋白酶水解成氨基酸而失活，食用含nisin的液体10min之后，在人体唾液中检测不出nisin，不存在干涉肠道有益微生物的正常构成而改变肠道内的正常菌群，以及引起其他抗菌素出现的抗药性。有关病理学及毒力学研究包括致癌性、存活性、再生性、血液化学、肾功能、脑功能等，都证明nisin对人体安全无毒。Nisin产生菌株本身对nisin具有免疫性，该免疫性由4个功能相关的免疫基因(nisI、nisF、nisE、nisG)共同决定，表现出对nisin的高效耐受性。其中nisI编码由245个氨基酸残基组成，分子量为32kDa的蛋白，具有细菌脂蛋白性质，该蛋白在该免疫性中发挥的作用最大，而且NisI蛋白本身就具有良好的免疫功能。而对于某些本身不产生nisin的乳酸乳球菌，他们对nisin也具有抗性，不同于免疫蛋白的是，这种抗性是由抗性基因nsr所编码的nisin抗性蛋白Nis^R所产生。

由于乳链菌肽是一种食品级分子，所以nisin免疫基因nisI，和nisin的抗性基因nsr，可用作载体选择标记。将nisI或nsr基因克隆到特定的乳球菌质粒上，可作为多种乳酸菌食品级抗性筛选标记，在含有nisin的培养基筛选到nisin抗性重组子。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种乳酸乳球菌食品级载体，此种载体能克服现有表达载体的抗生素抗性标记的缺点；其选择使用对人体和环境安全的食品级选择标记取代抗生素标记，从而建立食品级选择标记的载体，克服以抗生素为选择压力的基因表达系统存在的缺陷。

为了解决上述技术问题，本发明提供两种乳酸乳球菌食品级载体；一种是乳酸乳球菌食品级载体pNI1，其核苷酸序列为SEQ ID NO：3；另一种是乳酸乳球菌食品级载体pNI2，其核苷酸序列为SEQ ID NO：4。

本发明的乳酸乳球菌食品级载体pNI1，其含有来自乳酸乳球菌LacA的nisI选择标记，来自乳酸乳球菌的内源质粒pSH71的复制子(repA，repC和ori⁺)和引入的多克隆位点，该载体所有的基因序列均为食品级的，因此，该载体为食品级载体。

本发明的乳酸乳球菌食品级载体pNI2，其含有来自乳酸乳球菌LacR的nsr选择标记，来自乳酸乳球菌的内源质粒pSH71的复制子(repA，repC和ori⁺)和引入的多克隆位点，该载体所有的基因序列均为食品级的，因此，该载体为食品级载体。

本发明的两种乳酸乳球菌食品级载体pNI1和pNI2，分别来自乳酸乳球菌LacA和LacR的nisI或nsr基因选择标记；还来自乳酸乳球菌内源性质粒pSH71的复制子(repA，repC和ori⁺)，并引入部分多克隆位点即BglII，EcoRI，PstI，NcoI，NotI，SalI，XbaI等。

本发明的两种乳酸乳球菌食品级载体pNI1和pNI2，其构建方法包括以下步骤：

1)、设计扩增乳链菌肽免疫基因nisI和抗性基因nsr；

2)、设计扩增乳酸乳球菌内源质粒pSH71的全载体序列；

3)、将获得的pSH71的全载体序列分别与nisI基因和nsr基因连接，获得食品级载体pNI1/1和pNI2/1；

4)、设计引物分别扩增pNI1/1和pNI2/1的全载体序列，并通过引物引入多克隆位点BglII，EcoRI，PstI，NotI，NcoI，SalI，XbaI等。

5)、获得食品级载体pNI1和pNI2，这两个载体中均含有多克隆位点BglII，EcoRI，PstI，NotI，NcoI，SalI，XbaI等。

上述构建方法中nisI基因来自乳酸乳球菌LacA菌株，nsr基因来自乳酸乳球菌LacR菌株，并通过PCR方法获得的；质粒的复制区等来自于乳酸乳球菌质粒pSH71，并通过PCR方法获得的。

本发明的两种乳酸乳球菌食品级载体pNI1和pNI2，其载体中所有的DNA片段都是食品级的，因此整个载体是食品级的；而且表达宿主也是食品级的，可以用于表达表达安全的蛋白。

本发明构建的食品级载体pNI1具有nisin的免疫基因nisI，该基因表达免疫蛋白NisI，pNI2具有nisin的抗性基因nsr，该基因表达抗性蛋白Nis^R，这两种蛋白均能够抵抗一定浓度的nisin。其宿主菌乳酸乳球菌Lac6不能够在含有nisin的培养基上生长。将食品级载体pNI1和pNI2导入Lac6后，Lac6/pNI1和Lac6/pNI2菌株能够在含有一定浓度的含有nisin的培养基上生长。

前述的乳酸乳球菌的食品级载体的构建方法，其中所述的获取食品级选择标记nisI基因是根据乳酸乳球菌LacA的nisI基因序列特异性引物对(1)和(2)，以LacA为模版，通过PCR扩增获得的；所述的获取食品级选择标记nsr基因是根据乳酸乳球菌LacA的nsr基因序列特异性引物对(3)和(4)，以LacR为模版，通过PCR扩增获得的；所述的分别将nisI和nsr基因插入到pSH71质粒载体中是根据pSH71质粒序列设计序列特异性引物对(5)和(6)，以pSH71质粒为模版，通过PCR扩增获得质粒序列，然后分别将质粒序列和nisI，或nsr序列酶切，回收目的片段，然后连接。连接产物转化乳酸乳球菌Lac6菌株，在含nisin的GM17琼脂平板上筛选转化子，从平板上挑取部分菌落提取质粒鉴定，并将获得的质粒命名为pNI1/1和pNI2/1。所述的引入多克隆位点是通过pNI1/1和pNI2/1载体序列，设计引物对(7)和(8)，并在引物中引入酶切位点，通过PCR扩增整个载体序列，并自连转化获得。

前述的乳酸乳球菌的食品级载体的构建方法，其中所述引物1(5PnisI)为：5′-cgGGATCC ATGAGAAAATATTTAATACT-3′，其含有BamHI限制性内切酶位点，引物2(3PnisI)为5′-ctCTCGAG CTAGTTTCCTACCTTCGTTGCA-3′，其含有XhoI限制性内切酶位点；所述的引物3(5PnisR)为5′-cgGGATCCATGAAAATAGGTAAGCGCATTT-3′，其含有BamHI限制性内切酶位点，引物4(3PnisR)为5′-ctCTCGAG TTACTTTATTTGAGATTTTATC-3′，其含有EcoRI限制性内切酶位点；所述的引物5(5PSH1)为5′-ctCTCGAGAGGGGGCTTTTATTTTGGTTTGATG-3′，其含有XhoI限制性内切酶位点，引物6(3PSH1)为5′-cgGGATCC TCGACTTTCGTCAGGGGGGCTTTTA-3′，其含有BamHI限制性内切酶位点；所述的引物7(5PSH2)为5′-GTCGACCATGGTCGATTTTTTATTAAAACGTC-3′，其含有SalI和NcoI限制性内切酶位点，引物8(3PSH2)为5′-CTGCAGAATTCTAGATCT AAATTATATTGGCAAATTATAA-3′，其含有PstI，EcoRI，XbaI和BglII限制性内切酶位点。

乳酸菌的许多特性是由其质粒上的基因编码的，利用这一特性，人们可以在食品及医药工程领域中构建食品级表达系统。乳酸乳球菌能经受胃肠液考验，本身不攻击肠粘膜且不引起强的免疫反应，在人体内可以存活2～3d，具有重要的健康促进作用及非特异性的抗感染能力，以其表达系统作为基因工程疫苗载体已经引起人们的极大兴趣。但是，已有报道的疫苗表达载体系统大多数是以抗生素作为外源性基因稳定表达的压力。近年来，人们选择使用对人体和环境安全的食品级选择标记取代抗生素抗性标记，建立食品级选择标记的载体。

探索将传统载体的抗生素抗性基因改造成食品级选择标记，选用安全的食品级诱导因子，并采用乳酸菌等有益菌作为宿主系统表达外源基因，在功能食品、医疗保健、微生态制剂、化妆品及人工口服疫苗等领域的应用具有诱人前景。

具体实施方式

(一)本发明实验中使用和涉及到的细菌菌株和质粒

1.Lactococcus lactis LacA(乳链菌肽产生菌，染色体中含有nisI免疫基因，根据其对nisin的免疫特性从新鲜牛奶中分离。)

2.Lactococcus lactis LacR(乳链菌肽抗性菌，染色体中含有nsr nisin抗性基因，根据其对nisin的抗性特性从新鲜牛奶中分离。)

3.Lactococcus lactis Lac6(对nisin没有免疫性/抗性的乳酸乳球菌)

4.E.coli DH5α(属于公知技术)

5.pSH71(属于公知技术)

(二)本发明实验中使用和涉及的培养基的配制

1.LB培养基

蛋白胨        10.0g

酵母粉        5g

NaCl          10g

加蒸馏水定容至1000ml，用NaOH调节pH值至7.6-7.8，分装，121℃高压灭菌20min，4℃储存备用，固体培养基添加1.8％琼脂。

2.GM17培养基(Terzaghi BE et al.，Appl.Environ.Microbiol.1975，29：807～813)

聚蛋白胨      5.0g

胰蛋白胨        5.0g

牛肉膏          5.0g

葡萄糖          5.0g

酵母粉          2.5g

维生素C         0.5g

MgSO₄·7H₂O     0.25g

β-磷酸甘油钠   19.0g

加蒸馏水定容至1000ml，pH 7.0，121℃高压灭菌20min。

3.SR培养基培养基

在GM17培养基的基础上，加入0.3mol/L蔗糖和60IU/ml nisin。

4.G-SGM17B培养基

在GM17培养基的基础上，加入0.3mol/L蔗糖和2％的甘氨酸。

5.SR培养基

在GM17培养基的基础上，加入0.3mol/L蔗糖、20mmol/L的MgCl₂和2mmol/L的CaCl₂。

大肠杆菌使用LB培养基，而乳酸乳球菌使用GM17培养基，如果需要，大肠杆菌使用抗生素的终浓度为氨苄青霉素100μg/ml，乳酸乳球菌使用氯霉素的终浓度为5μg/ml，nisin终浓度为60IU/ml.

(三)本发明实验中使用和涉及的主要试剂

Taq DNA Polymerase购自上海生物工程技术服务有限公司。

质粒提取试剂盒、割胶回收试剂盒、PCR试剂盒、PCR清洗试剂盒、pUCm-T Vector连接试剂盒均购自上海生物工程技术服务有限公司。

限制性内切酶BglII，EcoRI，PstI，NotI，NcoI，SalI，XbaI，XhoI，BamHI等购自TaKaRa生物工程有限公司。

其它试剂均为国产分析纯。

(四)本发明实验中使用和涉及的主要仪器

Enppendorf Centrifuge 5415D和Beckman COULTER离心机；MettlerToledo320pH计，超声波破碎仪，LEICA Qwin图像处理与分析系统(Qwin软件、微机、Leica光学显微镜)，FeroTec Thermal cycler PCR仪，上海分析仪器厂7230型分光光度计，Eppendorf electroporator 2510电击转化仪，EPS-601型电泳仪及垂直型Hoefer miniVE vertical electophoresis system。

(五)乳酸乳球菌食品级载体pNI的具体构建步骤

1.食品级选择标记nisI基因的选择和获取

选择的nisI基因来自L.lactis，根据已经发表的L.lactis的nisI基因序列(Engelke et al.，Regulation of nisin biosynthesis and immunity in Lactococcuslactis 6F3.Appl.Environ.Microbiol.1994，60(3)，814-825)，设计一对特异性引物(引物1和引物2)，并分别在上游引物和下游引物的5′端插入EcoRI和BamHI酶切位点。以L.lactis LacA染色体DNA为模版进行PCR扩增，引物序列如下：

引物1(5PnisI)：5′-cgGGATCCATGAGAAAATATTTAATACT-3′(含有BamHI限制性内切酶位点)

引物2(5PnisI)：5′-ctCTCGAGCTAGTTTCCTACCTTCGTTGCA-3′(含有XhoI限制性内切酶位点)

PCR反应体系(50μl)：Nisin产生菌LacA基因组DNA 0.5-1.0μl，10×Taqbutter 5μl，dNTP(2.5mM)2-4μl，上游引物(5PnisI，13pmol/μl)1-2μl，下游引物(3Pnis，13pmol/μl)1-2μl，Taq-plus DNA pol.(1U/μl)0.2-0.5μl，加ddH₂O至总体积50μl。扩增条件为94℃变性1-2min，51℃复性1-1.5min，72℃延伸1.5-2.0min，30-35个循环后在72℃延伸7-10min。

2.食品级选择标记nsr基因的选择和获取

选择的nsr基因来自L.lactis，根据已经发表的L.lactis的nsr基因序列(Froseth and McKay.Molecular characterization of the nisin resistance region ofLactococcus lactis subsp.lactis biovar diacetylactis DRC3.Appl.Environ.Microbiol.1991，57(3)，804-811)，设计一对特异性引物(引物3和引物4)，并分别在上游引物和下游引物的5′端插入BamHI和XhoI酶切位点。以L.lactisLacR染色体DNA为模版进行PCR扩增，引物序列如下：

引物3(5PnisR)：5′-cgGGATCC ATGAAAATAGGTAAGCGCATTT-3′(含有BamHI限制性内切酶位点)

引物4(5PnisR)：5′-ctCTCGAGTTACTTTATTTGAGATTTTATC-3′(含有XhoI限制性内切酶位点)

PCR反应体系(50μl)：Nisin产生菌LacR基因组DNA 0.5-1.0μl，10×Taqbutter 5μl，dNTP(2.5mM)2-4μl，上游引物(5PnisI，13pmol/μl)1-2μl，下游引物(3Pnis，13pmol/μl)1-2μl，Taq-plus DNA pol.(1U/μl)0.2-0.5μl，加ddH₂O至总体积50μl。扩增条件为94℃变性1-2min，46℃复性1-1.5min，72℃延伸1.5-2.0min，30-35个循环后在72℃延伸7-10min。

3.重组质粒pUCm:nisI和pUCm:nsr的构建

nisI基因和nsr基因PCR扩增产物割胶回收，纯化，与pUCm-T载体连接，连接反应如下：nisI基因割胶回收产物1μl，pUCm-T Vector 1.0μl，10×连接酶缓冲液1μl，T4DNA连接酶(1U/μl)1μl，ddH₂O 4μl，总体积10μl。16℃连接过夜，将基因定向插入到质粒pUCm-T中。以CaCl₂法制备感受态细胞，转化E.coli DH5α。连接产物转化、感受态的制备、阳性克隆筛选、质粒DNA的提取均按文献所记载的现有技术进行。融合基因片段与质粒pUCm-T连接并导入宿主菌DH5α后，经氨苄青霉素抗性及α-互补筛选后，分别筛选阳性重组质粒，pUCm:nisI和pUCm:nsr。

用碱法提取质粒，用BigDye terminator v2.0测序试剂盒(EpicentreTeclnologies)对抽提的质粒在全自动测序仪(ABI Prim 377-18，PE公司)进行测序，获得nisIDNA序列，全长共754bp，详细序列见SEQ ID No：1，其中nisI基因序列全长共738bp，与GenBank中登录的nisI基因序列一致(Accession mumber：X76884)；获得nsr DNA序列，全长957bp，详细序列见SEQ ID No：2，其中nsr基因序列全长共957bp，与GenBank中登录的nsr基因序列一致(Accession mumber：M37002)。

4.质粒全序列pSH71的获得

以原质粒pSH71为模板，以5PSH1和3PSH1为引物，PCR扩增，其长度为2059bp。

引物5(5PSH1)：5′-ctCTCGAG AGGGGGCTTTTATTTTGGTTTGATG-3′(含有XhoI和限制性内切酶位点)

引物6(3PSH1)：5′-cgGGATCC TCGACTTTCGTCAGGGGGGCTTTTA-3′(含有BamHI限制性内切酶位点)。

PCR反应体系(50μl)：pSH71载体DNA 0.5-1.0μl，10×Taq butter 5μl，dNTP(2.5mM)2-4μl，上游引物(5PnI，13pmol/μl)1-2μl，下游引物(3PnI，13pmol/μl)1-2μl，Taq-plus DNA pol.(1U/μl)0.2-0.5μl，加ddH₂O至总体积50μl。扩增条件为94℃变性1-2min，53℃复性2min，72℃延伸2min，30-35个循环后在72℃延伸7-10min。

5.构建食品级表达载体pNI1/1和pNI2/1

将pSH71PCR产物，pUCm:nisI和pUCm:nsr分别用BamHI和XhoI限制性内切酶酶切，割胶回收目的片段，纯化，分别连接pSH71PCR产物酶切产物和nsr或nisI。连接反应体系如下：nisI/nsr基因割胶回收产物4μl，pSH71PCR产物割胶回收产物4.0μl，10×连接酶缓冲液1μl，T4DNA连接酶(1U/μl)1μl，总体积10μl。16℃连接过夜，电击转化乳酸乳球菌Lac6感受态细胞，经nisin抗性筛选后，筛选阳性重组质粒，得到食品级表达载体pNI1/1和pNI2/2。

乳酸乳球菌的感受态细胞制备及其电转化方法主要参考Holo等(Holo H，et al.Appl.Environ.Microbiol.1989；55：3119-3123)，具体实验步骤如下：

(1)将-80℃冻存的L.lactis Lac6菌种接种至GM17琼脂平板，培养24～36h，至平板上出现大小合适的单菌落。

(2)将菌接种于5ml G-SGM17B培养基中，30℃培养，过夜。

(3)将5ml培养液接种于50ml G-SGM17B培养基中，30℃培养，过夜。

(4)将50ml培养液接种于400ml G-SGM17B培养基中，30℃培养，至OD600为0.2-0.3(0.7)(大约需要3h)，4℃，4000rpm离心20min(在原始的参考文献上为5000g)，收集菌体。

(5)用400ml预冷的0.5M蔗糖/10％甘油重悬，离心，收集沉淀。

(6)冰浴15min。

(7)用200ml预冷的0.5M蔗糖/10％甘油/EDTA重悬，离心，收集沉淀。

(8)用100ml预冷的0.5M蔗糖/10％甘油重悬，离心，收集沉淀。

(9)将菌体重悬于4ml 0.5M蔗糖/10％甘油中。

(10)取40ul用于电转化(放于冰上)，其余保存于-80℃，用时冰上解冻。

(11)将40ul感受态和1ul DNA加入到电转化杯中，放于冰上。

(12)用Biorad Genepulser：2.0KV，25uF，200欧姆脉冲，一般4.5-5.0msec。

(13)加入0.96ml含有20mM MgCl2和2mM CaCl2的GM17培养基，。

(14)冰浴5min，30℃温浴1-1.5h，用SR平板复活菌。

6.构建食品级表达载体pNI1和pNI2

分别以获得的质粒pNI1/1和pNI2/1为模板，以5PSH2和3PSH2为引物，PCR扩增全载体序列，并通过引物引入酶切位点BglII，EcoRI，PstI，NotI，NcoI，SalI，XbaI，BamHI，XhoI等。分别将得到的目的片断平末端连接，电击转化乳酸乳球菌Lac6感受态细胞。

分别从两个平板上随机挑取部分菌落提取质粒，经琼脂糖凝胶电泳后分别发现有一大小约2.8kb(2799bp)和3.0kb(3018bp)的质粒条带。将这两个质粒分别以EcoRI，BamHI，BglII，NcoI限制性内切酶进行酶切，结果质粒均被切为线性，说明该质粒存在上述酶切位点，将这两个质粒分别命名为pNI1和pNI2。完整的pNI1和pNI2载体片段分别如SEQ ID No：3和SEQ ID No：4所示。

本发明构建的载体pNI1和pNI2包括3个部分，来自L.lactis LacA的nisI选择标记，或来自L.lactis LacR的nsr选择标记；来自pSH71的复制子(repA，repC和ori⁺)；和引入的多克隆位点。质粒pNI1和pNI2的选择性标记，多克隆位点和复制子均来自食品级微生物乳酸乳球菌，同时不含有任何抗生素抗性选择标记和其它外源DNA成分，因此，可以将质粒pNI1和pNI2看作为食品级载体。

本发明乳酸乳球菌的食品级载体pNI1和pNI2的有益效果：本发明建立的基于nisin抗性的乳酸乳球菌食品级载体系统同其它传统克隆载体一样，可以在此载体的基础上进行基因的克隆，但又引入了食品级选择标记而可以直接应用于食品级表达，对于乳酸菌的深层次开发利用具有极为广阔的前景。

具体应用如下：

利用这些系统将有益于人和动物的基因，如将某些营养物质(如维生素、必需氨基酸等)，某些保健和治病的药物(如抗癌药物、防衰老药物、减肥药物、避孕药物等)的基因导入到乳酸菌受体菌中，制成活菌制剂，在适当的诱导条件下表达所需成分，产生生物活性或诱导免疫应答反应。因为乳酸乳球菌食品级基因表达系统中的载体、受体及诱导物均为食品级，这种活菌制剂可以直接应用，免去了一般基因工程菌所需的烦琐、复杂的提取工艺，安全方便。同时，也为在乳酸乳球菌中进行外源性抗原基因的克隆和表达奠定了很好的基础，为发展新型、有效的疫苗表达系统提供了可靠的工具。

序列表

SEQ ID No：1

  1 cgggatccat gagaagatat ttaatactta ttgtggcctt aatagggata acaggtttat

 61 cagggtgtta tcaaacaagt cataaaaagg tgaggtttga cgaaggaagt tatactaatt

121 ttatttatga taataaatcg tatttcgtaa ctgataagga gattcctcag gagaacgtta

181 acaattccaa agtaaaattt tataagctgt tgattgttga catgaaaagt gagaaacttt

241 tatcaagtag caacaaaaat agtgtgactt tggtcttaaa taatatttat gaggcttctg

301 acaagtcgct atgtatgggt attaacgaca gatactataa gatacttcca gaaagtgata

361 agggggcggt caaagctttg agattacaaa actttgatgt gacaagcgat atttctgatg

421 ataattttgt tattgataaa aatgattcac gaaaaattga ctatatggga aatatttaca

481 gtatatcgga caccaccgta tctgatgaag aattgggaga atatcaggat gttttagctg

541 aagtacgtgt gtttgattca gttagtggca aaagtatccc gaggtctgaa tgggggagaa

601 ttgataagga tggttcaaat tccaaacaga gtaggacgga atgggattat ggcgaaatcc

661 attctattag aggaaaatct cttactgaag catttgccgt tgagataaat gatgatttta

721 agcttgcaac gaaggtagga aactagctcg agag

SEQ ID No：2

  1 cgggatccat gaaaataggt aagcgcattt tattaggtct agtggcagta tgtgctttat

 61 ttttaggaat tatctatctt tgggggtata aattcaacat atatttagta ccaccctccc

121 ctcagaagta tgttcgagtt gccttaaaaa atatggatga acttgggcta tttactgatt

181 caaaagaatg ggtagaaact aaaaaaaaga cgatagaaga aacatcaaat gctaaaaact

241 atgcagaaac aatccctttt ttacaaaaag cgattaaagt tgcaggagga aagcattctt

301 ttattgaaca tgaagaagac atatcaaaaa gaagcatgac aaaatatata aaaccaaagg

361 cagaaatcga aggcaacact ttaatattaa ctattcctga atttactgga aatgatagtc

421 aagcatctga ttacgctaat tttttagaat cttcattgca taaaaacaat tataatgggg

481 taattgttga tttgaggggg aatagaggtg gagacttatc tcctatggta ttaggattat

541 cccccctatt gcctgatgga actctattta cttatgttga taaaagtagt cattctaaac

601 ctgttgaact acaaaatgga gaaataaata gtggcgggtc atcaacaaaa ataagtgata

661 ataaaaaaat taaaaaagct cctattgctg tattaataga taataataca gggagctccg

721 gcgaattaac cgctttgtgc tttgagggaa tacctaatgt taaatttttg ggttctgatt

781 cagcaggtta tacttctgct aatcaaaccg tctatttata tgatggctca acattacaaa

841 taacttctgc ttttgtaaaa gacagaacaa ataatattta taaaaatttt cctattagtc

901 cggacattca aacaaataat gctaaaagtt ctgcaataga atggataaaa tctcaaataa

961 agtaactcga gag

SEQ ID No：3

  1 agggggcttt tattttggtt tgatgttgcg attaatagca atacgattgc aataaacaaa

 61 atgatcgatg ctgtttggca aaaaaagaaa aagtgattaa tttatatttt atttatggcg

121 ctaatttatt agcgcttttt ttgttgtcgg ctagccgact tctgatacat ttttttaagc

181 acaaaaacca cccaattttg gagtggtgtg taagtgcgca ttgttcgaaa aatcgaacta

241 tgatttattt ttgctgttgt atttattttt catcttttgg gttttggttt tgttttttgt

301  tgctatcgta gtttatttgc tttttaaggg ctctattttt cgttctacgg catttttata

361  atttgccaat ataatttact gcagaattct agatctgtcg accatggtcg attttttatt

421  aaaacgtctc aaaatcgttt ctgagacgtt ttagcgttta tttcgtttag ttatcggcat

481  aatcgttaaa acaggcgtta tcgtagcgta aaagcccttg agcgtagcgt gctttgcagc

541  gaagatgttg tctgttagat tatgaaagcc gatgactgaa tgaaataata agcgcagcgt

601  ccttctattt cggttggagg aggctcaagg gagtttgagg gaatgaaatt ccctcatggg

661  tttgatttta aaaattgctt gcaattttgc cgagcggtag cgctggaaaa atttttgaaa

721  aaaatttgga atttggaaaa aaatgggggg aaaggaagcg aattttgctt ccgtactacg

781  accccccatt aagtgccgag tgccaatttt tgtgccaaaa acgctctatc ccaactggct

841  caagggtttg aggggttttt caatcgccaa cgaatcgcca acgttttcgc caacgttttt

901  tataaatcta tatttaagta gctttattgt tgtttttatg attacaaagt gatacactaa

961  ttttataaaa ttatttgatt ggagtttttt aaatggtgat ttcagaatcg aaaaaaagag

1021 ttatgatttc tctgacaaaa gagcaagata aaaaattaac agatatggcg aaacaaaaag

1081 gtttttcaaa atctgcggtt gcggcgttag ctatagaaga atatgcaaga aaggaatcag

1141 aataaaaaaa ataagcgaaa gctcgcgttt ttagaaggat acgagttttc gctacttgtt

1201 tttgataagg taatatatca tggctattaa atactaaagc tagaaatttt ggatttttat

1261 tatatcctga ctcaattcct aatgattgga aagaaaaatt agagagtttg ggcgtatcta

1321 tggctgtcag tcctttacac gatatggacg aaaaaaaaga taaagataca tggaatagta

1381 gtgatgttat acgaaatgga aagcactata aaaaaccaca ctatcacgtt atatatattg

1441 cacgaaatcc tgtaacaata gaaagcgtta ggaacaagat taagcgaaaa ttggggaata

1501 gttcagttgc tcatgttgag atacttgatt atatcaaagg ttcatatgaa tatttgactc

1561 atgaatcaaa ggacgctatt gctaagaata aacatatata cgacaaaaaa gatattttga

1621 acattaatga ttttgatatt gaccgctata taacacttga tgaaagccaa aaaagagaat

1681 tgaagaattt acttttagat atagtggatg actataattt ggtaaataca aaagatttaa

1741 tggcttttat tcgccttagg ggagcggagt ttggaatttt aaatacgaat gatgtaaaag

1801 atattgtttc aacaaactct agcgccttta gattatggtt tgagggcaat tatcagtgtg

1861 gatatagagc aagttatgca aaggttcttg atgctgaaac gggggaaata aaatgacaaa

1921 caaagaaaaa gagttatttg ctgaaaatga ggaattaaaa aaagaaatta aggacttaaa

1981 agagcgtatt gaaagataca gagaaatgga agttgaatta agtacaacaa tagatttatt

2041 gagaggaggg attattgaat aatgagaaga tatttaatac ttattgtggc cttaataggg

2101 ataacaggtt tatcagggtg ttatcaaaca agtcataaaa aggtgaggtt tgacgaagga

2161 agttatacta attttattta tgataataaa tcgtatttcg taactgataa ggagattcct

2221 caggagaacg ttaacaattc caaagtaaaa ttttataagc tgttgattgt tgacatgaaa

2281 agtgagaaac ttttatcaag tagcaacaaa aatagtgtga ctttggtctt aaataatatt

2341 tatgaggctt ctgacaagtc gctatgtatg ggtattaacg acagatacta taagatactt

2401 ccagaaagtg ataagggggc ggtcaaagct ttgagattac aaaactttga tgtgacaagc

2461 gatatttctg atgataattt tgttattgat aaaaatgatt cacgaaaaat tgactatatg

2521 ggaaatattt acagtatatc ggacaccacc gtatctgatg aagaattggg agaatatcag

2581 gatgttttag ctgaagtacg tgtgtttgat tcagttagtg gcaaaagtat cccgaggtct

2641 gaatggggga gaattgataa ggatggttca aattccaaac agagtaggac ggaatgggat

2701 tatggcgaaa tccattctat tagaggaaaa tctcttactg aagcatttgc cgttgagata

2761 aatgatgatt ttaagcttgc aacgaaggta ggaaactag

SEQ ID No：4

  1  agggggcttt tattttggtt tgatgttgcg attaatagca atacgattgc aataaacaaa

 61  atgatcgatg ctgtttggca aaaaaagaaa aagtgattaa tttatatttt atttatggcg

121  ctaatttatt agcgcttttt ttgttgtcgg ctagccgact tctgatacat ttttttaagc

181  acaaaaacca cccaattttg gagtggtgtg taagtgcgca ttgttcgaaa aatcgaacta

241  tgatttattt ttgctgttgt atttattttt catcttttgg gttttggttt tgttttttgt

301  tgctatcgta gtttatttgc tttttaaggg ctctattttt cgttctacgg catttttata

361  atttgccaat ataatttact gcagaattct agatctgtcg accatggtcg attttttatt

421  aaaacgtctc aaaatcgttt ctgagacgtt ttagcgttta tttcgtttag ttatcggcat

481  aatcgttaaa acaggcgtta tcgtagcgta aaagcccttg agcgtagcgt gctttgcagc

541  gaagatgttg tctgttagat tatgaaagcc gatgactgaa tgaaataata agcgcagcgt

601  ccttctattt cggttggagg aggctcaagg gagtttgagg gaatgaaatt ccctcatggg

661  tttgatttta aaaattgctt gcaattttgc cgagcggtag cgctggaaaa atttttgaaa

721  aaaatttgga atttggaaaa aaatgggggg aaaggaagcg aattttgctt ccgtactacg

781  accccccatt aagtgccgag tgccaatttt tgtgccaaaa acgctctatc ccaactggct

841  caagggtttg aggggttttt caatcgccaa cgaatcgcca acgttttcgc caacgttttt

901  tataaatcta tatttaagta gctttattgt tgtttttatg attacaaagt gatacactaa

961  ttttataaaa ttatttgatt ggagtttttt aaatggtgat ttcagaatcg aaaaaaagag

1021 ttatgatttc tctgacaaaa gagcaagata aaaaattaac agatatggcg aaacaaaaag

1081 gtttttcaaa atctgcggtt gcggcgttag ctatagaaga atatgcaaga aaggaatcag

1141 aataaaaaaa ataagcgaaa gctcgcgttt ttagaaggat acgagttttc gctacttgtt

1201 tttgataagg taatatatca tggctattaa atactaaagc tagaaatttt ggatttttat

1261 tatatcctga ctcaattcct aatgattgga aagaaaaatt agagagtttg ggcgtatcta

1321 tggctgtcag tcctttacac gatatggacg aaaaaaaaga taaagataca tggaatagta

1381 gtgatgttat acgaaatgga aagcactata aaaaaccaca ctatcacgtt atatatattg

1441 cacgaaatcc tgtaacaata gaaagcgtta ggaacaagat taagcgaaaa ttggggaata

1501 gttcagttgc tcatgttgag atacttgatt atatcaaagg ttcatatgaa tatttgactc

1561 atgaatcaaa ggacgctatt gctaagaata aacatatata cgacaaaaaa gatattttga

1621 acattaatga ttttgatatt gaccgctata taacacttga tgaaagccaa aaaagagaat

1681 tgaagaattt acttttagat atagtggatg actataattt ggtaaataca aaagatttaa

1741 tggcttttat tcgccttagg ggagcggagt ttggaatttt aaatacgaat gatgtaaaag

1801 atattgtttc aacaaactct agcgccttta gattatggtt tgagggcaat tatcagtgtg

1861 gatatagagc aagttatgca aaggttcttg atgctgaaac gggggaaata aaatgacaaa

1921 caaagaaaaa gagttatttg ctgaaaatga ggaattaaaa aaagaaatta aggacttaaa

1981 agagcgtatt gaaagataca gagaaatgga agttgaatta agtacaacaa tagatttatt

2041 gagaggaggg attattgaat aatgaaaata ggtaagcgca ttttattagg tctagtggca

2101 gtatgtgctt tatttttagg aattatctat ctttgggggt ataaattcaa catatattta

2161 gtaccaccct cccctcagaa gtatgttcga gttgccttaa aaaatatgga tgaacttggg

2221 ctatttactg attcaaaaga atgggtagaa actaaaaaaa agacgataga agaaacatca

2281 aatgctaaaa actatgcaga aacaatccct tttttacaaa aagcgattaa agttgcagga

2341 ggaaagcatt cttttattga acatgaagaa gacatatcaa aaagaagcat gacaaaatat

2401 ataaaaccaa aggcagaaat cgaaggcaac actttaatat taactattcc tgaatttact

2461 ggaaatgata gtcaagcatc tgattacgct aattttttag aatcttcatt gcataaaaac

2521 aattataatg gggtaattgt tgatttgagg gggaatagag gtggagactt atctcctatg

2581 gtattaggat tatcccccct attgcctgat ggaactctat ttacttatgt tgataaaagt

2641 agtcattcta aacctgttga actacaaaat ggagaaataa atagtggcgg gtcatcaaca

2701 aaaataagtg ataataaaaa aattaaaaaa gctcctattg ctgtattaat agataataat

2761 acagggagct ccggcgaatt aaccgctttg tgctttgagg gaatacctaa tgttaaattt

2821 ttgggttctg attcagcagg ttatacttct gctaatcaaa ccgtctattt atatgatggc

2881 tcaacattac aaataacttc tgcttttgta aaagacagaa caaataatat ttataaaaat

2941 tttcctatta gtccggacat tcaaacaaat aatgctaaaa gttctgcaat agaatggata

3001 aaatctcaaa taaagtaa

Claims (2)

1.一种乳酸乳球菌食品级载体pNI1，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ IDNO：3。

2.一种乳酸乳球菌食品级载体pNI2，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ IDNO：4。