CN107058366A - 乳酸乳球菌食品级双筛选标记分泌表达载体、含有所述载体的工程菌株、其构建方法及应用 - Google Patents

乳酸乳球菌食品级双筛选标记分泌表达载体、含有所述载体的工程菌株、其构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种乳酸球菌食品级双筛选标记分泌表达载体及其制备方法，该载体包括melA基因和含有P32启动子的nisI融合基因双选择标记、质粒pWV01的复制子、多克隆位点、分泌表达用的P32启动子和乳酸球菌Usp45分泌蛋白的部分序列。本发明还公开了NN1‑1作为外源蛋白表达载体的一种应用，包括以NN1‑1为载体构建的分泌表达产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)的内切葡聚糖酶(end‑l)基因的重组乳酸乳球菌。

Description

乳酸乳球菌食品级双筛选标记分泌表达载体、含有所述载体 的工程菌株、其构建方法及应用
【技术领域】
本发明属于生物工程与技术领域，涉及到一种可以在乳酸乳球菌中分泌表达的外源基因的双筛选标记分泌表达载体、含有所述载体的工程菌株、其构建方法及应用。
【背景技术】
乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)一类能够发酵糖类产生乳酸的革兰氏阳性细菌[De VosW M.Gene expression systems for lactic acid bacteria.CurrentOpinionin Microbiology,1999,2(3):289～295]，是公认的安全食品级微生物，具有抗菌、降低胆固醇、维持微生态系统平衡、抑癌和增强免疫力等重要生物学功能，在食品、饲料、制药等领域的应用越来越广泛[ELMADFA I,KLEIN P,MEYER A L.Immune-stimulatingeffects oflactic acid bacteria in vivo and in vitro[J].Proc Nutr Soc,2010,June 16:1-5.[Epub ahead of print].]。乳酸菌能够作为异源蛋白表达的宿主菌，有以下几点原因：①不产生内毒素或其他毒性物质[Bolotin,A.,Wincher,P.,Mauger,S.,Jaillon,O.,Malarme,K.,Weissenbach,J.,Ehrlich,S.D.,Sorokin,A.,2001.Thecompletegenome sequence of the lactic acid bacterium Lactococcuslactisssp.lactis IL1403.Genome Res.11,731–753]；②乳酸菌可以粘附并存活在肠道中,其用于降解、治疗、免疫作用的外源基因表达产物可以持续地在肠道中产生,成为生物体内功能性生物制剂的合成及处理中心,从而起到相应的提供营养、保护和治疗性作用；可在细胞内、表面甚至分泌到细胞外表达。但是由于乳酸菌表达载体很少，尤其是具有高筛选、多用途、表达高的分泌型载体更少，限制了乳酸菌生物工程的发展[SUN Zhilan,KONGJian,KONG Wentao.Characterization of a cryptic plasmid p D403fromLactobacillus plantarum and construction of shuttle vectors based on itsreplicon[J].Mol Biotechnol,2010,45(1):24-33.]。
质粒pMG 36e来源于乳酸菌常用载体pWV 01载体，以乳酸乳球菌乳脂亚种蛋白酶基因的转录和翻译信号为基础构建而成的组成型载体[Van De GuchteM,Van Der VossenJM B M,Kok J,etal.Construction of alactococcal expression vector:Expressionof hen egg white lysozyme in Lactococcus lactis subsp.l actis.AppliedandEnvironmental Microbiology,1989,55(1):224～228]，它包括强启动子p32及其下游的部分开放阅读框、多克隆位点和转录终止子[Van Der Vossen JM B M,KoddeJ,HaandrikmanAJ,etal.Characterization of transcription initiation and termination signalsof the proteinasegenes of Lactococcuslactis Wg2 and enhancement ofproteolysis in L.lactis.Applied and EnvironmentalMicrobiology,1992,58(9):3142～3149]以及pWV 01复制子和红毒素抗性基因Emr构成[Horinouchi S,W eisblumB.Nucleotides equence and functional map of pE 194,aplasmid that specifiesinducible resistanceto macrolide,lincosamide,and streptogramin type Bantibiotics.JournalofBacteriology,1982,150(2):804～814]，大小3.6kb，可表达各种外源基因。近年来，很多研究者对其进行改造，成功构建了食品级载体，质粒pMG 36e已经成为食品级载体首选载体骨架。
食品级表达系统是一种能够耐受压力和安全选择的，并用于食品及食品相关产品生产的表达系统。作为食品级的表达系统，必须具有以下特点：①表达载体的序列都是食品级的，来源安全型微生物的基因序列，且不含有非食品级基因序列片段；②宿主菌要求为食品级，生理性状清晰及稳定的微生物；③选择标记必须是安全可靠地，即食品级选择标记代替抗生素抗性标记；④诱导物要求为食品级的，为食用物质[Vos WMd.Safe andsustainable systems for food-grade fermentations by genetically modifiedlacic acid bacteria.Int Daily J.1999,9(1):3-10]。
选择标记是鉴定转化及细胞重组是否成功的筛选标记。由于表达载体的转化率低，一般采用一个或多个选择性筛选标记，来鉴定含有转化子的受体菌。[Bernard R G，Jack J P.分子生物技术重组DNA的原理与应用[M].陈丽珊，任大明主译.第3版，北京：化学工业出版社，2005，48-53.]食品级选择标记，是一类有别于抗生素选择标记的，可用于食品工业的选择标记。[Platteeuw C,Van AB,Van S S,et al.Food-grade cloning andexpression system for Lactococcus lactis[J].Appl Environ Microbiol,1996,62(3):1008-1013.]。目前，乳酸菌的食品级选择标记可以分为三类：糖类利用选择性标记、细菌营养缺陷型标记和乳酸菌抗性标记。
中国发明申请CN 200710175269.3公开了一种乳酸乳球菌食品级分泌表达载体，其包括thyA基因选择标记、质粒pWV0l的复制子、多克隆位点、分泌表达用P32启动子、Usp45的核糖体结合位点、Usp45的信号肽序列及部分Usp45成熟肽编码序列，并验证了其核酸酶表达活性。然而可以看出，该技术方案只能才用胸甘酸合成酶缺陷突变株(△thyA突变株)做宿主，因此限制了其应用。
另一方面，在饲料工业中需要大量的纤维素酶改善品质来提高牛羊的营养。纤维素酶又称纤维素酶系，属于糖苷水解酶类，是一类由多个酶系组成的可以降解纤维素的复合物，相互协同作用，分解纤维素产生寡糖和纤维二糖，最终水解为葡萄糖(顾方媛,陈朝银,石家骥,等.纤维素酶的研究进展与发展趋势[J].微生物学杂志,2008,28(1):83-86)。其中内切葡聚糖酶是纤维素酶系中最重要的酶之一。通过NN1-1可以高效表达，尤其可以将外源蛋白表分泌到胞外，有利于青贮饲料的发酵，提高发酵的效果。
应用基因工程技术，改造pMG36e载体，构建具有在乳酸乳球菌双筛选标记的分泌表达外源蛋白功能的新型表达载体，并用于产琥珀酸丝状杆菌内切葡聚糖酶的表达，建立更安全有效的分泌内切葡聚糖酶菌株，这对青贮饲料的发酵和酶制剂的生产具有重要意义，有望产生相当可观的社会和经济价值，目前尚无报道。
【发明内容】
为了克服现有技术的缺陷，解决以上问题，一方面，本发明提供一种乳酸乳球菌食品级双筛选标记分泌表达载体。
另一方面，本发明提供一种乳酸乳球菌食品级分泌表达。
另一方面，本发明的目的还在于提供一种该载体的构建方法。
另一方面，本发明的目的还在于提供一种该载体在分泌表达外源基因中的应用。
为了实现上述目的，本发明提供一种乳酸球菌食品级双筛选标记分泌表达载体，其特征在于所述载体包含P32启动子和乳酸球菌Usp45分泌蛋白的融合基因、melA基因和nisI基因双选择标记、质粒pWV01的复制子和多克隆位点；所述融合基因的核苷酸序列如SEQ No.2所示。
在本发明中，含有P32启动子和乳酸球菌Usp45分泌蛋白的融合基因是外分泌表达的主要元件。
根据一种可选的实施方式，melA(α-半乳糖苷酶)基因的核苷酸序列如SEQ No.3所示；含有P32启动子的nisI(细菌素nisin免疫)融合基因的核苷酸序列如SEQ No.34所示。
在本发明中，所述的包含P32启动子和乳酸球菌Usp45分泌蛋白的融合基因与外源基因在乳酸球菌中融合表达，以实现外源基因在乳酸球菌里分泌表达。
根据权利要求1所示的乳酸球菌食品级双筛选标记分泌表达载体，其特征在于所述的融合基因位于EcoRI和SacI多克隆位点之间。
根据权利要求1所示的乳酸球菌食品级双筛选标记分泌表达载体，其特征在于所述的melA基因选择标记为植物乳酸杆菌的α-半乳糖苷酶；nisI基因选择标记是根据NCBI中GenBank上公布的P32启动子和乳酸链球菌素nisin免疫基因序列组成的表达序列框。
本发明还提供上述乳酸球菌食品级双筛选标记分泌表达载体的构建方法，该方法包括：
(1)分别提取乳酸乳球菌MG 1363和乳酸杆菌的基因组DNA，以所述基因组DNA为PCR模板分别扩增到melA(α-半乳糖苷酶)和Usp45分泌蛋白的核苷酸序列；
(2)以乳酸菌表达载体pMG36e为PCR模板，扩增得到p32启动子的核苷酸序列；
(3)分别用BamHI单酶切p32启动子和Usp45分泌蛋白的PCR产物后，进行连接，然后以连接产物的模板，用高保真酶进行PCR，从而得到融合基因序列；
(4)根据NCBI中公布的nisI基因序列，并结合P32启动子序列，设计出nisI完整的表达框核苷酸序列，然后通过人工合成的方式合成nisI融合基因；
(5)将p32+SPusp45融合基因、melA、nisI融合基因分别与T克隆载体进行连接、并转化到大肠杆菌感受态细胞中；
(6)分别提取含有这三个基因的质粒，与pMG36e载体分别进行双酶切或单酶切，各个酶切下的基因分别与自身对应的酶切pMG36e进行连接，从而构建出双筛选标记分泌表达载体；
(7)将含有红霉素基因的双筛选标记分泌表达载体进行HpaI单酶切再自连，构建出食品级双筛选标记分泌表达载体NN1；
(8)将NN1-1质粒通过电传孔的方式转化到乳酸乳球菌MG1363感受态细胞中；
(9)对所得表达载体NN1-1中melA、nisI融合基因的功能效果进行检测并确认。
本发明还提供上述乳酸乳球菌食品级分泌表达载体作在分泌表达外源基因中的应用。
在本发明中，所述外源蛋白的编码基因是产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobactersuccinogenes)的内切葡聚糖酶(end-l)的编码基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ No.5所示。
优选地，所述在乳酸乳球菌中分泌表达产琥珀酸丝状杆菌内切葡聚糖酶(end-l)的载体是NN1-end-I，所述载体的核苷酸序列如SEQ No.6所示。
本发明还提供一株重组乳酸乳球菌，所述乳酸乳球菌包含上述的乳酸球菌食品级双筛选标记分泌表达载体及宿主菌。
根据一种优选的实施方式，所述宿主菌是乳酸乳球菌MG1363。
本发明有以下几点优点：
1.本发明的分泌表达载体中的melA(α-半乳糖苷酶)基因和nisI(细菌素nisin免疫)基因双选择标记可以双重保证阳性克隆的得率，在含有nisin的BCP培养基上进行双重筛选，与目前最可靠的大肠杆菌表达系统类似，即通过进行颜色筛选也可进行抗性筛选，增加筛选的可靠性，显著优于现有技术。作为对比，如根据CN 200710175269.3的技术方案，只能用胸甘酸合成酶缺陷突变株(△thyA突变株)作为宿主；
2.melA(α-半乳糖苷酶)基因的筛选标记为糖类利用选择性标记，其能专一性催化α-半乳糖苷键的水解，可以分解蜜二糖，故又称为蜜二糖酶，普遍存在于动植物体内，但在多数乳酸菌通常不含有melA基因，不能利用蜜二糖。本发明将该基因克隆到不具有melA基因的乳球菌中进行表达，被转化菌株发酵蜜二糖产酸，使加有溴甲酚紫的培养基由紫色变黄，因此可将melA基因作为显性筛选标记。
3.nisI是源于乳酸菌自身，是乳酸链球菌素(Nisin)的抗性基因或免疫相关基因。Nisin是天然生物活性细菌素，是乳酸菌代谢过程中产生的食品级具有抑菌作用的多肽[相丽,刘伟,范丽平等.应用于乳酸菌的非抗生素抗性选择标记系统[J].中国生物化学与分子生物学报,2007,23(1):1-7.]。提供选择压力的物质nisin又被公认为安全的天然食品防腐剂，因此nisI基因是一种理想的食品级选择标记。
4.本发明的食品级分泌表达载体的宿主菌株选择广泛。尽管本发明采用了乳酸乳球菌MG1363作为宿主菌，但可以预想除此以外，只要对nisin(细菌素)敏感的乳酸菌都可以做宿主菌(如其他乳酸乳球菌株、粪肠球菌等)，如果选择的宿主菌基因组里缺陷melA基因也同时可以进行颜色筛选，为该载体的应用提供了广泛的选择空间，也优于其他现有技术如CN 200710175269.3的效果；
5.本发明的食品级分泌表达载体的所用改造基因均来自公认安全的可食用菌株，而且也去掉了pMG36e质粒中的红霉素基因，达到真正意义上的食品级安全性，而且宿主菌也是食品级微生物，因此此系统完全符合食品级表达系统的要求。此外，本发明的载体克服了pMG36e表达载体不能分泌表达外源蛋白的缺陷，因此该发明的系统可以持续培养、蛋白直接分泌得到细胞外；
6.本发明应用食品级分泌表达载体NN1-1构建的表达产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)的内切葡聚糖酶(end-l)，能够在乳酸乳球菌MG1363中分泌表达内切葡聚糖酶(end-l)的功能。其意义在于NN1-end-I不含有抗生素基因，既安全又可高效分泌表达，在青贮饲料的加工和动物微生物添加剂上具有非常大的应用价值；
7.本发明应用食品级分泌表达载体NN1-1，还可以分泌表达有益于动物的外源基因，如营养、保健、治疗疾病、生长激素、无害食物防腐等等。还可以将包含本发明的食品级分泌表达载体的活体菌通过口服或者饲喂等形式，进入生物体后，提供机体所需的外源基因的产物。潜在的社会和市场价值巨大。
附图说明
图1为乳酸乳球菌食品级双筛选标记分泌表达载体构建示意图；
图2为P32+SPusp45基因结构示意图；
图3为P32基因琼脂糖凝胶电泳图，其中M为分子量标准(DL3000)；1-2为P32的pcr产物；
图4为SPusp45基因琼脂糖凝胶电泳图，其中M为分子量标准(DL3000)；1-4为SPusp45的pcr产物；
图5为P32+SPusp45琼脂糖凝胶电泳图，其中M为分子量标准(DL3000)；1-4为P32+SPusp45的pcr产物；
图6为P32+SPusp45基因插入pMG36e载体中的重组质粒菌液PCR鉴定，其中M为分子量标准(D2000)；1-19为重组质粒菌液PCR产物；
图7为melA基因结构示意图；
图8为melA基因的pcr产物琼脂糖凝胶电泳图，其中M为分子量标准(DL3000)；1-2为melA基因的pcr产物；
图9为melA基因插入pMG36e+P32+SPusp45载体中的重组质粒菌液PCR鉴定，其中M为分子量标准(DL3000)；1-11为重组质粒菌液PCR产物；
图10为nisI基因表达框结构示意图；
图11为nisI基因表达框的pcr产物琼脂糖凝胶电泳图，其中M为分子量标准(DL3000)；1-2为nisI基因表达框的pcr产物；
图12为nisI基因表达框插入pMG36e+P32+SPusp45+melA载体中的重组质粒菌液PCR鉴定，其中M为分子量标准(D2000)；1-19为重组质粒菌液PCR产物；
图13为pMG36e载体结构示意图；
图14为NN1-end-I表达载体构建示意图；
图15NN1-end-l重组质粒PCR鉴定,其中M为分子量标准(DL2000)；1-27为end-l基因的pcr产物；
图16为乳酸乳球菌食品级双筛选标记分泌表达载体的部分序列，其中包括nisI和melA基因的选择性标记、分泌表达用的P32启动子、乳酸乳球菌Usp45序列部分及部分Usp45成熟肽编码序列、多克隆位点。
图17食品级分泌型表达系统36小时培养显色反应；
图18食品级分泌型表达系统48小时nisin敏感性实验；
具体实施方式
(一)本发明试验中使用的细菌菌株和质粒
乳酸乳球菌MG1363由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所孙强正博士馈赠，采用含150ml/L甘油的GM17培养基于-80℃保存该菌。
乳酸菌载体pMG36e购自长沙赢润生物技术有限公司。pMG36e载体如图13所示，含启动子P32、多克隆位点、质粒pWV01的复制子、红霉素基因和来自乳酸乳菌乳脂亚种蛋白酶基因的转录终止子以及pWV01复制子和来自于质粒pE194的红毒素抗性基因(Emr)。
大肠杆菌感受态细胞Trans-T1购自北京全式金生物有限公司。
pMD-19T克隆载体购自宝生物工程(大连)有限公司。
(二)本发明试验中涉及的培养基的配制
LB液体培养基：称取胰蛋白胨10g；酵母提取物5g；NaCl 10g，溶于1L的蒸馏水中，用10NNaOH调PH值为7.0,121℃高压灭菌20min，4℃保存。
LB固体培养基：称取胰蛋白胨10g；酵母提取物5g；NaCl 10g，Agar15g，溶于1L的蒸馏水中，用10NNaOH调PH值为7.0,121℃高压灭菌20min，4℃保存。
GM17液体培养基：称取M17肉汤粉末4.23g，溶于100ml的蒸馏水中,121℃高压灭菌15min，4℃保存。
GM17固体培养基：称取M17琼脂粉末5.5g，溶于100ml的蒸馏水中,121℃高压灭菌15min，4℃保存。
BCP培养基(GM17)：M17琼脂培养基11g，葡萄糖5g，溴甲酚紫0.04g，蜜二糖5g，定溶到1L水中，调pH至7.0。
在本发明中，如无特殊说明，用于解释浓度的“％”均为重量百分比，“份”均为重量份。
(三)本发明涉及试验中使用的试剂
M17肉汤和琼脂培养基购自青岛海博生物技术有限公司；红霉素购自生工生物工程(上海)股份有限公司；氨卡青霉素购自sigma公司；Ex Taq pcr mix、加A反应液、限制性内切酶BamHI、SacI、EcoRI、HpaI购自宝生物工程(大连)有限公司。T4连接酶、限制性内切酶EarI、NsiI、磷酸化酶购自NEB公司；试剂盒凝胶回收DNA试剂盒购自OMEGA公司；细菌DNA提取试剂盒和质粒中量小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；其他常用试剂均为国产分析纯试剂。
实施例1、L.lactis分泌表达载体pMG36e+p32+SPusp45的构建
1乳酸球菌MG1363总DNA的提取
(1)装有采集的标本50ml离心管中加入3ml灭菌的生理盐水洗脱，轻轻沿试管壁挤压后，吸取2ml放到2ml离心管中12000rpm，10min离心。
(2)向管中加入20μl Proteinase K溶液，混匀。
(3)加入220μl缓冲液GB，振荡15sec，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(4)加220μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(7)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。
(8)重复操作步骤7。
(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。该步骤用于去除吸附柱中残余的漂洗液，避免漂洗液中的乙醇的残留会影响后续反应(如酶切、PCR反应)的实验结果。
(11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。
2启动子P32和乳酸球菌Usp45分泌蛋白的PCR扩增
2.1引物设计与合成
根据pMG36e载体上的P32启动子序列设计引物(表1)，以质粒pMG36e[Van DeGuchteM,Van Der Vossen JM B M,Kok J,etal.Construction of alactococcalexpression vector:Expression of hen egg white lysozyme in Lactococcus lactissubsp.l actis.Appliedand Environmental Microbiology,1989,55(1):224～228]为模板扩增P32启动子片段、包括-35、-10区；根据GenBank上公布的SPusp45(EU382094.1)[vanAsseldonk，M.,Rutten，G.,Oteman，M.,et al.Clonging of usp45，a gene encoding asecretedprotein form Lactococcus lactis subsp.lactis MG1363，Gene.1990:95:155-160]序列设计引物，以乳酸乳球菌MG1363的基因组DNA为模板扩增SPusp45，包括usp45的核糖体结合位点、起始密码子、ORF开放阅读框部分序列。
表1
以上引物由南京金斯瑞生物有限公司合成。
2.2 P32和Usp45基因的PCR扩增
P32、SPusp45基因的PCR反应体系(25μL)：2X XUltra-pfu-PCR Master Mix12.5μL，10μm/L的上下游引物各1.0μL，模板2.0μL，加去离子水至25μL。
P32、SPusp45基因PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸30sec，共35个循环，72℃延伸10min，最后反应结束后4℃保存。
2.3启动子P32与SPusp45基因序列的拼接后克隆
2.3.1启动子P32与SPusp45基因序列的酶切与拼接
P32和SPusp45 PCR产物纯化后直接用BamHI单酶切，酶切产物用T4连接酶进行拼接。酶切体系为：纯化的P32/SPusp45 PCR产物42μL；QuickCut BamHI 2.0μL；10×QuickCutGreen buffer 5.0μL；加去离子水至50μL。37℃酶切2h。
将胶回收纯化的P32-2和SPusp45基因酶切片段通过T4DNA连接酶进行连接，连接反应体系为：10×DNA Ligase Buffer 2μL，P32基因单酶切纯化产物8μL，SPusp45基因单酶切纯化产物8μL，T4DNA Ligase 2μL，总体积20μL。16℃过夜。
2.3.2启动子P32与SPusp45基因的融合序列PCR扩增
P32和SPusp45基因的融合基因PCR反应体系(25μL)：2X XUltra-pfu-PCR MasterMix 12.5μL，10μm/L的上下游引物各1.0μL，融合序列模板3.0μL，加去离子水至25μL。
P32、SPusp45基因PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸30sec，共35个循环，72℃延伸10min，最后反应结束后4℃保存。
2.3.3启动子P32与SPusp45基因的融合序列克隆
扩增产物胶回收纯化，克隆到载体pMD-19T，热转化到大肠杆菌Trans-T1感受态细胞中，蓝白斑筛选阳性克隆子送南京金斯瑞生物技术有限公司测序。技术方法可参照产品说明书进行。
3 P32+SPusp45的融合序列与表达载体pMG36e的双酶切连接
3.1 32+SPusp45的融合序列与pMG36e双酶切产物的回收
将测序正确的克隆子及表达载体pMG36e分别用EcoRI和SacI双酶切，酶切体系如下：克隆子/pMG36e 39μL；QuickCut EcoRI 3.0μL；QuickCut SacI 3.0μl；10×QuickCutGreen buffer 5.0μL；加去离子水至50μL。37℃酶切2h。
将胶回收纯化的P32+SPusp45融合基因以及表达载体pMG36e双酶切片段通过T4DNA连接酶进行连接，连接反应体系为：10×DNA Ligase Buffer 1μL，P32+SPusp45融合基因6μL，pMG36e双酶切纯化产物2μL，T4DNA Ligase 1μL，总体积10μL。16℃过夜。
3.2分泌表达载体S213(pMG36e+32+SPusp45)的转化与鉴定
将连接产物热转化到大肠杆菌Trans-T1感受态细胞中，红霉素筛选后进行重组子的菌液鉴定正确的阳性克隆子送南京金斯瑞生物技术有限公司测序。
结果如下：
上述P32、SPusp45基因的PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳检测，大小分别约为134bp和172bp，与预期长度相吻合。如SEQ No.2的融合基因P32+SPusp45，所得产物大小为294bp，与预期长度相吻合。融合基因通过T-A克隆测序后，所得序列与文献和NCBI中公布的基因序列完全一致。将测序正确的克隆子和表达载体pMG36e分别以EcoRI和SacI双酶切，然后相互连接，通过转化，得到大肠杆菌的克隆子。经过PCR鉴定，测序，最终成功得到分泌表达载体S213(pMG36e+32+SPusp45)。
实施例2、melAL(α-半乳糖苷酶)为选择性标记的表达载体SL1-1
(pMG36e+p32+SPusp45+melA)的构建
1乳酸杆菌(实验室保存)总DNA的提取
方法同乳酸球菌MG1363总DNA的提取。
2 melAL(α-半乳糖苷酶)基因的PCR扩增
2.1引物设计与合成
根据GenBank已知的melA基因序列(登录号：AF189765)的编码序列(codingsequence，CDS)设计一对引物，如表2。引物由南京金斯瑞生物有限公司合成。
表2
2.2 melA(α-半乳糖苷酶)基因的PCR扩增
melA基因的PCR反应体系(25μL)：2X XUltra-pfu-PCR Master Mix 12.5μL，10μm/L的上下游引物各1.0μL，模板2.0μL，加去离子水至25μL。
melA基因PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸3min，共35个循环，72℃延伸10min，最后反应结束后4℃保存。
2.3 melA基因序列的克隆
将胶回收纯化的melA基因酶切片段末端加A与pMD-19T载体进行连接，连接反应体系为：melA基因纯化产物4μL，pMD-19T Vector，Solution I 5μL，总体积10μL。16℃过夜。
热转化到大肠杆菌Trans-T1感受态细胞中，蓝白斑筛选阳性克隆子送南京金斯瑞生物技术有限公司测序。
3 MelA基因为筛选标记的分泌型表达载体SL1-1(pMG36e+p32+SPusp45+melA)的构建
3.1 melA基因和S213(pMG36e+p32+SPusp45)载体的EcoRI酶切产物的回收
将测序正确的克隆子及表达载体S213(pMG36e+p32+SPusp45)分别用EcoRI单酶切，酶切体系如下：克隆子/S213 43μL；QuickCut EcoRI 2.0；10×QuickCut Green buffer5.0μL；加去离子水至50μL。37℃酶切40min。
3.2酶切回收的melA和S213(pMG36e+p32+SPusp45)载体的EarI酶切产物的回收
将EcoRI酶切的melA和S213载体胶回收后分别用EarI酶切，酶切体系如下：EcoRI酶切的melA/S213胶回收产物43μL；EarI 2μL；10×NEB buffer 5μL；加去离子水至50μL。37℃酶切1h。
3.3 melA基因与表达载体S213(pMG36e+p32+SPusp45)的双酶切连接
将胶回收纯化的melA基因以及表达载体S213双酶切片段通过T4DNA连接酶进行连接，连接反应体系为：10×DNA Ligase Buffer 1μL，melA基因6μL，S213双酶切纯化产物2μL，，T4DNA Ligase 1μL，总体积10μL。16℃过夜。
3.4分泌表达载体S213(pMG36e+32+SPusp45)的转化与鉴定
将连接产物热转化到大肠杆菌Trans-T1感受态细胞中，红霉素筛选后进行重组子的菌液鉴定正确的阳性克隆子送南京金斯瑞生物技术有限公司测序。
结果如下：
melA基因的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测如图7示，大小为2357bp，符合预期长度。melA基因的PCR产物通过T-A克隆测序后，所得序列与文献和NCBI中公布的基因序列完全一致。将测序正确的克隆子以EcoRI和EarI双酶切后，与同样酶切的S213(pMG36e+32+SPusp45)质粒连接，转化到E.coli Trnas-T1。经过PCR鉴定、测序，最终成功得到melA基因为选择标记的分泌表达载体SL1-1(pMG36e+p32+SPusp45+melA)。
实施例3、melA(α-半乳糖苷酶)和nisI基因为双选择性标记的表达载体
NN1(pMG36e+p32+SPusp45+melA+nisI)的构建
1 nisI基因完整表达框序列的设计与合成
根据GenBank已知的nisI基因序列(登录号：X76884.1)的编码序列并结合P32启动子序列设计出一个完整的表达框序列。该序列由苏州金唯智生物科技有限合成。
2 NisI(细菌素nisin免疫)基因序列扩增克隆
2.1 nisI基因表达框引物设计
根据人工合成的基因序列设计引物如表3，引物上下游加酶切位点。引物由南京金斯瑞生物有限公司合成。
表3
2.2 nisI(细菌素nisin免疫)基因表达框的PCR扩增
nisI基因的PCR反应体系(25μL)：2X XUltra-pfu-PCR Master Mix 12.5μL，10μm/L的上下游引物各1.0μL，模板2.0μL，加去离子水至25μL。
nisI基因PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30sec，58.5℃退火30sec，72℃延伸1min，共35个循环，72℃延伸10min，最后反应结束后4℃保存。
2.3 nisI基因表达框序列的克隆
将胶回收纯化的nisI基因酶切片段末端加A与pMD-19T载体进行连接，连接反应体系为：nisI基因纯化产物4μL,pMD-19T Vector，Solution I 5μL，总体积10μL。16℃过夜。
热转化到大肠杆菌Trans-T1感受态细胞中，蓝白斑筛选阳性克隆子送南京金斯瑞生物技术有限公司测序。
3双筛选标记的分泌型表达载体NN1(pMG36e+p32+SPusp45+melA+nisI)的构建
3.1 nisI基因表达框和SL1-1(pMG36e+p32+SPusp45+melA)载体的NsiI酶切产物的回收
将测序正确的克隆子及实施例2得到的表达载体SL1-1(pMG36e+p32+SPusp45+melA)分别用NsiI单酶切，酶切体系如下：克隆子/SL1-142μL；NsiI 3.0μL；10×NEB buffer5.0μL；加去离子水至50μL。37℃酶切40min。
3.2NsiI酶切的SL1-1(pMG36e+p32+SPusp45+melA)载体的去磷酸化处理
为防止SL1-1载体单一酶切发生自连，NsiI酶切的SL1-1要进行去磷酸化处理，体系如下：NsiI酶切SL1in TE buffer43μL，CIAP(10-30units/μL)5μL，10×A/Kalinephosphatase buffer 2.0μL，总体积50μl。离心混匀后，于37℃水浴15min，50℃15min。
3.3 nisI基因与表达载SL1-1(pMG36e+p32+SPusp45+melA)的酶切连接
将胶回收纯化的目的片段NisI和NsiI酶切的经过去磷酸化处理的SL1载体通过T4DNA连接酶进行连接，连接反应体系为：10×DNA Ligase Buffer 1μL，nisI基因6Μl,SL1-1酶切去磷酸化处理并纯化产物2μL，T4DNA Ligase 1μL，总体积10μL。16℃过夜。
3.4双筛选标记的分泌型表达载体NN1(pMG36e+p32+SPusp45+melA+nisI)的转化与鉴定
将连接产物热转化到大肠杆菌Trans-T1感受态细胞中，红霉素筛选后进行重组子的菌液鉴定正确的阳性克隆子送南京金斯瑞生物技术有限公司测序。
结果如下：
nisI基因表达框的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，大小约为936bp，符合预期长度。nisI基因的PCR产物通过T-A克隆测序后，所得序列与文献和NCBI中公布的基因序列完全一致。将测序正确的克隆子以NsiI酶切后，与同样酶切的经过去磷酸化处理的SL1-1(pMG36e+p32+SPusp45+melA)质粒连接，转化到E.coli Trnas-T1。经过PCR鉴定、测序，最终成功得到melA基因为选择标记的分泌表达载体NN1(pMG36e+p32+SPusp45+melA+nisI)。
实施例4、食品级双选择性标记的表达系统的构建
(pMG36e+p32+SPusp45+melA+nisI-Emr)的构建
1 NN1(pMG36e+p32+SPusp45+melA+nisI)载体HpaI酶切产物的回收
因为在设计MelA基因的上游引物时就带了一个HpaI酶切位点，与红霉素基因末端的HpaI酶切位点整好呼应，可将红霉素基因切掉，故将测序正确的克隆质粒NN1用HpaI酶切，酶切体系如下：NN1 42μL，HpaI 2μL，10×NEB buffer 5.0μL，总体积50μl。
2 HpaI酶切后的NN1自身连接
将胶回收纯化的目的片段NN1和NN10通过T4DNA连接酶进行自接，10μL连接反应体系如下：10×DNA Ligase Buffer1μL，HpaI酶切的NN18μL，T4DNA Ligase 1μl，总体积10μL。离心混匀后，16℃水浴过夜连接，连接产物直接用于转化。
3食品级双选择性标记的表达载体NN1-1
(pMG36e+p32+SPusp45+melA+nisI-Emr)的转化与鉴定
将连接产物热转化到乳酸乳球菌MG1363感受态细胞中，乳酸乳球菌MG1363感受态细胞的制备和转化方法见参考文献[Holo H,Nes IF.High frequency transformation byelectroporation of Lactococcus lactis subsp.cremoris grown with glycineinosmotically stabilized media[J].Appl Environ Microbiol,1989,55:3 119-3123.]细菌素nisin筛选后提取质粒进行重组子的PCR鉴定正确的阳性克隆子送南京金斯瑞生物技术有限公司测序。
结果如下：
将测序正确的NN1(pMG36e+p32+SPusp45+melA+nisI)以HpaI酶切后，自身连接，转化到乳酸乳球菌MG1363。经过PCR鉴定、测序，表明食品级双选择性标记的表达载体NN1-1(pMG36e+p32+SPusp45+melA+nisI-Emr)构建成功。
实施例5、对食品级表达载体NN1-1中melA、nisI融合基因的功能效果进行检测
吸取含有食品级分泌表达载体NN1-1的菌株5μL，以含有pMG36e质粒的酸乳球菌MG1363为对照，分别滴加到BCP培养基上，32℃培养48h；含有食品级分泌表达载体NN1-1的菌株，以含有pMG36e质粒的酸乳球菌MG1363为对照，稀释10-4取50ul菌液涂布在对照组(无Nisin)及实验组(1mg/ml Nisin) 平板上，32℃培养48h。
结果如下：
含有食品级分泌表达载体NN1-1的菌株在BCP培养基显黄色，对照组无变化，如图17所示；含有食品级分泌表达载体NN1-1的菌株在含nisin(细菌素)的GM17培养基上能够大量生长，而含有pMG36e质粒的酸乳球菌含nisin(细菌素)的GM17培养基上不生长，如图18所示。
实施例6、葡聚糖内切酶基因密码子的优化及表达
1葡聚糖内切酶(end-l)基因密码子的优化与合成
产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes，GenBank:X88561.1)的内切葡聚糖酶(end-l)基因从NCBI网站获得，序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成，合成前利用该公司的密码子优化工具OPTIMWIZ针对乳酸乳球菌MG1363密码子偏爱性及相关的参数进行优化，如SEQ No.5所示。优化合成的序列克隆至AMP抗性的pUC57质粒后进行测序，序列正确的质粒开展后续实验。
表4
2葡聚糖内切酶(end-l)基因的重组质粒的构建
将测序正确的NN1-1(pMG36e+p32+SPusp45+melA+nisI-Emr)质粒及公司合成构建成pUC57-end-l质粒分别用XbaI和HindIII双酶切，胶回收纯化,T4DNA连接酶连接,电转乳酸乳球菌MG1363，筛选S213-end-l阳性克隆子,提取乳酸球菌质粒进行PCR鉴定。
3葡聚糖内切葡聚糖酶重组菌株酶活测定
取摇瓶发酵的重组菌株发酵液上清，分别以微晶纤维素和羧甲基纤维素(CMC-Na)为底物，采用DNS法测定内切葡聚糖酶酶活。
结果如下：
将测序正确的NN1-1(pMG36e+p32+SPusp45+melA+nisI-Emr)及公司合成构建成pUC57-end-l质粒分别用XbaI和HindIII双酶切后连接，转化到乳酸乳球菌MG1363。经过PCR鉴定、测序以及酶活测定，表明葡聚糖内切酶重组菌构建成功。
SEQUENCE LISTING
<110> 内蒙古自治区农牧业科学院
<120> 乳酸乳球菌食品级双筛选标记分泌表达载体、含有所述载体的工程菌株、其
构建方法及应用
<130> 17033.1
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 6922
<212> DNA
<213> 乳酸乳球菌食品级双筛选标记分泌表达载体NN1-1序列
<400> 1
ggtgatttca gaatcgaaaa aaagagttat gatttctctg acaaaagagc aagataaaaa 60
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gcccatattt tttcctcctt ataaaattag tataattata gcacggtcga tcttctatat 3300
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tgccacagga atacggtggc aataataccg gtgattatcg gcaacccgcc gcgattattc 3720
gcgcggccaa tggtgctcga acagttgatt ttcgttatca agactgccgg atggaagccg 3780
gtaagccgga acttaagggc ttgccacaaa cttatgtcga agatgaggat gaagcccaaa 3840
ctttgattgt gacgttgcga gatgccacat taggcgtgac actcgaatta gcctacacga 3900
tttatcggga tcggccagtt atcacgcgta gcgcccggtt gattaatcac agtgagcaag 3960
ctgtcgactt agaaaaagtg gcttcgatgc agatggacct gccaacccaa ccattagatg 4020
ccatttcgtt acctggaagc tatgcgcgtg agcgccagct tagtcgtgaa cggctccatc 4080
gaggtgtaac tcagtttgaa agtcgccggg gtgctagttc tcatcatatg aatccttttg 4140
tggcgctagc tgatccgaat actaatgaat ttcaaggcaa tgtccttggt gcattgctaa 4200
tttattcagg taaccaccag attagtttag aacgggaccc aattggtcag acacgcttga 4260
ctatgggaat caatgaatat aacttcgact ggcgattggc ggccggtgat agtttccaaa 4320
cgcccgaggt tgcaatggta tactcgacga cggggcttaa tggtatgtcg caaacctacc 4380
atgatttatt gcgtgatcgc gtggcgcgca gtcgttacaa gcacgatctc cggccgatct 4440
tgatcaacaa ttgggaagcc acttactttg actttgatgc ggacaagatt caatcaatct 4500
tggatgctgc agcaccactg ggtatcgaaa tgtttgtgct ggatgacggt tggttcggtc 4560
atcgaaatga tgataatagt tcgctaggtg actggtttgt taatcggaac aagttaccag 4620
gaggcttagc ggatattagc aaacggaccc atgataaagg gatgcggttc ggactttggt 4680
tcgagccaga aaatatttca gccgattccg atctttatcg ggcccatcct gattgggtgt 4740
taggcgtacc agatcgtggc cgaacgttat cgcggaacga atacgtgctt gatttcagcc 4800
agccggatgt tgtcgacaat atttttgaac aaatgaccgc agttcttgat aaggtgccca 4860
ttgattatat caagtgggat atgaaccgca atttaacgga agtctattcg ccacatagcg 4920
attcaactca tgaaggtgag actagccacc gctttatctt aggtgtatat gacttgatgg 4980
agcgtttaac aaaacgctat ccacagatct tatttgaagg ctgctctggc ggtggtggcc 5040
gctttgatgc tggtttaatg tattatatgc cacagagttg gccatcagat aataatgacc 5100
cgattgaacg gctcaaaatt caatatggga cttcactcgt ttatccaatc tctgcaatta 5160
ccgcccatgt tgggacgagc ccggatgaat tgttaggacg gtcgacgtcg atgaagatgc 5220
gtggtgctgt ggcaatgagt ggtaccttgg gctatgaact ggacgcggcc caactaagtg 5280
atgcggacaa gcaggccgtt aaaagacagg ttgccttcta taagcagcac cgtgagttag 5340
ttcaatacgg gaccttttat cgattagaga gcccgtttga atctaatacg gtggcgtgga 5400
tgtttgttag tccggatcag aaagaagcct tgctgttcac cttcgttatt ttaggtgcag 5460
ttcaaccaga accgcatatt acgaagttag cgggattaga ccctcagcag acctacgttg 5520
agaccgacac aaacaaaatg tacggtggcg atgaattgat gcaactagga ctctacacga 5580
ctcccgttca aactagtgac tttacggcgc aggtacatta cttcaaggct aaggactaag 5640
atcagccatt aaacatatta aaacttaatc atcgttaatc taaaagaacg ctctggcaaa 5700
taactcgccg gaattcagat taatagtttt agctattaat ctttttttat ttttatttaa 5760
gaatggctta ataaagcggt tactttggat ttttgtgagc ttggactaga aaaaaacttc 5820
acaaaatgct atactagggg atccaaccga acttaatggg aggaaaaatt aaaaaagaac 5880
agttatgaaa aaaaagatta tctcagctat tttaatgtct acagtgatac tttctgctgc 5940
agccccgttg tcaggtgttt acgctgacac aaactcagat attgctaaac aagatgcgga 6000
gctcgcccgg ggatcgatcc tctagagtcg acctgcaggc atgcaagctt gcaaagtctg 6060
aaaacgaagg tggcagctgc cgttgaagcg gccaagacag ttggtaaagg cgacggtaca 6120
accggtacta gcgacaaagg cggcggtcaa ggtaccccgg cgctacgata tttggagttg 6180
aggttcaaag tcaaatggta ctgatgaccg gtaaaattta atattttgaa ccttgcttag 6240
gcagctgact tcacattgtt gagatcagct gccttttgct tatagttcat tgagtagaaa 6300
cggttctgtt gcgaagtttg aaaatcaaac gcaagctcga ttttttatta aaacgtctca 6360
aaatcgtttc tgagacgttt tagcgtttat ttcgtttagt tatcggcata atcgttaaaa 6420
caggcgttat cgtagcgtaa aagcccttga gcgtagcgtg gctttgcagc gaagatgttg 6480
tctgttagat tatgaaagcc gatgactgaa tgaaataata agcgcagcgc ccttctattt 6540
cggttggagg aggctcaagg gagtatgagg gaatgaaatt ccctcatggg tttgatttta 6600
aaaattgctt gcaattttgc cgagcggtag cgctggaaaa tttttgaaaa aaatttggaa 6660
tttggaaaaa aatgggggga aaggaagcga attttgcttc cgtactacga ccccccatta 6720
agtgccgagt gccaattttt gtgccaaaaa cgctctatcc caactggctc aagggtttaa 6780
ggggtttttc aatcgccaac gaatcgccaa cgttttcgcc aacgtttttt ataaatctat 6840
atttaagtag ctttattgtt gtttttatga ttacaaagtg atacactaac tttataaaat 6900
tatttgattg gagtttttta at 6922
<210> 2
<211> 294
<212> DNA
<213> P32+ Usp45的融合基因序列
<400> 2
gaattcagat taatagtttt agctattaat ctttttttat ttttatttaa gaatggctta 60
ataaagcggt tactttggat ttttgtgagc ttggactaga aaaaaacttc acaaaatgct 120
atactagggg atccaaccga acttaatggg aggaaaaatt aaaaaagaac agttatgaaa 180
aaaaagatta tctcagctat tttaatgtct acagtgatac tttctgctgc agccccgttg 240
tcaggtgttt acgctgacac aaactcagat attgctaaac aagatgcgga gctc 294
<210> 3
<211> 2357
<212> DNA
<213> melA基因序列
<400> 3
ctcttcatcc gttaacttgt gaactgaaat agaaaaagct aatagcgaag ggaagatttt 60
actatggcag taacgttgca gcaaacttta attgacattg atgaagaaca acttgtcttt 120
cacctgcata acgatcaaat ctcgtatatt ctaggtgtgg agacaggcaa cgtgttggcc 180
cacttgtact ttggcccacg ggttcggggt tatcatggcg agcgtcagta tccccggatt 240
gatcgggggt tctcaggaaa tttaccgaat acgactgatc gaagctattc caaggatgat 300
ttgccacagg aatacggtgg caataatacc ggtgattatc ggcaacccgc cgcgattatt 360
cgcgcggcca atggtgctcg aacagttgat tttcgttatc aagactgccg gatggaagcc 420
ggtaagccgg aacttaaggg cttgccacaa acttatgtcg aagatgagga tgaagcccaa 480
actttgattg tgacgttgcg agatgccaca ttaggcgtga cactcgaatt agcctacacg 540
atttatcggg atcggccagt tatcacgcgt agcgcccggt tgattaatca cagtgagcaa 600
gctgtcgact tagaaaaagt ggcttcgatg cagatggacc tgccaaccca accattagat 660
gccatttcgt tacctggaag ctatgcgcgt gagcgccagc ttagtcgtga acggctccat 720
cgaggtgtaa ctcagtttga aagtcgccgg ggtgctagtt ctcatcatat gaatcctttt 780
gtggcgctag ctgatccgaa tactaatgaa tttcaaggca atgtccttgg tgcattgcta 840
atttattcag gtaaccacca gattagttta gaacgggacc caattggtca gacacgcttg 900
actatgggaa tcaatgaata taacttcgac tggcgattgg cggccggtga tagtttccaa 960
acgcccgagg ttgcaatggt atactcgacg acggggctta atggtatgtc gcaaacctac 1020
catgatttat tgcgtgatcg cgtggcgcgc agtcgttaca agcacgatct ccggccgatc 1080
ttgatcaaca attgggaagc cacttacttt gactttgatg cggacaagat tcaatcaatc 1140
ttggatgctg cagcaccact gggtatcgaa atgtttgtgc tggatgacgg ttggttcggt 1200
catcgaaatg atgataatag ttcgctaggt gactggtttg ttaatcggaa caagttacca 1260
ggaggcttag cggatattag caaacggacc catgataaag ggatgcggtt cggactttgg 1320
ttcgagccag aaaatatttc agccgattcc gatctttatc gggcccatcc tgattgggtg 1380
ttaggcgtac cagatcgtgg ccgaacgtta tcgcggaacg aatacgtgct tgatttcagc 1440
cagccggatg ttgtcgacaa tatttttgaa caaatgaccg cagttcttga taaggtgccc 1500
attgattata tcaagtggga tatgaaccgc aatttaacgg aagtctattc gccacatagc 1560
gattcaactc atgaaggtga gactagccac cgctttatct taggtgtata tgacttgatg 1620
gagcgtttaa caaaacgcta tccacagatc ttatttgaag gctgctctgg cggtggtggc 1680
cgctttgatg ctggtttaat gtattatatg ccacagagtt ggccatcaga taataatgac 1740
ccgattgaac ggctcaaaat tcaatatggg acttcactcg tttatccaat ctctgcaatt 1800
accgcccatg ttgggacgag cccggatgaa ttgttaggac ggtcgacgtc gatgaagatg 1860
cgtggtgctg tggcaatgag tggtaccttg ggctatgaac tggacgcggc ccaactaagt 1920
gatgcggaca agcaggccgt taaaagacag gttgccttct ataagcagca ccgtgagtta 1980
gttcaatacg ggacctttta tcgattagag agcccgtttg aatctaatac ggtggcgtgg 2040
atgtttgtta gtccggatca gaaagaagcc ttgctgttca ccttcgttat tttaggtgca 2100
gttcaaccag aaccgcatat tacgaagtta gcgggattag accctcagca gacctacgtt 2160
gagaccgaca caaacaaaat gtacggtggc gatgaattga tgcaactagg actctacacg 2220
actcccgttc aaactagtga ctttacggcg caggtacatt acttcaaggc taaggactaa 2280
gatcagccat taaacatatt aaaacttaat catcgttaat ctaaaagaac gctctggcaa 2340
ataactcgcc ggaattc 2357
<210> 4
<211> 936
<212> DNA
<213> nisI基因序列（正向）
<400> 4
atgcatagat taatagtttt agctattaat ctttttttat ttttatttaa gaatggctta 60
ataaagcggt tactttggat ttttgtgagc ttggactaga aaaaaacttc acaaaatgct 120
atactaggta ggtaaaaaaa tattcggagg aattttgaaa tggcaatcgt ttcagcagaa 180
aaattcgtaa ttatgagaag atatttaata cttattgtgg ccttaatagg gataacaggt 240
ttatcagggt gttatcaaac aagtcataaa aaggtgaggt ttgacgaagg aagttatact 300
aattttattt atgataataa atcgtatttc gtaactgata aggagattcc tcaggagaac 360
gtcaacaatt ccaaagtaaa attttataag ctgttgattg ttgacatgaa aagtgagaaa 420
cttttatcaa gtagcaacaa aaatagtgtg actttggtct taaataatat ttatgaggct 480
tctgacaagt cgctatgtat gggtattaac gacagatact ataagatact tccagaaagt 540
gataaggggg cggtcaaagc tttgagatta caaaactttg atgtgacaag cgatatttct 600
gatgataatt ttgttattga taaaaatgat tcacgaaaaa ttgactatat gggaaatatt 660
tacagtatat cggacaccac cgtatctgat gaagaattgg gagaatatca ggatgtttta 720
gctgaagtac gtgtgtttga ttcagttagt ggcaaaagta tcccgaggtc tgaatggggg 780
agaattgata aggatggttc aaattccaaa cagagtagga cggaatggga ttatggcgaa 840
atccattcta ttagaggaaa atctcttact gaagcatttg ccgttgagat aaatgatgat 900
tttaagcttg caacgaaggt aggaaactag atgcat 936
<210> 5
<211> 1167
<212> DNA
<213> end-1基因序列
<400> 5
atgtatattg ataataatga ttggtcagga gttacttatt cacttggaga aggaaaattc 60
attgatttat caaaagttcg tgataaagga ggattatatt tttggattaa aggaaaactt 120
ggaggagaaa agttatatgt aggaattctt gataatcaag gacatgacat taaatcacaa 180
actaaagttg gattaaacga ttggattaaa gtatcaaaag attggcagct tgctaaaatt 240
ccattaaaac gttttacaga taagggaaaa gcatgggacg ctaacaagtc agcagaggtt 300
gctaaggata ttaaatggac acgttttcgt aaatctgctt cactttcaga ttgggcaaag 360
actcaagcaa atggaaaacc agcaccagta acagtttttg ttgatcaaat tacattcaca 420
tctaatatcg attgggtaga tccagattta aagtgggatt catttaaatc aaatgctcca 480
gattatgtta tttcagattt tgaaggtaaa tttgctaaag ataaatggga accatctaca 540
ggaccaaaat cacaacttaa atttaaagga gagaattgtg ctgaatttaa atctaattgt 600
cttaatattg aacactactt attagctgat tgggttgatg ttgttttaga tatgcaaaaa 660
aacggacgtc cagcagctga tcgtgattgg actaagcact ggggacttat gtttgacgtt 720
tattcagata aggcttggca atcaattaca gttcaagttc aagatgctgg taatgaaatt 780
tttgtttcta atgttggtgc tccaaaggct cgtccacaat attcatttcg ttcagttaga 840
tcagcttcat cccgtacaat taatcgttta acattactta aaacagtatc atcaaatctt 900
caaggagtta ctgctttaga ttttcgtcca tcaggagaag gtactgctgg aggatttaaa 960
attgataata ttcgtttaac aaatcaaaga gctgtaaaag ctaaagaacg tccagcagtt 1020
attaaagttc ttgttaaagg agaaaaagaa gttttaaacc cagaaatttc aggaggttta 1080
ttcggtatta atgctgcttt tggaacagct acttgttcaa caactcgtac atcacgtttt 1140
agattagtaa attcatctaa tggttaa 1167
<210> 6
<211> 8079
<212> DNA
<213> 乳酸乳球菌食品级双筛选标记分泌表达载体NN1-1和end-1
<400> 6
ggtgatttca gaatcgaaaa aaagagttat gatttctctg acaaaagagc aagataaaaa 60
attaacagat atggcgaaac aaaaaggttt ttcaaaatct gcggttgcgg cgttagctat 120
agaagaatat gcaagaaagg aatcagaaca aaaaaaataa gcgaaagctc gcgtttttag 180
aaggatacga gttttcgcta cttgtttttg ataaggtaat tatatcatgg ctattaaaaa 240
tactaaagct agaaattttg gatttttatt atatcctgac tcaattccta atgattggaa 300
agaaaaatta gagagtttgg gcgtatctat ggctgtcagt cctttacacg atatggacga 360
aaaaaaagat aaagatacat ggaatagtag tgatgttata cgaaatggaa agcactataa 420
aaaaccacac tatcacgtta tatatattgc acgaaatcct gtaacaatag aaagcgttag 480
gaacaagatt aagcgaaaat tggggaatag ttcagttgct catgttgaga tacttgatta 540
tatcaaaggt tcatatgaat atttgactca tgaatcaaag gacgctattg ctaagaataa 600
acatatatac gacaaaaaag atattttgaa cattaatgat tttgatattg accgctatat 660
aacacttgat gaaagccaaa aaagagaatt gaagaattta cttttagata tagtggatga 720
ctataatttg gtaaatacaa aagatttaat ggcttttatt cgccttaggg gagcggagtt 780
tggaatttta aatacgaatg atgtaaaaga tattgtttca acaaactcta gcgcctttag 840
attatggttt gagggcaatt atcagtgtgg atatagagca agttatgcaa aggttcttga 900
tgctgaaacg ggggaaataa aatgacaaac aaagaaaaag agttatttgc tgaaaatgag 960
gaattaaaaa aagaaattaa ggacttaaaa gagcgtattg aaagatacag agaaatggaa 1020
gttgaattaa gtacaacaat agatttattg agaggaggga ttattgaata aataaaagcc 1080
ccctgacgaa agtcgaaggg ggtttttatt ttggtttgat gttgcgatta atagcaatac 1140
aattgcaata aacaaaatga tcgacctcgg gacccctatc tagcgaactt ttagaaaaga 1200
tataaaacat cagagtatgg acagttgcgg atgtacttca gaaaagatta gatgtctaaa 1260
aagctagctt tttagacatc taaatctagg tactaaaaca attcatccag taaaatataa 1320
tattttattt tctcccaatc aggcttgatc cccagtaagt caaaaaatag ctcgacatac 1380
tgttcttccc cgatcgaccc gattcacaaa aaataggcac acgaaaaaca agttaaggga 1440
tgcagtttat gcatctagtt tcctaccttc gttgcaagct taaaatcatc atttatctca 1500
acggcaaatg cttcagtaag agattttcct ctaatagaat ggatttcgcc ataatcccat 1560
tccgtcctac tctgtttgga atttgaacca tccttatcaa ttctccccca ttcagacctc 1620
gggatacttt tgccactaac tgaatcaaac acacgtactt cagctaaaac atcctgatat 1680
tctcccaatt cttcatcaga tacggtggtg tccgatatac tgtaaatatt tcccatatag 1740
tcaatttttc gtgaatcatt tttatcaata acaaaattat catcagaaat atcgcttgtc 1800
acatcaaagt tttgtaatct caaagctttg accgccccct tatcactttc tggaagtatc 1860
ttatagtatc tgtcgttaat acccatacat agcgacttgt cagaagcctc ataaatatta 1920
tttaagacca aagtcacact atttttgttg ctacttgata aaagtttctc acttttcatg 1980
tcaacaatca acagcttata aaattttact ttggaattgt taacgttctc ctgaggaatc 2040
tccttatcag ttacgaaata cgatttatta tcataaataa aattagtata acttccttcg 2100
tcaaacctca cctttttatg acttgtttga taacaccctg ataaacctgt tatccctatt 2160
aaggccacaa taagtattaa atatcttctc ataattacga atttttctgc tgaaacgatt 2220
gccatttcaa aattcctccg aatatttttt tacctaccta gtatagcatt ttgtgaagtt 2280
tttttctagt ccaagctcac aaaaatccaa agtaaccgct ttattaagcc attcttaaat 2340
aaaaataaaa aaagattaat agctaaaact attaatctat gcatccctta acttacttat 2400
taaataattt atagctattg aaaagagata agaattgttc aaagctaata ttgtttaaat 2460
cgtcaattcc tgcatgtttt aaggaattgt taaattgatt ttttgtaaat attttcttgt 2520
attctttgtt aacccatttc ataacgaaat aattatactt ttgtttatct ttgtgtgata 2580
ttcttgattt ttttctactt aatctgataa gtgagctatt cactttaggt ttaggatgaa 2640
aatattctct tggaaccata cttaatatag aaatatcaac ttctgccatt aaaagtaatg 2700
ccaatgagcg ttttgtattt aataatcttt tagcaaaccc gtattccacg attaaataaa 2760
tctcattagc tatactatca aaaacaattt tgcgtattat atccgtactt atgttataag 2820
gtatattacc atatatttta taggattggt ttttaggaaa tttaaactgc aatatatcct 2880
tgtttaaaac ttggaaatta tcgtgatcaa caagtttatt ttctgtagtt ttgcataatt 2940
tatggtctat ttcaatggca gttacgaaat tacacctctt tactaattca agggtaaaat 3000
ggccttttcc tgagccgatt tcaaagatat tatcatgttc atttaatctt atatttgtca 3060
ttattttatc tatattatgt tttgaagtaa taaagttttg actgtgtttt atatttttct 3120
cgttcattat aaccctcttt aatttggtta tatgaatttt gcttattaac gattcattat 3180
aaccacttat tttttgtttg gttgataatg aactgtgctg attacaaaaa tactaaaaat 3240
gcccatattt tttcctcctt ataaaattag tataattata gcacggtcga tcttctatat 3300
aaaagatata ttatcttatc agtattgtca atatattcaa ggcaatctgc ctcctcatcc 3360
tcttcatccg ttaacttgtg aactgaaata gaaaaagcta atagcgaagg gaagatttta 3420
ctatggcagt aacgttgcag caaactttaa ttgacattga tgaagaacaa cttgtctttc 3480
acctgcataa cgatcaaatc tcgtatattc taggtgtgga gacaggcaac gtgttggccc 3540
acttgtactt tggcccacgg gttcggggtt atcatggcga gcgtcagtat ccccggattg 3600
atcgggggtt ctcaggaaat ttaccgaata cgactgatcg aagctattcc aaggatgatt 3660
tgccacagga atacggtggc aataataccg gtgattatcg gcaacccgcc gcgattattc 3720
gcgcggccaa tggtgctcga acagttgatt ttcgttatca agactgccgg atggaagccg 3780
gtaagccgga acttaagggc ttgccacaaa cttatgtcga agatgaggat gaagcccaaa 3840
ctttgattgt gacgttgcga gatgccacat taggcgtgac actcgaatta gcctacacga 3900
tttatcggga tcggccagtt atcacgcgta gcgcccggtt gattaatcac agtgagcaag 3960
ctgtcgactt agaaaaagtg gcttcgatgc agatggacct gccaacccaa ccattagatg 4020
ccatttcgtt acctggaagc tatgcgcgtg agcgccagct tagtcgtgaa cggctccatc 4080
gaggtgtaac tcagtttgaa agtcgccggg gtgctagttc tcatcatatg aatccttttg 4140
tggcgctagc tgatccgaat actaatgaat ttcaaggcaa tgtccttggt gcattgctaa 4200
tttattcagg taaccaccag attagtttag aacgggaccc aattggtcag acacgcttga 4260
ctatgggaat caatgaatat aacttcgact ggcgattggc ggccggtgat agtttccaaa 4320
cgcccgaggt tgcaatggta tactcgacga cggggcttaa tggtatgtcg caaacctacc 4380
atgatttatt gcgtgatcgc gtggcgcgca gtcgttacaa gcacgatctc cggccgatct 4440
tgatcaacaa ttgggaagcc acttactttg actttgatgc ggacaagatt caatcaatct 4500
tggatgctgc agcaccactg ggtatcgaaa tgtttgtgct ggatgacggt tggttcggtc 4560
atcgaaatga tgataatagt tcgctaggtg actggtttgt taatcggaac aagttaccag 4620
gaggcttagc ggatattagc aaacggaccc atgataaagg gatgcggttc ggactttggt 4680
tcgagccaga aaatatttca gccgattccg atctttatcg ggcccatcct gattgggtgt 4740
taggcgtacc agatcgtggc cgaacgttat cgcggaacga atacgtgctt gatttcagcc 4800
agccggatgt tgtcgacaat atttttgaac aaatgaccgc agttcttgat aaggtgccca 4860
ttgattatat caagtgggat atgaaccgca atttaacgga agtctattcg ccacatagcg 4920
attcaactca tgaaggtgag actagccacc gctttatctt aggtgtatat gacttgatgg 4980
agcgtttaac aaaacgctat ccacagatct tatttgaagg ctgctctggc ggtggtggcc 5040
gctttgatgc tggtttaatg tattatatgc cacagagttg gccatcagat aataatgacc 5100
cgattgaacg gctcaaaatt caatatggga cttcactcgt ttatccaatc tctgcaatta 5160
ccgcccatgt tgggacgagc ccggatgaat tgttaggacg gtcgacgtcg atgaagatgc 5220
gtggtgctgt ggcaatgagt ggtaccttgg gctatgaact ggacgcggcc caactaagtg 5280
atgcggacaa gcaggccgtt aaaagacagg ttgccttcta taagcagcac cgtgagttag 5340
ttcaatacgg gaccttttat cgattagaga gcccgtttga atctaatacg gtggcgtgga 5400
tgtttgttag tccggatcag aaagaagcct tgctgttcac cttcgttatt ttaggtgcag 5460
ttcaaccaga accgcatatt acgaagttag cgggattaga ccctcagcag acctacgttg 5520
agaccgacac aaacaaaatg tacggtggcg atgaattgat gcaactagga ctctacacga 5580
ctcccgttca aactagtgac tttacggcgc aggtacatta cttcaaggct aaggactaag 5640
atcagccatt aaacatatta aaacttaatc atcgttaatc taaaagaacg ctctggcaaa 5700
taactcgccg gaattcagat taatagtttt agctattaat ctttttttat ttttatttaa 5760
gaatggctta ataaagcggt tactttggat ttttgtgagc ttggactaga aaaaaacttc 5820
acaaaatgct atactagggg atccaaccga acttaatggg aggaaaaatt aaaaaagaac 5880
agttatgaaa aaaaagatta tctcagctat tttaatgtct acagtgatac tttctgctgc 5940
agccccgttg tcaggtgttt acgctgacac aaactcagat attgctaaac aagatgcgga 6000
gctcgcccgg ggatcgatcc tctagaatat gtatattgat aataatgatt ggtcaggagt 6060
tacttattca cttggagaag gaaaattcat tgatttatca aaagttcgtg ataaaggagg 6120
attatatttt tggattaaag gaaaacttgg aggagaaaag ttatatgtag gaattcttga 6180
taatcaagga catgacatta aatcacaaac taaagttgga ttaaacgatt ggattaaagt 6240
atcaaaagat tggcagcttg ctaaaattcc attaaaacgt tttacagata agggaaaagc 6300
atgggacgct aacaagtcag cagaggttgc taaggatatt aaatggacac gttttcgtaa 6360
atctgcttca ctttcagatt gggcaaagac tcaagcaaat ggaaaaccag caccagtaac 6420
agtttttgtt gatcaaatta cattcacatc taatatcgat tgggtagatc cagatttaaa 6480
gtgggattca tttaaatcaa atgctccaga ttatgttatt tcagattttg aaggtaaatt 6540
tgctaaagat aaatgggaac catctacagg accaaaatca caacttaaat ttaaaggaga 6600
gaattgtgct gaatttaaat ctaattgtct taatattgaa cactacttat tagctgattg 6660
ggttgatgtt gttttagata tgcaaaaaaa cggacgtcca gcagctgatc gtgattggac 6720
taagcactgg ggacttatgt ttgacgttta ttcagataag gcttggcaat caattacagt 6780
tcaagttcaa gatgctggta atgaaatttt tgtttctaat gttggtgctc caaaggctcg 6840
tccacaatat tcatttcgtt cagttagatc agcttcatcc cgtacaatta atcgtttaac 6900
attacttaaa acagtatcat caaatcttca aggagttact gctttagatt ttcgtccatc 6960
aggagaaggt actgctggag gatttaaaat tgataatatt cgtttaacaa atcaaagagc 7020
tgtaaaagct aaagaacgtc cagcagttat taaagttctt gttaaaggag aaaaagaagt 7080
tttaaaccca gaaatttcag gaggtttatt cggtattaat gctgcttttg gaacagctac 7140
ttgttcaaca actcgtacat cacgttttag attagtaaat tcatctaatg gttaagcatg 7200
caagcttgca aagtctgaaa acgaaggtgg cagctgccgt tgaagcggcc aagacagttg 7260
gtaaaggcga cggtacaacc ggtactagcg acaaaggcgg cggtcaaggt accccggcgc 7320
tacgatattt ggagttgagg ttcaaagtca aatggtactg atgaccggta aaatttaata 7380
ttttgaacct tgcttaggca gctgacttca cattgttgag atcagctgcc ttttgcttat 7440
agttcattga gtagaaacgg ttctgttgcg aagtttgaaa atcaaacgca agctcgattt 7500
tttattaaaa cgtctcaaaa tcgtttctga gacgttttag cgtttatttc gtttagttat 7560
cggcataatc gttaaaacag gcgttatcgt agcgtaaaag cccttgagcg tagcgtggct 7620
ttgcagcgaa gatgttgtct gttagattat gaaagccgat gactgaatga aataataagc 7680
gcagcgccct tctatttcgg ttggaggagg ctcaagggag tatgagggaa tgaaattccc 7740
tcatgggttt gattttaaaa attgcttgca attttgccga gcggtagcgc tggaaaattt 7800
ttgaaaaaaa tttggaattt ggaaaaaaat ggggggaaag gaagcgaatt ttgcttccgt 7860
actacgaccc cccattaagt gccgagtgcc aatttttgtg ccaaaaacgc tctatcccaa 7920
ctggctcaag ggtttaaggg gtttttcaat cgccaacgaa tcgccaacgt tttcgccaac 7980
gttttttata aatctatatt taagtagctt tattgttgtt tttatgatta caaagtgata 8040
cactaacttt ataaaattat ttgattggag ttttttaat 8079
<210> 7
<211> 8079
<212> DNA
<213> 乳酸乳球菌食品级双筛选标记分泌表达载体的部分序列
<400> 7
ggtgatttca gaatcgaaaa aaagagttat gatttctctg acaaaagagc aagataaaaa 60
attaacagat atggcgaaac aaaaaggttt ttcaaaatct gcggttgcgg cgttagctat 120
agaagaatat gcaagaaagg aatcagaaca aaaaaaataa gcgaaagctc gcgtttttag 180
aaggatacga gttttcgcta cttgtttttg ataaggtaat tatatcatgg ctattaaaaa 240
tactaaagct agaaattttg gatttttatt atatcctgac tcaattccta atgattggaa 300
agaaaaatta gagagtttgg gcgtatctat ggctgtcagt cctttacacg atatggacga 360
aaaaaaagat aaagatacat ggaatagtag tgatgttata cgaaatggaa agcactataa 420
aaaaccacac tatcacgtta tatatattgc acgaaatcct gtaacaatag aaagcgttag 480
gaacaagatt aagcgaaaat tggggaatag ttcagttgct catgttgaga tacttgatta 540
tatcaaaggt tcatatgaat atttgactca tgaatcaaag gacgctattg ctaagaataa 600
acatatatac gacaaaaaag atattttgaa cattaatgat tttgatattg accgctatat 660
aacacttgat gaaagccaaa aaagagaatt gaagaattta cttttagata tagtggatga 720
ctataatttg gtaaatacaa aagatttaat ggcttttatt cgccttaggg gagcggagtt 780
tggaatttta aatacgaatg atgtaaaaga tattgtttca acaaactcta gcgcctttag 840
attatggttt gagggcaatt atcagtgtgg atatagagca agttatgcaa aggttcttga 900
tgctgaaacg ggggaaataa aatgacaaac aaagaaaaag agttatttgc tgaaaatgag 960
gaattaaaaa aagaaattaa ggacttaaaa gagcgtattg aaagatacag agaaatggaa 1020
gttgaattaa gtacaacaat agatttattg agaggaggga ttattgaata aataaaagcc 1080
ccctgacgaa agtcgaaggg ggtttttatt ttggtttgat gttgcgatta atagcaatac 1140
aattgcaata aacaaaatga tcgacctcgg gacccctatc tagcgaactt ttagaaaaga 1200
tataaaacat cagagtatgg acagttgcgg atgtacttca gaaaagatta gatgtctaaa 1260
aagctagctt tttagacatc taaatctagg tactaaaaca attcatccag taaaatataa 1320
tattttattt tctcccaatc aggcttgatc cccagtaagt caaaaaatag ctcgacatac 1380
tgttcttccc cgatcgaccc gattcacaaa aaataggcac acgaaaaaca agttaaggga 1440
tgcagtttat gcatctagtt tcctaccttc gttgcaagct taaaatcatc atttatctca 1500
acggcaaatg cttcagtaag agattttcct ctaatagaat ggatttcgcc ataatcccat 1560
tccgtcctac tctgtttgga atttgaacca tccttatcaa ttctccccca ttcagacctc 1620
gggatacttt tgccactaac tgaatcaaac acacgtactt cagctaaaac atcctgatat 1680
tctcccaatt cttcatcaga tacggtggtg tccgatatac tgtaaatatt tcccatatag 1740
tcaatttttc gtgaatcatt tttatcaata acaaaattat catcagaaat atcgcttgtc 1800
acatcaaagt tttgtaatct caaagctttg accgccccct tatcactttc tggaagtatc 1860
ttatagtatc tgtcgttaat acccatacat agcgacttgt cagaagcctc ataaatatta 1920
tttaagacca aagtcacact atttttgttg ctacttgata aaagtttctc acttttcatg 1980
tcaacaatca acagcttata aaattttact ttggaattgt taacgttctc ctgaggaatc 2040
tccttatcag ttacgaaata cgatttatta tcataaataa aattagtata acttccttcg 2100
tcaaacctca cctttttatg acttgtttga taacaccctg ataaacctgt tatccctatt 2160
aaggccacaa taagtattaa atatcttctc ataattacga atttttctgc tgaaacgatt 2220
gccatttcaa aattcctccg aatatttttt tacctaccta gtatagcatt ttgtgaagtt 2280
tttttctagt ccaagctcac aaaaatccaa agtaaccgct ttattaagcc attcttaaat 2340
aaaaataaaa aaagattaat agctaaaact attaatctat gcatccctta acttacttat 2400
taaataattt atagctattg aaaagagata agaattgttc aaagctaata ttgtttaaat 2460
cgtcaattcc tgcatgtttt aaggaattgt taaattgatt ttttgtaaat attttcttgt 2520
attctttgtt aacccatttc ataacgaaat aattatactt ttgtttatct ttgtgtgata 2580
ttcttgattt ttttctactt aatctgataa gtgagctatt cactttaggt ttaggatgaa 2640
aatattctct tggaaccata cttaatatag aaatatcaac ttctgccatt aaaagtaatg 2700
ccaatgagcg ttttgtattt aataatcttt tagcaaaccc gtattccacg attaaataaa 2760
tctcattagc tatactatca aaaacaattt tgcgtattat atccgtactt atgttataag 2820
gtatattacc atatatttta taggattggt ttttaggaaa tttaaactgc aatatatcct 2880
tgtttaaaac ttggaaatta tcgtgatcaa caagtttatt ttctgtagtt ttgcataatt 2940
tatggtctat ttcaatggca gttacgaaat tacacctctt tactaattca agggtaaaat 3000
ggccttttcc tgagccgatt tcaaagatat tatcatgttc atttaatctt atatttgtca 3060
ttattttatc tatattatgt tttgaagtaa taaagttttg actgtgtttt atatttttct 3120
cgttcattat aaccctcttt aatttggtta tatgaatttt gcttattaac gattcattat 3180
aaccacttat tttttgtttg gttgataatg aactgtgctg attacaaaaa tactaaaaat 3240
gcccatattt tttcctcctt ataaaattag tataattata gcacggtcga tcttctatat 3300
aaaagatata ttatcttatc agtattgtca atatattcaa ggcaatctgc ctcctcatcc 3360
tcttcatccg ttaacttgtg aactgaaata gaaaaagcta atagcgaagg gaagatttta 3420
ctatggcagt aacgttgcag caaactttaa ttgacattga tgaagaacaa cttgtctttc 3480
acctgcataa cgatcaaatc tcgtatattc taggtgtgga gacaggcaac gtgttggccc 3540
acttgtactt tggcccacgg gttcggggtt atcatggcga gcgtcagtat ccccggattg 3600
atcgggggtt ctcaggaaat ttaccgaata cgactgatcg aagctattcc aaggatgatt 3660
tgccacagga atacggtggc aataataccg gtgattatcg gcaacccgcc gcgattattc 3720
gcgcggccaa tggtgctcga acagttgatt ttcgttatca agactgccgg atggaagccg 3780
gtaagccgga acttaagggc ttgccacaaa cttatgtcga agatgaggat gaagcccaaa 3840
ctttgattgt gacgttgcga gatgccacat taggcgtgac actcgaatta gcctacacga 3900
tttatcggga tcggccagtt atcacgcgta gcgcccggtt gattaatcac agtgagcaag 3960
ctgtcgactt agaaaaagtg gcttcgatgc agatggacct gccaacccaa ccattagatg 4020
ccatttcgtt acctggaagc tatgcgcgtg agcgccagct tagtcgtgaa cggctccatc 4080
gaggtgtaac tcagtttgaa agtcgccggg gtgctagttc tcatcatatg aatccttttg 4140
tggcgctagc tgatccgaat actaatgaat ttcaaggcaa tgtccttggt gcattgctaa 4200
tttattcagg taaccaccag attagtttag aacgggaccc aattggtcag acacgcttga 4260
ctatgggaat caatgaatat aacttcgact ggcgattggc ggccggtgat agtttccaaa 4320
cgcccgaggt tgcaatggta tactcgacga cggggcttaa tggtatgtcg caaacctacc 4380
atgatttatt gcgtgatcgc gtggcgcgca gtcgttacaa gcacgatctc cggccgatct 4440
tgatcaacaa ttgggaagcc acttactttg actttgatgc ggacaagatt caatcaatct 4500
tggatgctgc agcaccactg ggtatcgaaa tgtttgtgct ggatgacggt tggttcggtc 4560
atcgaaatga tgataatagt tcgctaggtg actggtttgt taatcggaac aagttaccag 4620
gaggcttagc ggatattagc aaacggaccc atgataaagg gatgcggttc ggactttggt 4680
tcgagccaga aaatatttca gccgattccg atctttatcg ggcccatcct gattgggtgt 4740
taggcgtacc agatcgtggc cgaacgttat cgcggaacga atacgtgctt gatttcagcc 4800
agccggatgt tgtcgacaat atttttgaac aaatgaccgc agttcttgat aaggtgccca 4860
ttgattatat caagtgggat atgaaccgca atttaacgga agtctattcg ccacatagcg 4920
attcaactca tgaaggtgag actagccacc gctttatctt aggtgtatat gacttgatgg 4980
agcgtttaac aaaacgctat ccacagatct tatttgaagg ctgctctggc ggtggtggcc 5040
gctttgatgc tggtttaatg tattatatgc cacagagttg gccatcagat aataatgacc 5100
cgattgaacg gctcaaaatt caatatggga cttcactcgt ttatccaatc tctgcaatta 5160
ccgcccatgt tgggacgagc ccggatgaat tgttaggacg gtcgacgtcg atgaagatgc 5220
gtggtgctgt ggcaatgagt ggtaccttgg gctatgaact ggacgcggcc caactaagtg 5280
atgcggacaa gcaggccgtt aaaagacagg ttgccttcta taagcagcac cgtgagttag 5340
ttcaatacgg gaccttttat cgattagaga gcccgtttga atctaatacg gtggcgtgga 5400
tgtttgttag tccggatcag aaagaagcct tgctgttcac cttcgttatt ttaggtgcag 5460
ttcaaccaga accgcatatt acgaagttag cgggattaga ccctcagcag acctacgttg 5520
agaccgacac aaacaaaatg tacggtggcg atgaattgat gcaactagga ctctacacga 5580
ctcccgttca aactagtgac tttacggcgc aggtacatta cttcaaggct aaggactaag 5640
atcagccatt aaacatatta aaacttaatc atcgttaatc taaaagaacg ctctggcaaa 5700
taactcgccg gaattcagat taatagtttt agctattaat ctttttttat ttttatttaa 5760
gaatggctta ataaagcggt tactttggat ttttgtgagc ttggactaga aaaaaacttc 5820
acaaaatgct atactagggg atccaaccga acttaatggg aggaaaaatt aaaaaagaac 5880
agttatgaaa aaaaagatta tctcagctat tttaatgtct acagtgatac tttctgctgc 5940
agccccgttg tcaggtgttt acgctgacac aaactcagat attgctaaac aagatgcgga 6000
gctcgcccgg ggatcgatcc tctagaatat gtatattgat aataatgatt ggtcaggagt 6060
tacttattca cttggagaag gaaaattcat tgatttatca aaagttcgtg ataaaggagg 6120
attatatttt tggattaaag gaaaacttgg aggagaaaag ttatatgtag gaattcttga 6180
taatcaagga catgacatta aatcacaaac taaagttgga ttaaacgatt ggattaaagt 6240
atcaaaagat tggcagcttg ctaaaattcc attaaaacgt tttacagata agggaaaagc 6300
atgggacgct aacaagtcag cagaggttgc taaggatatt aaatggacac gttttcgtaa 6360
atctgcttca ctttcagatt gggcaaagac tcaagcaaat ggaaaaccag caccagtaac 6420
agtttttgtt gatcaaatta cattcacatc taatatcgat tgggtagatc cagatttaaa 6480
gtgggattca tttaaatcaa atgctccaga ttatgttatt tcagattttg aaggtaaatt 6540
tgctaaagat aaatgggaac catctacagg accaaaatca caacttaaat ttaaaggaga 6600
gaattgtgct gaatttaaat ctaattgtct taatattgaa cactacttat tagctgattg 6660
ggttgatgtt gttttagata tgcaaaaaaa cggacgtcca gcagctgatc gtgattggac 6720
taagcactgg ggacttatgt ttgacgttta ttcagataag gcttggcaat caattacagt 6780
tcaagttcaa gatgctggta atgaaatttt tgtttctaat gttggtgctc caaaggctcg 6840
tccacaatat tcatttcgtt cagttagatc agcttcatcc cgtacaatta atcgtttaac 6900
attacttaaa acagtatcat caaatcttca aggagttact gctttagatt ttcgtccatc 6960
aggagaaggt actgctggag gatttaaaat tgataatatt cgtttaacaa atcaaagagc 7020
tgtaaaagct aaagaacgtc cagcagttat taaagttctt gttaaaggag aaaaagaagt 7080
tttaaaccca gaaatttcag gaggtttatt cggtattaat gctgcttttg gaacagctac 7140
ttgttcaaca actcgtacat cacgttttag attagtaaat tcatctaatg gttaagcatg 7200
caagcttgca aagtctgaaa acgaaggtgg cagctgccgt tgaagcggcc aagacagttg 7260
gtaaaggcga cggtacaacc ggtactagcg acaaaggcgg cggtcaaggt accccggcgc 7320
tacgatattt ggagttgagg ttcaaagtca aatggtactg atgaccggta aaatttaata 7380
ttttgaacct tgcttaggca gctgacttca cattgttgag atcagctgcc ttttgcttat 7440
agttcattga gtagaaacgg ttctgttgcg aagtttgaaa atcaaacgca agctcgattt 7500
tttattaaaa cgtctcaaaa tcgtttctga gacgttttag cgtttatttc gtttagttat 7560
cggcataatc gttaaaacag gcgttatcgt agcgtaaaag cccttgagcg tagcgtggct 7620
ttgcagcgaa gatgttgtct gttagattat gaaagccgat gactgaatga aataataagc 7680
gcagcgccct tctatttcgg ttggaggagg ctcaagggag tatgagggaa tgaaattccc 7740
tcatgggttt gattttaaaa attgcttgca attttgccga gcggtagcgc tggaaaattt 7800
ttgaaaaaaa tttggaattt ggaaaaaaat ggggggaaag gaagcgaatt ttgcttccgt 7860
actacgaccc cccattaagt gccgagtgcc aatttttgtg ccaaaaacgc tctatcccaa 7920
ctggctcaag ggtttaaggg gtttttcaat cgccaacgaa tcgccaacgt tttcgccaac 7980
gttttttata aatctatatt taagtagctt tattgttgtt tttatgatta caaagtgata 8040
cactaacttt ataaaattat ttgattggag ttttttaat 8079

Claims (9)

1.一种乳酸球菌食品级双筛选标记分泌表达载体，其特征在于所述载体包含P32启动子和乳酸球菌Usp45分泌蛋白的融合基因、melA基因和nisI基因双选择标记、质粒pWV01的复制子和多克隆位点；所述融合基因的核苷酸序列如SEQ No.2所示。
2.根据权利要求1所示的乳酸球菌食品级双筛选标记分泌表达载体，其特征在于所述的融合基因与外源基因在乳酸球菌中融合表达，以实现外源基因在乳酸球菌里分泌表达。
3.根据权利要求1所示的乳酸球菌食品级双筛选标记分泌表达载体，其特征在于所述的融合基因位于EcoRI和SacI多克隆位点之间。
4.权利要求1-3任一项所述的乳酸球菌食品级双筛选标记分泌表达载体的构建方法，该方法包括：
(1)分别提取乳酸乳球菌MG 1363和乳酸杆菌的基因组DNA，以所述基因组DNA为PCR模板分别扩增到melA(α-半乳糖苷酶)和Usp45分泌蛋白的核苷酸序列；
(2)以乳酸菌表达载体pMG36e为PCR模板，扩增得到p32启动子的核苷酸序列；
(3)分别用BamHI单酶切p32启动子和Usp45分泌蛋白的PCR产物后，进行连接，然后以连接产物的模板，用高保真酶进行PCR，从而得到融合基因序列；
(4)根据NCBI中公布的nisI基因序列，并结合P32启动子序列，设计出nisI完整的表达框核苷酸序列，然后通过人工合成的方式合成nisI融合基因；
(5)将p32+SPusp45融合基因、melA、nisI融合基因分别与T克隆载体进行连接、并转化到大肠杆菌感受态细胞中；
(6)分别提取含有这三个基因的质粒，与pMG36e载体分别进行双酶切或单酶切，各个酶切下的基因分别与自身对应的酶切pMG36e进行连接，从而构建出双筛选标记分泌表达载体；
(7)将含有红霉素基因的双筛选标记分泌表达载体进行HpaI单酶切再自连，构建出食品级双筛选标记分泌表达载体NN1；
(8)将NN1-1质粒通过电传孔的方式转化到乳酸乳球菌MG1363感受态细胞中；
(9)对所得表达载体NN1-1中melA、nisI融合基因的功能效果进行检测并确认。
5.根据权利要求1-3中任一项权利要求所述的乳酸乳球菌食品级分泌表达载体作在分泌表达外源基因中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述外源蛋白的编码基因是产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)的内切葡聚糖酶(end-l)的编码基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ No.5所示。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于所述在乳酸乳球菌中分泌表达产琥珀酸丝状杆菌内切葡聚糖酶(end-l)的载体是NN1-end-I，所述载体的核苷酸序列如SEQ No.6所示。
8.一株重组乳酸乳球菌，所述乳酸乳球菌包含根据权利要求1-5任一项所述的乳酸球菌食品级双筛选标记分泌表达载体及宿主菌。
9.根据权利要求8所述的种组乳酸乳球菌，其特征在于所述宿主菌是乳酸乳球菌MG1363。
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