CN111394295B - 一种制备固定化精氨酸脱亚胺酶及生产[14/15n]-l-瓜氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种制备固定化精氨酸脱亚胺酶及生产[14/15N]‑L‑瓜氨酸的方法，所述基因工程菌中表达精氨酸脱亚胺酶。本申请还公开了一种由cipA‑arc表达的融合蛋白及其制备方法。本申请公开的含cipA‑精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌和由cipA‑arc表达的cipA‑arc融合蛋白均可用于转化[14/15N]‑L‑精氨酸生产[14/15N]‑L‑瓜氨酸。本申请还提供了一种[14/15N]‑L‑瓜氨酸的酶催化制备新方法。该方法产物后处理简单，操作方便，易于放大生产，酶蛋白可重复利用，生产成本低。

Description

一种制备固定化精氨酸脱亚胺酶及生产[14/15N]-L-瓜氨酸的 方法
技术领域
本申请涉及一种生物催化制备[14/15N]-L-瓜氨酸的方法，属于生物制药和生物化工技术领域。
背景技术
瓜氨酸是一种α-氨基酸，因最先从西瓜中获取，而得名瓜氨酸。L-瓜氨酸能提高体内一氧化氮的含量，一氧化氮可舒缓动脉，促进全身血液流动从而更好的工作。瓜氨酸对防治前列腺疾病，包括前列腺炎、前列腺肿胀、前列腺肥大等作用明显。最近研究表明，瓜氨酸在体内转化为人体必需氨基酸L-精氨酸。精氨酸缺乏可导致一系列的心血管疾病，包括高血压、动脉粥样硬化、心衰等。由于L-瓜氨酸作为合成L-精氨酸的前体，在许多组织中能转化成L-精氨酸，且在胃肠道和肝脏中不代谢，亦不诱导精氨酸酶活性升高，因此补充L-瓜氨酸能辅助治疗精氨酸缺乏引起的相关疾病。瓜氨酸有较强的抗氧化能力，能够清除自由基，可有效保护DNA免受氧化反应的侵害，可以作为抗衰老、提高免疫力的保健品，也可作为美容化妆品，具有护肤防皱祛斑之功效。服用瓜氨酸能有效的改善人体的抗疲劳能力，维护健康的心肺功能，提高脑力清晰度，降低压力和克服沮丧情绪，平衡血糖浓度，增强人体的肌肉强度，在运动保健方面具有良好的作用。
目前，瓜氨酸常用的生产方法主要有化学合成法、提取法、发酵法、酶转化法等。化学法是在碱性条件下水解精氨酸获得瓜氨酸，存在工艺难以精确控制，产物属于非单一构型，含有D-瓜氨酸，影响质量，产生的废水影响环境。专利CN105483060中通过发酵法生产瓜氨酸，主要采用诱变选育的方法，存在生产菌株随机性大，很难得到高产菌种。天然产物中瓜氨酸含量较低，原料来源受限，生产规模小，工艺复杂，产率低。专利CN104805144采用酶转化法合成瓜氨酸，工艺简单。但是使用的菌种为大肠杆菌，存在革兰氏阴性菌共同的缺点就是含有内毒素，限制其在食品或化妆品中的应用。
固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应，整体结构保持不变，酶的催化活性得到很好保留。但是，由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用，因此对一些反应不适用。化学法包括结合法、交联法。化学法酶与载体之间结合紧密，不易脱落，稳定性好，但反应条件激烈，操作复杂，控制条件苛刻，活力损失较大。
发明内容
根据本申请的第一方面，提供了一种含精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌，所述基因工程菌中表达精氨酸脱亚胺酶。具体的，所述基因工程菌中，在谷氨酸棒杆菌中表达出精氨酸脱亚胺酶，所述的基因工程菌保藏名称为谷氨酸棒杆菌SUMHS-2020.01，分类命名为Corynebacterium glutamicum，该菌株已于2020年1月17日保藏于中国北京市朝阳区北辰西路1 号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏中心的保藏编号为CGMCC No.19404。
所述基因工程菌由以下步骤制备：
(1)将cipA基因序列在DNA5’端引入HindIII位点，3’端引入SalI位点，得到基因序列为SEQ ID NO.1的片段，合成的片段经过测序后，用HindIII/SalI双酶切目标基因和表达载体 pXMJ19，酶切产物经过凝胶回收后，将目标片段和载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞，获得阳性转化子pXMJ19-cipA；
(2)将精氨酸脱亚胺酶arc基因序列在DNA5’端引入XhoI位点，3’端引入SacI位点，得到基因序列为SEQ ID NO.2的片段，合成的片段经过测序后，用XhoI/SacI双酶切目标基因和表达载体pXMJ19-cipA，酶切产物经过凝胶回收后，将目标片段和载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得阳性转化子重组质粒pXMJ19-cipA-arc。
根据本申请的第二方面，提供了本申请的第一方面所述的含精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌用于转化[14/15N]-L-精氨酸生产[14/15N]-L-瓜氨酸的应用。
根据本申请的第三方面，提供了一种cipA-arc融合蛋白，精氨酸脱亚胺酶arc固定于包涵体蛋白cipA上，产生具有催化活性的包涵体蛋白cipA-arc即cipA-arc融合蛋白。
可选地，所述cipA-arc融合蛋白由以下步骤制备：
(1)制备谷氨酸棒杆菌感受态细胞；
(2)重组质粒pXMJ19-cipA-arc电击转化谷氨酸棒杆菌感受态细胞；
(3)基因工程菌诱导表达得到的重组菌体全细胞，经过超声破碎、离心后，所得的沉淀即为cipA-arc融合蛋白(即包涵体蛋白cipA-arc形式固定化)。
可选地，所述谷氨酸棒杆菌感受态细胞由如下方法制备：
将谷氨酸棒杆菌ATCC13032在含LBG固体培养基中培养后，挑取新鲜菌株接种于LBG 液体培养基中，经培养后按0.8-1.5％的接种量将活化菌液转接至LBG培养基中，继续培养至 OD600为0.8-1.0；将菌液经冰水混合物预冷、离心，吸出上清液后加入甘油，吹吸至菌体悬浮，再次经离心、吸出上清液后加入甘油，吹吸至菌体悬浮，即可得到谷氨酸棒杆菌感受态细胞。
作为优选方案中将谷氨酸棒杆菌ATCC13032划线于含LBG(LBG液体培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，葡萄糖5g，调节pH7.0-7.5，补足去离子水至1L；固体平板为LBG液体培养基+12-15g/L的琼脂粉)固体培养基的平板中，于培养箱培养，待菌体长出挑取新鲜菌株接种于LBG液体培养基中，于温度为20-40℃转速为150-300r/min摇床中培养 12-24h；按1％接种量将活化菌液转接至LBG培养基中，于温度为20-40℃转速为150-300r/min摇床中培养至OD600为0.9；将菌液置于冰水混合物中预冷15-20min，再于超净台中将预冷的菌液分装至灭菌的离心管中，4℃6000g离心30s，冰水放置2min；将离心管中的上清液吸出，向离心管中各加入预冷的10％甘油，用移液枪缓慢吹吸至菌体悬浮；悬浮液于4℃6000g离心30s，将离心管中的上清液吸出，向离心管中加入预冷的10％甘油，用移液枪缓慢吹吸至菌体悬浮。
可选地，所述培养的温度均为30℃；所述培养时的转速均为200r/min。
可选地，所述重组质粒pXMJ19-cipA-arc电击转化感受态细胞由如下方法制备：
取谷氨酸棒杆菌感受态细胞和重组质粒pXMJ19-cipA-arc混匀，冰上冷却后，在相同温度条件下，以电击条件为电压1-5kV，电击1-10ms；再在室温下加入LBG液体培养基，转移到离心管中，经振荡培养后取所得液体涂布于含氯霉素抗性平板，挑选单菌落提取质粒，再通过双酶切、PCR确认目的片段的插入，得到的重组菌接种。
作为优选方案中，取谷氨酸棒杆菌感受态细胞和重组质粒pXMJ19-cipA-arc混匀，冰上冷却10min；迅速加入冰冷的电击杯电击，电击条件为电压2-4kV，时间3-7ms；脉冲结束后尽快取出电击杯，室温下加入LBG液体培养基，转移到离心管中轻柔振荡培养2h，取所得液体涂布于含20μg/ml氯霉素抗性平板；挑选单菌落提取质粒，再通过双酶切或PCR确认目的片段的插入。
可选地，所述电击的电压为2.5kV；所述电击的时间为5ms。
可选地，所述基因工程菌的诱导表达方法如下：
将重组菌接种于含氯霉素的LBG培养基中，经摇床培养至菌体OD600值达到0.8-1.0时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，经诱导过夜后离心收集得到重组菌体全细胞，用Tris-HCl 缓冲液洗涤菌体后重悬于磷酸缓冲液，超声破碎细胞后再次离心，沉淀即为获得的cipA-arc 融合蛋白。
作为优选方案，将鉴定成功的重组菌接种于含终浓度为20μg/ml氯霉素的LBG培养基中，培养温度设置为20-40℃，摇床转速150-300r/min，培养至菌体OD600值达到0.9时加入终浓度为1mM的IPTG，于温度20-40℃，转速150-300r/min条件下诱导过夜；4℃离心收集得到重组菌体全细胞，用Tris-HCl缓冲液洗涤菌体后重悬于磷酸缓冲液，超声破碎细胞后再次于4℃离心，沉淀即为获得的cipA-arc融合蛋白。
可选地，所述培养和所述诱导的温度均为30℃；所述培养时的转速为200r/min；所述诱导时的转速为180r/min。
优选地，所述Tris-HCl的pH值为7.0；
优选地，所述磷酸缓冲液的pH值为6.5。
根据本申请的第四方面，提供了本申请的第三方面所述的包涵体蛋白cipA-arc即cipA-arc融合蛋白用于转化[14/15N]-L-精氨酸生产[14/15N]-L-瓜氨酸的应用。
根据本申请的第五方面，提供了一种[14/15N]-L-瓜氨酸的酶催化制备方法，所述方法包括如下步骤：
取本申请的第三方面所述的cipA-arc融合蛋白即包涵体蛋白cipA-arc投入转化液中进行反应；
所述反应的条件：转化液中包含[14/15N]-L-精氨酸和缓冲溶液，转化温度为25-50℃，pH 为5.0-8.0，转化时间2-8h。
可选地，所述缓冲溶液为磷酸缓冲溶液，所述转化温度为37℃；所述pH为6.0；所述转化时间为5h。
可选地，所述制备方法还包括：离心收集上清和沉淀。
可选地，所述上清用于纯化[14/15N]-L-瓜氨酸；
所述沉淀中加缓冲液，重悬，再次投入转化液中进行反应；
优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；
优选地，所述磷酸缓冲液的pH为6.0。
本申请中，“cipA基因序列”，是指Kirsten Jung等(Wang Y,Heermann R,JungK.CipA and CipB as Scaffolds To Organize Proteins into Crystalline Inclusions[J].ACS Synthetic Biology, 2017,6,826-836)报道的cipA基因序列。
本申请中，“arc基因序列”，是指Kim等(Kim J E,Jeong D W,Lee HJ.Expression, purification,and characterization of arginine deiminase fromLactococcus lactis ssp.lactis ATCC 7962in Escherichia coli BL21[J].ProteinExpression and Purification,2007,53(1):0-15)报道的精氨酸脱亚胺酶(arc)基因序列。
本申请中，“pXMJ19”，是指在谷氨酸棒杆菌中携带基因表达蛋白的载体。
本申请能产生的有益效果包括：
1)本申请中合成并克隆了精氨酸脱亚胺酶的基因，构建了一种高产精氨酸脱亚胺酶工程菌，在谷氨酸棒杆菌中表达出精氨酸脱亚胺酶。
2)本申请将精氨酸脱亚胺酶固定于包涵体蛋白cipA上，产生具有催化活性的包涵体蛋白cipA-arc(即cipA-arc融合蛋白)。
3)本申请提供的具有催化活性的固定化cipA-精氨酸脱亚胺酶(cipA-arc)融合蛋白，能反复使用50次以上。
4)本申请提供的包涵体蛋白cipA-arc即arc-cipA固定化融合蛋白能催化[14/15N]-L-精氨酸转化为[14/15N]-L-瓜氨酸，后处理简单，产物分离纯化方便，成本低，易于放大生产，为酶法制备[14/15N]-L-瓜氨酸增加了一条新途径；反应液真空减压浓缩、结晶、干燥，得到白色粉末状固体，即为纯度为99.9％以上的[14/15N]-L-瓜氨酸。
5)本申请提供的同位素标记的[14/15N]L-瓜氨酸，为前列腺疾病、心血管疾病等的诊断与治疗提供了有效途径。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
如无特别说明，本申请的实施例中的原料均通过购买自探索平台，其中质粒pXMJ19购自武汉淼灵生物科技有限公司。
谷氨酸棒杆菌ATCC13032购自广东省微生物保藏中心。
根据本申请的一种实施方式，主要包括：1)化学合成目的基因(cipA、arc)；2)将合成好的cipA、arc连续与载体pXMG19连接，构建表达载体pXMJ19-cipA-arc；3)将pXMJ19-cipA-arc通过电转化法导入谷氨酸棒杆菌ATCC13032中；4)诱导表达并分离包涵体蛋白cipA-arc(即cipA-arc融合蛋白)；5)利用包涵体蛋白cipA-arc催化精氨酸合成[14/15N]-L-瓜氨酸。
本申请的实施例中，[14/15N]-L-瓜氨酸转化率基于碳摩尔数进行计算。
实施例1含精氨酸脱亚胺酶基因工程菌的构建
1.1根据Kirsten Jung等(2016)报道的cipA基因序列化学合成按照谷氨酸棒杆菌密码子偏好性优化的编码区DNA。化学合成由苏州金唯智生物科技公司完成。cipA基因序列如下：
ATGATCAACGACATGCACCCATCCCTGATCAAGGACAAGGACATGATGGACGA CGTTATGCTGCGCTCCTGCAAGATCATCGCTATGAAGATCATGCCAGACAAGGTTATG CAGGTTATGGTTACCGTTCTGATGCTGGACGGCACCTCCGAGGAGATGCTGCTGAAGT GGAACCTGCTGGACAACCGCGGCATGGCTATCTACAAGGTTCTGATGGAGGCTCTGT GCGGCAAGAAGGACGTTAAGATCGGCACCGTTGGCAAGGTTGGCCCACTGGGCTGCGACTACATCAACTGCGTTGAGATCTCCATG
合成的基因序列(SEQ ID NO.1)在DNA5’端引入HindIII位点，3’端引入SalI位点，合成的片段经过测序后，用HindIII/SalI双酶切目标基因和表达载体pXMJ19(生物风)，酶切产物经过凝胶回收后，将目标片段和载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得阳性转化子鉴定成功后命名为pXMJ19-cipA。
1.2根据Kim等(2007)报道的精氨酸脱亚胺酶(arc)基因序列化学合成按照谷氨酸棒杆菌密码子偏好性优化的编码区DNA。化学合成由苏州金唯智生物科技公司完成。arc基因序列如下：
ATGAACAACGGCATCAACGTTAACTCCGAGATCGGCAAGCTGAAGTCCGTTCTG CTGCACCGCCCAGGCGCTGAGGTTGAGAACATCACCCCAGACACCATGAAGCAGCTG CTGTTCGACGACATCCCATACCTGAAGATCGCTCAGAAGGAGCACGACTTCTTCGCTC AGACCCTGCGCGACAACGGCGCTGAGACCGTTTACATCGAGAACCTGGCTACCGAGG TTTTCGAGAAGTCCTCCGAGACCAAGGAGGAGTTCCTGTCCCACCTGCTGCACGAGG CTGGCTACCGCCCAGGCCGCACCTACGACGGCCTGACCGAGTACCTGACCTCCATGTC CACCAAGGACATGGTTGAGAAGATCTACGCTGGCGTTCGCAAGAACGAGCTGGACAT CAAGCGCACCGCTCTGTCCGACATGGCTGGCTCCGACGCTGAGAACTACTTCTACCTG AACCCACTGCCAAACGCTTACTTCACCCGCGACCCACAGGCTTCCATGGGCGTTGGCA TGACCATCAACAAGATGACCTTCCCAGCTCGCCAGCCAGAGTCCCTGATCACCGAGT ACGTTATGGCTAACCACCCACGCTTCAAGGACACCCCAATCTGGCGCGACCGCAACC ACACCACCCGCATCGAGGGCGGCGACGAGCTGATCCTGAACAAGACCACCGTTGCTA TCGGCGTTTCCGAGCGCACCTCCTCCAAGACCATCCAGAACCTGGCTAAGGAGCTGTT CGCTAACCCACTGTCCACCTTCGACACCGTTCTGGCTGTTGAGATCCCACACAACCAC GCTATGATGCACCTGGACACCGTTTTCACCATGATCAACCACGACCAGTTCACCGTTT TCCCAGGCATCATGGACGGCGCTGGCAACATCAACGTTTTCATCCTGCGCCCAGGCA AGGACGACGAGGTTGAGATCGAGCACCTGACCGACCTGAAGGCTGCTCTGAAGAAG GTTCTGAACCTGTCCGAGCTGGACCTGATCGAGTGCGGCGCTGGCGACCCAATCGCT GCTCCACGCGAGCAGTGGAACGACGGCTCCAACACCCTGGCTATCGCTCCAGGCGAG ATCGTTACCTACGACCGCAACTACGTTACCGTTGAGCTGCTGAAGGAGCACGGCATC AAGGTTCACGAGATCCTGTCCTCCGAGCTGGGCCGCGGCCGCGGCGGCGCTCGCTGC ATGTCCCAGCCACTGTGGCGCGAGGACCTGTAA
合成的基因序列(SEQ ID NO.2)在DNA5’端引入XhoI位点，3’端引入SacI位点，合成的片段经过测序后，用XhoI/SacI双酶切目标基因和表达载体pXMJ19-cipA，酶切产物经过凝胶回收后，将目标片段和载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得阳性转化子鉴定成功后命名为pXMJ19-cipA-arc，即为含精氨酸脱亚胺酶基因工程菌。所述的基因工程菌保藏名称为谷氨酸棒杆菌SUMHS-2020.01，分类命名为Corynebacteriumglutamicum，该菌株已于2020年1月17日保藏于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏中心的保藏编号为CGMCC No.19404。
实施例2融合蛋白cipA-arc表达
2.1谷氨酸棒杆菌感受态细胞的制备
将谷氨酸棒杆菌ATCC13032划线于含LBG固体培养基的平板中，于30℃培养箱培养，待菌体长出挑取新鲜菌株接种于LBG液体培养基中，于温度为30℃转速为200r/min摇床中培养12-24h。按1％接种量将活化菌液转接至LBG培养基中，于温度为30℃转速为200r/min摇床中培养至OD600约为0.9。将菌液置于冰水混合物中预冷15-20min，再于超净台中将预冷的菌液分装至灭菌的50mL离心管中，4℃6000g离心30s，冰水放置2min。将离心管中的上清液吸出，快速向离心管中各加入2.5mL预冷的10％甘油，用移液枪缓慢吹吸至菌体悬浮。悬浮液于4℃6000g离心30s，将离心管中的上清液吸出，快速向离心管中加入500μL预冷的10％甘油，用移液枪缓慢吹吸至菌体悬浮，并重复此操作三次。
2.2重组质粒pXMJ19-cipA-arc电击转化感受态细胞
取80μL感受态细胞和2μL重组质粒pXMJ19-cipA-arc混匀，冰上冷却10min；迅速加入冰冷的电击杯电击，电击条件为电压2.5kV，时间5ms。脉冲结束后尽快取出电击杯，室温下加入lmL的LBG液体培养基，转移到离心管中30℃轻柔振荡培养2h，取200μL涂布于含 20μg/mL氯霉素抗性平板。挑选单菌落提取质粒，再通过双酶切或PCR确认目的片段的插入。
2.3基因工程菌的诱导表达
将鉴定成功的重组菌接种于含终浓度为20μg/mL氯霉素的LBG培养基中，培养温度设置为30℃，摇床转速200r/min，培养至菌体OD600值达到0.9时加入终浓度为1mM的IPTG，于 30℃，转速180r/min条件下诱导过夜。4℃离心收集得到重组菌体全细胞；用50mM的pH7.0 的Tris-HCl洗涤菌体两次后，重悬50mM的pH 6.5的磷酸缓冲液，超声破碎细胞后再次于4℃离心，沉淀即为获得的包涵体蛋白cipA-arc(即cipA-arc融合蛋白)。
2.4分光光度法测定cipA-arc融合蛋白活性
利用L-瓜氨酸在强酸性溶液中与二乙酰一肟的专一性显色反应及反应复合物在490nm 处吸光度与L-瓜氨酸浓度呈线性关系来测定cipA-精氨酸脱亚胺酶融合蛋白的酶活。配制含终浓度200mM的[14/15N]-L-精氨酸的底物缓冲液((pH 6.0,50mM磷酸盐缓冲液)，取2.8mL底物溶液，加入0.2mL酶液，37℃反应10min。将酶反应液稀释适当的倍数(10-100倍)，取2mL稀释后的反应液，加入3mL混合酸(体积比H2SO4:H3PO4＝1:3)溶液，0.5二乙酰-肟、氨基硫脲混合液，摇匀，立即沸水浴10min，测定其530nm处的吸光度值。cipA-精氨酸脱亚胺酶融合蛋白酶活定义:在37℃、pH 6.0的条件下，每分钟催化[14/15N]-L-精氨酸转化生成1μmol瓜氨酸的酶量定义为一个单位酶活力((1U)。比酶活定义:每mg蛋白里包含的酶活数量(U/mg)。蛋白质浓度采用Bradford法测定。
实施例3融合蛋白cipA-arc表达
除步骤2.1中的培养的温度为20℃，培养时的转速为300r/min，培养至OD600约为0.3外，其余实验条件及实验步骤与实施例2相同。
实施例4融合蛋白cipA-arc表达
除步骤2.1中的培养的温度为37℃，培养时的转速为150r/min，培养至OD600约为1.0外，其余实验条件及实验步骤与实施例2相同。
实施例5融合蛋白cipA-arc表达
除步骤2.1中的培养的温度为40℃，培养时的转速为180r/min，培养至OD600约为0.72 外，其余实验条件及实验步骤与实施例2相同。
不同的实施条件对谷氨酸棒杆菌感受态细胞制备效果影响
Figure BDA0002463998330000081
Figure BDA0002463998330000091
实施例6融合蛋白cipA-arc表达
除步骤2.2中的电击的电压为1kV，电击的时间为10ms外，其余实验条件及实验步骤与实施例2相同。
实施例7融合蛋白cipA-arc表达
除步骤2.2中的电击的电压为5kV，电击的时间为1ms外，其余实验条件及实验步骤与实施例2相同。
不同的电击下条件下对谷氨酸棒杆菌感受态细胞转化效率的影响
Figure BDA0002463998330000092
实施例8融合蛋白cipA-arc表达
除步骤2.3中的培养温度为40℃，培养时的转速为150r/min，培养至OD600约为0.7，诱导温度为40℃，诱导时的转速为150r/min外，其余实验条件及实验步骤与实施例2相同。
实施例9融合蛋白cipA-arc表达
除步骤2.3中的培养温度为20℃，培养时的转速为300r/min，培养至OD600约为0.5，诱导的温度为20℃，诱导时的转速为200r/min外，其余实验条件及实验步骤与实施例2相同。
实施例10融合蛋白cipA-arc表达
除步骤2.3中的培养温度为25℃，培养时的转速为150r/min，培养至OD600约为1.0，诱导的温度为35℃，诱导时的转速为220r/min外，其余实验条件及实验步骤与实施例2相同。
不同的培养条件下对重组谷氨酸棒杆菌融合蛋白cipA-arc表达效率的影响
Figure BDA0002463998330000101
实施例11转化[14/15N]-L-精氨酸生产[14/15N]-L-瓜氨酸
Figure BDA0002463998330000102
取包涵体蛋白cipA-arc即cipA-arc融合蛋白(9200U)投入1L转化液中进行反应，反应条件：底物[14/15N]-L-精氨酸为400g，转化温度37℃，pH6.5，转化时间5h。检测[14/15N]-L- 精氨酸的转化率为99.9％以上。离心收集上清和沉淀，上清经过真空减压浓缩、结晶、过滤、干燥，得到白色粉末状固体389.6g，收率97.4％，纯度为99.9％以上的[14/15N]-L-瓜氨酸；沉淀加入至pH 6.5，50mM磷酸盐缓冲液中，并重悬，再一次投入反应液中进行反应。如此循环反应50次，酶活降低1.5％，按比例添加或更换部分新酶。
实施例12转化[14/15N]-L-精氨酸生产[14/15N]-L-瓜氨酸
除转化温度为25℃，pH为5.0，转化时间为8h，检测[14/15N]-L-精氨酸的转化率为97.6％，得到白色粉末状固体390.8g，收率97.7％，纯度为98.5％以上的[14/15N]-L-瓜氨酸以上外，如此循环反应50次，酶活降低7.6％，按比例添加或更换部分新酶，调节pH为5.0。其余实验条件及实验步骤与实施例11相同。
实施例13转化[14/15N]-L-精氨酸生产[14/15N]-L-瓜氨酸
除转化温度为50℃，pH为8.0，转化时间为2h，检测[14/15N]-L-精氨酸的转化率为86.5％，得到白色粉末状固体346.0g，收率88.3％，纯度为97.8％以上的[14/15N]-L-瓜氨酸以上外，如此循环反应45次，酶活降低15.4％，按比例添加或更换部分新酶，调节pH为8.0。其余实验条件及实验步骤与实施例11相同。
不同的催化条件下对融合蛋白cipA-arc催化效率的影响
Figure BDA0002463998330000111
实施例14菌体全细胞转化[14/15N]-L-精氨酸生产[14/15N]-L-瓜氨酸
取诱导表达包涵体蛋白cipA-arc的基因工程菌菌体30g/L，投入1L转化液中进行反应，反应条件：底物[14/15N]-L-精氨酸为400g，转化温度40℃，pH6.7，转化时间7h。检测[14 /15N]-L- 精氨酸的转化率为99.9％以上。离心收集上清和沉淀，上清经过真空减压浓缩、结晶、过滤、干燥，得到白色粉末状固体382.8g，收率95.7％，纯度为99.5％以上的[14/15N]-L-瓜氨酸；沉淀加入至pH 6.7，50mM磷酸盐缓冲液中，并重悬，再一次投入反应液中进行反应。如此循环反应50次，酶活降低2.2％，按比例添加或更换部分新菌体。
实施例15转化[14/15N]-L-精氨酸生产[14/15N]-L-瓜氨酸
取诱导表达包涵体蛋白cipA-arc的基因工程菌菌体60g/L，除转化温度为37℃，pH为6.2，转化时间为3.5h，检测[14/15N]-L-精氨酸的转化率为99.9％以上，得到白色粉末状固体385.2g，收率96.3％，纯度为99.8％以上的[14/15N]-L-瓜氨酸以上外，如此循环反应50次，酶活降低1.6％，按比例添加或更换部分新菌体，调节pH为6.2，其余实验条件及实验步骤与实施例14相同。
实施例16转化[14/15N]-L-精氨酸生产[14/15N]-L-瓜氨酸
取诱导表达包涵体蛋白cipA-arc的基因工程菌菌体60g/L，除转化温度为50℃，pH为8.0，转化时间为2h，检测[14/15N]-L-精氨酸的转化率为85.5％以上，得到白色粉末状固体345.2g，收率86.3％，纯度为94.2％以上的[14/15N]-L-瓜氨酸以上外，如此循环反应45次，酶活降低7.4％，按比例添加或更换部分新菌体，调节pH为8.0。其余实验条件及实验步骤与实施例14相同。
不同的催化条件下对含融合蛋白cipA-arc菌体全细胞催化效率的影响
Figure BDA0002463998330000121
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海健康医学院
<120> 一种制备固定化精氨酸脱亚胺酶及生产[14/15N]-L-瓜氨酸的方法
<130> 2019.11.6
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 312
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
ATGATCAACGACATGCACCCATCCCTGATCAAGGACAAGGACATGATGGACGACGTTATGCTGCGCTCCTGCAAGATCATCGCTATGAAGATCATGCCAGACAAGGTTATGCAGGTTATGGTTACCGTTCTGATGCTGGACGGCACCTCCGAGGAGATGCTGCTGAAGTGGAACCTGCTGGACAACCGCGGCATGGCTATCTACAAGGTTCTGATGGAGGCTCTGTGCGGCAAGAAGGACGTTAAGATCGGCACCGTTGGCAAGGTTGGCCCACTGGGCTGCGACTACATCAACTGCGTTGAGATCTCCATG
<210> 2
<211> 1233
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
ATGAACAACGGCATCAACGTTAACTCCGAGATCGGCAAGCTGAAGTCCGTTCTGCTGCACCGCCCAGGCGCTGAGGTTGAGAACATCACCCCAGACACCATGAAGCAGCTGCTGTTCGACGACATCCCATACCTGAAGATCGCTCAGAAGGAGCACGACTTCTTCGCTCAGACCCTGCGCGACAACGGCGCTGAGACCGTTTACATCGAGAACCTGGCTACCGAGGTTTTCGAGAAGTCCTCCGAGACCAAGGAGGAGTTCCTGTCCCACCTGCTGCACGAGGCTGGCTACCGCCCAGGCCGCACCTACGACGGCCTGACCGAGTACCTGACCTCCATGTCCACCAAGGACATGGTTGAGAAGATCTACGCTGGCGTTCGCAAGAACGAGCTGGACATCAAGCGCACCGCTCTGTCCGACATGGCTGGCTCCGACGCTGAGAACTACTTCTACCTGAACCCACTGCCAAACGCTTACTTCACCCGCGACCCACAGGCTTCCATGGGCGTTGGCATGACCATCAACAAGATGACCTTCCCAGCTCGCCAGCCAGAGTCCCTGATCACCGAGTACGTTATGGCTAACCACCCACGCTTCAAGGACACCCCAATCTGGCGCGACCGCAACCACACCACCCGCATCGAGGGCGGCGACGAGCTGATCCTGAACAAGACCACCGTTGCTATCGGCGTTTCCGAGCGCACCTCCTCCAAGACCATCCAGAACCTGGCTAAGGAGCTGTTCGCTAACCCACTGTCCACCTTCGACACCGTTCTGGCTGTTGAGATCCCACACAACCACGCTATGATGCACCTGGACACCGTTTTCACCATGATCAACCACGACCAGTTCACCGTTTTCCCAGGCATCATGGACGGCGCTGGCAACATCAACGTTTTCATCCTGCGCCCAGGCAAGGACGACGAGGTTGAGATCGAGCACCTGACCGACCTGAAGGCTGCTCTGAAGAAGGTTCTGAACCTGTCCGAGCTGGACCTGATCGAGTGCGGCGCTGGCGACCCAATCGCTGCTCCACGCGAGCAGTGGAACGACGGCTCCAACACCCTGGCTATCGCTCCAGGCGAGATCGTTACCTACGACCGCAACTACGTTACCGTTGAGCTGCTGAAGGAGCACGGCATCAAGGTTCACGAGATCCTGTCCTCCGAGCTGGGCCGCGGCCGCGGCGGCGCTCGCTGCATGTCCCAGCCACTGTGGCGCGAGGACCTGTAA

Claims (6)

1.一种cipA-arc融合蛋白，其特征在于，精氨酸脱亚胺酶arc固定于包涵体蛋白cipA上，产生具有催化活性的包涵体蛋白cipA-arc即cipA-arc融合蛋白，所述cipA-arc融合蛋白的制备包括以下步骤：
(1)制备谷氨酸棒杆菌感受态细胞；
(2)采用含精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌pXMJ19-cipA-arc电击转化步骤(1)所述的谷氨酸棒杆菌感受态细胞，得到重组菌；
含精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌pXMJ19-cipA-arc的构建方法如下：
将序列为SEQ ID NO.1的cipA基因在DNA5’端引入HindIII位点，3’端引入SalI位点，合成的片段经过测序后，用HindIII/SalI双酶切目标基因和表达载体pXMJ19，酶切产物经过凝胶回收后，将目标片段和载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得阳性转化子表达载体pXMJ19-cipA；将序列为SEQ ID NO.2的精氨酸脱亚胺酶arc基因在DNA5’端引入XhoI位点，3’端引入SacI位点，合成的片段经过测序后，用XhoI/SacI双酶切目标基因和表达载体pXMJ19-cipA，酶切产物经过凝胶回收后，将目标片段和载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得阳性转化子重组质粒pXMJ19-cipA-arc，即为含精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌，所述重组质粒pXMJ19-cipA-arc电击转化感受态细胞采用如下制备方法：
取谷氨酸棒杆菌感受态细胞和重组质粒pXMJ19-cipA-arc混匀，冰上冷却后，在相同温度条件下，以电击条件为电压2.5kV，电击5ms；再在室温下加入LBG液体培养基，转移到离心管中，经振荡培养后取所得液体涂布于含氯霉素抗性平板，挑选单菌落提取质粒，再通过双酶切、PCR确认目的片段的插入，得到的重组菌接种；
(3)将步骤(2)所述得到的重组菌经基因工程菌诱导表达得到的重组菌体全细胞，经超声破碎、离心后，所得的沉淀即为cipA-arc融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的cipA-arc融合蛋白，其特征在于，所述基因工程菌中，在谷氨酸棒杆菌中表达出精氨酸脱亚胺酶，所述的基因工程菌保藏名称为谷氨酸棒杆菌SUMHS-2020.01，分类命名为Corynebacterium glutamicum，该菌株已于2020年1月17日保藏于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏中心的保藏编号为CGMCC No.19404。
3.根据权利要求1所述的cipA-arc融合蛋白，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌感受态细胞采用如下制备方法：
将谷氨酸棒杆菌ATCC13032在含LBG固体培养基中培养后，挑取新鲜菌株接种于LBG液体培养基中，经培养后按0.8-1.5％的接种量将活化菌液转接至LBG培养基中，继续培养至OD600为0.8-1.0；将菌液经冰水混合物预冷、离心，吸出上清液后加入甘油，吹吸至菌体悬浮，再次经离心、吸出上清液后加入甘油，吹吸至菌体悬浮，即可得到谷氨酸棒杆菌感受态细胞。
4.根据权利要求1所述的cipA-arc融合蛋白，其特征在于，所述基因工程菌的诱导表达方法如下：
将重组菌接种于含氯霉素的LBG培养基中，经摇床培养至菌体OD600值达到0.8-1.0时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，经诱导过夜后离心收集得到重组菌体全细胞，用Tris-HCl缓冲液洗涤菌体后重悬于磷酸缓冲液，超声破碎细胞后再次离心，沉淀即为获得的cipA-arc融合蛋白。
5.一种酶催化[14/15N]-L-瓜氨酸的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
取权利要求1-4任一项所述的cipA-arc融合蛋白投入转化液中进行反应；
所述反应的条件：所述的转化液中包含[14/15N]-L-精氨酸和缓冲溶液，转化温度为25-50℃，pH为5.0-8.0，转化时间2-8h。
6.根据权利要求5所述的酶催化[14/15N]-L-瓜氨酸的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液为磷酸缓冲溶液，所述转化温度为37℃；所述pH为6.5；所述转化时间为5h。
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