CN115960807A - 一种厌氧高产l-精氨酸工程菌及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种厌氧高产L‑精氨酸工程菌及其制备方法和应用。所述工程菌中含有编码N‑乙酰谷氨酸合成酶变体的基因，所述编码N‑乙酰谷氨酸合成酶变体的基因由被外源环境条件诱导的启动子控制，所述工程菌被工程化为缺乏功能性ArgR。本发明通过基因编辑技术合成L‑Arg工程菌，实现诱导启动大量产生L‑Arg，L‑精氨酸产量与野生菌相比提高近1000倍，且所述工程菌能够在肿瘤微环境中靶向定殖，利用肿瘤细胞生成的代谢废物作为营养物质生存，并产生L‑Arg通过代谢来调控肿瘤免疫微环境，对提高肿瘤治疗疗效有着重要的意义。

Description

一种厌氧高产L-精氨酸工程菌及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种厌氧高产L-精氨酸工程菌及其制备方法和应用。

背景技术

L-精氨酸(L-Arginine，简称L-Arg)是人体和动物体内所需半必需碱性氨基酸之一，是精氨酸生物合成途径的最终产物。L-Arg在生物医学领域具有广泛用途，它作为一种含有胍基的碱性氨基酸，是生物体尿素循环的一种重要中间代谢物，对于调节机体免疫反应，激励免疫系统具有重要作用。同时，在抗肿瘤免疫调控方面，它还可抑制肿瘤生长、促进损伤组织愈合康复等作用。L-Arg代谢是调节免疫细胞功能活性的重要途径之一。研究表明，口服L-Arg具有良好的抗肿瘤效果，L-Arg可有效提高免疫力、促进免疫系统产生自然杀伤细胞、细胞毒性T细胞、吞噬细胞和白介素-1(Interleukin-1)等免疫细胞因子，有利于对抗癌细胞并增强免疫细胞新陈代谢，尤其是肿瘤微环境中高含量的L-Arg可以提高T细胞的存活率和抗肿瘤活性，从而靶向L-Arg代谢可作为提高机体抗肿瘤免疫应答的有效策略。因此，L-Arg不仅在在医药和食品工业中具有广泛用途，而且在未来抗肿瘤免疫治疗领域展现出巨大的应用潜力。

目前L-Arg主要有两种生产工艺，即蛋白质水解提取和生物发酵。蛋白质水解法来生产L-Arg，但是该方法操作费时、收率低，且环境污染严重，不能实现高效的靶向递送至病灶部位。随着生物发酵技术的兴起与大力发展，利用发酵菌种生产L-Arg逐渐兴起，L-Arg的发酵菌种研究的较多的主要有谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、钝齿棒杆菌(Corynebacteriumcrenatum)、大肠杆菌(Escherichiacoli)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)等，但大多数发酵生产技术的产酸水平仍然较低，并且主要局限于食品工业。近年来，美国宾夕法尼亚州立大学的RogerGeiger教授研究发现基因工程菌能调控肿瘤微环境，有效改善微环境的免疫抑制。然而，目前用来生产L-Arg的微生物菌株基本都是在有氧环境下生存，缺少能肿瘤乏氧环境下利用肿瘤代谢产物合成L-Arg的工程菌株。基因工程技术对于L-Arg高产菌株选育具有重要的推动作用，利用基因工程构建L-Arg高产菌株是一种高效率、理性化的育种手段。尽管如此，如何构建和筛选出能瘤内高产L-Arg和含有兼性厌氧特性的工程菌株，仍然面临着机体负反馈、缺乏厌氧启动子等诸多挑战。

综上所述，构建产L-精氨酸工程菌，实现高效生产L-精氨酸且能有效应用于免疫治疗，具有重要意义。

发明内容

目前构建和筛选出能瘤内高产L-Arg和含有兼性厌氧特性的工程菌株，仍然面临着机体负反馈、缺乏厌氧启动子、产量低等诸多挑战，针对上述问题，本申请提供一种厌氧高产L-精氨酸工程菌及其制备方法和应用，设计构建产L-精氨酸工程菌，实现高效生产L-精氨酸且能有效应用于免疫治疗。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种厌氧高产L-精氨酸工程菌，所述工程菌中含有编码N-乙酰谷氨酸合成酶变体的基因，所述编码N-乙酰谷氨酸合成酶变体的基因由被外源环境条件诱导的启动子控制，所述工程菌被工程化为缺乏功能性ArgR，所述编码N-乙酰谷氨酸合成酶变体的基因具有选自以下的DNA序列中任意一种：

a)SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.5；

b)除了冗余的遗传密码以外，编码与由SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.5编码的多肽相同的多肽的DNA序列；

c)与a)或b)的DNA序列具有至少80％同源性的DNA序列。

本发明设计一种能在肿瘤内生存并高产L-Arg工程菌株的基因工程菌，通过对大肠杆菌、沙门氏菌等厌氧菌株的基因工程改造，使其能利用肿瘤细胞生成的代谢废物作为营养物质生存，并产生L-Arg通过代谢来调控肿瘤免疫微环境，克服肿瘤免疫抑制，使之更适合抗肿瘤效应细胞的增殖代谢，尤其是免疫细胞通过工程菌的代谢产物进行营养补偿，有效促进其抗肿瘤免疫的持续性，为了克服现有L-Arg生产菌株在厌氧环境中表达水平低的难题，通过基因编辑技术合成L-Arg工程菌，敲除或弱化工程菌株中抑制L-Arg合成途径的阻遏蛋白ArgR基因，使得菌株L-Arg产量获得显著的提升，并整合特定过表达基因ArgA和诱导型启动子，从而实现诱导启动大量产生L-Arg，对提高肿瘤治疗疗效有着重要的意义。

本发明中，筛选特定的N-乙酰谷氨酸合酶变体，其对精氨酸的负反馈调节的敏感性更低，能够进一步提高L-Arg产量。

SEQ ID NO.1：

atggtaaaggaacgtaaaaccgagttggtcgagggattccgccattcggttccctgtatcaatacccaccggggaaaaacgtttgtcatcatgctcggcggtgaagccattgagcatgagaatttctccagtatcgttaatgatatcgggttgttgcacagcctcggcatccgtctggtggtggtctatggcgcacgtccgcagatcgacgcaaatctggctgcgcatcaccacgaaccgctgtatcacaagaatatacgtgtgaccgacgccaaaacactggaactggtgaagcaggctgcgggaacattgcaactggatattactgctcgcctgtcgatgagtctcaataacacgccgctgcagggcgcgcatatcaacgtcgtcagtggcaattttattattgcccagccgctgggcgtcgatgacggcgtggattactgccatagcgggcgtatccggcggattgatgaagacgcgatccatcgtcaactggacagcggtgcaatagtgctaatggggccggtcgctgtttcagtcactggcgagagctttaacctgacctcggaagagattgccactcaactggccatcaaactgaaagctgaaaagatgattggtttttgctcttcccagggcgtcactaatgacgacggtgatattgtctccgaacttttccctaacgaagcgcaagcgcgggtagaagcccaggaagagaaaggcgattacaactccggtacggtgcgctttttgcgtggcgcagtgaaagcctgccgcagcggcgtgcgtcgctgtcatttaatcagttatcaggaagatggcgcgctgttgcaagagttgttctcacgcgacggtatcggtacgcagattgtgatggaaagcgccgagcagattcgtcgcgcaacaatcaacgatattggcggtattctggagttgattcgcccactggagcagcaaggtattctggtacgccgttctcgcgagcagctggagatggaaatcgacaaattcaccattattcagcgcgataacacgactattgcctgcgccgcgctctatccgttcccggaagagaagattggggaaatggcctgtgtggcagttcacccggattaccgcagttcatcaaggggtgaagttctgctggaacgcattgccgctcaggctaagcagagcggcttaagcaaattgtttgtgctgaccacgcgcagtattcactggttccaggaacgtggatttaccccagtggatattgatttactgcccgagagcaaaaagcagttgtacaactaccagcgtaaatccaaagtgttgatggcggatttagggtaa。

优选地，所述编码N-乙酰谷氨酸合成酶变体的基因在工程菌基因组上的插入位置包括malE和malK之间或attλ插入位点。

本发明中，发现编码N-乙酰谷氨酸合成酶变体的基因插入的位置的差异性，会产生不同的基因表达效果，插入特定的位置具有高度选择性与特异性，在attλ位点插入，能使得基因更加的稳定的表达。

可以理解，本发明所述工程化为缺乏功能性ArgR包括敲除或弱化ArgR基因表达量。

可以理解，响应肿瘤微环境因素的启动子均适用于本发明。

可选地，所述被外源环境条件诱导的启动子包括乏氧响应启动子、酸响应启动子、氧化还原响应启动子、光刺激启动子、电刺激启动子或磁驱动启动子中任意一种。

优选地，所述乏氧响应启动子选自fnr-sp、hip1、i14018、ptet-arca、ptet-fnr、r1074、ssbp1或ysgap中任意一种。

本发明中采用乏氧响应启动子fnr-sp，即可构建进一步响应肿瘤微环境的工程菌，靶向性地在肿瘤微环境中高效表达L-Arg。

可选地，所述fnr-sp的核酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列。

SEQ ID NO.2：

aaaaacgccgcaaagtttgagcgaagtcaataaactctctacccattcagggcaatatctctcttggatccaaagtgaactctagaaataattttgtttaac tttaagaaggagatatacat。

可选地，所述工程菌的出发菌株选自谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、变形杆菌、肠杆菌、伤寒杆菌、沙门氏菌或志贺氏菌中任意一种。

第二方面，本发明提供一种第一方面所述的厌氧高产L-精氨酸工程菌的制备方法，所述方法包括：

利用Crispr-Cas9系统敲除出发菌株的ArgR基因，并在出发菌株的基因组中插入编码N-乙酰谷氨酸合成酶变体的基因，所述编码N-乙酰谷氨酸合成酶变体的基因由被外源环境条件诱导的启动子控制，得到所述厌氧高产L-精氨酸工程菌，所述编码N-乙酰谷氨酸合成酶变体的基因具有选自以下的DNA序列中任意一种：a)SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.5；b)除了冗余的遗传密码以外，编码与由SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.5编码的多肽相同的多肽的DNA序列；c)与a)或b)的DNA序列具有至少80％同源性的DNA序列。

本发明中，设计特定的基因修饰方法，能够实现对出发菌株快速、高效地基因编辑，快速、稳定地制备工程菌。

优选地，所述Crispr-Cas9系统的sgRNA的核酸序列包括SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示的序列。

SEQ ID NO.3：gttggtacacccagttcagc。

SEQ ID NO.4：tcaagttagtataaaaaagc。

本发明中，利用Crispr-Cas9系统敲除或插入基因的具体过程包括：

首先，设计相关引物，用设计的引物构建或整合同源臂，以测序阳性的质粒为模板进行同源臂的修复扩增；其次，用人工设计的sgRNA识别目的基因组序列，并引导Cas9蛋白酶进行DNA双链的切割，形成双链断裂，电转化的sgRNA质粒进行同源臂修复，从而达到基因的敲除或敲入的目的；最后，将整合成功的菌株进行抗性消除。

第三方面，本发明提供第一方面所述的厌氧高产L-精氨酸工程菌在生产L-精氨酸中的应用。

第四方面，本发明提供一种生产L-精氨酸的方法，所述方法包括：

对第一方面所述的厌氧高产L-精氨酸工程菌进行发酵培养，获得L-精氨酸。

可以理解，本发明中可根据需求及本领域常规手段选择具体的培养方法，例如所述方法可包括：复苏工程菌，接种到含无有机氮源基础培养基中进行摇菌培养，并在该菌对数生长期时进行无氧激活，在无有机氮源基础培养基的摇菌下产生L-Arg。

可选地，所述含无有机氮源基础培养基是一种合成含无机氮源和碳源的培养基，专门用于培养重组工程菌菌株的培养，包括但不限于M9培养基、无氨基酸培养基等。

可选地，所述摇菌的方法及条件包括以下步骤：将复苏的工程菌在对数生长期时，持续10～20min往LB培养基菌液中充入恒定速率的氮气，排除培养基中的绝大部分氧气，形成无氧环境；在30～37℃、无氧环境中静置刺激1～4h启动，使得整合无氧启动子的突变体基因被激活，取0.25～0.5mL培养基菌液，在2～8℃、3000～7000rpm、5～10min的条件下离心收集菌体，用PBS洗去菌体上残留的LB培养基后，用无有机氮源基础培养基菌体重悬(0.1～1×10⁸)，在30～37℃、150～250rpm条件下的摇床中进行工程菌的摇菌培养。

第五方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的厌氧高产L-精氨酸工程菌。

第六方面，本发明提供第一方面所述的厌氧高产L-精氨酸工程菌或第五方面所述的药物组合物在制备治疗或辅助治疗肿瘤的药物中的应用。

优选地，所述肿瘤可选自急性髓系白血病、神经母细胞瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌、三阴性乳腺癌、脑转移瘤、结肠癌或肝癌等等。

本发明设计的厌氧高产L-精氨酸工程菌能够显著稳定提高体内、外L-Arg的产量，同时能有效定植肿瘤组织并抑制肿瘤的生长。该基因工程菌既可以直接通过吸收氮源、碳源等营养物质来生产L-Arg，也可以作为原始菌株做进一步改良以期筛选出更加安全、稳定、高效L-Arg生产菌株。

第七方面，本发明提供一种以非疾病诊断为目的的瘤内产生L-Arg的方法，所述方法包括：

将第一方面所述的厌氧高产L-精氨酸工程菌注射到实验动物体内。

所述注射的方法及接种量包括：将体外培养在对数生长期的工程菌用氮气排除培养基内大部分空气，无氧刺激1～4h后离心收集，并用PBS洗去菌体上残留的LB培养基后计数，用PBS将收集的菌体重悬至0.5～1×10⁵CFU/μL浓度，并取100～200μL的PBS重悬液，通过尾静脉注射到实验动物体内，工程化细菌消耗肿瘤代谢废物高效产生L-Arg。

所述L-Arg含量检测方法包括：将尾静脉注射工程菌后3天后的实验动物肿瘤取下，收获并称重肿瘤组织，在50～100mg肿瘤组织中提取代谢物，在液氮中研磨处理肿瘤组织，加入300～500μL冷的高效液相色谱(HPLC)级80％甲醇提取极性代谢物，随后在-80％℃孵育4～5h，然后将样品在4℃、10,000～16,000×g、10～20min高速真空浓缩上清液，并使用LC-MS检测瘤内L-Arg含量。

本发明中，所述厌氧高产L-精氨酸工程菌通过静脉注射等方式进入体内后，可基于厌氧靶向定殖特性，自动靶向聚集到肿瘤内，并利用肿瘤微环境中的氮源和碳源等营养物质，消耗肿瘤代谢废物高效表达产生L-Arg，可有效应用于非治疗为目的的肿瘤基础行为研究等。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明设计一种能在肿瘤内生存并高产L-Arg工程菌株的基因工程菌，通过基因编辑技术合成L-Arg工程菌，敲除或弱化工程菌株中抑制L-Arg合成途径的阻遏蛋白ArgR基因，使得菌株L-Arg产量获得显著的提升，并整合过表达特定ArgA基因和诱导型启动子，从而实现诱导启动大量产生L-Arg，并通过代谢免疫调控有效克服肿瘤的微环境抑制，对提高肿瘤治疗疗效有着重要的意义。

附图说明

图1为菌株工程化改造设计图；

图2为ArgR敲除验证电泳图；

图3为Fnr-ArgA215插入验证电泳图；

图4为野生菌ECN与基因工程菌L-ArgBac.菌株的生长曲线图；

图5为野生菌ECN与基因工程菌L-ArgBac.的L-Arg产量图；

图6为野生菌ECN与基因工程菌L-ArgBac.瘤内菌落结果图；

图7为野生菌ECN与基因工程菌L-ArgBac.肿瘤生长曲线图；

图8为不同基因工程菌精氨酸的生成速率图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。

本发明提供了一种能高产L-Arg并调节肿瘤微环境的工程菌，其核心为利用CRISPR基因编辑手段来改造工程菌株，敲除L-Arg产生抑制基因ArgR，并通过整合过表达基因ArgA和乏氧响应启动子，在特定位置插入整合乏氧响应启动子的负反馈调节突变体基因Fnr-ArgA215，使得改造后的菌株降低负反馈调节限制，从而获得稳定并高产L-Arg的基因工程厌氧表达菌株L-ArgBac.。同时，探索并筛选了工程菌株在厌氧条件下稳定、高效生产L-Arg的培养条件与标准生产方法。该基因工程菌L-ArgBac.其利用兼性厌氧呼吸特性能靶向定殖肿瘤内部，改造后的工程菌通过L-精氨酸调节肿瘤细胞的异常代谢，改善肿瘤微环境免疫抑制，提高免疫细胞在肿瘤微环境中的浸润，促进免疫细胞的增殖代谢，全面提高肿瘤免疫治疗的效果。

为了使得工程菌达到上述目的，本发明采用如图所示的基因工程设计方案(图1)，主要包括以下步骤：

(1)L-Arg合成途径阻遏蛋白ArgR抑制基因的敲除：野生型菌株在对数生长期时经离心可得到感受态菌细胞，通过电转化形成含pCas9质粒的工程菌Bac.pCas9，用LB培养基恢复培养，在含有抗生素的抗性平板上进行涂布培养，同时以电转化的方法将Bac.pCas9制备成感受态，并使用设计的引物对L-Arg的ArgR抑制基因及其同源臂进行扩增和修复，最后对工程细菌进行sgRNA及修复同源臂的转化，转化成功的菌株通过温度敏感型将抗性消除，并将敲除L-Arg合成途径阻遏蛋白ArgR基因无抗性菌株命名为Bac.△ArgR；

(2)L-Arg负反馈突变体ArgA215基因和乏氧诱导型启动子的整合并插入：将工程菌Bac.△ArgRCas9细胞电转化成感受态，并引物以基因合成质粒为模板扩增突变体基因fnr-ArgA215片段，同时以attλ-puxT质粒为模板进行反向扩增attλ同源臂，产物经PCR产物纯化后，将回收的产物进行无缝克隆连接，阳性产物以attλ-ArgA215pux-T质粒为模板扩增获得修复同源臂。最后取感受态细胞加入sgRNA质粒和修复同源臂在2000～3000KV条件下电转化，在有含有抗性的平板进行涂布培养，克隆产物接种于无抗的LB培养基，稀释后分别在LB(无抗)、LB(壮观霉素)、LB(卡那霉素)点板培养，选择抗性板不长的克隆菌株接种于LB无抗培养并保菌，在敲除ArgR基因基础上成功整合乏氧诱导型启动子并插入突变体ArgA215基因的无抗性菌株命名为L-ArgBac.；

(3)L-Arg体内外表达方法：①L-Arg的体外表达，工程菌在37℃、150～250rpm条件下LB培养基中进行活化，在培养基中持续充入氮气10～20min后，无氧刺激1～4h激活乏氧诱导型启动子，并用无有机氮源培养基以活化细菌的LB培养基条件进行扩大培养12～24h，该工程菌即可在体外高效、稳定分泌表达L-Arg；②L-Arg的瘤内表达，取上述①中无氧刺激激活的工程菌，在1000～10000rpm、2～20min、4℃条件下离心收集菌体并计数，以0.1～1×10⁸的接种量通过尾静脉注射到实验动物体内，分布在12～72h连续时间点内HPLC-MS检测L-Arg在肿瘤组织中的浓度。由于该菌厌氧靶向肿瘤特性，在肿瘤微环境中肿瘤代谢产生大量无机盐NH4⁺，工程菌以此为营养物质产生大量的L-Arg。

实施例1

本实施例进行基因工程菌L-ArgBac.构建与基因测序鉴定。

使用大肠杆菌Nissle1917(ECN)为例进行基因工程改造，基因工程菌L-ArgBac.的构建方法主要分为以下两个步骤：

①L-Arg合成途径阻遏蛋白Arg_R基因的敲除：敲除大肠杆菌ECN基因组中的敲除精氨酸合成途径阻遏蛋白ArgR基因，获得基因敲除菌株ECNΔArgR；第一步，同源臂的扩增及构建；首先提取大肠杆菌ECNDNA为模板，使用序列为ArgR-UP-F(核酸序列为：ctccgctgccgcgaccttaatcc)和ArgR-up-R(核酸序列为：cgacggggcagagaaagtcacccgatatggtggttgatac)；ArgR-down-F(核酸序列为：tctgccccgtcgcttctggcggcggggaa)和ArgR-down-R(核酸序列为：cacaccacttacggatacggtcc)的引物对L-Arg的ArgR抑制基因及其同源臂进行扩增，用引物ArgR-up-F/ArgR-down-R进行PCR体系配制修复同源臂overlapping融合扩增及T载体连接，产在物加入A连pUX-T载体，转化EcoliDH5alpha感受态细胞到含氨苄青霉素(Amp)抗性的平板均匀涂布。并挑取单克隆至10μL无菌水中混匀后取，0.5μL为模板按照相应体系进行扩增，用引物M13-F(pUC)：CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG和M13-R(pUC)：AGCGGATAACAATTTCACACAGG进行菌落PCR鉴定，并挑取阳性克隆产物进行测序比对，得到阳性克隆测序结果为98.1％，成功构建上下游同源臂；

ArgR敲除菌测序结果(argR-up-F单向)：

cggttttcatggaccacatatcaagaatgtgtagtcacgcaagtttagcgtttatgcatttaattgccgtaatcaggaacctaacttacgtaattaacagtcacttatgcattagcgcaacattccaacaggtggtgacaatataccctaccgctcagccaaaacaatatcaatttgataacaattaatttacttttaagcagaatttgcaggccgtgacgcaggcatgtttctcaataacgaaatttgataaaatcccgctctttcataacattatttcagccttcttcagggctgactgtttgcataaaaattcatctgtatgcacaataatgttgtatcaaccaccatatcgggtgactttctctgccccgtcgcttctggcggcggggaaaatgttgcttttgcctatcaaccccctgctttcccctgcgattcatttaacgaatagtgcgttttactgcgacatatcattcacacaatgaatacatatagtaaaaaagcacattatgcaaaattcattatctaattgaaaatactataattaacaataaatgatcgtgtttttaattcttttttgttattaaaattcacatttttaacacttagtatcaactgaaacagttagcgtggtattaattagttcaataattagtgtatacttgattttgtgatatgggtcacgaaacaaaggcccagctaaaagattatgtcgaggtaaaaatcatgaaaatcaaaaccactgttgctgcattaagtgtgctttctgttctctctttcggtgcattcgctgccgactccattgatgctgcacaagcacaaaatcgtgaagcaatcgggacgtc；

比对结果：(与预计敲除后序列比对)

FastalignmentofDNAsequencesDNAMAN2andDNAMAN1

Ktuple＝2Gap_penalty＝7

Upperline:DNAMAN2,from3to843

Lowerline:DNAMAN1,from35to875

DNAMAN2:DNAMAN1identity＝99.17％(838/845)gap＝3.65％(32/877)；

第二步，Crispr-Cas9基因敲除，首先电转化ECN成为感受态细胞，将野生型大肠杆菌ECN接种至5mLLB液体培养基中，在37℃时活化培养过夜，将1％转接至50mLLB液体培养基中，测OD₆₀₀值为0.6～0.8时离心收集菌体，使用10％甘油洗三次，最后用2mL10％甘油重悬菌体即可得到制备好的感受态细胞。将含pCas9的质粒电转化后，取10μL质粒加到制备好的大肠杆菌ECN感受态细胞在冰上放置5min，2500KV电转化，加入1mLLB培养基，在37℃恢复培养1h后，在卡那霉素(Kan)抗性平板上进行涂布培养，以同样的方法制备pCas9ECN成为感受态后转化sgRNA(SEQ IDNO.3)及修复同源臂，并用引物ArgR-up-F/ArgR-down-R进行扩增鉴定精氨酸合成途径阻遏蛋白ArgR基因是否敲除(图2)；

第三步，编辑消除菌株的抗性，通过温度敏感型消除抗性，得到敲除成功的菌株，并把无抗性菌株命名为ECN△ArgR；

②L-Arg负反馈调节N-乙酰谷氨酸合酶ArgA215突变体基因的插入：对①中ArgR基因敲除菌ECNΔArgR的基因组中插入负反馈调节N-乙酰谷氨酸合酶ArgA的突变体基因ArgA215，获得L-精氨酸生产能力更高的基因工程重组菌株L-Argbac.(ECNΔArgRattλ:fnr-ArgA215)，首先获得整合乏氧诱导型启动子的突变体Fnr-ArgA215基因核苷酸序列，以及该基因的插入位点核苷酸序列信息；

Fnr-ArgA215核苷酸序列：

aaaaacgccgcaaagtttgagcgaagtcaataaactctctacccattcagggcaatatctctcttggatccaaagtgaactctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatggtaaaggaacgtaaaaccgagttggtcgagggattccgccattcggttccctgtatcaatacccaccggggaaaaacgtttgtcatcatgctcggcggtgaagccattgagcatgagaatttctccagtatcgttaatgatatcgggttgttgcacagcctcggcatccgtctggtggtggtctatggcgcacgtccgcagatcgacgcaaatctggctgcgcatcaccacgaaccgctgtatcacaagaatatacgtgtgaccgacgccaaaacactggaactggtgaagcaggctgcgggaacattgcaactggatattactgctcgcctgtcgatgagtctcaataacacgccgctgcagggcgcgcatatcaacgtcgtcagtggcaattttattattgcccagccgctgggcgtcgatgacggcgtggattactgccatagcgggcgtatccggcggattgatgaagacgcgatccatcgtcaactggacagcggtgcaatagtgctaatggggccggtcgctgtttcagtcactggcgagagctttaacctgacctcggaagagattgccactcaactggccatcaaactgaaagctgaaaagatgattggtttttgctcttcccagggcgtcactaatgacgacggtgatattgtctccgaacttttccctaacgaagcgcaagcgcgggtagaagcccaggaagagaaaggcgattacaactccggtacggtgcgctttttgcgtggcgcagtgaaagcctgccgcagcggcgtgcgtcgctgtcatttaatcagttatcaggaagatggcgcgctgttgcaagagttgttctcacgcgacggtatcggtacgcagattgtgatggaaagcgccgagcagattcgtcgcgcaacaatcaacgatattggcggtattctggagttgattcgcccactggagcagcaaggtattctggtacgccgttctcgcgagcagctggagatggaaatcgacaaattcaccattattcagcgcgataacacgactattgcctgcgccgcgctctatccgttcccggaagagaagattggggaaatggcctgtgtggcagttcacccggattaccgcagttcatcaaggggtgaagttctgctggaacgcattgccgctcaggctaagcagagcggcttaagcaaattgtttgtgctgaccacgcgcagtattcactggttccaggaacgtggatttaccccagtggatattgatttactgcccgagagcaaaaagcagttgtacaactaccagcgtaaatccaaagtgttgatggcggatttagggtaa；

attλ插入位点附近核苷酸序列信息：

atttgccgcgcgggttgacgtcgtgacgccagtcggcagggctcatgccaccatcaagggaaagcccaatcttcacatcaatcggtttttcacccgtaccgtacagagtaattccacccggagcggcagggacatacaccgttccctgatactcaccaggcatcacggcaatatactggcgcttgttggtacgcttgataattgccgcatctaccgccgcctgaatcgtggtatgcgttacaccttgagtacccgccgggccgacaacaaagtcaggttgcgcaggcagggtaatcggggaaggattccacgctgccgcacctggtgtcagggatgcaaaatagtgttgagcatcgaaattctgcgcttcttttgccgacagaatcgggcgcgaagaggtaccaggcgcggtttgatcagaaggacgttgatcgggcggtgttgagctacaggcggtcagcgtcacgccaaaagccaatgccagcgccagacgggaaactgaaaatgtgttcacaggttgctccgggctatgaaatagaaaaatgaatccgttgaagcctgcttttttatactaacttgagcgaaacgggaaggtaaaaagacaaaaagttgtttttaatacctttaagtgataccagatggcattgcgccatctggcagagtgattaactaaacatcgcagtaatcgaggcactcgccagagagtgaaaatgaacgttaaacccgaccatcgcgccgctggcaccttcatcgacatcaatacgttctacatccagcgcgtgaacggtaaaaatgtagcgatgggtttcgcctttcggcggcgctgcgccatcgtacccggttttaccaaagtcggtacgcgtctgcaaaacgccgtctggcatagctaccagaccagagccaaacccttgcggtaatacgcgggtatcagcgggtaaattaacaactacccagtgccaccagccggagccggttggcgcatccgggtcat；

插入Fnr-ArgA215后，整个表达盒序列信息如下：

cagtcggcagggctcatgccaccatcaagggaaagcccaatcttcacatcaatcggtttttcacccgtaccgtacagagtaattccacccggagcggcagggacatacaccgttccctgatactcaccaggcatcacggcaatatactggcgcttgttggtacgcttgataattgccgcatctaccgccgcctgaatcgtggtatgcgttacaccttgagtacccgccgggccgacaacaaagtcaggttgcgcaggcagggtaatcggggaaggattccacgctgccgcacctggtgtcagggatgcaaaatagtgttgagcatcgaaattctgcgcttcttttgccgacagaatcgggcgcgaagaggtaccaggcgcggtttgatcagaaggacgttgatcgggcggtgttgagctacaggcggtcagcgtcacgccaaaagccaatgccagcgccagacgggaaactgaaaatgtgttcacaggttgctccgggctatgaaatagaaaaatgaatccgttgaagcctgcttttttaaaaacgccgcaaagtttgagcgaagtcaataaactctctacccattcagggcaatatctctcttggatccaaagtgaactctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatggtaaaggaacgtaaaaccgagttggtcgagggattccgccattcggttccctgtatcaatacccaccggggaaaaacgtttgtcatcatgctcggcggtgaagccattgagcatgagaatttctccagtatcgttaatgatatcgggttgttgcacagcctcggcatccgtctggtggtggtctatggcgcacgtccgcagatcgacgcaaatctggctgcgcatcaccacgaaccgctgtatcacaagaatatacgtgtgaccgacgccaaaacactggaactggtgaagcaggctgcgggaacattgcaactggatattactgctcgcctgtcgatgagtctcaataacacgccgctgcagggcgcgcatatcaacgtcgtcagtggcaattttattattgcccagccgctgggcgtcgatgacggcgtggattactgccatagcgggcgtatccggcggattgatgaagacgcgatccatcgtcaactggacagcggtgcaatagtgctaatggggccggtcgctgtttcagtcactggcgagagctttaacctgacctcggaagagattgccactcaactggccatcaaactgaaagctgaaaagatgattggtttttgctcttcccagggcgtcactaatgacgacggtgatattgtctccgaacttttccctaacgaagcgcaagcgcgggtagaagcccaggaagagaaaggcgattacaactccggtacggtgcgctttttgcgtggcgcagtgaaagcctgccgcagcggcgtgcgtcgctgtcatttaatcagttatcaggaagatggcgcgctgttgcaagagttgttctcacgcgacggtatcggtacgcagattgtgatggaaagcgccgagcagattcgtcgcgcaacaatcaacgatattggcggtattctggagttgattcgcccactggagcagcaaggtattctggtacgccgttctcgcgagcagctggagatggaaatcgacaaattcaccattattcagcgcgataacacgactattgcctgcgccgcgctctatccgttcccggaagagaagattggggaaatggcctgtgtggcagttcacccggattaccgcagttcatcaaggggtgaagttctgctggaacgcattgccgctcaggctaagcagagcggcttaagcaaattgtttgtgctgaccacgcgcagtattcactggttccaggaacgtggatttaccccagtggatattgatttactgcccgagagcaaaaagcagttgtacaactaccagcgtaaatccaaagtgttgatggcggatttagggtaaatactaacttgagcgaaacgggaaggtaaaaagacaaaaagttgtttttaatacctttaagtgataccagatggcattgcgccatctggcagagtgattaactaaacatcgcagtaatcgaggcactcgccagagagtgaaaatgaacgttaaacccgaccatcgcgccgctggcaccttcatcgacatcaatacgttctacatccagcgcgtgaacggtaaaaatgtagcgatgggtttcgcctttcggcggcgctgcgccatcgtacccggttttaccaaagtcggtacgcgtctgcaaaacgccgtctggcatagctaccagaccagagccaaacc。

第一步，同源臂的构建，首先进行引物的设计，并对引物fnr-ArgA215扩增，用设计的引物ArgA-attλ-F(tgaagcctgcttttttaaaaacgccgcaaagtttgagcga)/argA-attλ-R(gctcaagttagtatttaccctaaatccgccatcaacactt)，以基因合成质粒为模板按照设定条件扩增fnr-ArgA215的片段。其次用引物attλArgA215-F(tggcggatttagggtaaatactaacttgagcgaaacggga)/attλArgA215-R(actttgcggcgtttttaaaaaagcaggcttcaacggattc)通过ECNattλ-puxT质粒为模板进行反向扩增attλ同源臂，得到产物经PCR纯化后，按照设定条件将回收的产物进行无缝克隆连接，并在冰上静置30min，转化EcoliDH5alpha成感受态细胞到含氨苄青霉素(Amp)抗性的平板均匀涂布，在37℃培养过夜。最后对长出的克隆进行菌落PCR鉴定，挑取单克隆至10μL无菌水中混匀后取，0.5μL为模板在设定体系条件体系下进行扩增，用引物M13-F(pUC)：CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG和M13-R(pUC)：AGCGGATAACAATTTCACACAGG进行鉴定，得到阳性的克隆进行测序比对，以测序阳性的attλ-ArgA215pux-T质粒为模板按照设定体系条件进行扩增修复同源臂扩增，得到阳性克隆测序结果为99.70％，成功获得整合的同源臂；

Nissle1917△ArgRattλ-argA插入测序及比对测序拼接结果：(测序引物1917attλup-F、1917attλcx-F、1917attλcx-R)

atcggtttttccccgtaccgtacagagtaattccacccggagcggcagggacatacaccgttccctgatactcaccaggcatcacggcaatatactggcgcttgttggtacgcttgataattgccgcatctaccgccgcctgaatcgtggtatgcgttacaccttgagtacccgccgggccgacaacaaagtcaggttgcgcaggcagggtaatcggggaaggattccacgctgccgcacctggtgtcagggatgcaaaatagtgttgagcatcgaaattctgcgcttcttttgccgacagaatcgggcgcgaagaggtaccaggcgcggtttgatcagaaggacgttgatcgggcggtgttgagctacaggcggtcagcgtcacgccaaaagccaatgccagcgccagacgggaaactgaaaatgtgttcacaggttgctccgggctatgaaatagaaaaatgaatccgttgaagcctgcttttttaaaaacgccgcaaagtttgagcgaagtcaataaactctctacccattcagggcaatatctctcttggatccaaagtgaactctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatggtaaaggaacgtaaaaccgagttggtcgagggattccgccattcggttccctgtatcaatacccaccggggaaaaacgtttgtcatcatgctcggcggtgaagccattgagcatgagaatttctccagtatcgttaatgatatcgggttgttgcacagcctcggcatccgtctggtggtggtctatggcgcacgtccgcagatcgacgcaaatctggctgcgcatcaccacgaaccgctgtatcacaagaatatacgtgtgaccgacgccaaaacactggaactggtgaagcaggctgcgggaacattgcaactggatattactgctcgcctgtcgatgagtctcaataacacgccgctgcagggcgcgcatatcaacgtcgtcagtggcaattttattattgcccagccgctgggcgtcgatgacggcgtggattactgccatagcgggcgtatccggcggattgatgaagacgcgatccatcgtcaactggacagcggtgcaatagtgctaatggggccggtcgctgtttcagtcactggcgagagctttaacctgacctcggaagagattgccactcaactggccatcaaactgaaagctgaaaagatgattggtttttgctcttcccagggcgtcactaatgacgacggtgatattgtctccgaacttttccctaacgaagcgcaagcgcgggtagaagcccaggaagagaaaggcgattacaactccggtacggtgcgctttttgcgtggcgcagtgaaagcctgccgcagcggcgtgcgtcgctgtcatttaatcagttatcaggaagatggcgcgctgttgcaagagttgttctcacgcgacggtatcggtacgcagattgtgatggaaagcgccgagcagattcgtcgcgcaacaatcaacgatattggcggtattctggagttgattcgcccactggagcagcaaggtattctggtacgccgttctcgcgagcagctggagatggaaatcgacaaattcaccattattcagcgcgataacacgactattgcctgcgccgcgctctatccgttcccggaagagaagattggggaaatggcctgtgtggcagttcacccggattaccgcagttcatcaaggggtgaagttctgctggaacgcattgccgctcaggctaagcagagcggcttaagcaaattgtttgtgctgaccacgcgcagtattcactggttccaggaacgtggatttaccccagtggatattgatttactgcccgagagcaaaaagcagttgtacaactaccagcgtaaatccaaagtgttgatggcggatttagggtaaatactaacttgagcgaaacgggaaggtaaaaagacaaaaagttgtttttaatacctttaagtgataccagatggcattgcgccat；

与预期插入后序列比对：

FastalignmentofDNAsequencesDNAMAN2andDNAMAN1

Ktuple＝2Gap_penalty＝7

Upperline:DNAMAN2,from58to2078

Lowerline:DNAMAN1,from6to2026

DNAMAN2:DNAMAN1identity＝99.70％(2020/2026)gap＝2.50％(52/2078)；

第二步，Crispr-Cas9基因插入，将ECN△ArgRCas9菌株电转成感受态制备，并取制备好的电转化感受态100μL加入sgRNA(SEQ ID NO.4)质粒和修复同源臂，在2500KV条件下电转化，其次在卡那霉素/壮观霉素(Kan/spc)抗性平板上进行涂布培养，最后用引物attλ-up-F/attλ-down-R进行整合鉴定(图3)；

第三步，消除抗性，接种插入成功菌株至LB液体培养基(无抗)，在37℃过夜，稀释倍数进行涂板LB(无抗)平板，37℃过夜，挑取单克隆分别点板在LB(无抗)、LB(壮观霉素)、LB(卡那霉素)，选择抗性板子不长的克隆接种于LB无抗培养基保存菌株，并命名为ECN△ArgRattλ：fnr-argA215。

参照上述方法，分别使用ArgA213、ArgA214和ArgA216基因替换ArgA215基因制备工程菌，并检测各工程菌精氨酸的生成速率，具体方法包括：将含有工程质粒的工程菌与谷氨酰胺和鸟氨酸共同孵育6h，并使用LC-MS测定含有表达突变的argA(ArgA213、ArgA214、ArgA215、ArgA216)质粒的细胞游离精氨酸的总产量，获得细胞每小时每干重游离精氨酸的合成速率，结果如图8所示，可知使用ArgA215基因能够进一步提高精氨酸的生成速率。

ArgA213基因序列为：

atggtaaaggaacgtaaaaccgagttggtcgagggattccgccattcggttccctatatcaatacccaccggggaaaaacgtttgtcatcatgctcggcggtgaagccattgagcatgagaatttctccagtatcgttaatgatatcgggttgttgcacagcctcggcatccatctggtggtggtctatggcgcacgtccgcagattgacgcaaatctggctgcgcatcaccacgaaccgctgtatcacaagaatatacgtgtgaccgacgccaaaacactggaactggtgaagcaggctgcgggaacattgcaactggatattactgctcgcctgtcgatgagtctcaataacacgccgctgcagggcgcgcatatcaacgtcgtcagtggcaattttattattgcccagccgctgggcgtcgatgacggcgtggattactgccatagcgggcgtatccggcggattgatgaagacgcgatccatcgtcaactggacagcggtgcaatagtgctaatggggccggtcgctgtttcagtcactggcgagagctttaacctgacctcggaagagattgccactcaactggccatcaaactgaaagctgaaaagatgattggtttttgctcttcccagggcgtcactaatgacgacggtgatattgtctccgaacttttccctaacgaagcgcaagcgcgggtagaagcccaggaagagaaaggcgattacaactccggtacggtgcgctttttgcgtggcgcagtgaaagcctgccgcagcggcgtgcgtcgctgtcatttaatcagttatcaggaagatggcgcgctgttgcaagagttgttctcacgcgacggtatcggtacgcagattgtgatggaaagcgccgagcagattcgtcgcgcaacaatcaacgatattggcggtattctggagttgattcgcccactggagcagcaaggtattctggtacgccgttctcgcgagcagctggagatggaaatcgacaaattcaccattattcagcgcgataacacgactattgcctgcgccgcgctctatccgttcccggaagagaagattggggaaatggcctgtgtggcagttcacccggattaccgcagttcatcaaggggtgaagttctgctggaacgcattgccgctcaggcgaagcagagcggcttaagcaaattgtttgtgctgaccacgcgcagtattcactggttccaggaacgtggatttaccccagtggatattgatttactgcccgagagcaaaaagcagttgtacaactaccagcgtaaatccaaagtgttgatggcggatttagggtaa。

ArgA214基因序列为(SEQ ID NO.5)：

atggtaaaggaacgtaaaaccgagttggtcgagggattccgctattcggttccctatatcaatacccaccggggaaaaacgtttgtcatcatgctcggcggtgaagccattgagcatgagaatttctccagtatcgttaatgatatcgggttgttgcacagcctcggcatccgtctggtggtggtctatggcgcacgtccgcagatcgacgcaaatctggctgcgcatcaccacgaaccgctgtatcacaagaatatacgtgtgaccgacgccaaaacactggaactggtgaagcaggctgcgggaacattgcaactggatattactgctcgcctgtcgatgagtctcaataacacgccgctgcagggcgcgcatatcaacgtcgtcagtggcaattttattattgcccagccgctgggcgtcgatgacggcgtggattactgccatagcgggcgtatccggcggattgatgaagacgcgatccatcgtcaactggacagcggtgcaatagtgctaatggggccggtcgctgtttcagtcactggcgagagctttaacctgacctcggaagagattgccactcaactggccatcaaactgaaagctgaaaagatgattggtttttgctcttcccagggcgtcactaatgacgacggtgatattgtctccgaacttttccctaacgaagcgcaagcgcgggtagaagcccaggaagagaaaggcgattacaactccggtacggtgcgctttttgcgtggcgcagtgaaagcctgccgcagcggcgtgcgtcgctgtcatttaatcagttatcaggaagatggcgcgctgttgcaagagttgttctcacgcgacggtatcggtacgcagattgtgatggaaagcgccgagcagattcgtcgcgcaacaatcaacgatattggcggtattctggagttgattcgcccactggagcagcaaggtattctggtacgccgttctcgcgagcagctggagatggaaatcgacaaattcaccattattcagcgcgataacacgactattgcctgcgccgcgctctatccgttcccggaagagaagattggggaaatggcctgtgtggcagttcacccggattaccgcagttcatcaaggggtgaagttctgctggaacgcattgccgctcaggctaagcagagcggcttaagcaaattgtttgtgctgaccacgcgcagtattcactggttccaggaacgtggatttaccccagtggatattgatttactgcccgagagcaaaaagcagttgtacaactaccagcgtaaatccaaagtgttgatggcggatttagggtaa。

ArgA216基因序列为：

atggtaaaggaacgtaaaaccgagttggtcgagggattccgccattcggttccctatatcaatacccaccggggaaaaacgtttgtcatcatgctcggcggtgaagccattgagcatgagaatttctccagtatcgttaatgatatcgggttgttgcacagcctcggcatccgtctggtggtggtctatggcgcacgtccgcagatcgacgcaaatctggctgcgcatcaccacgaaccgctgtatcacaagaatatacgtgtgaccgacgccaaaacactggaactggtgaagcaggctgcgggaacattgcaactggatattactgctcgcctgtcgatgagtctcaataacacgccgctgcagggcgcgcatatcaacgtcgtcagtggcaattttattattgcccagccgctgggcgtcgatgacggcgtggattactgccatagcgggcgtatccggcggattgatgaagacgcgatccatcgtcaactggacagcggtgcaatagtgctaatggggccggtcgctgtttcagtcactggcgagagctttaacctgacctcggaagagattgccactcaactggccatcaaactgaaagctgaaaagatgattggtttttgctcttcccagggcgtcactaatgacgacggtgatattgtctccgaacttttccctaacgaagcgcaagcgcgggtagaagcccaggaagagaaaggcgattacaactccggtacggtgcgctttttgcgtggcgcagtgaaagcctgccgcagcggcgtgcgtcgctgtcatttaatcagttatcaggaagatggcgcgctgttgcaagagttgttctcacgcgacggtatcagtacgcagattgtgatggaaagcgccgagcagattcgtcgcgcaacaatcaacgatattggcggtattctggagttgattcgcccactggagcagcaaggtattctggtacgccgttctcgcgagcagctggagatggaaatcgacaaattcaccattattcagcgcgataacacgactattgcctgcgccgcgctctatccgttcccggaagagaagattggggaaatggcctgtgtggcagttcacccggattaccgcagttcatcaaggggtgaagttctgctggaacgcattgccgctcaggcgaagcagagcggcttaagcaaattgtttgtgctgaccacgcgcagtattcactggttccaggaacgtggatttaccccagtggatattgatttactgcccgagagcaaaaagcagttgtacaactaccagcgtaaatccaaagtgttgatggcggatttagggtaa。

实施例2

本实施例进行基因工程菌L-Argbac.活性的检测与体外培养L-Arg产量检测。

①活性检测。

分别在有氧和无氧条件下测试工程菌活性，将ECN和L-ArgBac.菌株从-80℃的甘油菌复苏，并各分成两组：有氧和无氧变量组，四组菌株分别接种到LB培养基的摇菌管中，在37℃、100r/min条件下震荡培养12h，利用紫外分光光度计检测菌株OD₆₀₀值，取OD₆₀₀在0.6～0.8之间得菌液，充入氮气排除无氧组LB培养基菌液中的氧气，无氧组在无氧环境中，37℃静置2h进行通路诱导。各组取0.25mLLB培养基菌液用离心法收集菌体，并用PBS清洗一次后稀释20倍在M9培养基中，用摇菌管在37℃、100rpm环境中摇瓶培养，采集各组0h时的代表性样本，同时震荡培养，分别取3h、9h和24h等不同时间节点的样品，检测OD₆₀₀值(图4)，由OD₆₀₀值数据变化可知，本发明所得工程菌株L-ArgBac.活性较野生菌减弱，但是总体上菌株活性改变不大，且活性趋势向上；

②L-Arg产量检测。

在①中取无氧组3h、9h和24h取有代表性的样本LC-MS检测改造后的菌株L-Arg产量，由检测结果可得L-ArgBac.经基因工程改造后L-Arg产量是野生大肠杆菌ECN菌的1000倍(图5)。

实施例3

本实施例进行基因工程菌L-ArgBac.的肿瘤靶向定殖。

取-80℃冻存的ECN和L-ArgBac.甘油菌复苏，各分成两组，同实施例2①中标记组别，分别接种到LB培养基的摇菌管中，37℃、100r/min，震荡培养12h，监测菌液OD₆₀₀值，取OD₆₀₀值0.6～0.8菌液离心收集菌体，用PBS洗涤3次并计数，取5×10⁷个菌体用PBS重悬后尾静脉注入荷瘤的老鼠体内，24h后，断颈处死小鼠，取肿瘤组织并称重，将肿瘤组织消化重悬成单细胞悬液，稀释的单细胞悬液样品各20μL，在细菌培养板上进行均匀涂板，37℃培养12h，进行菌落计数，计算单位肿瘤组织内所含的菌落数(图6)，表明本发明改造所得菌株通过尾静脉注射后肿瘤靶向能力与原始菌株靶向能力改变不大。

实施例4

本实施例进行基因工程菌L-ArgBac.瘤内产L-Arg与抑瘤效果分析。

使用免疫正常的C57/BL6J小鼠构建B16动物肿瘤模型，每只小鼠皮下注射5×10⁶鼠源黑色素瘤B16F10细胞，5天后肿瘤体积达到50mm³，并将荷瘤小鼠随机分成两组：ECN组和L-Argbac.组，取-80℃冻存的ECN和L-ArgBac.甘油菌复苏，同实施例2①中标记组别，分别接种到LB培养基的摇菌管中，37℃、100r/min，震荡培养过夜，取OD₆₀₀值0.6～0.8菌液离心收集菌体，离心收集菌体，用PBS洗涤3次并计数，将5×10⁷CFU菌株用PBS重悬后尾静脉注射到荷瘤的小鼠体内，定期记录小鼠肿瘤定期记录(图7)，由图7可知，L-ArgBac.组瘤内产生的L-Arg使得肿瘤较ECN组生长缓慢，对肿瘤的生长有一定的抑制效果。

综上所述，本发明通过基因编辑技术合成L-Arg工程菌，敲除或弱化工程菌株中抑制L-Arg合成途径的阻遏蛋白ArgR基因，使得菌株L-Arg产量获得显著的提升，并整合特定过表达基因ArgA和诱导型启动子，从而实现诱导启动大量产生L-Arg，成功构建厌氧高产L-精氨酸工程菌，L-精氨酸产量与野生菌相比提高近1000倍，且所述工程菌能够在肿瘤微环境中靶向定殖，利用肿瘤细胞生成的代谢废物作为营养物质生存，并产生L-Arg通过代谢来调控肿瘤免疫微环境，对提高肿瘤治疗疗效有着重要的意义。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种厌氧高产L-精氨酸工程菌，其特征在于，所述工程菌中含有编码N-乙酰谷氨酸合成酶变体的基因，所述编码N-乙酰谷氨酸合成酶变体的基因由被外源环境条件诱导的启动子控制；

所述工程菌被工程化为缺乏功能性ArgR；

所述编码N-乙酰谷氨酸合成酶变体的基因具有选自以下的DNA序列中任意一种：

a)SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.5；

b)除了冗余的遗传密码以外，编码与由SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.5编码的多肽相同的多肽的DNA序列；

c)与a)或b)的DNA序列具有至少80％同源性的DNA序列。

2.根据权利要求1所述的厌氧高产L-精氨酸工程菌，其特征在于，所述编码N-乙酰谷氨酸合成酶变体的基因在工程菌基因组上的插入位置包括malE和malK之间或attλ插入位点；

优选地，所述工程化为缺乏功能性ArgR包括敲除ArgR基因或弱化ArgR基因表达量。

3.根据权利要求1所述的厌氧高产L-精氨酸工程菌，其特征在于，所述被外源环境条件诱导的启动子包括乏氧响应启动子、酸响应启动子、氧化还原响应启动子、光刺激启动子、电刺激启动子或磁驱动启动子中任意一种；

优选地，所述乏氧响应启动子选自fnr-sp、hip1、i14018、ptet-arca、ptet-fnr、r1074、ssbp1或ysgap中任意一种。

4.根据权利要求1所述的厌氧高产L-精氨酸工程菌，其特征在于，所述工程菌的出发菌株选自谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、变形杆菌、肠杆菌、伤寒杆菌、沙门氏菌或志贺氏菌中任意一种。

5.一种权利要求1-4任一项所述的厌氧高产L-精氨酸工程菌的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

利用Crispr-Cas9系统敲除出发菌株的ArgR基因，并在出发菌株的基因组中插入编码N-乙酰谷氨酸合成酶变体的基因，所述编码N-乙酰谷氨酸合成酶变体的基因由被外源环境条件诱导的启动子控制，得到所述厌氧高产L-精氨酸工程菌；

所述编码N-乙酰谷氨酸合成酶变体的基因具有选自以下的DNA序列中任意一种：

a)SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.5；

b)除了冗余的遗传密码以外，编码与由SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.5编码的多肽相同的多肽的DNA序列；

c)与a)或b)的DNA序列具有至少80％同源性的DNA序列。

6.根据权利要求5所述的厌氧高产L-精氨酸工程菌的制备方法，其特征在于，其特征在于，所述Crispr-Cas9系统的sgRNA的核酸序列包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的序列。

7.权利要求1-4任一项所述的厌氧高产L-精氨酸工程菌在生产L-精氨酸中的应用。

8.一种生产L-精氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括：

对权利要求1-4任一项所述的厌氧高产L-精氨酸工程菌进行发酵培养，获得L-精氨酸。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-4任一项所述的厌氧高产L-精氨酸工程菌。

10.权利要求1-4任一项所述的厌氧高产L-精氨酸工程菌或权利要求9所述的药物组合物在制备治疗或辅助治疗肿瘤的药物中的应用；

优选地，所述肿瘤包括急性髓系白血病、神经母细胞瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌、三阴性乳腺癌、脑转移瘤、结肠癌或肝癌。

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