CN110195036B - 一种高产乙酰氨基葡萄糖的重组谷氨酸棒杆菌及其应用 - Google Patents

一种高产乙酰氨基葡萄糖的重组谷氨酸棒杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种高产乙酰氨基葡萄糖的重组谷氨酸棒杆菌，是敲除了乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因NagA和乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因GamA，并表达了来源于秀丽隐杆线虫的氨基葡萄糖脱乙酰化酶编码基因GNA1。该重组谷氨酸棒杆菌可实现乙酰氨基葡萄糖在胞外积累，其浓度最高为24.7g/L，相比未改造菌株提升84.2％，为进一步代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。本发明提供的重组谷氨酸棒杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。

Description

一种高产乙酰氨基葡萄糖的重组谷氨酸棒杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种高产乙酰氨基葡萄糖的重组谷氨酸棒杆菌及其应用，属于代谢工程领域。
背景技术
N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）是氨基葡萄糖的一种衍生物，具有还原性，也是合成双岐因子和透明质酸的重要前体物质，又称2-（乙酰氨基）-2-脱氧-葡萄糖及N-乙酰葡萄糖胺，是生物体内多种多糖的基本组成单位，在生物体内具有重要的生理功能。GlcNAc是一种新型生化药品，它在临床上是治疗风湿性及类风湿性关节炎的药物。对癌症和恶性肿癌起到抑制和治疗作用，对降低胆固醇、减肥、增钙等方面效果显著。它是生物细胞内许多重要多糖的基本组成单位，它是合成双歧因子的重要前体，在生物体内具有许多重要生理功能，所以也作为婴幼儿食品添加剂，糖尿病患者甜味剂。还可用于临床增强人体免疫系统的功能。GlcNAc可以提高关节抗炎活性和蛋白活性，其效果好于透明质酸。GlcNAc可以诱导白血病细胞的分化，很可能成为新的低毒、高效的治疗白血病的候选药物。
GlcNAc的生产方法目前主要有甲壳素水解法、生物转化法和微生物合成法。相对前两者，微生物合成法具有生产时间短、产量高、效率高、对环境污染小等诸多优点，从而受到广大学者的青睐。
谷氨酸棒杆菌是一种革兰氏阳性菌，它作为一种食品级的微生物已经应用于诸多氨基酸的工业化发酵生产中，如谷氨酸、缬氨酸、赖氨酸等。近年来，学者们开始研究利用谷氨酸棒杆菌生产非氨基酸物质。相比于大肠杆菌来说，谷氨酸棒杆菌具有高安全性、低致病性、高抗逆性、受噬菌体污染的概率较低等优点，因此，它也在基因工程领域发挥着重要作用。然而，乙酰氨基葡萄糖是谷氨酸棒杆菌优先利用的碳源物质，当培养基中的葡萄糖耗尽后，乙酰氨基葡萄糖通过胞内脱氨基和脱乙酰基作用，以果糖-6-磷酸形式进入细胞糖酵解途径，从而参与细胞代谢，导致胞外乙酰氨基葡萄糖的浓度降低。因此，提供一种能够积累胞外乙酰氨基葡萄糖的方法，对于工业生产GlcNAc具有很高的应用价值。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种产乙酰氨基葡萄糖的重组谷氨酸棒杆菌，是敲除了N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶编码基因NagA和氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶编码基因NagB，并表达了来源于秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的氨基葡萄糖-6-磷酸N-乙酰基转移酶编码基因GNA1。
在本发明的一种实施方式中，所述氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因如NCBI- GeneID: 179437所示。
在本发明的一种实施方式中，N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶编码基因如NCBI-GeneID: 1020593所示。
在本发明的一种实施方式中，氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶编码基因如NCBI-GeneID: 1020592所示。
在本发明的一种实施方式中，以谷氨酸棒状杆菌S9114为出发菌株。
在本发明的一种实施方式中，所述氨基葡萄糖-6-磷酸N-乙酰基转移酶编码基因通过表达载体pJYW-4进行表达，以启动子Ptac控制葡萄糖乙酰化酶基因的表达。
在本发明的一种实施方式中，所述启动子Ptac由PTrp启动子和Plac启动子杂合而成，具有更高的转录效率。启动子Ptac的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
本发明的第二个目的是提供一种构建上述重组谷氨酸棒杆菌的方法，具体方法如下:
1）构建N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶编码基因NagA和N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨基酶编码基因NagB敲除框，通过同源重组将敲除框中的卡那霉素抗性基因kana代替谷氨酸棒杆菌基因组中的N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶编码基因NagA和N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨基酶编码基因NagB；
2）克隆秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的氨基葡萄糖-6-磷酸N-乙酰基转移酶编码基因GNA1，连接到质粒pTYW-4-ceN上，在GNA1基因的3’非翻译区插入重复性回文序列基因的3’非翻译区插入重复性回文序列，重复性回文序列的的核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示，构建重组质粒pTYW-4-ceN-REP；将重组质粒转化进已敲除N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶编码基因NagA和N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨基酶编码基因NagB的谷氨酸棒杆菌，得到产N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸的谷氨酸棒杆菌工程菌。
本发明的第三个目的是提供利用上述重组谷氨酸棒杆菌发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸的方法，是将28-30℃，200-220 rpm下培养16-20 h的重组谷氨酸棒杆菌种子以5-10%的接种量转入发酵培养基，于28-30℃，200-220 rpm条件下培养100-120 h。
本发明的第四个目的是提供上述的重组谷氨酸棒杆菌在制药领域的应用，如制备风湿性及类风湿性关节炎药物、抗癌药物、白血病药物、降低胆固醇药物、减肥药物、增钙药物，如合成双歧因子，如制备婴幼儿食品添加剂或糖尿病患者甜味剂。
本发明提供了一种产N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸的重组谷氨酸棒杆菌，是敲除了N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶编码基因NagA和氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶编码基因NagB，并表达了来源于秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的氨基葡萄糖-6-磷酸N-乙酰基转移酶编码基因GNA1。该重组谷氨酸棒杆菌可实现乙酰氨基葡萄糖在胞外积累，其浓度最高为24.7 g/L，相比未改造菌株提升84.2%，为进一步代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。本发明提供的重组谷氨酸棒杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。
附图说明
图1：不同时间下产乙酰氨基葡萄糖的产量。
具体实施方式
（一）培养基
种子活化培养基液体（LBG）（g/L）:蛋白胨 10.0，酵母膏5.0，NaCl 10.0，葡萄糖5.0，装液量20mL每250ml三角瓶。
种子活化培养基固体（LBG固体）（g/L）:蛋白胨 10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0，葡萄糖5.0，营养琼脂15.0-20.0。
感受态培养基（g/L）:蛋白胨 10.0，酵母膏5.0，NaCl 10.0，甘氨酸30.0，异烟肼4.0，同时加入10 mL的Tween 80, 装液量50 mL每500 mL三角瓶。
电击转化后恢复培养基LBHIS （g/L）:蛋白胨 5.0，酵母膏2.5，NaCl 5.0，脑心浸液18.5，山梨醇91.0。
转化子检出培养基固体（g/L）:蛋白胨 5.0，酵母膏2.5，NaCl 5.0，脑心浸液18.5，山梨醇91.0，营养琼脂15.0-20.0。
种子培养基（g/L）:葡萄糖25.0 , 玉米浆 20.0，KH2PO4 1.0，（NH4）2SO4 0.5，尿素 1.25，pH 7.0。
发酵培养基（g/L）:葡萄糖 40.0，玉米浆 20.0，KH2PO4 1.0，（NH4）2SO4 20.0，MgSO4 0.5，CaCO3 20.0，pH 7.0。
灭菌条件: 115℃，20 min，所有培养基用于转化子检出或用于重组菌培养时加入25 mg/L硫卡那霉素。
（二）乙酰氨基葡萄糖的测定方法
高效液相色谱（HPLC）检测法:Agilent 1260，RID检测器，HPX-87H柱（Bio-RadHercules, CA），流动相:5 mM H2SO4，流速0.6 mL/min，柱温35℃，进样体积为10 μL。
（三）谷氨酸棒杆菌电转感受态的制备
（1）Corynebacterium glutamicum接种于LBG培养基（需要在新鲜培养的斜面上进行挑选，否则会影响菌体的生长），置于巡回式摇床（200 rpm）上，30℃培养16 h，OD562达到3.0。
（2）以10%的接种量将（1）中的菌液转接入感受态培养基中OD562达到0.3，置于巡回式摇床（200 rpm）上，30℃培养至OD562达到0.9（培养约3-5 h，处于对数生长期即可，一般如果菌浓持续较低，OD562在0.6左右也可以继续进行后续操作）。需要保证菌体浓度尽量要浓，一般浓缩倍数为100倍（50 mL感受态培养基浓缩至0.5 mL制备5管感受态细胞）。
（3）菌液冰水浴15 min，4000 rpm，4℃离心10 min，弃去上清。
（4）用30 mL预冷10%甘油充分悬浮菌体，4000 rpm，4℃离心10 min，弃去上清，重复洗涤四次。
（5）用500 μL预冷10%甘油重悬细胞（浓缩100倍），1.5 mL无菌离心管分装，每管100 μL。
（6）-80℃保存待用（为保证感受态的转化效率最好现用现做，不能放置超过1周，否则由于感受态细胞裂解细胞内容物释放，在后续电击转化过程中造成电转杯的击穿，同时影响转化效率）。
（四）谷氨酸棒杆菌的电击转化：
（1）-80℃保存的谷氨酸棒状杆菌感受态，冰浴中融化。
（2）加入1-5.0 μL质粒混匀（DNA总量约为1.0 μg），冰浴5-10 min。
（3）加入于预冷的0.1 cm电击杯中，1.8 KV电压5 ms电击2次。
（4）迅速加入预热的恢复用培养基（LBWS） 1.0 mL混匀并转移到新的1.5 mL无菌离心管中，46℃水浴6 min，后放入冰浴中。
（5）将菌体置于巡回式摇床（100 rpm）上，30℃后培养2 h。
（6）6000 rpm，常温离心1 min，涂布到加入对应抗性的转化子检出平板中，于30℃恒温培养箱，培养2-3天。
（7）感受态效率验证:加入5.0 μL无菌ddH2O作为阴性对照，无菌落，阳性对照加入1-5 μL质粒pXMJl9（DNA总量约为1.0 μg），长出大量菌落。
实施例1 敲除N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶编码基因（NagA）和氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶编码基因（NagB）
根据NCBI上公布的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum） ATCC 13032N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶编码基因（NagA）和氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶编码基因NagB（核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示）上下游序列，设计敲除同源臂扩增引物，左臂上下游引物分别为2555loxPU F（核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示）和2555loxPU R（核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示）；右臂上下游引物分别为2555loxPD F（核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示）和2555loxPD R（核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示）；分别以谷氨酸棒杆菌S9114菌株基因组DNA为模板，通过PCR将左臂和右臂扩增下来。根据质粒pDTW-202（构建方法见文献：Construction and application of an efficient multiple-gene-deletion system inCorynebacterium glutamicum. Plasmid 2013;70:303-13.）上loxp-kana-loxp基因的核苷酸系列设计引物2555Kanloxp F（核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示）和2555Kanloxp F（核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示），以质粒pDTW-202为模板将loxp-kana-loxp基因扩增loxp基因和卡那霉素抗性基因。通过酶切连接的方法，用快切酶XhoI/XbaI酶切2小时后的左臂、用快切酶XbaI/BamHI酶切2小时后的loxp-kana-loxp基因片段、用快切酶BamHI/EcoRI酶切2小时的右臂、用快切酶XhoI/EcoRI酶切2小时的质粒pBluescriptIISK（+）（构建方法见文献：Construction and application of an efficient multiple-gene-deletion systemin Corynebacterium glutamicum. Plasmid 2013;70:303-13.）用T4连接酶于16℃过夜连接(1)。
将构建好的带有NagA和NagB敲除框的pBluescriptIISK（+）连接体系转化E. coliJM109感受态细胞（感受态制备方法详见Takara大肠杆菌感受态试剂盒说明书；货号：9128），挑选菌落PCR正确的转化子进行测序验证，得到重组质粒pBluescriptIISK（+）-NagA-NagB。提取重组质粒pBluescriptIISK（+）-NagA-NagB电转化谷氨酸棒杆菌S9114，通过卡那霉素抗性平板筛选，菌落PCR验证，确认敲除框左右臂均结合到S9114基因组上，确认N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶编码基因（NagA）和氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶编码基因NagB敲除，得到重组谷氨酸棒杆菌S9114-ΔNagA-NagB。
实施例2 重组质粒pTYW-4-ceN-REP的构建
使用引物ceGNA1F（核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示）所示和ceGNA1R（核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示）将来自线虫的葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶基因（CeGNA1）从pP43-HA-ceN-RBS4质粒（构建方法见文献：Metabolic engineering of carbon overflowmetabolism of Bacillus subtilis for improved N-acetyl-glucosamine production.Bioresour Technol 2018;250:642-9. ）上扩增下来，使用的酶切位点是PstI和NotI。
使用质粒pJYW-4（构建方法见文献：Construction and application of anefficient multiple-gene-deletion system in Corynebacterium glutamicum.Plasmid 2013;70:303-13.作为表达载体来表达GNA1。
使用LA Taq HS DNA聚合酶（购于上海公司赛默飞公司，货号：F122S ）扩增CeGNA1基因。
以提取的pP43-HA-ceN-RBS4质粒为模板，PCR条件为：95℃预变性3 min；98℃变性1min；58℃退火1 min；72℃延伸45 s，反应30个循环；最后72℃延伸l0 min。PCR产物用DNA纯化试剂盒回收，获得CeGNA1基因。
用限制性内切酶Pst I和Not I切上一步所得CeGNA1基因PCR产物，验证用酶切体系为：PCR产物DNA 5 µL，Pst I 0.5 µL，Not I 0.5 µL，10×H buffer 2 µL，加入双蒸水至20 µL；回收用酶切体系为：质粒DNA 16 µL，Pst I 1 µL，Not I 1µL，10×H buffer 2µL。进行1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物或回收目的片段。同时将质粒pJYW-4做同样的双酶切处理，然后胶回收酶切产物。
采用连接试剂盒（购于上海公司赛默飞公司，货号： 15224041）连接插入片段和质粒。将载体和插入片段按1:1 到1:10的摩尔比混合，加入等量的连接混合溶液，16℃下采用T4连接酶连接1 h或过夜。然后转化E. coli. JM109感受态细胞。挑选菌落PCR正确的转化子进行测序验证，得到重组质粒pJYW-4-ceN。
在质粒pJYW-4-ceN的基础上用引物PJYWREP（JG）F（核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示）和PJYWREP（JG）R（核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示）将带有间隔区序列的REP序列（核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示）加GNA1基因的3'UTR处，以测序正确的pJYW-4-ceN质粒为模板，PCR条件为：95℃预变性3 min; 98℃变性1 min; 58℃退火1 min；72℃延伸7 min 40s，反应30个循环；最后72℃延伸l0 min。PCR产物用DNA纯化试剂盒回收，然后转化E. coliJM109感受态细胞。测序正确后得到重组质粒pJYW-4-ceN-REP。
将质粒pJYW-4-ceN-REP通过电击转化法转化到谷氨酸棒杆菌S9114-ΔNagA-NagB菌株中。
实施例3 重组谷氨酸棒杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖
将测序结果正确的分别含有将质粒pJYW-4-ceN-REP的重组谷氨酸棒杆菌菌株S9114-ΔNagA-NagB于甘油管接种划线LBG平板（添加硫卡那霉素25 mg/L），30℃下220rpm培养18h后再挑选单菌落重新划线LBG平板直至长出大量菌落。
接种一环单菌落至种子培养基，30℃下220rpm培养16至18h至细胞生长对数前期。
按起始OD562为1.7-1.8的接种量将种子培养液接种至发酵培养基中，30℃，220rpm培养72h。每隔12 h取一次菌液，测量OD562，葡萄糖剩余量及GlcNac生成量。72 h后GlcNac产量为24.7 g/L（图1）。通过在已敲除N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶编码基因（NagA）和氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶编码基因(NagB)的宿主菌中过表达氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因（GNA1）,实现了乙酰氨基葡萄糖在重组谷氨酸棒杆菌胞外产量的提高。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种高产乙酰氨基葡萄糖的重组谷氨酸棒杆菌及其应用
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gttccaatgc gttgattgca taaatgaatt ga 32
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<212> DNA
<213> 人工序列
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atctcgaggg tcaaaggtga tttcaccggc gaatt 35
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<212> DNA
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acctctagag gaaacggcca catcgctttc aatgagc 37
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
acctctagag cgcaattaac cctcactaaa g 31
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atggatccaa tacgactcac tatagggcg 29
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
acggatccag gaaacgcgcc accgtttcc 29
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ccggaattct ccttggtgcc tgcaagaacg cca 33
<210> 8
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ataagaatgc ggccgcccgc tagaaagaag gaggacccga caatgtatcc gta 53
<210> 9
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
aaaactgcag ttaaaagcgc tgggtcataa aattacagtc atcctgaaag cca 53
<210> 10
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gcgcccgata cgggcgcctt atccggccta cagcttggct gttttggcgg atgagagaag 60
attttcag 68
<210> 11
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cggcatccgg cttttcttct cctttgctag tgttaaaagc gctgggtcat aaaattacag 60
tcatcctgaa agccaa 76
<210> 12
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
actagcaaag gagaagaaaa gccggatgcc ggcgcccgat acgggcgcct tatccggcct 60
ac 62
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ttgacaatta atcatcggct cgtataatg 29

Claims (7)

1.一种产乙酰氨基葡萄糖的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，是敲除了N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶编码基因NagA和氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶编码基因NagB，并表达了来源于秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的氨基葡萄糖-6-磷酸N-乙酰基转移酶编码基因GNA1；所述氨基葡萄糖-6-磷酸N-乙酰基转移酶编码基因如NCBI- Gene ID: 179437所示；N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶编码基因如NCBI-GeneID: 1020593所示；氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶编码基因如NCBI-GeneID: 1020592所示。
2.如权利要求1任一所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，以谷氨酸棒状杆菌S9114为出发菌株。
3.如权利要求2所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述氨基葡萄糖-6-磷酸N-乙酰基转移酶编码基因通过表达载体pJYW-4进行表达。
4.一种构建权利要求1-3任一所述的重组谷氨酸棒杆菌的方法，其特征在于，具体方法如下:
1）构建N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶编码基因NagA和氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶编码基因NagB敲除框，通过同源重组将敲除框中的卡那霉素抗性基因kana代替谷氨酸棒杆菌基因组中的N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶编码基因NagA和氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶编码基因NagB；
2）克隆秀丽隐杆线虫的氨基葡萄糖-6-磷酸N-乙酰基转移酶编码基因GNA1，连接到质粒pTYW-4-ceN上，在GNA1基因的3’非翻译区插入重复性回文序列基因的3’非翻译区插入重复性回文序列，重复性回文序列的的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，构建重组质粒pTYW-4-ceN-REP；将重组质粒转化进已敲除N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶编码基因NagA和氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶编码基因NagB的谷氨酸棒杆菌，得到产乙酰氨基葡萄糖的谷氨酸棒杆菌工程菌。
5.一种生产乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，应用了权利要求1-3任一所述的重组谷氨酸棒杆菌进行发酵。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，是将28-30℃，200-220 rpm下培养16-20 h的重组谷氨酸棒杆菌种子以5-10%的接种量转入发酵培养基，于28-30℃，200-220 rpm条件下培养100-120 h。
7.权利要求1-3任一所述的重组谷氨酸棒杆菌在制药领域的应用。
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