CN117467594B

CN117467594B - 一种生产2'-岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其应用

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Publication number: CN117467594B
Application number: CN202311807095.3A
Authority: CN
Inventors: 张志乾; 耿锐; 吴奕瑞; 江翱; 王海梅; 傅玮; 林玉书; 王帆; 杨刚柱
Original assignee: Tichuang Biotechnology Guangzhou Co ltd
Current assignee: Tichuang Biotechnology Guangzhou Co ltd
Priority date: 2023-12-26
Filing date: 2023-12-26
Publication date: 2024-04-09
Anticipated expiration: 2043-12-26
Also published as: CN117467594A

Abstract

本发明属于基因工程领域，提供了一种生产2’‑岩藻糖基乳糖的基因工程菌、其制备方法及应用。本发明通过转座载体系统将2个拷贝数的SetA基因插入改造菌株的基因组中，使得SetA基因在细胞内稳定表达，提高了2’‑FL的输出速率，解除了胞内产物积累对2’‑FL合成过程的抑制作用，最终实现发酵产量的大幅提高。此外，本发明还在发酵培养基中优化了金属离子组分以及补料中乳糖的浓度，在提高产量的同时一定程度上降低了成本。

Description

一种生产2’-岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种生产2’-岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其应用，属于基因工程领域。

背景技术

大肠杆菌发酵过程中，培养基中葡萄糖作为主要碳源被胞内吸收，在manB、manC、wcaG等催化酶的作用下最终生成GDP-岩藻糖。胞外的乳糖被细胞摄入后与GDP-岩藻糖共同生成2’-岩藻糖基乳糖（2’-Fucosyllactose，2’-FL），具体过程如附图1所示。

2’-岩藻糖基乳糖是母乳低聚糖的重要成分之一。作为母乳成分之一，2’-岩藻糖基乳糖占母乳低聚糖的比例可达30%，并具有较高的营养和药用价值。目前生产2’-岩藻糖基乳糖的方法包括化学合成法、酶法、发酵法等。其中发酵法生产2’-岩藻糖基乳糖具有成本低、环境友好等优势。

大肠杆菌细胞具有高代谢活性和高繁殖率的优点，因此各种遗传背景的大肠杆菌是分子生物学和生物技术领域中最常用的生物之一。本领域已对大肠杆菌发酵生产2’-岩藻糖基乳糖进行了广泛的研究，以提高2’-岩藻糖基乳糖的产率。其中对大肠杆菌合成2’-岩藻糖基乳糖的从头合成途径和补救途径以及相关的关键酶的研究较为深入。

然而，现有的菌株在改造完2’-FL合成途径关键基因后，其发酵产量仍有待提高，主要是因为2’-岩藻糖基乳糖（2’-FL）运输出胞外的效率不高，导致2’-FL在胞内积累，对整个合成途径有一定的反馈抑制作用。

糖外排转运体（Sugar efflux transporter，Set）是1999年在大肠杆菌中发现的转运蛋白家族，包括SetA、SetB和SetC。该族转运蛋白可将葡萄糖、乳糖、某些单糖和二糖以及诱导分子例如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG)外排。

SetA蛋白具有广泛的底物特异性，偏好用于具有烷基或芳基取代基的糖苷或半乳糖苷。常规条件下，SetA基因表达水平较低，且对庚糖或三糖等寡糖转运活性较低。

SetA蛋白被发现具有外排2’-岩藻糖基乳糖的作用，从而可能通过降低胞内2’-岩藻糖基乳糖提高胞外2’-岩藻糖基乳糖的水平。然而，SetA基因转录调控机制并不完全清楚，SetA基因过表达对2’-岩藻糖基乳糖生产的影响尚难以预测。同时，目前通过外源质粒过表达SetA基因，从而将2’-岩藻糖基乳糖输出至胞外的效果并不稳定。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，通过转座载体系统，将2个拷贝数的SetA基因插入改造菌株的基因组中，使得SetA基因在改造菌株的细胞内稳定表达，以此提高2’-FL的输出速率，解除了胞内产物积累对合成过程的抑制作用，最终实现发酵产量的大幅提高。

为此，本发明一方面提供了一种生产2’-岩藻糖基乳糖的基因工程菌，其含有2个拷贝数的大肠杆菌的SetA基因。

在本发明优选的实施方案中，通过转座载体系统将2个拷贝数的SetA基因转入到基因工程菌中。

在本发明优选的实施方案中，所述基因工程菌为大肠杆菌。

本发明另一方面提供了制备本发明所述基因工程菌的方法，包括将2个拷贝数的大肠杆菌的SetA基因转入基因工程菌中。

本发明另一方面提供了一种包含2个拷贝数的大肠杆菌SetA基因的质粒。

在本发明优选的实施方案中，所述质粒为Cargo-SetA质粒。

本发明另一方面提供了本发明所述的基因工程菌在生产2’-岩藻糖基乳糖中的应用。

本发明另一方面提供了一种发酵生产2’-岩藻糖基乳糖的方法，包括在适宜的条件培养本发明所述的基因工程菌。

在本发明优选的实施方案中，在培养基因工程菌的培养基中，乳糖的浓度为5-15g/L。

在本发明更加优选的实施方案中，乳糖的浓度为5-10 g/L。

在本发明进一步优选的实施方案中，乳糖的浓度为10 g/L。

在本发明优选的实施方案中，发酵培养基中无需额外添加金属离子及维生素，并且补料控制乳糖浓度低于12.5 g/L时，顿补乳糖至浓度为17.5 g/L。

本发明通过采用上述技术方案，获得了以下的有益效果：

1、本发明使用转座载体系统在大肠杆菌基因组中定向插入2个拷贝数的SetA基因，使其能够在基因组中稳定遗传，不受其他外源条件的调控；

2、本发明改造后的菌株无抗性，可作为安全菌株进行工业化生产；

3、在发酵培养条件优化后，与原始菌株相比，改造菌株中2’-FL的产量提高率为104%；

4、本发明的发酵培养基中，无需额外添加金属离子及维生素，并且补料控制乳糖浓度低于12.5 g/L时，顿补乳糖至浓度为17.5 g/L。减少了乳糖的浓度，在提高产量的同时一定程度上降低了成本，更有利于2’-FL的工业化生产。

附图说明

图1为大肠杆菌发酵过程中，生成2’-岩藻糖基乳糖（2’-FL）的示意图。

图2为转座载体系统中各质粒的图谱。

图3为SetA基因与Cargo载体的核酸凝胶电泳检测图。

A：SetA基因片段；

B：Cargo载体骨架。

图4为Cargo-SetA质粒测序结果比对图。

图5为菌落PCR验证包含Cargo-SetA质粒和靶点质粒B的阳性转化子的凝胶电泳检测图。

A：Cargo-SetA质粒验证；

B：靶点质粒B验证。

图6为菌落PCR验证包含Cargo-SetA质粒、靶点质粒B和转座酶质粒A的阳性转化子的凝胶电泳检测图。

A：Cargo-SetA质粒验证；

B：靶点质粒B验证；

C：转座酶质粒A验证。

图7为菌落PCR验证SetA基因有无插入原始菌株的凝胶电泳检测图。

图8为菌落PCR验证传代结束后菌株SetA基因有无插入的凝胶电泳检测图。

图9为消除质粒后改造菌株的培养验证图。

A：LB+Amp；

B：LB+Kan；

C：LB+Strp；

D：LB+Surcose。

图10为改造菌株的无抗培养验证图。

图11为原始菌株及改造菌株发酵罐培养中的产量图。

A：原始菌株；

B：改造菌株。

图12为原始菌株、改造菌株以及改造菌株经条件优化后发酵罐培养中的产量图。

A：原始菌株；

B：改造菌株；

C：经条件优化的改造菌株。

图13为发酵培养条件优化后，改造菌株的菌体生长、糖耗和产物生成图。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原始材料和试剂盒等均可通过购买获得。

实施例1：克隆大肠杆菌MG1655基因组的SetA基因，将该基因片段连接入转座载体系统的Cargo质粒中

1、构建转座载体系统

本发明的转座载体系统包括转座酶质粒A、靶点质粒B、Cargo质粒C和消除质粒D共四个质粒。

其中转座酶质粒A包含转座酶基因复合体；靶点质粒B包含待插入位点序列；Cargo质粒C包含待插入基因组的基因片段；消除质粒D可定向切割转座酶质粒A、靶点质粒B、Cargo质粒C三个质粒，从而达到消除质粒的目的。

根据序列信息分别生物合成各质粒片段，转化大肠杆菌感受态全式金生物的TranS5α细胞（目录号：CD201-01），在相应平板上长出单菌落后使用LB液体培养基培养过夜，使用TIANGEN质粒提取试剂盒（目录号：DP103）提取转座酶质粒A、靶点质粒B、Cargo质粒C和消除质粒D四种质粒，转座载体系统中各质粒的图谱如附图2所示。各质粒的具体序列分别如SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 4所示。

2、配置LB液体培养基，对唯地生物的大肠杆菌MG1655（目录号: DL2030）进行摇菌培养，使用TIANGEN基因组提取试剂盒（目录号：DP302）提取MG1655基因组，通过TAKARA公司primerSTAR-DNA聚合酶（目录号：R045A）扩增SetA基因的引物扩增该基因片段。

SetA引物序列分别为引物1和引物2，具体序列如SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示。

PCR扩增体系如表1所示。

表1 PCR扩增体系

引物F，R分别对应引物1，2。

PCR扩增条件如表2所示。

表2 PCR扩增条件

琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的目的条带，并使用TIANGEN胶回收试剂盒（目录号：DP209）对目的条带进行胶回收。琼脂糖凝胶电泳对目的条带的检测如附图3的A部分所示。

3、分别采用引物3和引物4，扩增Cargo质粒C骨架，引物3和引物4的具体序列如SEQID No. 7和SEQ ID No. 8所示。

PCR扩增体系和扩增条件如表1和表2所示。

引物F，R分别对应引物3，4。

琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的目的条带，并使用TIANGEN胶回收试剂盒（目录号：DP209）对目的条带进行胶回收。琼脂糖凝胶电泳对目的条带的检测如附图3的B部分所示。

4、使用诺唯赞同源重组试剂盒（目录号：C112）连接上述两个目的片段，转化全式金大肠杆菌感受态Trans10细胞（目录号：CD101），使用TIANGEN质粒提取试剂盒（目录号：DP103）提取质粒Cargo-SetA。

5、将提取的质粒送往擎科生物公司测序，测序结果如附图4所示，插入的SetA基因序列如SEQ ID No.9所示。结果显示，质粒Cargo-SetA中插入的基因与SetA基因序列匹配率达到100%，表明质粒Cargo-SetA构建完成。

实施例2：将转座载体系统中的Cargo-SetA质粒、转座酶质粒A及靶点质粒B共同转化入原始菌株

本实施例采用的原始菌株为菌株E. coil MG27。E .coli MG27记载于公开号为CN116732075 A、公开日为2023年9月12日的中国专利申请中。具体的构建方法如下：

以大肠杆菌MG1655△fliR::futC ,△fuck::fkp ,△lacI ,△wcaJ ,△lacZ ,△flgA::futC ,△flgG::futC为宿主菌，将N端融合蛋白标签硫氧还蛋白A(TrxA)的α-1 ,2-岩藻糖基转移酶FutC整合至yjip位点。

1、制备原始菌株的化学感受态细胞，将原始菌株使用LB培养基（10 g/L氯化钠、5g/L酵母粉、10 g/L蛋白胨）摇菌培养，待OD₆₀₀长至0.4-0.6时，收集菌体，使用0.08 M CaCl₂和0.02 M MgCl₂混合溶液清洗菌体2次，重悬后用于Cargo-SetA质粒与靶点质粒B热激转化，于LB固体（含100 μg/mL Amp、50 μg/mL Strp抗生素）平板中筛选，菌落PCR验证阳性转化子。

采用引物5和引物6，以及表1和表2所示的PCR扩增体系和扩增条件，对Cargo-SetA质粒进行验证，引物5和引物6的具体序列如SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 11所示。

引物F，R分别对应引物5，6。

采用引物7和引物8，以及表1和表2所示的PCR扩增体系和扩增条件，对靶点质粒B进行验证，引物7和引物8的具体序列如SEQ ID No. 12和SEQ ID No. 13所示。

引物F，R分别对应引物7，8。

菌落PCR阳性转化子的鉴定结果如附图5所示。

2、采用与上述相同的方法，将上述步骤获得的阳性转化子再次制备感受态细胞，从而转入转座酶质粒A，于LB平板（含50 μg/mL Kan、100 μg/mL Amp、50 μg/mL Strp抗性）中培养生长，菌落PCR鉴定阳性转化子。

采用引物9和引物10，以及表1和表2所示的PCR扩增体系和扩增条件，对Cargo-SetA质粒、转座酶质粒A及靶点质粒B进行验证，引物9和引物10的具体序列如SEQ ID No.14和SEQ ID No. 15所示。

引物F，R分别对应引物9，10。

菌落PCR阳性转化子的鉴定结果如附图6所示。

实施例3：添加IPTG诱导转座载体系统激活，将SetA基因插入原始菌株的基因组中

1、挑取3-5个阳性转化子混匀于100 μL无菌水中，涂布在含IPTG的LB平板（含50 μg/mL Kan、100 μg/mL Amp、50 μg/mL Strp抗性）中，待长出单菌落后使用验证引物11，12验证SetA有无插入，PCR扩增体系和扩增条件如表1和表2所示，引物11和引物12的具体序列如SEQ ID No. 16和SEQ ID No. 17所示。

引物F，R分别对应引物11，12。

PCR验证SetA基因插入情况如附图7所示。

2、对已经插入SetA基因的单菌落进行传代培养，将附图7中阳性转化子于LB固体平板（含50 μg/mL Kan、100 μg/mL Amp、50 μg/mL Strp抗性及0.5 mM IPTG）中划线培养，待长出单菌落后再次划线于新的平板中，重复该步骤5次，每次长出单菌落为新的一代。

3、传代至第六代后使用验证引物11及引物12再次PCR检测SetA的插入情况，确保SetA无丢失，琼脂糖凝胶电泳结果如附图8所示。

实施例4：转化消除质粒D于改造菌株中，消除转座载体系统的Cargo质粒C、转座酶质粒A及靶点质粒B，得到最终改造菌株

1、实施例3中得到的菌株含转座载体系统中的3个质粒（Cargo质粒C、转座酶质粒A及靶点质粒B），带有3种抗性基因，需转入消除质粒D以剪切消除上述3个质粒，从而得到无抗安全菌株。

2、将实施例3中得到的SetA基因插入菌株于LB液体培养基（无抗）中30℃摇菌培养，待OD₆₀₀至0.4-0.6时，于冰上预冷，收集菌体后用10%甘油重悬清洗菌体，加入消除质粒D，于2.5 KV，200 Ω，25 μF下电转感受态，加入LB液体培养基于30℃复苏培养2 hr，收集菌体，将菌体重悬于含10 mM 鼠李糖的LB液体培养基中，于37℃复苏3 hr。

3、复苏后的菌液取100 μL涂布于无抗的LB平板中待其长出单菌落。

4、将单菌落分别划线于含50 μg/mL Kan、100 μg/mL Amp、50 μg/mL Strp或10 g/L 蔗糖的四种筛选标记的平板中，鼠李糖诱导消除质粒D合成锚定转座载体系统中3个质粒的片段，Cas蛋白对这三个质粒进行切割使其丢失，消除质粒D由于其松弛型复制子的原因随着培养过程丢失，因此只有在蔗糖平板上生长的菌株才为消除了转座载体系统3个质粒的菌株。

改造菌株消除质粒的验证如附图9所示。

5、将步骤3中的菌株使用无抗LB液体培养基摇菌过夜后，稀释涂板于无抗LB平板中，后单菌落分别划线LB无抗平板及含50 μg/mL Apra（安普霉素）的抗性平板，只在无抗平板上生长的菌株才为最终的改造菌株，改造菌株相较于原始菌株插入了SetA基因。

改造菌株的无抗验证如附图10所示。

实施例5：对改造菌株提取基因组，检测SetA基因的拷贝数，确定转座载体系统插入的SetA基因数目

1、使用天根基因组提取试剂盒（目录号：DP302-02）提取原始菌株和改造菌株的基因组，使用定量PCR引物检测SetA基因的拷贝数。

SetA基因定量PCR检测引物分别为引物13和引物14，具体序列如SEQ ID No. 18和SEQ ID No. 19所示。

定量PCR扩增体系如表1所示，扩增条件如表3所示。

表3 定量PCR扩增条件

引物F，R分别对应引物13，14。

2、使用内参基因RsmA作为对照基因，分别检测原始菌株和改造菌株中两个基因的Ct值，-△△Ct代表Ct值的差值，代表定量PCR循环数的差值，2^-△△T代表相较于原始菌株，改造菌株中SetA基因的插入数目。

RsmA定量PCR检测引物分别为引物15和引物16，具体序列如SEQ ID No. 20和SEQID No.21所示。

定量PCR扩增体系如表1所示，扩增条件如表3所示。

引物F，R分别对应引物15，16。

定量PCR检测SetA基因拷贝数如表4所示。

表4 定量PCR检测SetA基因拷贝数

结果显示，改造菌株中成功插入2个拷贝的SetA基因。

实施例6：对改造菌株及原始菌株进行摇瓶发酵培养，检测2’-FL的产量

1、针对原始菌株与改造菌株进行摇瓶发酵，摇瓶发酵培养基组分包括：30 g/L葡萄糖、15 g/L乳糖、12 g/L酵母浸粉、18 g/L酵母蛋白胨、3.2 g/L (NH₄)₂SO₄、5.73 g/LK₂HPO₄·3H₂O、2 g/L MgSO₄·7H₂O、1.8 g/L一水合柠檬酸，检测摇瓶发酵后2’-FL的产量，具体如表5所示。

表5 摇瓶发酵产量测定

2、根据计算，改造菌株相较于原始菌株的摇瓶产量提高了40.2%。

实施例7：调整发酵培养基中的乳糖浓度，确定最适的乳糖浓度范围

1、调整培养基中乳糖浓度，设置浓度梯度分别为5 g/L、10 g/L和15 g/L，使用原始菌株及改造菌株，将原始乳糖浓度15 g/L作为对比，摇瓶发酵。

2、根据产量检测结果，乳糖最适浓度为5-10 g/L。当乳糖浓度为5 g/L时，摇瓶产量提高72.94%，改造菌株产量与发酵培养基中乳糖含量有关。

发酵培养基中乳糖浓度调整后，各菌株2’-FL发酵产量如表6所示。

表6 发酵培养基中乳糖浓度调整

实施例8：对改造菌株及原始菌株于10 L发酵罐培养，检测最终2’-FL的产量

1、将改造菌株及原始菌株于相同条件下进行分批补料发酵。

发酵培养基组分包括：葡萄糖30 g/L、乳糖15 g/L、酵母浸粉5 g/L、磷酸二氢钾13.5 g/L、磷酸氢二铵4 g/L、柠檬酸1.8 g/L、七水硫酸镁2 g/L、VB1 4.5 mL/L、100×金属离子10 mL/L。其中100×金属离子：七水硫酸亚铁10 g/L、七水硫酸锌2.2 g/L、五水硫酸铜1.0 g/L、四硼酸钠0.02 g/L、二水钼酸钠0.1 g/L、一水硫酸锰0.38 g/L、氯化钙2 g/L。

补料培养基组分包含：葡萄糖800 g/L、乳糖300 g/L。

发酵条件为：接种量5%，培养温度30℃，pH 6.0，溶氧30%-40%。

补料控制：初始葡萄糖降为10 g/L，开始流加补料，葡萄糖控制10 g/L，乳糖低于10 g/L，顿补补料至17.5 g/L。

2、分别取样检测原始菌株和改造菌株发酵液中2’-FL的产量，如附图11所示，最终下罐产量改造菌株相较于原始菌株提高76.5%。

3、根据摇瓶检测结果优化发酵培养基及条件，确定最佳发酵培养基组分为：葡萄糖30 g/L、乳糖20 g/L、酵母浸粉12 g/L、胰蛋白胨18 g/L、硫酸铵3.2 g/L、磷酸二氢钾5.73 g/L、柠檬酸 1.8 g/L、七水硫酸镁2 g/L；补料培养基包括：葡萄糖800 g/L、乳糖300g/L；发酵条件为：接种量5%，培养温度30℃，pH 6.0，溶氧30%-40%；补料条件控制：初始葡萄糖降为10 g/L，流加补料，葡萄糖控制10 g/L，乳糖低于12.5 g/L，顿补补料至17.5 g/L；取样检测优化条件后改造菌株发酵液中2’-FL的产量及生长情况，如附图12所示。

根据产量检测结果，改造菌株2’-FL最终产量达86.8 g/L，相较于原始菌株提高率达104%。

发酵培养条件优化后，改造菌株的菌体生长、糖耗和产物生成情况如附图13所示。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种生产2’-岩藻糖基乳糖的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌中具有2个拷贝数的大肠杆菌的SetA基因，通过转座载体系统将2个拷贝数的SetA基因转入到基因工程菌中，所述基因工程菌的原始菌株为菌株E. coli MG27，所述SetA基因的序列如SEQ IDNo.9所示。

2.制备权利要求1所述基因工程菌的方法，包括通过转座载体系统将2个拷贝数的大肠杆菌的SetA基因转入基因工程菌中。

3.权利要求1所述的基因工程菌在发酵生产2’-岩藻糖基乳糖中的应用，其特征在于：其中发酵培养基中无需额外添加金属离子及维生素，并且补料控制乳糖浓度低于12.5 g/L时，顿补乳糖至浓度为17.5 g/L。

4.一种发酵生产2’-岩藻糖基乳糖的方法，包括在适宜的条件培养权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于：其中发酵培养基中无需额外添加金属离子及维生素，并且补料控制乳糖浓度低于12.5 g/L时，顿补乳糖至浓度为17.5 g/L。