TWI790378B

TWI790378B - 生產５’-黃核苷單磷酸的棒狀桿菌屬微生物及使用該微生物製備５’-黃核苷單磷酸的方法

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Publication number: TWI790378B
Application number: TW108116733A
Authority: TW
Inventors: 白珉知; 李智惠; 林寶藍; 尹炳勳; 李姃恩; 任繡彬; 鄭宰鎬
Original assignee: 南韓商Ｃｊ第一製糖股份有限公司
Priority date: 2018-06-07
Filing date: 2019-05-15
Publication date: 2023-01-21
Also published as: JP6938633B2; US11332708B2; CN112210522B; AU2018386357B2; SG10202103819XA; TW202012429A; CN112210522A; BR112019016482B1; RU2720520C1; US20210040441A1; MX2019009214A; US20200263126A1; BR112019016482A2; EP3597756B1; PL3597756T3; PT3597756T; CN109913397A; SG11201904426XA; WO2019235680A1; AU2018386357A1

Abstract

本發明係有關生產5’-黃核苷單磷酸的棒狀桿菌屬微生物和使用該微生物生產5’-黃核苷單磷酸之方法。

Description

生產5’-黃核苷單磷酸的棒狀桿菌屬微生物及使用該微生物製備5’-黃核苷單磷酸的方法

本發明係有關生產5’-黃核苷單磷酸之微生物和使用該微生物生產5’-黃核苷單磷酸的方法。

5’-黃核苷單磷酸(XMP)不僅在動物和植物中作為核酸生物合成和代謝系統的中間體而具有生理學意義，而且還用於各種目的：食品、藥物和各種醫學用途。特別地，當與麩胺酸鈉(MSG)一起使用時，在增強風味方面有協同效應。因此，XMP係作為引起關注的調味品之核酸系風味增強劑之一。

此外，5’-黃核苷單磷酸是嘌呤核苷酸生物合成代謝中的中間體，並且係用於生產5’-鳥苷單磷酸(GMP)的重要原料。製備具有高商業價值並且影響味覺強度增加的鳥苷單磷酸的周知方法是微生物的發酵，其參與生產5’-黃核苷單磷酸並將其酶促轉形為5’-鳥苷單磷酸。由於這方法是最經濟的，只需要與5’-鳥苷單磷酸等量的5’-黃核苷單磷酸。

至於製備5’-黃核苷單磷酸的方法，已知(1)化學合成、(2)將製備之5’-黃核苷單磷酸進行脫胺基化、(3)在培養基中添加黃嘌呤作為前驅物進行發酵生產、(4)生產5’-黃核苷單磷酸之微生物的突變菌株的直接發酵等。在各種方法中，藉由突變微生物菌株而直接發酵5’-黃核苷單磷酸在經濟方便係最具優勢。然而，仍然需要研究以高產率生產5’-黃核苷單磷酸的方法。

本案發明人進行了廣泛的努力以開發能夠生產高產率的5’-黃核苷單磷酸的微生物，結果，發現當特定蛋白質的活性增強時，5’-黃核苷單磷酸的產量增加，從而完成了本發明。

本發明的一個目的是提供生產5’-黃核苷單磷酸的棒狀桿菌屬(Corynebacterium)微生物，其中增強了包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列的蛋白質的活性。

本發明的另一個目的是提供使用該微生物生產5’-黃核苷單磷酸的方法。

本發明的棒狀桿菌屬微生物對輸出5’-黃核苷單磷酸的蛋白質具有增強活性，從而增加了5’-黃核苷單磷酸的生產，這可以顯著地有助於減少生產5’-黃核苷單磷酸的成本。

[最佳模式]

在後文中，更詳細地描述了本發明。同時，本發明中揭示的每個描述和例示性具體例可以應用於其他描述和例示性具體例。亦即，本發明中揭露的各種元件的所有組合皆落入本發明的範疇內。另外，本發明的範疇不應被解釋為受以下具體敘述的限制。

作為實現上述目的的一個態樣，本發明提供了生產5’-黃核苷單磷酸的棒狀桿菌屬微生物，其中增強了包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列的蛋白質的活性。

如本文所用，術語“5’-黃核苷單磷酸”是指名為5’-黃嘌呤酸、黃核苷等的化合物。在本發明中，5’-黃核苷單磷酸與“XMP”可以互換地使用。

如本文所用，術語“包括SEQ ID NO：2的胺基酸序列的蛋白質”是指內源性存在於棒狀桿菌屬微生物中的蛋白質，其係由輸出來自微生物的5’-黃核苷單磷酸的主要促進子超家族轉運蛋白質(MFS轉運蛋白質)基因所編碼。具體地，該蛋白質可以是內源性存在於棒狀桿菌屬微生物中的包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列的MFS轉運蛋白質。再者，蛋白質可以是由SEQ ID NO：2的胺基酸序列或由包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列所構成的蛋白質，但不限於此。本發明內容中的MFS轉運蛋白質可以稱為“xmpE”或“xmpE蛋白質”。

如本文所用，“包括特定SEQ ID NO的胺基酸序列的蛋白質”只要具有與包含相同SEQ ID NO的蛋白質相同或相應的活性者，可包含在胺基酸序列末端前添加不改變蛋白質功能之序列；自然發生的突變；或其沉默突變。具有此添加或突變序列的蛋白質的情況，顯然也包括在本發明的範疇內。

此外，本發明的蛋白質可包括SEQ ID NO：2的胺基酸序列，但也包括與SEQ ID NO：2具有至少60%同源性或同一性的蛋白質。包括與SEQ ID NO：2具有至少60%的同源性或同一性之胺基酸序列的蛋白質與可為包含SEQ ID NO：2具有至少60%，具體為70%，更具體為80%，甚至更具體為83%，84%，85%，88%，90%，93%，95%或97%的同源性或同一性之胺基酸序列的蛋白質。具有同源性或同一性的胺基酸序列可排除與該範圍具有100%同一性或具有小於100%的同一性的胺基酸序列。顯然，只要具有序列同源性或同一性的序列之胺基酸序列實質上具有與SEQ ID NO：2相同或相應的生物學活性，即使部分序列具有胺基酸序列的刪除、修飾、取代或添加，還是被包括在本發明的範疇內。

另外，編碼包括SEQ ID NO：2的胺基酸序列的蛋白質的基因的核苷酸序列可以從已知的數據庫如NCBI GenBank獲得，但不限於此。具體地，包括SEQ ID NO：2的胺基酸序列的蛋白質可以由包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的基因以及由SEQ ID NO：1的核苷酸序列組成或構成的基因編碼，但不限於此。

再者，SEQ ID NO：1的核苷酸序列不僅可以包括SEQ ID NO：1本身的核苷酸序列，還可以包括與SEQ ID NO：1具有至少80%同源性或同一性的核苷酸序列。

具體地，能夠編碼與SEQ ID NO：2具有至少80%同源性或同一性的胺基酸序列的任何核苷酸序列都包括在本發明的範疇內，但該蛋白質可以由包括與SEQ ID NO：1具有至少80%，特別是83%，84%，85%，88%，90%，93%，95%或97%的同源性或同一性的核苷酸序列的基因編碼。但是，顯然核苷酸序列是包括在本發明的範疇內而沒有限制，只要其係編碼具有與包括SEQ ID NO：2的胺基酸序列的蛋白質的活性相對應的活性的蛋白質即可。

另外，顯然由於遺傳密碼簡併性，可以轉譯成包含相同胺基酸序列的蛋白質或與其具有同源性或同一性的蛋白質的多核苷酸可以包括在本發明的範疇內。此外，可以包含從已知基因序列(例如，編碼具有包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列的蛋白質活性的蛋白質的任何序列)藉由使全部或部分核苷酸序列與其互補序列在嚴格條件下雜交而製備之探針，並無限制。“嚴格條件”是指能夠在多核苷酸之間進行特異性雜交的條件。在參考文獻中詳細描述了這些條件(J.Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989)；例如，其中具有至少40%，具體為85%，具體為90%，更具體為95%，更具體為97%，特別具體為99%的高同源性或同一性的基因雜交而彼等具有較低同源性或同一性的基因則無雜交之條件；或傳統南方雜交法的條件，亦即，在相當於60℃，1×SSC， 0.1%SDS，特別是60℃，0.1×SSC，0.1%SDS，更具體地68℃，0.1×SSC，0.1%SDS的溫度和鹽濃度下清洗一次，特別是洗滌兩次至三次。雖然雜交可能取決於嚴格程度而允許鹼基之間的錯配，惟需要兩個核酸彼此具有互補序列。如本文所用，術語“互補”用於描述能夠彼此雜交的核苷酸鹼基之間的關係。關於DNA，例如，腺嘌呤與胸腺嘧啶互補，胞嘧啶與鳥嘌呤互補。因此，本發明不僅可以包括與實質相似的核酸序列互補之單離的核酸片段，還可以包含整個序列。

具體地，可以使用雜交條件檢測具有同源性或同一性的多核苷酸，該雜交條件包括T_m值為55℃的雜交步驟和上述條件。再者，T_m值可以是60℃、63℃或65℃，但不限於此，並且可以由發明所屬領域的技術人員適當地調節。

多核苷酸雜交的適當的嚴格程度取決於多核苷酸的長度和互補性的程度，並且變數在相應的技術領域中是公知的(參見Sambrook et al.，同上，9.50-9.51,11.7-11.8)。

如本文所用，術語“同源性”是指兩個給定胺基酸序列或核苷酸序列之間的同一性程度，並且可用百分比表示。在本說明書中，與給定的胺基酸序列或多核苷酸序列具有相同或相似活性的同源序列可以用“%同源性”表示。

如本文所用，術語“同一性”是指胺基酸或核苷酸序列之間的序列相關程度，並且在一些情況下，它可以藉由這些序列串之間的匹配而確定。

術語“同源性”和“同一性”通常可彼此互換地使用。

保守多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可以藉由標準比對演算法而確定，並與由所使用的程式建立的默認空位罰分一起使用。實質上，通常預期同源或相同的多核苷酸或多肽在中度或高度嚴格性下，沿著所有或目標多核苷酸或多肽的全長的至少約50%、60%、70%、80%或90%雜交。還考慮了在雜交多肽中含有簡併密碼子替代密碼子的多核苷酸。

任何兩個多核苷酸或多肽序列是否具有例如，至少50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%或99%之同源性或同一性，可以使用已知的電腦演算法，例如使用默認參數之“FASTA”程式(例如，Pearson et al.,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444)而確定。或者，可以使用Needleman-Wunsch演算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48：443-453)而確定，該演算法在EMBOSS套組的Needleman程式中執行(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000,Trends Genet.16：276-277)(較佳為5.0.0版本或更高)。(包含GCG程式套組(Devereux,J.,et al.,Nucleic Acids Research 12：387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,[S.][F.,][ET AL.,J MOLEC BIOL 215]：403(1990)；Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop,[ED.,]Academic Press,San Diego,1994,and[CARILLO ETA/.](1988)SIAM J Applied Math 48：1073)。例如，可以使用美國國家生物技術資訊中心(NCBI)的BLAST或ClustalW來確定同源性或同一性。

多核苷酸或多肽的同源性或同一性可藉由比較公佈的序列訊息(例如，Smith and Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2：482)而確定，例如，使用Needleman et al.,(1970),J Mol Biol.48：443中揭露的GAP電腦程式。總之，GAP程式將同源性或同一性定義為藉由將相似比對的符號(即，核苷酸或氨基酸)的數量除以兩個序列中較短者的符號的總數而獲得的值。GAP程式的默認參數可以包括(1)一元比較矩陣(對於同一性之值為1，對於非同一性為0)和Gribskov et al.(1986),Nucl.Acids Res.14：6745之加權比較矩陣，如Schwartz and Dayhoff eds,Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358,1979所揭露者；(2)每個缺口罰分為3.0和每個缺口中之每個符號額外罰分為0.10(或缺口開放罰分為10，缺口延伸罰分為0.5)；(3)對末端缺口不予處分。因此，如本文所用，術語“同源性”或“同一性”是指多肽或多核苷酸之間的相關性。

在本發明中生產5’-黃核苷單磷酸的棒狀桿菌屬微生物對包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列的蛋白質可以具有增強活性。

包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列的蛋白質活性的增強與xmpE的活性或由包括SEQ ID NO：1的核苷酸序列的基因編碼的蛋白質的活性的增強可互換地使用。

如本文所用，術語“包括SEQ ID NO：2的胺基酸序列的蛋白質的增強活性”是指蛋白質與其親代菌株相比為增強的表現或包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列的蛋白質與未修飾的菌株相比為增強的表現；有相同表現而增強其活性；或其增強活性和表現。該術語還指蛋白質與其內源活性相比為增強的活性，以及xmpE與親代菌株或其未修飾菌株相比為增強的表現或活性。

在本發明中，可以藉由應用發明所屬技術領域中已知的各種方法而達成蛋白質活性的增強。例如，可以藉由增加編碼蛋白質的多核苷酸的拷貝數、增強啟動子活性、起始密碼子的取代或其組合而達成活性的增強；具體地，1)增加編碼蛋白質的多核苷酸的拷貝數；2)修飾表現調節因子(啟動子、操縱子等)的序列，以增加多核苷酸的表現；3)修飾染色體上的基因序列(起始密碼子等)，以增強蛋白質活性、或其組合，但不限於此。

具體地，關於蛋白質活性的增強，可以藉由應用發明所屬技術領域中已知的各種方法而實現修飾表現調節子序列的方法。例如，可以藉由在調節序列中以刪除、插入或非保守或保守取代或其組合誘導修飾；或者用具有更為增強的活性的核苷酸序列取代核苷酸序列，而進行修飾以增強表現調節序列的活性。表現調節子包括啟動子、增強子、操縱子、核醣體結合位點和調節轉錄和轉譯終止的序列，但不限於此。

另外，可以藉由在序列中以刪除、插入或非保守或保守取代或其組合誘導修飾；或者以具有更為增強活性的經修飾的基因序列取代基因序列，而修飾基因序列的方法以增強蛋白質活性，但不限於此。

在一個特定例示性具體中，可以藉由增加xmpE的拷貝數；用另一種具有增強活性的啟動子取代xmpE的啟動子；取代xmpE的起始密碼子；或其組合而實現蛋白質活性的增強。

如本文所用，術語“載體”是指DNA構建體，其包括編碼目標蛋白質的多核苷酸的核苷酸序列，該目標蛋白質可操作地連接至適當的調節序列以在適當的宿主中表現目標蛋白質。調節序列可包括可啟動轉錄之啟動子、控制轉錄的任何操縱基因序列、編碼適當mRNA核醣體結合位點的序列以及控制轉錄和轉譯終止的序列。載體可以轉染入合適的宿主，然後可以獨立於宿主基因組而進行複製或作用，並且可以整合入基因組本身。

如本文所用，術語“轉形”是指將包含編碼目標蛋白質的多核苷酸的載體導入宿主細胞中，使得由該多核苷酸編碼的蛋白質可在宿主細胞中表現。只要可以在宿主細胞中表現，轉形的多核苷酸可以整合入宿主細胞的染色體中並置於宿主細胞的染色體中或者位於染色體外。此外，多核苷酸包括編碼目標蛋白質的DNA和RNA。多核苷酸可以以任何形式導入，只要它可以被導入宿主細胞並在其中表現即可。例如，多核苷酸可以以表現盒的形式導入宿主細胞，該表現盒是包含其自主表現所需的所有元件的多核苷酸構建體。表現盒可包括與基因可操作地連接的啟動子、轉錄終止訊號、核醣體結合位點和轉譯終止訊號。表現盒可以是可自我複制的表現載體的形式。另外，多核苷酸可以原樣導入宿主細胞中，並且可操作地連接到宿主細胞中表現所需的序列。

如本文所用，術語“生產5’-黃核苷單磷酸的微生物”或“具有生產5’-黃核苷單磷酸的能力的微生物”是指天然具有生產5’-黃核苷單磷酸的能力的微生物或其中生產5’-黃核苷單磷酸的能力被賦予不具有生產5’-黃核苷單磷酸能力的親代菌株的微生物。具體地，該微生物可為具有生產5’-黃核苷單磷酸的能力的微生物，其中增強了包含SEQ ID NO：2或xmpE蛋白質的胺基酸序列的蛋白質的活性。

再者，考慮到本發明的目的，由於5’-黃核苷單磷酸輸出能力的增強，可以改善/增強微生物生產5’-黃核苷單磷酸的能力。

具體地，術語“生產能力”和“輸出能力”可互換地使用。再者，微生物與“輸出5’-黃核苷單磷酸的微生物”或“具有5’-黃核苷單磷酸輸出能力的微生物”可互換地使用。它可以指天然具有5’-黃核苷單磷酸輸出能力的微生物或其中賦予不具有5’-黃核苷單磷酸輸出能力的親代菌株5’-黃核苷單磷酸輸出能力的微生物。

具體地，生產5’-黃核苷單磷酸的棒狀桿菌屬微生物可為停滯棒狀桿菌(Corynebacterium stationis)或麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)或產胺棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)；更具體地，可以是停滯棒狀桿菌，但不限於此。

至於另一態樣，本發明提供了一種生產5’-黃核苷單磷酸的方法，包括在培養基中培養棒狀桿菌屬微生物；以及從微生物或培養基回收5’-黃核苷單磷酸。

根據本發明的微生物和5’-黃核苷單磷酸係與前述相同。

本發明中的棒狀桿菌屬微生物可以是停滯棒狀桿菌屬，但不限於此。

關於本發明的方法，可以使用發明所屬技術領域中已知的任何培養條件和方法培養棒狀桿菌屬微生物。

如本文所用，術語“培養物”是指在中度人工控制的環境條件下培養微生物。本發明的培養過程可以根據發明所屬技術領域中已知的合適培養基和培養條件進行。再者，培養方法包括批次培養、連續培養和補料批次培養；具體地，可以連續培養批次程序或補料批次或重複補料批次程序，但培養方法不限於此。

用於培養的基質應以適當的方式滿足特定菌株的要求。用於棒狀桿菌屬微生物的培養基是發明所屬領域中已知的(例如，Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology,Washington D.C.,USA,1981)。

具體地，可用於培養基的糖源包括醣類和碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、澱粉、纖維素等；油脂，如大豆油、葵花籽油、蓖麻油、椰子油等；脂肪酸，如棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸等；甘油；醇類，如乙醇；以及有機酸，如乙酸。這些物質可以單獨使用或作為混合物使用，但不限於此。

可以使用的碳源可以是粗蔗糖或葡萄糖，或含有大量蔗糖的糖蜜；具體地，可以是純化葡萄糖，但不限於此。可以使用其他各種碳源。

可以使用的氮源包括蛋白質腖、酵母提取物、牛肉提取物、麥芽提取物、玉米漿、大豆粉和尿素或無機化合物，例如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨。氮源也可以單獨使用或作為混合物使用，但不限於此。

可以使用的磷酸鹽源包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀或相應的含鈉鹽。

再者，培養基可以含有金屬鹽，例如硫酸鎂或硫酸鐵。除了上述材料之外，還可以使用必需的生長物質，如胺基酸和維生素。適當的前驅物也可用於培養基。上述原料可以適當的方式批次或連續地添加到保溫箱中。

培養基的pH可以藉由使用鹼性化合物如氫氧化鈉、氫氧化鉀和胺；或者以適當的方式使用酸性化合物(如磷酸和硫酸)而調節。另外，藉由使用消泡劑如脂肪酸聚乙二醇酯，而可以抑制泡沫形成。可以將氧氣或含氧氣體(例如，空氣)注入培養基中以維持好氧條件。

具體地，培養溫度通常為30℃至37℃，更具體為32℃至33℃。培養可以持續，直至獲得所需量的5’-黃核苷單磷酸，但具體可以進行40小時至120小時。

從培養物中分離5’-黃核苷單磷酸可以藉由發明所屬領域中已知的傳統方法進行；例如，離心、過濾、離子交換層析術、結晶等。例如，可以低速離心培養物以除去生物質，然後，可以藉由離子交換層析而分離所得上清液。然而，分離不限於此。

回收步驟還可以包括純化過程。

[發明的模式]

在後文中，將參考以下例示性實施例更詳細地描述本發明。然而，這些實施例僅用於闡釋目的，並且本發明不受限於這些實施例。

實施例1：5’-黃核苷單磷酸(XMP)輸出蛋白質的發現

為了辨識參與XMP輸出的棒狀桿菌的膜蛋白質，製備了停滯棒狀桿菌(ATCC6872)基因組DNA庫。根據其中提供的實驗方案，使用Intron的G-spin Total DNA Extraction Minin Kit(目錄型號17045)提取ATCC6872 菌株(即，野生型停滯棒狀桿菌)的基因組DNA。使用提取的基因組DNA作為模板而製備膜蛋白質庫。

為了研究哪種蛋白質具有輸出功能，將製備的基因組DNA庫導入用作KR專利第10-2011-0105662號中的親代菌株的棒狀桿菌KCCM-10530菌株中。

然後將XMP另外加入含有1.7%瓊脂的基礎培養基中以建立篩選條件，其中KCCM-10530菌株顯示生長抑制。藉由用ATCC6872菌株的膜蛋白質的基因組庫質粒電穿孔而轉形KCCM-10530菌株，並選擇通常係在培養基中加入過量XMP的條件中生長的菌落。從選擇的菌落中獲得質粒，並藉由核苷酸序列分析方法分析其核苷酸序列。在上述實驗中辨識了一種膜蛋白質，其參與在加入過量XMP的條件下去除生長抑制。

業經證實棒狀桿菌膜蛋白質具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列和SEQ ID NO：2的胺基酸序列(NCBI GenBank：NZ_CP014279.1，WP_066795121，MFS轉運蛋白質)。膜蛋白質被稱為MFS轉運蛋白質，但其功能尚未明確辨識。此外，仍不知具有輸出XMP的功能。在本發明中，膜蛋白質被命名為“xmpE”。

實施例2：xmpE的辨識

實施例2-1：xmpE缺陷型載體的製備

製備缺陷載體以確認當從生產XMP的菌株中刪除由於實施例1中辨識的XMP而參與去除生長抑制的蛋白質xmpE時，XMP輸出能力是否降低。

用於載體製備的基因片段係使用ATCC6872菌株的基因組DNA作為親代菌株，而藉由PCR獲得。具體地，PCR係使用SEQ ID NO：3和4的引子對xmpE而進行。使用的引子係基於在美國國立衛生研究院(NIH)GenBank中登記的停滯棒狀桿菌(ATCC6872)基因(NCBI Genbank：NZ_CP014279.1)及其周圍的核苷酸序列的訊息而製備。

PCR係在以下條件下進行：在94℃變性5分鐘；進行25個循環：在94℃變性30秒，在52℃黏合30秒，以及72℃聚合1分鐘。然後在72℃下進行最終聚合5分鐘。xmpE基因片段係使用SEQ ID NO：3和4的引子擴增，獲得約1.0kbp的多核苷酸模板。所得TOPO-△xmpE載體係使用T載體(Solgent)選殖而獲得的基因片段。

實施例2-2：xmpE缺陷菌株的製備

用實施例2-1中製備的載體(使用根據Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52：541-545的轉形方法)電穿孔而轉形KCCM-10530菌株，並從含有25mg/L卡那黴素的培養基選擇由於同源序列重組而具有載體插至染色體的菌株。將選擇的xmpE缺陷菌株命名為“KCCM-10530_△xmpE”，並評估其生產XMP的能力。

將親代菌株停滯棒狀桿菌KCCM-10530和菌株KCCM-10530_△xmpE接種入包含如下3mL之種菌培養基的14mL管中，並在30℃以170rpm振盪培養24小時。然後，在相應的250mL三角燒瓶中，將種菌培養物以0.7mL至32mL的量加至如下之生產培養基(24mL主培養基+8mL另外的無菌培養基)中，然後在30℃培養和在170rpm振動72 小時。進行HPLC分析以測量培養完成後所生產的XMP的量。培養基的構成和培養基中XMP濃度的結果如下表1所示。

XMP基礎培養基

葡萄糖2%、硫酸鈉0.3%、磷酸二氫鉀0.1%、磷酸氫二鉀0.3%、硫酸鎂0.3%、氯化鈣10mg/L、硫酸鐵10mg/L、硫酸鋅1mg/L、氯化錳3.6mg/L、L-半胱胺酸20mg/L，泛酸鈣10mg/L、鹽酸硫胺素5mg/L、生物素30μg/L、腺嘌呤20mg/L、鳥嘌呤20mg/L、pH 7.3

XMP營養培養基

蛋白質腖1%、牛肉提取物0.5%、氯化鈉0.25%、酵母提取物1%、尿素0.3%、腺嘌呤50mg/L、鳥嘌呤50mg/L、瓊脂2%、pH 7.2

XMP燒瓶種菌培養基

葡萄糖20g/L、蛋白質腖10g/L、酵母提取物10g/L、氯化鈉2.5g/L、尿素3g/L、腺嘌呤150mg/L、鳥嘌呤150mg/L、pH 7.0

XMP燒瓶生產培養基(主培養基)

葡萄糖50g/L、硫酸鎂10g/L、氯化鈣100mg/L、硫酸鐵20mg/L、硫酸錳10mg/L、硫酸鋅10mg/L、硫酸銅0.8mg/L、組胺酸20mg/L、半胱胺酸15mg/L、β-丙胺酸15mg/L、生物素100μg/L、硫胺素5mg/L、腺嘌呤50mg/L、鳥嘌呤25mg/L、菸酸5mg/L、pH 7.0

XMP燒瓶生產培養基(另外的無菌培養基)

磷酸二氫鉀18g/L、磷酸氫二鉀42g/L、尿素7g/L、硫酸銨5g/L

比較親代菌株KCCM-10530和xmpE缺陷菌株KCCM-10530-△xmpE的培養基中的XMP濃度；結果，如上表1所示，在相同條件下，與親代菌株相比，KCCM-10530-△xmpE菌株的XMP濃度降低至少約10g/L。

因此，證實了xmpE是參與XMP輸出的蛋白質。

實施例3：增強xmpE蛋白質活性

根據如下實施例，增強了菌株中xmpE蛋白質的活性，並檢驗了具有增強的xmpE活性的菌株是否增加了生產/輸出XMP的能力。

實施例3-1：增加xmpE的拷貝數

實施例3-1-1：製備用於增加xmpE拷貝數的載體

為了確認當預測參與XMP輸出能力的xmpE的活性增強時XMP輸出能力是否增加，製備了用於增強xmpE基因的載體。使用增加拷貝數的方法作為增強方法，進行以下實驗。

用於製備載體的基因片段係通過使用ATCC6872菌株的基因組DNA作為模板之PCR而獲得。具體地，使用SEQ ID NO：5和6的引子對擴增xmpE基因，以使包含xmpE基因的上游484bp。用限制酶XbaI和SpeI處理擴增的xmpE基因片段。在pDZ載體(KR專利第10- 0924065號和國際公開案第2008-033001號)的XbaI位點進行選殖以製備pDZ-xmpE載體。然後使用SEQ ID NO：6和7的引子對對xmpE基因進行PCR，以製備含有兩個拷貝的載體。用DNA限制酶SpeI切割如此獲得的每個DNA片段，並選殖到用DNA限制酶XbaI切割的pDZ-xmpE載體中以製備載體。將含有兩個拷貝的xmpE基因的載體命名為“PDZ-xmpEX2”。

實施例3-1-2：評估具有增加的xmpE拷貝數的菌株的生產XMP的能力

用實施例3-1-1中製備的pDZ-xmpEX2載體電穿孔而轉形KCCM-10530菌株(使用根據Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52：541-545的轉形方法)，並且從含有25mg/L卡那黴素的培養基選擇具有由於同源序列重組而插至染色體上的載體的菌株。其中目標基因的菌株係藉由所選擇的原菌株的二次互換而選擇。最終轉形菌株的基因的成功插入係以使用SEQ ID NO：8和9的引子對的PCR證實。將所選具有增加拷貝數的xmpE的菌株命名為“KCCM-10530-xmpEX2”，並評估了其生產XMP的能力。

為了測量菌株生產XMP的能力，使用與實施例2-2中相同的方法。進行HPLC分析以測量培養完成後所生產的XMP的量，且結果如下表2所示。

比較親代菌株停滯棒狀桿菌菌株KCCM-10530和具有增加的xmpE拷貝數的KCCM-10530-xmpEX2菌株的培養基中的XMP濃度；結果，如上表2所示，KCCM-10530-xmpEX2菌株的XMP濃度為1.3g/L，表示在相同條件下與親代菌株相比，濃度增加約11%。

此可理解為非常有意義的結果，通過該結果證實生產的XMP量的增加是由於增強的xmpE蛋白質活性。

實施例3-2：通過取代啟動子增強xmpE表現

實施例3-2-1：製備用於替換xmpE啟動子的載體

為了確認當預測參與XMP輸出能力的xmpE的活性增強時XMP輸出能力是否增加，製備了載體(其中xmpE基因的啟動子係經具有強烈表現的啟動子取代)。用於製備載體的基因片段係以使用ATCC6872菌株的基因組DNA作為模板之PCR而獲得。

使用在KR專利第10-0620092號中報導為在停滯棒狀桿菌中強烈表現的Pcj7作為啟動子。

為了擴增Pcj7基因的片段，使用ATCC6872菌株的基因組DNA作為模板，且使用SEQ ID NO：10和11的引子對。分別以使用SEQ ID NO：12和13及14和15的引子對之PCR擴增每個xmpE基因。PCR反應在如下條件下進行：在94℃變性5分鐘；進行25個循環：在94℃變性30秒、在52℃黏合30秒以及在72℃聚合1分鐘。然後在72℃進行最終聚合5分鐘。2.3kbp的多核苷酸模板係藉由使用三個擴增的基因片段Pcj7、xmpE-1和xmpE-2作為模板，而以重疊聚合酶連鎖反應而獲得。將獲得的基因片段用限制酶XbaI切割，並用使用T4連接酶選殖到用XbaI切割的線性pDZ載體中以製備“pDZ-Pcj7/xmpE”載體。

實施例3-2-2：製備具有經取代的xmpE啟動子的菌株並評估其生產XMP的能力

用實施例3-2-1中製備的pDZ-xmpEX2載體電穿孔而轉形KCCM-10530菌株(使用根據Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52：541-545的轉形方法)，並且從含有25mg/L卡那黴素的培養基選擇具有由於同源序列重組而插至染色體上的載體的菌株。其中目標基因的菌株係藉由所選擇的原菌株的二次互換而選擇。最終轉形菌株的基因啟動子的成功插入係以使用SEQ ID NO：16和17的引子對的PCR證實。將其中啟動子經更強啟動子取代的菌株命名為“KCCM-10530-Pcj7/xmpE”，並評估了它生產XMP的能力。

為了測量菌株生產XMP的能力，使用與實施例2-2中相同的方法。進行HPLC分析以測量培養完成後所生產的XMP的量，結果如下表3所示。

比較親代菌株停滯棒狀桿菌菌株KCCM-10530和由於更強的啟動子而具有增強的xmpE表現的KCCM-10530-Pcj7/xmpE菌株的培養基中的XMP濃度；結果，如上表3所示，KCCM-10530-Pcj7/xmpE菌株的XMP濃度為0.7g/L，表示在相同條件下與親代菌株相比，濃度增加約6%。

實施例3-3：取代xmpE的起始密碼子

實施例3-3-1：製備用於取代xmpE的起始密碼子的載體

為了確認當預測參與XMP排出能力的xmpE蛋白質的表現增強時XMP排出能力是否增加，製備載體(其中起始密碼子gtg係經atg取代)。用於製備載體的基因片段係以使用ATCC6872菌株的基因組DNA作為模板之PCR而獲得。為了製備具有經atg取代的起始密碼子gtg的載體，分別使用SEQ ID NO：18和19及20和21的引子對而獲得兩個基因片段A和B。PCR反應係在如下條件下進行：25個循環為：在94℃變性5分鐘；在94℃變性30秒；在52℃黏合30秒；以及在72℃聚合1分鐘。然後在72℃進行最終聚合5分鐘。結果，針對片段A和B，分別獲得約0.7kbp和1kbp的多核苷酸。將用這兩個片段用作模板，使用SEQ ID NO：18和21的引子對進行PCR，以獲得約1.7kbp的PCR產物(後文稱為“g1a片段”)。聚合係在如下條件下進行：25個循環為：在94℃變性5分鐘；在94℃變性30秒；在55℃黏合30秒；以及在72℃聚合120秒。然後在72℃進行最終聚合7分鐘。

獲得的基因片段係用限制酶XbaI切割，並用T4連接酶選殖入以XbaI切割的線性pDZ載體中，以製備“pDZ-xmpE(g1a)”載體。

實施例3-3-2：製備具有xmpE之經取代之起始密碼子的菌株並評估其生產XMP的能力

用實施例3-3-1中製備的pDZ-xmpEX2(g1a)載體電穿孔而轉形KCCM-10530菌株(使用根據Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52：541-545的轉形方法)，並且從含有25mg/L卡那黴素的培養基選擇具有由於同源序列重組而插至染色體上的載體的菌株。其中目標基因增強的菌株係藉由所選擇的原菌株的二次互換而選擇。最終轉形菌株的基因啟動子的成功插入係以使用SEQ ID NO：18和21的引子對的PCR證實，並以核苷酸序列分析法分析經取代之核苷酸序列。將其中xmpE之起始密碼子經atg取代的所選菌株命名為CJX1662，並評估了其生產XMP的能力。

為了測量生產菌株的XMP的能力，使用與實施例2-2中相同的方法。進行HPLC分析以測量培養完成後所生產的XMP的量，且結果如下表4所示。

比較親代菌株停滯棒狀桿菌菌株KCCM-10530和具有經取代之起始密碼子xmpE的CJX1662菌株的培養基中的XMP濃度；結果，如上表4所示，CJX1662菌株的XMP濃度為2.3g/L，表示在相同條件下與親代菌株相比，濃度增加約20%。

此外，如上製備的CJX1662菌株係於2018年4月11日寄存在布達佩斯條約下的國際寄存機構韓國微生物培養中心(KCCM)，寄存號為KCCM12248P。

實施例3-4基於生產野生型XMP的細胞株製備具有增強的xmpE的菌株

實施例3-4-1：基於生產野生型XMP的細胞株製備具有增強的xmpE的菌株

具有生產XMP生產力的能力的菌株係藉由弱化野生型ATCC6872菌株中屬於XMP分解途徑的腺苷酸琥珀酸合成酶和XMP脫氫酶的活性而製備。為了減弱這兩種酶的活性，製備了一種菌株，其中，purA和guaA(其係分別編碼這兩種酶的基因)的核苷酸序列的第一個核苷酸‘a’經‘t’取代。更具體地，將藉由弱化ATCC6872菌株中兩個基因的表現而製備的菌株命名為CJX1663。

用實施例3-3-2中製備的pDZ-xmpE(g1a)載體電穿孔而轉形製備的CJX1663菌株，並從含有25mg/L卡那黴素的培養基中選擇由於同源序列重組而插入染色體上的載體的菌株。其中目標基因增強的菌株係藉由所選擇的原菌株的二次互換而選擇。最終轉形菌株的基因啟動子的成功插入係使用SEQ ID NO：18和21的引子對之PCR證實。

將其中選擇的xmpE之起始密碼子經atg取代的菌株命名為“CJX1663_xmpE(g1a)”，並評估其生產XMP的能力。

進行HPLC分析以測量培養完成後所生產的XMP的量，且結果如下表5所示。

比較親代菌株停滯棒狀桿菌菌株CJX1663和具有xmpE之經取代之起始密碼子的CJX1663_xmpE(g1a)菌株的培養基中的XMP濃度；結果，如上表5所示，CJX1663_xmpE(g1a)菌株的XMP濃度為2.8g/L，表示在相同條件下與親代菌株相比，濃度增加約33%。

從結果證實，藉由本發明的增強輸出5’-黃核苷單磷酸的蛋白質(xmpE)的活性，可以提高XMP生產力。

同時，本發明中使用的引子序列如表6所示。

發明所屬領域中具有通常知識者將認知到，在不悖離本發明的精神或基本特徵的情況下，本發明可以以其他特定形式實施。在這方面，所描述的具體例在所有態樣都應被視為僅是闡釋性，而非限制性。因此，本發明的範疇係由所附申請專利範圍表示，而非前述內容。在申請專利範圍的等效物的含義和範圍內的所有變化都包含在本發明的範疇內。

【生物材料寄存】生物材料1

[寄存國家]KR南韓

[寄存機構]韓國微生物保存中心

[寄存日期]2018/04/11

[寄存號碼]KCCM12248P

生物材料2

[寄存國家]TW中華民國

[寄存機構]財團法人食品工業發展研究所

[寄存日期]2019/08/22

[寄存號碼]BCRC 910931

<110> CJ第一製糖股份有限公司(CJ CHEILJEDANG CORPORATION)

<120> 生產5’-黃核苷單磷酸的棒狀桿菌屬微生物及使用該微生物製備5’-黃核苷單磷酸的方法

<150> KR 10-2018-0065681

<151> 2018-06-07

<160> 21

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 1242

<212> DNA

<213> 棒狀桿菌屬

<400> 1

<210> 2

<211> 413

<212> PRT

<213> 棒狀桿菌屬

<400> 2

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> xmpE del F

<400> 3

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> xmpE del R

<400> 4

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> xmpE 2copv F(xbaI)

<400> 5

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> xmpE 2copy R(speI)

<400> 6

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> xmpE 2copy F(speI)

<400> 7

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> xmpE 2copy CF

<400> 8

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> xmpE 2copy CR

<400> 9

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pcj7 F

<400> 10

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pcj7 R

<400> 11

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> xmpE P 1

<400> 12

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> xmpE P 2

<400> 13

<210> 14

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> xmpE P 3

<400> 14

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> xmpE P 4

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<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pcj7/xmpE CF

<400> 16

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pcj7/xmpE CR

<400> 17

<210> 18

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> xmpE atg 1

<400> 18

<210> 19

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> xmpE atg 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> xmpE atg 3

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<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> xmpE atg 4

<400> 21

Claims

一種生產5’-黃核苷單磷酸之棒狀桿菌屬(Corynebacterium)微生物，其中，相較於親代菌株或未修飾的菌株，包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的蛋白質之活性係經修飾為增強者，其中該修飾為藉由增加編碼蛋白質之多核苷酸之拷貝數、增強啟動子之活性、起始密碼子之取代或其組合而達成。
如申請專利範圍第1項所述之棒狀桿菌屬(Corynebacterium)微生物，其中，該蛋白質係由包含SEQ ID NO：1之核苷酸序列的基因編碼。
如申請專利範圍第1所述之棒狀桿菌屬(Corynebacterium)微生物，其中，該生產5’-黃核苷單磷酸之棒狀桿菌屬(Corynebacterium)微生物係停滯棒狀桿菌(Corynebacterium stationis)。
一種生產5’-黃核苷單磷酸之方法，包括：在培養基中培養如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之棒狀桿菌屬(Corynebacterium)微生物；以及從該棒狀桿菌屬(Corynebacterium)微生物或該培養基回收該5’-黃核苷單磷酸。
如申請專利範圍第4項所述之生產5’-黃核苷單磷酸之方法，其中，該生產5’-黃核苷單磷酸之棒狀桿菌屬(Corynebacterium)微生物係停滯棒狀桿菌(Corynebacterium stationis)。