BR112019016482A2

BR112019016482A2 - Micro-organismo do gênero corynebacterium que produz monofosfato de 5?-xantosina e método para produzir monofosfato de 5?-xantosina

Info

Publication number: BR112019016482A2
Application number: BR112019016482-0A
Authority: BR
Inventors: Min Ji Baek; Ji Hye Lee; Boram LIM; Byoung Hoon Yoon; Jeong Eun Lee; Su-bin LIM; Jaeho Jeong
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2018-06-07
Filing date: 2018-06-21
Publication date: 2020-12-22
Also published as: ZA201903098B; JP6938633B2; MX2019009214A; CN112210522B; AU2018386357B2; US11332708B2; EP3597756A4; CN112210522A; PL3597756T3; EP3597756B1; AU2021204450B2; CN109913397B; CN109913397A; KR101929158B1; JP2020521431A; AU2021204450A1; US10844348B2; PT3597756T; RU2720520C1; BR112019016482B1

Abstract

a presente revelação refere-se a um micro-organismo do gênero corynebacterium que produz monofosfato de 5'-xantosina e um método para produzir monofosfato de 5'-xantosina com o uso do mesmo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “MICRO-ORGANISMO DO GÊNERO CORYNEBACTERIUM QUE PRODUZ MONOFOSFATO DE 5’- XANTOSINA E MÉTODO PARA PRODUZIR MONOFOSFATO DE 5’-XANTOSINA”

CAMPO DA TÉCNICA

[001] A presente revelação refere-se a um micro-organismo que produz monofosfato de 5′-xantosina e um método para produzir monofosfato de 5′-xantosina com o uso do mesmo.

TÉCNICA ANTECEDENTE

[002] Monofosfato de 5′-xantosina (XMP) não somente tem significância fisiológica em animais e plantas como um intermediário em biossíntese de ácido nucleico e sistemas metabólicos, mas é também usado para vários propósitos: alimentos, medicamentos e vários usos médicos. Em particular, quando usado junto com glutamato de monossódio (MSG), há um efeito sinérgico em acentuar sabores. Consequentemente, XMP é um dos acentuadores de sabor à base de ácido nucleico que atraíram atenção como um condimento.

[003] Além disso, monofosfato de 5′-xantosina é um intermediário em metabolismo de biossíntese de nucleotídeo de purina, e é uma matéria-prima importante para a produção de monofosfato de 5′-guanosina (GMP). Um método conhecido para preparar monofosfato de guanosina que tem alto valor comercial e afeta em aumentar a intensidade de gosto é a fermentação de um micro-organismo, que envolve produzir monofosfato de 5′-xantosina e converter de modo enzimático o mesmo a monofosfato de 5′-guanosina. Visto que esse método é o mais econômico, monofosfato de 5′-xantosina é necessário tanto quanto monofosfato de 5′-guanosina.

[004] Como os métodos para preparar monofosfato de 5′-xantosina, (1) síntese química, (2) desaminação do monofosfato de 5′-xantosina preparado, (3) produção fermentativa adicionando-se xantina como um precursor no meio de cultura, (4) fermentação direta de uma cepa mutante de um micro-organismo que produz monofosfato de 5′-xantosina, etc. são conhecidos. Dentre os vários métodos, a fermentação direta de monofosfato de 5′-xantosina por uma cepa de micro-organismo mutante é o mais economicamente vantajoso. Todavia, a pesquisa em métodos para produzir monofosfato de 5′-xantosina em um alto rendimento está ainda em demanda.

REVELAÇÃO DETALHADA [PROBLEMA DA TÉCNICA]

[005] Os presentes inventores realizaram esforços intensivos para desenvolver micro-organismos com capacidade de produzir um alto rendimento de monofosfato de 5′-xantosina e, como resultado, os mesmos constataram que o rendimento de produção de monofosfato de 5′-xantosina aumenta quando a atividade de uma proteína particular é acentuada, completando assim a presente revelação. [SOLUÇÃO TÉCNICA]

[006] Um objetivo da presente revelação é fornecer um micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz monofosfato de 5′-xantosina, no qual a atividade de uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 é acentuada

[007] Outro objetivo da presente revelação é fornecer um método para produzir monofosfato de 5′-xantosina com o uso do micro-organismo.

EFEITOS VANTAJOSOS

[008] O micro-organismo do gênero Corynebacterium da presente revelação tem atividade acentuada de uma proteína que exporta monofosfato de 5′-xantosina, tendo assim aumentado a produção de monofosfato de 5′-xantosina, e isso pode contribuir significativamente para a redução do custo de produção de monofosfato de 5′- xantosina.

MELHOR MODO

[009] Abaixo no presente documento, a presente revelação é descrita em mais detalhes. Entretanto, cada descrição e modalidade exemplificativa revelada na presente revelação pode ser aplicada a outras descrições e modalidades exemplificativas. Ou seja, todas as combinações dos vários elementos revelados na presente revelação estão dentro do escopo da presente revelação. Adicionalmente, o escopo da presente revelação não pode ser interpretado como sendo limitado pela descrição específica abaixo.

[010] Como um aspecto para alcançar os objetivos acima, a presente revelação fornece um micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz monofosfato de 5′-xantosina, no qual a atividade de uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 é acentuada

[011] Conforme usado no presente documento, o termo “monofosfato de 5′- xantosina” se refere a um composto chamado ácido 5′-xantílico, xantosina, etc. Na presente revelação, o monofosfato de 5′-xantosina pode ser usado de modo intercambiável com “XMP”.

[012] Conforme usado no presente documento, o termo “proteína que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2” se refere a uma proteína presente de modo endógeno em um micro-organismo do gênero Corynebacterium, codificado por um gene transportador de superfamília de facilitador principal (transportador de MFS) que exporta monofosfato de 5′-xantosina do micro- organismo. Especificamente, o mesmo pode ser uma proteína transportadora de MFS que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, que está presente de modo endógeno no micro-organismo do gênero Corynebacterium. Além disso, a proteína pode ser uma proteína que consiste em ou é composta da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, porém sem limitação à mesma. A proteína transportadora de MFS na presente revelação pode ser chamada “xmpE” ou “proteína de xmpE”.

[013] Conforme usado no presente documento, “proteína que compreende uma sequência de aminoácidos de uma SEQ ID NO particular”, desde que a mesma tenha atividade idêntica ou correspondente a uma proteína que inclui a mesma SEQ ID NO, pode incluir uma adição de uma sequência que não altera a função do proteinato na frente da extremidade da sequência de aminoácidos; uma mutação naturalmente ocorrente; ou uma mutação silenciosa da mesma. No caso de proteínas que têm tal adição de sequência ou mutação, é evidente que as mesmas são também incluídas dentro do escopo da presente revelação.

[014] Além disso, a proteína da presente revelação pode compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, mas também aquela que tem pelo menos 60% de homologia ou identidade a SEQ ID NO: 2. A proteína que compreende a sequência de aminoácidos que tem pelo menos 60% de homologia ou identidade à SEQ ID NO: 2 pode ser uma proteína que inclui uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 60%, especificamente 70%, mais especificamente 80%, ainda mais especificamente 83%, 84%, 85%, 88%, 90%, 93%, 95%, ou 97% de homologia ou identidade à SEQ ID NO: 2. A sequência de aminoácidos que tem a homologia ou identidade pode excluir aquela que tem 100% identidade da dita faixa ou ser aquela que tem identidade de menos do que 100%. É obvio que desde que a sequência de aminoácidos, como uma sequência que tem a homologia ou identidade de sequência, tem substancialmente atividade biológica idêntica ou correspondente a aquela de SEQ ID NO: 2, a mesma é incluída no escopo da presente revelação mesmo se parte da sequência tiver deleção, modificação, substituição, ou adição de uma sequência de aminoácidos.

[015] Adicionalmente, uma sequência de nucleotídeos de um gene que codifica a proteína que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 pode ser obtida de um banco de dados conhecido tal como NCBI GenBank, porém, sem limitação a isso. Especificamente, a proteína que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 pode ser codificada por um gene que inclui uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, assim como um gene que consiste em ou é composto da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, porém sem limitação ao mesmo.

[016] Além disso, a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 pode incluir não somente a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, por si só, mas também uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 80% de homologia ou identidade à SEQ ID NO: 1.

[017] Especificamente, qualquer sequência de nucleotídeos com capacidade de codificar uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de homologia ou identidade à SEQ ID NO: 2 é incluída dentro do escopo da presente revelação, mas a proteína pode ser codificada por um gene que inclui uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 80%, especificamente 83%, 84%, 85%, 88%, 90%, 93%, 95%, ou 97% de homologia ou identidade à SEQ ID NO: 1. No entanto, é obvio que uma sequência de nucleotídeos é incluída dentro do escopo da presente revelação sem limitação desde que a mesma codifique uma proteína que tem atividade correspondente a da proteína que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

2.

[018] Adicionalmente, é obvio que, devido à degeneracidade de código genético, um polinucleotídeo que pode ser transladado a uma proteína que inclui a mesma sequência de aminoácidos ou uma proteína que tem homologia ou identidade à mesma pode ser incluída dentro do escopo da presente revelação. Além disso, uma sonda que pode ser preparada de uma sequência genética conhecida, por exemplo, qualquer sequência que codifica uma proteína que tem atividade de uma proteína que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 hibridizando-se o todo ou uma parte da sequência de nucleotídeos com sua sequência de complemento sob condições rigorosas pode ser incluída sem limitação. As “condições rigorosas” se referem a condições que permitem hibridização específica entre polinucleotídeos. As condições são descritas em detalhes na referência (J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, Nova York, 1989); por exemplo, uma condição na qual genes que tem alta homologia ou identidade de pelo menos 40%, especificamente, 85%, especificamente, 90%, mais especificamente, 95%, mais especificamente, 97%, e particularmente, especificamente 99% são hibridizadas e aquelas que tem homologia ou identidade inferior não são hibridizadas; ou uma condição de hibridização Southern convencional, ou seja, lavar uma vez, especificamente duas a três vezes em uma temperatura e concentração de sal equivalente a 60° C, 1×SSC, 0,1% de SDS, especificamente 60° C, 0,1×SSC, 0,1% de SDS, mais especificamente, 68° C, 0,1×SSC, 0,1% de SDS. Embora a hibridização possa permitir incompatibilidade entre bases dependendo do grau de estringência, a mesma exige dois ácidos nucleicos tenham uma sequência complementar entre si. Conforme usado no presente documento, o termo “complementar” é usado para descrever a relação entre bases de nucleotídeo com capacidade de hibridização entre si. Em relação ao DNA, por exemplo, adenosina é complementar à timina, e citosina é complementar à guanina. Consequentemente, a presente revelação também pode incluir um fragmento de ácido nucleico isolado complementar não somente a uma sequência de ácidos nucleicos substancialmente similares, mas também a sequência inteira.

[019] Especificamente, o polinucleotídeo que tem homologia ou identidade pode ser detectado com o uso de uma condição de hibridização que inclui uma etapa de hibridização em um valor Tm de 55° C e as condições descritas acima. Além disso, o valor Tm pode ser 60° C, 63° C, ou 65° C, porém, sem limitação a isso e pode ser apropriadamente ajustada por um elemento versado na técnica.

[020] Um grau apropriado de estringência de hibridização de polinucleotídeo é dependente do comprimento e grau de complementaridade do polinucleotídeo, e variáveis são conhecidas no campo técnico correspondente (consultar Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8).

[021] Conforme usado no presente documento, o termo “homologia” refere-se ao grau de identidade entre duas dadas sequências de aminoácidos ou sequências de nucleotídeos, e pode ser expresso como uma percentagem. No presente relatório descritivo, a sequência homóloga que tem uma atividade igual ou semelhante à determinada sequência de aminoácidos ou sequência de nucleotídeos pode ser indicada em termos de “% de homologia”.

[022] Conforme usado no presente documento, o termo “identidade” se refere ao grau de relação de sequência entre sequências de aminoácidos ou nucleotídeos e, em alguns casos, isso pode ser determinado por uma compatibilidade entre as cadeias de tais sequências.

[023] Os termos “homologia” e “identidade” são frequentemente usados de modo intercambiável entre si.

[024] A homologia ou identidade de sequência de polinucleotídeos conservados ou polipeptídeos pode ser determinada por algoritmos de alinhamento padrão e usado com uma penalidade de lacuna padrão estabelecida por um programa que é usado. Substancialmente, em geral, espera-se que os polinucleotídeos ou polipeptídeos homólogos ou idênticos hibridizem sob estringência moderada ou alta, ao longo de pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% do comprimento inteiro de todos ou dos polinucleotídeos ou polipeptídeos alvo. Os polinucleotídeos que contêm códons degenerados em vez de códons nos polipeptídeos hibridizantes são também considerados.

[025] Seja quaisquer duas sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeos têm uma homologia ou identidade de, por exemplo, pelo menos 50%, 55%, 60%, 65% 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% pode ser determinada com o uso de um algoritmo de computador conhecido tal como “programa FASTA” (por exemplo, Pearson et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A 85: 2444) com o uso de parâmetros padrão. Alternativamente, pode ser determinado o uso de algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443 a 453), que é realizado no programa Needleman do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276 a 277) (preferencialmente, versão 5.0.0 ou posterior). (incluindo o pacote de programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL., J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide For Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego, 1994, e [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). Por exemplo, a homologia ou identidade pode ser determinada com o uso de BLAST ou ClustalW da National Center for Biotechnology Information (NCBI).

[026] A homologia ou identidade de polinucleotídeo ou polipeptídeo pode ser determinada comparando-se as informações de sequência conforme publicado (por exemplo, Smith e Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482), por exemplo, com o uso do programa de computador GAP, conforme revelado em Needleman et al. (1970), J Mol. Biol.48: 443. Em resumo, o programa GAP define a homologia ou identidade como um valor obtido dividindo-se o número de símbolos alinhados de modo similar (por exemplo, nucleotídeos ou aminoácidos) pelo número total de símbolos na mais curta das duas sequências. Parâmetros padrão para o programa GAP pode incluir (1) uma matriz de comparação unária (que contém um valor de 1 para identidades e 0 para não-identidades) e a matriz de comparação ponderada de Gribskov et al. (1986), Nucl. Acids Res. 14:6745, conforme revelado em Schwartz e Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, p. 353 a 358, 1979; (2) uma penalidade de 3,0 para cada lacuna e uma penalidade adicional de 0.10 adicional para cada símbolo em cada lacuna (ou uma penalidade de abertura de lacuna de 10 e uma penalidade de extensão de lacuna de 0,5); e (3) sem penalidade para lacunas de extremidade. Consequentemente, conforme usado no presente documento, o termo “homologia” ou “identidade” se refere a uma relevância entre polipeptídeos ou polinucleotídeos.

[027] O micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz monofosfato de 5′-xantosina na presente revelação pode ter atividade acentuada da proteína que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

[028] A acentuação de atividade da proteína que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 pode ser usada de modo intercambiável com a acentuação de atividade de xmpE ou a de uma proteína codificada por um gene que inclui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1.

[029] Conforme usado no presente documento, o termo “atividade acentuada de uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2” se refere à expressão acentuada da proteína em comparação a sua cepa percursora ou a da proteína que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 em comparação a uma cepa não modificada; atividade acentuada da mesma com expressão equivalente; ou atividade acentuada e expressão da mesma. O termo também se refere a atividade acentuada da proteína em comparação a sua atividade endógena, e expressão acentuada ou atividade de xmpE em comparação à cepa percursora ou cepa não modificada da mesma.

[030] Na presente revelação, a acentuação de atividade de proteína pode ser alcançada aplicando-se vários métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a acentuação de atividade pode ser alcançada aumentando-se o número de cópia de polinucleotídeos que codificam a proteína, acentuando-se a atividade de promotor, substituição de um códon de início, ou uma combinação dos mesmos; especificamente, 1) amentando-se o número de cópia de polinucleotídeo que codifica a proteína; 2) modificar uma sequência de um regulador de expressão (promotor, operador, etc.) de modo a aumentar a expressão do polinucleotídeo; 3) modificar uma sequência do gene (códon de início, etc.) em um cromossomo de modo a acentuar a atividade de proteína, ou uma combinação dos mesmos, porém, sem limitação a isso.

[031] Especificamente, em relação à acentuação da atividade de proteína, o método para modificar uma sequência de um regulador de expressão pode ser alcançado aplicando-se vários métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a modificação pode ser realizada para acentuar a atividade da sequência reguladora de expressão induzindo-se uma modificação por deleção, inserção, ou substituição não- conservativa ou conservativa, ou uma combinação dos mesmos na sequência reguladora; ou substituindo a sequência de nucleotídeos com uma sequência de nucleotídeos que tem atividade mais acentuada. O regulador de expressão inclui um promotor, um acentuador, um operador, um sítio de ligação de ribossomo, e uma sequência que regula a terminação de transcrição e tradução, porém, sem limitação a isso.

[032] Adicionalmente, o método para modificar a sequência do gene pode ser realizado para acentuar a atividade de proteína induzindo-se uma modificação por deleção, inserção, ou substituição não-conservativa ou conservativa, ou uma combinação dos mesmos na sequência; ou substituindo-se a sequência de genes com uma sequência de genes modificada que tem atividade mais acentuada, porém, sem limitação a isso.

[033] Em uma modalidade exemplificativa específica, a acentuação da atividade de proteína pode ser alcançada aumentando-se o número de cópia de xmpE;

substituindo-se um promotor de xmpE com outro promotor que tem atividade acentuada; substituindo o códon de início de xmpE; ou uma combinação dos mesmos.

[034] Conforme usado no presente documento, o termo “vetor” se refere a um construto de DNA que compreende a sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo que codifica a proteína-alvo ligada de modo operativo à sequência reguladora apropriada para expressar a proteína-alvo no hospedeiro apropriado. A sequência reguladora pode incluir o promotor que pode iniciar a transcrição, qualquer sequência de operador para controlar a transcrição, a sequência para codificar o sítio de ligação de ribossomo de mRNA apropriado, e a sequência para controlar a terminação de transcrição e tradução. O vetor pode ser transfectado em um hospedeiro adequado, e então, pode ser replicado ou funcionar, independentemente do genoma hospedeiro, e pode ser integrado no próprio genoma.

[035] Conforme usado no presente documento, o termo “transformação” se refere à introdução de um vetor que inclui um polinucleotídeo que codifica uma proteína-alvo em uma célula hospedeira de modo que a proteína codificada pelo polinucleotídeo possa ser expressa na célula hospedeira. Desde que a mesma possa ser expressa na célula hospedeira, o polinucleotídeo transformado pode ser tanto integrado e colocado no cromossomo da célula hospedeira como localizado de modo extracromossômico. Além disso, o polinucleotídeo inclui DNA e RNA que codificam a proteína-alvo. O polinucleotídeo pode ser introduzido em qualquer forma desde que possa ser introduzido na célula hospedeira e expresso na mesma. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeira na forma de um cassete de expressão, que é um construto de polinucleotídeo que inclui todos os elementos necessários para sua expressão autônoma. O cassete de expressão pode incluir um promotor ligado de modo operável ao gene, um sinal de terminação de transcrição, um sítio de ligação de ribossomo e um sinal de terminação de tradução. O cassete de expressão pode estar na forma de um vetor de expressão autorreplicável. Adicionalmente, o polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeira visto que o mesmo é ligado de modo operativo a uma sequência necessária para a expressão na célula hospedeira.

[036] Conforme usado no presente documento, o termo “micro-organismo que produz monofosfato de 5′-xantosina” ou “micro-organismo que tem capacidades de produzir monofosfato de 5′-xantosina” se refere a um micro-organismo que tem naturalmente capacidades de produzir monofosfato de 5′-xantosina ou um micro- organismo na qual a capacidade de produzir monofosfato de 5′-xantosina é conferido a uma cepa percursora que não tem capacidade de produzir monofosfato de 5′- xantosina. Especificamente, o mesmo pode ser um micro-organismo que tem capacidades de produzir monofosfato de 5′-xantosina, no qual a atividade de uma proteína que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou a proteína de xmpE é acentuada

[037] Além disso, considerando o objetivo da presente revelação, a capacidade de produzir monofosfato de 5′-xantosina do micro-organismo pode ser aprimorada/acentuada devido à acentuação de monofosfato de capacidade de exportação de 5′-xantosina.

[038] Especificamente, os termos “capacidade de produzir” e “capacidade de exportar” podem ser usados de modo intercambiável. Além disso, o micro-organismo pode ser usado de modo intercambiável com “micro-organismo que exporta monofosfato de 5′-xantosina” ou “micro-organismo que tem monofosfato de capacidade de exportação de 5′-xantosina”. O mesmo pode se referir a um micro- organismo que tem naturalmente monofosfato de capacidade de exportação de 5′- xantosina ou um micro-organismo no qual monofosfato de capacidade de exportação de 5′-xantosina é conferida a uma cepa percursora que não tem monofosfato de capacidade de exportação de 5′-xantosina.

[039] Especificamente, o micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz monofosfato de 5′-xantosina pode ser Corynebacterium stationis ou Corynebacterium glutamicum, ou Corynebacterium ammoniagenes; e mais especificamente pode ser Corynebacterium stationis, porém, sem limitação a isso.

[040] Conforme outro aspecto, a presente revelação fornece um método para produzir monofosfato de 5′-xantosina, que compreende cultivar o micro-organismo do gênero Corynebacterium em um meio de cultura; e recuperar o monofosfato de 5′- xantosina do micro-organismo ou do meio de cultura.

[041] O micro-organismo e monofosfato de 5′-xantosina de acordo com a presente revelação são as mesmas que anteriormente descrito.

[042] O micro-organismo do gênero Corynebacterium na presente revelação pode ser Corynebacterium stationis, porém, sem limitação a isso.

[043] Em relação ao método da presente revelação, o micro-organismo do gênero Corynebacterium pode ser cultivado com o uso de quaisquer condições de cultivo e métodos conhecidos na técnica.

[044] Conforme usado no presente documento, o termo “cultura” se refere ao cultivo do micro-organismo sob condições ambientais artificial e moderadamente controladas. O processo de cultivo da presente revelação pode ser realizado de acordo com um meio de cultura adequado e condições de cultura conhecidas na técnica. Além disso, o método de cultura inclui uma cultura de batelada, uma cultura contínua, e uma cultura de batelada alimentada; especificamente, um processo de batelada ou um processo de batelada alimentada ou de batelada alimentada repetida pode ser continuamente cultivado, mas o método de cultura não é limitado a isso.

[045] O meio usado para cultura deve satisfazer as exigências de cepas específicas de um modo apropriado. O meio de cultura para o micro-organismo do gênero Corynebacterium é conhecido na técnica (por exemplo, Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., E.U.A, 1981).

[046] Em geral, as fontes de açúcar que podem ser usadas para o meio incluem sacarídeos e carboidratos, tais como glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amido, celulose, etc.; óleos e gorduras, tais como óleo de soja, óleo de girassol, óleo de rícino, óleo de coco, etc.; ácidos graxos, tais como ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, etc.; glicerol; álcoois, tais como etanol; e ácidos orgânicos, tais como ácidos acéticos. Essas substâncias podem ser usadas de modo individual ou como uma mistura, porém não são limitadas às mesmas.

[047] Fontes de carbono que podem ser usados podem ser sacarose crua ou glicose, ou melaços que contém uma grande quantidade de sacarose; e especificamente podem ser glicose purificada, mas, porém, sem limitação a isso. Outras várias fontes de carbono podem ser usadas.

[048] Fontes de nitrogênio que podem ser usadas incluem peptona, extrato de amido, extrato de bife, extrato de malte, milhocina, farinha de soja, e ureia ou compostos inorgânicos, por exemplo, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio, e nitrato de amônio. As fontes de nitrogênio também podem ser usadas individualmente ou como uma mistura, porém, sem limitação a isso.

[049] Fontes de fosfato, que podem ser usadas incluem fosfato de di-hidrogênio de potássio, fosfato de hidrogênio de dipotássio, ou sais que contêm sódio correspondentes.

[050] Além disso, o meio de cultura pode conter sais metálicos, tais como sulfato de magnésio ou sulfato de ferro. Adicionalmente aos materiais acima, substâncias de crescimento essenciais, tais como aminoácidos e vitaminas, podem ser usadas. Percursores apropriados também podem ser usados para o meio de cultura. As matérias-primas-primas descritas acima podem ser adicionadas em batelada ou continuamente a um incubador de maneira apropriada.

[051] Um pH do meio de cultura pode ser ajustado com o uso de um composto básico, tal como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, e amônia; ou um composto ácido tal como ácido fosfórico e ácido sulfúrico de maneira apropriada. Adicionalmente, a formação de espuma pode ser suprimida com o uso de um agente antiespumante, tal como poliglicol éster de ácido graxo. Oxigênio ou um gás que contém oxigênio (por exemplo, ar) pode ser injetado no meio de cultura para manter uma condição aeróbica.

[052] Especificamente, a temperatura de cultivo é normalmente 30° C a 37° C, mais especificamente, 32° C a 33° C. O cultivo pode continuar até uma quantidade desejada de monofosfato de 5′-xantosina é obtida, mas especificamente pode ser realizada por 40 horas a 120 horas.

[053] A separação de monofosfato de 5′-xantosina da cultura pode ser realizada por um método convencional conhecido na técnica; por exemplo, centrifugação, filtração, cromatografia de troca de íon, cristalização, etc. Por exemplo, a cultura pode ser centrifuga em uma baixa velocidade para remover biomassa, e então, o sobrenadante obtido pode ser separado através de cromatografia de troca de íon. No entanto, a separação não é limitada a isso.

[054] A etapa de recuperação pode incluir adicionalmente um processo de purificação. [MODO PARA INVENÇÃO]

[055] Doravante no presente documento, a presente revelação será descrita em mais detalhes em referência às modalidades exemplificativas a seguir. Entretanto, esses Exemplos são para propósitos ilustrativos apenas, e a presente revelação não se destina a ser limitada por esses Exemplos. EXEMPLO 1: CONSTATAÇÃO DE PROTEÍNA QUE EXPORTA MONOFOSFATO DE 5′-XANTOSINA (XMP)

[056] Para identificar proteína de membrana de Corynebacterium envolvida em exportação de XMP, uma biblioteca de DNA genômico de Corynebacterium stationis (ATCC6872) foi preparado. Um DNA genômico de cepa de ATCC6872 (isto é, tipo selvagem de Corynebacterium stationis) foi extraído com o uso de G-spin Total DNA Extraction Minin Kit pela Intron (Cat. Nº 17045) de acordo com o protocolo fornecido no mesmo. A biblioteca de proteína de membrana foi preparada com o uso do DNA genômico extraído como um modelo.

[057] Para investigar qual proteína tem a função de exportação, a biblioteca de DNA genômico preparada foi introduzida na cepa Corynebacterium KCCM-10530 usada como uma cepa percursora no documento de Patente nº KR 10-2011-0105662.

[058] XMP foi então adicionalmente adicionada ao meio de cultura mínimo que contém 1,7% de ágar para estabelecer uma condição de triagem na qual a cepa KCCM-10530 mostra inibição de crescimento. A cepa KCCM-10530 foi transformada por eletroporação com um plasmídeo de biblioteca genômica de uma proteína de membrana de cepa de ATCC6872, e colônias foram selecionadas que normalmente crescem em uma condição em que uma quantidade excessiva de XMPs são adicionadas ao meio de cultura. Um plasmídeo foi obtido da colônia selecionada e sua sequência de nucleotídeos foi analisada por um método de análise de sequência de nucleotídeos. Um tipo de proteína de membrana envolvido em remover a inibição de crescimento sob a condição de uma quantidade excessiva de XMP adicionada foi identificada a partir do experimento acima.

[059] A proteína de membrana de Corynebacterium foi confirmada para ter a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 e a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (NCBI GenBank: NZ_CP014279.1, WP_066795121, transportador de MFS). A proteína de membrana é conhecida como um transportador de MFS, mas sua função não é claramente identificada. Além disso, a mesma não é conhecida por ter a função de exportar XMP. Na presente revelação, a proteína de membrana é chamada de “xmpE”. EXEMPLO 2: IDENTIFICAÇÃO DE xmpE EXEMPLO 2-1: PREPARAÇÃO DE VETOR DEFICIENTE DExmpE-

[060] Um vetor Deficiente foi preparado para confirmar se a capacidade de exportar XMP diminui quando xmpE, a proteína envolvida na remoção de inibição de crescimento devido ao XMP identificado no Exemplo 1, é deletado da cepa de produção de XMP.

[061] Um fragmento de gene para a preparação de vetor foi obtido por PCR com o uso do DNA genômico da cepa de ATCC6872 como uma cepa percursora. Especificamente, o PCR foi realizado para o xmpE com o uso de iniciadores de SEQ ID NOS: 3 e 4. Os iniciadores que foram usados foram preparados com base nas informações acerca de genes Corynebacterium stationis (ATCC6872) registrados na National Institutes of Health (NIH) GenBank (NCBI Genbank: NZ_CP014279.1) e a sequência de nucleotídeos circundante dos mesmos.

[062] O PCR foi realizado sob as seguintes condições: desnaturação a 94° C por

5 minutos; 25 ciclos de desnaturação a 94° C por 30 segundos, anelamento a 52° C por 30 segundos, e polimerização a 72° C por 1 minuto. A polimerização final foi então realizada a 72° C por 5 minutos. Como um fragmento de gene de xmpE amplificado com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOS: 3 e 4, um modelo de polinucleotídeo de cerca de 1,0 kbp foi obtido. O fragmento de gene obtido foi clonado com o uso de um vetor T (Solgent) para obter um vetor TOPO-∆xmpE. EXEMPLO 2-2: PREPARAÇÃO DE CEPA DEFICIENTE DE xmpE

[063] A cepa KCCM-10530 foi transformada por eletroporação com o vetor preparado no exemplo 2-1 (com o uso do método de transformação de acordo com Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541-545), e a cepa que tem o vetor inserido em um cromossomo devido à recombinação de sequência homóloga foi selecionada de um meio de cultura que contém 25 mg/l de canamicina. A cepa deficiente de xmpE selecionada foi chamada de “KCCM-10530_∆xmpE”, e sua capacidade de produzir XMP foi avaliada.

[064] A cepa percursora Corynebacterium stationis KCCM-10530 e a cepa KCCM-10530_∆xmpE foram inoculadas em um tubo de 14 ml que inclui 3 ml do meio de cultura de semente abaixo e cultivada a 30° C por 24 horas com agitação a 170 rpm. Então, as culturas de semente foram adicionadas em uma quantidade de 0,7 ml a 32 ml do meio de cultura de produção a seguir (24 ml de meio de cultura principal + 8 ml de meio de cultura estéril adicional) em respectivos frascos de canto defletor de 250 ml, seguido por cultura a 30° C por 72 horas com agitação a 170 rpm. A análise de HPLC foi realizada para medir a quantidade de XMP produzido após a conclusão da cultura. A constituição do meio de cultura e o resultado de concentrações de XMP no meio de cultura são conforme mostrado na Tabela 1 abaixo.

MEIO DE CULTURA MÍNIMO DE XMP

[065] glicose 2%, sulfato de sódio 0,3%, fosfato de monopotássio 0,1%, fosfato de dipotássio 0,3%, sulfato de magnésio 0,3%, cloreto de cálcio 10 mg/l, sulfato de ferro 10 mg/l, sulfato de zinco 1 mg/l, cloreto de manganês 3,6 mg/l, L-cisteína 20 mg/l, pantotenato de cálcio 10 mg/l, cloridrato de tiamina 5 mg/l, biotina 30 μg/l, adenina 20 mg/l, guanina 20 mg/l, pH 7,3

MEIO DE CULTURA NUTRICIONAL DE XMP

[066] peptona 1%, extrato de bife 0,5%, cloreto de sódio 0,25%, extrato de amido 1%, ureia 0,3%, adenina 50 mg/l, guanina 50 mg/l, ágar 2%, pH 7,2

MEIO DE CULTURA DE SEMENTE DE FRASCO DE XMP

[067] glicose 20 g/l, peptona 10 g/l, extrato de amido 10 g/l, cloreto de sódio 2,5 g/l, ureia 3 g/l, adenina 150 mg/l, guanina 150 mg/l, pH 7,0 MEIO DE CULTURA DE PRODUÇÃO DE FRASCO DE XMP (MEIO DE CULTURA PRINCIPAL)

[068] glicose 50 g/l, sulfato de magnésio 10 g/l, cloreto de cálcio 100 mg/l, sulfato de ferro 20 mg/l, sulfato de manganês 10 mg/l, sulfato de zinco 10 mg/l, sulfato de cobre 0.8 mg/l, histidina 20 mg/l, cisteína 15 mg/l, beta-alanina 15 mg/l, biotina 100 μg/l, tiamina 5 mg/l, adenina 50 mg/l, guanina 25 mg/l, niacina 5 mg/l, pH 7,0 MEIO DE CULTURA DE PRODUÇÃO DE FRASCO DE XMP (MEIO DE CULTURA ESTÉRIL ADICIONAL)

[069] fosfato de monopotássio 18 g/l, fosfato de dipotássio 42 g/l, ureia 7 g/l, sulfato de amônio 5 g/l TABELA 1 XMP Rendimento Cepa nº (g/l) (%) KCCM-10530 11,8 23,6 KCCM-10530- 1,6 3,2 ∆xmpE

[070] As concentrações de XMP nos meios de cultura da cepa percursora KCCM- 10530 e da cepa deficiente de xmpE KCCM-10530-∆xmpE foram comparadas; como resultado, conforme mostrado na Tabela 1 acima, a concentração de XMP da cepa KCCM-10530-∆xmpE diminuiu pelo menos cerca de 10 g/l em comparação à cepa percursora sob as mesmas condições.

[071] Consequentemente, xmpE foi confirmado como uma proteína envolvida na exportação de XMP. EXEMPLO 3: ACENTUAÇÃO DE ATIVIDADE DE proteína de xmpE

[072] A atividade da proteína de xmpE na cepa foi acentuada de acordo com os exemplos a seguir, e a cepa com atividade de xmpE acentuada foi examinada em relação a se sua capacidade de produzir/exportar XMP foi aumentada. EXEMPLO 3-1: AUMENTO DO NÚMERO DE CÓPIA DE xmpE EXEMPLO -1-1: PREPARAÇÃO DE VETOR PARA AUMENTAR NÚMERO DE CÓPIA DE xmpE

[073] De modo a confirmar se a capacidade de exportar XMP aumenta quando a atividade de xmpE, que é prevista para estar envolvida na capacidade de exportar XMP, é acentuada, um vetor foi preparado para acentuar um gene de xmpE. Com o uso de um método para aumentar o número de cópia como o método de acentuação, o seguinte experimento foi realizado.

[074] O fragmento de gene para preparar o vetor foi obtido através de PCR com o uso de DNA genômico da cepa de ATCC6872 como um modelo. Especificamente, o gene de xmpE foi amplificado de modo a conter 484 bp a montante do gene de xmpE com o uso de um par dos iniciadores de SEQ ID NOS: 5 e 6. O fragmento de gene de xmpE amplificado foi tratado com enzimas de restrição XbaI e SpeI. A clonagem foi realizada no sítio de XbaI de vetor pDZ (Documento de Patente nº KR 10-0924065 e Publicação Internacional nº 2008-033001) para preparar um vetor pDZ-xmpE. PCR foi então realizado no gene de xmpE com o uso de um par dos iniciadores de SEQ ID NOS: 6 e 7 de modo a preparar o vetor que contém duas cópias. Cada fragmento de DNA obtido desse modo foi clivado com a enzima de restrição de DNA SpeI, e clonado no vetor pDZ-xmpE clivado pela enzima de restrição de DNA XbaI de modo a prepare um vetor. O vetor que contém duas cópias do gene de xmpE foi chamado de “pDZ- xmpEX2”. EXEMPLO 3-1: AVALIAÇÃO DE CAPACIDADE DE PRODUZIR XMP DA

CEPA QUE TEM UM NÚMERO DE CÓPIA AUMENTADO DE xmpE

[075] A cepa KCCM-10530 foi transformada por eletroporação com o vetor pDZ- xmpEX2 preparado no Exemplo 3-1-1(com o uso do método de transformação de acordo com Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541-545), e a cepa que tem o vetor inserido no cromossomo devido à recombinação de sequência homóloga foi selecionada de um meio de cultura que contém 25 mg/l de canamicina. A cepa na qual um gene-alvo é inserido foi selecionada por cruzamento secundário da cepa primária selecionada. A inserção bem-sucedida do gene da cepa transformada definitiva foi confirmada por PCR com o uso de um par dos iniciadores de SEQ ID NOS: 8 e 9. A cepa selecionada com um número de cópia aumentado de xmpE foi chamado de “KCCM-10530-xmpEX2”, e sua capacidade de produzir XMP foi avaliada.

[076] De modo a medir a capacidade de produzir XMP da cepa, o mesmo método que no Exemplo 2-2 foi usado. A análise de HPLC foi realizada para medir a quantidade de XMP produzido após a conclusão da cultura, e o resultado é conforme mostrado na Tabela 2 abaixo. [TABELA 2] X Ren Cepa nº MP (g/l) dimento (%) 1 KCCM-10530 23,6 1,8 KCCM-10530; 1 26,1 xmpEX2 3,1

[077] As concentrações de XMP nos meios de cultura da cepa percursora Corynebacterium stationis KCCM-10530 e a cepa KCCM-10530-xmpEX2 que tem um número de cópia aumentado de xmpE foram comparadas; como resultado, conforme mostrado na Tabela 2 acima, a concentração de XMP da cepa KCCM-10530-xmpEX2 foi 1,3 g/l, indicando um aumento de concentração de cerca de 11% em comparação à cepa percursora sob as mesmas condições.

[078] Isso pode ser entendido como um resultado muito significativo através do qual tal é conformado que o aumento na quantidade de XMP produzido é devido à atividade de proteína de xmpE acentuada. EXEMPLO 3-2: ACENTUAÇÃO DE EXPRESSÃO DE xmpE ATRAVÉS

DE SUBSTITUIÇÃO DE PROMOTOR EXEMPLO -2-1: PREPARAÇÃO DE VETOR PARA SUBSTITUIR PROMOTOR DE xmpE

[079] De modo a confirmar se a capacidade de exportar XMP aumenta quando a atividade de xmpE, que é prevista para estar envolvida na capacidade de exportar XMP, é acentuada, um vetor foi preparado no qual o promotor de gene de xmpE é substituído por um promotor de forte expressão. Um fragmento de gene para preparar o vetor foi obtido por PCR com o uso de DNA genômico da cepa de ATCC6872 como um modelo.

[080] Pcj7, que é relatado como fortemente expresso em Corynebacterium stationis no Documento de Patente nº KR 10-0620092, foi usado como um promotor.

[081] De modo a amplificar um fragmento de gene Pcj7, um par dos iniciadores de SEQ ID NOS: 10 e 11 foi usado com o uso do DNA genômico da cepa de ATCC6872 como um modelo. Cada gene de xmpE foi amplificado por PCR com o uso de um par dos iniciadores de SEQ ID NOS: 12 e 13; e 14 e 15, respectivamente. A reação de PCR foi realizada sob as seguintes condições: desnaturação a 94° C por 5 minutos; 25 ciclos de desnaturação a 94° C por 30 segundos, anelamento a 52° C por 30 segundos, e polimerização a 72° C por 1 minuto. A polimerização final foi então realizada a 72° C por 5 minutos. Um modelo de polinucleotídeo de 2.3 kbp foi obtido realizando-se reação em cadeia de polimerase sobreprojetante com o uso dos três fragmentos de gene amplificados Pcj7, xmpE-1, e xmpE-2 como modelos. O fragmento de gene obtido foi clivado por uma enzima de restrição XbaI, e foi clonado no vetor linear pDZ clivado com XbaI com o uso de T4 ligase para preparar um vetor “pDZ-Pcj7/xmpE”. EXEMPLO -2-2: PREPARAÇÃO DE CEPA QUE TEM PROMOTOR DE xmpE SUBSTITUÍDO E AVALIAÇÃO DE SUA CAPACIDADE DE PRODUZIR XMP

[082] A cepa KCCM10530 foi transformada por eletroporação com O vetor pDZ- Pcj7/xmpE preparado no Exemplo 3-2-1 (com o uso do método de transformação de acordo com Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541-545), e a cepa que tem o vetor inserido no cromossomo devido à recombinação de sequência homóloga foi selecionada de um meio de cultura que contém 25 mg/l de canamicina. A cepa na qual um gene-alvo é acentuado foi selecionada por cruzamento secundário da cepa primária selecionada. A inserção bem-sucedida do promotor de gene da cepa transformada definitiva foi confirmado por PCR com o uso de um par dos iniciadores de SEQ ID NOS: 16 e 17. A cepa na qual o promotor é substituído com um promotor mais forte foi chamada de “KCCM-10530-Pcj7/xmpE”, e sua capacidade de produzir XMP foi avaliada.

[083] De modo a medir a capacidade de produzir XMP da cepa, o mesmo método que no Exemplo 2-2 foi usado. A análise de HPLC foi realizada para medir a quantidade de XMP produzido após a conclusão da cultura, e o resultado é conforme mostrado na Tabela 3 abaixo. [TABELA 3]

R

XMP Cepa nº endimento (g/l) (%) 2 KCCM-10530 11,8 3,6 KCCM-10530- 2 12,5 Pcj7/xmpE 5,0

[084] As concentrações de XMP nos meios de cultura da cepa percursora Corynebacterium stationis KCCM-10530 e a cepa KCCM-10530-Pcj7/xmpE que tem uma expressão de xmpE acentuada devido ao promotor mais forte foram comparados; como resultado, conforme mostrado na Tabela 3 acima, a concentração de XMP da cepa KCCM-10530-Pcj7/xmpE foi 0,7 g/l, indicando um aumento de concentração de cerca de 6% em comparação à cepa percursora sob as mesmas condições.

[085] Isso pode ser entendido como um resultado muito significativo através do qual tal é conformado que o aumento na quantidade de XMP produzido é devido à atividade de proteína de xmpE acentuada. EXEMPLO 3-3: SUBSTITUIÇÃO DE CÓDON DE INÍCIO DE xmpE EXEMPLO -3-1: PREPARAÇÃO DE VETOR PARA SUBSTITUIR CÓDON DE INÍCIO DE xmpE

[086] De modo a confirmar se a capacidade de excretar XMP aumenta quando a expressão da proteína de xmpE, que é prevista para ser envolvida na capacidade de excretar XMP, é acentuada, um vetor foi preparado no qual o códon de início gtg é substituído por atg. Um fragmento de gene para preparar o vetor foi obtido por PCR com o uso de um DNA genômico da cepa de ATCC6872 como um modelo. De modo a preparar um vetor que tem o códon de início gtg substituído por atg, dois fragmentos de gene A e B foram obtidos com o uso de pares dos iniciadores de SEQ ID NOS: 18 e 19; e 20 e 21, respectivamente. A reação de PCR foi realizada sob as condições a seguir: 25 ciclos de desnaturação a 94° C por 5 minutos; desnaturação a 94° C por 30 segundos; anelamento a 52° C por 30 segundos; e polimerização a 72° C por 1 minuto. A polimerização final foi então realizada a 72° C por 5 minutos. Como resultado, cerca de 0,7 kbp e 1 kbp polinucleotídeos foram obtidos para fragmentos A e B, respectivamente. Com o uso dos dois fragmentos como modelos, PCR foi conduzido com o uso de um par dos iniciadores de SEQ ID NOS: 18 e 21 para obter um PCR resultante de cerca de 1,7 kbp (doravante, “fragmento de g1a”). A polimerização foi realizada sob as condições a seguir: 25 ciclos de desnaturação a 94° C por 5 minutos; desnaturação a 94° C por 30 segundos; anelamento a 55° C por 30 segundos; e polimerização a 72° C por 120 segundos. A polimerização final foi então realizada a 72° C por 7 minutos.

[087] O fragmento de gene obtido foi clivado por uma enzima de restrição XbaI, e foi clonado no vetor linear pDZ clivado com XbaI com o uso de T4 ligase para preparar um vetor “pDZ-xmpE (g1a)”. EXEMPLO -3-2: PREPARAÇÃO DE CEPA QUE TEM CÓDON DE INÍCIO DE xmpE SUBSTITUÍDO E AVALIAÇÃO DE SUA CAPACIDADE DE PRODUZIR

XMP

[088] A cepa KCCM-10530 foi transformada por eletroporação com o vetor pDZ- xmpE(g1a) preparado no Exemplo 3-3-1(com o uso do método de transformação de acordo com Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541-545), e a cepa que tem o vetor inserido no cromossomo devido à recombinação de sequência homóloga foi selecionada de um meio de cultura que contém 25 mg/l de canamicina. A cepa na qual um gene-alvo é acentuado foi selecionada por cruzamento secundário da cepa primária selecionada. A inserção bem-sucedida do promotor de gene da cepa transformada definitiva foi confirmado por PCR com o uso de um par dos iniciadores de SEQ ID NOS: 18 e 21, seguido pela análise da sequência de nucleotídeos substituída por um método de análise de sequência de nucleotídeos. A cepa selecionada na qual códon de início de xmpE é substituída por atg foi chamada de CJX1662, e sua capacidade de produzir XMP foi avaliada.

[089] De modo a medir a capacidade de produzir XMP da cepa, o mesmo método que no Exemplo 2-2 foi usado. A análise de HPLC foi realizada para medir a quantidade de XMP produzido após a conclusão da cultura, e o resultado é conforme mostrado na Tabela 4 abaixo. [TABELA 4] XM Re Cepa nº P (g/l) ndimento (%) 11, 23, KCCM-10530 8 6 14, 28, CJX1662 1 2

[090] As concentrações de XMP nos meios de cultura da cepa percursora

Corynebacterium stationis KCCM-10530 e a cepa CJX1662 que tem o códon de início substituído de xmpE foram comparadas; como resultado, conforme mostrado na Tabela 4 acima, a concentração de XMP da cepa CJX1662 foi 2,3 g/l, indicando um aumento de concentração de cerca de 20% em comparação à cepa percursora sob as mesmas condições.

[091] Isso pode ser entendido como um resultado muito significativo através do qual tal é conformado que o aumento na quantidade de XMP produzido é devido à atividade de proteína de xmpE acentuada.

[092] Além disso, a cepa CJX1662 preparada acima foi depositada no Centro de Cultura Coreano de Micro-organismos (KCCM), uma autoridade depositária internacional sob o Tratado de Budapeste em 11 de abril de 2018, como Nº de Acesso KCCM12248P. EXEMPLE 3-4 PREPARAÇÃO DE CEPA QUE TEM xmpE ACENTUADA

COM BASE EM LINHAGEM CELULAR QUE PRODUZ XMP DE TIPO SELVAGEM EXEMPLO -4-1: PREPARAÇÃO DE CEPA QUE TEM xmpE

ACENTUADA COM BASE EM LINHAGEM CELULAR QUE PRODUZ XMP DE TIPO SELVAGEM

[093] Uma cepa que tem capacidade de produzir produtividade de XMP foi preparada enfraquecendo-se atividades de adenil succinato sintetase e XMP de- hidrogenase, que pertencem às vias de decomposição de XMP, em uma cepa de tipo selvagem de ATCC6872. De modo a atenuar as atividades das duas enzimas, uma cepa foi preparada na qual ‘a’, o primeiro nucleotídeo da sequência de nucleotídeos de purA e guaA, os genes respectivamente que codificam as duas enzimas, é substituído por ‘t’. Mais especificamente, a cepa preparada enfraquecendo-se a expressão dos dois genes na cepa de ATCC6872 foi chamada de CJX1663.

[094] A cepa CJX1663 preparada foi transformada por eletroporação com o vetor pDZ-xmpE(g1a) preparado no Exemplo 3-3-2, e a cepa que tem o vetor inserido no cromossomo devido à recombinação de sequência homóloga foi selecionada dentre um meio de cultura que contém 25 mg/l de canamicina. A cepa na qual um gene-alvo é acentuado foi selecionada por cruzamento secundário da cepa primária selecionada. A inserção bem-sucedida do promotor de gene da cepa transformada definitiva foi confirmado por PCR com o uso de um par dos iniciadores de SEQ ID NOS: 18 e 21.

[095] A cepa na qual o códon de início de xmpE selecionado é substituído por atg foi chamada de “CJX1663_xmpE(g1a)”, e sua capacidade de produzir XMP foi avaliada.

[096] A análise de HPLC foi realizada para medir a quantidade de XMP produzido após a conclusão da cultura, e o resultado é conforme mostrado na Tabela 5 abaixo. [TABELA 5] X Re Cepa nº MP (g/l) ndimento (%) 2 CJX1663 4,2 ,1 2 CJX1663_ xmpE(g1a) 5,6 ,8

[097] As concentrações de XMP nos meios de cultura da cepa percursora Corynebacterium stationis CJX1663 e a cepa CJX1663_xmpE(g1a) que tem o códon de início substituído de xmpE foram comparadas; como resultado, conforme mostrado na Tabela 5 acima, a concentração de XMP da cepa CJX1663_xmpE(g1a) foi 2,8 g/l, indicando um aumento de concentração de cerca de 33% em comparação à cepa percursora sob as mesmas condições.

[098] Foi confirmado a partir do resultado que, acentuando-se a atividade da proteína (xmpE) da presente revelação, que exporta monofosfato de 5′-xantosina, a produtividade de XMP pode ser aumentada.

[099] Entretanto, as sequências de iniciador usadas na presente revelação são conforme mostrado na Tabela 6. [TABELA 6] S Sequência

EQ ID NO 3 GTCAAACTCTTTACGCCGACG 4 CGACAACACCAACAGATACTGC 5 ATGCTCTAGACTAGATCTTCTCGACGGGCAG 6 ATGATACTAGTCCTTGGGGACTTCGCGTGTCG 7 ATGATACTAGTCTAGATCTTCTCGACGGGCAG 8 TTCGGCTCAGCATTTTCCAC 9 CAATAGTGGTCGCGATGACG 1

GCAGTAAGGAGAATCAGAAACATCCCAGCGCTACTA 0 1 ACCTCTTCGGTTGTGTGCACGAGTGTTTCCTTTCGTT 1 GGG 1

ATGCTCTAGATCCAGTGTGGTTAAGAAGTCG 2 1

CGCTGGGATGTTTCTGATTCTCCTTACTGCAGT 3 1 GTACCCAACGAAAGGAAACACTCGTGCACACAACCG 4 AAGAGGT 1

ATGCTCTAGATTATTGAGCCAGAACCATGG 5 1

CTAGATCTTCTCGACGGGCAG 6 1

CAATAGTGGTCGCGATGACG 7 1

ATGCTCTAGATCCAGTGTGGTTAAGAAGTCG 8 1 GACCTCTTCGGTTGTGTGCATGATTCTCCTTACTGCA 9 GTTA

2 TAACTGCAGTAAGGAGAATCATGCACACAACCGAAG 0 AGGTC 2

ATGCTCTAGACTCGCTCTTGTCGACAACAC 1

[0100] As pessoas de habilidade comum na técnica reconhecerão que a presente revelação pode ser incorporada em outras formas específicas sem que se afaste de seu espírito ou suas características essenciais. Em relação a isso, as modalidades descritas devem ser consideradas em todos os aspectos somente como ilustrativas e não como restritivas. Portanto, o escopo da presente revelação é, portanto, indicado pelas reivindicações anexas em vez da descrição supracitada. Todas as mudanças que são abrangidas pelo significado e alcance de equivalência das reivindicações devem ser abrangidas pelo escopo da presente revelação.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz monofosfato de 5′-xantosina caracterizado por a atividade de uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ser acentuada

2. Micro-organismo do gênero Corynebacterium, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a proteína ser codificada por um gene que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1.

3. Micro-organismo do gênero Corynebacterium, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a acentuação da atividade ser alcançada por um aumento no número de cópias de polinucleotídeos que codificam a proteína, acentuação de atividade de promotor, substituição de um códon de início ou uma combinação dos mesmos.

4. Micro-organismo do gênero Corynebacterium, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz monofosfato de 5′-xantosina ser Corynebacterium stationis.

5. Método para produzir monofosfato de 5′-xantosina caracterizado por compreender: cultivar o micro-organismo do gênero Corynebacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 em um meio de cultura; e recuperar o monofosfato de 5′-xantosina do micro-organismo ou do meio de cultura.

6. Método para produzir monofosfato de 5′-xantosina, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz monofosfato de 5′-xantosina ser Corynebacterium stationis.