BR112016016773B1

BR112016016773B1 - Micro-organismos recombinantes do gênero escherichia com produtividade de l-treonina e método de produzir l-treonina usando os mesmos

Info

Publication number: BR112016016773B1
Application number: BR112016016773-2A
Authority: BR
Inventors: Hyung Joon Kim; Su Yon Kwon; Eun Sung Koh; Ji Sun Lee; Keun Cheol Lee; Young Bin Hwang; Hyeong Pyo Hong
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2013-02-13
Filing date: 2014-04-25
Publication date: 2022-10-25
Also published as: JP6412147B2; JP2017509326A; KR20140102393A; US10053698B2; BR112016016773A2; WO2014126384A1; JP2018161154A; US20170002365A1

Abstract

MICRO-ORGANISMOS RECOMBINANTES DO GÊNERO ESCHERICHIA COM PRODUTIVIDADE DE L- TREONINA E MÉTODOS DE PRODUZIR L-TREONINA USANDO OS MESMOS. A presente invenção refere-se a uma cepa mutante de Escherichia coli tendo produtividade de L-treonina melhorada pela introdução de permease derivada de bactérias corineformes, e um método de produzir L-treonina usando a mesma.

Description

Campo Técnico

[001] A presente invenção refere-se a um micro-organismo recombinante do gênero Escherichia tendo produtividade de L-treonina melhorada, que é obtida modificando-se um micro-organismo do gênero Escherichia de modo a expressar a permease de origem de Corynebacterium, e a um método de produzir L-treonina usando o micro-organismo recombinante.

Técnica Antecedente

[002] L-treonina, um tipo de aminoácido essencial, é amplamente usada como um aditivo para ração e alimento para animais, e como fluidos e materiais sintéticos para uso médico e farmacêutico. L-treonina é principalmente produzida por fermentação usando Escherichia coli, Serratia, Providencia ou Corynebacterium, desenvolvidos por métodos de mutação artificiais ou métodos de recombinação genética, ou cepas mutantes artificiais destes. Genes relacionados à biossíntese de treonina e vários métodos para aumentar a expressão destes genes foram desenvolvidos, mas a demanda para um método capaz de produzir L-treonina em rendimento alto em uma maneira mais eficaz de custo ainda existe.

[003] É conhecido que a proteína GalP que é codificada por galP em E. coli é galactose permease que transporta uma variedade de monossacarídeos, incluindo galactose e glicose, em células (V. Hernandez-Montalvo F. Valle F. Bolivar G. Gosset, Appl Microbiol Biotechnol (2001) 57:186 - 191). Além disso, é conhecido que a proteína GalP também age como glicose permease (Venter, Henrietta et al., Biochemical Journal (2002) 363:243 - 252). Foi relatado que, quando a expressão do gene galP em E. coli é aumentada, por exemplo, aumentando-se o número de cópia do gene, a produção de treonina na E. coli é aumentada (WO 2004/087937).

[004] Foi relatado que inositol permease que é codificada pelos genes iolT1 e iolT2 em Corynebacterium glutamicum também pode agir como glicose permease (Ikeda et al., Appl Microbiol Biotechnol (2011) 90:1443 - 1451). Também foi relatado que os genes iolT1 e iolT2 têm homologia alta com o gene galP de E. coli. Entretanto, a correlação entre inositol permease e produção de treonina ainda não foi relatada.

[005] Os presentes inventores descobriram que, quando o gene iolT1 e/ou gene iolT2 que codificam inositol permease em microorganismos do gênero Corynebacterium são introduzidos em um microorganismo da Escherichia Coli, o micro-organismo do gênero Escherichia tem produtividade de L-treonina melhorada, desse modo concluindo a presente invenção.

Divulgação Problema Técnico

[006] Portanto, é um objetivo da presente invenção fornecer um micro-organismo recombinante do gênero Escherichia tendo produtividade de L-treonina melhorada, que é obtido modificando-se um micro-organismo da Escherichia de modo a expressar a permease de origem de Corynebacterium.

[007] Um outro objetivo da presente invenção é fornecer um método de produzir L-treonina em rendimento alto usando o microorganismo recombinante.

Solução Técnica

[008] De modo a realizar o objetivo acima, a presente invenção fornece um micro-organismo recombinante do gênero Escherichia, obtido transformando-se um micro-organismo do gênero Escherichia de modo a expressar a permease de origem de Corynebacterium glutamicum.

[009] A presente invenção também fornece um método de produzir L-treonina em rendimento alto usando o micro-organismo recombinante.

Efeitos Vantajosos

[0010] De acordo com a presente invenção, a taxa de crescimento de uma cepa é muito aumentada comparado àquelas de cepas convencionais de modo que a cepa possa produzir L-treonina em rendimento alto. Assim, a produção de L-treonina industrialmente significante pode ser muito aumentada.

Descrição dos Desenhos

[0011] A figura 1 mostra o alinhamento de homologia das sequências de aminoácido do galP de origem de E. coli e do iolT1 e iolT2 de origem de Corynebacterium glutamicum.

[0012] A figura 2 mostra um mapa de clivagem do vetor recombinante pCC1BAC-iolT1 compreendendo o gene iolT1 de origem de Corynebacterium glutamicum.

[0013] A figura 3 mostra um mapa de clivagem do vetor recombinante pCC1BAC-iolT2 compreendendo o gene iolT2 de origem de Corynebacterium glutamicum.

[0014] A figura 4 mostra um mapa de clivagem do vetor recombinante pCC1BAC-iolT1-iolT2 compreendendo os genes iolT1 e iolT2 de origem de Corynebacterium glutamicum.

Modo para a Invenção

[0015] A presente invenção fornece um micro-organismo recombinante do gênero Escherichia tendo produtividade de L-treonina melhorada, que é obtido transformando-se um micro-organismo do gênero Escherichia de modo a expressar a permease de origem de Corynebacterium.

[0016] Na presente invenção, a permease de origem de Corynebacterium pode ser de origem de Corynebacterium glutamicum, e preferivelmente origem de ATCC 13032 de Corynebacterium glutamicum, mas não é limitada a isto.

[0017] O mais preferivelmente, a permease de origem de Corynebacterium pode ter uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. A permease de origem de Corynebacterium tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 é codificada pelo gene iolT1 tendo uma sequência de nucleotídeo representada pela SEQ ID NO: 3, e a permease de origem de Corynebacterium tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 é codificada pelo gene iolT2 tendo uma sequência de nucleotídeo representada pela SEQ ID NO: 4.

[0018] Além disso, mutantes tendo uma mutação nas sequências de aminoácido das proteínas acima, ou permeases tendo uma homologia de pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, e particular e preferivelmente pelo menos 97%, às sequências de aminoácido das proteínas acima, também são incluídos no escopo da presente invenção, contanto que eles sejam proteínas tendo atividade de permease como divulgado na presente invenção.

[0019] Como usado aqui, o termo "homologia" refere-se à identidade entre duas sequências de aminoácido. A homologia pode ser determinada usando métodos bem conhecidos àqueles habilitados na técnica, por exemplo, BLAST 2.0 que calcula parâmetros tais como contagem, identidade ou similaridade.

[0020] Em um exemplo da presente invenção, genes tendo homologia ao gene galP que codifica glicose permease em E. coli foram identificados a partir de ATCC 13032 de Corynebacterium glutamicum. Como um resultado, a sequência de aminoácido codificada por iolT1 (Sequência de Referência de NCBI: NC_006958,1, cg0223) derivado de ATCC 13032 de Corynebacterium glutamicum mostrou uma homologia de 34% à sequência de aminoácido de galP de E. coli, e a sequência de aminoácido codificada por iolT2 (Sequência de Referência de NCBI: NC_006958,1, cg3387) mostrou uma homologia de 31% à sequência de aminoácido do galP de E. coli (ver a figura 1).

[0021] O galP de E. coli é conhecido, e pode ser obtido da sequência genômica de E. coli (Acesso no AAC75876) descrito em Blattner et al., Science 277: 1453 - 1462 (1997), e também pode ser obtido de bases de dados tais como a base de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI) e a base de dados do DNA Databank of Japan (DDBJ).

[0022] O micro-organismo do gênero Escherichia tendo produtividade de L-treonina de acordo com a presente invenção pode ser E. coli ou um mutante de E. coli que produz L-treonina. Mais preferivelmente, o micro-organismo do gênero Escherichia tendo produtividade de L-treonina é KCCM 10541 de E. coli (Patente Coreana No 10-0576342) derivado de KFCC 10718 de E. coli (Patente Coreana No 10-0058286). KCCM 10541 de E. coli é uma cepa que produz L- treonina que tem um fenótipo auxotrófico de metionina, resistência a um análogo de treonina, resistência a um análogo de lisina, resistência a um análogo de isoleucina, e resistência a um análogo de metionina, e compreende duas ou mais cópias de gene de fosfoenol piruvato carboxilase (gene de ppc) e operon de treonina introduzido no cromossomo.

[0023] Um método que permite que o gene que codifica permease seja expressado no micro-organismo do gênero Escherichia tendo produtividade de L-treonina de acordo com a presente invenção não é especificamente limitado. Por exemplo, de modo a permitir a expressão do gene que codifica permease, um vetor recombinante compreendendo o gene que codifica permease pode ser transformado em um micro-organismo, ou o número de cópia do gene que codifica permease pode ser aumentado, ou uma sequência reguladora de expressão do gene que codifica permease pode ser modificada. Além disso, dois ou mais destes métodos também podem ser usados em combinação. Geralmente, métodos para aumentar o nível de expressão do gene relacionado à biossíntese de treonina incluem um método de aumentar o número de cópia do gene em um único micro-organismo. Para isto, um plasmídeo cujo número de cópia é mantido em um nível alto é usado (Sambrook et al., Molecular cloning, 2a edição, 1989, 1,3 - 1,5). Especificamente, um gene desejado é inserido em um plasmídeo cujo número de cópia é mantido em um nível alto, e o plasmídeo recombinante resultante é transformado em um micro-organismo. Neste caso, o efeito de aumentar o número de cópia do gene ao número de cópia do plasmídeo por micro-organismo pode ser obtido. Além disso, um método de inserir o gene relacionado à biossíntese de treonina em DNA cromossômico também pode ser usado.

[0024] Em uma modalidade , a presente invenção fornece um vetor recombinante compreendendo o gene iolT1 e/ou gene iolT2 de origem de Corynebacterium glutamicum, e um micro-organismo recombinante do gênero Escherichia tendo produtividade de L-treonina melhorada, que é obtido por transformação com o vetor recombinante.

[0025] Como usado aqui, o termo "vetor" refere-se a uma construção de DNA contendo a sequência de nucleotídeo de um gene que codifica proteína alvo operavelmente ligado a uma sequência reguladora adequada de modo a ser capaz de expressar o gene alvo em uma célula hospedeira adequada. A sequência reguladora inclui um promotor capaz de iniciar a transcrição, qualquer operador para regular esta transcrição, uma sequência que codifica um sítio de ligação ao ribossomo de mRNA adequado, e uma sequência para regular a terminação da transcrição e tradução. Uma vez transformado em um hospedeiro adequado, o vetor pode replicar ou funcionar independentemente do genoma do hospedeiro, ou pode integrar no genoma propriamente dito.

[0026] O vetor que é usado na presente invenção não é especificamente limitado e pode ser qualquer vetor conhecido na técnica, contanto que ele possa replicar em um hospedeiro. Exemplos dos vetores comumente usados podem incluir plasmídeos, cosmídeos, vírus, e bacteriófagos naturais ou recombinantes.

[0027] A presente invenção fornece um vetor recombinante compreendendo o gene iolT1 de origem de Corynebacterium glutamicum. Preferivelmente, o recombinante é pCC1BAC-iolT1. Mais preferivelmente, o vetor recombinante tem um mapa de clivagem mostrado na figura 2.

[0028] A presente invenção também fornece um vetor recombinante compreendendo o gene iolT2 de origem de Corynebacterium glutamicum. Preferivelmente, o vetor recombinante é pCC1BAC-iolT2. Mais preferivelmente, o vetor recombinante tem um mapa de clivagem mostrado na figura 3.

[0029] A presente invenção também fornece um vetor recombinante para expressar simultaneamente os genes iolT1 e iolT2 de origem de Corynebacterium glutamicum. Preferivelmente, o vetor recombinante é pCC1BAC-iolT1-iolT2. Mais preferivelmente, o vetor recombinante tem um mapa de clivagem mostrado na figura 4.

[0030] Como usado aqui, o termo "transformação" significa introduzir um vetor compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo em uma célula hospedeira de modo a ser capaz de expressar uma proteína codificada pelo polinucleotídeo na célula hospedeira. Os polinucleotídeos transformados incluem todos os genes inseridos no cromossomo da célula hospedeira ou localizados fora do cromossomo, contanto que eles possam ser expressados na célula hospedeira. Além disso, os polinucleotídeos incluem DNA e RNA, que codificam a proteína alvo. Contanto que o polinucleotídeo possa ser introduzido na célula hospedeira e expressado nesta, o gene pode ser introduzido em qualquer forma. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeira na forma de um cassete de expressão que é uma construção de polinucleotídeo incluindo todos os elementos para expressar o gene. O cassete de expressão inclui um promotor que é operavelmente ligado ao gene, um sinal de terminação da transcrição, um sítio de ligação ao ribossomo, e um sinal de terminação da tradução. O cassete de expressão pode estar na forma de um vetor de expressão capaz de autorreplicação. O polinucleotídeo também pode ser introduzido na célula hospedeira por si só, e ser operavelmente ligado à sequência necessária para a expressão na célula hospedeira.

[0031] Em um aspecto, a presente invenção fornece um micro organismo do gênero Escherichia tendo produtividade de L-treonina melhorada, em que o micro-organismo é obtido por transformação com um vetor recombinante compreendendo o gene iolT1 ou gene iolT2 de origem de Corynebacterium glutamicum.

[0032] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um micro-organismo do gênero Escherichia tendo produtividade de L- treonina melhorada, em que o micro-organismo é obtido por transformação com um vetor recombinante compreendendo o gene iolT1 e gene iolT2 de origem de Corynebacterium glutamicum.

[0033] Preferivelmente, o micro-organismo recombinante transformado do gênero Escherichia pode ser E. coli. Mais preferivelmente, o micro-organismo pode ser CA03-0230 de E. coli (KCCM11370P), CA03-0260 de E. coli (KCCM11369P) ou CA03-0231 de E. coli (KCCM11371P).

[0034] As cepas produtoras de treonina, recombinantes da presente invenção, como descrito acima, compreendem o gene iolT1 e/ou iolT2 de origem de Corynebacterium introduzido em E. coli, em que o gene introduzido pode aumentar a expressão de permease na cepa de E. coli para desse modo aumentar muito a taxa de consumo de açúcar e taxa de crescimento da cepa. Assim, as cepas da presente invenção podem produzir L-treonina em concentração alta.

[0035] A presente invenção também fornece um método para produzir L-treonina, o método compreendendo as etapas de: cultivar o micro-organismo recombinante transformado do gênero Escherichia; e separar L-treonina da cultura do micro-organismo.

[0036] O micro-organismo recombinante do gênero Escherichia de acordo com a presente invenção pode ser cultivado por qualquer método convencional. Especificamente, o micro-organismo pode ser cultivado inoculando-o em um meio que total ou parcialmente contém sacarose ou glicose como uma fonte de carbono. O processo de cultura pode ser realizado em meios e condições de cultura adequados conhecidos na técnica. Este processo de cultura pode ser facilmente modificado por qualquer pessoa habilitada na técnica dependendo do tipo de cepa selecionado. Exemplos do processo de cultura incluem, mas não são limitados a, cultura descontínua, cultura contínua, e cultura semicontínua. O meio que é usado em cultura do micro-organismo da presente invenção deveria satisfazer apropriadamente as necessidades do micro-organismo da presente invenção.

[0037] Especificamente, o meio que é usado na presente invenção contém sacarose ou glicose como uma principal fonte de carbono. Além disso, melaço contendo uma concentração alta de sacarose também pode ser usado como uma fonte de carbono. Além disso, quantidades adequadas de várias fontes de carbono podem ser usadas. Preferivelmente, glicose purificada é usada. Exemplos de fontes de nitrogênio que podem ser usadas na presente invenção incluem fontes de nitrogênio orgânicas tais como peptona, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, milhocina, e farinha de soja, e fontes de nitrogênio inorgânicas tais como ureia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio, e nitrato de amônio. Preferivelmente, peptona é usada. Estas fontes de nitrogênio podem ser usadas sozinhas ou em combinação. O meio pode conter fosfato de potássio monobásico, fosfato de potássio dibásico e sais contendo sódio correspondentes, como fontes de fósforo. Além disso, o meio pode conter um sal metálico tal como sulfato de magnésio ou sulfato de ferro. Além disso, o meio pode conter aminoácidos, vitaminas e precursores adequados. Estes meios ou precursores podem ser adicionados ao meio em uma maneira descontínua ou contínua.

[0038] O meio de cultura é tipicamente mantido em uma temperatura variando de 27 °C a 37 °C, e preferivelmente de 30 °C a 37 °C. A cultura do micro-organismo pode ser continuada até que o nível desejado da substância útil seja obtido. Preferivelmente o período de cultura é de 10 a 100 horas.

[0039] Em seguida, a presente invenção será descrita em mais detalhe com referência aos exemplos. Deve ser entendido, entretanto, que estes exemplos são para propósitos ilustrativos apenas e não são intencionados a limitar o escopo da presente invenção.

Exemplos Exemplo Comparativo: Construção de cepas recombinantes por transformação com vetor recombinante compreendendo gene galP de E. coli e comparação da produtividade de L-treonina

[0040] Foi relatado que galactose permease em E. coli funciona como glicose permease, e quando a expressão de galactose permease é aumentada, por exemplo, aumentando-se o número de cópia de galactose permease, a produtividade de treonina da cepa de E. coli é aumentada (WO 2004/087937). Para verificar este relato, uma cepa recombinante foi construída aumentando-se o número de cópia do gene galP na cepa KCCM 10541 que produz L-treonina, e a produtividade de

L-treonina desta foi avaliada. (1) Construção do vetor recombinante compreendendo gene galP de E. coli

[0041] Para obter um fragmento de 1,4 kb compreendendo a estrutura de leitura aberta do gene galP de E. coli, o DNA genômico da cepa W3110 de E. coli do tipo selvagem foi extraído usando um sistema Genomic-tip (Qiagen).

[0042] Uma reação em cadeia de polimerase (em seguida abreviada como "PCR") foi realizada usando o DNA genômico (gDNA) como um padrão. A reação PCR foi realizada usando iniciadores das SEQ ID NOS: 9 e 10 sob as condições seguintes: 30 ciclos, cada um consistindo em desnaturação a 94 °C por 30 s, recozimento a 56 °C por 30 s, e alongamento a 72 °C por 50 s. O produto de PCR (em seguida referido como "fragmento galP") foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 0,8%, e depois uma faixa tendo um tamanho desejado foi eluída.

[0043] O fragmento galP obtido foi tratado com a enzima de restrição HindIII, e depois ligado com um vetor de pCC1BAC linear (EPICENTRE, em seguida o mesmo) tratado com a mesma enzima de restrição HindIII de modo que ele esteja na mesma orientação com o promotor lac do vetor.

[0044] Células DH5a de E. coli foram transformadas com o vetor construído, e depois plaqueadas em um meio sólido de LB contendo cloranfenicol e cultivadas durante a noite a 37 °C. Uma alça de platina da colônia cultivada foi inoculada em 3 ml de um meio líquido de LB contendo cloranfenicol e cultivada durante a noite, e depois DNA plasmídico foi recuperado usando um kit de minipreparação de plasmídeo (QIAGEN, em seguida o mesmo). O tamanho do vetor recombinante foi determinado por tratamento com a enzima de restrição HindIII (dados não mostrados), e o clone foi identificado realizando-se PCR usando iniciadores das SEQ ID NOS: 11 e 12 sob as condições seguintes: desnaturação a 94 °C por 30 s, recozimento a 56 °C por 30 s, e alongamento a 72 °C por 60 s. O vetor recombinante foi denominado pCC1BAC-galP (dados não mostrados).

[0045] Além disso, o fragmento galP foi ligado com um vetor de pCL1920 linear tratado com a mesma enzima de restrição HindIII de modo que ele estaria na mesma orientação como o promotor lac do vetor. Células DH5a de E. coli foram transformadas com o vetor construído, e depois plaqueadas em um meio de LB contendo espectinomicina e cultivadas durante a noite a 37 °C. Uma alça de platina da colônia cultivada foi inoculada em 3 ml de um meio líquido de LB contendo espectinomicina e cultivadas durante a noite, e depois DNA plasmídico foi recuperado usando um kit de minipreparação de plasmídeo. O tamanho do vetor recombinante foi determinado por tratamento com a enzima de restrição HindIII (dados não mostrados), e o clone foi identificado realizando-se PCR usando iniciadores das SEQ ID NOS: 13 e 14 sob as condições seguintes: desnaturação a 94 °C por 30 s, recozimento a 56 °C por 30 s, e alongamento a 72 °C por 60 s. O vetor recombinante foi denominado pCL1920-galP (dados não mostrados).

(2) Construção de cepa recombinante por transformação com vetor recombinante

[0046] O vetor recombinante pCC1BAC-galP foi introduzido na cepa que produz L-treonina de E. coli KCCM10541 como uma cepa precursora por eletroporação, e a cepa de E. coli foi plaqueada em um meio sólido contendo 15 ,^/ml de cloranfenicol para selecionar uma única colônia. Da mesma maneira como acima, o vetor recombinante pCL1920-galP foi introduzido na cepa que produz L-treonina de E. coli KCCM10541 por eletroporação, e a cepa de E. coli foi plaqueada em um meio sólido contendo 50 ,^/ml de espectinomicina para selecionar uma única colônia.

[0047] As cepas selecionadas foram denominadas KCCM10541/pCC1BAC-galP e KCCM10541/pCL1920-galP, respectivamente.

(3) Comparação da produtividade de L-treonina entre cepas recombinantes

[0048] As cepas recombinantes construídas na seção (2) acima foram cultivadas usando o meio de título de treonina mostrado na tabela 1 abaixo em um frasco Erlenmeyer de acordo com o método descrito abaixo, e as produtividades de L-treonina das cepas recombinantes foram examinadas. Tabela 1

[0049] A avaliação de título foi realizada usando a cepa precursora de E. coli KCCM10541 e as cepas KCCM10541/pCC1BAC-galP e KCCM10541/pCL1920-galP. Quando introduzido em cada uma das cepas, o vetor recombinante pCC1BAC-galP é expressado como 1 cópia, e o vetor recombinante pCL1920-galP é expressado como 5 cópias. O efeito do aumento no número de cópia foi examinado.

[0050] Cada uma das cepas recombinantes tendo diferentes caracteres genéticos foi cultivada durante a noite em meio sólido de LB em uma incubadora a 33 °C, depois do que uma alça de platina de cada uma das cepas recombinantes foi inoculada em 25 ml de um meio de título contendo glicose tendo a composição mostrada na tabela 1 acima, e depois foi cultivada em uma incubadora a 33 °C e 200 rpm por 48 horas. Os resultados da cultura são mostrados na tabela 2 abaixo. Tabela 2

[0051] Como um resultado, como pode ser observado na tabela 2 acima, a cepa precursora de E. coli KCCM10541 produziu 32,0 g/L de L-treonina quando cultivada por 48 horas, mas a cepa recombinante de E. coli KCCM10541/pCC1BAC-galP construída no Exemplo Comparativo produziu 31,1 g/L de L-treonina, e a cepa recombinante KCCM10541/pCL1920-galP produziu 30,8 g/L de L-treonina. Assim, as produtividades de L-treonina destas cepas recombinantes foram reduzidas em 0,9 g/L e 1,2 g/L, respectivamente, comparado àquela da cepa precursora.

[0052] Como pode ser observado na tabela 2 acima, a cepa precursora de E. coli KCCM10541 mostrou uma taxa de consumo de açúcar de 0,753 g/L/h, mas KCCM10541/pCC1BAC-galP mostrou uma taxa de consumo de açúcar de 0,793 g/L/h, e KCCM 10541/pCL1920-galP mostrou uma taxa de consumo de açúcar de 0,816 g/L/h. As taxas de consumo de açúcar destas cepas recombinantes aumentaram em 5,3% e 8,4%, respectivamente, comparado àquela da cepa precursora.

Exemplo 1: Construção do vetor recombinante compreendendo iolTI e/ou iolT2 de origem de Corynebacterium (1) Comparação da homologia com glicose permease (galP) de E. coli'

[0053] Foi relatado que os genes iolT1 e iolT2 que codificam inositol permease em Corynebacterium glutamicum têm homologia ao gene galP que codifica glicose permeasse de E. coli. Genes tendo homologia ao gene galP de E. coli foram identificados a partir do genoma de ATCC 13032 de Corynebacterium glutamicum do tipo selvagem e comparados, e os resultados da comparação são mostrados na figura 1. A sequência de aminoácido codificada por iolT1 de Corynebacterium glutamicum mostrou uma homologia de 34% à sequência de aminoácido codificada por galP de E. coli, e a sequência codificada por iolT2 de Corynebacterium glutamicum mostrou uma homologia de 31% à sequência de aminoácido codificada por galP de E. coli.

(2) Preparação do fragmento de gene iolT1

[0054] Para obter um fragmento de 1,5 kb compreendendo a estrutura de leitura aberta do gene iolT1 da SEQ ID NO: 3, o DNA genômico de ATCC 13032 de Corynebacterium glutamicum foi extraído usando um sistema Genomic-tip (Qiagen).

[0055] Uma reação em cadeia de polimerase foi realizada usando o DNA genômico (gDNA) como um padrão. A reação PCR foi realizada usando iniciadores das SEQ ID NOS: 5 e 6 sob as condições seguintes: 30 ciclos, cada um consistindo em desnaturação a 94 °C por 30 s, recozimento a 56 °C por 30 s, e alongamento a 72 °C por 60 s. O produto de PCR (em seguida referido como "fragmento iolT1") foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 0,8%, e depois uma faixa tendo um tamanho desejado foi eluída.

(3) Construção de vetor recombinante pCCIBAC-iolTI

[0056] O fragmento iolT1 preparado no exemplo 1-(2) acima foi tratado com a enzima de restrição HindIII, e depois ligado com um vetor de pCC1BAC linear tratado com a mesma enzima de restrição HindIII de modo que ela estaria na mesma orientação com o promotor lac do vetor.

[0057] Células DH5a de E. coli foram transformadas com o vetor construído, e depois plaqueadas em um meio sólido de LB contendo cloranfenicol e cultivadas durante a noite a 37 °C. Uma alça de platina da colônia cultivada foi inoculada em 3 ml de um meio líquido de LB contendo cloranfenicol e cultivada durante a noite, e depois DNA plasmídico foi recuperado usando um kit de minipreparação de plasmídeo. O tamanho do vetor recombinante foi determinado por tratamento com a enzima de restrição HindIII (dados não mostrados), e o clone foi identificado realizando-se PCR usando iniciadores das SEQ ID NOS: 11 e 12 sob as condições seguintes: desnaturação a 94 °C por 30 s, recozimento a 56 °C por 30 s, e alongamento a 72 °C por 90 s. O vetor recombinante foi denominado pCC1BAC-iolT1.

(4) Preparação de fragmento de gene iolT2

[0058] Para obter um fragmento de 1,6 kb compreendendo a estrutura de leitura aberta do gene iolT2 da SEQ ID NO: 4, o DNA genômico de ATCC 13032 de Corynebacterium glutamicum foi extraído usando um sistema Genomic-tip (Qiagen).

[0059] Uma reação em cadeia de polimerase foi realizada usando o DNA genômico (gDNA) como um padrão. A reação PCR foi realizada usando iniciadores das SEQ ID NOS: 7 e 8 sob as condições seguintes: 30 ciclos, cada um consistindo em desnaturação a 94 °C por 30 s, recozimento a 56 °C por 30 s, e alongamento a 72 °C por 60 s. O produto de PCR (em seguida referido como "fragmento iolT2") foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 0,8%, e depois uma faixa tendo um tamanho desejado foi eluída.

(5) Construção do vetor recombinante pCCIBAC-iolT2

[0060] O fragmento de iolT2 preparado no exemplo 1-(4) acima foi tratado com a enzima de restrição EcoRI, e depois ligado com um vetor de pCC1BAC linear tratado com a mesma enzima de restrição EcoRI de modo que ela estaria na mesma orientação com o promotor lac do vetor.

[0061] Células DH5a de E. coli foram transformadas com o vetor construído, e depois plaqueadas em um meio sólido de LB contendo cloranfenicol e cultivadas durante a noite a 37 °C. Uma alça de platina da colônia cultivada foi inoculada em 3 ml de um meio líquido de LB contendo cloranfenicol e cultivada durante a noite, e depois DNA plasmídico foi recuperado usando um kit de minipreparação de plasmídeo. O tamanho do vetor recombinante foi determinado por tratamento com a enzima de restrição EcoRI (dados não mostrados), e o clone foi identificado realizando-se PCR usando iniciadores das SEQ ID NOS: 11 e 12 sob as condições seguintes: desnaturação a 94 °C por 30 s, recozimento a 56 °C por 30 s, e alongamento a 72 °C por 90 s. O vetor recombinante foi denominado pCC1BAC-iolT2.

(6) Construção do vetor recombinante pCCIBAC-iolTI - iolT2

[0062] O vetor pCC1BAC-iolT2 construído no exemplo 1-(5) acima foi tratado com a enzima de restrição HindIII, e depois ligado com o fragmento de iolT1 preparado no exemplo 1-(2) acima de modo que ele estaria na mesma orientação com o promotor lac do vetor.

[0063] Células DH5a de E. coli foram transformadas com o vetor construído, e depois plaqueadas em um meio sólido de LB contendo cloranfenicol e cultivadas durante a noite a 37 °C. Uma alça de platina da colônia cultivada foi inoculada em 3 ml de um meio líquido de LB contendo cloranfenicol e cultivada durante a noite, e depois DNA plasmídico foi recuperado usando um kit de minipreparação de plasmídeo. O tamanho do vetor recombinante foi determinado por tratamento com a enzima de restrição HindIII (dados não mostrados), e o clone foi identificado realizando-se PCR usando iniciadores das SEQ ID NOS: 11 e 12 sob as condições seguintes: desnaturação a 94 °C por 30 s, recozimento a 56 °C por 30 s, e alongamento a 72 °C por 120 s. O vetor recombinante foi denominado pCC1BAC-iolT1-iolT2.

Exemplo 2: Construção de cepas recombinantes por transformação e comparação de produtividade de L-treonina (7) Construção de cepas recombinantes usando E. coli do tipo selvagem

[0064] Cada um dos vetores recombinantes (pCC1BAC-iolT1, pCC1BAC-iolT2 e pCC1BAC-iolT1-iolT2) construídos no exemplo 1 acima foi introduzido em MG1655 de E. coli do tipo selvagem compreendendo o vetor de superexpressão de operon de treonina pBRThrABCR3 (Lee KH et al., Molecular Systems Biology (2007) 3:149) por eletroporação, e depois as células de E. coli foram plaqueadas em meios sólidos contendo 100 ,^/ml de ampicilina e 15 ,^/ml de cloranfenicol para selecionar as colônias únicas.

[0065] As cepas selecionadas foram denominadas MG1655/pBRThrABCR3/pCC1BAC-iolT1, MG1655/pBRThrABCR3/pCC1BAC-iolT2 e MG1655/pBRThrABCR3/pCC1BACiolT1-iolT2, respectivamente.

[0066] As produtividades de L-treonina destas cepas foram analisadas da mesma maneira como descrito no Exemplo Comparativo 1-(3) acima usando o meio de título de treonina tendo a composição mostrada na tabela 1 acima, e os resultados da análise são mostrados na tabela 3 abaixo.

[0067] Como um resultado, como pode ser observado na tabela 3 acima, a cepa precursora MG1655 de E. coli produziu 3,86 g/L de L- treonina quando cultivada por 48 horas, e a cepa recombinante MG1655/pCC1BAC-iolT1 construída no Exemplo da presente invenção produzido 3,88 g/L de L-treonina, e as cepas recombinantes MG1655/pCC1BAC-iolT2 e MG1655/pCC1BAC-iolT1-iolT2 produziram 3,92 g/L e 3,85 g/L de L-treonina, respectivamente. Em outras palavras, as cepas recombinantes produziram L-treonina em níveis similares àqueles da cepa precursora.

[0068] Como pode ser observado na tabela 3 acima, a cepa precursora do tipo selvagem de E. coli MG1655 mostrou uma taxa de consumo de açúcar de 0,877 g/L/h, mas MG1655/pCC1BAC-iolT2, MG1655/pCC1BAC-iolT1 e MG1655/pCC1BAC-iolT1-iolT2 mostraram taxas de consumo de açúcar de 1,035 g/L/h, 1,109 g/L/h e 1,123 g/L/h, que aumentaram em 18,0%, 26,5% e 28,1%, respectivamente, comparado àquelas da cepa precursora.

(2) Construção de cepas recombinantes usando KCCM 10541 de E. coli'

[0069] Cada um dos vetores recombinantes (pCC1BAC-iolT1, pCC1BAC-iolT2 e pCC1BAC-iolT1-iolT2) construídos no exemplo 1 acima foi introduzido na cepa de E. coli KCCM10541 que produz L- treonina como uma cepa precursora por eletroporação, e depois as células de E. coliforam plaqueadas em meios sólidos contendo 15 ,^/ml de cloranfenicol para selecionar colônias únicas.

[0070] As cepas selecionadas foram denominadas KCCM10541/pCC1BAC-iolT1, KCCM10541/pCC1BAC-iolT2 e KCCM10541/pCC1BAC-iolT1-iolT2, respectivamente.

[0071] As produtividades de L-treonina destas cepas junto com os micro-organismos recombinantes obtidos no Exemplo Comparativo 1(2) acima foram analisadas da mesma maneira como descrito no Exemplo Comparativo 1-(3) usando o meio de título de treonina tendo a composição mostrada na tabela 1 acima, e os resultados da análise são mostrados na tabela 4 abaixo. Tabela 4

[0072] Como um resultado, como pode ser observado na tabela 4 acima, a cepa precursora de E. coli KCCM 10541 produziu 30,3 g/L de L-treonina quando cultivada por 48 horas, e a cepa recombinante KCCM 10541/pCC1BAC-iolT2 construída no exemplo 2-(2) acima mostrou um aumento na produção de L-treonina em 2,2 g/L comparado à cepa precursora, e KCCM10541/pCC1BAC-iolT1 e KCCM10541/pCC1BAC- iolT1-iolT2 produziram 29,5 g/L e 29,9 g/L de L-treonina, respectivamente. Em outras palavras, estas cepas recombinantes produziram L-treonina em níveis similares àqueles da cepa precursora.

[0073] As cepas KCCM 10541/pCC1BAC-galP e KCCM 10541/pCL1920-galP mostrando uma expressão aumentada do gene galP de E. coli produziram 29,8 g/L e 29,3 g/L de L-treonina, respectivamente.

[0074] Como pode ser observado na tabela 4 acima, a cepa precursora de E. coli KCCM 10541 mostrou uma taxa de consumo de açúcar de 0,823 g/L/h, mas KCCM 10541/pCC1BAC-iolT2, KCCM 10541/pCC1BAC-iolT1-iolT2 e KCCM 10541/pCC1BAC-iolT1 mostraram taxas de consumo de açúcar de 1,093 g/L/h, 1,200 g/L/h e 1,213 g/L/h, respectivamente, que aumentaram em 32,8%, 45,8% e 47,4%, respectivamente, comparado àquelas da cepa precursora. Além disso, porque as taxas de consumo de açúcar de KCCM 10541/pCC1BAC-galP e KCCM 10541/pCL1920-galP aumentaram em 4,7% e 7,4%, respectivamente, comparado àquelas da cepa precursora, pode ser observado que as taxas de consumo de açúcar das cepas introduzidas com o gene iolT1 e/ou iolT2 de Corynebacterium significantemente aumentaram.

[0075] As cepas de E. coli transformadas, KCCM 10541/pCC1BAC- iolT1, KCCM 10541/pCC1BAC-iolT2 e KCCM 10541/pCC1BAC-iolT1- iolT2, foram denominadas CA03-0230, CA03-0260 e CA03-0231, respectivamente, e foram depositadas no Korean Culture Center of Microorganisms; em seguida abreviado como 'KCCM') em 5 de Fevereiro de 2013 sob números de acesso KCCM11370P, KCCM11369P e KCCM11371P, respectivamente.

[0076] Os resultados descritos acima sustentam que, quando a expressão de permease de Corynebacterium em E. coli tendo produtividade de L-treonina é aumentada, isto é, quando um ou mais dos genes iolT1 e iolT2 são introduzidos na cepa de E. coli, a taxa de consumo de açúcar aumenta, e o tempo necessário para produzir a mesma concentração de L-treonina, isto é, a produtividade de treonina aumenta, comparado a quando a expressão de glicose permease de E. coli em E. coli tendo produtividade de L-treonina é aumentada.

[0077] Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência às modalidades ilustrativas particulares, será entendido por aqueles versados na técnica à qual a presente invenção pertence que a presente invenção pode ser incorporada em outras formas específicas sem divergir do espírito técnico ou características essenciais da presente invenção. Portanto, as modalidades descritas acima são consideradas como sendo ilustrativas em todos os respeitos e não restritivas. Além disso, o escopo da presente invenção é definido pelas reivindicações anexas ao invés da descrição detalhada, e deve ser entendido que todas as modificações ou variações derivadas dos significados e escopo da presente invenção e equivalentes desta são incluídas no escopo das reivindicações anexas.

Números de Acesso

[0078] Autoridade depositária: Korean Culture Center of

Microorganisms;

[0079] Número de acesso: KCCM11370P;

[0080] Data de depósito: 5 de Fevereiro de 2013.

[0081] Autoridade depositária: Korean Culture Center of

Microorganisms;

[0082] Número de acesso: KCCM11369P;

[0083] Data de depósito: 5 de Fevereiro de 2013.

[0084] Autoridade depositária: Korean Culture Center of

Microorganisms;

[0085] Número de acesso: KCCM11371P;

[0086] Data de depósito: 5 de Fevereiro de 2013.

Claims

1. Micro-organismo recombinante do gênero Escherichia tendo taxa de produção de L-treonina melhorada em comparação com a cepa parental, caracterizado pelo fato de que é obtido por introdução de uma ou mais dentre (i) a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 3 e sequências nucleotídicas degeneradas da mesma que codificam a mesma sequência de aminoácidos, e (ii) a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 4 e sequências nucleotídicas degeneradas da mesma que codificam a mesma sequência de aminoácidos de modo a conter permease de origem de Corynebacterium possuindo SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2.

2. Micro-organismo recombinante do gênero Escherichia tendo produtividade de L-treonina melhorada, de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo recombinante é Escherichia coli.

3. Micro-organismo recombinante do gênero Escherichia de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo recombinante é obtido por introdução de uma ou mais dentre (i) a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 3 e sequências nucleotídicas degeneradas da mesma que codificam a mesma sequência de aminoácidos, e (ii) a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 4 e sequências nucleotídicas degeneradas da mesma que codificam a mesma sequência de aminoácidos de modo a conter tanto as permeases de Corynebacterium da SEQ ID NO: 1 quanto da SEQ ID NO: 2.

4. Micro-organismo recombinante do gênero Escherichia de acordo com reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é Escherichia coli.

5. Método para produzir L-treonina, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: inocular e cultivar o micro-organismo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4; e separar o L-aminoácido da cultura.