KR101145943B1

KR101145943B1 - Ｌ-아미노산 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR101145943B1
Application number: KR1020100021925A
Authority: KR
Inventors: 이광호; 김효진
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2010-03-11
Filing date: 2010-03-11
Publication date: 2012-05-15
Also published as: KR20110102752A

Abstract

본 발명은 수크로스를 주 탄소원으로 이용할 수 있도록 형질전환되고 L-아미노산 생산능을 가지며, 수크로스 non-PTS 시스템 및 수크로스 PTS 시스템을 동시에 이용하는 미생물 및 상기 미생물을 이용하여 L-아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

Ｌ-아미노산 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용하여 Ｌ-아미노산을 생산하는 방법{Microorganisms producing L-amino acids and process for producing L-amino acids using the same}

본 발명은 수크로스를 주 탄소원으로 이용하여 고수율의 L-아미노산을 생산할 수 있도록 형질전환된 미생물 및 이를 이용한 L-아미노산 생산 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 수크로스를 주 탄소원으로 이용할 수 있도록 형질전환되고 L-아미노산 생산능을 가지며, 수크로스 non-PTS 시스템 및 수크로스 PTS 시스템(phosphtransferase system)을 동시에 이용하는 미생물 및 상기 미생물을 이용하여 L-아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

최근 바이오 연료 개발이 가속화됨에 따라 발효 산업에 주로 이용되는 전분당에 대한 수요가 급증하고, 이상 기후에 의한 작물의 흉작으로 인해 전분당을 비롯한 곡물가격이 급상승하고 있는 추세이다. 이러한 전분당에 비해 값이 싼 수크로스 또는 수크로스를 다량 포함하는 당밀(molasses)을 발효산업의 탄소원으로 이용할 경우, 보다 높은 원가 경쟁력을 확보할 수 있는 장점이 있다. 자연계에 존재하는 대장균의 약 50 % 정도는 수크로스를 대사할 수 있는 능력을 가지고 있지만, 발효 산업에 주로 이용되고 있는 대장균 K12 균주, B 균주, C 균주 등은 수크로스 자화능이 없다 (Mol . Microbiol. (1988) 2:1-8, Can . J. Microbiol . (1999) 45:418-422). 그러므로 수크로스 자화능과 관련된 유전자들을 규명하고 이를 개량하여 강화된 수크로스 자화능 관련 유전자들을 확보하는 것과 이들을 수크로스 비자화성 산업용 대장균에 도입하여 목적하는 대사산물을 생산하는 것은 발효산업의 가장 중요한 연구주제 중 하나이다.

수크로스를 이용할 수 있는 시스템은 크게 수크로스 non-PTS 시스템과 수크로스 PTS 시스템으로 나눌 수 있다.

먼저, 수크로스 non-PTS 시스템은 프로톤 심포트 타입의 수크로스 퍼미아제 (proton symport-type sucrose permease)를 이용하는 시스템으로서, 이러한 수크로스 퍼미아제를 암호화하는 cscB를 포함하는 csc 유전자군이 잘 알려져 있다. csc 유전자군은 cscB (proton symport-type sucrose permease), cscK (fructokinase), cscA (sucrose hydrolase), cscR (LacI-related sucrose-specific repressor)로 구성되어 있다(J. Bacteriol . (2002) 184: 5307-5316).

cscB는 프로톤 심포트 타입의 수크로스 퍼미아제로서, 수크로스 PTS 시스템과 비교할 때 수크로스 non-PTS 시스템의 가장 큰 특징을 보여주는 단백질이며, 수크로스 PTS 시스템과는 달리, 에너지원으로 PEP를 사용하지 않고 외부 수크로스를 수소의 농도 구배에 의해 세포내로 유입된다 (J. Bacteriol . (2002) 184:5307-5316). 세포내로 유입된 수크로스는 수크로스 하이드로라제 (sucrose hydrolase)인 cscA에 의해 글루코스와 프락토오즈로 가수분해된다.

세포내 글루코스는 글루코카이네이즈(glucokinase)에 의해 글루코스-6-포스페이트(glucose-6-phosphate)로 전환되고, 프락토오즈는 프락토카이네이즈 (fructokinase)인 CscK 또는 mak에 의해 프락토오즈-6-포스페이트 (fructose-6-phosphate)로 전환되어 함께 해당과정으로 들어가게 된다.

CscK처럼 프락토카이네이즈 활성을 가지는 단백질로는 수크로스 PTS 시스템의 ScrK와 Mak (mannokinase)가 알려져 있다. CscK는 pUR 400유래의 ScrK와 아미노산 상동성이 74 %이며 (J. Bacteriol . (2002) 184:5307-5316), Mak와는 상동성이 없다. 한편, Mak는 대장균 K12 균주의 염색체내에 포함되어 있는 유전자이며, 만노오스, 프락토오즈를 포함한 헥소스 (hexose)를 6-포스포-에스터 (6-phospho-ester) 형태로 전환해주는 카이네이즈 (kinase) 활성을 가진다(J. Mol . Microbiol . Biotechnol. (2001) 3:355-359, Biochemistry (2005) 44:10776-10783).

본 발명자들은 수크로스를 고효율적으로 이용하는 미생물을 개발하기 위한 일환으로서, 수크로스 대사에 관여할 것으로 예상되는 유전자들을 탐색하는 연구를 수행하던 중, 수크로스 대사에 있어서 만노키나아제가 중요한 역할을 할 것이라는 사실을 밝혀내게 되었다. 만노키나아제가 불활성화된 대장균에 온전한 csc 유전자군을 도입하더라도, 만노키나아제가 불활성화되지 않는 야생형 대장균에 비해 수크로스 이용속도가 감소되는 사실을 확인하게 되었다(출원번호 KR10-2009-0012048).

다음으로, 수크로스 PTS 시스템은 에너지원으로 PEP를 사용하여 외부 수크로스를 세포내로 수크로스를 유입하는 것으로 알려져 있다. scr 유전자군은 scrK (fructokinase), scrY (sucrose porin), scrA (sucrose-specific EIIBC component), scrB (sucrose-6-phosphate hydrolase), scrR (LacI-related sucrose-specific repressor)의 5개의 유전자로 구성되어 있으며, scr 유전자군의 작용 기작은 외부막 단백질 (OMP, outer membrane protein)인 ScrY를 통해서 외부의 수크로스가 세포외질 (periplasmic space)로 유입되고, 유입된 수크로스는 ScrA(sucrose-specific EIIBC component)가 포함된 수크로스 PTS 퍼미아제를 통하여 수크로스-6-포스페이트 (sucrose-6-phosphate) 형태로 세포내부로 들어오게 된다. 수크로스-6-포스페이트는 ScrB(sucrose-6-phosphate hydrolase)에 의해서 글루코스-6-포스페이트와 프락토오즈로 가수분해되고, 프락토오즈는 ScrK (fructokinase)에 의해 프락토오즈-6-포스페이트로 전환되어 글루코스-6-포스페이트와 함께 해당과정으로 들어가게 된다 (J. Biotechnol . (2001) 92:133-158). 그 대표적인 예로써 그람 음성 미생물인 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae), 어위니아 아미노보라(Erwinia amylovora)의 염색체상에 존재하는 scr 유전자군을 들 수 있다, 본 발명자들은 수크로스를 효율적으로 이용할 수 있도록 하기 위해 많은 연구를 진행하던 중, Scr 유전자군을 대장균 K12에 형질 전환하여 수크로스 자화능을 부여하여 아미노산을 생산하였다(특허번호 KR 10-2009-018127).

수크로스 이용에 있어서, 수크로스 PTS 시스템 보다는 수크로스 유입시 PEP(phosphoenolpyruvate)를 소모하지 않는 수크로스 non-PTS 시스템을 이용하는 것이 더 바람직할 것이다. PEP는 중앙 대사경로에서 중요한 중간체 (metabolite)로서, 당 (sugar) PTS 시스템의 포스페이트 도너 (phosphate donor)의 역할을 하여 피루베이트(pyruvate)으로 전환되어 TCA 회로로 유입되어 ATP 생산을 위한 환원력 공급뿐만 아니라 대사과정에서 생산되는 중간 산물을 생합성에 필요한 탄소골격으로 공급하여 몇 가지 아미노산이나 옥살로아세테이트 (oxaloacetate, OAA)의 직접적인 전구체로도 작용한다 (Metab . Eng . (2002) 4:124-137, Microb . Cell Fact . (2005) 4:14). 특히 OAA는 쓰레오닌, 이소로이신 메티오닌, 라이신, 아스파라진, 아스파틱산 등의 아미노산의 탄소골격 (carbon skeleton)으로 이용된다 (미국등록특허 6960455).

PEP의 대부분은 당 PTS 시스템에 의해 가장 많이 소모되는 것으로 알려져 있다. 탄소원으로서 글루코스가 포함된 최소배지에서 당 PTS 시스템에 소모되는 PEP의 양은 전체 PEP의 50 %에 이른다고 한다 (Microb . Cell Fact . (2005) 4:14). 따라서 당 PTS 시스템 대신 당 non-PTS 시스템을 이용한다면, 세포내의 PEP 풀(pool)을 증가시킬 수 있으며 증가된 PEP를 발효산물의 생합성에 이용함으로써, 생산성 및 수율을 향상 시킬 수 있다(Biotechnol . Bioeng . (2001) 74: 364-375, Appl . Microbiol. Biotechnol . (2001) 57:186-191, Metab . Eng . (2005) 7:70-87).

수크로스 non-PTS 시스템은 PEP 풀을 증가시켜 수율을 향상 시킬 수 있지만, 낮은 농도의 수크로스를 효율적으로 이용할 수 없다는 단점을 가지고 있다. csc 유전자군이 도입된 대장균은 0.2 % 이하의 수크로스가 포함된 배지에서 대수 증식기 (doubling time)가 20 시간에 이른다 (J. Bacteriol . (2002) 184:5307-5316).

그러나, 수크로스 PTS 시스템은 낮은 농도의 수크로스까지 효율적으로 유입 할 수 있다는 장점은 있으나, PEP를 소모하여 수크로스를 유입하므로 세포내의 PEP 풀(pool)을 감소시키는 단점이 있다. 본 발명자들은 이러한 문제를 해결하고자 연구를 계속 수행하던 중, 수크로스 non-PTS 시스템과 수크로스 PTS 시스템을 동시에 이용하는 다양한 균주를 발명하여 낮은 농도에서도 수크로스를 효율적으로 이용하는 균주를 제작하였다. 또한, 본 발명자들은 수크로스를 효율적으로 이용하여 수율 및 생산성이 향상된 미생물을 개발하기 위한 일환으로서, 성장 중의 생합성 또는 아미노산 생성을 위해 소요되는 옥살로아세테이트(OAA)를 보충하는 유전자들을 탐색하는 연구를 수행하던 중 피루베이트 카르복실라제(pyruvate carboxylase) 유전자를 도입하였다. 피루베이트 카르복실라제는 피루베이트로부터 옥살로아세테이트의 생성을 촉매하는 활성을 가진다. 옥살로아세테이트 생성은 쓰레오닌, 이소로이신 메티오닌, 라이신, 아스파라진, 아스파틱산 등의 아미노산의 탄소골격 (carbon skeleton) 즉, 발효산물의 생합성에 이용함으로써 생산성 및 수율을 향상 시킬 수 있다(미국등록특허 6960455).

이와 같은 배경 하에, 본 발명자들은 수크로스 non-PTS 시스템과 수크로스 PTS 시스템을 동시에 이용하여 저농도에서도 수크로스를 효율적으로 이용할 수 있는 균주를 개발하였고, 추가로, 피루베이트 카르복실라제 활성을 부여하여 PEP에서 전환된 피루베이트로부터 옥살로아세테이트를 합성하여 TCA 회로로 유입되는 피루베이트 풀(pool)을 형성하고, 이것이 아미노산 생합성 경로의 탄소골격으로 공급됨으로써 수율이 향상됨을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 수크로스를 주 탄소원으로 이용하여 L-아미노산을 생산하는 에스케리키아속 미생물, 바람직하게는 수크로스 non-PTS 시스템과 수크로스 PTS 시스템을 동시 이용하고, 추가로 피루베이트 카르복실라제의 활성이 부여된 에스케리키아속 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 에스케리키아속 미생물을 이용하여 L-아미노산을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 수크로스 비자화성 미생물에 수크로스 non-PTS 시스템과 수크로스 PTS 시스템의 동시이용성을 부여하는 것을 특징으로 하는, 수크로스 자화성 및 증가된 L-아미노산 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 수크로스 non-PTS 시스템은 수크로스 퍼미아제, 수크로스 하이드로라제, 수크로스 전사 조절자, 및 만노키나아제의 활성을 가지며, 수크로스 PTS 시스템은 수크로스 PTS 퍼미아제와 수크로스 PTS 하이드로라제 활성을 가지는 것을 말한다. 본 발명에 이용된 수크로스 non-PTS 시스템의 수크로스 퍼미아제는 외부의 수크로스를 세포내로 유입하는 활성을 가지고, 수크로스 하이드로라제는 세포내로 유입된 수크로스를 글루코스와 프락토스로 가수분해하는 활성을 가지며, 만노키아제는 프락토스를 프락토스-6-포스페이트로 전환하는 활성을 가진다. 수크로스 PTS 시스템의 수크로스 PTS 퍼미아제는 외부의 수크로스를 수크로스-6-포스페이트 형태로 세포내로 유입하는 활성을 가지고, 수크로스 PTS 하이드로라제는 수크로스-6-포스페이트를 글루코스-6-포스페이트와 프락토스로 가수분해하는 활성을 가진다. 상기 수크로스 non-PTS 시스템과 수크로스 PTS 시스템에 이용된 유전자들의 활성은 수크로스 자화능이 존재하는 미생물에 존재하지만, 산업적으로 이용되는 산업용 대장균 K12 균주, B 균주, C 균주 에는 존재하지 않는다. 따라서, 본 발명에 따르면, 이러한 산업용 대장균들에 상기 수크로스 non-PTS 시스템과 수크로스 PTS 시스템에 이용된 유전자들의 활성을 도입하여 수크로스 자화능을 가지면서도 증가된 L-아미노산 생산능을 갖도록 할 수 있다.

본 발명에 이용된 수크로스 non-PTS 시스템은 수크로스 퍼미아제를 암호화하는 유전자, 수크로스 하이드로라제를 암호화하는 유전자, 수크로스 전사 조절자를 암호화하는 유전자, 및 만노키나아제를 암호화하는 유전자를 포함한다.

본 발명에서 상기 수크로스 퍼미아제를 암호화하는 유전자, 수크로스 하이드로라제를 암호화하는 유전자, 및 수크로스 전사 조절자를 암호화하는 유전자는 수크로스 자화능이 있는 미생물에서 얻어지는 유전자를 말하며, 바람직하게는 수크로로스 자화능이 있는 에스케리키아속 미생물에서 얻어지는 유전자를 말하며, 가장 바람직하게는 대장균 ATCC9637 (Appl . Environ . Microbiol . (1989) 55:1943-1948)에서 얻어지는 수크로스 퍼미아제를 암호화하는 유전자 (cscB, 서열번호 4), 수크로스 하이드로라제를 암호화하는 유전자 (cscA, 서열번호 6), 수크로스 전사 조절자를 암호화하는 유전자 (cscR, 서열번호 7)를 말한다.

만노키나아제(mannokinase)는 만노오스를 포함한 헥소스를 ATP를 이용하여 6-포스포-에스터 형태로 전환해 주는 활성을 가지는 효소를 말한다. 만노키나아제를 암호화하는 유전자는 에스케리키아속 미생물에서 작동 가능한 염기서열을 가지는 유전자이면 족하다. 하나의 구체적인 예는 대장균에서 유래하였으며, 바람직하게 서열번호 13의 염기서열 (GenBank accession number AC000091)을 가지는 폴리뉴클레오타이드이다. 특히, 상기 만노키나아제를 암호화하는 염기서열은 그 활성을 유지하는 한 일정 정도 변형이 가능하다. 본 기술 분야의 당업자라면 이러한 인위적인 변형에 의해 70 % 이상의 상동성이 유지되는 염기서열이 본 발명에서 목적하는 유전자의 활성을 보유하는 한, 본 발명의 상기 염기서열로부터 유래된 것과 균등한 것임을 쉽게 이해할 것이다.

본 발명에서 수크로스 PTS 시스템은 수크로스 PTS 퍼미아제를 암호화하는 유전자와 수크로스 PTS 하이드로라제를 암호화하는 유전자를 포함한다. 상기 수크로스 PTS 퍼미아제를 암호화하는 유전자 및 수크로스 PTS 하이드로라제를 암호화하는 유전자는 수크로스 자화능이 있는 미생물에서 얻어지는 유전자를 말하며, 바람직하게는 수크로스 자화능이 있는 클렙시엘라 속 미생물 유전자를 말하며, 보다 바람직하게는 클렙시엘라 뉴모니애 ATCC700721에서 얻어지는 유전자를 말하며, 가장 바람직하게는 클렙시엘라 뉴모니애 ATCC700721에서 얻어지는 수크로스 PTS 퍼미아제를 암호화하는 유전자 (scrA, 서열번호 21), 수크로스 하이드로라제를 암호화하는 유전자 (scrB, 서열번호 22)를 말한다.

본 발명에 있어 L-아미노산 생산능을 가지는 에스케리키아속 미생물의 수크로스 non-PTS 시스템과 수크로스 PTS 시스템을 암호화하는 유전자들을 동시 이용하기 위해 활성을 강화하는 방법은 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하다. 그 방법으로는 non-PTS 시스템과 수크로스 PTS 시스템을 암호화하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 염색체에 삽입하는 방법과 벡터 시스템에 도입하는 방법에 의하여 카피수를 증가시키는 방법, 강한 프로모터로 교체하는 방법, 프로모터에 변이를 도입하는 방법 및 유전자 변이에 의한 방법, 무작위 돌연변이법 (random mutagenesis) 또는 부위 특이적 돌연변이법 (site-directed mutagenesis)을 이용하는 방법 등이 있을 수 있다.

본 발명에 따른 수크로스 non-PTS 시스템의 구체적인 일 실시예에서는 수크로스 퍼미아제, 수크로스 하이드로라제, 수크로스 전사 조절자, 및 만노키나아제를 암호화하는 유전자를 포함하는 염기서열에 하이드록실아민 (hydroxylamine)을 처리하여 무작위 변이를 유발 하는 방법 (Methods Enzymol . (1991) 194:302-318)을 이용하여, 저농도 수크로스 배지에서 이용성이 향상된 것을 선정하였다. 상기 수크로스 비자화성 에스케리키아 속 미생물이 수크로스 퍼미아제, 수크로스 하이드로라제, 130번째 아미노산이 히스티딘에서 타이로신으로 치환된 수크로스 전사 조절자 (cscR', 서열번호 17)의 활성을 보유하도록 하는 방법은, 수크로스 퍼미아제, 수크로스 하이드로라제, 변이된 수크로스 전사 조절자, 및 만노키나아제를 암호화하는 핵산서열을 벡터 조절자(pAcscBAR'-M, 서열번호 28)에 도입하고, 그 재조합 벡터로 수크로스 비자화성 L- 아미노산 생산능을 가지는 에스케리키아속 미생물을 형질 전환함으로써 제조하였다. 수크로스 퍼미아제, 수크로스 하이드로라제, 변이된 또는 변이되지 않은 수크로스 전사 조절자를 암호화하는 염기서열을 포함하고, 활성이 강화된 만노키나아제를 포함하는 방법은 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법이 적용 가능하다. 이미 만노키나아제의 활성이 강화된 L-아미노산 생산능을 가지는 에스케리키아속 미생물에 수크로스 퍼미아제, 수크로스 하이드로라제, 및 변이된 또는 변이되지 않은 수크로스 전사 조절자를 암호화하는 염기서열을 포함하는 벡터를 형질전환 하는 방법이 있을 수 있다. 또는, 수크로스 퍼미아제, 수크로스 하이드로라제, 및 변이된 또는 변이되지 않은 수크로스 전사 조절자를 암호화하는 염기서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 L-아미노산 생산능을 가지는 에스케리키아속 미생물의 만노키나아제 활성을 강화시키는 방법이 있을 수 있다. 본 발명의 구체적 일 실시예에서는, 수크로스 퍼미아제, 수크로스 하이드로라제, 변이된 또는 변이되지 않은 수크로스 전사 조절자를 암호화하는 염기서열과 만노키나아제를 암호화하는 염기서열을 포함하는 벡터로 L-아미노산 생산능을 가지는 에스케리키아속 미생물을 형질전환함으로써 만노키나아제의 활성을 강화함과 동시에 수크로스 퍼미아제, 수크로스 하이드로라제, 수크로스 전사 조절자의 활성을 보유하도록 하였다.

본 발명에 따른 수크로스 PTS 시스템의 구체적 일 실시예에서는 수크로스 PTS 퍼미아제 및 수크로스 PTS 하이드로라제의 프로모터를 교체하여 활성을 강화하였고, 수크로스 PTS 퍼미아제, 수크로스 PTS 하이드로라제를 암호화하는 핵산서열을 벡터(pC-Ptrc-scrAB, 서열번호 29)에 도입하고, 그 재조합 벡터로 수크로스 비자화성 L- 아미노산 생산능을 가지는 에스케리키아속 미생물을 형질 전환함으로써 제조하였다. 이 밖에도, 추가로 염색체에 삽입하는 방법, 강한 프로모터로 교체하는 방법, 프로모터에 변이를 도입하는 방법 및 유전자 변이에 의한 방법, 무작위 돌연변이법 (random mutagenesis) 또는 부위 특이적 돌연변이법 (site-directed mutagenesis)을 이용할 수 있다.

더욱 바람직한 구체예로서, L-아미노산 생산능을 가지는 에스케리키아속 미생물의 수크로스 non-PTS 시스템과 수크로스 PTS 시스템의 활성을 강화시키기 위해 이들을 암호화하는 염기서열을 벡터에 도입함으로써 카피수를 증가 또는 프로모터 교체시키는 방법을 사용할 수 있다. 수크로스 non-PTS 시스템과 수크로스 PTS 시스템을 암호화하는 염기서열을 도입한 재조합 벡터로 L-아미노산 생산능을 가지는 에스케리키아속 미생물을 형질전환함으로써 수크로스 non-PTS 시스템과 수크로스 PTS 시스템의 활성이 강화된 에스케리키아속 미생물을 제조할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태로서, 본 발명은 상기 수크로스 non-PTS 시스템과 수크로스 PTS 시스템의 활성을 강화시키기 위해 이들을 암호화하는 염기서열을 벡터에 도입하고, 추가로 피루베이트 카르복실라제의 활성을 부여하는 것을 특징으로 하는, 수크로스 자화성 및 증가된 L-아미노산 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물에 관한 것이다. 상기 피루베이트 카르복실라제의 활성을 부여하는 방법으로는 염색체에 삽입, 벡터 시스템에 도입에 의하여 카피수를 증가, 강한 프로모터로 교체, 유전자 변이, 프로모터에 변이를 도입 등의 기존 활성보다 더 강화 된 것이 포함된다.

본 발명에 있어서, 피루베이트 카르복실라제(pyruvate carboxylase) 는 피루베이트로부터 옥살로아세테이트의 생성을 촉매하는 활성을 가지는 펩타이드를 말한다. 상기 피루베이트 카르복실라제의 활성은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillus), 브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum) 및 코리네박테리움 글루타미컴(corynebacterium glutamicum) 등의 미생물에는 존재하지만, 산업적으로 이용되는 산업용 대장균 K12 균주, B 균주, W 균주에는 존재하지 않는다(Microbiology 143: 1095-1103(1997), Appl . Environ . Microbiol .(2000) 66:1844-1850). 따라서 본 발명에 이용된 피루베이트 카르복실라제를 암호화하는 유전자는 코리네박테리아 속 미생물 유전자를 말하며, 보다 바람직하게는 코리네박테리아에서 얻어지는 유전자를 말하며, 가장 바람직하게는 라이신 생산 균주(KFCC 10881, 한국 공개특허 10-2009-0084099, 한국 등록특허 10-0798118))에서 얻어지는 피루베이트 카르복실라제를 암호화하는 유전자를 말한다(서열번호 25).

본 발명에 있어서, 피루베이트 카르복실라제의 활성을 강화하는 방법은 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하다. 그 방법으로는 피루베이트 카르복실라제를 암호화하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 염색체에 삽입하는 방법과 벡터 시스템에 도입하는 방법에 의하여 카피수를 증가시키는 방법, 강한 프로모터로 교체하는 방법, 프로모터에 변이를 도입하는 방법 및 유전자 변이에 의한 방법 등이 있을 수 있다.

바람직한 일 실시예로서, 피루베이트 카르복실라제의 프로모터를 교체하여 활성을 강화하였고, 상기 구체적 실시에서 보여준 바와 같이 피루베이트 카르복실라제를 암호화하는 핵산서열을 벡터(pB-Ptrc-pyc, 서열번호 30)에 도입하고, 그 재조합 벡터로 수크로스 non-PTS 시스템과 수크로스 PTS 시스템의 활성이 강화된 에스케리키아속 미생물에 추가로 형질전환함으로써 제조하였다. 또는, 추가로 염색체에 삽입하는 방법, 강한 프로모터로 교체하는 방법, 프로모터에 변이를 도입하는 방법 및 유전자 변이에 의한 방법, 무작위 돌연변이법 (random mutagenesis) 또는 부위 특이적 돌연변이법 (site-directed mutagenesis)을 이용할 수 있다.

또다른 바람직한 일 실시예로서, L-아미노산 생산능을 가지는 수크로스 non-PTS 시스템과 수크로스 PTS 시스템의 활성이 강화된 에스케리키아속 미생물에 피루베이트 카르복실라제 활성을 강화시키기 위해 이들을 암호화하는 염기서열을 벡터에 도입함으로써 카피수를 증가 또는 프로모터 교체시키는 방법을 사용할 수 있다. 상기와 같은 방법으로, 수크로스 non-PTS 시스템과 수크로스 PTS 시스템을 암호화하는 염기서열을 도입한 재조합 벡터로 L-아미노산 생산능을 가지는 에스케리키아속 미생물을 형질전환하고, 추가로 피루베이트 카르복실라제 활성을 강화된 에스케리키아속 미생물을 제조할 수 있다.

본 발명에서 "벡터"란 수크로스 퍼미아제, 수크로스 하이드로라제, 수크로스 전사 조절자 및 만노키나아제를 암호화하는 유전자를 숙주세포인 수크로스 비자화성 에스케리키아속 미생물로 도입하여 본 발명에 따른 에스케리키아속 미생물을 제공하는데 사용되는 핵산 화합물로서, 목적 단백질을 발현하기 위한 통상의 필수적인 발현 요소를 포함한다. 구체적으로, 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈 및 폴리아데보화 서열과 같은 조절서열을 가지며, 이의 다양한 변형이 가능하다. 또한, 인핸서 서열 또는 분비 서열을 포함할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 pACYC177, pCL, pCC1BAC 벡터를 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어 "형질전환"은 유전자를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주 세포 내에서 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 유전자는 숙주 세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하든지 상관없이 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 유전자는 폴리펩타이드를 코딩 할 수 있는 폴리뉴클레오티드로 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 유전자는 숙주 세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 유전자는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트 (expression cassette) 의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.

본 발명의 미생물은 L-아미노산을 생산할 수 있고, 수크로스 non-PTS 시스템과 수크로스 PTS 시스템을 동시에 이용할 수 있으며, 피루베이트 카르복실라제의 활성을 추가로 부여되며 수크로스 자화능을 갖는 미생물을 말한다. 따라서, 본 발명의 미생물은 상기 특성을 보유하는 한 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함된다. 예를 들면, 에스케리키아 (Escherichia) 속, 어위니아 (Erwinia) 속, 세라티아 (Serratia) 속, 프로비덴시아 (Providencia) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움 (Brevibacterium)속에 속하는 미생물 균주가 포함 될 수 있다. 바람직하게는, 에스케리키아 속에 속하는 미생물이고, 보다 바람직하게는 대장균이다.

본 발명에 있어서, "Ｌ-아미노산"은 Ｌ-쓰레오닌, Ｏ-석시닐-호모세린(O-succinyl-homoserine), Ｏ-아세틸-호모세린(O-Acetyl-homoserine), Ｌ-메티오닌, Ｌ-라이신, Ｌ-호모세린, Ｌ-이소루신, Ｌ-발린, Ｌ-트립토판 등을 말한다. 바람직하게 상기 Ｌ-아미노산은 Ｌ-쓰레오닌, Ｏ-석시닐-호모세린, Ｏ-아세틸-호모세린 및 Ｌ-트립토판이다.

구체적인 일 실시예에서, 본 발명자들은 Ｌ-쓰레오닌 생산능을 가지는 대장균이 pAcscBAR'-M 유전자군을 포함한 서열번호 28의 염기서열을 갖는 벡터, pC-Ptrc-scrAB 유전자군을 포함한 서열번호 29의 염기서열을 갖는 벡터, pB-Ptrc-pyc 유전자군을 포함한 서열번호 30의 염기서열을 갖는 벡터로 Ｌ-쓰레오닌 생산능을 가지는 대장균 ABA5G 균주(NTG 돌연변이법에 의해 제작된 균주, 메치오닌 요구성, 아이소루이신 리키(leaky), α-아미노-β-히드록시 바레릭산 내성, 2-아미노에틸-1-시스테인 내성, 1-아제티딘-2-카르복시산 내성)를 형질전환하였으며, 제작된 균주를 대장균 CA03-0392P로 명명하고, 2010년 2월 5일자로 대한민국 서울 특별시 서대문구 홍제 1동 361-221 번지에 소재하는 국제기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM11060P로 기탁하였다.

본 발명의 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 수크로스 자화능 및 L-아미노산 생산능을 가지는 에스케리키아 속 미생물을 수크로스가 주 탄소원으로 포함되어 있는 배지에 배양하여 L-아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명은 탄소원으로서 수크로스의 일부 혹은 전부가 포함된 배양 배지에 상기 언급된 수크로스 자화능을 가지고 L-아미노산을 생산하는 미생물을 접종하여 배양하는 단계; 및 상기 배양물로부터 L-아미노산을 분리하는 단계를 포함하는, 수크로스를 포함한 탄소원에서 상기 에스케리키아 속 미생물을 이용하여 L-아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 상기 배양과정은 당 업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양방법의 예에는 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 만족시켜야 한다.

본 발명에서 사용되는 배지는 수크로스를 주탄소원으로 사용하고, 수크로스를 다량으로 포함한 당밀 또한 탄소원으로 이용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한없이 다양하게 이용할 수 있다. 또한, 사용될 수 있는 질소원의 예는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 오수수 침지액, 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원이 포함될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산 철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한 배양 중에는 지방산 폴리클리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 27 ℃ 내지 37 ℃, 바람직하게는 30 ℃ 내지 35 ℃이다. 배양 기간은 원하는 유용 물질의 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 100 시간이다.

본 발명의 상기 배양 단계에서 생산된 L-아미노산을 수집 및 회수하는 방법은 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 L-아미노산을 수집할 수 있다.

본 발명에 따른 수크로스를 탄소원으로 효율적으로 이용할 수 있도록 만들고, 수크로스 non-PTS시스템과 수크로스 PTS 시스템을 동시에 이용할 수 있는 특성을 갖는L-아미노산 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물을 사용하여 L-아미노산을 생산하는 경우, 발효산업에 주로 이용되었던 전분당 이외에 수크로스를 주탄소원으로 이용함으로써 급변하는 세계 곡물가에 유연하게 대처할 수 있을 뿐만 아니라, 낮은 농도에서도 수크로스를 효율적으로 이용하여 고수율의 L-아미노산을 생산할 수 있다.

도 1은 pAcscBAR'-M을 포함하는 재조합 플라스미드 pAcscBAR'-mak의 제작도이다.
도 2는 Ptrc-scrAB를 포함하는 재조합 플라스미드 pC-Ptrc-scrAB의 제작도이다.
도 3은 Ptrc-pyc를 포함하는 재조합 플라스미드 pB-Ptrcpyc의 제작도이다.
도 4는 ABA5G/pAcscBAR'-M, ABA5G/pAcscBAR'-M, pC-Ptrc-scrAB, ABA5G/ pAcscBAR'-M, pC-Ptrc-scrAB, pB-Ptrcpyc를 탄소원으로 수크로스 7% 조건의 배지 하에서 배양하였을 때, 시간당 성장율을 흡광도로 나타낸 것이다.
도 5는 ABA5G/pAcscBAR'-M, ABA5G/pAcscBAR'-M, pC-Ptrc-scrAB, ABA5G/ pAcscBAR'-M, pC-Ptrc-scrAB, pB-Ptrcpyc를 탄소원으로 수크로스 7% 조건의 배지 하에서 배양하였을 때, 당 소모 속도를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 수크로스 이용성 유전자 csc regulon 의 획득 및 클로닝과 서열분석

수크로스 non-PTS 시스템인 cscBKAR 유전자는 미국생물자원센터 (American Type Culture Collection)로부터 구매한 대장균 W 균주 (ATCC9637)의 염색체를 주형으로 PCR법을 통하여 증폭하였다. 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머를 이용하여 PCR 법을 통하여 게놈상에 연속적으로 존재하는 4종의 유전자 전부를 단일 폴리뉴클레오티드로 증폭하였으며, 서열번호 1의 프라이머는 제한 효소 EagI 부위를 가지고 있고, 서열번호 2의 프라이머는 XbaI 부위를 가지고 있다.

서열 번호 1: 5'-CTTACGGCCGGAGTACATTTGAGCGACTGT-3'

서열 번호 2: 5'-CGACTCTAGACTCGTTGGCGAGAACAGAGG-3'

PCR법의 조건은 94℃에서 3분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링, 72℃ 5분 중합을 25회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 5179 bp의 폴리뉴클레오티드를 획득할 수 있었다. 얻어진 폴리뉴클레오티드를 EagI, XbaI의 제한 효소 처리를 한 후 pACYC184 벡터의 EagI, XbaI자리에 클로닝하여 대장균 DH5α에 형질전환한 후 1 % 수크로스가 포함되어 있는 맥콘키 고체배지 (MacConkey agar plate)에 도말하였다. 콜로니중 진한 자주색 (purple color)을 띠는 콜로니를 선별한 후 통상에 알려진 플라스미드 미니프렙법을 이용하여 플라스미드를 획득하였다.

획득된 플라스미드를 pAcscBKAR로 명명하고, EagI, XbaI 자리에 클로닝된cscBKAR의 DNA 염기서열 (서열번호 3)을 결정하였을 때, 141번째부터 1388번째 염기서열은 cscB 유전자 (서열번호 4), 1460번째부터 2374번째 염기서열은 cscK 유전자 (서열번호 5), 2590번째부터 4023번째 염기서열은 cscA 유전자 (서열번호 6), 4031번째부터 5026번째 염기서열은 cscR 유전자 (서열번호 7)로 밝혀졌다.

실시예 2. pAcscBAR -M 제작

상기 제작은pAcscBAR에 mak유전자를 클로닝하는 방법을 이용하였다. pAcscBAR의 제작은, 서열번호 8과 9의 프라이머를 이용하여 cscK 부위가 제거된 cscB부위의 폴리뉴클레오티드로 증폭하였다.

서열번호 8: 5'-CGCGATATCTAGCATATGCCGGGTACCGCACTAGTTGAGA

GTAAACGGCGAAGT-3'

서열번호 9: 5'-ATTCGGCCGGAGCCCTGCAGGTGCACGAGTACATTTGA

GCGACTGT-3'

PCR법의 조건은 94℃에서 3분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링, 72℃ 1분 30초 중합을 25회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 1521 bp의 폴리뉴클레오티드를 획득할 수 있었다. 얻어진 폴리뉴클레오티드와 pAcscBKAR를 각각 EcoRV와 EagI으로 제한 효소 처리를 한 후 클로닝하여 대장균 DH5α에 형질전환 하였다. LB 배지에서 성장한 콜로니를 이용한 PCR법을 통하여 pAcscBAR이 포함된 콜로니를 선별하였으며, 통상에 알려진 플라스미드 미니프렙법을 이용하여 플라스미드를 획득하였다. 획득된 pAcscBAR 플라스미드의 XbaI과 EagI자리에 연결된cscBAR 의 염기서열 (서열번호 10) 분석을 통하여 변이가 없는 것을 확인하였다.

이어서, 서열번호 11과 12의 프라이머와 대장균 W3110의 염색체를 주형으로 하여 mak가 포함된 폴리뉴클레오티드로 증폭한 후 pAcscBAR의 PstI과 EagI 의 제한 효소 자리에 클로닝하였다.

서열번호 11: 5'-CACTGCAGTGGGGTAAATGCCATCG-3'

서열번호 12: 5'-AACGGCCGTCTCGGTGCTCATTACT-3'

PCR법의 조건은 94 ℃에서 3분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링, 72℃ 1분 30초 중합을 25회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 1388 bp의 폴리뉴클레오티드 (서열번호 13)를 획득할 수 있었다. 얻어진 폴리뉴클레오티드와 pAcscBAR를 각각 PstI과 EagI으로 제한 효소 처리를 한 후 클로닝하여 대장균 DH5α에 형질전환 하였다. LB 배지에서 성장한 콜로니를 이용한 PCR법을 통하여 pAcscBAR-M가 포함된 콜로니를 선별하였으며, 통상에 알려진 플라스미드 미니프렙법을 이용하여 플라스미드를 획득하였다. 획득된 pAcscBAR-M 플라스미드의 XbaI과 EagI자리에 연결된cscBAR-M 의 염기서열 (서열번호 14) 분석을 통하여 변이가 없는 것을 확인하였다.

실시예 3. cscBAR - mak 의 mutation 도입

수크로스 이용성을 향상 시킬 뿐만 아니라 쓰레오닌 생산성을 향상 시키기 위하여 하이드록실아민 (Hydroxylamine)을 처리하여 변이된 수크로스 이용성 유전자를 얻는 화학적 무작위 변이법 (chemical random mutagenesis)을 수행하였다 (Methods Enzymol . (1991) 194:302-318). 우선 1 M 하이드록실아민, 2 mM EDTA, 100 mM 소디움 클로라이드 (sodium chloride), 50 mM 소디움 파이로포스페이트 (sodium pyrophosphate) 를 첨가하여 변이유발액 (mutagenesis solution)을 제조한 후, 1 ml 변이유발액에 목적 DNA를 0.2 mg/ml 농도로 25 μl 넣었다. 서열번호 15과 16의 프라이머와 pAcscBAR-M플라스미드를 주형으로 하여 cscBAR-M가 포함된 폴리뉴클레오티드로 증폭한 후 5887 bp의 cscBAR-M가 포함된 DNA 조각을 목적 DNA로 이용하였다.

서열번호 15: 5'-ATATCTAGACTCGTTGGCGAGAACAGAG-3'

서열번호 16: 5'-AAT TCTAGATGCTCATTACTTATTGCCG-3'

변이유발액을 첨가한 DNA 조각을 75℃에서 30분, 1시간, 2시간, 4시간 마다 500 μl씩 정제컬럼 (purification column)을 이용하여 정제하였다. 하이드록실아민이 처리된 DNA와 XbaI의 제한 효소가 처리된 pACYC177 벡터를 T4 DNA 라이게이즈 (ligase)를 이용하여 연결한 후 쓰레오닌 생산주ABA5G에 형질전환하였다. 형질전환된 균주를 0.1 %의 저농도 수크로스가 포함된 맥콘키 고체 배제에 도말하여 37℃에서 하루 배양 후 진한 퍼플색을 띠는 콜로니를 선별하였다.

선별된 콜로니들을 역가 배지에서 쓰레오닌 생산성과 수크로스 이용속도를 평가하여 최종적으로 쓰레오닌 생산성과 수크로스 이용성이 가장 우수한 한 균주를 선별하였다. 선별된 균주로부터 통상의 플라스미드 미니 프렙법을 이용하여 플라스미드를 얻은 후 염기서열 분석을 수행하였다. 결과적으로 cscR의 388 번째 염기가C에서 T로 치환되었으며, 그에 따라 130번째 아미노산이 히스티딘에서 타이로신으로 변이가 일어났으며, 이 변이를 가진 수크로스 전사 조절자는 서열번호 17의 염기서열에 의해 암호화된다.

실시예 4. 수크로스 이용성 유전자 프로모터 교체된 scrAB 의 획득 및 클로닝과 염기서열

수크로스 PTS 시스템인 scrKYABR 유전자는 미국생물자원센터 (American Type Culture Collection)로부터 구매한 클렙시엘라 뉴모니애 (ATCC700721D-5)의 염색체를 주형으로 PCR법을 통하여 증폭하였다. 클렙시엘라 뉴모니애의 scrAB는 서열번호 18과 서열번호 19의 프라이머를 이용하여 PCR 법을 통하여 게놈상에 연속적으로 존재하는 각 2종의 유전자 전부를 단일 폴리뉴클레오티드로 증폭하였다.

서열번호 18: 5'-AATA CCATGGATTTTGAACAGATTTCCC-3'

서열번호 19: 5'-ATAA TCTAGA GTTTGGTTTTCATCAGCAC-3'

서열번호 18 프라이머는 제한 효소 NcoI부위를 가지고 있고, 서열번호 19의 프라이머는 XbaI 부위를 가지고 있다. 이 때 이용한 프라이머는 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 에 등록되어 있는 클렙시엘라 뉴모니애 (KEGG organism, kpn)의 scrAB 및 주변 염기서열에 대한 정보를 바탕으로 제작하였다.

PCR법의 조건은 94 ℃에서 3분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링, 72℃ 2분 중합을 25회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 클렙시엘라 뉴모니애의 경우 2799 bp의 폴리뉴클레오티드를 획득할 수 있었다. 얻어진 각각의 폴리뉴클레오티드를 NcoI, XbaI의 제한 효소 처리를 한 후 pCL-trc 벡터의 NcoI, XbaI자리에 클로닝하여 대장균 DH5α에 형질전환하여 1 % 수크로스가 포함되어 있는 맥콘키 고체배지 (MacConkey agar plate)에 도말하였다. 콜로니중 진한 퍼플 색 (purple color)을 띠는 콜로니를 선별한 후 통상에 알려진 플라스미드 미니프렙법을 이용하여 플라스미드를 획득하였다.

획득된 클렙시엘라 뉴모니애의 scrAB가 포함된 플라스미드를 pC-Ptrc-scrAB로 명명하고, NcoI, XbaI자리에 클로닝된 trc 프로모터로 교체된scrAB의 DNA 염기서열 (서열번호 20)을 결정하였을 때, 261번째부터 1631번째 염기서열은 scrA 유전자 (서열번호 21), 1631번째부터 3031번째 염기서열은 scrB 유전자 (서열번호 22)로 밝혀졌다.

실시예 5. 프로모터 교체된 pyc 의 획득 및 클로닝과 염기서열

pyc유전자를 확보하기 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 생산능을 가지는 균주 바람직하게는KFCC 10881 균주(한국 공개특허 10-2009-0084099, 한국 등록특허 10-0798118)의 염색체를 주형으로 서열번호 23과 서열번호 24의 프라이머를 이용하여 PCR 법을 통하여 게놈상에 유전자를 증폭하였다. 서열번호 23의 프라이머는 제한 효소 NcoI부위를 가지고 있고, 서열번호 24의 프라이머는 HindIII 부위를 가지고 있다. 이때 이용한 프라이머는 미국 국립 보건원의 유전자 은행(NIH GenBank)을 근거로 하여 pyc 유전자의 염기서열 정보를 확보하였다.

서열번호 23: 5'-AATACCATGGCGACTCACACATCTTC-3'

서열번호 24: 5'-ATTAAGCTTTAAACCAAGACGGCA-3'

PCR법의 조건은 94 ℃에서 3분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링, 72℃ 3분 중합을 25회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 라이신 생산 균주의 경우 3423bp의 폴리뉴클레오티드를 획득할 수 있었다(서열번호 25). 얻어진 각각의 폴리뉴클레오티드를 NcoI, HindIII의 제한 효소 처리를 한 후 pSE380 vector 벡터의 NcoI, HindIII자리에 클로닝하여 대장균 DH5α에 형질전환하여 콜로니를 선별한 후 통상에 알려진 플라스미드 미니프렙법을 이용하여 획득된 플라스미드를 pSE380-Ptrc-pyc로 명명하였다. 제작된 pSE380-Ptrc-pyc 플라스미드를 주형으로 하여 서열번호 24과 서열번호 26의 프라이머를 이용하여 PCR 법을 통하여 게놈상에 유전자를 증폭하였다. 서열번호 24의 프라이머는 제한 효소 HindIII 부위를 가지고 있고, 서열번호 26의 프라이머는 HindIII 부위를 가지고 있다.

서열번호 26: 5'-TATAAGCTTGGCGTCAGGCAGCCATCG-3'

PCR법의 조건은 94 ℃에서 3분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링, 72℃ 3분 중합을 25회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 라이신 생산 균주의 경우3810 bp의 폴리뉴클레오티드를 획득할 수 있었다. 얻어진 각각의 폴리뉴클레오티드를 HindIII의 제한 효소 처리를 한 후 BAC 벡터의 HindIII자리에 클로닝하여 대장균 DH5α에 형질전환하여 콜로니를 선별한 후 통상에 알려진 플라스미드 미니프렙법을 이용하여 획득하였다.

획득된 라이신 생산균주의 pyc가 포함된 플라스미드를 pB-Ptrc-pyc로 명명하고, HindIII자리에 클로닝된 trc 프로모터 교체된pyc 의 DNA 염기서열 (서열번호 27)을 결정하였다.

실시예 6. 쓰레오닌 생산주에 pAcscBAR' -M, pC - Ptrc - scrAB , pB - Ptrcpyc 도입을 통한 L- 쓰레오닌 생산성 향상

pAcscBAR'-M (서열번호 28), pC-Ptrc-scrAB (서열번호 29) 및 pB-Ptrc-pyc(서열번호 30)을 쓰레오닌을 생산하는 대장균에 도입하였을 때, 수크로스를 이용하여 성장할 뿐만 아니라, 실제 효율적인 쓰레오닌 생산이 가능한지 확인하기 위하여 통상의 형질전환 방법을 통하여 쓰레오닌 생산주, ABA5G 균주(NTG 돌연변이법에 의해 제작된 균주이며, 메치오닌 요구성, 아이소루이신 리키(leaky), α-아미노-β-히드록시 바레릭산 내성, 2-아미노에틸-1-시스테인 내성, 1-아제티딘-2-카르복시산 내성)에 도입하여 플라스크 역가 평가를 수행하였다. 33℃ 배양기에서 LB 고체 배지 중에 밤새 배양한 균주를 표 1의 25 mL 역가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 33℃, 200 rpm의 배양기에서 51시간 배양하였으며, 이의 결과를 표 2에 나타내었다.　

조성물	농도 (리터당)
수크로스	70 g
KH₂PO₄	2 g
(NH₄)₂SO₄	25 g
MgSO₄?7H₂O	1 g
FeSO₄?7H₂O	5 mg
MnSO₄?4H₂O	5 mg
효모액기스	2 g
탄산칼슘	30 g
pH	6.8

모균주 ABA5G	OD	잔당 (g/L)	L-쓰레오닌 (g/L)
pAcscBAR' -M	10.8	44	12.3
pAcscBAR' -M, pC-Ptrc-scrAB	29	0	22.8
pAcscBAR'-M, pC-Ptrc-scrAB, pB-Ptrcpyc	27	0	24.7

표 2에서 나타난 바와 같이, 수크로스 non-PTS 시스템 균주(ABA5/ pAcscBAR'-M)는 51시간 배양하였을 경우 26 g/L의 수크로스를 이용하고, 12.3 g/L의 L-쓰레오닌을 생산하였으나, 수크로스 non-PTS 시스템과 수크로스 PTS 시스템을 동시에 이용하는 균주(ABA5G/pAcscBAR'-M, pC-Ptrc-scrAB)는 70 g/L의 수크로스를 이용하고 22.8 g/L의 L-쓰레오닌을 생산하였다. 그리고, 수크로스 non-PTS 시스템과 수크로스 PTS 시스템을 동시 이용하고 추가로 피루베이트 카르복실라제의 활성을 부여한 균주(ABA5G/pAcscBAR'-M, pC-Ptrc-scrAB, pB-Ptrcpyc)는 70 g/L의 수크로스를 이용하고 24.7 g/L의 L-쓰레오닌을 생산하였다. 수크로스 7% 조건의 배지하에서 배양하였을 때, 시간당 성장율을 흡광도로 나타내었다. 수크로스 non-PTS균주(ABA5G/pAcscBAR'-M)의 경우, 51시간 배양 시 OD₆₀₀ 값이 11정도 되며, 수크로스 non-PTS 시스템과 수크로스 PTS 시스템을 동시에 이용하는 균주(ABA5G/pAcscBAR'-M, pC-Ptrc-scrAB) 또는, 수크로스 non-PTS 시스템과 수크로스 PTS 시스템을 동시에 이용하고 추가로 피루베이트 카르복실라제의 활성을 부여한 균주(ABA5G/pAcscBAR'-M, pC-Ptrc-scrAB, pB-Ptrcpyc)의 경우, 51시간 배양 시 OD₆₀₀ 값이 28정도로 나타났고, 시간당 성장율을 흡광도로 나타낸 것이다(도 4). 또, 당 소모 속도의 경우, 수크로스 non-PTS시스템 균주(ABA5G/ pAcscBAR'-M)의 경우, 51시간 배양시 수크로스가 40g/L정도 배지 중에 남아 있었고, 수크로스 non-PTS 시스템과 수크로스 PTS 시스템을 동시에 이용하는 균주(ABA5G/pAcscBAR'-M, pC-Ptrc-scrAB) 또는, 수크로스 non-PTS 시스템과 수크로스 PTS 시스템을 동시에 이용하고 추가로 피루베이트 카르복실라제의 활성을 부여한 균주(ABA5G/pAcscBAR'-M, pC-Ptrc-scrAB, pB-Ptrcpyc)의 경우, 51시간 배양 시 수크로스를 모두 이용하여 배지 중에 수크로스가 남아 있지 않았다(도 5 참조).

즉, 수크로스 non-PTS 시스템과 수크로스 PTS 시스템을 동시에 이용하는 균주(ABA5G/pAcscBAR'-M, pC-Ptrc-scrAB) 또는, 수크로스 non-PTS 시스템과 수크로스 PTS 시스템을 동시에 이용하고 추가로 피루베이트 카르복실라제의 활성을 부여한 균주(ABA5G/pAcscBAR'-M, pC-Ptrc-scrAB, pB-Ptrcpyc)는 수크로스 non-PTS균주(ABA5G/pAcscBAR'-M)보다 수크로스 이용 속도가 약 2.6 배, 쓰레오닌 생산성이 10 g/L 상승하였다.

따라서, 수크로스 non-PTS 시스템과 수크로스 PTS 시스템을 동시에 이용하는 균주(ABA5G/pAcscBAR'-M, pC-Ptrc-scrAB) 또는, 수크로스 non-PTS 시스템과 수크로스 PTS 시스템을 동시에 이용하고 추가로 피루베이트 카르복실라제의 활성을 부여한 균주(ABA5G/pAcscBAR'-M, pC-Ptrc-scrAB, pB-Ptrcpyc)의 경우, 수크로스 이용성 및 L-쓰레오닌의 생산성이 향상됨을 확인할 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당 업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11060

20100205

서열목록 전자파일 첨부

Claims

수크로스 비자화성 미생물에 수크로스 비-포스포트랜스퍼라제 시스템(non-PTS)과 수크로스 포스포트랜스퍼라제 시스템(PTS)의 동시 이용성이 부여된 것을 특징으로 하는 수크로스 자화능 및 증가된 L-아미노산 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물로서, 상기 수크로스 비-포스포트랜스퍼라제 시스템은 수크로스 퍼미아제, 수크로스 하이드로라제, 수크로스 전사 조절자 및 만노키나아제의 활성을 포함하고, 상기 수크로스 포스포트랜스퍼라제 시스템은 수크로스 포스포트랜스퍼라제 시스템 퍼미아제 및 수크로스 포스포트랜스퍼라제 시스템 하이드로라제 활성을 포함하는 것인, 에스케리키아속 미생물.
제 1항에 있어서, 피루베이트 카르복실라제의 활성을 추가로 갖는 에스케리키아속 미생물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 수크로스 퍼미아제가 서열번호 4, 수크로스 하이드로라제가 서열번호 6, 수크로스 전사 조절자가 서열번호 7, 만노키나아제가 서열번호 13의 염기 서열로 암호화된 것이고,
상기 수크로스 포스포트랜스퍼라제 시스템 퍼미아제가 서열번호 21이고, 수크로스 포스포트랜스퍼라제 시스템 하이드로라제가 서열번호 22의 염기서열로 암호화된 것인 에스케리키아속 미생물.
제 4항에 있어서, 수크로스 전사 조절자가 변이체로 서열번호 17의 염기 서열로 암호화된 것인 에스케리키아속 미생물.
제 1항에 있어서, 상기 수크로스 비-포스포트랜스퍼라제 시스템과 수크로스 포스포트랜스퍼라제 시스템의 동시이용은 상기 수크로스 비-포스포트랜스퍼라제 시스템과 수크로스 포스포트랜스퍼라제 시스템을 암호화하는 유전자들의 염색체 삽입 또는 벡터 도입에 의한 카피수 증가, 및 프로모터 교체로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 방법에 의한 것을 특징으로 하는 에스케리키아속 미생물.
제 2항에 있어서, 상기 피루베이트 카르복실라제가 서열번호 25의 염기서열로 암호화된 것인 에스케리키아속 미생물.
제 2항에 있어서, 상기 피루베이트 카르복실라제를 암호화하는 염기서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 에스케리키아속 미생물.
제 6항에 있어서, 프로모터 교체에 의한 방법에 의해 활성이 강화된 것인 에스케리키아속 미생물.
제 1항에 있어서, 상기 미생물은 대장균인 에스케리키아속 미생물.
제 2항에 있어서, 상기 미생물은 대장균 CA03-0392P (수탁번호 KCCM11060P)인 것을 특징으로 하는 에스케리키아속 미생물.
제 1항에 있어서, L-아미노산이 L-쓰레오닌, O-숙시닐-호모세린, O-아세틸호모세린, L-메티오닌, L-라이신, L-호모세린, L-이소루신, L-발린, 및 L-트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 에스케리키아속 미생물.
탄소원으로서 수크로스의 일부 또는 전부가 포함된 배양 배지에 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제12항 중 어느 한 항의 미생물을 접종하여 배양하는 단계; 및
상기 배양물로부터 L-아미노산을 분리하는 단계를 포함하는 L-아미노산 생산방법.
제 13항에 있어서, L-아미노산은 L-쓰레오닌, O-숙시닐-호모세린, O-아세틸호모세린, L-메티오닌, L-라이신, L-호모세린, L-이소루신, L-발린, 및 L-트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 것을 특징으로 하는 L-아미노산 생산방법.