KR100837845B1

KR100837845B1 - 탄소원의 수송 조절을 담당하는 유전자의 활성이 증가된ｌ-쓰레오닌 생산 미생물 및 이를 이용한 ｌ-쓰레오닌 생산방법

Info

Publication number: KR100837845B1
Application number: KR1020060127205A
Authority: KR
Inventors: 최종일; 양영렬; 박영훈
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2006-12-13
Filing date: 2006-12-13
Publication date: 2008-06-13

Abstract

본 발명은 L-쓰레오닌의 생산능을 가진 미생물로서, 탄소원의 수송 조절을 담당하는 유전자의 발현을 증가시켜 L-쓰레오닌의 생산효율이 증가된 것을 특징으로 하는 미생물과 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 L-쓰레오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

쓰레오닌, 대장균, 크실로오스(Xylose), xylR

Description

탄소원의 수송 조절을 담당하는 유전자의 활성이 증가된 Ｌ-쓰레오닌 생산 미생물 및 이를 이용한 Ｌ-쓰레오닌 생산 방법{A microorganism whose expression level of transcriptional regulator for carbon source transport is enhanced and the process for producing L-threonine using the microorganism}

도 1은 재조합 벡터 pCL-P_aroF-xylR의 제작과정을 도시한 것이다.

본 발명은 탄소원의 수송 조절을 담당하는 유전자의 활성을 증가시켜 L-쓰레오닌 생산 효율이 증가된 L-쓰레오닌 생산 미생물 및 이를 이용한 L-쓰레오닌 생산 방법에 관한 것이다.

L-쓰레오닌은 필수 아미노산의 일종으로 사료 및 식품 첨가제로서 널리 사용되며 의약용으로 수액제 및 의약품의 합성 원료로도 사용되고 있다. L-쓰레오닌은 미생물 발효법으로 제조되며, 대장균(Escherichia coli), 코리네박테리움(Corynebacterium), 세라티아(Serratia) 속 또는 프로비덴시아(Providencia) 속 미생물의 야생주로부터 유도된 인공변이주 등이 사용되고 있다.

일본국 공개특허 평제2-219582호에는 프로비덴시아(Providencia) 속에 속하며 α-아미노-β-히드록시 발레르산, L-메티오닌, 티아이소루이신(thiaisoleucine), 옥시티아민(oxythiamine) 및 설파구아니딘(sulfaguanidine) 내성을 지니며, L-루이신 요구성, L-이소루이신 리키(leaky)형 요구성 미생물을 이용하여 L-쓰레오닌을 생산하는 방법이 기술되어 있으며, 한국특허공개 제1992-0012423호에는 L-메티오닌 유사체에 대한 내성을 가지며, 메티오닌 영양요구성, L-쓰레오닌 유사체에 대한 내성, 이소루이신 리키형 요구성, L-라이신 유사체에 대한 내성 및 α-아미노 부티르산 내성을 가지며, L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 대장균(Escherichia coli)에 속하는 미생물에 대하여 기술되어 있다.

전술된 바와 같은 종래 기술의 방법들은 무작위로 유전자를 변형시켜 유효한 미생물을 선별하였다. 하지만, 대장균 등의 전체 염색체 서열이 확인되고, 이후 다양한 생물 정보학 자료들이 축적되면서 이전까지는 알지 못하였던 유전자들의 기능에 관한 연구가 가능해졌다. 생합성 경로에 직접적으로 관여하는 효소들의 발현 강화가 주로 이루어져 높은 생산 수율로 아미노산을 생산할 수 있는 다수의 미생물이 개발되고 있다. 최근에는 탄소원의 세포 내로의 수송을 증가시켜 대사 활성 및 이에 따른 L-쓰레오닌의 생산 효율을 증가시키려는 시도가 이루어지고 있다. 예를 들면, WO 06/043730은 D-크실로오스 퍼미아제의 활성이 증가되도록 변형된 엔테로박테리아시애 과에 속하는 L-아미노산 생산 미생물을 기재하고 있다.

아미노산의 생합성 경로에 직접 관여하는 효소들의 활성이나 그 유전자의 발현을 강화하고 생합성 경로 조절을 최적화하여 아미노산의 생산 효율을 증가시킨 미생물이 많이 개발되었으나, 개선된 아미노산 생산능을 갖는 균주에서는 탄소원의 공급이 생산 효율의 제한 요인으로 작용할 수 있다. 따라서, 탄소원의 세포 내로의 수송을 향상시켜 고수율로 아미노산을 생산하는 미생물의 개발이 요구된다.

이에 본 발명자는 L-쓰레오닌 생산성을 증가시키기 위한 연구를 수행한 결과, 대장균 내에서 크실로오스 수송을 코딩하는(xylose transporter) xylFGH와 크실로오스 분해 경로(xylose degradation pathway)를 코딩하는 xylAB의 전사 활성자로 알려진 xylR을 발현량을 증가시켜 L-쓰레오닌 생산성이 증가한다는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 탄소원의 수송 조절을 담당하는 유전자의 발현을 증가시켜 L-쓰레오닌의 생산 효율이 증가된, L-쓰레오닌 생산능을 갖는 엔테로박테리아시애(Enterobacteriaceae) 과에 속하는 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 탄소원의 수송 조절을 담당하는 유전자의 발현을 증가시켜 L-쓰레오닌의 생산 효율이 증가된, L-쓰레오닌 생산능을 갖는 엔테로박테리아시애 과의 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, L-쓰레오닌을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 L-쓰레오닌의 생산능을 가지며, 탄소원의 수송 조절을 담당하는 유전자의 발현을 증가시켜 L-쓰레오닌의 생산효율이 증가된 것을 특징으로 하는 엔테로박테리아시애 과에 속하는 미생물을 제공 한다.

본 발명에서 탄소원의 수송 조절을 담당하는 유전자는 대장균에서 유래한 서열번호 6의 서열을 갖는 유전자 xylR(NCBI GI:15833706)일 수 있다.

대장균에서 크실로오스의 수송 및 대사에 관여하는 효소들은 xylABFGHR에 의해 코딩된다. 즉, 이들은 크실로오스의 수송(xylF, xylG 및 xylH), 이성질체화(xylA), 인산화(xylB)에 관여하는 효소들 및 전사 조절자(xylR)로 구성되며, 이들 중 xylR 유전자는 전자 조절자의 기능을 갖는 것으로 추정되고 있다. xylR 유전자의 발현을 증가시키면 크실로오스 등의 오탄당 뿐 아니라 포도당의 탄소원으로서의 이용이 촉진된다.

본 발명의 일 양태에서 탄소원의 수송 조절을 담당하는 유전자는 서열번호 6의 xylR 유전자 일 수 있다.

본 발명의 미생물은 엔테로박테라아시애 과에 속하는 세균으로 구성될 수 있으며, L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 어떤 미생물도 가능하다. 본 발명의 미생물은 에세리키아속 세균, 세라티아속 세균, 및 프로비덴시아 속 세균으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는 대장균이다. 보다 바람직하게는 대장균 TF5015(메티오닌 요구성, 아이소루이신 리키형, α-아미노-β-히드록시발레르산 내성, 2-아미노에틸-l-시스테인 내성, l-아제티딘-2-카르복시산 내성)을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 양태에서는 대상이 되는 유전자의 발현을 증가시키기 위해 유전자를 다복제수의 벡터를 이용하여 숙주세포로 도입하여 발현량을 증가시킬 수 있 다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 바람직하게는, 에세리키아(Escherichia) 속의 박테리아에서 자율적으로 증식할 수 있는 카피 수가 적은 pCL1920 플라스미드 벡터(Lerner, C.G. and Inouye, M., Nucl. Acids Res. (1990) 18:4631)를 사용할 수 있다.

또한 본 발명에서 이용되는 재조합 벡터는 공지된 통상의 방법에 의하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 발현을 위한 프로모터와 터미네이터가 있는 적절한 벡터에 SmaI , HindIII 등의 제한효소 및 DNA 리가아제를 사용하여 상기 xylR 유전자를 라이게이션시킴으로써 제조할 수 있다. 발현을 위한 프로모터로는 trc, tac, lac 등 이나 대장균 aroF 유전자의 프로모터 등을 사용할 수 있으며, 또한 효과적인 발현을 위하여 터미네이터를 사용할 수 있다.

본 발명의 미생물은 탄소원 수송의 조절을 담당하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 미생물일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 미생물은 서열번호 6의 xylR 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 미생물일 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 미생물은 상기 재조합 벡터로 대장균 TF5015(Global Analyses of Transcriptomes and Proteomes of a Parent Strain and an L-Threonine-Overproducing Mutant Strain, Jin-Ho Lee, Dong-Eun Lee, Bheong-Uk Lee, and Hak-Sung Kim, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Sept. 2003, p. 5442-5451)를 형질전환시켜 수득된 대장균 CO01-0014 (수탁번호 KCCM10806)일 수 있다.

본 발명에서 형질전환된 미생물은 탄소원 수송의 조절을 담당하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 사용하여 통상의 방법으로 숙주세포를 형질전환시켜 제조할 수 있다. 숙주세포는 L-쓰레오닌 생산능 미생물이며, 바람직하게는 그람음성 박테리아에 속하는 미생물이고, 보다 바람직하게는 엔테로박테리아시애 과에 속하는 미생물일 수 있다. 가장 바람직하게는, 에세리키아 속에 속하는 미생물일 수 있다.

상기와 같은 L-쓰레오닌 생성용 재조합 미생물은 대장균 내의 xylR 유전자의 발현양을 증가시킴으로써 탄소원으로 포도당, 크실로오스, 또는 포도당과 크실로오스 혼합물을 사용하여 L-쓰레오닌의 생산 농도가 변이 전의 L-쓰레오닌 생산 농도보다 증가함으로써 L-쓰레오닌을 고농도로 생산할 수 있다.

본 발명은 또한 탄소원 수송 조절을 담당하는 유전자의 발현을 증가시켜 L-쓰레오닌의 생산 효율이 증가된 것을 특징으로 하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, L-쓰레오닌을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 탄소원의 수송 조절을 담당하는 유전자는 xylR 유전자일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 6의 xylR 유전자일 수 있다.

본 발명에서, L-쓰레오닌 생산능을 갖는 미생물을 배양하는 단계를 탄소원으로 포도당, 크실로오스, 또는 포도당과 크실로오스 혼합물을 사용할 수 있다.

본 발명의 재조합 미생물로부터 L-쓰레오닌을 대량 생산하기 위해 그 미생물을 배양하고, 그 배양물로부터 목적하는 L-쓰레오닌을 분리하는 모든 공정은 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1 : xylR 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제조

대장균의 xylR 유전자의 발현량 증가에 따른 L-쓰레오닌 생산능의 향상을 확인하기 위하여 xylR 유전자를 대장균에서 다복제수를 갖는 플라즈미드를 이용하여 과다 발현시키는 방법을 사용하였다.

(1) aroF 프로모터의 클로닝

발현에 필요한 프로모터를 벡터인 플라즈미드 pCL1920(Lerner, C.G. and Inouye, M., Nucl. Acids Res. (1990) 18:4631)에 삽입하였다. 대장균의 염색체에 존재하는 aroF 유전자의 프로모터를 사용하기 위하여 각각 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 1과 2를 제작하였다. 대장균 야생주 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응법(PCR법) [Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories](PCR 조건: 변성=95℃, 30초/어닐링=53℃, 30초/중합=72℃, 1분, 30회)에 의해 약 294 쌍의 aroF 유전자의 프로모터 부분(서열번호 5)을 증폭하였다. 얻어진 DNA 단편을 KpnI 과 EcoRV의 제한 효소로 절단하고 동일한 제한 효소로 절단된 pCL1920 플라즈미드를 T4 DNA 리가아제를 이용하여 라이게이션하여 pCL-P_aroF를 제작하였다.

(2) xylR 유전자의 클로닝

대장균 W3110으로부터 xylR 를 클로닝하기 위하여 각각 서열번호 3 및 서열 번호 4의 프라이머 3과 4를 제작하였다. xylR 유전자 (NCBI GI: 15833706: 서열번호 6)의 염기 서열은 이미 문헌에 보고되어 있다. 대장균 야생주 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응법(PCR법) [Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories](PCR 조건: 변성=95℃, 30초/어닐링=53℃, 30초/중합=72℃, 1분, 30회)에 의해 약 1179 염기쌍의 xylR 유전자(서열번호 6)를 증폭하였다.

(3) 재조합 벡터의 제조

수득된 xylR DNA 단편을 SmaI 과 HindIII의 제한 효소로 절단하고 상기 DNA 단편과 EcoRV 및 HindIII 제한 효소로 절단된 pCL-P_aroF 플라즈미드를 T4 DNA 리가아제를 이용하여 라이게이션하여 도 1과 같은 재조합 벡터 pCL-P_aroF-xylR를 제조하였다.

실시예 2 : 포도당으로부터 xylR 유전자가 과발현된 재조합 미생물의 쓰레오닌 생산 농도 비교

본 실시예에서는 실시예 1에서 제작된 재조합 벡터(pCL-P_aroF-xylR)로 L-쓰레오닌 생산능 대장균 (Escherichia coli) TF5015를 전기 형질전환(electro-transformation)시켰다. 먼저, 대장균 TF5015를 LB 배지에서 초기 대수 증식기까지 배양한 후 di-H₂O와 10% 글리세롤로 세척하고 최소 부피의 10% 글리세롤에 현탁하여 형질전환용 세포들(electro-competent cell)을 제작하였다. 제작된 상기 형질전환용 세포를 유전자 펄서(Gene pulser)를 이용하여 실시예 1에서 수득한 벡터 pCL- P_aroF-xylR로 형질전환시켰다. 얻어진 대장균 형질전환체 CO01-0014(수탁번호 KCCM10806)를 표 1에서와 같은 조성을 갖는 플라스크 역가 배지를 이용하여 배양하고, 그로부터 얻어진 쓰레오닌 농도와 대장균 TF5015에서 얻어진 쓰레오닌 농도를 비교하였다. 얻어진 L-쓰레오닌 농도는 3개의 플가스크 결과의 평균값을 사용하였다.

표 1:플라스크 역가 배지

조성	농도(g/L)
포도당	70
효모 추출물	2
황산 암모늄	28
황산 마그네슘	0.5
황산 제1철	0.005
황산 망간	0.005
L-메티오닌	0.15
탄산칼슘	30
인산 이수소칼륨	1

그 결과, 표 2와 같이 대장균 형질전환체 CO01-0014(수탁번호 KCCM10806)에 의해 생산된 L-쓰레오닌 농도가 대장균 TF5015에서보다 16% 증가한 것이 확인되었다.

표 2: L-쓰레오닌 농도 비교

균주	L-쓰레오닌(g/L)
TF5015	9.29
CO01-0014	10.78

실시예 3 : 크실로오스로부터 xylR 유전자가 과발현된 재조합 미생물의 쓰레오닌 생산 농도 비교

본 실시예에서는 실시예 2에서 수득한 대장균 형질전환체 CO01-0014(수탁번 호 KCCM10806)를 표 3에서와 같은 조성을 갖는 플라스크 역가 배지를 이용하여 배양하고, 그로부터 얻어진 쓰레오닌 농도와 대장균 TF5015에서 얻어진 쓰레오닌 농도를 비교하였다. 표 5의 역가 배지 조성은 표3의 역가 배지 조성에서 탄소원으로 포도당 대신 크실로오스를 사용한 것이다. 얻어진 L-쓰레오닌 농도는 3개의 플가스크 결과의 평균값을 사용하였다.

표 3:플라스크 역가 배지

조성	농도(g/L)
크실로오스	50
효모 추출물	2
황산 암모늄	28
황산 마그네슘	0.5
황산 제1철	0.005
황산 망간	0.005
L-메티오닌	0.15
탄산칼슘	30
인산 이수소칼륨	1

그 결과, 표 4와 같이 대장균 형질전환체 CO01-0014(수탁번호 KCCM10806)에 의해 생산된 L-쓰레오닌 농도가 대장균 TF5015에서보다 50.8% 증가한 것이 확인되었다.

표 4:L-쓰레오닌 농도 비교

균주	L-쓰레오닌(g/L)
TF5015	5.33
CO01-0014	8.04

실시예 4 : 포도당과 크실로오스의 혼합물로부터 xylR 유전자가 과발현된 재조합 미생물의 쓰레오닌 생산 농도 비교

본 실시예에서는 실시예 2에서 수득한 대장균 형질전환체 CO01-0014(수탁번 호 KCCM10806)를 표 5에서와 같은 조성을 갖는 플라스크 역가 배지를 이용하여 배양하고, 그로부터 얻어진 쓰레오닌 농도와 대장균 TF5015에서 얻어진 쓰레오닌 농도를 비교하였다. 표 6의 역가 배지 조성은 표3의 역가 배지 조성에서 탄소원으로 포도당 대신 포도당과 크실로오스를 사용한 것이다. 얻어진 L-쓰레오닌 농도는 3개의 플라스크 결과의 평균값을 사용하였다.

표 6: 플라스크 역가 배지

조성	농도(g/L)
포도당	60
크실로오스	10
효모 추출물	2
황산 암모늄	28
황산 마그네슘	0.5
황산 제1철	0.005
황산 망간	0.005
L-메티오닌	0.15
탄산칼슘	30
인산 이수소칼륨	1

그 결과, 표 7과 같이 대장균 형질전환체 CO01-0014의 포도당으로부터의 L-쓰레오닌의 생산 수율이 대장균 TF5015에서보다 19.1% 증가한 것이 확인되었다. L-쓰레오닌의 생산 수율은 소모된 포도당의 양에 대한 생산된 L-쓰레오닌의 양의 백분율로 표시하였다. 본 실시예에서 보는 바와 같이, 형질전환체 CO01-0014의 배양에서 포도당과 함께 저가의 크실로오스를 탄소원으로 첨가하여 고가의 포도당에 대한 L-쓰레오닌의 생산수율이 증가하였다. 또한, 대장균 TF5015는 포도당이 고갈된 이후에 크실로오스를 소모하기 시작하나, 형질전환체 CO01-0014는 포도당과 동시에 크실로오스를소모하여 포도당과 크실로오스의 동시 이용성을 보였다. 따라서, 저가의 헤미셀룰로오스 가수분해물을 탄소원으로 이용할 경우 형질 전환체 CO01-0014는 모균주인 TF5015보다 높은 수율로 L-쓰레오닌을 생산할 수 있다는 것을 알 수 있 다.

표 7:L-쓰레오닌 농도 비교

균주	포도당으로부터의 L-쓰레오닌(g L-쓰레오닌/g 포도당)
TF5015	17.44%
CO01-0014	20.78%

본 발명자들은 상기한 실시예 2에서 제작된 대장균 CO01-0014를 부다페스트 조약에 따른 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 2006년 11월 28일자로 기탁하고 수탁번호 KCCM10806을 부여받았다.

본 발명의 미생물은 탄소원의 수송 조절을 담당하는 유전자의 발현을 증가시켜 L-쓰레오닌의 생산 효율이 증가된다. 본 발명의 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 L-쓰레오닌을 생산하는 방법에 의하면, L-쓰레오닌을 높은 생산 효율로 생산할 수 있다.

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서열번호 6의 서열로 구성된 xylR 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환되어 L-쓰레오닌의 생산효율이 증가된 것을 특징으로 하는 대장균 CO01-0014(KCCM10806).
제4항의 대장균을 배양하는 단계를 포함하는 L-쓰레오닌을 생산하는 방법.