KR20080010905A

KR20080010905A - Ｌ-쓰레오닌 생합성 경로의 속도제한 단계를 담당하는효소의 활성이 강화된 ｌ-쓰레오닌 생산 미생물 및 이를이용한 ｌ-쓰레오닌 생산 방법

Info

Publication number: KR20080010905A
Application number: KR1020060071580A
Authority: KR
Inventors: 최종일; 박영훈; 양영렬
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 2006-07-28
Filing date: 2006-07-28
Publication date: 2008-01-31
Also published as: WO2008013428A1

Abstract

본 발명은 L-쓰레오닌의 생산능을 가진 미생물로서, 상기 미생물에 의한 L-쓰레오닌의 생합성 경로에 있어서 속도 제한 단계를 담당하는 효소의 발현을 증가시켜 L-쓰레오닌의 생산효율이 증가된 것을 특징으로 하는 미생물 및 이를 이용한 L-쓰레오닌의 생산방법에 관한 것이다.

L-쓰레오닌, 대사조절 분석, 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제, 속도 제한 단계(rate-limiting step)

Description

Ｌ-쓰레오닌 생합성 경로의 속도제한 단계를 담당하는 효소의 활성이 강화된 Ｌ-쓰레오닌 생산 미생물 및 이를 이용한 Ｌ-쓰레오닌 생산 방법{A microorganism whose enzyme activity for a rate-limiting step in the biosynthesis of L-threonine is enhanced and the process for producinig L-threonine using the microorganism}

도 1은 재조합 벡터 pCL-P_aroF-asd의 제작과정을 도시하며,

도 2는 L-쓰레오닌의 생합성 경로를 도시한다.

본 발명은 L-쓰레오닌을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 L-쓰레오닌 생산방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 대사조절분석(metabolic control analysis)을 이용하여 L-쓰레오닌(L-threonine) 생산능을 갖는 미생물에서 L-쓰레오닌 생합성 경로의 속도 제한 단계(rate-limiting step)를 결정하고, 그 단계를 담당하는 효소 발현을 증가시켜 제작된 L-쓰레오닌을 고수율로 생산하는 미생물 및 그 미생물을 이용하여 L-쓰레오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

L-쓰레오닌은 필수 아미노산의 일종으로 사료 및 식품 첨가제로서 널리 사용되며 의약용으로 수액제 및 의약품의 합성 원료로도 사용되고 있다. L-쓰레오닌은 미생물 발효법으로 제조되며, 대장균(Escherichia coli), 코리네박테리움(Corynebacterium), 세라티아(Serratia) 속 또는 프로비덴시아(Providencia) 속 미생물의 야생주로부터 유도된 인공변이주 등이 그 생산 균주로서 사용되고 있다. 일본국 공개특허 평제2-219582호에는 프로비덴시아(Providencia) 속에 속하며 α-아미노-β-히드록시발레르산, L-메티오닌, 티아이소루이신(thiaisoleucine), 옥시티아민(oxythiamine) 및 설파구아니딘(sulfaguanidine) 내성을 지니며, L-루이신 요구성, L-이소루이신 리키(leaky)형 요구성 미생물을 이용하는 방법이 기술되어 있으며, 한국 등록특허 제58286호에는 L-메티오닌 유사체에 대한 내성을 가지며, 메티오닌 영양요구성, L-쓰레오닌 유사체에 대한 내성, 이소루이신 리키형 요구성, L-라이신 유사체에 대한 내성 및 α-아미노 부티르산 내성을 가지며, L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 대장균(Escherichia coli)에 속하는 미생물에 대하여 기술되어 있다.

전술된 바와 같은 선행 기술의 방법들은 인공돌연변이 방법을 이용하여 무작위로 변형이 일어난 미생물들 중에서 유효한 변이를 갖는 미생물을 선별한다. 따라서, 이러한 인공변이에 의한 미생물 개발 방법을 이용하는 경우, 변형된 미생물의 특성을 정확히 파악할 수 없을 뿐만 아니라 변형된 미생물들이 미생물의 성장을 저해하는 변이들을 가질 수도 있다. 그 결과, 이와 같은 인공 돌연변이를 이용하는 선행 기술 방법은 L-쓰레오닌 수율은 증가시키나 미생물의 성장 속도를 저해하여 생산성의 감소를 야기할 수도 있다. 따라서 대사회로 내에서 변형이 필요한 부위를 정확하게 확인할 수 있는 기법의 개발이 필요하게 되었다.

최근에는 L-쓰레오닌을 생합성하는 대사경로에 관여하는 주요 효소의 반응성을 증가시키는 대사공학적 방법을 통해 재조합 균주를 제조하고, 이로부터 L-쓰레오닌을 대량으로 생산할 수 있는 방법이 개발되고 있다. 즉, 유전자 재조합 기술을 이용하여 L-쓰레오닌의 대사경로에 관여하는 효소들의 유전자를 분리하고 이들 유전자를 적당한 벡터에 클로닝 한 후, 이 재조합 벡터를 이용하여 미생물을 형질변환시켜 L-쓰레오닌 생산성을 향상시키는 방법이 개발되고 있다.

한편, 대사 공학적 방법의 일종인 대사회로분석 기법은 미생물 내에서의 효소 반응을 수학적으로 모델링하여 효소의 활성이나 변형에 따른 대사 흐름이나 대사체의 농도에 미치는 영향을 예측하는 방법이다. 최근 대장균의 주요 대사 회로에 관한 동역학적 모델들이 발표되었으나(Dynamic modeling of the central carbon metabolism of Escherichia coli, Christophe Chassagnole, Naruemol Noisommit-Rizzi, Joachim W. Schmid, Klaus Mauch, Matthias Reuss, Biotechnology and Bioengineering, Volume 79, Issue 1: 53-73), 이러한 대사회로분석 기법을 이용하여 L-쓰레오닌 생산성을 증가시킨 미생물의 개발은 아직 이루어지지 않았다.

이에 본 발명자는 L-쓰레오닌 생산성을 증가시키기 위한 연구를 수행한 결과, 대사조절분석 기법을 이용하여 L-쓰레오닌 생합성 경로에서의 반응 속도 제한 단계를 확인하고 그 확인된 반응 단계에 관여하는 효소의 활성을 증가시킴으로써 L-쓰레오닌 생산성이 증가한다는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 대사조절분석 기법을 이용하여 L-쓰레오닌 생합성 경로에서의 속도 제한 단계를 결정하고, 그 반응 단계에 관여하는 효소의 활성을 강화시킨 L-쓰레오닌 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 L-쓰레오닌 생산능 재조합 미생물을 배양하여 L-쓰레오닌을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 L-쓰레오닌의 생산능을 가진 미생물로서, 상기 미생물에 의한 L-쓰레오닌의 생합성 경로에 있어서 속도 제한 단계를 담당하는 효소의 발현을 증가시켜 L-쓰레오닌의 생산효율이 증가된 것을 특징으로 하는 미생물을 제공한다.

본 발명의 일 양태에서, L-쓰레오닌 생합성의 속도를 제한하는 반응을 담당하는 효소는 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제(Asparate Semialdehyde dehydrogenase)일 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, L-쓰레오닌의 생산능을 가진 미생물은 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 미생물일 수 있다.

본 발명의 L-쓰레오닌 생성용 미생물은 대장균, 코리네박테리움속 세균, 세라티아속 세균, 프로덴시아 세균 등과 같이 L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 어떤 미생물도 가능하며, 바람직하게는 대장균이다. 보다 바람직하게는 메티오닌 요구성, 이소루이신 리키형 요구성, α-아미노-β-히드록시발레르산 내성, 2-아미노에틸-L-시스테인 내성, L-아제티딘-2-카르복시산 내성을 갖는 대장균 TF5015(Global Analyses of Transcriptomes and Proteomes of a Parent Strain and an L-Threonine-Overproducing Mutant Strain, Jin-Ho Lee, Dong-Eun Lee, Bheong-Uk Lee, and Hak-Sung Kim, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Sept. 2003, p. 5442-5451)을 사용할 수 있다.

본 발명의 미생물을 제조하기 위해 활용된 대사조절분석 기법은 대사 흐름이 특정 효소의 활성과 대사체 농도에 따라 어떻게 변화하는지를 이해하기 위한 통계적인 모델링 기법이다. 대사조절분석은 대사 시스템의 조절을 모델링하기 위한 방법을 수학적 형태로 제공하며 독립적인 변수(Parameters)가 대사흐름이나 대사체의 농도(Variables)에 영향을 주는 상대적인 값을 묘사한다. 따라서 수학적 해법에 의하여 대사 흐름에 상대적으로 많은 영향을 주는 인자를 발견하고, 그 인자를 조절함으로써 원하는 생산물로의 대사 흐름을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, L-쓰레오닌 생산을 위한 미생물의 생합성 효율을 증진시키기 위해 도 2와 같은 L-쓰레오닌 생합성 경로를 파악하고 각 단계에 관여하는 효소 및 기질 농도를 조절하면서 최종 생성물인 L-쓰레오닌의 양에 가장 큰 영향을 미치는 인자를 찾아 이를 조절하여 생산성을 높일 수 있다. 즉, L-쓰레오닌 생합성 경로에서 전체 반응 속도를 결정하는 속도 제한 단계(rate limiting step)를 담당하는 효소를 찾아 그 발현의 증가를 통해 활성을 강화하여 L-쓰레오닌을 고수율로 생산하는 미생물을 제조할 수 있다.

본 발명의 일 양태에서는 대상이 되는 효소의 활성을 증가시키기 위해 효소 의 유전자를 다복제수의 벡터를 이용하여 숙주세포로 도입하여 효소량을 증가시키는 방법을 사용한다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 바람직하게는, 에세리키아 (Escherichia) 속의 박테리아에서 자율적으로 증식할 수 있는 카피 수가 적은 pCL1920 플라미스미드 벡터를 사용할 수 있다.

또한 본 발명의 재조합 벡터는 공지된 통상의 방법에 의하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 발현을 위한 프로모터와 터미네이터가 있는 적절한 벡터에 SmaI과 PstI 등의 제한효소를 사용하여 상기 대사조절분석에서 확인된 효소의 유전자를 라이게이션시킴으로써 제조할 수 있다. 발현을 위한 프로모터로는 trc, tac, lac 등 이나 대장균 aroF 유전자의 프로모터 등을 사용할 수 있으며, 또한 효과적인 발현을 위하여 터미네이터를 사용할 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 재조합 벡터에 의해 형질전환된 L-쓰레오닌의 생산능을 가진 미생물은 대장균 TF64211(KCCM-10764)일 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 형질전환 미생물은 상기의 재조합 벡터를 사용하여 통상의 방법으로 숙주세포를 형질전환시켜 제조할 수 있다. 숙주세포는 L-쓰레오닌 생성용 미생물이며, 바람직하게는 그람음성 박테리아에 속하는 미생물이고, 보다 바람직하게는 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하는 미생물일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서는 상기 재조합 벡터로 대장균(Escherichia coli) TF5015를 형질전환시켜 대장균 TF64211(KCCM-10764)을 제조하였다.

상기와 같은 L-쓰레오닌 생성용 재조합 미생물은 대사조절분석 기법에 의하 여 속도 결정 단계의 효소의 활성을 증가시킴으로써 L-쓰레오닌의 생산성이 변이 전의 L-쓰레오닌 생산성보다 증가함으로써 L-쓰레오닌을 고생산성으로 생산할 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태에서, 본 발명은 속도 결정 단계의 효소 활성이 증가된 L-쓰레오닌 생성용 재조합 미생물로부터 L-쓰레오닌을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 재조합 미생물로부터 L-쓰레오닌을 대량 생산하기 위해 그 미생물을 배양하고, 그 배양물로부터 목적하는 L-쓰레오닌을 분리하는 모든 공정은 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1 : 대사조절분석 기법을 이용한 L- 쓰레오닌 생합성 경로의 속도 제한 단계 결정.

대장균에서의 L-쓰레오닌 생합성 경로에 대한 효소 반응의 수학적 모델은 Christophe Chassagnole 등에 의하여 이전에 발표되었다 (An integrated study of threonine-pathway enzyme kinetics in Escherichia coli, Biochem . J. (2001) 356, 415 - 423). 하지만, 발표된 수학적 모델은 야생 대장균 미생물에 관한 정보를 이용하여 수립되었고, 본 발명에서 사용된 L-쓰레오닌 생성능 미생물인 대장균 TF5015의 경우 아스파테이트 키나아제-호모세린 디하이드로게나아제를 코딩하는 유 전자인 thrA 내의 염기서열 변이로 인해 야생 미생물과는 다른 L-쓰레오닌 생합성 효소들의 특성을 가지므로 TF5015에 맞도록 L-쓰레오닌 생합성 효소들의 반응식을 수정하였다. 본 발명에서 이용된 모델은 다음과 같은 식들을 포함한다:

상기에서,

V1 = 아스파테이트 키나아제의 반응식;

V2 = 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제의 반응식;

V3 = 호모세린 디하이드로게나아제의 반응식;

V5 = 호모세린 키나아제의 반응식;

V4 = 쓰레오닌 신타아제의 반응식;을 나타낸다.

구체적으로 TF5015에서는 L-쓰레오닌에 의한 아스파테이트 키나아제 효소의 피드백 저해가 해제되었으므로 논문에 발표된 아스파테이트 키나아제에 의한 반응 의 수학적 모델을 수정하였다. 또한 각각의 효소 반응 속도식의 매개변수들에 대해서도 논문에서 발표된 값들과는 다른 L-쓰레오닌 생성능 대장균 TF5015에 대한 매개변수들로 수정하였다. 이와같이 L-쓰레오닌에 의한 피드백 조절의 영향이 해제된 모델을 가지고 L-쓰레오닌 생합성에서 중요한 역할을 하는 5가지 효소, 즉, 아스파테이트 키나아제(aspartate kinase), 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제(aspartate semialdehyde dehydrogenase), 호모세린 디하이드로게나아제 (homoserine dehydrogenase), 호모세린 키나아제(homoserine kinase), 쓰레오닌 신타아제(threonine synthase)에 대하여 L-쓰레오닌 생합성에 관련하는 효소들의 대사조절분석 기법을 이용하여 각 효소 활성의 증가에 대한 L-쓰레오닌 대사 흐름의 증가량을 계산하였다. 각각의 효소의 활성 증가에 따른 L-쓰레오닌 대사 흐름의 증가량을 상대적으로 비교한 값들을 표 1에 표시한다.

표 1:효소 활성 증가에 따른 대사 흐름 증가의 상대량

효소 이름	L-쓰레오닌 대사 흐름 증가량
아스파테이트 키나아제	24.7
아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제	56.5
호모세린 디하이드로게나아제	18.2
호모세린 키나아제	0.6
쓰레오닌 신타아제	0

그 결과 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제(asd)의 양을 증가시켰을 경우 L-쓰레오닌 생합성 경로의 대사흐름이 가장 크게 증가한다는 결과를 얻었다. 이에 의해, 대장균 TF5015에서 L-쓰레오닌의 생합성 속도를 제한하는 단계는 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제에 의한 단계임을 알 수 있었다.

실시예 2 : 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로제나제 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제조

대사조절분석 기법을 이용하여 대장균 TF5015의 L-쓰레오닌 생합성에서의 속도 결정단계로 확인된 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제의 활성 증가를 위하여 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제의 유전자를 대장균에서 다복제수를 갖는 플라즈미드를 이용하여 과다 발현시키는 방법을 사용하였다.

먼저 발현에 필요한 프로모터를 벡터인 플라즈미드 pCL1920에 삽입하였다. 대장균의 염색체에 존재하는 aroF 유전자의 프로모터를 사용하기 위하여 각각 서열번호 1 및 2를 갖는 아래 표 2의 프라이머 1과 2를 제작하였다. 대장균 야생주 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응법(PCR법) [Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories](PCR 조건: Denaturing=95℃, 30초/Annealing=53℃, 30초/Polymerization=72℃, 1분, 30회)에 의해 약 700 쌍의 aroF 유전자의 프로모터 부분을 증폭하였다. 얻어진 DNA 단편을 KpnI 과 EcoRV의 제한 효소로 절단하고 같은 제한 효소로 절단된 pCL-플라즈미드를 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 라이게이션하여 pCL-P_aroF를 제작하였다.

표 2:프라이머 1 및 2의 염기서열

프라이머 1	5'-cgg ggt acc tgc tgg tca agg ttg gcg cgt-3'(서열번호 1)
프라이머 2	5'-ccg gat atc gat cct gtt tat gct cgt ttg-3'(서열번호 2)

또한, 대장균 W3110으로부터 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제(asd)를 클로닝하기 위하여 각각 서열번호 3 및 4를 갖는 표 3과 같은 프라이머를 제작하였다. 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제 유전자 asd(NCBI GI: 1789841)의 염기 서열은 이미 문헌에 보고되어있다. 대장균 야생주 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응법(PCR법) [Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories](PCR 조건: Denaturing=95℃, 30초/Annealing=53℃, 30초/Polymerization=72℃, 1분, 30회)에 의해 약 1,104 염기쌍의 asd 유전자를 증폭하였다. 얻어진 DNA 단편을 SmaI 과 PstI의 제한 효소로 절단하고 EcoRV와 PstI의 제한 효소로 절단된 pCL-(aroF) 플라즈미드를 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 라이게이션하여 도1과 같은 재조합 벡터 pCL-P_aroF-asd를 제조하였다.

표 3:프라이머 3 및 4의 염기서열

프라이머 3	5'-ggg ccc ggg atg aaa aat gtt ggt ttt at-3'(서열번호 3)
프라이머 4	5'-ggg ctgc agg tac gcc agt tga cga ag-3' (서열번호 4)

실시예 3 : 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제가 과발현된 재조합 미생물의 쓰레오닌 생산 농도 비교

본 실시예에서는 실시예 2에서 제작된 재조합 벡터(pCL-P_aroF-asd)로 쓰레오닌 생성능 대장균 TF5015를 형질전환시켰다. 얻어진 형질전환체 TF64211(KCCM-10764)를 표 4에서와 같은 조성을 갖는 플라스크 역가 배지를 이용하여 배양하고, 그로부터 얻어진 쓰레오닌 농도와 TF5015에서 얻어진 쓰레오닌 농도를 비교하였다. 얻어진 L-쓰레오닌 농도는 3개의 플가스크 결과의 평균값을 사용하였다.

표 4:플라스크 역가 배지

조성	농도(g/L)
글루코오스	70
효모 추출물	2
암모늄 설페이트	28
마그네슘 설페이트	0.5
페러스 설페이트	0.005
망간 설페이트	0.005
L-메티오닌	0.15
칼슘 카르보네이트	30
포타슘 디히드로겐포스페이트	1

그 결과, 표 5와 같이 역가를 측정한 형질전환체 TF64211(KCCM-10764)의 L-쓰레오닌 농도가 대장균 TF5015에서보다 22.9% 증가한 것이 확인되었다.

표 5:L-쓰레오닌 농도 비교

균주	L-쓰레오닌(g/L)
TF5015	9.6
TF5015(pCL-P_aroF-asd)	11.8

본 발명에 따라 대사조절분석 기법을 이용하여 L-쓰레오닌을 생산하는 미생물에서 L-쓰레오닌 생산 속도를 제한하는 것으로 결정된 반응 단계에 관여하는 효소의 활성을 증가시킴으로써 L-쓰레오닌 생산성을 증가시킬 수 있다. 구체적으로는 L-쓰레오닌 생산능 대장균 TF5015에서 대사조절기법을 이용하여 확인된 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제가 과다 발현되는 미생물 대장균 TF64211(KCCM-10764)을 제조하고, 이의 배양을 통해 L-쓰레오닌을 생산하여 그 생산성을 증가시킬 수 있다.

<110> CJ corporation <120> Identification of the rate-limiting step of L-threonine biosynthesis by metabolic control analysis and method for producing L-threonine using a microorganism whose enzyme activity for the rate limiting step is enhanced <130> <160> <170> <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 1 cgg ggt acc tgc tgg tca agg ttg gcg cgt 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 2 ccg gat atc gat cct gtt tat gct cgt ttg 30 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3 for asd <400> 3 ggg ccc ggg atg aaa aat gtt ggt ttt at 29 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for asd <400> 4 ggg ctgc agg tac gcc agt tga cga ag 27

Claims

L-쓰레오닌의 생산능을 가진 미생물로서, 상기 미생물에 의한 L-쓰레오닌의 생합성 경로에 있어서 속도 제한 단계를 담당하는 효소의 발현을 증가시켜 L-쓰레오닌의 생산효율이 증가된 것을 특징으로 하는 미생물.
제1항에 있어서, 상기 효소는 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제(asd)인 것인 미생물.
제2항에 있어서, 상기 미생물은 아스파테이트 세미알데히드 디하드로게나아제를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 것인 미생물.
제3항에 있어서, 상기 형질전환된 L-쓰레오닌 생산 미생물은 대장균 TF64211(KCCM-10764)인 것인 미생물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 L-쓰레오닌을 생산하는 방법.