KR100837842B1 - 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제 활성이증가된 ｌ-쓰레오닌 생산 미생물 및 이를 이용한ｌ-쓰레오닌 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 L-쓰레오닌의 생산능을 가진 미생물로서, 상기 미생물에 의한 L-쓰레오닌의 생합성 경로에 있어서 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제의 효소 활성을 코딩하는 유전자 usg의 발현을 증가시켜 L-쓰레오닌의 생산효율이 증가된 것을 특징으로 하는 미생물 및 이를 이용한 L-쓰레오닌 생산 방법에 관한 것이다.

L-쓰레오닌, 대장균, 유전자 usg, 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제 활성

Description

아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제 활성이 증가된 Ｌ-쓰레오닌 생산 미생물 및 이를 이용한 Ｌ-쓰레오닌 생산 방법{A microorganism whose activity of Aspartate Semialdehyde Dehydrogenase is enhanced and the process for producing L-threonine using the microorganism}

도 1은 재조합 벡터 pCL-P_aroF-usg의 제작과정을 나타내는 도면이다.

도 2는 L-쓰레오닌의 생합성 경로를 나타내는 도면이다.

본 발명은 생물정보학을 이용하여 종래에 기능이 알려지지 않았던 대장균의 유전자 usg의 기능을 밝히고 usg 유전자의 발현이 증가된 L-쓰레오닌을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 L-쓰레오닌 생산방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 생물정보학을 이용하여 대장균의 기능이 밝혀져 있지 않은 유전자 usg의 염기 서열에 대한 유사성 검색을 수행하여 L-쓰레오닌 생합성 경로에 관여하는 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제와 아미노산 서열 상의 유의성 있는 유사성을 갖는 있다는 결과로부터 유전자 usg의 발현양을 증가시켜 L-쓰레오닌을 고 수율로 생산하는 미생물을 제작하고, 이를 이용하여 L-쓰레오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

L-쓰레오닌은 필수 아미노산의 일종으로 사료 및 식품 첨가제로서 널리 사용되며 의약용으로 수액제 및 의약품의 합성 원료로도 사용되고 있다. L-쓰레오닌은 주로 미생물 발효법으로 제조되며, 대장균(Escherichia coli), 코리네박테리움(Corynebacterium), 세라티아(Serratia)속 또는 프로비덴시아(Providencia)속 미생물의 야생주로부터 유도된 인공변이주 등이 그 생산균주로서 이용되고 있다. 일본국 공개특허 평제2-219582호에는 프로비덴시아(Providencia)속에 속하며 α-아미노-β-히드록시 발레르산, L-메티오닌, 티아이소루이신(thiaisoleucine), 옥시티아민(oxythiamine) 및 설파구아니딘(sulfaguanidine) 내성을 지니며, L-루이신 요구성, L-이소루이신 리키(leaky)형 요구성 미생물을 이용하는 방법이 기술되어 있으며, 한국 등록특허 제58286호에는 L-메티오닌 유사체에 대한 내성을 가지며, 메티오닌 영양요구성, L-쓰레오닌 유사체에 대한 내성, 이소루이신 리키형 요구성, L-라이신 유사체에 대한 내성 및 α-아미노 부티르산에 대한 내성을 가지며, L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 대장균(Escherichia coli)에 대하여 기술되어 있다.

전술된 바와 같은 선행 기술의 방법들은 무작위로 유전자를 변형시켜 유효한 미생물을 선별하였다. 그러나, 이러한 인공변이에 의한 미생물 개발 방법을 이용하는 경우, 변형된 미생물의 특성을 정확히 파악할 수 없을 뿐만 아니라 변형된 미생물들이 미생물의 성장을 저해하는 변이들을 가질 수도 있다. 따라서, 원하는 특성만을 개선하거나 억제할 수 있는 보다 정확하게 제어가능한 미생물 개발 방법이 요 구된다.

최근에는 대장균 등의 전체 유전체의 서열이 확인되고, 다양한 생물 정보학 자료들이 축적되면서 이전까지는 알지 못하였던 유전자들의 기능에 관한 연구가 가능해졌다.

대장균과 같은 다수의 세균의 전체 유전체의 서열이 확인되었으며, 이들 중 일부는 아직 그 기능이 파악되지 않고 있다. 염기서열이나 아미노산 서열이 그에 의해 코딩되는 단백질의 기능이나 구조와 상관관계를 가지므로, 이미 밝혀진 서열들 간의 상동성을 조사하여 그 기능을 파악하는 연구들이 활발하게 이루어지고 있다.

이에 본 발명자는 미생물을 통한 L-쓰레오닌 생산의 효율성을 증가시키기 위한 연구를 수행한 결과, 대장균에서 서열은 밝혀졌으나 그 기능이 확인되지 못한 유전자 usg(NCBI GI: 16130524: 서열번호 5)에 의해 코딩되는 단백질이 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제와 아미노산 서열상의 유의성 있는 유사성을 갖는다는 사실을 확인하고, 이에 근거하여 usg 유전자의 발현양을 증가시킴으로써 L-쓰레오닌 생산성을 증가시키는 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 대장균 유전자 usg의 발현양을 증가시켜 L-쓰레오닌의 생산능이 증가된 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 L-쓰레오닌 생산능이 증가된 재조합 미생물을 배양하여 L-쓰레오닌을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 L-쓰레오닌의 생산능을 가진 미생물로서, 상기 미생물에 의한 L-쓰레오닌의 생합성 경로에 있어서 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제의 활성이 증가되어 L-쓰레오닌의 생산효율이 증가된 것을 특징으로 하는 미생물을 제공한다.

본 발명의 일 양태에서, 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제는 대장균 유래의 유전자 usg에 의해 코딩되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, L-쓰레오닌의 생산능을 가진 미생물은 유전자 usg를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 미생물일 수 있다.

본 발명의 L-쓰레오닌 생산용 미생물은 대장균, 코리네형 세균, 세라티아속 세균, 프로덴시아 세균 미생물 등과 같이 L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 어떤 미생물도 가능하며, 바람직하게는 대장균이다. 보다 바람직하게는 상기 L-쓰레오닌 생산용 미생물은 메티오닌 요구성, 이소루이신 리키형 요구성, α-아미노-β-히드록시발레르산 내성, 2-아미노에틸-L-시스테인 내성, 및 L-아제티딘-2-카르복시산 내성을 갖는 대장균 TF5015(Global Analyses of Transcriptomes and Proteomes of a Parent Strain and an L-Threonine-Overproducing Mutant Strain, Jin-Ho Lee, Dong-Eun Lee, Bheong-Uk Lee, and Hak-Sung Kim, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Sept. 2003, p. 5442-5451)이다.

유전자 usg는 대장균의 유전체 상에 존재하며 그 서열은 밝혀져 있으나, 기능은 파악되지 않은 유전자였다(NCBI GI: 16130254). 본 발명에서는 생물정보학적 기법을 이용하여 유전자 usg의 서열을 L-쓰레오닌 생합성 경로에 관여하는 효소들의 서열과 비교한 결과, 아스파테이드 세미알데히드 디하이드로게나아제의 아미노산 서열과 유의한 상동성을 갖는다는 것을 발견했다. 또한, 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제는 대장균의 L-쓰레오닌 생합성 경로(도 2)에서 속도 결정 단계를 담당하는 것으로 여겨진다. 따라서, 유전자 usg의 발현을 증가시켜 L-쓰레오닌 생산능 미생물의 L-쓰레오닌 생산성을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 일 양태에서는 대상이 되는 유전자의 발현을 증가시키기 위해 유전자를 다복제수의 벡터를 이용하여 숙주세포로 도입하여 발현양을 증가시키는 방법을 사용한다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 바람직하게는, 에스케리시아(Escherichia) 속의 세균에서 자율적으로 증식할 수 있는 카피 수가 적은 pCL1920 플라미스미드 벡터를 사용할 수 있다.

또한 본 발명의 재조합 벡터는 공지된 통상의 방법에 의하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 발현을 위한 프로모터와 터미네이터가 있는 적절한 벡터에 EcoRV , HindIII 등의 제한효소를 사용하여 상기 생물정보학적 분석에 의하여 기능이 확인된 유전자를 라이게이션시킴으로써 제조할 수 있다. 발현을 위한 프로모터로는 trc, tac , lac 또는 대장균 aroF 유전자의 프로모터 등을 사용할 수 있으며, 또한 효과적인 발현을 위하여 터미네이터를 사용할 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 재조합 벡터에 의해 형질전환된 L-쓰레오닌의 생산능을 가진 미생물은 대장균 TF64212(수탁번호: KCCM-10768)일 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 형질전환 세포는 상기의 재조합 벡터를 사용하여 통상의 방법으로 숙주세포를 형질전환시켜 제조할 수 있다. 숙주세포는 L-쓰레오닌 생성용 미생물이며, 바람직하게는 그람음성 박테리아에 속하는 미생물이고, 보다 바람직하게는 에스케리시아(Escherichia) 속에 속하는 미생물일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서는 상기 재조합 벡터(pCL-P_aroF-usg)로 대장균 (Escherichia coli) TF5015(Global Analyses of Transcriptomes and Proteomes of a Parent Strain and an L-Threonine-Overproducing Mutant Strain, Jin-Ho Lee, Dong-Eun Lee, Bheong-Uk Lee, and Hak-Sung Kim, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Sept. 2003, p. 5442-5451)를 형질전환시켜 대장균 TF64212(수탁번호: KCCM-10768)을 제조하였다.

상기와 같은 L-쓰레오닌 생산용 재조합 미생물은 생물정보학에 의하여 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제 활성을 갖는 것으로 기능이 확인된 대장균 usg 유전자의 발현양을 증가시켜 L-쓰레오닌의 생산량이 변이 전의 L-쓰레오닌 생산량보다 증가되므로 L-쓰레오닌을 고농도로 생산할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제 활성이 증가되어 L-쓰레오닌의 생산효율이 증가된 L-쓰레오닌 생성용 재조합 미생물로부터 L-쓰레오닌을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 재조합 미생물로부터 L-쓰레오닌을 대량 생산하기 위해 그 미생물을 배양하고, 그 배양물로부터 목적하는 L-쓰레오닌을 분리하는 모든 공정은 본 분야에 잘 알려져 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실 시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1: 생물정보학을 이용한 대장균 유전자 usg 의 기능 확인.

대장균의 전체 유전체 서열이 밝혀진 이후 기능이 밝혀져 있지 않은 가상 단백질(hypothetical protein)의 기능을 예측하기 위한 여러 생물정보학적인 기법들이 개발되었다. 본 발명에서 이용된 생물정보학적 분석은 유전자의 염기서열이나 유전자가 전사와 번역 과정을 거쳐 얻어진 단백질의 아미노산 서열을 이용하여 유전자의 기능을 예측하는 기법이다.

본 실시예에서는 대장균에서 기능이 밝혀지지 않은 유전자 usg의 염기 서열을 이용하여 생물정보학적 기법으로 BLAST 서치를 통해 서열상 유사성을 갖는 알려진 기능의 효소를 검색하였다. 그 결과 유전자 usg에 의해 코딩되는 USG 단백질은 하기와 같이 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제와 28%의 아미노산 서열상의 유사성을 갖는 것으로 확인되었다:

유전자 usg와 상당한 유사성을 보이는 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제는 도 2에서 보는 바와 같이 L-쓰레오닌의 생합성에서 L-아스파테이드 세미알데하이드를 L-아스파틸-4-포스페이트로 전환시키는 효소이다. 또한, 대장균의 L-쓰레오닌 생합성 경로에서 속도 결정 단계는 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제에 의해 촉매된다. 따라서 유전자 usg의 발현양을 증가시킬 경우 L-쓰레오닌의 생산능을 증가킬 수 있을 것으로 예측되었다.

실시예 2: 유전자 usg 를 포함하는 재조합 벡터의 제조

생물정보학을 이용하여 그 기능이 예측된 유전자 usg의 발현양 증가에 의한 L-쓰레오닌 생산능의 향상을 확인하기 위하여 유전자 usg를 대장균에서 다복제수를 갖는 플라즈미드를 이용하여 과다 발현시키는 방법을 사용하였다.

먼저 발현에 필요한 프로모터를 벡터인 플라즈미드 pCL1920에 삽입하였다. 대장균의 염색체에 존재하는 유전자 aroF의 프로모터를 사용하기 위하여 각각 서열번호 1 및 2를 갖는 아래 표 1의 프라이머 1과 2를 제작하였다. 대장균 야생주 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응법(PCR법) [Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories](PCR 조건: 변성=95℃, 30초/어닐링=53℃, 30초/중합=72℃, 1분, 30회)에 의해 약 700 쌍의 aroF 유전자의 프로모터 부분을 증폭하였다. 얻어진 DNA 단편을 KpnI 과 EcoRV의 제한 효소로 절단하고 동일한 제한 효소로 절단된 pCL-플 라즈미드에 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 라이게이션하여 pCL-P_aroF를 제작하였다.

표 1:프라이머 1 및 2의 염기서열

프라이머 1	5'-cgg ggt acc tgc tgg tca agg ttg gcg cgt-3'(서열번호 1)
프라이머 2	5'-ccg gat atc gat cct gtt tat gct cgt ttg-3'(서열번호 2)

또한, 대장균 W3110으로부터 유전자 usg를 클로닝하기 위하여 각각 서열번호 3 및 4를 갖는 표 2와 같은 프라이머를 제작하였다. usg 유전자 (NCBI GI: 1613054:서열번호 5)의 염기 서열은 이미 문헌에 보고되어있다. 대장균 야생주 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응법(PCR법) [Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories](PCR 조건: 변성=95℃, 30초/어닐링=53℃, 30초/중합=72℃, 1분, 30회)에 의해 약 1014 염기쌍의 usg 유전자를 증폭하였다. 얻어진 DNA 단편을 EcoRV 과 HindIII의 제한 효소로 절단하고 동일한 제한 효소로 절단된 pCL-P_aroF 플라즈미드에 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 라이게이션하여 도1과 같은 재조합 벡터 pCL-P_aroF-usg를 제조하였다.

표 3:프라이머 3 및 4의 염기서열

프라이머 3	5'- ggg gat atc atg tct gaa ggc tgg aac-3'(서열번호 3)
프라이머 4	5'- ggg aag ctt tta gta cag ata ctc ctg-3'(서열번호 4)

실시예 3: 유전자 usg 가 과발현된 재조합 미생물의 쓰레오닌 생산량 비교

본 실시예에서는 실시예 2에서 제작된 재조합 벡터(pCL-P_aroF-usg)로 쓰레오닌 생산능 대장균 (Escherichia coli) TF5015를 형질전환시켰다. 얻어진 형질전환 체 TF64212(KCCM-10768)를 표 4에서와 같은 조성을 갖는 플라스크 역가 배지를 이용하여 배양하고, 배양액을 원심분리하여 얻은 상층액을 액체크로마토그래피로 분석하여 쓰레오닌 농도를 측정하였다. 이에 의해, 형질전환된 대장균 TF64212로부터 측정된 쓰레오닌 농도와 대장균 TF5015에서 측정된 쓰레오닌 농도를 비교하였다. 생산된 L-쓰레오닌의 농도는 3개의 플라스크 결과의 평균값을 사용하였다.

표 4:플라스크 역가 배지

조성	농도(g/L)
글로코스	70
효모 추출물	2
암모늄 설페이트	28
마그네슘 설페이트	0.5
페러스 설페이트	0.005
망간 설페이트	0.005
L-메티오닌	0.15
칼슘 카르보네이트	30
포타슘 디히드로겐포스페이트	1

그 결과, 표 5에 표시된 바와 같이 역가를 측정한 형질전환된 대장균 TF64212(수탁번호: KCCM-10768)에서의 L-쓰레오닌 농도가 대장균 TF5015에서보다 20.8% 증가한 것이 확인되었다.

표 4:L-쓰레오닌 농도 비교

균주	L-쓰레오닌(g/L)
TF5015	9.6
TF64212	11.6

본 발명에 따라 생물정보학 기법을 이용하여 대장균에서 기능이 알려져 있지 않은 usg 유전자의 기능을 예측한 결과 L-쓰레오닌 생합성에 관여하는 아스파테이 트 세미알데히드 디하이드로게나아제와 높은 아미노산 서열상의 유사성을 갖는다는 것을 확인할 수 있었으며, 유전자 usg의 발현양을 증가시킴으로써 L-쓰레오닌 생산성을 증가시킬 수 있다. 구체적으로는 L-쓰레오닌 생산능 대장균 TF5015를 usg 유전자를 과다 발현하도록 형질전환시킨 대장균 TF64212를 제조하고, 이의 배양을 통해 L-쓰레오닌을 생산하여 그 생산성을 증가시킬 수 있다.

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Claims (6)

1. L-쓰레오닌의 생산능을 가진 대장균으로서, 상기 대장균에 의한 L-쓰레오닌의 생합성 경로에 있어서 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제의 활성이 증가되어 L-쓰레오닌의 생산효율이 증가된 것을 특징으로 하는 대장균.
2. 제1항에 있어서, 상기 대장균은 메티오닌 요구성, 이소루이신 리키형, α-아미노-β-히드로발레르산 내성, 2-아미노에틸-L-시스테인 내성, 및 L-아제티딘-2-카르복시산 내성을 갖는 것인 대장균.
3. 제1항에 있어서, 상기 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제는 유전자 usg(서열번호 5)에 의해 코딩되는 것인 대장균.
4. 제3항에 있어서, 상기 대장균은 아스파테이트 세미알데히드 디하드로게나아제를 코딩하는 유전자 usg를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 것인 대장균.
5. 제4항에 있어서, 상기 형질전환된 L-쓰레오닌 생산 대장균은 대장균 TF64212(수탁번호: KCCM-10768)인 것인 대장균.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 대장균을 배양하는 단계를 포함하는 L-쓰레오닌을 생산하는 방법.

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