KR100851745B1 - ｙｄｊＫ 유전자의 발현이 증가된 Ｌ-쓰레오닌 생산 미생물및 이를 이용한 Ｌ-쓰레오닌 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 L-쓰레오닌의 생산 미생물 및 이를 이용한 L-쓰레오닌 생산방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 대장균의 추정상의 수송 단백질 ydjK 유전자의 발현을 증가시킴으로써 L-쓰레오닌의 생산효율이 증가된 미생물 및 이를 이용한 L-쓰레오닌 생산방법에 관한 것이다.

L-쓰레오닌, 대장균, 유전자 ydjK, 수송 단백질

Description

ｙｄｊＫ 유전자의 발현이 증가된 Ｌ-쓰레오닌 생산 미생물 및 이를 이용한 Ｌ-쓰레오닌 생산 방법{A MICROORGANISM WHOSE EXPRESSION LEVEL OF YDJK IS ENHANCED AND THE PROCESS FOR PRODUCING L-THREONINE USING THE MICROORGANISM}

도 1은 재조합 벡터 pCL-P_aroF-ydjK의 제작과정을 도시한 것이다.

본 발명은 생물정보학(bioinformatics)을 이용하여 종래에 기능이 알려지지 않은 대장균내의 ydjK 유전자의 기능을 밝히고 ydjK 유전자의 발현이 증가된 L-쓰레오닌을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 L-쓰레오닌 생산방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 대장균 내에서의 기능이 추정상의 수송 단백질(putative transport protein)로만 밝혀져 있는 ydjK 유전자의 염기 서열을 생물정보학을 이용하여, 유사성 검색을 수행하여 갈락토스 트랜스포터(galactose transporter; galP) 또는 아라비노스 트랜스포터(arabinose transpoter; araE) 등과 아미노산 서열이 높은 유사성을 갖는 다는 결과로부터 ydjK의 발현량을 증가시켜 L-쓰레오닌을 고수율로 생산하는 재조합 미생물을 제작하고, 이를 이용하여 L-쓰레오닌을 생산하 는 방법에 관한 것이다.

L-쓰레오닌은 필수 아미노산의 일종으로 사료 및 식품 첨가제로서 널리 사용되며 의약용으로 수액제 및 의약품의 합성 원료로도 사용되고 있다. L-쓰레오닌은 미생물 발효법으로 제조되며, 대장균(Escherichia coli), 코리네박테리움(Corynebacterium), 세라티아(Serratia) 속 또는 프로비덴시아(Providencia) 속 미생물의 야생주로부터 유도된 인공 변이주 등이 사용되고 있다. 일본국 공개특허 평제2-219582호에는 프로비덴시아(Providencia) 속에 속하며 α-아미노-β-히드록시 발레릭산, L-에티오닌, 티아이소루이신(thiaisoleucine), 옥시티아민(oxythiamine) 및 설파구아니딘(sulfaguanidine) 내성을 지니며, L-루이신 요구성, L-이소루이신 리키(leaky)형 요구성 미생물을 이용하는 방법이 기술되어 있으며, 한국 등록특허 제58286호에는 L-메티오닌 유사체에 대한 내성을 가지며, 메티오닌 영양요구성, L-쓰레오닌 유사체에 대한 내성, 이소루이신 리키형 요구성, L-라이신 유사체에 대한 내성 및 α-아미노 부티르산 내성을 가지며, L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 대장균(Escherichia coli)에 속하는 미생물에 대하여 기술되어 있다.

전술된 바와 같은 선행 기술의 방법들은 무작위로 유전자를 변형시켜 유효한 미생물을 선별하였다. 하지만, 대장균등의 전체 염색체 서열이 확인되고, 이후 다양한 생물 정보학 자료들이 축적되면서 이전까지는 알지 못하였던 유전자들의 기능에 관한 연구가 가능해졌다. 기능이 밝혀진 유전자의 염기서열이나 모티프(motif)와의 유사성을 이용하여 새로운 단백질의 기능을 예측할 수 있게 되었다. 따라서, 대장균의 전체 염기 서열이 밝혀지면서 여러 추정상의(putative) 유전자들이 새롭게 주석(annotation)되어졌고, ydjK 또한 추정상의 수송 단백질(putative transporter protein)로서 주석되었다.

이에 본 발명자는 L-쓰레오닌 생산성을 증가시키기 위한 연구를 수행한 결과, 대장균에서 기능이 확인되지 못한 ydjK 단백질이 갈락토스 트랜스포터 또는 아라비노스 트랜스포터 등과 높은 아미노산 서열상의 유사성을 갖고 있다는 사실을 확인하고, ydjK 유전자의 발현량을 증가시킴으로써 L-쓰레오닌 생산성이 증가한다는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 생물정보학 결과들을 이용하여 대장균에서 기능이 밝혀지지 않은 ydjK 단백질의 갈락토스 트랜스포터 또는 아라비노스 트랜스포터 등과 높은 아미노산 서열상의 유사성을 확인하고, 이를 이용하여 ydjK의 발현량을 증가시킨 L-쓰레오닌 생산 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 L-쓰레오닌 생산 미생물을 배양하여 L-쓰레오닌을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 L-쓰레오닌의 생산능을 가진 미생물로서, 기능이 알려져 있지 않은 유전자의 발현을 증가시켜 L-쓰레오닌의 생산효율이 증가된 것을 특징으로 하는 미생물을 제공한다.

본 발명의 기능이 알려져 있지 않은 유전자로는 대장균의 ydjK일 수 있다.

본 발명의 기능이 알려져 있지 않은 ydjK 유전자는 대장균 내에서 추정상의 수송 단백질(putative transport protein)으로만 밝혀져 있다. 대장균에서의 전체염색체 서열이 밝혀진 이후 기능이 밝혀져 있지 않은 이론상의 단백질의 기능을 예측하기 위한 여러 생물정보학적인 기법들이 개발되었다. 생물정보학은 새로운 미생물 자원을 대량으로 탐색하고 발굴하는 데에서부터 수백만 쌍의 염기서열을 해독하고 각 유전자의 기능을 단 기간 내에 밝히고, 찾아낸 유용 유전자를 대량으로 이용하는 데까지의 자동화 고속화된 과정에서 필수적으로 만들어지는 다량의 데이터를 빠른 시간에 처리, 가공하고 이용할 수 있게 한다.

본 발명에서의 생물정보학 분석은 유전자의 염기서열 또는 유전자의 전사 및 번역 과정에 의해 얻어진 단백질의 아미노산 서열을 이용하여 유전자의 기능을 예측하는 기법이다.

본 발명은 상기 ydjK 유전자의 염색체 서열(NCBI GI: 16129729)을 이용하여 생물정보학 기법으로 유사성을 갖는 알려진 기능의 효소를 검색하였다. 대장균에 있어서 상기 ydjK 유전자는 공지되어 있으며, 유전자 서열은 미국생물공학정보센터(NCBI) 및 일본의 DNA 데이터 뱅크(DDBJ)와 같은 데이터베이스로부터도 얻을 수 있다. 그 결과 ydjK 단백질은 갈락토스 트랜스포터 및 아라비노스 트랜스포터 등과 높은 아미노산 서열상의 유사성을 갖는 것으로 확인되었다. 상기 갈락토스 트랜스포터 및 아라비노스 트랜스포터 등은 배지 내의 여러 종의 당을 세포 내부로 수송하는 투과효소(permease)로 알려져 있는 효소로서, ydjK 단백질은 주요 촉진인자 수퍼 패밀리(major facilitator superfamily)에 속한 트랜스포터라는 것이 확인되 었다. 따라서 ydjK의 발현량을 증가시킬 경우 L-쓰레오닌의 생산능을 증가킬 수 있을 것으로 예측되었다.

L-쓰레오닌의 생산능을 가진 미생물은 ydjK 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 미생물일 수 있다.

본 발명의 L-쓰레오닌 생산 미생물은 대장균, 코리네형 세균, 세라티아속 세균, 프로비덴시아속 세균 등과 같이 L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 어떤 미생물도 가능하며, 바람직하게는 대장균이다. 보다 바람직하게는 대장균 TF5015 메티오닌 영양 요구성, 아이소루이신 리키(leaky)형 요구성, α-아미노-β-하이드록시발레릭산 내성, 2-아미노에틸-l-시스테인 내성, l-아제티딘-2-카르복실산 내성)을 사용할 수 있다.

본 발명에서는 대상이 되는 유전자의 발현을 증가시키기 위해 유전자를 다복제수의 벡터를 이용하여 숙주세포로 도입하여 발현량을 증가시키는 방법을 사용한다.

통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 바람직하게는, 에세리키아 (Escherichia) 속의 박테리아에서 자율적으로 증식할 수 있는 카피 수가 적은 pCL1920 플라미스미드 벡터를 사용할 수 있다.

또한 본 발명의 재조합 벡터는 공지된 통상의 방법에 의하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 발현을 위한 프로모터와 터미네이터가 있는 적절한 벡터에 EcoRV, HindIII 등의 제한효소를 사용하여 상기 생물정보학에 의하여 기능이 확인된 유전 자를 라이게이션시킴으로써 제조할 수 있다. 발현을 위한 프로모터로는 trc, tac, lac 등 이나 대장균 aroF 유전자의 프로모터 등을 사용할 수 있으며, 또한 효과적인 발현을 위하여 rrnE등의 터미네이터를 사용할 수 있다. 본 발명자들은 재조합 벡터 pCL-P_aroF-ydjK를 제작하였다.

본 발명의 형질전환된 L-쓰레오닌의 생산능을 가진 미생물은 CO01-0012(수탁번호 KCCM 10804P)일 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 형질전환 세포는 상기의 재조합 벡터를 사용하여 통상의 방법으로 숙주세포를 형질전환시켜 제조할 수 있다. 숙주세포는 L-쓰레오닌 생산 미생물이며, 바람직하게는 그람음성 박테리아에 속하는 미생물이고, 보다 바람직하게는 에세리키아 (Escherichia) 속에 속하는 미생물일 수 있다.

본 발명의 상기 재조합 벡터로 대장균(Escherichia coli) TF5015(Global Analyses of Transcriptomes and Proteomes of a Parent Strain and an L-Threonine-Overproducing Mutant Strain, Jin-Ho Lee, Dong-Eun Lee, Bheong-Uk Lee, and Hak-Sung Kim, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Sept. 2003, p. 5442-5451)를 형질전환시켜 대장균 CO01-0012(KCCM 10804P)를 제조하였다.

상기와 같은 L-쓰레오닌 생산 재조합 미생물은 생물정보학에 의하여 기능이 확인된 대장균 ydjK 유전자의 발현량을 증가시킴으로써 L-쓰레오닌의 생산 농도가 변이 전의 L-쓰레오닌 생산 농도보다 증가함으로써 L-쓰레오닌을 고수율로 생산할 수 있다.

본 발명은 또한, 대장균 ydjK 유전자의 발현량이 증가된 L-쓰레오닌 생산 재조합 미생물로부터 L-쓰레오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 재조합 미생물로부터 L-쓰레오닌을 대량 생산하기 위해 그 미생물을 배양하고, 그 배양물로부터 목적하는 L-쓰레오닌을 분리하는 모든 공정은 본 분야에 잘 알려져 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1 : 생물정보학을 이용한 대장균 ydjK 의 기능 확인

본 실시예에서는 대장균에서 기능이 밝혀지지 않은 ydjK(NCBI GI: 16129729) 유전자(서열번호 5)의 염색체 서열을 이용하여 생물정보학 기법으로 유사성을 갖는 알려진 기능의 효소를 검색하였다.

구체적으로는 ydjK 유전자의 상동성 검색(homology search)을 이용하여 기능이 밝혀진 유전자로부터 기능을 확인하였다.

따라서, 상기와 같이 ydjK 단백질은 갈락토스 트랜스포터 또는 아라비노스 트랜스포터 등과 아미노산 서열상에서 높은 유사성을 갖는다는 것이 확인되었다.

실시예 2 : ydjK 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제조

생물정보학을 이용하여 그 기능이 예측된 ydjK 유전자의 발현량 증가에 의한 L-쓰레오닌 생산능의 향상을 확인하기 위하여 ydjK 유전자를 대장균에서 다복제수를 갖는 플라즈미드를 이용하여 과다 발현시키는 방법을 사용하였다.

먼저 발현에 필요한 프로모터를 벡터인 플라즈미드 pCL1920 (Nucleic Acids Res. 18, 4631 (1990)) 에 삽입하였다. 대장균의 염색체에 존재하는 aroF 유전자의 프로모터를 사용하기 위하여 각각 서열번호 1 및 2를 갖는 하기의 프라이머 1과 2를 제작하였다(표 1). 대장균 야생주 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응법(PCR법) [Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories](PCR 조건: Denaturing=95℃, 30초/Annealing=53℃, 30초/Polymerization=72℃, 1분, 30회)에 의해 약 700 쌍의 aroF 유전자의 프로모터 부분을 증폭하였다. 얻어진 DNA 단편을 KpnI 과 EcoRV의 제한 효소로 절단하고 같은 제한 효소로 절단된 pCL-플라즈미드를 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 라이게이션하여 플라스미드 pCL-P_aroF를 제작하였다.

프라이머 1	5'-cgg ggt acc tgc tgg tca agg ttg gcg cgt-3'(서열번호 1)
프라이머 2	5'-ccg gat atc gat cct gtt tat gct cgt ttg-3'(서열번호 2)

또한, 대장균 야생주 W3110으로부터 ydjK 를 클로닝하기 위하여 각각 서열번호 3 및 4를 갖는 프라이머3과 4를 제작하였다(표 2). ydjK 유전자(NCBI GI: 16130254)의 염기 서열은 이미 문헌에 보고되어있다. 대장균 야생주 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응법(PCR법) [Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories](PCR 조건: Denaturing=95℃, 30초/Annealing=53℃, 30초/Polymerization=72℃, 1분, 30회)에 의해 약 1400 염기쌍의 ydjK 유전자를 증폭하였다. 얻어진 DNA 단편을 SmaI 과 PstI의 제한 효소로 절단하고 EcoRV 과 PstI 제한 효소로 절단된 pCL-P_aroF 플라즈미드를 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 라이게이션하여 도1과 같은 재조합 벡터 pCL-P_aroF-ydjK를 제조하였다.

프라이머 3	5'- ggg ccc ggg atg gaa cag ata aca aaa cc -3'(서열번호 3)
프라이머 4	5'- ggg ctg cag tta ttt att ggc tac tgc at -3'(서열번호 4)

실시예 3 : ydjK 유전자가 과발현된 재조합 미생물의 쓰레오닌 생산 농도 비교

본 실시예에서는 실시예 2에서 제작된 재조합 벡터(pCL-P_aroF-ydjK)로 쓰레오닌 생산 대장균(Escherichia coli) TF5015를 형질전환시켰다. 얻어진 재조합 균주를 대장균 CO01-0012로 명명하였으며, 2006년 11월 28일자로 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제 1동 361-221번지에 소재하는 국제기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM 10804P로 기탁하였다.

상기 재조합 균주를 표 3에서와 같은 조성을 갖는 플라스크 역가 배지를 이용하여 배양하고, 그로부터 얻어진 쓰레오닌 농도와 TF5015에서 얻어진 쓰레오닌 농도를 비교하였다. 얻어진 L-쓰레오닌 농도는 3개의 플라스크 결과의 평균값을 사용하였다. 쓰레오닌 농도 측정 방법은 통상적으로 알려진 HPLC를 이용한 방법을 사용하였다.

조성	농도(g/L)
글루코스	70
효모 추출물	2
암모늄 설페이트	28
마그네슘 설페이트	0.5
페러스 설페이트	0.005
망간 설페이트	0.005
L-메티오닌	0.15
칼슘 카르보네이트	30
포타슘 디히드로겐포스페이트	1

그 결과, 수득된 L-쓰레오닌의 농도는 하기의 표 4와 같이 형질전환체 CO01-0012(KCCM 10804P)의 L-쓰레오닌 농도가 대장균 TF5015에서보다 21.6% 증가되었음을 확인하였다.

균주	L-쓰레오닌(g/L)
TF5015	9.29
CO01-0012	11.30

이상에서 상세히 설명하였듯이, 본 발명에 따라 생물정보학 기법을 이용하여 대장균에서 기능이 알려져 있지 않은 ydjK 유전자의 기능을 예측한 결과 갈락토스 트랜스포터나 아라비노스 트랜스포터 등과 높은 아미노산 서열상의 유사성을 갖는다는 것을 확인할 수 있었으며, ydjK의 발현량을 증가시킴으로써 L-쓰레오닌 생산성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 구체적으로는 L-쓰레오닌 생산능을 가진 대장균 TF5015을 형질전환시켜 ydjK 유전자의 발현이 증가된 재조합 대장균 CO01-0012(KCCM 10804P)를 제조하고, 이의 배양을 통하여 L-쓰레오닌을 고농도로 생산하여 그 생산성을 증가시킬 수 있다.

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Claims (5)

1. 대장균 유래의 추정상의 수송 단백질(putative transport protein)을 암호화하는 ydjK 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환되어 ydjK 유전자의 발현이 증가된 것을 특징으로 하는 L-쓰레오닌 생산능을 가진 대장균.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,

   상기 형질전환된 대장균이 대장균 CO01-0012(KCCM 10804P)인 것을 특징으로 하는 L-쓰레오닌 생산능을 가진 대장균.
5. 제1항 또는 제4항의 대장균을 배양하는 단계를 포함하는 L-쓰레오닌 생산방법.

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