KR20060126690A - 에스케리치아 속에 속하는 ｌ-트레오닌 생산 세균 및ｌ-트레오닌의 생산 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제의 활성이 증진되도록 변형된, 에스케리치아 속에 속하는 세균을 사용하여 L-트레오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.
L-트레오닌, 에스케리치아 속, 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제, thrA 유전자, thrB 유전자, thrC 유전자, rhtA 유전자
Description
본 발명은 발효에 의한 L-아미노산의 생산 방법 및 보다 구체적으로, 당해 발효를 도와주는 에스케리치아 콜리(Escherichia coli) 기원 유전자에 관한 것이다. 당해 유전자는 L-아미노산 생산 및 특히, 예를 들어, L-트레오닌 생산을 개선시키는데 유용하다.
통상적으로, L-아미노산은 천연 공급원으로부터 수득한 미생물 균주 또는 L-아미노산 생산 수율이 증진되도록 변형된 이의 돌연변이체를 사용하는 발효 방법에 의해 산업적으로 생산된다.
재조합 DNA를 사용한 미생물의 형질전환을 포함하는 L-아미노산의 생산 수율을 증진시키는 많은 기술이 보고되어 왔다(예를 들어, 미국 특허 제4,278,765호 참조). 생산 수율을 증진시키는 또 다른 기술은 아미노산 생합성에 관여하는 효소 활성을 증가시키고/증가시키거나 수득된 L-아미노산에 의한 피드백 억제 표적 효소 를 탈감작시킴을 포함한다[예를 들어, WO 95/16042 또는 미국 특허 제4,346,170호, 제5,661,012호 및 제6,040,160호 참조].
발효에 의한 L-트레오닌 생산에 유용한 균주는 L-트레오닌 생합성에 관여하는 효소 활성이 증가된 균주(미국 특허 제5,175,107호; 제5,661,012호; 제5,705,371호; 제5,939,307호; EP0219027), L-트레오닌 및 이의 유사체와 같은 화학물질에 내성인 균주(WO 0114525A1, EP301572A2, 미국 특허 제5,376,538호), 생산된 L-아미노산 또는 이의 부산물에 의한 피드백 억제에 탈감작화된 표적 효소를 갖는 균주(미국 특허 제5,175,107호; 제5,661,012호) 및 트레오닌 분해 효소가 불활성화된 균주(미국 특허 제5,939,307호; 제6,297,031호)를 포함하는 것으로 공지되어 있다.
공지된 트레오닌 생산 균주 VKPM B-3996(미국 특허 제5,175,107호 및 제5,705,371호)는 현재 최상의 트레오닌 생산자이다. 균주 VKPM B-3996를 작제하기 위해, 하기에 기재된 몇몇 돌연변이 및 플라스미드가 모균주 이. 콜리 K-12(VKPM B-7)에 도입되었다. 돌연변이 thrA 유전자(돌연변이 thrA442)는 트레오닌에 의한 피드백 억제에 내성인 아스파르토키나제 호모세린 데하이드로게나제 I를 암호화하고 있다. 돌연변이 ilvA 유전자(돌연변이 ilvA442)는 활성이 감소된 트레오닌 데아미나제를 암호화하고 있고 이에 의해 이소류신 생합성율이 감소되고 이소류신이 결핍된 불완전한 표현형을 나타낸다. ilvA442 돌연변이를 함유하는 세균에서, thrABC 오페론의 전사는 이소류신에 의해 억제되지 않고 따라서 트레오닌 생산을 위해 매우 효율적이다. tdh 유전자의 불활성화는 트레오닌 분해를 차단시킨다. 사카로스 동화를 위한 유전자 결정인자(scrKYABR) 유전자가 당해 균주로 전달되었다. 트레오닌 생합성을 조절하는 유전자의 발현을 증가시키기 위해, 돌연변이 트레오닌 오페론 thrA442BC을 함유하는 플라스미드 pVIC40이 중간 균주 TDH6에 도입되었다. 균주 발효동안에 축적되는 L-트레오닌의 양은 85g/l 이하일 수 있다.
본 발명자는 이. 콜리 K-12에 대해, 최소 배지에서 고농도의 트레오닌 또는 호모세린에 내성을 갖는 돌연변이 thrR(본원에서 rhtA23으로 언급됨)를 수득하였다[문헌참조: Astaurova, O.B. et al., Appl. Bioch. And Microbiol., 21, 611-616(1985)]. 당해 돌연변이는 균주 VKPM B-3996과 같은 각각의 이. 콜리 생산 균주에 의한 L-트레오닌(SU 특허 제974817호), 호모세린 및 글루타메이트(문헌참조: Astaurova, O.B. et al., Appl. Bioch. And Microbiol.,27, 556-561, 1991, EP 1013765 A)의 생산을 개선시켰다. 추가로, 본 발명자는 rhtA 유전자가 이 콜리 염색체의 18분 위치에 존재하여 글루타민 수송 시스템의 성분을 암호화하는 glnHPQ 오페론에 인접해 있음을 밝혔고 rhtA 유전자가 pexB와 ompX 유전자 사이에 위치한 ORF1(ybiF 유전자, 진뱅크 승인 번호 AAA218541, gi:440181에서 764번 내지 1651번)과 동일함을 밝혔다. ORF1에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 단위체는 rhtA(rht: 호모세린 및 트레오닌에 내성) 유전자로서 지정되었다. 또한, 본 발명자는 rhtA23 돌연변이가 ATG 개시 코돈에 대해 -1 위치에서 G대신 A로 대체되어 있음을 밝혔다[문헌참조: ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765A].
주요 트레오닌 생합성 경로의 최적화 조건하에, 트레오닌 생산 균주는 세균에 아스파르테이트와 같은 트레오닌의 훨씬 이전의 증가된 양의 전구체를 보충함으로써 추가로 개선될 수 있다.
아스파르테이트는 아스파르테이트 계열(트레오닌, 메티오닌, 라이신)의 아미노산 및 세균 세포 벽의 화합물 성분인 디아미노피멜레이트의 합성을 위한 탄소 공여체인 것으로 공지되어 있다. 이들 합성은 분기점이 여러개이고 극히 민감한 조절 기작을 갖는 복합한 경로에 의해 수행된다. 분기점(아스파르테이트, 아스파르테이트 세미알데하이드, 호모세린)에서, 아미노산들이 당해 생합성 단계에서 유래되는 만큼 많은 동위효소들이 있다. thrABC 오페론의 일부가 암호화하는 아스파르토키나제 호모세린 데하이드로게나제 I는 트레오닌 생합성의 제1 및 제3 반응을 유발한다. 트레오닌 및 이소류신은 아스파르토키나제 호모세린 데하이드로게나제 I의 발현을 조절하고 트레오닌은 상기된 반응을 촉매하는 활성 둘다를 억제한다[문헌참조: Escherichia coli and salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996].
asd 유전자는 라이신, 메티오닌, 트레오닌 및 디아미노피멜레이트에 대한 생합성 경로에서 주요 효소인 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제(Asd; EC 1.2.1.11)를 암호화한다. 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제는 NADP가 환원됨에 따라 L-아스파르틸-4-P를 L-아스파르테이트 세미알데하이드로 역으로 전환시킨다. 이. 콜리 균주에 의한 아스파르테이트 계열 아미노 산인 L-라이신의 생산에 대한 asd 유전자의 증폭 효과가 개시되어 있다(문헌참조: 미국 특허 제6,040,160호). 또한 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제가 코리네형 세균에 의한 L-라이신, L-트레오닌 및 L-이소류신의 생산에 유용할 수 있음이 개시되어 있다[문헌참조: EP 0219027 A].
그러나, 현재까지, L-트레오닌의 생산을 위해 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이로게나제 활성이 증진된 에스케리치아 속에 속하는 세균을 사용한 보고는 없었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 L-트레오닌-생산 균주의 생산성을 증진시키고 당해 균주를 사용한 L-트레오닌의 생산 방법을 제공하는 것이다.
당해 목적은 낮은 카피 벡터상에 클로닝된 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제를 암호화하는 asd 유전자가 L-트레오닌 생산을 증진시킴을 밝혀내어 성취되었다. 따라서, 본 발명이 완성되었다.
본 발명의 목적은, 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제의 활성이 증진되도록 변형된 에스케리치아 속에 속하는 L-트레오닌 생산 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은, 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제의 활성이 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제 유전자의 발현을 증가시켜 증진된 상기된 바와 같은 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제의 활성이 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제 유전자 카피수를 증가시키거나 유전자 발현이 증진되도록 유전자의 조절 서열을 변형시켜 증진된 상기된 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 카피수가 당해 유전자 함유 벡터로 세균을 형질전환시킴으로써 증가된 상기된 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제 유전자가 에스케리치아 속에 속하는 세균으로부터 유래된 상기된 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제 유전자가,
(A) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 및 (B) 서열번호 2의 아미노산 서열중 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하고 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단백질을 암호화하는 상기된 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제 유전자가
(a) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1 내지 1196의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 및
(b) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1 내지 1196의 뉴클레오타이드 서열 또는 엄중 조건하에 당해 뉴클레오타이드 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 하이브리드화할 수 있고 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 DNA를 포함하는 상기된 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 엄중 조건이, 세척이 1 x SSC 및 0.1% SDS의 염농도에서 60℃에서 15분동안 수행되는 조건을 포함하는 상기된 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은,
- 아스파르토키나제 호모세린 데하이드로게나제 I를 암호화하고 트레오닌에 의한 피드백 억제에 내성인 돌연변이 thrA 유전자;
- 호모세린 키나제를 암호화하는 thrB 유전자;
- 트레오닌 신타제를 암호화하는 thrC 유전자 및
- 추정 막관통 단백질을 암호화하는 rhtA 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현이 증진되도록 변형된 상기된 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 당해 돌연변이 thrA 유전자, 당해 thrB 유전자, 당해 thrC 유전자 및 rhtA 유전자의 발현이 증가하도록 변형된 상기된 세균을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 상기된 세균을 배양 배지에서 배양하여 배양 배지 내에 L-트레오닌을 축적시키고 배양 배지로부터 L-트레오닌을 수거함을 포함하는 L-트레오닌의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서, "L-트레오닌-생산 세균"은 세균이 배지에서 배양되는 경우 배지내에 L-트레오닌을 축적시키는 능력을 갖는 세균을 의미한다. L-트레오닌 생산 능력은 증식에 의해 부여되거나 증진될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "L-트레오닌 생산 세균"은 또한 이 콜리의 야생형 또는 모균주, 예를 들어, 이. 콜리 K-12 균주보다 대량으로 배양배지내에 L-트레오닌을 생산하고 축적시킬 수 있는 세균을 의미한다.
용어 "에스케리치아 속에 속하는 세균"은 세균이 미생물학 분야의 기술자에게 공지된 분류법에 따라 에스케리치아 속으로 분류됨을 의미한다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 에스케리치아 속에 속하는 미생물의 예는 에스케리치아 콜리(이. 콜리)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용될 수 있는 에스케리치아 속에 속하는 세균은 특별히, 제한되지 않으며, 예를 들어, 문헌[참조: Neidhardt, F.C. et al.(Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Table 1)에 기재된 세균은 본 발명에 포함된다.
용어 "아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제의 활성"은 포스페이트 또는 아르세네이트의 존재하에 NADP의 가역적 기질 의존성 환원을 촉매하는 활성을 의미한다. 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제의 활성은 예를 들어, 문헌[참조: Preiss, J. et al(Curr. Microbiol., 7:263-268(1982)]에 기재된 방법에 의해 측정될 수 있다.
용어 "아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제의 활성이 증진되도록 변형된"은 세포당 활성이 비변형된 균주, 예를 들어, 야생형 균주의 활성 보다 높음을 의미한다. 당해 변형의 예는 세포당 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제 분자수를 증가시키고 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제 분자당 비활성(specific activity)을 증가시키는 것등을 포함한다. 추가로, 비교 목적을 위해 사용될 수 있는 야생형 균주는 예를 들어, 에스케리치아 콜리 K-12를 포함한다. 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제의 세포내 활성이 증진된 결과로서, 배지내 L-트레오닌 축적양이 증가한다.
세균 세포내 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제 활성의 증진은 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자의 발현을 증진시켜 달성될 수 있다. 에스케리치아 속에 속하는 세균 유래 임의의 유전자 및 기타 코리네형 세균과 같은 기타 세균으로부터 유래된 임의의 유전자는 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제 유전자로서 사용될 수 있다. 이들 중에서, 에스케리아치아 속에 속하는 세균 유래 유전자가 바람직하다.
에스케리치아 콜리의 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자로서, asd 유전자가 이미 판명되었다(GenBank 승인 NC_000913.1, gi:16131307의 서열에서 뉴클레오타이드 번호 3572511 내지 3571408). 따라서, asd 유전자는 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 기초로 제조된 프라이머를 사용하는 PCR[문헌참조: polymerase chain reaction; refer to White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185(1989)]에 의해 수득될 수 있다. 기타 미생물의 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자는 유사한 방식으로 수득될 수 있다.
에스케리치아 콜리 유래 asd 유전자는 하기의 단백질 (A) 또는 (B)를 암호화하는 DNA로 예시된다:
(A) 서열번호 2로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는
(B) 서열번호 2로 나타낸 아미노산 서열중 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 첨가된 아미노산 서열을 갖고 아스파르테이트 세미알데하이드 데하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질.
"수개의" 아미노산 수는 단백질의 3차원 구조에서 아미노산 잔기의 위치 또는 유형에 따라 상이하다. 이는 단백질 (A)에 대해 2 내지 30개, 바람직하게는 2 내지 15개 및 보다 바람직하게는 2 내지 5개일 수 있다. 아미노산은 단백질의 기능에 중요하지 않은 단백질 영역에서 결실, 치환, 삽입 또는 첨가될 수 있다. 이것은 몇몇 아미노산이 서로에 대해 높은 상동성을 가져 3차원 구조 또는 활성이 당해 변화에 의해 영향받지 않기때문이다. 따라서, 단백질 변이체(B)는, 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제의 활성이 유지되는 한, 서열번호 2에 나타낸 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제의 전체 아미노산 서열에 대해 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상 및 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 변이체일 수 있다. 2개의 아미노산 서열간의 상동성은 널리 공지된 방법, 예를 들어, 컴퓨터 프로그램 BLAST 2.0을 사용하여 3개의 변수, 스코어, 동일성 및 유사성을 계산하여 측정될 수 있다.
하나 또는 수개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입 또는 첨가는 보존성 돌연변이여서 활성이 유지되어야만 한다. 대표적인 보존성 돌연변이는 보존성 치환이다. 보존성 치환의 예는 Ala의 Ser 또는 Thr로의 치환, Arg의 Gln, His 또는 Lys로의 치환, Asn의 Glu, Gln, Lys, His 또는 Asp로의 치환, Asp의 Asn, Glu 또는 Gln으로의 치환, Cys의 Ser 또는 Ala로의 치환, Gln의 Asn, Glu, Lys, His, Asp 또는 Arg로의 치환, Glu의 Asn, Gln, Lys 또는 Asp로의 치환, Gly의 Pro로의 치환, His의 Asn, Lys, Gln, Arg 또는 Tyr로의 치환, Ile의 Leu, Met, Val 또는 Phe로의 치환, Leu의 Ile, Met, Val 또는 Phe로의 치환, Lys의 Asn, Glu, Gln, His 또는 Arg로의 치환, Met의 Ile, Leu, Val 또는 Phe로의 치환, Phe의 Trp, Tyr, Met, Ile 또는 Leu로의 치환, Ser의 Thr 또는 Ala로의 치환, Thr의 Ser 또는 Ala로의 치환, Trp의 Phe 또는 Tyr로의 치환, Tyr의 His, Phe 또는 Trp로의 치환 및 Val의 Met, Ile 또는 Leu로의 치환을 포함한다.
상기된 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제와 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는 예를 들어, 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제를 암호화하는 DNA의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 1)을 변형시킴으로써, 예를 들어, 부위 지시된 돌연변이유발 방법으로 특정 부위에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 결실, 치환, 삽입 또는 첨가하여 수득될 수 있다. 상기된 바와 같은 변형된 DNA는 통상적으로 공지된 돌연변이 처리에 의해 수득될 수 있다. 당해 처리는 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA의 하이드록실아민 처리 또는 DNA를 함유하는 세균의 UV 조사 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 또는 질산과 같은 시약으로의 처리를 포함한다.
아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제와 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는 적절한 세포에서 상기된 바와 같은 돌연변이를 갖는 DNA를 발현시키고 임의의 발현된 생성물의 활성을 조사하여 수득될 수 있다. 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제와 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는 또한 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제를 암호화하는 돌연변이 DNA로부터 또는, 돌연변이 함유 세포로부터, 예를 들면 서열번호 1로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 프로브와 엄중 조건하에 하이브리드화할 수 있고 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 분리하여 수득될 수 있다. 본원에 언급된 "엄중 조건"은 소위 특이적 하이브리드가 형성되고 비특이적 하이브리드는 형성되지 않는 조건이다. 임의의 수치를 사용하여 당해 조건을 명백하게 표현하기는 어렵다. 그러나, 예를 들어, 엄중 조건은 고도의 상동성을 갖는 DNA, 예를 들어, 50% 미만의 상동성을 갖는 DNA가 서로 하이브리드화할 수 있지만 이 보다 낮은 상동성을 갖는 DNA는 서로 하이브리드화 할 수 없는 조건으로 예시될 수 있다. 또한, 엄중 조건은 서던 하이브리드화에서 통상적인 세척 조건(즉, 60℃에서 1 x SSC, 0.1% SDS, 바람직하게 0.1 x SSC, 0.1% SDS)과 동등한 염농도에서 하이브리드화할 수 있는 조건으로 예시될 수 있다. 세척 지속 시간은 블롯팅을 위해 사용되는 막 유형에 따라 상이하고 일반적으로 제조업자에 의해 추천된다. 예를 들어, 엄중조건하에 하이본드TM N + 나일론 막(Amersham)을 세척하기 위해 추천된 지속시간은 15분이다.
서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열의 부분 서열은 또한 프로브로서 사용될 수 있다. 프로브는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 기초로하는 프라이머 및 주형으로서 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 DNA 단편을 사용하는 PCR에 의해 제조될 수 있다. 길이가 약 300bp인 DNA 단편이 프로브로서 사용되는 경우, 세척을 위한 하이브리드화 조건은 예를 들어, 50℃, 2 x SSC 및 0.1% SDS를 포함한다.
상기된 바와 같은 뉴클레오타이드의 치환, 결실, 삽입 또는 첨가는 또한 예를 들어, 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제를 함유하는 세균의 종 또는 속의 다양성으로 인해 천연적으로 발생하는 돌연변이(돌연변이체 또는 변이체)를 포함한다.
"단백질을 암호화하는 DNA를 사용한 세균의 형질전환"은 예를 들어, 통상적인 방법에 의해 DNA를 세균으로 도입함을 의미한다. 당해 DNA의 형질전환은 본 발명의 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 증가시키고 세균 세포에서 단백질의 활성을 증진시킨다.
유전자 발현 증진 방법은 유전자 카피수를 증가시킴을 포함한다. 유전자를 에스케리치아 속에 속하는 세균에서 기능할 수 있는 벡터로 도입하여 유전자 카피수를 증가시킨다. 바람직하게, 낮은 카피 벡터를 사용한다. 낮은 카피 벡터의 예는 pSC101, pMW118 및 pMW119등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 용어 "낮은 카피 벡터"는 카피수가 세포당 5카피 이하인 벡터에 대해 사용된다. 형질전환 방법은 지금까지 보고된 임의의 공지된 방법을 포함한다. 예를 들어, 수용체 세포를 염화칼슘으로 처리하여 DNA에 대한 세포의 투과성을 증가시키는 방법은 에스케리치아 콜리 K-12에 대해 보고되었고[문헌참조: Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159(1970)] 이를 사용할 수 있다.
유전자 발현은 예를 들어, 상동성 재조합, Mu 통합 등의 방법에 의해 세균 염색체내로 다중 유전자 카피를 도입함에 의해 증진될 수 있다. 예를 들어, Mu 통합 작용으로 세균 염색체내로 3개 카피 이하의 유전자가 도입될 수 있다.
유전자 발현은 또한 본 발명의 DNA를 강력한 프로모터의 조절하에 위치시켜 증진될 수 있다. 예를 들어, lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터 및 람다 파아지의 PR 및 PL 프로모터는 강력한 프로모터로서 공지되어 있다. 강력한 프로모터의 사용을 조합하여 유전자 카피를 증대시킬 수 있다.
또한, 프로모터의 효과는 예를 들어, 돌연변이를 프로모터로 도입하여 프로모터의 하류에 위치하는 유전자의 전사 수준을 증가시킴으로써 증진될 수 있다. 추가로, 리보솜 결합 부위(RBS)와 개시 코돈 사이의 스페이서, 특히, 개시 코돈 상류에 바로 인접한 서열에서 수개의 뉴클레오타이드의 치환은 mRNA의 해독성에 심오한 영향을 미치는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 발현 수준의 20배 범위는 개시 코돈 이전의 3개의 뉴클레오타이드의 특성에 의존하는 것으로 밝혀졌다[문헌참조: Gold et al., Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981; Hui et al., EMBO J., 3, 623-629, 1984]. 이전에, rhtA23 돌연변이는 ATG 개시 코돈에 대해 -1 위치에서 G가 A로 치환된 것으로 밝혀졌다[문헌참조: ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457]. 따라서, 이것은 rhtA23 돌연변이가 rhtA 유전자 발현을 증진시키고 결과로서 트레오닌, 호모세린 및 세포 외부로 수송되는 물질에 대한 내성을 증가시키는 것으로 제안될 수 있다.
더욱이, 또한 세균 염색체상에 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제 유전자의 프로모터 영역으로 뉴클레오타이드를 치환시켜 보다 강한 프로모터 기능을 유발할 수 있다. 발현 조절 서열은 예를 들어, 국제 공개 공보 WO00/18935 및 일본 특허 공보 제1-215280호에 기재된 바와 같은 온도 민감성 플라스미드를 사용하는 유전자 치환과 동일한 방식으로 수행될 수 있다.
또한 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제 유전자의 카피수는 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제 유전자의 다중 카피를 세균의 염색체 DNA로 도입하여 증가시킬 수 있다. 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제 유전자의 다중 카피를 세균 염색체로 도입하기 위해, 다중 카피가 표적으로서 염색체 DNA에 존재하는 서열을 사용하여 상동성 재조합을 수행한다. 염색체 DNA에 다중 카피를 갖는 서열은 트랜스포존 요소의 말단에 존재하는 반복 DNA 또는 역위된 반복체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또한, 미국 특허 제5,595,889호에 기재된 바와 같이, 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제 유전자를 트랜스포존으로 도입할 수 있고 이것이 전달되어 다중 카피의 유전자가 염색체 DNA로 도입될 수 있다.
플라스미드 DNA의 제조 방법은 DNA의 분해 및 연결, 형질전환, 프라이머로서 올리고뉴클레오타이드의 선별등 또는 당업자에게 널리 공지된 기타 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 방법은 예를 들어, 문헌[참조: Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]에 기재되어 있다.
본 발명의 세균은 상기 언급된 DNA를, L-트레오닌의 고유 생산능을 갖는 세균으로 도입하여 수득할 수 있다. 또한, 본 발명의 세균은 이미 DNA를 함유하는 세균으로 L-트레오닌 생산능을 부여하여 수득할 수 있다.
본 발명에 의해 포함되는 모균주의 예는 이. 콜리 균주 TDH-6/pVIC40(VKPM B-3996)(미국 특허 제5,175,107호, 미국 특허 제5,705,371호), 이. 콜리 균주 NRRL-21593(미국 특허 제5,939,307), 이. 콜리 균주 FERM BP-3756(미국 특허 제5,474,918호), 이. 콜리 균주 FERM BP-3519 및 FERM BP-3520(미국 특허 제5,376,538호), 이. 콜리 균주 MG442(Gusyatiner et al., Genetika(in Russian), 14, 947-956(1978)) 및 이 콜리 균주 VL643 및 VL2055(EP 1139911 A)등과 같은 에스케리치아 속에 속하는 트레오닌 생산 세균을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
균주 TDH-6은 thrC 유전자 결핍이고 슈크로스 동화성이며 ilvA 유전자는 누출 돌연변이를 갖는다. 당해 균주는 rhtA 유전자에 고농도의 트레오닌 또는 호모세린에 내성을 부여하는 돌연변이를 갖는다. 균주 B-3996은 실질적으로 트레오닌에 의한 피드백 억제가 탈감작된 아스파르토키나제 호모세린 데하이드로게나제 I를 암호화하는 돌연변이 thrA 유전자를 포함하는 thrA * BC 오페론을 RSF1010-유래 벡터에 삽입하여 수득된 플라스미드 pVIC40을 함유한다. 균주 B-3996은 기탁번호 RIA 1867하에 올-유니온 사이언티픽 센터 오브 앤티바이오틱스(All-union scientific center of antibiotics)(주소: Nagatinskaya Street 3-A, 113105 Moscow, Russian Federation)에 1987년 11월 19일자로 기탁되었다. 당해 균주는 또한 기탁번호 B-3996하에 러시안 내셔날 콜렉션 오브 인더스트리얼 마이크로오거니즘(VKPM)(Dorozhny proezd. 1, Moscow 113545, Russian Federation)에 1987년 4월 7일자로 기탁되었다.
바람직하게, 본 발명의 세균은 추가로 변형되어 asd 유전자 뿐만 아니라 하기의 하나 이상의 유전자 발현이 증진된다:
- 트레오닌에 의한 피드백 억제에 내성인 아스파르토키나제 호모세린 데하이드로게나제 I를 암호화하는 돌연변이 thrA 유전자;
- 호모세린 키나제를 암호화하는 thrB 유전자 및
- 트레오닌 신타제를 암호화하는 thrC 유전자.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태는 변형되어 asd 유전자가 증진될 뿐만 아니라 추정 막관통 단백질을 암호화하는 rhtA 유전자가 증진된 세균이다. 본 발명의 가장 바람직한 양태는 변형되어 asd 유전자, 돌연변이 thrA 유전자, thrB 유전자, thrC 유전자 및 rhtA 유전자의 발현이 증가된 세균이다.
본 발명의 L-트레오닌 생산 방법은 본 발명의 세균을 배양 배지에서 배양시키는 단계, L-트레오닌을 배양 배지에 축적시키는 단계 및 배양 배지로부터 L-트레오닌을 수거하는 단계를 포함한다.
본 발명에서, 배지로부터 L-트레오닌의 배양, 수거 및 정제는 L-트레오닌이 미생물을 사용하여 생산되는 통상적인 발효 방법과 유사한 방식으로 수행될 수 있다.
배양에 사용되는 배지는 배지가 탄소원 및 질소원 및 무기물 및 경우에 따라 미생물 증식에 요구되는 적당한 양의 영양물을 함유하는 한 합성 또는 천연 배지일 수 있다. 탄소원은 글루코스 및 슈크로스와 같은 다양한 탄수화물 및 다양한 유기산을 포함할 수 있다. 선택된 미생물의 동화 방식에 의존하여 에탄올 및 글리세롤을 포함하는 알콜이 사용될 수 있다. 질소원으로서, 암모니아 및 황산암모늄과 같은 다양한 암모늄 염, 아민과 같은 기타 질소 화합물, 펩톤, 대두-가수분해물과 같은 천연 질소원 및 분해된 발효 미생물이 사용된다. 무기물로서, 일인산칼륨, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황화철, 황화망간, 염화칼슘등이 사용된다. 비타민으로서, 티아민, 효모 추출물등이 사용된다. 경우에 따라 추가의 영양물이 첨가될 수 있다. 예를 들어, 미생물이 증식을 위해 이소류신을 요구하는 경우(이소류신 영양요구성), 충분한 양의 이소류신이 배양 배지에 첨가될 수 있다.
배양은 바람직하게 진탕 배양 및 통기 교반 배양과 같은 호기 조건하에 20 내지 40℃에서, 바람직하게 30 내지 38℃의 온도에서 수행된다. 배양 pH는 일반적으로 5 내지 9이고 바람직하게는 6.5 내지 7.2이다. 배양 pH는 암모니아, 탄산칼슘, 다양한 산, 다양한 염기 및 완충제를 사용하여 조정될 수 있다. 일반적으로, 1 내지 5일간의 배양은 액체 배지에서 L-트레오닌을 축적시킨다.
배양 후, 세포와 같은 고체는 원심분리 또는 막 여과에 의해 액체 배지로부터 제거될 수 있고 이어서 L-트레오닌은 이온 교환, 농축 및 결정화 방법에 의해 수거되고 정제될 수 있다.
본 발명은 하기의 비제한적인 실시예를 참조로 하기에서 보다 상세하게 설명될 것이다.
실시예 1: 이. 콜리로부터 asd 유전자의 pM 벡터로의 클로닝
asd 유전자는 러시안 내셔널 콜렉션 오브 인더스트리얼 마이크로오거니즘(VKPM)(Dorozhny proezd. 1, Moscow 113545, Russian Federation)으로부터 수득된 이. 콜리 균주(K12 Mu cts62 Mud5005)의 염색체 DNA로부터 클로닝되었다. 먼저, 이. 콜리 균주(K12 Mu cts62 Mud5005)(VKPM B-6804)에서 소형 Mu-파아지가 유도되었다. 이어서, 염색체 일부를 함유하는 플라스미드 pMud5005의 수득된 유도체 세트를 asd 균주 SH 309를 형질전환시키는데 사용하였다. 러시안 내셔널 콜렉션 오브 인더스트리얼 마이크로오거니즘(VKPM)(Dorozhny proezd. 1, Moscow 113545, Russian Federation)으로부터 수득된 균주 SH 309(VKPM B-3899)는 하기의 표현형을 갖는다: F- araD139 rpsL150deoC1 ptsF25 relA1 feb5301 rbsR ugpA704::Tn10Del(argF-lac) U169Del(mal-asd)TetRStrR. asd- 균주 SH 309는 L 배지상에서 증식할 수 없고 증식을 위해 디아미노피멜린산(DAPA)을 필요로한다. 플라스미드 pMud5005-asd 함유 SH 309 asd+ 클론을 L-배지상에서 선별하였다. 플라스미드 pMud5005-asd를 분리하고 asd 유전자를 함유하는 BamHI-PstI DNA 단편(1646 bp)을 프로모터 Plac가 프로모터 PR로 치환되어 사전에 변형된 플라스미드 pMW119에 재클로닝하였다. 따라서, 프로모터 PR 조절하에 있는 asd 유전자 함유 플라스미드 pMW-asd를 작제하였다. 플라스미드 pMW-asd는 플라스미드 pVIC40(레플리콘 pRSF1010)와 공존할 수 있음에 따라 2개의 플라스미드 pVIC40과 pMW-asd는 세균에 동시에 유지될 수 있다.
pMW-asd 플라스미드를 스트렙토마이신 내성 트레오닌 생산자 이. 콜리 균주 B-3996으로 도입하였다. 따라서, 균주 B-3996(pMW-asd)을 수득하였다.
실시예 2. 트레오닌 생산에 대한 asd 유전자 증폭 효과
이. 콜리 균주 B-3996과 B-3996(pMW-asd) 둘다를 스트렙토마이신(100㎍/ml)과 앰피실린(100㎍/ml)을 함유하는 L-한천 플레이트상에서 37℃에서 18 내지 24시간동안 증식시켰다. 종균 배양물을 수득하기 위해, 균주를 4% 슈크로스와 함께 2ml의 L-브로쓰를 함유하는 20 x 200 mm 시험 튜브에서 18시간동안 32℃에서 회전 진탕기(250rpm)에서 증식시켰다. 이어서, 발효 배지에 0.1ml(5%)의 종균 물질을 접종하였다. 20x200 mm 시험튜브에서 발효시키기 위한 최소의 배지 2ml에서 발효 를 수행하였다. 세포를 250rpm에서 진탕시키면서 32℃에서 24시간동안 증식시켰다.
배양 후, 배지내 축적된 양의 L-트레오닌을 TLC로 측정하였다. 소르브필(Sorbfil) 플레이트(Stock Company Sorbopolymer, Krasnodar, Russia)는 이동상: 프로판-2-올:아세톤:물:25% 수성 암모니아 = 25:25:7:6(v/v)을 사용하여 전개하였다. 아세톤중 닌하이드린 용액 2%를 가시화 시약으로서 사용하였다. 그 결과는 표 1에 나타낸다.
발효 배지의 조성(g/l)은 다음과 같다:
슈크로스 40.0
(NH4)2SO4 10.0
KH2PO4 1.0
MgSO4ㆍ7H2O 0.4
FeSO4ㆍ7H2O 0.02
MnSO4ㆍ5H2O 0.02
티아민 HCl 0.0002
효모 추출물 1.0
CaCO3 20.0
L-이소류신 0.05
슈크로스 및 황산마그네슘을 별도로 멸균시킨다. CaCO3는 180℃에서 2시간동안 건조열로 멸균시킨다. pH는 7.0으로 조정한다. 항생제는 멸균 후 배지에 도입한다.
본 발명은 이의 바람직한 양태를 참조로 상세하게 기재되었지만 본 발명의 취지를 벗어나지 않고 이를 다양하게 변화시킬 수 있고 이의 등가물이 사용될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 상기 언급된 문헌 각각은 이의 전반적인 내용이 본원에 참조로 인용된다.
| 균주 | OD560 | 트레오닌, g/l |
| B3996/pMW-asd | 8.6 | 18.5 |
| 8.4 | 18.3 | |
| 9.1 | 19.8 | |
| 9.5 | 19.2 | |
| 9.3 | 20.0 | |
| 8.9 | 18.6 | |
| 9.4 | 19.3 | |
| 9.0 | 19.3 | |
| 9.0 ±0.4 | 19.1 ±0.6 | |
| B-3996(대조군) | 9.3 | 18.6 |
| 9.6 | 17.9 | |
| 10.5 | 17.9 | |
| 10.6 | 17.6 | |
| 9.8 | 17.8 | |
| 9.9 | 18.1 | |
| 10.2 | 18.0 | |
| 10.0 | 17.9 | |
| 10.0 ±0.4 | 18.0 ±0.3 |
L-트레오닌은 효율적으로 생산될 수 있다.
<110> Ajinomoto Co., Inc.
<120> L-THREONINE PRODUCING BACTERIUM BELONGING TO THE GENUS ESCHERICHIA AND METHOD FOR PRODUCING L-THREONINE
<130> C254OPC4231
<150> RU 2003135292
<151> 2003-12-05
<150> US 60/586,222
<151> 2004-07-09
<160> 2
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 1104
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1104)
<400> 1
atg aaa aat gtt ggt ttt atc ggc tgg cgc ggt atg gtc ggc tcc gtt 48
Met Lys Asn Val Gly Phe Ile Gly Trp Arg Gly Met Val Gly Ser Val
1 5 10 15
ctc atg caa cgc atg gtt gaa gag cgc gac ttc gac gcc att cgc cct 96
Leu Met Gln Arg Met Val Glu Glu Arg Asp Phe Asp Ala Ile Arg Pro
20 25 30
gtc ttc ttt tct act tct cag ctt ggc cag gct gcg ccg tct ttt ggc 144
Val Phe Phe Ser Thr Ser Gln Leu Gly Gln Ala Ala Pro Ser Phe Gly
35 40 45
gga acc act ggc aca ctt cag gat gcc ttt gat ctg gag gcg cta aag 192
Gly Thr Thr Gly Thr Leu Gln Asp Ala Phe Asp Leu Glu Ala Leu Lys
50 55 60
gcc ctc gat atc att gtg acc tgt cag ggc ggc gat tat acc aac gaa 240
Ala Leu Asp Ile Ile Val Thr Cys Gln Gly Gly Asp Tyr Thr Asn Glu
65 70 75 80
atc tat cca aag ctt cgt gaa agc gga tgg caa ggt tac tgg att gac 288
Ile Tyr Pro Lys Leu Arg Glu Ser Gly Trp Gln Gly Tyr Trp Ile Asp
85 90 95
gca gca tcg tct ctg cgc atg aaa gat gac gcc atc atc att ctt gac 336
Ala Ala Ser Ser Leu Arg Met Lys Asp Asp Ala Ile Ile Ile Leu Asp
100 105 110
ccc gtc aat cag gac gtc att acc gac gga tta aat aat ggc atc agg 384
Pro Val Asn Gln Asp Val Ile Thr Asp Gly Leu Asn Asn Gly Ile Arg
115 120 125
act ttt gtt ggc ggt aac tgt acc gta agc ctg atg ttg atg tcg ttg 432
Thr Phe Val Gly Gly Asn Cys Thr Val Ser Leu Met Leu Met Ser Leu
130 135 140
ggt ggt tta ttc gcc aat gat ctt gtt gat tgg gtg tcc gtt gca acc 480
Gly Gly Leu Phe Ala Asn Asp Leu Val Asp Trp Val Ser Val Ala Thr
145 150 155 160
tac cag gcc gct tcc ggc ggt ggt gcg cga cat atg cgt gag tta tta 528
Tyr Gln Ala Ala Ser Gly Gly Gly Ala Arg His Met Arg Glu Leu Leu
165 170 175
acc cag atg ggc cat ctg tat ggc cat gtg gca gat gaa ctc gcg acc 576
Thr Gln Met Gly His Leu Tyr Gly His Val Ala Asp Glu Leu Ala Thr
180 185 190
ccg tcc tct gct att ctc gat atc gaa cgc aaa gtc aca acc tta acc 624
Pro Ser Ser Ala Ile Leu Asp Ile Glu Arg Lys Val Thr Thr Leu Thr
195 200 205
cgt agc ggt gag ctg ccg gtg gat aac ttt ggc gtg ccg ctg gcg ggt 672
Arg Ser Gly Glu Leu Pro Val Asp Asn Phe Gly Val Pro Leu Ala Gly
210 215 220
agc ctg att ccg tgg atc gac aaa cag ctc gat aac ggt cag agc cgc 720
Ser Leu Ile Pro Trp Ile Asp Lys Gln Leu Asp Asn Gly Gln Ser Arg
225 230 235 240
gaa gag tgg aaa ggg cag gcg gaa acc aac aag atc ctc aac aca tct 768
Glu Glu Trp Lys Gly Gln Ala Glu Thr Asn Lys Ile Leu Asn Thr Ser
245 250 255
tcc gta att ccg gta gat ggt tta tgt gtg cgt gtc ggg gca ttg cgc 816
Ser Val Ile Pro Val Asp Gly Leu Cys Val Arg Val Gly Ala Leu Arg
260 265 270
tgc cac agc cag gca ttc act att aaa ttg aaa aaa gat gtg tct att 864
Cys His Ser Gln Ala Phe Thr Ile Lys Leu Lys Lys Asp Val Ser Ile
275 280 285
ccg acc gtg gaa gaa ctg ctg gct gcg cac aat ccg tgg gcg aaa gtc 912
Pro Thr Val Glu Glu Leu Leu Ala Ala His Asn Pro Trp Ala Lys Val
290 295 300
gtt ccg aac gat cgg gaa atc act atg cgt gag cta acc cca gct gcc 960
Val Pro Asn Asp Arg Glu Ile Thr Met Arg Glu Leu Thr Pro Ala Ala
305 310 315 320
gtt acc ggc acg ctg acc acg ccg gta ggc cgc ctg cgt aag ctg aat 1008
Val Thr Gly Thr Leu Thr Thr Pro Val Gly Arg Leu Arg Lys Leu Asn
325 330 335
atg gga cca gag ttc ctg tca gcc ttt acc gtg ggc gac cag ctg ctg 1056
Met Gly Pro Glu Phe Leu Ser Ala Phe Thr Val Gly Asp Gln Leu Leu
340 345 350
tgg ggg gcc gcg gag ccg ctg cgt cgg atg ctt cgt caa ctg gcg taa 1104
Trp Gly Ala Ala Glu Pro Leu Arg Arg Met Leu Arg Gln Leu Ala
355 360 365
<210> 2
<211> 367
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 2
Met Lys Asn Val Gly Phe Ile Gly Trp Arg Gly Met Val Gly Ser Val
1 5 10 15
Leu Met Gln Arg Met Val Glu Glu Arg Asp Phe Asp Ala Ile Arg Pro
20 25 30
Val Phe Phe Ser Thr Ser Gln Leu Gly Gln Ala Ala Pro Ser Phe Gly
35 40 45
Gly Thr Thr Gly Thr Leu Gln Asp Ala Phe Asp Leu Glu Ala Leu Lys
50 55 60
Ala Leu Asp Ile Ile Val Thr Cys Gln Gly Gly Asp Tyr Thr Asn Glu
65 70 75 80
Ile Tyr Pro Lys Leu Arg Glu Ser Gly Trp Gln Gly Tyr Trp Ile Asp
85 90 95
Ala Ala Ser Ser Leu Arg Met Lys Asp Asp Ala Ile Ile Ile Leu Asp
100 105 110
Pro Val Asn Gln Asp Val Ile Thr Asp Gly Leu Asn Asn Gly Ile Arg
115 120 125
Thr Phe Val Gly Gly Asn Cys Thr Val Ser Leu Met Leu Met Ser Leu
130 135 140
Gly Gly Leu Phe Ala Asn Asp Leu Val Asp Trp Val Ser Val Ala Thr
145 150 155 160
Tyr Gln Ala Ala Ser Gly Gly Gly Ala Arg His Met Arg Glu Leu Leu
165 170 175
Thr Gln Met Gly His Leu Tyr Gly His Val Ala Asp Glu Leu Ala Thr
180 185 190
Pro Ser Ser Ala Ile Leu Asp Ile Glu Arg Lys Val Thr Thr Leu Thr
195 200 205
Arg Ser Gly Glu Leu Pro Val Asp Asn Phe Gly Val Pro Leu Ala Gly
210 215 220
Ser Leu Ile Pro Trp Ile Asp Lys Gln Leu Asp Asn Gly Gln Ser Arg
225 230 235 240
Glu Glu Trp Lys Gly Gln Ala Glu Thr Asn Lys Ile Leu Asn Thr Ser
245 250 255
Ser Val Ile Pro Val Asp Gly Leu Cys Val Arg Val Gly Ala Leu Arg
260 265 270
Cys His Ser Gln Ala Phe Thr Ile Lys Leu Lys Lys Asp Val Ser Ile
275 280 285
Pro Thr Val Glu Glu Leu Leu Ala Ala His Asn Pro Trp Ala Lys Val
290 295 300
Val Pro Asn Asp Arg Glu Ile Thr Met Arg Glu Leu Thr Pro Ala Ala
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Val Thr Gly Thr Leu Thr Thr Pro Val Gly Arg Leu Arg Lys Leu Asn
325 330 335
Met Gly Pro Glu Phe Leu Ser Ala Phe Thr Val Gly Asp Gln Leu Leu
340 345 350
Trp Gly Ala Ala Glu Pro Leu Arg Arg Met Leu Arg Gln Leu Ala
355 360 365
Claims (11)
- 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제의 활성이 증진되도록 변형된, 에스케리치아 속에 속하는 L-트레오닌 생산 세균.
- 제1항에 있어서, 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제의 활성이 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제 유전자의 발현을 증가시켜 증진된 세균.
- 제1항에 있어서, 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제의 활성이 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제 유전자의 카피수를 증가시키거나 유전자 발현이 증진되도록 유전자의 발현 조절 서열을 변형시켜 증진된 세균.
- 제3항에 있어서, 카피수가 세균을 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환시켜 증가된 세균.
- 제2항에 있어서, 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제 유전자가 에스케리치아 속에 속하는 세균으로부터 유래하는 세균.
- 제5항에 있어서, 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제 유전자가,(A) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 및(B) 서열번호 2의 아미노산 서열중 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하고 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단백질을 암호화하는 세균.
- 제5항에 있어서, 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제 유전자가,(a) 서열번호 1중 뉴클레오타이드 1 내지 1196의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 및(b) 서열번호 1중 뉴클레오타이드 1 내지 1196의 뉴클레오타이드 서열 또는 엄중 조건하에 당해 뉴클레오타이드 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 하이브리드화할 수 있고 아스파르테이트-β-세미알데하이드 데하이드로게나제의 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 DNA를 포함하는 세균.
- 제7항에 있어서, 엄중 조건이, 세척이 1 x SSC 및 0.1% SDS의 염농도에서 60℃에서 15분동안 수행되는 조건을 포함하는 세균.
- 제1항에 있어서,- 아스파르토키나제 호모세린 데하이드로게나제 I를 암호화하고 트레오닌에 의한 피드백 억제에 내성인 돌연변이 thrA 유전자;- 호모세린 키나제를 암호화하는 thrB 유전자;- 트레오닌 신타제를 암호화하는 thrC 유전자 및- 추정 막관통 단백질을 암호화하는 rhtA 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현이 증진되도록 추가로 변형된 세균.
- 제9항에 있어서, 돌연변이 thrA 유전자, thrB 유전자, thrC 유전자 및 rhtA 유전자의 발현이 증가되도록 변형된 세균.
- 배양 배지에서 제1항에 따른 세균을 배양하여 당해 배양 배지에서 L-트레오닌을 축적시키는 단계 및 당해 배양 배지로부터 L-트레오닌을 수거하는 단계를 포함하는, L-트레오닌의 생산 방법.
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