KR20100056460A - Ｌ-리신의 제조법 - Google Patents

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Abstract

L-리신 생산능을 갖는 에스케리키아 콜라이로서, 메소-α,ε-디아미노피멜산 합성 경로의 1 또는 2 이상의 효소, 예를 들면 2,3,4,5-테트라하이드로피리딘-2,6-디카복실산 N-석시닐트랜스퍼라제, 석시닐디아미노피멜산 트랜스아미나제, 석시닐디아미노피멜산 데석시닐라제, 또는 디아미노피멜산 에피머라제의 활성이 저하되도록 개변되고, 디아미노피멜산 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자가 도입된 에스케리키아 콜라이를 배지 중에서 배양하고, 당해 배지로부터 L-리신을 채취함으로써, L-리신을 제조한다.

Description

Ｌ-리신의 제조법{Method for production of L-lysine}
본 발명은, 에스케리키아 콜라이를 사용한 L-리신의 제조법에 관한 것이다. L-리신은 필수 아미노산이며, 의약이나, 동물용 사료 첨가물과 같은 여러 가지 영양 혼합물의 컴포넌트로서 이용된다.
L-리신 등의 L-아미노산은, 이들의 L-아미노산 생산능을 갖는 코리네형 세균 또는 에스케리키아속 세균 등의 아미노산 생산균을 사용하여 발효법에 의해 공업 생산되고 있다. 이러한 아미노산 생산균으로서는, 생산성을 향상시키기 위해서, 자연계로부터 분리한 균주 또는 당해 균주의 인공 변이주, 또는 유전자 재조합에 의해 L-아미노산 생합성 효소 활성이 증강된 재조합체 등이 사용되고 있다. L-리신의 제조법으로서는 예를 들면, 특허문헌 1 내지 4에 기재된 방법을 들 수 있다.
L-리신 등의 아미노산 생산능을 향상시키는 방법으로서, 목적으로 하는 아미노산에 고유의 생합성 경로의 효소의 발현량을 강화하는 방법 이외에, 호흡쇄 경로를 개변하여 에너지 효율을 개선하는 방법(특허문헌 5), 니코틴아미드 뉴클레오타이드 트랜스하이드로게나제 유전자를 증폭시켜 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 인산 생산능을 상승시키는 방법(특허문헌 6)이 개발되어 있다.
또한 다양한 아미노산 생합성의 공통 경로를 개변하는 방법으로서, 피루브산 카르복실라제 활성을 증가시킨 코리네형 세균 L-리신 생산균(특허문헌 7), 피루브산 키나제를 결손시킨 에스케리키아속 L-리신 생산균(특허문헌 8), 말레이트 퀴논 옥시도리덕타제(malate quinone oxidoreductase)를 결손시킨 코리네형 세균 L-리신 생산균(특허문헌 9) 등의, 보충 경로를 개변한 L-아미노산 생산균이 알려져 있다.
L-리신의 전구체로서 메소-α,ε-디아미노피멜산(이하, 「메소-DAP」라고도 한다)이 존재한다. 메소-DAP는 L-리신의 전구체인 동시에, 세포벽의 구성 성분으로서 세균의 생육에 필수적인 물질이다. 에스케리키아속 세균의 메소-DAP 합성에 관해서는, 그 전구체인 2,3,4,5-테트라하이드로피리딘-2,6-디카복실산(이하, 「THDP」라고도 한다)으로부터, 메소-DAP 합성 경로에 속하는 2,3,4,5-테트라하이드로피리딘-2,6-디카복실산 N-석시닐트랜스퍼라제(이하, 「DapD」라고도 한다. 비특허문헌 1), 석시닐디아미노피멜산 트랜스아미나제(이하, 「DapC」라고도 한다. 비특허문헌 2), 석시닐디아미노피멜산 데석시닐라제(이하, 「DapE」라고도 한다. 비특허문헌 3), 디아미노피멜산 에피머라제(이하, 「DapF」라고도 한다. 비특허문헌 4)와 같은 4개의 효소의 기능에 의해 메소-DAP이 합성되는 것이 알려져 있다. 코리네형 세균에 있어서는, THDP를 전구체로 하는 메소-DAP 합성 경로가 별도로 존재하고, 메소-DAP 탈수소효소(이하, 「디아미노피멜산 데하이드로게나제」또는 「DDH」라고도 한다)를 사용한 1단계의 반응에 의해 THDP로부터 메소-DAP이 합성되는 것이 밝혀져 있으며, DDH 발현이 메소-DAP의 제조에 유용한 것이 알려져 있다(특허문헌 10). 또한, 에스케리키아속 세균의 L-리신 생합성의 율속 단계를 조사하는 과정에서, 메소-DAP 합성 경로에 속하는 효소의 활성을 증강시키는 대신에, 코리네형 세균의 DDH를 암호화하는 유전자를 에스케리키아속의 L-리신 생산균에 도입하여 L-리신 생산을 실시한 것이 개시되어 있다(특허문헌 13). 그러나, 에스케리키아속 세균에 있어서 DDH를 발현시킬 때에, 메소-DAP 합성 경로에 속하는 효소의 활성을 저하시키는 것이, L-리신 생산에 유효한 것은 예상되지 않았다.
특허문헌 1: 일본 공개특허공보 제(평)10-165180호
특허문헌 2: 일본 공개특허공보 제(평)11-192088호
특허문헌 3: 일본 공개특허공보 2000-253879호
특허문헌 4: 일본 공개특허공보 2001-057896호
특허문헌 5: 일본 공개특허공보 2002-17363호
특허문헌 6: 일본 특허공보 제2817400호
특허문헌 7: 일본 국제공개특허공보 2002-508921호
특허문헌 8: 국제공개 제WO03/008600호 팜플렛
특허문헌 9: 미국 특허출원공개공보 제2003/0044943호
특허문헌 10: 일본 공개특허공보 제(소)61-289887호
특허문헌 11: 국제공개 제WO2006/093322호
특허문헌 12: 미국 특허출원공개공보 제2006/0160191호
특허문헌 13: 미국 특허공고 제6040160호
비특허문헌 1: Richaud, C. et al., J. Biol. Chem., 259(23):14824-14828, 1984
비특허문헌 2: Heimberg, H. et al., Gene. 90(1):69-78, 1990
비특허문헌 3: Bouvier, J. et al., J. Bacteriol., 174(16):5265-71, 1992
비특허문헌 4: Wiseman, J. S. et al., J. Biol. Chem., 259(14):8907-14, 1984
본 발명은, L-리신의 생산능이 향상된 에스케리키아 콜라이 및 이를 사용한 L-리신의 제조법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토를 실시한 결과, 에스케리키아 콜라이를, 메소-DAP 합성 경로에 속하는 효소의 활성이 저하되도록 개변하고, 디아미노피멜산 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자를 도입함으로써, L-리신 생산능을 향상시킬 수 있는 것을 밝혀내고, 이 지견에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
(1) L-리신 생산능을 갖는 에스케리키아 콜라이로서, 메소-α,ε-디아미노피멜산 합성 경로의 1 또는 2 이상의 효소의 활성이 저하되도록 개변되고, 디아미노피멜산 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자가 도입된 것을 특징으로 하는 에스케리키아 콜라이.
(2) 상기 메소-α,ε-디아미노피멜산 합성 경로의 효소가, 2,3,4,5-테트라하이드로피리딘-2,6-디카복실산 N-석시닐트랜스퍼라제, 석시닐디아미노피멜산 트랜스아미나제, 석시닐디아미노피멜산 데석시닐라제, 및 디아미노피멜산 에피머라제로부터 선택되는, 상기 에스케리키아 콜라이.
(3) 상기 2,3,4,5-테트라하이드로피리딘-2,6-디카복실산 N-석시닐트랜스퍼라제, 석시닐디아미노피멜산 트랜스아미나제, 석시닐디아미노피멜산 데석시닐라제, 및 디아미노피멜산 에피머라제가, 각각 dapD 유전자, dapC 유전자, dapE 유전자 및 dapF 유전자에 의해 암호화되는, 상기 에스케리키아 콜라이.
(4) 상기 유전자의 발현량을 저하시키거나, 또는 이러한 유전자를 파괴함으로써, 메소-α,ε-디아미노피멜산 합성 경로의 효소의 활성이 저하된, 상기 에스케리키아 콜라이.
(5) 적어도 2,3,4,5-테트라하이드로피리딘-2,6-디카복실산 N-석시닐트랜스퍼라제 활성이 저하되도록 개변된, 상기 에스케리키아 콜라이.
(6) 상기 디아미노피멜산 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자가, 코리네형 세균의 ddh 유전자인, 상기 에스케리키아 콜라이.
(7) 상기 2,3,4,5-테트라하이드로피리딘-2,6-디카복실산 N-석시닐트랜스퍼라제가, 하기 (A) 또는 (B)에 기재한 단백질인 상기 에스케리키아 콜라이.
(A) 서열번호 2에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질.
(B) 서열번호 2에 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 2,3,4,5-테트라하이드로피리딘-2,6-디카복실산 N-석시닐트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질.
(8) 상기 석시닐디아미노피멜산 트랜스아미나제가, 하기 (C) 또는 (D)에 기재된 단백질인 상기 에스케리키아 콜라이.
(C) 서열번호 4에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질.
(D) 서열번호 4에 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 석시닐디아미노피멜산 트랜스아미나제 활성을 갖는 단백질.
(9) 상기 석시닐디아미노피멜산 데석시닐라제가, 하기 (E) 또는 (F)에 기재된 단백질인 상기 에스케리키아 콜라이.
(E) 서열번호 6에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질.
(F) 서열번호 6에 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 석시닐디아미노피멜산 데석시닐라제 활성을 갖는 단백질.
(10) 상기 디아미노피멜산 에피머라제가, 하기 (G) 또는 (H)에 기재된 단백질인 상기 에스케리키아 콜라이.
(G) 서열번호 8에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질.
(H) 서열번호 8에 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 디아미노피멜산 에피머라제 활성을 갖는 단백질.
(11) 상기 dapD 유전자가, 하기 (a) 또는 (b)에 기재된 DNA인, 상기 에스케리키아 콜라이.
(a) 서열번호 1의 염기 서열을 포함하는 DNA, 또는
(b) 서열번호 1의 염기 서열 또는 동 염기 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 2,3,4,5-테트라하이드로피리딘-2,6-디카복실산 N-석시닐트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
(12) 상기 dapC 유전자가, 하기 (c) 또는 (d)에 기재된 DNA인, 상기 에스케리키아 콜라이.
(c) 서열번호 3의 염기 서열을 포함하는 DNA, 또는
(d) 서열번호 3의 염기 서열 또는 동 염기 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 석시닐디아미노피멜산 트랜스아미나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
(13) 상기 dapE 유전자가, 하기 (e) 또는 (f)에 기재된 DNA인, 상기 에스케리키아 콜라이.
(e) 서열번호 5의 염기 서열을 포함하는 DNA, 또는
(f) 서열번호 5의 염기 서열 또는 동 염기 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 석시닐디아미노피멜산 데석시닐라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
(14) 상기 dapF 유전자가, 하기 (g) 또는 (h)에 기재된 DNA인, 상기 에스케리키아 콜라이.
(g) 서열번호 7의 염기 서열을 포함하는 DNA, 또는
(h) 서열번호 7의 염기 서열 또는 동 염기 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 디아미노피멜산 에피머라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
(15) 상기 디아미노피멜산 데하이드로게나제가, 하기 (I) 또는 (J)에 기재된 단백질인 상기 에스케리키아 콜라이.
(I) 서열번호 10, 12, 14, 16, 또는 18에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질.
(J) 서열번호 10, 12, 14, 16, 또는 18에 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 디아미노피멜산 데하이드로게나제 활성을 갖는 단백질.
(16) 상기 ddh 유전자가, 하기 (i) 또는 (j)에 기재된 DNA인, 상기 에스케리키아 콜라이.
(i) 서열번호 9, 11, 13, 15, 또는 17의 염기 서열을 포함하는 DNA, 또는
(j) 서열번호 9, 11, 13, 15, 또는 17의 염기 서열 또는 동 염기 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 디아미노피멜산 데하이드로게나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
(17) 또한, L-리신에 의한 피드백 저해가 해제된 디하이드로디피콜린산 합성 효소, 및 L-리신에 의한 피드백 저해가 해제된 아스파르토키나제를 보유하고, 디하이드로디피콜린산 리덕타제 활성이 증강된, 상기 에스케리키아 콜라이.
(18) 상기 에스케리키아 콜라이를 배지 중에서 배양하고, 당해 배지로부터 L-리신을 채취하는 것을 특징으로 하는, L-리신의 제조법.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
<1> 본 발명의 에스케리키아 콜라이
본 발명의 에스케리키아 콜라이(이하, 「본 발명의 세균」이라고도 한다)는, L-리신 생산능을 갖는 에스케리키아 콜라이로서, 메소-DAP 합성 경로에 속하는 효소의 활성이 저하되도록 개변되고, 디아미노피멜산 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자가 도입된 것을 특징으로 하는, 에스케리키아 콜라이이다.
또한, 본 발명의 바람직한 세균은, 상기 성질에 더하여, 또한 L-리신에 의한 피드백 저해가 해제된 디하이드로디피콜린산 합성 효소, 및 L-리신에 의한 피드백 저해가 해제된 아스파르토키나제를 보유하고, 디하이드로디피콜린산 리덕타제 활성이 증강된 세균이다.
본 발명의 세균은, L-리신 생산능을 갖는 에스케리키아 콜라이를 친주로 하고, 메소-DAP 합성 경로에 속하는 효소의 활성이 저하되도록 개변하고, 또한 디아미노피멜산 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자를 도입함으로써 수득할 수 있다. 메소-DAP 합성 경로에 속하는 효소의 활성을 저하시키는 개변과, 디아미노피멜산 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자의 도입의 순서는 상관없다. 또한, L-리신 생산의 부여는, 상기 개변 및 유전자의 도입 사이에 실시되어도 양호하며, 마지막에 실시되어도 양호하다.
본 발명의 세균을 수득하기 위해 사용하는, 에스케리키아 콜라이의 친주로서는, 특별히 한정되지 않지만, 구체적으로는 나이하르트 외의 저서[참조: Neidhardt, F. C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1029 table 1]에 든 것을 이용할 수 있다. 구체적으로는, 프로토타입의 야생주 K12주 유래의 에스케리키아 콜라이 W3110(ATCC 27325), 에스케리키아 콜라이 MG1655(ATCC 47076) 등을 들 수 있다.
이들을 입수하기 위해서는, 예를 들면 아메리칸 타입 컬처 콜렉션(주소: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America)으로부터 분양을 받을 수 있다. 즉, 각 균주에 대응하는 등록번호가 부여되어 있으며, 이 등록번호를 이용하여 분양을 받을 수 있다. 각 균주에 대응하는 등록번호는, 아메리칸 타입 컬처 콜렉션의 카탈로그에 기재되어 있다.
<1-1> L-리신 생산능의 부여 및 L-리신 생산능을 갖는 에스케리키아 콜라이
에스케리키아 콜라이의 L-리신 생산균의 예로서는, L-리신 유사체에 내성을 갖는 변이주를 들 수 있다. L-리신 유사체는 에스케리키아 콜라이의 생육을 저해하지만, 이 저해는, L-리신이 배지에 공존할 때에는 완전히 또는 부분적으로 해제된다. L-리신 유사체의 예로서는, 옥사리신, 리신하이드록사메이트, S-(2-아미노에틸)-L-시스테인(AEC), γ-메틸리신, α-클로로카프로락탐 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 리신 유사체에 대해 내성을 갖는 변이주는, 에스케리키아 콜라이를 통상의 인공 변이 처리함으로써 수득할 수 있다. L-리신의 생산에 유용한 세균주의 구체예로서는, 이.콜라이 AJ11442(FERM BP-1543, NRRL B-12185; 미국 특허공보 제4,346,170호 참조) 및 이.콜라이 VL611을 들 수 있다. 이들 미생물에서는, 아스파르토키나제의 L-리신에 의한 피드백 저해가 해제되어 있다.
WC196주는, 이.콜라이의 L-리신 생산균으로서 사용할 수 있다. 이 균주는, 이.콜라이 K-12에 유래하는 W3110주에 AEC 내성을 부여함으로써 육종되었다. 동주는, 에스케리키아 콜라이 AJ13069이라고 명명되어, 1994년 12월 6일, 공업기술원 생명공학공업기술연구소(현 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 우편번호 305-8566 일본국 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반치 1 츄오 제6)에 수탁번호 FERM P-14690으로서 기탁되었고, 1995년 9월 29일에 부다페스트 조약에 기초하는 국제기탁으로 이관되어, 수탁번호 FERM BP-5252가 부여되어 있다[참조: 미국 특허공보 제5,827,698호].
L-리신 생산균을 유도하기 위한 친주의 예로서는, L-리신 생합성계 효소를 암호화하는 유전자의 1종 또는 그 이상의 발현이 증대되고 있는 주도 들 수 있다. 이러한 유전자의 예로서는, 디하이드로디피콜린산 신타제(dapA), 아스파르토키나제(lysC), 디하이드로디피콜린산 리덕타제(dapB), 디아미노피멜산 데카르복실라제(lysA), 포스포에놀피루브산 카르복실라제(ppc), 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나제(asd) 및 아스파르타제(aspA)[참조: EP1253195A]를 암호화하는 유전자를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 친주는, 에너지 효율에 관여하는 유전자(cyo)[참조: EP1170376A], 니코틴아미드 뉴클레오타이드 트랜스하이드로게나제를 암호화하는 유전자(pntAB)[참조: 미국 특허공보 제5,830,716호], ybjE 유전자[참조: WO2005/073390], 글루탐산 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자(gdhA)(Gene23:199-209(1983)) 또는, 이들의 조합의 발현 수준이 증대하고 있어도 양호하다. 또한, 괄호안은 그 유전자의 약어이다.
에스케리키아 콜라이의 lysC 유전자의 염기 서열을 서열번호 21에, 암호화되는 아스파르토키나제의 아미노산 서열을 서열번호 22에 나타낸다. 에스케리키아 콜라이의 dapA 유전자의 염기 서열을 서열번호 23에, 암호화되는 디하이드로디피콜린산 신타제의 아미노산 서열을 서열번호 24에 나타낸다. 또한, 에스케리키아 콜라이의 dapB 유전자의 염기 서열을 서열번호 25에, 암호화되는 디하이드로디피콜린산 리덕타제의 아미노산 서열을 서열번호 26에 나타낸다.
에스케리키아 콜라이 유래의 야생형 디하이드로디피콜린산 합성 효소는 L-리신에 의한 피드백 저해를 받는 것이 알려져 있으며, 에스케리키아 콜라이 유래의 야생형 아스파르토키나제는 L-리신에 의한 억제 및 피드백 저해를 받는 것이 알려져 있다. 따라서, dapA 유전자 및 lysC 유전자를 사용하는 경우, 이러한 유전자는, L-리신에 의한 피드백 저해를 받지 않는 변이형 효소를 암호화하는 변이형 유전자인 것이 바람직하다.
L-리신에 의한 피드백 저해를 받지 않는 변이형 디하이드로디피콜린산 합성 효소를 암호화하는 DNA로서는, 서열번호 24의 118 위치의 히스티딘 잔기가 티로신 잔기로 치환된 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 들 수 있다. 또한, L-리신에 의한 피드백 저해를 받지 않는 변이형 아스파르토키나제를 암호화하는 DNA로서는, 서열번호 22의 352 위치의 트레오닌 잔기가 이소류신 잔기로 치환, 323 위치의 글리신 잔기가 아스파라긴 잔기로 치환, 318 위치의 메티오닌이 이소류신으로 치환된 서열을 갖는 AKIII를 암호화하는 DNA를 들 수 있다(이들 변이체에 있어서는 미국 특허공보 제5661012호 및 제6040160호 참조). 변이형 DNA는 PCR 등에 의한 부위 특이적 변이법에 의해 취득할 수 있다.
또한, 상기와 같은 변이를 갖는 에스케리키아 콜라이의 변이형 디하이드로디피콜린산 합성 효소를 암호화하는 변이형 dapA 및 변이형 아스파르토키나제를 암호화하는 변이형 lysC를 포함하는 플라스미드로서, RSF1010 유래의 광숙주역 플라스미드 RSFD80, pCAB1, pCABD2이 알려져 있다[참조: 미국 특허공보 제6040160호]. RSFD80으로 형질전환된 에스케리키아 콜라이 JM109주[참조: 미국 특허공보 제6040160호]은, AJ12396라고 명명되고, 동주는 1993년 10월 28일에 통산성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(현 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 우편번호 305-8566 일본국 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반치 1 츄오 제6)에 수탁번호 FERM P-13936으로서 기탁되고, 1994년 11월 1일에 부다페스트 조약에 기초하는 국제 기탁으로 이관되어, FERM BP-4859의 수탁번호하에서 기탁되어 있다. RSFD80은, AJ12396주로부터 공지의 방법에 의해 취득할 수 있다. pCAB1은, 상기 RSFD80에, 추가로 에스케리키아 콜라이의 dapB 유전자를 삽입함으로써 제작되었다. 또한, pCABD2는, 당해 pCAB1에, 추가로 브레비박테리움 락토퍼멘텀(코리네박테리움 글루타미쿰) 2256주(ATCC13869)의 ddh 유전자를 삽입함으로써 제작되었다[참조: 미국 특허공보 제6040160호].
L-리신 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는, L-리신의 생합성 경로로부터 분기하여 L-리신 이외의 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 활성이 저하 또는 결손되어 있는 주도 들 수 있다. L-리신의 생합성 경로로부터 분기하여 L-리신 이외의 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 예로서는, 호모세린 데하이드로게나제, 리신 데카르복실라제[참조: 미국 특허공보 제5,827,698호], 및, 말산 효소[참조: WO2005/010175]를 들 수 있다. 여기에서, 리신 데카르복실라제 활성을 저하 또는 결손시키기 위해서는, 리신 데카르복실라제를 암호화하는 cadA 유전자와 ldcC 유전자 양자의 발현을 저하시키는 것이 바람직하다[참조: 국제공개 제WO2006/038695호 팜플렛].
본 발명에 사용하는 세균은, 글리세롤의 자화성을 높이기 위해서, glpR 유전자[참조: EP1715056]의 발현이 약화되어 있거나, glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, tpiA, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa 및 talC 유전자 등의 글리세롤 대사 유전자[참조: EP1715055A]의 발현이 강화되어 있어도 양호하다.
<1-2> 본 발명의 에스케리키아 콜라이의 구축
다음에, 메소-DAP 합성 경로에 속하는 효소의 활성을 저하시키는 개변과, 디아미노피멜산 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자의 도입에 관해서 설명한다.
에스케리키아 콜라이가 갖는 메소-DAP 합성 경로란, (S)-2,3,4,5-테트라하이드로피리딘-2,6-디카르복실레이트((S)-2,3,4,5-테트라하이드로디피콜리네이트)로부터, 메소-DAP(메소-2,6-디아미노피말레이트, 메소-α,ε-디아미노피멜레이트, 또는 메소-디아미노헵탄디오에이트)를 생성하는 경로이며, 이하의 4단계의 반응에 의해 촉매된다. 이들의 반응은 가역 반응이다. 에스케리키아 콜라이에서는, 메소-DAP 합성 경로는 DapDCEF 경로라고도 불린다.
1) DapD(2,3,4,5-테트라하이드로피리딘-2,6-디카복실산 N-석시닐트랜스퍼라제)(EC 2.3.1.117)
석시닐-CoA + (S)-2,3,4,5-테트라하이드로피리딘-2,6-디카르복실레이트 + H2O → CoA + N-석시닐-L-2-아미노-6-옥소헵탄디오에이트
DapD는, dapD 유전자가 암호화하고 있다. 에스케리키아 콜라이의 dapD 유전자의 서열을 서열번호 1에, DapD의 아미노산 서열을 서열번호 2에 나타낸다.
DapD의 효소 활성은, S. A, Simms 외의 방법[참조: J. Biol. Chem., 1984, Mar 10; 259(5):2734-2741]을 참고로 측정할 수 있다.
2) DapC(석시닐디아미노피멜산 트랜스아미나제)(SDAP 아미노기 전이효소라고도 한다)(EC 2.6.1.17)
N-석시닐-LL-2,6-디아미노헵탄디오에이트 + 2-옥소글루타레이트 → N-석시닐-L-2-아미노-6-옥소헵탄디오에이트 + L-글루타메이트
DapC는, dapC 유전자가 암호화하고 있다. 에스케리키아 콜라이의 dapC 유전자의 서열을 서열번호 3에, 아미노산 서열을 서열번호 4에 나타낸다.
DapC의 효소 활성은, Thilo, M. 외의 방법[참조: J. Bacteriol., 2000, Jul; 182(13):3626-3631]으로 측정할 수 있다.
3) DapE(석시닐디아미노피멜산 데석시닐라제)(SDAP 탈석시닐화효소라고도 한다)(EC 3.5.1.18)
N-석시닐-LL-2,6-디아미노헵탄디오에이트 + H2O → 석시네이트 + LL-2,6-디아미노헵탄디오에이트
DapE는, dapE 유전자가 암호화하고 있다. 에스케리키아 콜라이의 dapE 유전자의 서열을 서열번호 5에, 아미노산 서열을 서열번호 6에 나타낸다.
DapE의 효소 활성은, Lin, Y. K. 외의 방법[참조: J. Biol. Chem., 1988, Feb 5; 263(4):1622-1627)에 의해 측정할 수 있다.
4) DapF(디아미노피멜산 에피머라제(EC 5.1.1.7)
LL-2,6-디아미노헵탄디오에이트 → 메소-2,6-디아미노피말레이트
DapF는, dapF 유전자가 암호화하고 있다. 에스케리키아 콜라이의, dapF 유전자의 서열을 서열번호 7에, 아미노산 서열을 서열번호 8에 나타낸다.
DapF의 효소 활성은, Wiseman, J. S.외의 방법[참조: J. Biol. Chem., 1984, Jul 25; 259(14):8907-8914]을 참고로 하여 측정할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, DDH(디아미노피멜산 데하이드로게나제) (EC1.4.1.16)은, 메소-2,6-디아미노피말레이트로부터 (S)-2,3,4,5-테트라하이드로피리딘-2,6-디카르복실레이트를 가역적으로 생성하는 효소로, 이하의 반응을 촉매한다.
메소-2,6-디아미노피말레이트 + H2O + NADP+ → (S)-2,3,4,5-테트라하이드로피리딘-2,6-디카르복실레이트 + NH3 + NADPH + H+
DDH의 효소 활성은, Misono, H. 외의 방법[참조: J. Biol. Chem., 255, 10599-10605, 1980]을 참고로 하여 측정할 수 있다.
DDH를 암호화하는 ddh 유전자는, 에스케리키아속 세균은 가지고 있지 않지만, 코리네박테리움 글루타미쿰(서열번호 9), 브레비박테리움 락토퍼멘텀(서열번호 11), 코리네박테리움 에피시엔스(서열번호 13) 등의 코리네형 세균이 가지고 있는 ddh 유전자를 사용할 수 있다.
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 ddh 유전자(NCgl2528)는 Genbank NP-601818.2 GI:23308957에, 코리네박테리움 에피시엔스의 ddh 유전자(CE2498)는, NP-739108.1 GI:25029054에 등록되어 있다.
기타, 코리네형 세균 이외에는, 헤르미니이모나스 아세니콕시단스(Herminiimonas arsenicoxydans)의 ddh 유전자(서열번호 15), 박테로이데스 세타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron)의 ddh 유전자(서열번호 17)를 이용할 수 있다. 헤르미니이모나스 아세니콕시단스의 ddh 유전자는, Genbank YP-001100730.1 GI:134095655에, 박테로이데스 세타이오타오미크론의 ddh 유전자는 NP-810892.1 GI:29347389에 등록되어 있다.
상기 각 유전자, 및 상기의 L-리신 생합성계 효소 유전자는, 상기한 유전자 정보를 갖는 유전자나, 공지의 서열을 갖는 유전자에 한정되지 않고, 암호화되는 단백질의 기능이 손상되지 않는 한, 그 유전자의 동족체나 인위적인 개변체 등, 보존적 변이를 갖는 유전자라도 양호하다. 즉, 공지의 단백질의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수개의 위치에서의 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가 등을 포함하는 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자라도 양호하다.
여기서, 「1 또는 수개」란, 아미노산 잔기의 단백질의 입체 구조에 있어서의 위치나 아미노산 잔기의 종류에 따라서도 다르지만, 구체적으로는 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1 내지 10개, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개를 의미한다. 보존적 변이의 대표적인 것은, 보존적 치환이다. 또한, 보존적 치환이란, 치환 부위가 방향족 아미노산인 경우에는, Phe, Trp, Tyr 간에, 치환 부위가 소수성 아미노산인 경우에는, Leu, Ile, Val 간에, 극성 아미노산인 경우에는, Gln, Asn 간에, 염기성 아미노산인 경우에는, Lys, Arg, His 간에, 산성 아미노산인 경우에는, Asp, Glu 간에, 하이드록실기를 갖는 아미노산인 경우에는, Ser, Thr 간에 서로 치환하는 변이이다. 보존적 치환으로 간주되는 치환으로서는, 구체적으로는, Ala로부터 Ser 또는 Thr로의 치환, Arg로부터 Gln, His 또는 Lys로의 치환, Asn으로부터 Glu, Gln, Lys, His 또는 Asp로의 치환, Asp로부터 Asn, Glu 또는 Gln로의 치환, Cys로부터 Ser 또는 Ala로의 치환, Gln으로부터 Asn, Glu, Lys, His, Asp 또는 Arg로의 치환, Glu로부터 Gly, Asn, Gln, Lys 또는 Asp로의 치환, Gly로부터 Pro로의 치환, His로부터 Asn, Lys, Gln, Arg 또는 Tyr로의 치환, Ile로부터 Leu, Met, Val 또는 Phe로의 치환, Leu에서 Ile, Met, Val 또는 Phe로의 치환, Lys로부터 Asn, Glu, Gln, His 또는 Arg로의 치환, Met로부터 Ile, Leu, Val 또는 Phe로의 치환, Phe로부터 Trp, Tyr, Met, Ile 또는 Leu로의 치환, Ser로부터 Thr 또는 Ala로의 치환, Thr로부터 Ser 또는 Ala로의 치환, Trp로부터 Phe 또는 Tyr로의 치환, Tyr로부터 His, Phe 또는 Trp로의 치환, 및, Val로부터 Met, Ile 또는 Leu로의 치환을 들 수 있다. 또한, 상기와 같은 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가, 또는 역위 등에는, 유전자가 유래하는 미생물의 개체차, 종의 차이에 기초하는 경우 등의 천연적으로 생기는 변이(mutant 또는 variant)에 의해 발생하는 것도 포함된다. 이러한 유전자는, 예를 들면, 부위 특이적 변이법에 의해, 암호화되는 단백질의 특정 부위의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 포함하도록 공지의 유전자의 염기 서열을 개변함으로써 취득할 수 있다.
또한, 상기와 같은 보존적 변이를 갖는 유전자는, 암호화되는 아미노산 서열 전체에 대해, 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 가지며, 야생형 단백질과 동등한 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자라도 양호하다. 한편, 본 명세서에 있어서, 「상동성」(homology)」은, 「동일성」(identity)을 가리키는 경우가 있다.
또한, 유전자의 서열에 있어서의 각각의 코돈은, 유전자가 도입되는 숙주에서 사용하기 쉬운 코돈으로 치환한 것이라도 양호하다.
보존적 변이를 갖는 유전자는, 변이제 처리 등, 통상 변이 처리에 사용되는 방법에 의해 취득된 것이라도 양호하다.
또한, 유전자는, 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면 상기 유전자 서열 또는 이의 상보 서열과 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 공지의 유전자 산물과 동등한 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA라도 양호하다. 여기에서, 「엄격한 조건」이란, 소위 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 일례를 나타내면, 상동성이 높은 DNA끼리, 예를 들면 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 갖는 DNA끼리가 하이브리드화하고, 그것보다 상동성이 낮은 DNA끼리가 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 서던 하이브리드화의 세정 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 더욱 바람직하게는, 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도, 온도에서, 1회, 보다 바람직하게는 2 내지 3회 세정하는 조건을 들 수 있다.
프로브로서는, 유전자의 상보 서열의 일부를 사용할 수도 있다. 이러한 프로브는, 공지의 유전자 서열에 기초하여 제작한 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하고, 이들의 염기 서열을 포함하는 DNA 단편을 주형으로 하는 PCR에 의해 제작할 수 있다. 예를 들면, 프로브로서, 300bp 정도 길이의 DNA 단편을 사용하는 경우에는, 하이브리드화의 세정 조건은, 50℃, 2×SSC, 0.1% SDS를 들 수 있다.
「메소-DAP 합성 경로의 효소 활성이 저하되도록 개변되었다」란, 메소-DAP 합성 경로(이하, 「DapDCEF 경로」라고도 한다)에 속하는 효소, 구체적으로는 DapD, DapC, DapE 및 DapF의 4효소 중 적어도 어느 하나의 활성이 완전히 소실되거나, 또는, 에스케리키아 콜라이의 비개변주, 예를 들면 야생주에 비해 활성이 저하되도록 개변된 것을 의미한다.
활성을 저하시키는 효소는, DapD, DapC, DapE 및 DapF 중 어느 것이라도 양호하며, 또한, 1종 또는 2종 이상이라도 양호하다. DapDCEF 경로의 상류측의 효소의 활성을 저하시키는 것이 바람직하고, 적어도 DapD의 활성이 저하되도록 개변되어 있는 것이 특히 바람직하다.
DapDCEF 경로의 효소 활성이 저하되었다란, 예를 들면, DapDCEF 경로의 각각의 효소 활성이 비개변주, 예를 들면 야생주와 비교하여, 균체당 50% 이하, 바람직하게는 30% 이하, 더욱 바람직하게는 10% 이하로 저하되어 있는 것이 바람직하다.
여기서, 대조가 되는 에스케리키아 콜라이로서는, 예를 들면, 야생주로서, 프로토타입의 야생주 K12주 유래의 에스케리키아 콜라이 W3110(ATCC 27325), 에스케리키아 콜라이 MG1655(ATCC 47076) 등을 들 수 있다.
DapDCEF 경로의 효소 활성이 저하되는 개변은, 구체적으로는, 염색체 위의 DapDCEF 경로의 효소를 암호화하는 유전자, 구체적으로는 dapD, dapC, dapE 또는 dapF 유전자의 암호화 영역의 일부 또는 전부를 결손시키거나, 프로모터나 샤인 달가르노(SD) 서열 등의 발현 조절 서열을 개변하거나 하는 것 등에 의해 달성된다. 또한, 발현 조절 서열 이외의 비번역 영역의 개변에 의해서도, 유전자의 발현량을 저하시킬 수 있다. 또한, 염색체 위의 유전자 전후의 서열을 포함하여 유전자 전체를 결손시켜도 양호하다. 또한, 유전자 재조합에 의해, 염색체 위의 효소를 암호화하는 영역으로 아미노산 치환(미스센스 변이)을 도입하는 것, 또한 종결 코돈을 도입하는 것(난센스 변이), 또는 1 내지 2염기 부가·결실되는 프레임 시프트 변이를 도입함으로써도 달성할 수 있다[참조: Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997) Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839(1991)].
본 발명에 있어서는, 상동 재조합을 이용하여, 염색체 위의 유전자의 발현 조절 서열, 예를 들면 프로모터 영역, 또는 암호화 영역, 또는 비암호화 영역의 일부 또는 전부를 결손시키는 것, 또는 이러한 영역에 다른 서열을 삽입함으로써, 세포내의 효소 활성을 저하시키는 것이 바람직하다. 그러나, DapDCEF 경로의 효소 활성이 저하되는 개변이면, X선 또는 자외선을 조사, 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 등의 변이제에 의한 통상의 변이 처리에 의한 개변이어도 양호하다.
발현 조절 서열의 개변은, 바람직하게는 1염기 이상, 보다 바람직하게는 2염기 이상, 특히 바람직하게는 3염기 이상이다. 또한, 암호화 영역을 결실시키는 경우는, 생산되는 효소 단백질의 기능이 저하 또는 결실되는 것이면, 결실시키는 영역은, N 말단 영역, 내부 영역, C 말단 영역 중 어느 영역이라도 양호하고, 암호화 영역 전체라도 양호하다. 통상적으로 결실시키는 영역은 긴 쪽이 확실하게 유전자를 불활성화될 수 있다. 또한, 결실시키는 영역의 상류와 하류의 리딩 프레임은 일치하지 않는 것이 바람직하다.
암호화 영역에 다른 서열을 삽입하는 경우도, 유전자의 어느 영역이라도 양호하지만, 삽입하는 서열은 긴 쪽이, 확실하게 효소를 암호화하는 유전자를 불활성화할 수 있다. 삽입 부위의 전후의 서열은, 리딩 프레임이 일치하지 않는 것이 바람직하다. 다른 서열로서는, 효소 단백질의 기능을 저하 또는 결손시키는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 항생 물질 내성 유전자나 L-리신 생산에 유용한 유전자를 탑재한 트랜스포존 등을 들 수 있다.
염색체 위의 유전자를 상기와 같이 개변하기 위해서는, 예를 들면, 유전자의 부분 서열을 결실시키고, 정상적으로 기능하는 효소 단백질을 생산하지 않도록 개변한 결실형 유전자를 제작하고, 당해 유전자를 포함하는 DNA로 세균을 형질전환하여 결실형 유전자와 염색체 위의 유전자로 상동 재조합을 일으킴으로써, 염색체 위의 유전자를 결실형 유전자로 치환함으로써 달성할 수 있다. 결실형 유전자에 의해 암호화되는 효소 단백질은 생성되었다고 해도, 야생형 효소 단백질과는 다른 입체 구조를 가지며, 기능이 저하 또는 소실된다. 이러한 상동 재조합을 이용한 유전자 치환에 의한 유전자 파괴는 이미 확립되어 있으며, 「Red 드리븐 인테그레이션(Red-driven integration)」이라고 불리는 방법[참조: Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97:6640-6645(2000)], Red 드리븐 인테그레이션법과 λ파지 유래의 절취 시스템[참조: Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203(2002)]를 조합한 방법[참조: WO2005/010175호] 등의 직쇄상 DNA를 사용하는 방법이나, 온도 감수성 복제 기점을 포함하는 플라스미드, 접합 전달 가능한 플라스미드를 사용하는 방법, 숙주 내에서 복제 기점을 갖지 않는 자살 벡터를 이용하는 방법 등이 있다[참조: 미국 특허공보 제6303383호, 또는 일본 공개특허공보 제(평)05-007491호].
유전자의 전사량이 저하된 것의 확인은, 동유전자로부터 전사되는 mRNA의 양을 야생주, 또는 비개변주와 비교함으로써 실시할 수 있다. mRNA의 양을 평가하는 방법으로서는, 노던 하이브리드화, RT-PCR 등을 들 수 있다[참조: Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor(USA), 2001)].
유전자가 암호화하는 단백질의 양이 저하된 것의 확인은, 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 실시할 수 있다[참조: Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor(USA), 2001)].
에스케리키아 콜라이에 DDH를 암호화하는 유전자(ddh)를 도입하기 위해서는, 예를 들면, ddh 유전자를 플라스미드나 파지 등의 벡터를 사용하여 에스케리키아 콜라이를 형질전환하면 양호하다. 이러한 벡터로서는, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 등을 들 수 있다. DDH 유전자는, 에스케리키아 콜라이에서 발현 가능하면, 동유전자 고유의 프로모터를 사용해도 양호하지만, 에스케리키아 콜라이에서 효율적으로 기능하는 프로모터를 사용해도 양호하다. 이러한 프로모터로서는, lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다파지의 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터 등을 들 수 있다.
또한, ddh 유전자를, 형질도입, 트랜스포존[참조: Berg, D. E. and Berg, C. M., Bio/Technol., 1, 417(1983)), Mu 파지[참조: 일본 공개특허공보 제(평)2-109985호] 또는 상동 재조합[참조: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)]을 사용한 방법으로 에스케리키아 콜라이의 염색체에 편입해도 양호하다. 또한, 염색체 위에 편입된 ddh 유전자를 전이시켜 카피수를 상승시켜도 양호하다.
ddh 유전자가 도입된 것의 확인은, 예를 들면 서던 하이브리드화에 의해 실시할 수 있다. 또한, ddh 유전자가 도입된 에스케리키아 콜라이가 DDH 활성을 갖는 것은, 예를 들면 미소노 하루오, 발효와 공업 45, 964(1987)에 기재된 방법으로 DDH 활성을 측정함으로써 확인할 수 있다. 또한, 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해서도 DDH를 검출할 수 있다.
<2> L-리신의 제조법
본 발명의 L-리신의 제조법은, 본 발명의 세균을 배지에서 배양하여, L-리신을 당해 배지중 또는 균체내에 생성 축적시키고, 당해 배지 또는 균체로부터 L-리신을 채취하는 것을 특징으로 한다.
사용하는 배지는, 미생물을 사용한 L-리신의 발효 생산에 있어서 종래부터 사용되어 온 배지를 사용할 수 있다. 즉, 탄소원, 질소원, 무기 이온 및 필요에 따라 그 밖의 유기 성분을 함유하는 통상의 배지를 사용할 수 있다. 여기에서, 탄소원으로서는, 글루코스, 수크로스, 락토스, 갈락토스, 프룩토스나 전분의 가수분해물 등의 당류, 글리세롤이나 소르비톨 등의 알콜류, 푸마르산, 시트르산, 석신산 등의 유기산류를 사용할 수 있다. 질소원으로서는, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄 등의 무기 암모늄염, 대두 가수분해물 등의 유기 질소, 암모니아 가스, 암모니아수 등을 사용할 수 있다. 유기 미량 영양원으로서는, 비타민 B1, L-호모세린 등의 요구 물질 또는 효모 추출물 등을 적량 함유시키는 것이 바람직하다. 이들 이외에, 필요에 따라서, 인산칼륨, 황산마그네슘, 철 이온, 망간 이온 등이 소량 첨가된다. 또한, 본 발명에서 사용하는 배지는, 탄소원, 질소원, 무기 이온 및 필요에 따라서 그 밖의 유기 미량 성분을 포함하는 배지이면, 천연 배지, 합성 배지 중 어느 것이라도 양호하다.
특히 본 발명에 있어서는 글리세롤을 탄소원으로서 사용하는 것이 바람직하다. 글리세롤은, 시약인 글리세롤이라도 양호하지만, 공업적으로 생산되는 불순물을 포함하는 글리세롤을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 바이오디젤 연료생산을 위한 에스테르화 반응에 의해, 공업적으로 생산되는 글리세롤을 사용하는 것이 바람직하다[참조: Mu Y, et al, Biotechnol Lett., 28, 1755-91759 (2006), Haas MJ, et al; Bioresour Technol. 97, 4, 671-8678(2006)].
본 발명의 배지에 포함되는 글리세롤은, 단독의 탄소원이라도 양호하고, 글리세롤에 더하여, 다른 탄소원을 첨가한 혼합 배지를 사용해도 양호하다. 다른 탄소원으로서 바람직한 것은, 글루코스, 프룩토스, 수크로스, 락토스, 갈락토스, 폐당밀, 전분 가수분해물이나 비이오매스의 가수분해에 의해 수득된 당액 등의 당류, 에탄올 등의 알콜류, 푸마르산, 시트르산, 석신산 등의 유기산류이다. 혼합 배지를 사용하는 경우, 배지 중의 전체 탄소원에 대한 글리세롤의 비율은 50% 이상, 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상인 것이 바람직하다.
배양은 호기적 조건하에서 1 내지 7일간 실시하는 것이 양호하며, 배양 온도는 24 내지 37℃, 배양 중의 pH는 5 내지 9가 양호하다. 한편, pH 조정에는 무기 또는 유기의 산성 또는 알칼리성 물질, 또한 암모니아 가스 등을 사용할 수 있다. 발효액으로부터의 L-리신의 회수는 통상 이온 교환 수지법, 침전법 기타 공지의 방법을 조합함으로써 실시할 수 있다. 또한, 균체 내에 L-리신이 축적되는 경우에는, 예를 들면 균체를 초음파 등에 의해 파쇄하고, 원심분리에 의해 균체를 제거하여 수득되는 상청으로부터 이온 교환 수지법 등에 의해, L-리신을 회수할 수 있다.
또한, 배양 중의 pH가 6.5 내지 9.0, 배양 종료시의 배지의 pH가 7.2 내지 9.0이 되도록 제어하고, 발효중의 발효조내 압력이 양이 되도록 제어하거나, 또는, 탄산 가스 또는 탄산 가스를 포함하는 혼합 가스를 배지에 공급하여, 배지 중의 중탄산 이온 및/또는 탄산 이온이 적어도 2g/L 이상 존재하는 배양기가 있도록 하여, 상기 중탄산 이온 및/또는 탄산 이온을 염기성 아미노산을 주로 하는 양이온의 카운터 이온으로 하는 방법으로 발효를 실시하여, 리신을 회수하는 방법으로 제조를 실시해도 양호하다[참조: 일본 공개특허공보 2002-065287호, 미국 특허출원공개공보 제2002025564호].
〔실시예〕
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
〔실시예 1〕dapD가 파괴된 L-리신 생산균의 구축
<1-1> dapD 유전자 파괴주의 구축
우선, 에스케리키아 콜라이 야생형주 MG1655주를 사용하여, dapD 파괴주의 구축을 실시하였다.
pMW118(λattL-Kmr-λattR)[참조: 국제공개 제WO2006093322호] 플라스미드를 주형으로 하고, λ파지의 부착 부위의 서열 attL과 attR의 양 말단에 대응하는 서열을 프라이머의 3' 말단에, 목적 유전자인 dapD 유전자의 일부에 대응하는 프라이머의 5' 말단에 갖는 서열번호 19 및 20에 나타내는 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머에 사용하여 PCR을 실시하고, 미국 특허출원공개공보 제2006/0160191호 및 WO2005/010175에 기재된 λ-red법을 사용하여 MG1655ΔdapD::att-Km주를 구축하였다. λ-red법에 있어서의 Km 내성 재조합체의 취득은, 37℃에서 Km(카나마이신)(50mg/L)을 포함하는 L-한천 배지 위에서 평판 배양하고, Km 내성 재조합체를 선택함으로써 실시하였다.
<1-2> ΔdapD::att-kan의 L-리신 생산균 WC196LC/pCABD2주로의 형질도입
<1-1>에서 수득된 MG1655ΔdapD::att-Km주로부터, 통상적인 방법에 따라 P1 용해물을 취득하고, 미국 특허출원공개공보 제2006/0160191호에 기재된 방법으로 구축한 L-리신 생산균 WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2주를 숙주로 하여 P1 형질도입법을 사용하여 WC196ΔcadAΔldcCΔdapD::att-Km/pCABD2주를 구축하였다. WC196ΔcadAΔldc주는, 에스케리키아 콜라이 WC196의 리신 데카르복실라제 유전자 cadA 및 ldc를, Red-드리븐 인테그레이션법[참조: Datsenko, K. A. and Wanner, B. L., 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645]과 λ 파지 유래의 절취 시스템[참조: Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203(2002)]를 조합한 방법[참조: WO2005/010175호]에 의해 파괴한 주이다. 당해 주에, pCABD2를 도입한 것이 WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2이다.
목적의 형질도입주는, 37℃에서 Km(카나마이신)(50mg/L)과 Sm(스트렙토마이신)(20mg/L)을 포함하는 L-한천 배지 위에서 평판 배양하고, Km 내성, Sm 내성 재조합체를 선택함으로써 취득하였다.
또한, 이들 주를 20mg/L의 스트렙토마이신을 포함하는 L 배지에서 최종 OD600≒0.6이 되도록 37℃에서 배양한 후, 배양액과 등량의 40% 글리세롤 용액을 가하여 교반한 후, 적당량씩 분주하여 -80℃로 보존하였다. 이것을 글리세롤 스톡이라고 부른다.
〔실시예 2〕dapD가 파괴된 L-리신 생산균의 L-리신 생산능의 평가
실시예 1에서 수득된 주의 글리세롤 스톡을 융해하고, 100μL를, 20mg/L의 스트렙토마이신을 포함하는 L 플레이트에 균일하게 도포하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 수득된 플레이트의 약 1/8양의 균체를, 0.5mL의 생리식염수에 현탁하고, 분광 광도계 U-2000[히타치 제조]로 파장 600nm의 탁도를 측정하였다. 수득된 균을 포함하는 현탁액을, 500mL 판구 플라스크의, 20mg/L의 스트렙토마이신을 포함하는 발효 배지(MS 배지. 조성은 하기에 나타낸다) 20mL에, 파장 600nm의 탁도가 0.15가 되는 액량을 접종하고, 왕복 진탕 배양 장치로 교반 속도 114rpm, 온도 37℃에 있어서 약 24시간 동안 배양하였다. 배양후, 배지 중에 축적된 L-리신의 양, 및 잔존하고 있는 글루코스를 바이오텍 애널라이저 AS210[사쿠라 세이키 제조]을 사용하여 측정하였다. 또한, 배지 중에 축적되어 있는 글리세롤을 바이오텍 애널라이저 BF-5[오우시케이소쿠키키 제조]로 측정하였다.
〔발효 배지 조성, g/L〕
글루코스 또는 글리세롤 40
(NH4)2SO4 24
K2HPO4 11.0
MgSO4·7H2O 1.0
FeSO4·7H2O 0.01
MnSO4·5H2O 0.01
효모 추출물 2.0
KOH로 pH 7.0으로 조정하고, 115℃에서 10분 동안 오토클레이브(단, 글루코스 또는 글리세롤, 및 MgSO4·7H2O는 별도 살균) 후, 약전 CaCO3 30g/L(180℃에서 2시간 동안 건열 멸균한 것)을 넣는다. 20mg/L의 스트렙토마이신을 첨가하였다.
결과를 표 1에 기재한다(OD는 흡광도 660nm으로 26배 희석하여 측정하여 수득된 균체량, Lys(g/L)은 플라스크에 축적된 L-리신 축적량, 글루코스(g/L), 글리세롤(g/L)은 배지 중에 잔존한 글루코스, 글리세롤의 양, 수율(%)은 기질로부터의 L-리신 수율을 나타낸다). 표 1로부터 알 수 있는 바와 같이, WC196ΔcadAΔldcCΔdapD::att-Km/pCABD2주는, dapD 유전자를 결손하고 있지 않은 WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2주와 비교하여 다량의 L-리신을 축적하였다.
Figure pct00001
〔서열 표의 설명〕
서열번호 1: 이.콜라이 dapD의 염기 서열
서열번호 2: 이.콜라이 DapD의 아미노산 서열
서열번호 3: 이.콜라이 dapC의 염기 서열
서열번호 4: 이.콜라이 DapC의 아미노산 서열
서열번호 5: 이.콜라이 dapE의 염기 서열
서열번호 6: 이.콜라이 DapE의 아미노산 서열
서열번호 7: 이.콜라이 dapF의 염기 서열
서열번호 8: 이.콜라이 DapF의 아미노산 서열
서열번호 9: 씨.글루타미쿰의 ddh 유전자의 염기 서열
서열번호 10: 씨.글루타미쿰의 DDH의 아미노산 서열
서열번호 11: 비.락토퍼멘텀의 ddh 유전자의 염기 서열
서열번호 12: 비.락토퍼멘텀의 DDH의 아미노산 서열
서열번호 13: 씨.에피시엔스의 ddh 유전자의 염기 서열
서열번호 14: 씨.에피시엔스의 DDH의 아미노산 서열
서열번호 15: 에이치.아세니콕시단스의 ddh 유전자의 염기 서열
서열번호 16: 에이치.아세니콕시단스의 DDH의 아미노산 서열
서열번호 17: 비.세타이오타오미크론의 ddh 유전자의 염기 서열
서열번호 18: 비.세타이오타오미크론의 DDH의 아미노산 서열
서열번호 19: dapD 유전자 결실용 프라이머
서열번호 20: dapD 유전자 결실용 프라이머
서열번호 21: 이.콜라이 lysC의 염기 서열
서열번호 22: 이.콜라이 LysC의 아미노산 서열
서열번호 23: 이.콜라이 dapA의 염기 서열
서열번호 24: 이.콜라이 DapA의 아미노산 서열
서열번호 25: 이.콜라이 dapB의 염기 서열
서열번호 26: 이.콜라이 DapB의 아미노산 서열
본 발명에 의하면, 에스케리키아 콜라이를 사용한 발효법에 의한 L-리신의 제조에 있어서, L-리신의 생산량 및/또는 발효 수율을 향상시킬 수 있다. 또한, 본 발명은, 에스케리키아 콜라이의 L-리신 생산균의 육종에 이용할 수 있다.
통상산업성공업기술원생명공학공업기술연구소 FERMBP-4859(수탁일자19931028) 통상산업성공업기술원생명공학공업기술연구소 FERMBP-5252(수탁일자19941206)
<110> Ajinomoto Co., Inc. <120> Method for production of L-lysine <130> C919-C8129 <150> JP 2007-190795 <151> 2007-07-23 <160> 26 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 825 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(825) <400> 1 atg cag cag tta cag aac att att gaa acc gct ttt gaa cgc cgt gcc 48 Met Gln Gln Leu Gln Asn Ile Ile Glu Thr Ala Phe Glu Arg Arg Ala 1 5 10 15 gag atc acg cca gcc aat gca gac acc gtt acc cgc gaa gcg gta aat 96 Glu Ile Thr Pro Ala Asn Ala Asp Thr Val Thr Arg Glu Ala Val Asn 20 25 30 cag gtg atc gcc ctg ctg gat tcc ggc gca ctg cgt gta gcg gaa aaa 144 Gln Val Ile Ala Leu Leu Asp Ser Gly Ala Leu Arg Val Ala Glu Lys 35 40 45 att gac ggt cag tgg gtg acg cat cag tgg ttg aaa aaa gcg gtg ctg 192 Ile Asp Gly Gln Trp Val Thr His Gln Trp Leu Lys Lys Ala Val Leu 50 55 60 ctc tct ttc cgt att aat gat aat cag gtg atc gaa ggg gca gaa agc 240 Leu Ser Phe Arg Ile Asn Asp Asn Gln Val Ile Glu Gly Ala Glu Ser 65 70 75 80 cgc tac ttc gac aaa gtg ccg atg aaa ttc gcc gac 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Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu 195 200 205 gcg gag gct tta cac gca tct cgt gtt gat atc tgg acc gac gtc ccg 672 Ala Glu Ala Leu His Ala Ser Arg Val Asp Ile Trp Thr Asp Val Pro 210 215 220 ggc atc tac acc acc gat cca cgc gta gtt tcc gca gca aaa cgc att 720 Gly Ile Tyr Thr Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg Ile 225 230 235 240 gat gaa atc gcg ttt gcc gaa gcg gca gag atg gca act ttt ggt gca 768 Asp Glu Ile Ala Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala 245 250 255 aaa gta ctg cat ccg gca acg ttg cta ccc gca gta cgc agc gat atc 816 Lys Val Leu His Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp Ile 260 265 270 ccg gtc ttt gtc ggc tcc agc aaa gac cca cgc gca ggt ggt acg ctg 864 Pro Val Phe Val Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu 275 280 285 gtg tgc aat aaa act gaa aat ccg ccg ctg ttc cgc gct ctg gcg ctt 912 Val Cys Asn Lys Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu 290 295 300 cgt cgc aat cag act ctg ctc act ttg cac agc ctg aat atg ctg cat 960 Arg Arg Asn Gln Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Met Leu His 305 310 315 320 tct cgc ggt ttc ctc gcg gaa gtt ttc ggc atc ctc gcg cgg cat aat 1008 Ser Arg Gly Phe Leu Ala Glu Val Phe Gly Ile Leu Ala Arg His Asn 325 330 335 att tcg gta gac tta atc acc acg tca gaa gtg agc gtg gca tta acc 1056 Ile Ser Val Asp Leu Ile Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Ala Leu Thr 340 345 350 ctt gat acc acc ggt tca acc tcc act ggc gat acg ttg ctg acg caa 1104 Leu Asp Thr Thr Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gln 355 360 365 tct ctg ctg atg gag ctt tcc gca ctg tgt cgg gtg gag gtg gaa gaa 1152 Ser Leu Leu Met Glu Leu Ser Ala Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu 370 375 380 ggt ctg gcg ctg gtc gcg ttg att ggc aat gac ctg tca aaa gcc tgc 1200 Gly Leu Ala Leu Val Ala Leu Ile Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys 385 390 395 400 ggc gtt ggc aaa gag gta ttc ggc gta ctg gaa ccg ttc aac att cgc 1248 Gly Val Gly Lys Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn Ile Arg 405 410 415 atg att tgt tat ggc gca tcc agc cat aac ctg tgc ttc ctg gtg ccc 1296 Met Ile Cys Tyr Gly Ala Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro 420 425 430 ggc gaa gat gcc gag cag gtg gtg caa aaa ctg cat agt aat ttg ttt 1344 Gly Glu Asp Ala Glu Gln Val Val Gln Lys Leu His Ser Asn Leu Phe 435 440 445 gag taa 1350 Glu <210> 22 <211> 449 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 22 Met Ser Glu Ile Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp 1 5 10 15 Phe Asp Ala Met Asn Arg Ser Ala Asp Ile Val Leu Ser Asp Ala Asn 20 25 30 Val Arg Leu Val Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly Ile Thr Asn Leu Leu 35 40 45 Val Ala Leu Ala Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu 50 55 60 Asp Ala Ile Arg Asn Ile Gln Phe Ala Ile Leu Glu Arg Leu Arg Tyr 65 70 75 80 Pro Asn Val Ile Arg Glu Glu Ile Glu Arg Leu Leu Glu Asn Ile Thr 85 90 95 Val Leu Ala Glu Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp 100 105 110 Glu Leu Val Ser His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu 115 120 125 Ile Leu Arg Glu Arg Asp Val Gln Ala Gln Trp Phe Asp Val Arg Lys 130 135 140 Val Met Arg Thr Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp Ile Ala 145 150 155 160 Ala Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Gln Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu 165 170 175 Gly Leu Val Ile Thr Gln Gly Phe Ile Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg 180 185 190 Thr Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu 195 200 205 Ala Glu Ala Leu His Ala Ser Arg Val Asp Ile Trp Thr Asp Val Pro 210 215 220 Gly Ile Tyr Thr Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg Ile 225 230 235 240 Asp Glu Ile Ala Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala 245 250 255 Lys Val Leu His Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp Ile 260 265 270 Pro Val Phe Val Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu 275 280 285 Val Cys Asn Lys Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu 290 295 300 Arg Arg Asn Gln Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Met Leu His 305 310 315 320 Ser Arg Gly Phe Leu Ala Glu Val Phe Gly Ile Leu Ala Arg His Asn 325 330 335 Ile Ser Val Asp Leu Ile Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Ala Leu Thr 340 345 350 Leu Asp Thr Thr Gly Ser Thr Ser 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Arg Val Asn Gln Ile Lys Glu Leu 165 170 175 Val Ser Asp Asp Phe Val Leu Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu 180 185 190 Asp Phe Met Gln Leu Gly Gly His Gly Val Ile Ser Val Thr Ala Asn 195 200 205 Val Ala Ala Arg Asp Met Ala Gln Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Gly 210 215 220 His Phe Ala Glu Ala Arg Val Ile Asn Gln Arg Leu Met Pro Leu His 225 230 235 240 Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro Asn Pro Ile Pro Val Lys Trp Ala Cys 245 250 255 Lys Glu Leu Gly Leu Val Ala Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr 260 265 270 Pro Ile Thr Asp Ser Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Lys His 275 280 285 Ala Gly Leu Leu 290 <210> 25 <211> 822 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(822) <400> 25 atg cat gat gca aac atc cgc gtt gcc atc gcg gga gcc ggg ggg cgt 48 Met His Asp Ala Asn Ile Arg Val Ala Ile Ala Gly Ala Gly Gly Arg 1 5 10 15 atg ggc cgc cag ttg att cag gcg gcg ctg gca tta gag ggc gtg cag 96 Met Gly Arg Gln Leu Ile Gln Ala Ala Leu Ala Leu Glu Gly Val Gln 20 25 30 ttg ggc gct gcg ctg gag cgt gaa gga tct tct tta ctg ggc agc gac 144 Leu Gly Ala Ala Leu Glu Arg Glu Gly Ser Ser Leu Leu Gly Ser Asp 35 40 45 gcc ggt gag ctg gcc gga gcc ggg aaa aca ggc gtt acc gtg caa agc 192 Ala Gly Glu Leu Ala Gly Ala Gly Lys Thr Gly Val Thr Val Gln Ser 50 55 60 agc ctc gat gcg gta aaa gat gat ttt gat gtg ttt atc gat ttt acc 240 Ser Leu Asp Ala Val Lys Asp Asp Phe Asp Val Phe Ile Asp Phe Thr 65 70 75 80 cgt ccg gaa ggt acg ctg aac cat ctc gct ttt tgt cgc cag cat ggc 288 Arg Pro Glu Gly Thr Leu Asn His Leu Ala Phe Cys Arg Gln His Gly 85 90 95 aaa ggg atg gtg atc ggc act acg ggg ttt gac gaa gcc ggt aaa caa 336 Lys Gly Met Val Ile Gly Thr Thr Gly Phe Asp Glu Ala Gly Lys Gln 100 105 110 gca att cgt gac gcc gct gcc gat att gcg att gtc ttt gct gcc aat 384 Ala Ile Arg Asp Ala Ala Ala Asp Ile Ala Ile Val Phe Ala Ala Asn 115 120 125 ttt agc gtt ggc gtt aac gtc atg ctt aag ctg ctg gag aaa gca gcc 432 Phe Ser Val Gly Val Asn Val Met Leu Lys Leu Leu Glu Lys Ala Ala 130 135 140 aaa gtg atg ggt gac tac 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Claims (18)

  1. L-리신 생산능을 갖는 에스케리키아 콜라이로서, 메소-α,ε-디아미노피멜산 합성 경로의 1 또는 2 이상의 효소의 활성이 저하되도록 개변되고, 디아미노피멜산 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자가 도입된 것을 특징으로 하는 에스케리키아 콜라이.
  2. 제1항에 있어서, 상기 메소-α,ε-디아미노피멜산 합성 경로의 효소가, 2,3,4,5-테트라하이드로피리딘-2,6-디카복실산 N-석시닐트랜스퍼라제, 석시닐디아미노피멜산 트랜스아미나제, 석시닐디아미노피멜산 데석시닐라제, 및 디아미노피멜산 에피머라제로부터 선택되는, 에스케리키아 콜라이.
  3. 제2항에 있어서, 상기 2,3,4,5-테트라하이드로피리딘-2,6-디카복실산 N-석시닐트랜스퍼라제, 석시닐디아미노피멜산 트랜스아미나제, 석시닐디아미노피멜산 데석시닐라제, 및 디아미노피멜산 에피머라제가, 각각 dapD 유전자, dapC 유전자, dapE 유전자 및 dapF 유전자에 의해 암호화되는, 에스케리키아 콜라이.
  4. 제3항에 있어서, 상기 유전자의 발현량을 저하시키거나, 또는 이들의 유전자를 파괴함으로써, 메소-α,ε-디아미노피멜산 합성 경로의 효소의 활성이 저하된, 에스케리키아 콜라이.
  5. 제2항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 적어도 2,3,4,5-테트라하이드로피리딘-2,6-디카복실산 N-석시닐트랜스퍼라제 활성이 저하되도록 개변된, 에스케리키아 콜라이.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 디아미노피멜산 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자가, 코리네형 세균의 ddh 유전자인, 에스케리키아 콜라이.
  7. 제2항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 2,3,4,5-테트라하이드로피리딘-2,6-디카복실산 N-석시닐트랜스퍼라제가, 하기 (A) 또는 (B)에 기재된 단백질인 에스케리키아 콜라이.
    (A) 서열번호 2에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질.
    (B) 서열번호 2에 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 2,3,4,5-테트라하이드로피리딘-2,6-디카복실산 N-석시닐트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질.
  8. 제2항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 석시닐디아미노피멜산 트랜스아미나제가, 하기 (C) 또는 (D)에 기재된 단백질인 에스케리키아 콜라이.
    (C) 서열번호 4에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질.
    (D) 서열번호 4에 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 석시닐디아미노피멜산 트랜스아미나제 활성을 갖는 단백질.
  9. 제2항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 석시닐디아미노피멜산 데석시닐라제가, 하기 (E) 또는 (F)에 기재된 단백질인 에스케리키아 콜라이.
    (E) 서열번호 6에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질.
    (F) 서열번호 6에 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 석시닐디아미노피멜산 데석시닐라제 활성을 갖는 단백질.
  10. 제2항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 디아미노피멜산 에피머라제가, 하기 (G) 또는 (H)에 기재된 단백질인 에스케리키아 콜라이.
    (G) 서열번호 8에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질.
    (H) 서열번호 8에 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 디아미노피멜산 에피머라제 활성을 갖는 단백질.
  11. 제3항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 dapD 유전자가, 하기 (a) 또는 (b)에 기재된 DNA인, 에스케리키아 콜라이.
    (a) 서열번호 1의 염기 서열을 포함하는 DNA, 또는
    (b) 서열번호 1의 염기 서열 또는 동 염기 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 2,3,4,5-테트라하이드로피리딘-2,6-디카복실산 N-석시닐트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
  12. 제3항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 dapC 유전자가, 하기 (c) 또는 (d)에 기재된 DNA인, 에스케리키아 콜라이.
    (c) 서열번호 3의 염기 서열을 포함하는 DNA, 또는
    (d) 서열번호 3의 염기 서열 또는 동 염기 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 석시닐디아미노피멜산 트랜스아미나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
  13. 제3항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 dapE 유전자가, 하기 (e) 또는 (f)에 기재된 DNA인, 에스케리키아 콜라이.
    (e) 서열번호 5의 염기 서열을 포함하는 DNA, 또는
    (f) 서열번호 5의 염기 서열 또는 동 염기 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 석시닐디아미노피멜산 데석시닐라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
  14. 제3항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 dapF 유전자가, 하기 (g) 또는 (h)에 기재된 DNA인, 에스케리키아 콜라이.
    (g) 서열번호 7의 염기 서열을 포함하는 DNA, 또는
    (h) 서열번호 7의 염기 서열 또는 동 염기 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 디아미노피멜산 에피머라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
  15. 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 디아미노피멜산 데하이드로게나제가, 하기 (I) 또는 (J)에 기재된 단백질인 에스케리키아 콜라이.
    (I) 서열번호 10, 12, 14, 16, 또는 18에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질.
    (J) 서열번호 10, 12, 14, 16, 또는 18에 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 디아미노피멜산 데하이드로게나제 활성을 갖는 단백질.
  16. 제6항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 ddh 유전자가, 하기 (i) 또는 (j)에 기재된 DNA인, 에스케리키아 콜라이.
    (i) 서열번호 9, 11, 13, 15, 또는 17의 염기 서열을 포함하는 DNA, 또는
    (j) 서열번호 9, 11, 13, 15, 또는 17의 염기 서열 또는 동 염기 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 디아미노피멜산 데하이드로게나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
  17. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 또한, L-리신에 의한 피드백 저해가 해제된 디하이드로디피콜린산 합성 효소, 및 L-리신에 의한 피드백 저해가 해제된 아스파르토키나제를 보유하고, 디하이드로디피콜린산 리덕타제 활성이 증강된, 에스케리키아 콜라이.
  18. 제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 따르는 에스케리키아 콜라이를 배지 중에서 배양하고, 당해 배지로부터 L-리신을 채취하는 것을 특징으로 하는, L-리신의 제조법.
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