RU2518677C2 - Способ получения l-аминокислоты - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биохимии и представляет собой способ получения L-аминокислоты - L-лизина, L-треонина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-метионина или L-изолейцина - предусматривающий культивирование бактерии Escherichia coli в среде для получения и накопления L-аминокислоты и сбор L-аминокислоты. Бактерию модифицируют таким образом, чтобы повысить экспрессию ее гена gltP или гена gltS. Изобретение позволяет повысить выход целевой L-аминокислоты. 11 з.п. ф-лы, 5 табл., 5 пр.

Description

Область техники изобретения

Настоящее изобретение относится к способу получения L-аминокислоты с использованием бактерии. В промышленном отношении L-аминокислоты полезны в качестве кормовых добавок, компонентов лечебного питания, аминокислотных инфузионных форм и т.д.

Уровень техники

Способы получения путем ферментации с использованием микроорганизма целевого вещества, такого как L-аминокислота, включают в себя способы с использованием микроорганизма дикого типа (штамм дикого типа), способы с использованием полученного из штамма дикого типа ауксотрофного штамма, способы с использованием в качестве штамма, устойчивого к различным лекарственным препаратам, мутантного по регуляции метаболизма штамма, который получен из штамма дикого типа, способы с использованием штамма со свойствами и ауксотрофного штамма и штамма, мутантного по регуляции метаболизма и т.д.

В последние годы для получения целевых веществ путем ферментации применяют технологии рекомбинантных ДНК. Например, L-аминокислотную продуктивность микроорганизма улучшают путем увеличения экспрессии гена, кодирующего фермент биосинтеза L-аминокислот (патентные документы 1 и 2), или путем увеличения захвата источника углерода в систему биосинтеза L-аминокислоты (патентный документ 3).

Таким образом, в настоящем изобретении раскрыт способ использования ионов карбоната и ионов бикарбоната в качестве противоанионов основной аминокислоты, в целях замещения части ионов сульфата или ионов хлорида, для получения основной аминокислоты путем ферментации. В указанных ссылках в качестве способа добавления в среду ионов карбоната и ионов бикарбоната описан способ регуляции и поддержания положительного внутреннего давления в ферментационном чане во время ферментации, или введение в среду углекислого газа или смешанного газа, содержащего углекислый газ (патентные документы 4 и 5).

Недостатком общепринятой аминокислотной ферментации L-аминокислот семейства аспарагиновой кислоты, таких как L-лизин, является проблема побочной продукции L-глутаминовой кислоты, и в частности, в условиях высокого уровня pH такое описанное выше ферментативное производство страдает проблемой особенно значительной продукции L-глутаминовой кислоты. Поскольку во многих случаях после ферментативного получения в ходе L-аминокислотного производства требуется очистка L-аминокислоты до высокой степени чистоты, является нежелательным присутствие побочных продуктов, которое может вызывать проблемы усложнения способа очистки и уменьшения чистоты продукта.

В настоящее время известно, что белки GltP, GltS (непатентные документы 1 и 2), GadC (непатентный документ 3) и GltIJKL, обнаруженные в энтеробактериях, например Escherichia coli, вовлечены в захват Gluтаминовой кислоты.

Известно, что повышение продуктивности L-лизина, L-треонина и L-триптофана у штамма, который модифицировали таким образом, чтобы увеличить активность Gluтаматдекарбоксилазы, происходит путем увеличения антипортерной активности Gluтамата/ГАМК (гамма-аминомасляной кислоты (патентный документ 6). Вместе с тем, отсутствуют сообщения о получении L-аминокислоты с использованием микроорганизма, в котором амплифицированы ген gltP или ген gltS.

Ссылки предшествующего уровня техники

Патентные документы

Патентный документ 1: патент США № 5168056.

Патентный документ 2: патент США № 5776736.

Патентный документ 3: патент США № 5906925.

Патентный документ 4: опубликованная патентная заявка № 2002/0025564.

Патентный документ 5: международная патентная публикация WO 2006/038695.

Патентный документ 6: международная патентная публикация WO 2008/044453.

Непатентные документы

Непатентный документ 1: J. Bacteriol., 1992 Apr; 174 (7):2391-3.

Непатентный документ 2: J. Biol. Chem., 1990 Dec; 15; 265 (35):21704-8.

Непатентный документ 3: J. Bacteriol., 2006 Dec; 188 (23):8118-27.

Сущность изобретения

Задача, достигаемая изобретением

Задача по настоящему изобретению состоит в получении микроорганизма, принадлежащего семейству Enterobacteriaceae, который способен уменьшить продукцию L-глутаминовой кислоты как побочного продукта при производстве аминокислоты, выбираемой из L-лизина, L-треонина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-метионина, L-аланина, L-изолейцина и L-гомосерина, и в предоставлении способа получения L-аминокислоты, описание которой приведено выше, посредством использования микроорганизма, описанного выше, который способен уменьшить продукцию L-глутаминовой кислоты в качестве побочного продукта при получении аминокислоты.

Способы решения задач

Авторы по настоящему изобретению провели ряд исследований для решения вышеупомянутой задачи, и в результате выявили, что можно уменьшить количество L-глутаминовой кислоты, получаемой при ферментативном производстве L-аминокислот, путем модификации бактерии, которая увеличивает экспрессию gltP или/и gltS, и таким образом, достигли осуществления по настоящему изобретению.

Таким образом, настоящее изобретение относится к следующим аспектам:

(1) Способ получения L-аминокислоты, предусматривающий культивирование бактерии, принадлежащей семейству Enterobacteriaceae и способной продуцировать L-аминокислоту в среде, который включает продукцию и накопление L-аминокислоты в среде, и сбор L-аминокислоты из среды, где указанная бактерия была модифицирована так, чтобы увеличить экспрессию гена gltP и/или гена gltS, при этом L-аминокислоту выбирают из группы, состоящей из L-лизина, L-треонина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-метионина, L-аланина, L-изолейцина и L-гомосерина.

(2) Способ, описанный выше, в котором ген gltP кодирует белок, показанный ниже в абзацах (A) или (B):

(A) белок с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID No: 12,

(B) белок с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID No: 12, который включает в себя замены, делеции, вставки, добавления или инверсии одного или нескольких аминокислотных остатков и обладает активностью L-глутаматного транспортера.

(3) Способ, описанный выше, в котором ген gltP кодирует белок, показанный ниже в абзацах (A1) или (B1):

(A1) белок с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID No: 2,

(B1) белок с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID No: 2, включающий в себя замены, делеции, вставки, добавления или инверсии одного или нескольких аминокислотных остатков и обладающий активностью L-глутаматного транспортера.

(4) Способ, описанный выше, в котором ген gltP представляет собой ДНК, показанную в следующих абзацах(a) или (b):

(a) ДНК с нуклеотидной последовательность, показанной в SEQ ID No: 1,

(b) ДНК, способную к гибридизации с последовательностью, которая комплиментарна нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID No: 1, или зондом, который можно изготовить из нуклеотидной последовательности при жестких условиях, и которая кодирует белок, обладающий активностью L-глутаматного транспортера.

(5) Способ, описанный выше, в котором ген gltS кодирует белок, показанный в следующих абзацах (C) или (D):

(C) белок с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID No: 13 и обладающий активностью L-глутаматного транспортера,

(D) белок с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID No: 13, включающий в себя замены, делеции, вставки, добавления или инверсии одного или нескольких аминокислотных остатков и обладающий активностью L-глутаматного транспортера.

(6) Способ, описанный выше, в котором ген gltS кодирует белок, показанный в следующих абзацах (C1) или (D1):

(C1) белок с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID No: 4,

(D1) белок с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID No: 4, включающий в себя замены, делеции, вставки, добавления или инверсии одного или нескольких аминокислотных остатков и обладающий активностью L-глутаматного транспортера.

(7) Способ, описанный выше, в котором ген gltS представляет собой ДНК, показанную в следующих абзацах (c) или (d):

(c) ДНК с нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID No: 3,

(d) ДНК, способную к гибридизации с последовательностью, которая комплиментарна нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID No: 3 или с зондом, который можно изготовить из нуклеотидной последовательности при жестких условиях, и кодирующую белок, обладающий активностью L-глутаматного транспортера.

(8) Способ, описанный выше, в котором повышают экспрессию гена путем увеличения числа копий гена, или путем модификации экспрессии контрольной последовательности гена.

(9) Способ, описанный выше, в котором L-аминокислота представляет собой L-лизин, и у бактерии повышена экспрессия гена ybjE.

(10) Способ, описанный выше, в котором ген ybjE кодирует белок, показанный в следующих пп. (E) или (F):

(E) белок с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID No: 6, или аминокислотная последовательность аминокислот от №№ 17 до 315 в SEQ ID No: 6,

(F) белок с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID No: 6, или аминокислотная последовательность аминокислот от №№ 17 до 315 в SEQ ID No: 6, включающая в себя замены, делеции, вставки, добавления или инверсии одного или нескольких аминокислотных остатков и обладающая активностью экскреции L-лизина.

(11) Способ, описанный выше, в котором ген ybjE представляет собой ДНК, показанную в следующих абзацах (e) или (f):

(e) ДНК с нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID No: 5, или нуклеотидная последовательность нуклеотидов от №№ 49 до 948 в SEQ ID No: 5,

(f) ДНК, способную к гибридизации с последовательностью, которая комплиментарна нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID No: 5, или нуклеотидной последовательностью нуклеотидов от №№ 49 до 948 в SEQ ID No: 5, или зондом, который можно изготовить из нуклеотидной последовательности при жестких условиях, кодирующая белок, обладающий активностью экскреции L-лизина.

(12) Способ согласно описанию выше, в котором L-аминокислота представляет собой L-лизин, уровень pH среды регулируют таким образом, чтобы он составлял от 6,0 до 9,0 во время культивирования для ее получения, и от 7,2 до 9,0 в конце культивирования, и таким образом обеспечивается период культивирования, когда в среде присутствуют ионы бикарбоната и/или ионы карбоната в количестве 20 мМ или больше, с тем, чтобы ионы бикарбоната и/или ионы карбоната служили противоионами основной аминокислоты.

(13) Способ, описанный выше, в котором бактерией является бактерия Escherichia.

Варианты осуществления настоящего изобретения

Далее приведено подробное объяснение по настоящему изобретению.

<1> Бактерия, используемая в настоящем изобретении

Бактерия согласно настоящему изобретению относится к бактериям, принадлежащим семейству Enterobacteriaceae, обладает способностью продуцировать L-аминокислоту, и была модифицирована таким образом, чтобы увеличить экспрессию гена gltP и/или гена gltS. L-аминокислоту выбирают из группы, состоящей из L-лизина, L-треонина, L-аспарагиновой кислоты, L-аспарагина, L-метионина, L-аланина, L-изолейцина и L-гомосерина. При получении указанных L-аминокислот путем ферментации с использованием микроорганизма часто вырабатывается L-глутаминовая кислота в качестве побочного продукта. Что касается побочной продукции L-глутаминовой кислоты, является достаточным уменьшение указанной побочной продукции по сравнению с наблюдаемой у немодифицированного штамма, посредством модификации, повышающей экспрессию гена gltP и/или гена gltS, при этом желательное уменьшение составляет 40% или больше, предпочтительно 50% или больше, более предпочтительно 60% или больше.

Упомянутая в изобретении способность продуцировать L-аминокислоту означает способность бактерии по настоящему изобретению вырабатывать L-аминокислоту в среде или клетках и накапливать L-аминокислоту в таком количестве, что при культивировании бактерий в среде L-аминокислоту можно собирать из среды или клеток. Бактерия по настоящему изобретению может представлять собой бактерию, способную продуцировать одно из следующего: L-лизин, L-треонин, L-аспарагиновую кислоту, L-аспарагин, L-метионин, L-аланин, L-изолейцин и L-гомосерин, или может представлять собой бактерию, способную продуцировать два или три вида аминокислот. Бактерия, обладающая способностью продуцировать L-аминокислоту, может представлять собой бактерию, способную по своей природе продуцировать L-аминокислоту, или может представлять собой описанную ниже бактерию, которая была модифицирована для получения способности продуцировать L-аминокислоту посредством мутационного способа или технологии рекомбинантных ДНК.

"Увеличение экспрессии гена" означает увеличение транскрипции и/или трансляции гена.

<1-1> Наделение способностью продуцировать L-аминокислоту

Ниже в качестве примеров будут приведены способы наделения бактерий способностью продуцировать L-аминокислоту, выбираемую из L-лизина, L-треонина, L-аспарагиновой кислоты, L-аспарагина, L-метионина, L-изолейцина, L-аланина и L-гомосерина, и примеры бактерий, наделенных способностью продуцировать описанные выше L-аминокислоты, которые можно использовать по настоящему изобретению. Вместе с тем, при использовании бактерий, способных продуцировать L-аминокислоту, бактерии не ограничены указанными.

Перечень бактерий, используемых по настоящему изобретению, не имеет конкретных ограничений, поскольку выбираются бактерии, принадлежащие семейству Enterobacteriaceae, например бактерии из родов Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Трансляция и Morganella, и имеющие вышеупомянутую способность продуцировать L-аминокислоты. Более конкретно, можно использовать бактерии по классификации из семества Enterobacteriaceae согласно таксономии, применяемой в базе данных NCBI (Национального центра биотехнологической информации) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg? mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock). В качестве родительского штамма из семейства Enterobacteriaceae, который используют для модификации, желательно использовать, в частности, бактерии рода Escherichia, Enterobacter или Pantoea.

Родительские штаммы бактерий Escherichia, используемые для получения бактерий Escherichia, которые задействованы в настоящем изобретении, не имеют конкретных ограничений, вместе с тем, можно использовать штаммы, в частности, описанные в работе Neidhardt et al. (Backmann B.J., 1996, Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p.2460-2488, Table 1, In F.D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.). Из указанных бактерий Escherichia предпочтительными являются E.coli. Конкретные примеры Escherichia coli включают в себя Escherichia coli W3110 (ATCC 27325), Escherichia coli МГ1655 (ATCC 47076) и т.д., полученные из штамма-прототипа дикого типа, штамма K12.

Указанные штаммы доступны, например, в Американской коллекции типовых культур (P.O.Box 1549, Manassas, VA 20108, Соединенные Штаты Америки). То есть, каждому из штаммов присвоены регистрационные номера, и посредством этих регистрационных номеров можно заказывать штаммы (ссылка http://www.atcc.org/). Регистрационные номера штаммов перечислены в каталоге Американской коллекции типовых культур.

Примеры бактерий Enterobacter включают в себя Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes и т.д., и примеры бактерий Pantoea включают в себя Pantoea ananatis. Некоторые штаммы Enterobacter agglomerans недавно были переклассифицированы в Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis или Pantoea stewartii на основании анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК и т.д. В настоящем изобретении можно использовать бактерию, принадлежащую какому-либо роду из Enterobacter или Pantoea, если по классификации она представляет собой бактерию семейства Enterobacteriaceae. При воспроизведении штамма Pantoea ananatis посредством генноинженерной технологии можно использовать штамм Pantoea ananatis AJ13355 (FERM BP-6614), штамм AJ13356 (FERM BP-6615), штамм AJ13601 (FERM BP-7207) и их производные. Указанные штаммы были идентифицированы как Enterobacter agglomerans, затем выделены и депонированы как штаммы Enterobacter agglomerans. Вместе с тем, недавно они были переклассифицированы как штаммы Pantoea ananatis на основании нуклеотидной последовательности 16S рРНК и т.д., как описано выше.

Ниже описаны способы наделения бактерий семейства Enterobacteriaceae способностью продуцировать L-аминокислоту, выбираемую из L-лизина, L-треонина, L-аспарагиновой кислоты, L-аспарагина, L-метионина, L-аланина, L-изолейцина и L-гомосерина, и способы повышения способности бактерий, принадлежащих семейству Enterobacteriaceae, продуцировать вышеупомянутые L-аминокислоты.

Для передачи способности продуцировать L-аминокислоту можно применять общепринятые способы выведения коринеформных бактерий или бактерий рода Escherichia (см. "Amino Acid Fermentation", Gakkai Shuppan Center (Ltd). 1^st Edition, опубликованную 30 мая 1986 г., стр. 77-100). Такие способы включают в себя приобретение свойств ауксотрофного мутанта, методики посредством штамма, резистентного к L-аминокислотному аналогу, или мутанта регуляции метаболизма, или путем конструирования рекомбинантного штамма с задачей сверхэкспрессии фермента L-аминокислотного биосинтеза. В этом случае при выращивании бактерий, продуцирующих L-аминкислоту, может передаваться одно или больше из вышеописанных свойств, таких как ауксотрофность, резистентность к аналогам и мутантная регуляция метаболизма. Можно увеличивать экспрессию фермента (ферментов) биосинтеза L-аминокислоты единственного или в комбинации из двух или больше. Кроме того, можно объединять способы передачи свойств, таких как ауксотрофность, резистентность к аналогам и мутантная регуляция метаболизма, с повышением ферментов биосинтеза.

Можно получать штамм ауксотрофного мутанта, штамм с резистентностью к L-аминокислотным аналогам или штамм с мутантной регуляцией метаболизма, обладающий способностью продуцировать L-аминокислоту, путем общепринятого мутагенного воздействия на родительский штамм или штамм дикого типа, например, подвергая их рентгеновскому или ультрафиолетовому (УФ) облучению, или посредством обработки мутагеном, таким как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (НТГ) и этилметансульфонат (ЭМС), и после этого проводить отбор штаммов, проявляющих ауксотрофность, резистентность к аналогам или мутантную регуляцию метаболизма, которые при этом также обладают способностью продуцировать L-аминокислоту из полученных мутантных штаммов.

L-лизин-продуцирующие бактерии

Ниже описаны в качестве примеров L-лизин-продуцирующие бактерии и способы их создания.

Примеры штаммов, обладающих способностью продуцировать L-лизин, включают в себя, например, штаммы, резистентные к аналогу L-лизина, и штаммы с мутантной регуляцией метаболизма. Примеры L-лизиновых аналогов включают в себя без ограничения оксолизин, гидроксамат лизина, S-(2-аминоэтил)-цистеин (АЭЦ), γ-метиллизин, α-хлоркапролактам и т.д. Мутантные штаммы с резистентностью к указанным лизиновым аналогам можно получать путем воздействия на бактерию, принадлежащую семейству Enterobacteriaceae, общепринятой искусственной мутагенной обработкой. Конкретные примеры L-лизин-продуцирующих бактерий включают в себя штаммы Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185, см. опубликованный японский патент № 56-18596, и патент США № 4346170), штамм Escherichia coli VL611 (опубликованный японский патент № 2000-189180), и т.д. В качестве L-лизин-продуцирующих Escherichia coli также можно использовать штамм WC196 (см. международную патентную публикацию WO 96/17930).

Кроме того, также можно создавать L-лизин-продуцирующие бактерии путем повышения активности фермента системы биосинтеза L-лизина. Повышение активности такого фермента может быть достигнуто путем увеличения числа копий гена, кодирующего фермент в клетках, или путем модификации экспрессии его контрольной последовательности. Можно достигать увеличения числа копий гена, кодирующего фермент системы биосинтеза L-лизина, и модификации экспрессии его контрольной последовательности тем же способом, как описано далее для генов gltP и gltS.

Примеры генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-лизина, включают в себя гены, кодирующие ферменты пути диаминоимелата, такие как ген дигидродипиколинатсинтазы (dapA), ген аспартокиназы (lysC), ген дигидропиколинатредуктазы (dapB), ген диаминопимелатдекарбоксилазы (lysA), ген диаминопимелатдегидрогеназы (ddh) (WO 96/40934 для всех вышеупомянутых генов), ген фосфоэнолпируваткарбоксилазы (ppc) (японский опубликованный патент № 60-87788), ген аспартатаминотрансферазы (aspC) (японская патентная публикация (Kokoku) № 6-102028), и ген семиальдегидаспартатдегидрогеназы (asd) (WO 00/61723), и гены, кодирующие ферменты пути аминоадипиновой кислоты, такие как ген гомоаконитатгидратазы (японский опубликованный патент № 2000-157276). Дополнительно, в родительском штамме может выявляться повышенный уровень экспрессии гена, вовлеченного в энергетическую эффективность (cyo) (европейский опубликованный патент № 1170376), гена, кодирующего никотинамиднуклеотидтрансгидрогеназу (pntAB) (патент США № 5830716), гена ybjE, кодирующего белок, обладающий активностью экскреции L-лизина (WO 2005/073390), гена, кодирующего Gluтаматдегидрогеназу (gdhA) (Gene 23:199-209, 1983), или их произвольной комбинации. Сокращения для обозначения генов показаны в круглых скобках.

Среди вышеупомянутых генов предпочтительным является ген ybjE. Примеры гена ybjE включают в себя ген ybjE Escherichia coli и его гомологи. Примеры гена ybjE Escherichia coli включают в себя ген, кодирующий аминокислотную последовательность аминокислот от №№ 17 до 315 в SEQ ID No: 6, конкретно, ген с нуклеотидной последовательностью нуклеотидов от №№ 49 до 948 в SEQ ID No: 5. Установлено, что в SEQ ID No: 5 стартовый кодон представлен нуклеотидами с номерами нуклеотидов от 49 до 51. Нуклеотиды с нуклеотидными номерами от 1 до 3 в SEQ ID No: 5 составляют кодон, кодирующий валин (Val), gtg, но вместе с тем при трансляции стартовым кодоном может стать метионин (Met), и белок, кодируемый геном ybjE, может представлять собой белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID No: 6 (1-315). В таком случае предпочтительно использовать ДНК, имеющую нуклеотидную последовательность нуклеотидов от №№ 1 до 948 в SEQ ID No: 5. Вместе с тем, из примеров очевидно, что независимо от того, какой аминокислотный остаток представлен в стартовом кодоне, применимый для способа получения согласно настоящему изобретению микроорганизм можно получать путем использования ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность нуклеотидов от №№ 49 до 948 в SEQ ID No: 1.

Известно, что дигидропиколинатсинтаза дикого типа, полученная из Escherichia coli, подвергается ингибированию L-лизином по типу обратной связи, также известно, что аспартокиназа дикого типа, полученная из Escherichia coli, подвергается супрессии и ингибированию L-лизином по типу обратной связи. Поэтому указанные используемые ген dapA и ген lysC предпочтительно являются генами, кодирующими мутантные ферменты с десенситизацией ингибирования L-лизином по типу обратной связи.

Примеры ДНК, кодирующей мутантную дигидропиколинатсинтетазу, которая десенситизирована к ингибированию L-лизином по типу обратной связи, включают в себя ДНК, кодирующую такой белок с аминокислотной последовательностью, в которой гистидиновый остаток в положении 118 заменен тирозиновым остатком. Примеры ДНК, кодирующей мутантную аспартокиназу, которая десенситизирована к ингибированию L-лизином по типу обратной связи, включают в себя ДНК, кодирующую AKIII с аминокислотной последовательностью, в которой остаток треонина в положении 352, остаток глицина в положении 323 и остаток метионина в положении 318 заменены на остатки изолейцина, аспарагина и изолейцина соответственно (в отношении указанных мутантов см. патенты США №№ 5661012 и 6040160). Такие мутантные ДНК можно получать путем сайт-специфичного мутагенеза посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) или подобным образом.

Плазмиды с широким кругом хозяев RSFD80, pCAB1 и pCABD2 известны как плазмиды, содержащие мутантный ген dapA, кодирующий мутантную дигидропиколинатсинтазу, и мутантный ген lysC, кодирующий мутантную аспартокиназу (патент США № 6040160). Штамм Escherichia coli JM109, трансформированный плазмидой, получил наименование AJ12396 (патент США № 6040160), и этот штамм был депонирован в Национальном институте National Institute of Bioscience and Human Technology, Агентства промышленной науки и техники, Министерства международной торговли и промышленности (в настоящее время Национальный институт National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Международный патентный депозитарий организмов) 28 октября 1993 года и получил инвентарный номер FERM P-13936, и затем указанное депонирование перевели в международное депонирование согласно условиям Будапештского договора 1 ноября 1994 года, с присвоением инвентарного номера FERM BP-4859. RSFD80 может быть получен из штамма AJ12396 общепринятым способом.

Кроме того, у продуцирующих L-аминокислоты бактерий может быть снижена активность фермента, который катализирует реакцию, отклоняющуюся от пути биосинтеза L-аминокислоты и продуцирующую другое соединение, или может отсутствовать такая активность, или у них может быть снижена активность фермента, который отрицательно действует на синтез или накопление L-аминокислоты, или отсутствует такая активность. Примеры таких ферментов, вовлеченных в выработку L-лизина, включают в себя гомосериндегидрогеназу, лизиндекарбоксилазу (cadA, ldcC), яблочный фермент и т.д., и в патентах WO 95/23864, WO 96/17930, WO 2005/010175 и т.д. раскрыты штаммы, в которых активность указанных ферментов снижена или отсутствует.

Является предпочтительным уменьшение экспрессии обоих генов cadA и ldcC, кодирующих лизиндекарбоксилазу, для снижения или устранения активности лизиндекарбоксилазы. Экспрессию обоих генов можно уменьшить, например, посредством способа, описанного в WO 2006/078039.

Для уменьшения или устранения активности упомянутых ферментов можно в геноме ферментов внедрять мутацию в гены общепринятым способом мутагенеза или технологией рекомбинации генов с тем, чтобы уменьшить или устранить внутриклеточное действие ферментов. Такое внедрение мутации можно осуществлять, например, посредством генетической рекомбинации для устранения генов, кодирующих ферменты в геноме, или для модификации экспрессии контрольной последовательности, такой как промотерная последовательность или последовательность Шайн-Дальгарно (SD). Это может также достигаться путем внедрения мутации для аминокислотной замены (миссенс-мутация), стоп-кодона (нонсенс-мутация) или мутации со сдвигом рамки, для добавления или делеции одного или двух нуклеотидов в области, которые кодируют ферменты в геноме, или путем частичного или полного удаления генов (J. Biol. Chem., 272:8611-8617, 1997). Ферментативная активность также может быть уменьшена или устранена путем конструирования гена, кодирующего мутантный фермент, в котором полностью или частично удалены кодирующие области, и замещение этим геном нормального гена в геноме посредством гомологичной рекомбинации или подобным образом, или путем вставки в ген транспозона или IS-фактора.

Например, применяют следующие способы вставки мутации, которая уменьшает или устраняет активность вышеупомянутых ферментов посредством генетической рекомбинации. Создают мутантный ген путем модификации части последовательности гена-мишени, таким образом, чтобы он не кодировал фермент, способный нормально функционировать, и затем бактерию семейства Enterobacteriaceae можно трансформировать с ДНК, содержащей мутантный ген, чтобы вызвать мутантным геном рекомбинацию соответствующего гена в геноме для замены мутантным геном гена-мишени в геноме. Примеры такой генной замены с применением гомологичной рекомбинации включают в себя способы использования линейной ДНК, такие как способ под названием Red-зависимая интеграция (Datsenko, K.A, and Wanner, B.L., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:6640-6645), и способ, задействующий Red-зависимую интеграцию в комбинации с системой вырезания, полученной из λ-фага (Cho, E.H., Gumport, R.I. Gardner, J.F., 2002, J. Bacteriol., 184:5200-5203) (см. WO 2005/010175), способ с использованием плазмиды, содержащей термочувствительную точку начала репликации (патент США № 6303383, японский опубликованный патент № 05-007491), и т.д. Кроме того, такой сайт-специфичный мутагенез, основанный на замене генов посредством гомологичной комбинации, как описано выше, также можно проводить с использованием плазмиды, которая не может реплицироваться в хозяине.

Предпочтительные примеры L-лизин-продуцирующих бактерий включают в себя Escherichia coli WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2 (WO 2006/078039). Штамм был сконструирован путем введения плазмиды pCABD2, содержащий гены биосинтеза лизина (патент США № 6040160) в штамм WC196 с разорванными генами cadA и ldcC, которые кодируют лизиндекарбоксилазу. Штамм WC196 был создан из штамма W3110, который происходит из Escherichia coli K-12, путем замены гена дикого типа lysC в хромосоме штамма W3110 мутантным геном lysC, кодирующим мутантную аспартокиназу III, в котором треонин в положении 352 был заменен на изолейцин, что приводит к десенситизации ингибирования L-лизином по типу обратной связи (патент США № 5661012), и наделение AEC резистентностью к полученному штамму (патент США № 5827698). Штамм WC196 имеет наименование Escherichia coli AJ13069, был депонирован в Национальном институте National Institute of Bioscience and Human Technology (в настоящее время независимое административное агентство Национальный институт National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Международный патентный депозитарий организмов, Tsukuba-central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, 305-8566, Япония) 6 декабря 1994 года, и получил инвентарный номер FERM P-14690. затем он был переведен в международное депонирование согласно условиям Будапештского договора 29 сентября 1995 года с присвоением инвентарного номера FERM BP-5252 (патент США № 5827698). Сам штамм WC196ΔcadAΔldcC представляет собой также предпочтительную L-лизин-продуцирующую бактерию. Штамм WC196ΔcadAΔldcC был определен как AJ110692, депонирован в Национальном институте National Institute of Bioscience and Human Technology (в настоящее время независимое административное агентство Национальный институт National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Международный патентный депозитарий организмов, Tsukuba-central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, 305-8566, Япония) 7 октября 2008 года как международное депонирование, с присвоением инвентарного номера FERM BP-11027.

Плазмида pCABD2 включает мутантный ген dapA, полученный из Escherichia coli и кодирующий дигидропиколинатсинтазу (DDPS), несущую мутацию для десенситизации к ингибированию L-лизином по типу обратной связи, мутантный ген lysC, полученный из Escherichia coli и кодирующий аспартокиназу III с мутацией для десенситизации к ингибированию L-лизином по типу обратной связи, ген dapB, полученный из Escherichia coli и кодирующий дигидропиколинатредуктазу, и ген ddh, полученный из Brevibacterium lactofermentum и кодирующий диаминопимелатдегидрогеназу.

L-треонин-продуцирующие бактерии

Предпочтительные примеры L-треонин-продуцирующих бактерий, используемых в настоящем изобретении, включают в себя бактерии, принадлежащие семейству Enterobacteriaceae, у которых усилены одно или больше действий ферментов системы биосинтеза L-треонина. Примеры генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-треонина, включают в себя ген аспартокиназы III (lysC), ген аспартат-семиальдегиддегидрогеназы (asd), ген аспартокиназы I (thrA), ген гомосеринкиназы (thrB), и ген треонинсинтазы (thrC), кодируемый опероном thr. Можно вводить два или больше вида указанных генов. Гены, кодирующие ферменты биосинтеза L-треонина, можно вводить в бактерию Enterobacteriaceae с уменьшенным расщеплением треонина. Примеры бактерии Escherichia с уменьшенным расщеплением треонина включают в себя, например, штамм TDH6, который не обладает треониндегидрогеназной активностью (японский опубликованный патент № 2001-346578) и т.д.

Ферментная активность ферментов биосинтеза L-треонина ингибируется конечным продуктом, L-треонином. Поэтому для конструирования L-треонин-продуцирующего штамма желательно, чтобы гены для ферментов биосинтеза L-треонина были модифицированы таким образом, чтобы ферменты в L-треонин-продуцирующих штаммах были десенситизированы к ингибированию L-треонином по типу обратной связи. Вышеупомянутые гены thrA, thrB и thrC составляют треониновый оперон, который формирует структуру аттенуатора. Экспрессия треонинового оперона ингибируется изолейцином и треонином в культуральной среде и также подавляется аттенуированием. Поэтому можно модифицировать треониновый оперон путем удаления лидерной последовательности в аттенуирующей области или в аттенуаторе (см. Lynn, S.P., Burton, W.S., Donohue, T.J., Gould, R.M., Gumport, R.L, and Gardner, J.F., J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987); WO 02/26993; WO 2005/049808).

Нативный промотер треонинового оперона находится слева (выше) от треонинового оперона, и может быть заменен ненативным промотором (см. WO 98/04715), или треониновым опероном, который был модифицирован таким образом, чтобы экспрессию гена биосинтеза треонина регулировал ген-репрессор, также можно конструировать промотор λ-фага (см. европейский патент № 0593792). Кроме того, можно выбирать штамм, резистентный к α-амино-β-гидроксиизовалериановой кислоте (AHV) для такой модификации бактерии Escherichia, которая приводит к десенситизации к ингибированию L-треонином по типу обратной связи,

Предпочтительно увеличивать число копий треонинового оперона, который модифицирован до десенситизации к ингибированию L-треонином по типу обратной связи, или увеличивать экспрессию треонинового оперона путем лигирования его к мощному промотору. Число копий также можно увеличивать, помимо амплификации, посредством плазмиды, переносом треонинового оперона в геном, используя транспозон, Mu-фаг или подобные методики.

В отношении гена аспартокиназы III (lysC) желательно использовать ген, модифицированный до десенситизации фермента к ингибированию L-лизином по типу обратной связи. Такой ген lysC модифицированный до десенситизации фермента к ингибированию по типу обратной связи, можно получать способом, описанным в патенте США № 5932453.

Кроме увеличения экспрессии генов биосинтеза L-треонина, экспрессии генов, вовлеченных в гликолитический путь, цикл трикарбоновых кислот (ТКК), или дыхательную цепь, также можно предпочтительно увеличивать гены, которые регулируют экспрессию упомянутых генов, или генов, вовлеченных в усвоение сахара. Примеры таких генов, эффективных для продукции L-треонина, включают в себя гены, кодирующие трансгидрогеназу (pntAB, европейский патент № 7337l2), фосфоэнолпируваткарбоксилазу (pepC, WO 95/06114), фосфоэнолпируватсинтазу (pps, европейский патент № 877090), и ген, кодирующий пируваткарбоксилазу из коринеформных бактерий или бактерий Bacillus (WO 99/18228, европейский опубликованный патент № 1092776).

L-треонин-продуцирующие бактерии также можно предпочтительно получать путем повышения экспрессии гена, который придает L-треониновую резистентность и/или гена, который придает L-гомосериновую резистентность, или посредством наделения бактерии-хозяина L-треониновой резистентностью и/или L-гомосериновой резистентностью. Примеры генов, которые придают вышеупомянутую резистентность, включают в себя ген rhtA (Res. Microbiol. 154:123-135 (2003)), ген rhtB (европейский опубликованный патент № 0994190), ген rhtC (европейский опубликованный патент № 1013765), ген yfiK и ген yeaS (европейский опубликованный патент № 1016710). Примеры способов наделения L-треониновой резистентностью бактерии-хозяина включают в себя способы, описанные в европейском опубликованном патенте № 0994190 или WO 90/04636.

Штамм E. coli ВКПМ B-3996 (патент США № 5175107) может быть примером L-треонин-продуцирующей бактерии. Штамм ВКПМ B-3996 был депонирован 7 апреля 1987 года во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ), ГНИИ Генетика (Россия, 117545 Москва 1, Дорожный проезд, 1) под регистрационным номером ВКПМ B-3996. Штамм ВКПМ B-3996 включает плазмиду pVIC40 (WO 90/04636), которая была получена путем вставки генов биосинтеза треонина (треониновый оперон, thrABC) в плазмидный вектор с широким кругом хозяев pAYC32, содержащий маркер резистентности к стрептомицину (Chistorerdov, A.Y., and Tsygankov, Y.D., Plasmid, 16, 161-167 (1986)). В pVIC40 аспартокиназа I-гомосериндегидрогеназа I, кодируемая геном thrA в треониновом опероне, является десенситизированной к ингибированию L-треонином по типу обратной связи.

Штамм E. coli ВКПМ B-5318 (см. европейский патент № 0593792) может также служить примером предпочтительной L-треонин-продуцирующей бактерии. Штамм ВКПМ B-5318 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ГНИИ Генетика 3 мая 1990 года под регистрационным номером ВКПМ B-5318. Штамм ВКПМ B-5318 является прототрофным относительно L-изолейцина, и скрывает в себе рекомбинантную плазмидную ДНК, сконструированную так, чтобы треониновый оперон, то есть гены биосинтеза треонина, не имеющие область аттенуатора, которая исходно включает область регуляции транскрипции, были расположены справа (ниже) от термочувствительного С1 репрессора, полученного из λ-фага, PR-промотора и гена, кодирующего N-конец белка Cro, и экспрессия генов биосинтеза треонина регулируется геном-репрессором и промотором, полученным из λ-фага.

L-гомосерин-продуцирующие бактерии

Примеры бактерий, продуцирующих L-гомосерин, принадлежащих роду Escherichia, включают в себя штамм NZ10 (thrB), который является ревертантом Leu⁺, полученным из известного штамма C600 (thrB, leuB, см. Appleyard R.K., Genetics, 39, 440-452, 1954). Также можно предпочтительно использовать штамм-трансформант NZ10, трансформированный thrA геном, кодирующим аспартокиназу-гомосериндегидрогеназу I.

Если увеличивается число копий гена rhtB бактерии, эта бактерия становится резистентной к L-гомосерину и улучшается ее продуктивность для L-гомосерина, L-треонина, L-аланина, L-валина и L-изолейцина (европейский опубликованный патент № 994190 A2). Кроме того, если увеличивается число копий гена rthC бактерии, эта бактерия становится резистентной к L-гомосерину и L-треонину, улучшается ее продуктивность для L-гомосерина, L-треонина и L-лейцина (европейский опубликованный патент № 1013765 A1).

Кроме того, также можно использовать штамм 44 Escherichia coli (депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов с регистрационным номером ВКПМ B-2175).

L-метионин-продуцирующие бактерии

Примеры L-метионин-продуцирующих бактерий, принадлежащих роду Escherichia, включают в себя такие штаммы как Escherichia coli AJ11539 (NRRL B-12399), AJ11540 (NRRL B-12400), AJ11541 (NRRL B-12401), AJ11542 (NRRL B-12402, GB 2075055), 218 (ВКПМ B-8125, европейский патент № 1239041) и т.д.

Бактерии, продуцирующие L-аспарагиновую кислоту

Примеры продуцирующих L-аспарагиновую кислоту бактерий, принадлежащих роду Escherichia, включают в себя штамм Escherichia coli, в котором повышена активность аспартазы для получения L-аспарагиновой кислоты из фумаровой кислоты (японская патентная публикация № 38-6588).

L-аланин-продуцирующие бактерии

L-аланин продуцируется путем β-декарбоскилирования аспарагиновой кислоты. Поэтому примеры L-аланин-продуцирующих бактерий, принадлежащих роду Escherichia, включают в себя штамм Escherichia coli, в котором увеличено содержание аспартат-β- декарбоксилазы (японский опубликованный патент № 2-242690).

L-изолейцин-продуцирующие бактерии

Примеры родительских штаммов, которые используются для получения L-изолейцин-продуцирующих бактерий, включают в себя без ограничения мутанты, которые являются резистентными к 6-диметиламинопурину (японский опубликованный патент № 5-304969), мутанты, которые являются резистентными к аналогам изолейцина, таким как тиаизолейцин и изолейцин-гидроксамат, и мутанты, которые дополнительно резистентны к DL-этионину и/или гидроксамату аргинина (японский опубликованный патент № 5-130882). Дополнительно, в качестве родительских штаммов также используются рекомбинантные штаммы, трансформированные генами, кодирующими белки, вовлеченными в биосинтез L-изолейцина, такие как треониндеаминаза и ацетогидроксатсинтаза (японский опубликованный патент № 2-458, патент FR 0356739 и патент США № 5998178).

L-аспарагин-продуцирующие бактерии

L-аспарагин получают путем переноса аминогруппы в аспарагиновую кислоту (Boehlein, S.K., Richards, N.G.J., & Schuster, S.M. (1994a), J. Biol. Chem., 269, 7450-7457). Поэтому, примеры L-аспарагин-продуцирующих бактерий, принадлежащих роду Escherichia, включают в себя штаммы Escherichia coli с повышенным содержанием аспарагинсинтетазы, которые продуцируют L-аспарагиновую кислоту.

Можно получать бактерии по настоящему изобретению путем модификации такой бактерии, которая обладает способностью продуцировать L-аминокислоту, выбираемую из L-лизина, L-треонина, L-аспарагиновой кислоты, L-аспарагина, L-метионина, L-аланина, L-изолейцина и L-гомосерина, как описано выше, таким образом, чтобы повысить экспрессию ее гена gltP и/или гена gltS. Альтернативно, бактерия по настоящему изобретению может также быть получена путем придания способности продуцировать упомянутую L-аминокислоту бактерии, которая была модифицирована таким образом, чтобы повысить экспрессию ее гена gltP и/или гена gltS.

Состояние "является модифицированной таким образом, чтобы повысить экспрессию гена gltP и/или гена gltS" соответствует состоянию, когда увеличивается число молекул на клетку, кодируемых геном gltP и/или геном gltS, или повышается в молекуле активность белка GltP или белка GltS, кодируемого этими генами, по сравнению с немодифицированным штаммом, таким как штамм дикого типа или родительский штамм. Бактерия предпочтительно модифицирована таким образом, чтобы повысилась активность белка GltP или белка GltS в клетке на уровень 150% или больше, более предпочтительно, до 200% или больше, еще более предпочтительно до 300% или больше от уровня активности немодифицированного штамма. Примеры немодифицированных штаммов, служащих исходными для вышеупомянутого сравнения, такие как штаммы дикого типа микроорганизма, принадлежащего семейству Enterobacteriaceae, включают в себя, например, штамм Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076), штамм W3110 (ATCC 27325), штамм Pantoea ananatis AJ13335 (FERM BP-6614) и т.д. Активность белков GltP и GltS относится к действию, отвечающему за захват L-глутаминовой кислоты в бактериальные клетки из внеклеточного пространства, и в настоящем описании упоминается "как активность L-глутаматного транспортера". Активность L-глутаматного транспортера можно подтверждать путем сравнения скорости захвата L-глутамата в клетки микроорганизма по настоящему изобретению со скоростью захвата L-глутамата соответствующим немодифицированным штаммом. Скорость захвата L-глутамата можно измерить, например, посредством реакции живых клеток с L-глутаминовой кислотой, меченой RI на определенный период времени, и обнаружения радиоактивности в клетках (Wallace, B; Yang, YJ; Hong, JS; Lum, D, J. Bacteriol., Jun 1990.; 172 (6):3214-3220).

Увеличение экспрессии гена gltP и/или гена gltS по сравнению с экспрессией немодифицированного штамма, такого как родительский штамм или штамм дикого типа, можно подтверждать путем сравнения количества мРНК упомянутого гена с ее количеством в штамме дикого типа или в немодифицированном штамме. Примеры способа количественного подтверждения экспрессии включают в себя гибридизацию по Нозерну, ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA, 2001). Экспрессию можно увеличивать до любого уровня, если по сравнению с уровнем немодифицированного штамма этот уровень превышен, и например, желательно его увеличение не меньше чем в 1,5 раза, более предпочтительно не меньше чем в 2 раза, дополнительно предпочтительно не меньше чем 3 в раза, по сравнению с уровнем, например, немодифицированного штамма. Кроме того, повышение активности белков, кодируемых геном gltP и/или геном gltS, также можно подтверждать на основании увеличения количества белка-мишени по сравнению с этим количеством у немодифицированного штамма, и его можно обнаруживать, например, Вестерн-блоттингом с использованием антитела (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA, 2001).

Гены gltP и gltS по настоящему изобретению представляют собой гены gltP и gltS микроорганизма, принадлежащего семейству Enterobacteriaceae, или его гомологам. Примером гена gltP Escherichia coli может быть ген, кодирующий белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID No: 2 (SEQ ID No: 1) (b4077, номер доступа GenBank NP_418501. [gi:16131903]). Примером гена gltS Escherichia coli может быть ген, кодирующий белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID No: 4 (SEQ ID No: 3) (b3653, номер доступа GenBank NP_418110. [gi:16131524]).

Гомолог гена gltP или gltS означает ген, который получен из другого микроорганизма, но проявляет высокое структурное подобие гену gltP или гену gltS бактерии Escherichia, и кодирует белок, действующий на сокращение количества продуцируемой L-глутаминовой кислоты во время выработки L-аминокислоты, выбираемой из L-лизина, L-треонина, L-аспарагиновой кислоты, L-аспарагина, L-метионина, L-аланина, L-изолейцина и L-гомосерина и действующий для доставки Gluтаминовой кислоты в клетки при внедрении ген в хозяина. Примеры генных гомологов gltP или gltS включают в себя, например, гены, зарегистрированные в GenBank, включающие в себя гены бактерий Shigella и Enterobacter. Кроме того, ген gltP ген и/или gltS могут представлять собой гены, клонированные из бактерии Streptomyces, например, из Streptomyces coelicolor или молочнокислой бактерии рода Lactococcus, Lactobacillus или им подобным, на основании гомологии к генам, приведенным в качестве примера выше. Можно использовать любой ген, проявляющий высокую гомологию с геном gltP и/или геном gltS бактерий Escherichia, даже если этот ген имеет другое наименование. Генные гомологи гена gltP и/или gltS включают в себя, например, гены, которые можно клонировать посредством синтетических олигонуклеотидов SEQ ID No: 8 и 9, или SEQ ID No: 10 и 11.

Кроме того, ген в качестве генного гомолога гена gltP и/или gltS, проявляющий высокую гомологию, можно получать из общеизвестной базы данных на основании вышеупомянутой информации о последовательности. Гомологию аминокислотных последовательностей и нуклеотидных последовательностей можно определять посредством, например, алгоритма BLAST, Karlin и Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)) или FASTA (Methods Enzymol., 183, 63 (1990)). Программы под наименованием BLASTN и BLASTX были разработаны на основе упомянутого алгоритма BLAST (см. ресурс www.ncbi.nlm.nih.gov).

В настоящем описании термин "гомология" также может использоваться для обозначения "идентичности".

Ниже описаны гомологи, проявляющие высокую гомологию с геном gltP или gltS Escherichia coli, с наименованием гомологов, названиями бактерий, и регистрационными номерами в базах данных генных последовательностей.

Таблица 1
Иден-тич-ность	Источник	Номер доступа	Иден-тич-ность	Источник	Номер доступа
100%	Escherichia coli (штамм K12)	EMBL; M32488; AAA23832.1	99%	Escherichia coli (штамм UTI89/UPEC)	EMBL; CP000243; ABE10076.1
99%	Escherichia coli	CP000247	99%	Escherichia coli 53638	EMBL; AAKB02000001; EDU65993.1
99%	Shigella boydii (Sb227)	CP000034-CP000039	99%	Escherichia coli O9:H4 (штамм HS)	EMBL; CP000802; ABV08482.1
99%	Shigella sonnei (Ss046)	CP000034-CP000039	99%	Escherichia coli O139:H28 (штамм E24377A/ETEC)	EMBL; CP000800; ABV17642.1
99%	Escherichia coli O157:H7	EMBL; AE005174; AAG59275.1	99%	Shigella flexneri	EMBL; AE005674; AAN45560.1
99%	Escherichia coli O6	EMBL; AE014075; AAN83500.1	99%	Shigella flexneri серотип 5b (штамм 8401)	EMBL; CP000266; BF06119.1
99%	Shigella sonnei (штамм Ss046)	EMBL; CP000038; AAZ90754.1	98%	Escherichia albertii TW07627	EMBL; ABKX01000015; EDS90170.1
99%	Shigella boydii серотип 4 (штамм Sb227)	EMBL; CP000036; ABB68540.1	95%	Citrobacter koseri (штамм ATCC BAA-895/CDC 4225-83/SGSC4696)	EMBL; CP000822; ABV14881.1
99%	Escherichia coli O6:K15:H31 (штамм 536/UPEC)	EMBL; CP000247; ABG72258.1	94%	Salmonella paratyphi B (штамм ATCC BAA-1250/SPB7)	EMBL; CP000886; ABX70555.1
99%	Shigella boydii серотип 18 (штамм CDC 3083-94/BS512)	EMBL; CP001063; ACD08193.1	94%	Salmonella typhimurium	EMBL; AE008901; AAL23107.1

99%	Escherichia coli O157:H7 штамм EC4076	EMBL; ABHQ01000005; EDU70808.1	94%	Salmonella paratyphi A	EMBL; CP000026; AAV79845.1
99%	Escherichia coli O157:H7 штамм EC4113	EMBL; ABHP01000005; EDU55567.1	93%	Salmonella arizonae (штамм ATCC BAA-731/CDC346-86/RSK2980)	EMBL; CP000880; ABX23224.1
99%	Escherichia coli O157:H7 штамм EC4196	EMBL; ABHO01000008; EDU33758.1	93%	Salmonella typhi	EMBL; AE014613; AAO71654.1
99%	Escherichia coli (штамм SMS-3-5/SECEC)	EMBL; CP000970; ACB19931.1	93%	Enterobacter sp. (штамм 638)	EMBL; CP000653; ABP58966.1
99%	Escherichia coli (штамм ATCC 8739/DSM 1576/Crooks)	EMBL; CP000946; ACA79551.1	93%	Salmonella choleraesuis	EMBL; AE017220; AAX68069.1
99%	Escherichia coli(UTI89)	EMBL; CP000243/CP000244	93%	Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae (штамм ATCC 700721/MGH78578)	EMBL; CP000647; ABR79835.1
99%	Escherichia coli O1:K1/APEC	EMBL; CP000468; ABJ03557.1	90%	Enterobacter sakazakii (штамм ATCC BAA-894)	EMBL; CP000783; ABU75428.1

Таблица 2
Иден-тич-ность	Источник	Номер доступа	Иден-тич-ность	Источник	Номер доступа
100%	Escherichia coli		99%	Escherichia albertii TW07627	EMBL; ABKX01000002; EDS93075.1
99%	Escherichia coli O157:H7	EMBL; BA000007; BAB37952.1	98%	Escherichia coli 536	CP000247

99%	Escherichia coli O157:H7 штамм EC4076	EMBL; ABHQ01000003;EDU71328.1	98%	Escherichia coli O6	EMBL; AE014075; AAN82914.1
99%	Escherichia coli O157:H7 штамм EC4113	EMBL; ABHP01000008;EDU54990.1	98%	Escherichia coli O6:K15:H31 (штамм 536/UPEC)	EMBL; CP000247; ABG71723.1
99%	Escherichia coli O157:H7 штамм EC4196	EMBL; ABHO01000001;EDU35455.1	99%	Escherichia coli O157:H7	EMBL; AE005174; AAG58798.1
99%	Escherichia coli O9:H4 (штамм HS)	EMBL; CP000802; ABV08069.1	93%	Salmonella choleraesuis	EMBL; AE017220; AAX67576.1
99%	Escherichia coli O139:H28 (штамм E24377A/ETEC)	EMBL; CP000800; ABV17638.1	93%	Salmonella paratyphi A	EMBL; CP000026; AAV79398.1
99%	Escherichia coli (штамм SMS-3-5/SECEC)	EMBL; CP000970; ACB18417.1	93%	Salmonella paratyphi B (штамм ATCC BAA-1250/SPB7)	EMBL; CP000886; ABX69959.1
99%	Escherichia coli 53638	EMBL; AAKB02000001;EDU64770.1	92%	Salmonella typhimurium	EMBL; AE008874; AAL22605.1
99%	Escherichia coli	D00626	93%	Salmonella arizonae (штамм ATCC BAA-731/CDC346-86/RSK2980)	EMBL; CP000880; ABX23688.1
99%	Escherichia coli UTI89	Acc.No.CP000243/ CP000244	93%	Salmonella typhi	EMBL; AE014613; AAO71256.1
99%	Escherichia coli O1:K1/APEC	EMBL; CP000468; ABJ03124.1	92%	Salmonella typhi	EMBL; AL627280; CAD03248.1
99%	Escherichia coli (штамм UTI89/UPEC)	EMBL; CP000243; ABE09626.1

Аминокислотные последовательности, ставшие консервативными в вышеупомянутых гомологах, показаны в SEQ ID No: 12 (GltP) и SEQ ID No: 13 (GltS).

Кроме того, используемый в настоящем изобретении ген gltP и/или ген gltS не ограничен геном дикого типа, и он может представлять собой мутант или искусственно модифицированный ген, кодирующий белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID No: 2, 4, 12 или 13, включающий в себя замены, делеции, вставки, добавления или подобные изменения из одного или больше аминокислотных остатков в одном или больше положениях, если не ухудшается функция кодируемого белка, а именно активность L-глутаматного транспортера.

Количество, подразумеваемое под термином “один или несколько”, который используется в настоящем изобретении, может отличаться в зависимости от положения в трехмерной структуре белка или от типов аминокислотных остатков, в частности, это может быть от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 5. Вышеупомянутые замены, делеции, вставки или добавления одного или больше аминокислотных остатков соответствуют консервативной мутации, при которой сохраняется активность L-глутаматного транспортера. Консервативная мутация обычно представляет собой консервативную замену. Консервативная замена является заменой, которая взаимно происходит между Phe, Trp и Tyr, если областью замены является ароматическая аминокислота; между Leu, Ile и Val, если областью замены является гидрофобная аминокислота; между Gln и Asn, если это полярная аминокислота; между Lys, Arg и His, если это основная аминокислота; между Asp и Glu, если это кислая аминокислота; и между Ser и Thr, если это аминокислота, имеющая гидроксильную группу. По конкретным примерам замен предполагается, что консервативная замена включает в себя следующее: замена Ser или Thr на Ala; замена Gln, His или Lys на Arg; замена Glu, Gln, Lys, His или Asp на Asn; замена Asn, Glu или Gln на Asp; замена Ser или Ala на Cys; замена Asn, Glu, Lys, His, Asp или Arg на Gln; замена Gly, Asn, Gln, Lys или Asp на Glu; замена Pro на Gly; замена Asn, Lys, Gln, Arg или Tyr На His; замена Leu, Met, Val или Phe на Ile; замена Ile, Met, Val или Phe на Leu; замена Asn, Glu, Gln, Hisc или Arg на Lys; замена Ile, Leu, Val или Phe на Met; замена Trp, Tyr, Met, Ile или Leu на Phe; замена Thr или Ala на Ser; замена Ser или Ala на Thr; замена Phe или Tyr на Trp; замена His, Phe или Trp на Tyr; и замена Met, Ile или Leu на Val. Мутация для такой замены, делеции, вставки, добавления, инверсии или подобных изменений аминокислотных остатков, как описано выше, также включает в себя встречающиеся в природе мутации, основанные на индивидуальных отличиях, на разных видах микроорганизмов, несущих ген gltP и/или ген gltS (мутант или вариант) и т.д. Можно получать ген с такой мутацией путем модификации нуклеотидной последовательности SEQ ID No: 1 или 3 или ее гомолога, например, с помощью сайт-специфичного мутагенеза, таким образом, чтобы замена, удаление, вставка или дополнение аминокислотного остатка или остатков были включены в определенный участок кодируемого белка.

Кроме того, в качестве гена gltP и/или гена gltS можно использовать ген, кодирующий белок, который проявляет гомологию 80% или больше, предпочтительно 90% или больше, более предпочтительно 95% или больше, особенно предпочтительно 97% или больше, ко всей аминокислотной последовательности SEQ ID No: 2, 4, 12 или 13 и обладает активностью L-глутаматного транспортера.

Кроме того, кодоны gltP гена и/или gltS гена могут быть заменены на легко используемые хозяином кодоны, в которые введены ген gltP и/или ген gltS. Также, если сохраняется активность L-глутаматного транспортера, белок, кодируемый геном gltP или геном gltS, может представлять собой белок с удлиненной или делетированной последовательностью N-конца или C-конца. Длина аминокислотной последовательности, которая будет удлинена или делетирована, в отношении числа аминокислотных остатков может составлять 50 или меньше, предпочтительно 20 или меньше, более предпочтительно 10 или меньше, особенно предпочтительно 5 или меньше аминокислотных остатков. Более конкретно, белок может представлять собой белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID No: 2 с удлинением или делецией от 5 до 50 аминокислотных остатков со стороны N-конца или от 5 до 50 аминокислотных остатков со стороны C-конца.

Кроме того, модифицированный ген gltP и/или ген gltS также можно получать общепринято известной мутагенной обработкой, описанной ниже. Примеры мутагенной обработки включают в себя способ обработки одного или больше из гена gltP и/или гена gltS гидроксиламином или подобным веществом in vitro, и способ обработки микроорганизма, например, бактерий Escherichia, содержащей упомянутый ген, ультрафиолетовым облучением или мутагеном, используемым при общепринятой мутагенной обработке, например, N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидином (НТГ) или этилметансульфонатом (ЭМС). Можно подтверждать способность такого модифицированного гена кодировать белок, обладающий активностью L-глутаматного транспортера, например, давая возможность экспрессировать упомянутый ген в соответствующей клетке, и исследуя наличие у белка активности L-глутаматного транспортера.

Кроме того, ген gltP и/или ген gltS может также представлять собой ДНК, способную к гибридизации с последовательностью, комплиментарной нуклеотидной последовательности SEQ ID No: 1 или 3 соответственно, или зондом, который можно изготовить из упомянутых последовательностей при жестких условиях, и кодировать белок, обладающий активностью L-глутаматного транспортера. "Строгие условия", упомянутые в настоящем изобретении, означают условия, при которых создаются специфичные гибриды, но не образуются неспецифичные гибриды. Представляет трудности определение упомянутых условий в цифрах, но вместе с тем, примеры включают в себя, например, условия, при которых ДНК, проявляющие высокую гомологию друг к другу, например ДНК, проявляющие гомологию не менее 80%, предпочтительно не менее 90%, более предпочтительно не менее 95%, особенно предпочтительно не менее 97%, гибридизуются друг с другом, и ДНК, имеющие гомологию ниже вышеупомянутого уровня, не гибридизуются друг с другом, и следующие условия промывания при общепринятой Саузерн-гибридизации, а именно условие однократного промывания, предпочтительно промывание два раза или три раза, при солевой концентрации и температуре 1 × раствор цитрата и хлорида натрия (SSC), 0,1% додецилсульфата натрия (SDS) при 60°C, предпочтительно 0,1×SSC, 0,1% SDS при 60°C, более предпочтительно 0,1×SSC, 0,1% SDS при 68°C.

В качестве зонда также можно использовать часть комплиментарной последовательности из последовательности SEQ ID No: 1. Такой зонд можно изготовить посредством ПЦР с использованием олигонуклеотидов, изготовленных на основе комплиментарной последовательности SEQ ID No: 1 в качестве праймеров, и фрагмента ДНК, содержащего в качестве матрицы упомянутую нуклеотидную последовательность. Например, при использовании в качестве зонда фрагмента ДНК, имеющего длину около 300 пар нуклеотидов (п.н.), примером условия промывания после гибридизации может быть 2×SSC, 0,1% SDS при 50°C.

Для увеличения экспрессии одного или больше гена gltP и/или гена gltS можно осуществлять модификацию путем увеличения числа копий гена в клетках, например, посредством способов рекомбинации генов. Например, можно увеличивать число копий гена путем лигирования фрагмента ДНК, содержащего ген gltP и/или ген gltS вектор, который функционирует у бактерии-хозяина, предпочтительно, многокопийный вектор, изготовления рекомбинантной ДНК, и введения ее в бактерию для ее трансформации.

При использовании гена gltP Escherichia coli в качестве гена gltP его можно получать посредством ПЦР (полимеразной цепной реакции, см. публикацию White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)), с использованием праймеров, изготовленных на основе нуклеотидной последовательности SEQ ID No: 1, например, праймеров, показанных в SEQ ID No: 8 и 9, и геномной ДНК Escherichia coli в качестве матрицы. Гены gltP, полученные из других бактерий семейства Enterobacteriaceae, также можно получать из геномной ДНК каждого микроорганизма или геномной библиотеки ДНК с помощью ПЦР, в качестве праймеров, олигонуклеотиды, изготовленные на основе гена gltP, известном для упомянутой бактерии или бактерии другого вида, или с помощью информации об аминокислотной последовательности белка, кодируемого геном gltP, или путем гибридизации с использованием олигонуклеотида, изготовленного на основе такой информации о последовательности, как описано выше для зонда. Геномную ДНК можно изготовить из микроорганизма, который служит донором ДНК, например, с помощью способа Saito and Miura (Saito H. and Miura K., Biochem. Biophys. Acta, 72, 619, 1963; Experiment Manual for Biotechnology, edited by The Society for Biotechnology, Japan, pp.97-98, Baifukan Co., Ltd., 1992) или подобное.

Затем для изготовления рекомбинантную ДНК амплифицированный с помощью ПЦР ген gltP и/или ген gltS лигируют с векторной ДНК, которая способна функционировать в клетках бактерии-хозяина. Примеры вектора, способного функционировать в клетках бактерии-хозяина, включают в себя векторы, автономно реплицируемые в клетках бактерии-хозяина. Примеры автономно реплицируемого в клетках Escherichia coli вектора включают в себя pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184 (векторы серии pHSG, и pACYC доступны в фирме Takara Bio Inc), RSF1010, pBR322, pMW219 (pMW219 доступная форма Nippon Gene Co., Ltd)., pSTV29 (доступны в фирме Takara Bio Inc) и т.д.

Для введения в бактерию рекомбинантной ДНК, изготовленной согласно описанию выше, можно применять любой известный способ трансформации. Например, существует способ обработки клеток-реципиентов хлоридом кальция для повышения проницаемости для ДНК, который описан для Escherichia coli K-12 (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), и способ использования компетентных клеток, которые изготовлены из растущих клеток, и введение в них ДНК, который описан для Bacillus subtilis (Duncan, C.H., Wilson, G.A. and Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977)). Также применим способ превращения клеток-реципиентов ДНК в протопласты или сферопласты, которые легко воспринимают рекомбинантную ДНК, и введение в них рекомбинантной ДНК, и указанный способ известен для Bacillus subtilis, актиномицетов и дрожжей (Chang, S. and Choen, S.N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward, J.M. and Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J.B. and Fink, G.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)).

Также можно увеличивать число копий одного или больше гена gltP и/или гена gltS путем интеграции множественных копий одного или больше генов gltP и/или gltS, описанных выше, в геномную ДНК бактерии. Для интеграции множественных копий одного или больше генов gltP и/или gltS в геномную ДНК бактерии проводят гомологичную рекомбинацию путем нацеливания на геномную ДНК последовательности, которая имеется во множественных копиях. В качестве последовательности, присутствующей на геномной ДНК во множественном числе копий, можно использовать повторяющуюся ДНК или инвертированный повтор, находящийся в конце транспозируемого элемента. Ген можно лигировать отдельно от гена gltP и/или гена gltS, которые присутствуют в геноме в тандеме, или ген также можно вводить в лишний ген в геноме таким образом, чтобы присутствие гена было многократным. Такой перенос генов можно осуществлять посредством термочувствительного вектора или интегрирующего вектора.

Альтернативно, как раскрыто в японском опубликованном патенте № 2-109985, также можно вставлять ген gltP и/или ген gltS в транспозон, и создавать возможность его переноса, чтобы ввести множественные копии гена в геномную ДНК. Перенос гена в геном можно подтверждать с помощью Саузерн-гибридизации, используя в качестве зонда часть гена gltP и/или гена gltS.

Кроме того, помимо увеличения числа копий гена, описанного выше, экспрессию гена gltP и/или гена gltS также можно увеличивать согласно способу, описанному в WO 00/18935, путем замены контрольной последовательности экспрессии, такой как промотор гена gltP и/или гена gltS на геномной ДНК или плазмиде, на более сильный промотор, путем модификации последовательности области -35 и области -10 таким образом, чтобы последовательности стали консенсусными последовательностями, путем амплификации регулятора, который увеличивает экспрессию гена gltP и/или гена gltS, или делеции или уменьшения регулятора, который уменьшает экспрессию гена gltP и/или гена gltS. Например, промотор lac, промотор trp, промотор trc, промотор tac, промотор araBA, промотор PR лямбда-фага и промотор МН, промотор tet, промотор T7, промотор Φ10 и другие считаются сильными промоторами. Также можно использовать промотор, происходящий из промотора треонинового оперона E. coli или промотора tac.

Область RBS промотора (последовательность связывания рибосомы) или область SD гена gltP и/или гена gltS также можно модифицировать для усиления путем введения нуклеотидной замены или подобного изменения. Примеры способа для оценки силы промотора и сильных промоторов описаны в публикации Goldstein et al. (Prokaryotic promoters in biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)) и т.д. Дополнительно, известно, что замена нескольких нуклеотидов в спейсере между участком связывания рибосомы (RBS) и стартовым кодоном, в частности, в последовательности непосредственно выше стартового кодона, значительно влияют на эффективность трансляции мРНК, и поэтому эту последовательность можно модифицировать. Области контроля экспрессии гена gltP и/или гена gltS, такие как промотор, могут быть идентифицированы посредством вектора зонда промотора или программного обеспечения генетического анализа, такого как GENETYX. Посредством описанной выше замены или модификации промотора увеличивается экспрессия гена gltP и/или гена gltS. Замену последовательности контроля экспрессии также можно проводить, например, с применением способа с термочувствительной плазмидой или Red-зависимой интеграции (WO 2005/010175).

К вышеупомянутым описаниям гомологов генов и белков и увеличению экспрессии генов также относятся гены, отличные от генов gltP и gltS, например, ген, используемый для наделения способностью продуцировать L-аминокислоту, ген ybjE и продукты их экспрессии.

<2> Способ получения L-аминокислоты

Способ получения L-аминокислоты по настоящему изобретению отличается культивированием бактерий по настоящему изобретению в среде, для выработки и накопления L-аминокислоты, выбираемой из L-лизина, L-треонина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-метионина, L-аланина, L-изолейцина и L-гомосерина в среде, и сбора из среды или из клеток L-аминокислоты.

В качестве используемой среды можно использовать среды, общепринято используемые для получения L-аминокислот путем ферментации с применением бактерий. Таким образом, можно использовать, по необходимости, обычные среды, содержащие источник углерода, источник азота, неорганические ионы и необязательно другие органические компоненты. В качестве источника углерода можно использовать сахариды, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, галактоза, фруктоза, и гидролизаты крахмалов; спирты, такие как глицерин и сорбитол; и органические кислоты, такие как фумаровая кислота, лимонная кислота и янтарная кислота. Особенно предпочтительно использовать в качестве источника углерода глюкозу, фруктозу или сахарозу. Дополнительно, в отношении штамма, не способного ассимилировать сахарозу, становится возможным использование сахарозы как источника углерода, если в такой штамм вводится ген ассимиляции сахарозы (патент США № 5175107). В качестве источника азота можно использовать неорганические соли аммония, такие как сульфат аммония, хлорид аммония и фосфат аммония, органический азот, такие как гидролизат сои и т.д., аммиачный газ, водный аммиак. В отношении источников органических следовых питательных веществ желательно, чтобы среда содержала необходимые вещества, такие как витамин B1 и L-гомосерин, экстракт дрожжей, и т.д. в соответствующем количестве. Кроме вышеупомянутого, по необходимости в небольшом количестве добавляют фосфат калия, сульфат магния, ионы железа, ионы марганца и т.д. Дополнительно, при использовании среды, содержащей источник углерода, источник азота и неорганические ионы, и содержащей другие необходимые органические следовые компоненты, среда, используемая по настоящему изобретению, может быть или средой природного происхождения или синтетической средой.

Кроме того, можно добавлять L-аминокислоту, которая улучшает рост и продуктивность. В случае ферментации L-лизина предпочтительно добавление L-треонина, L-гомосерина и/или L-изолейцина, и в случае ферментации L-треонина предпочтительно добавление L-изолейцина, L-лизина, L-гомосерина и т.д. Концентрация добавления составляет примерно от 0,01 до 10 г/л.

Культивирование предпочтительно проводят в течение от 1 до 7 дней при аэробных условиях. Температура культивирования предпочтительно составляет от 24 до 37°C, и уровень pH во время культивирования предпочтительно составляет от 5 до 9. Для регулирования уровня pH можно использовать неорганические или органические кислые или щелочные вещества, аммиачный газ и т.д. Сбор L-аминокислоты из ферментационной среды обычно можно проводить посредством комбинации известных способов, таких как методика ионообменных смол и методика преципитации. При накоплении в клетках L-аминокислоты можно разрушать клетки, например, сверхзвуковыми волнами или подобным воздействием, и L-аминокислоту можно собирать посредством ионообменных смол или подобным способом из супернатанта, который получают путем удаления клеток центрифугированием из суспензии разрушенных клеток.

При получении основной аминокислоты, такой как L-лизин, производство можно осуществлять способом, при котором проводят ферментацию посредством регулирования уровня pH среды, чтобы уровень pH среды составлял от 6,5 до 9,0 во время культивирования, и в конце культивирования уровень pH среды должен составлять от 7,2 до 9,0, с обеспечением периода культивирования, когда среда включает 20 мМ или больше ионов бикарбоната и/или ионов карбоната, с тем, чтобы упомянутые ионы бикарбоната и/или ионы карбоната служили противоионами основной аминокислоты, и затем собирают рассматриваемую основную аминокислоту (японский опубликованный патент № 2002-65287, опубликованная патентная заявка США № 2002/0025564, европейский опубликованный патент № 1813677).

При культивировании в среде при аэробных условиях микроорганизма, обладающего способностью продуцировать основную аминокислоту, можно использовать ионы карбоната, ионы бикарбоната, или оба вида ионов в качестве главных противоионов основной аминокислоты. Чтобы обеспечить ионы карбоната и/или ионы бикарбоната в количестве, необходимом, чтобы служить противоионами основной аминокислоты, известно, что можно регулировать уровень pH среды, чтобы он составлял во время культивирования от 6,5 до 9,0, предпочтительно, от 6,5 до 8,0, и можно его регулировать, чтобы в конце культивирования он составлял от 7,2 до 9,0, и можно регулировать давление в ферментационном чане таким образом, чтобы оно было положительным во время ферментации, или в среду можно доставлять углекислый газ или смесь газов, содержащую углекислый газ (японский опубликованный патент № 2002-65287, опубликованная патентная заявка США № 2002/0025564, европейский опубликованный патент № 1813677).

Согласно настоящему изобретению, можно регулировать давление в ферментационном чане, чтобы оно было положительным во время ферментации, и в то же время среду можно доставлять углекислый газ или смешанный газ, содержащий углекислый газ. Обе вышеупомянутые операции предпочтительно проводят в такой период культивирования, когда в среде присутствуют ионы бикарбоната и/или ионы карбоната в количестве предпочтительно 20 мМ или больше, более предпочтительно 30 мМ или больше, особенно предпочтительно 40 мМ или больше. Можно определять внутреннее давление в ферментационном чане, количество вводимого углекислого газа или смешанного газа, содержащего углекислый газ, или предельный объем вводимого газа, например, путем измерения количества ионов бикарбоната или ионов карбоната в среде, или уровня pH, или концентрации аммиака в среде.

В вышеупомянутом варианте осуществления уровень pH среды регулируют таким образом, чтобы во время культивирования он составлял от 6,0 до 9,0, предпочтительно от 6,5 до 8,0, и в конце культивирования от 7,2 до 9,0. Согласно вышеупомянутому варианту осуществления, уровень pH среды может быть снижен по сравнению с общепринятыми способами, при обеспечении наличия ионов бикарбоната и/или ионов карбоната в количестве, необходимом в качестве противоионов. Если уровень pH регулируют аммиаком, при повышении уровня pH вводят аммиак, и он может служить источником азота для основной аминокислоты. Примеры катионов, отличных от основной аминокислоты в среде, включают в себя K, Na, Mg, Ca и т.д., источником которых служат компоненты среды. Они предпочтительно присутствуют в количестве 50% или меньше от общего количества катионов.

Кроме того, можно создавать положительное внутреннее давление в ферментационном чане во время ферментации, например, посредством более высокого давления вводимого газа, превышающего давление на выходе. При создании положительного внутреннего давления в ферментационном чане углекислый газ, произведенный путем ферментации, разлагается в культуральной среде с получением ионов бикарбоната или ионов карбоната, и они могут служить противоионами основной аминокислоты. Конкретно, внутреннее давление ферментационного чана составляет от 0,03 до 0,2 МПа, предпочтительно от 0,05 до 0,15 МПа, более предпочтительно от 0,1 до 0,3 МПа, по манометрическому давлению (разница в давлении относительно атмосферного давления). Кроме того, при введении в культуральную среду углекислого газа или смешанного газа, содержащего углекислый газ, в среде углекислый газ может растворяться. Кроме того, введение в среду углекислого газа или смешанного газа, содержащего углекислый газ, можно регулировать до положительного внутреннего давления в ферментационном чане.

Внутреннее давление в ферментационном чане можно регулировать до положительного, например, создавая более высокое давление вводимого газа, превышающее давление на выходе. Кроме того, при введении в среду углекислого газа, например, чистого углекислого газа или смешанного газа, содержащего 5% объема или больше углекислого газа, он может барботировать в среде.

Вышеупомянутые способы растворения в среде ионов бикарбоната и/или ионов карбоната можно применять по отдельности, или два или больше из них можно применять в комбинации.

Согласно общепринятым способам, в среду обычно добавляют достаточное количество сульфата аммония или хлорида аммония, чтобы они служили противоанионами для продуцируемой основной аминокислоты. Также в среду добавляют продукты расщепления белков посредством серной кислоты или соляной кислоты и т.д. в качестве питательного компонента, и таким образом в среде присутствуют продуцируемые ими ионы сульфата и ионы хлорида. Поэтому концентрация слабокислых ионов карбоната является чрезвычайно низкой во время культивирования, а именно составляет порядка мкг/г. Вышеупомянутый вариант осуществления по настоящему изобретению отличается тем, что количество этих ионов сульфата и ионов хлорида уменьшено, и углекислый газ, высвобождаемый микроорганизмом во время ферментации, разлагается в вышеупомянутой среде ферментации и используется в виде противоионов. Поэтому в вышеупомянутом варианте осуществления по настоящему изобретению необязательно добавлять ионы сульфата или ионы хлорида в среду в большем количестве, чем это необходимо для роста. Соответствующее количество сульфата аммония или подобного соединения предпочтительно добавляют в среду на ранней стадии культивирования, и добавление завершают в середине культивирования. Альтернативно, можно добавлять сульфат аммония или подобное соединение при сохранении равновесия с растворенными в среде ионами карбоната или ионами бикарбоната. Кроме того, в среду можно добавлять аммиак в качестве источника азота основной аминокислоты. Аммиак можно вводить в среду независимо, или вместе с другими газами.

Наиболее предпочтительны более низкие концентрации в среде других анионов, отличных от ионов бикарбоната и/или ионов карбоната, если они присутствуют в количестве, необходимом для роста микроорганизмов. Примеры таких анионов включают в себя ионы хлорида, ионы сульфата, ионы фосфата, ионизированные органические кислоты, гидроксид-ионы и т.д. Общая молярная концентрация упомянутых других ионов обычно предпочтительно составляет 900 мМ или ниже, более предпочтительно 700 мМ или ниже, еще более предпочтительно 500 мМ или ниже, наиболее предпочтительно 300 мМ или ниже, особенно предпочтительно 200 мМ или ниже.

Уменьшение необходимого количества ионов сульфата и/или ионов хлорида представляет собой одну из задач вышеупомянутого варианта осуществления по настоящему изобретению, и общее количество ионов сульфата или ионов хлорида, или общее содержение в среде обычно составляет 700 мМ или ниже, предпочтительно 500 мМ или ниже, более предпочтительно 300 мМ или ниже, еще более предпочтительно 200 мМ или ниже, особенно предпочтительно 100 мМ или ниже.

Если в среду добавляют сульфат аммония в качестве источника противоиона основной аминокислоты, углекислый газ в культуральной среде обычно удаляют посредством ионов сульфата. Вместе с тем, в вышеупомянутом варианте осуществления по настоящему изобретению не является необходимым добавление в среду лишнего количества сульфата аммония, и поэтому углекислый газ может легко разлагаться в ферментационой среде.

Кроме того, в вышеупомянутом варианте осуществления по настоящему изобретению предпочтительно регулировать общую концентрацию аммиака в среде до такой степени, чтобы "не ингибировать получение основной аминокислоты". Примеры условий достижения такого состояния включают в себя, например, условия, дающие выход и/или продуктивность, соответствующую предпочтительно 50% или больше, более предпочтительно 70% или больше, особенно предпочтительно 90% или больше, от выхода и/или продуктивности, достигаемой при производстве основной аминокислоты при оптимальных условиях. Более конкретно, общая концентрация аммиака в среде предпочтительно составляет 300 мМ или ниже, более предпочтительно 250 мМ или ниже, особенно предпочтительно 200 мМ или ниже. Степень диссоциации аммиака уменьшается с повышением уровня pH. Недиссоциированный аммиак более токсичен для бактерий по сравнению с ионами аммония. Поэтому верхняя граница общей концентрации аммиака должна определяться также в зависимости от уровня pH культуральной среды. Таким образом, с повышением уровня pH культуральной среды происходит уменьшение приемлемой общей концентрации аммиака. Поэтому вышеупомянутую общую концентрацию аммиака, "которая не ингибирует получение основной аминокислоты", предпочтительно определяют для каждого конкретного значения уровня pH. При этом диапазон общей концентрации аммиака, который является приемлемым при самом высоком уровне pH во время культивирования, может использоваться как верхняя граница общей концентрации аммиака на протяжении всего периода культивирования.

С другой стороны, общая концентрация аммиака, который действует как источник азота, необходимый для роста микроорганизма и выработки основного вещества, не имеет конкретных ограничений, и соответственно, ее можно определять до уровня уменьшения содержания источника азота, который может приводить к постоянной нехватке аммиака во время культивирования, до уменьшения продуктивности микроорганизма по выработке рассматриваемого вещества. Например, можно измерять концентрацию аммиака в течение продолжительного времени во время культивирования, и если аммиак в среде закончился, то небольшое количество аммиака можно добавлять в среду. Общая концентрация аммиака после его добавления не имеет конкретных ограничений, вместе с тем, общая концентрация аммиака, например, может составлять предпочтительно 1 мМ или выше, более предпочтительно 10 мМ или выше, особенно предпочтительно 20 мМ или выше.

Среда, используемая в настоящем изобретении, может быть любой средой, если она включает в качестве источников питания источник углерода и источник азота. Для способа по настоящему изобретению можно применять любую методику периодической культуры, культуры с подпиткой и непрерывной культуры.

Вышеупомянутая культура с подпиткой относится к способу культуры с подпитыванием среды непрерывно или периодически в сосуде при культивировании и до завершения культивирования среду из сосуда не извлекают. Непрерывная культура относится к способу непрерывного или периодического подпитывания среды в сосуде во время культивирования и к удалению среды из сосуда при культивировании (обычно в количестве, эквивалентном количеству подпиточной среды). В настоящем описании термин "стартовая среда" означает среду, используемую для периодического культивирования перед подачей питательной среды в культуру с подпиткой или в непрерывную культуру, и термин "подпиточная среда" означает среду, вводимую в ферментер при проведении культивирования с подпиткой или при непрерывном культивировании. Подпиточная среда может содержать все компоненты или часть компонентов, необходимых для роста микроорганизма. В настоящем описании термин "ферментационная среда" означает среду, содержащуюся в ферментере, и из этой ферментационной среды собирают рассматриваемое вещество. Кроме того, в настоящем описании термин “ферментер” означает сосуд, в котором осуществляют получение аминокислоты, и его форма не ограничена. Можно использовать ферментационный чан или флягу для ферментации. Кроме того, объем ферментера не ограничен при условии возможности получения и сбора рассматриваемого вещества.

В качестве источника углерода, содержащегося в среде, которую используют в настоящем изобретении, можно применять сахариды, такие как глюкоза, глицерин, фруктоза, сахароза, мальтоза, манноза, галактоза, гидролизат крахмала и патока, и особенно предпочтительными являются глюкоза и сахароза. Дополнительно, также можно использовать органические кислоты, такие как уксусная кислота и лимонная кислота, и спирты, такие как этанол и метанол, по отдельности или в комбинации с другими источниками углерода. Кроме того, в качестве исходного сырья источника углерода можно использовать тростниково-сахарную патоку, свекольную патоку, высококачественную патоку, патоку цитрусовых и инвертный сахар, и также можно использовать гидролизаты природного сырья, такие как целлюлоза, крахмал, зерно, злаки и тапиоку. Кроме того, в качестве источника углерода также можно использовать углекислый газ, растворяемый в культуральной среде. Эти источники углерода можно использовать в стартовой среде и в подпиточной среде. Среда может содержать один или два или больше видов таких источников углерода. Кроме того, для стартовой среды и подпиточной среды можно использовать один и тот же источник углерода, или источник углерода в подпиточной среде может отличаться от источника в стартовой среде. Например, можно использовать глюкозу как источник углерода, тогда как сахарозу можно использовать в качестве источника углерода в подпиточной среде.

В качестве источника азота, который включается в среде по настоящему изобретению, можно использовать аммиак, соли аммония, такие как сульфат аммония, карбонат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, ацетат аммония и мочевину, нитраты и т.д. Аммиачный газ и водный аммиак, используемые для регулирования уровня pH, также можно использовать как источник азота. Кроме того, также можно использовать пептон, экстракт дрожжей, мясной экстракт, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, гидролизат сои и т.д. Среда может включать один или два или больше видов таких источников азота. Эти источники азота могут использоваться и для стартовой среды и для подпиточной среды. Кроме того, один и тот же источник азота можно использовать и для стартовой среды и для подпиточной среды, или источник азота для подпиточной среды может отличаться от источника для стартовой среды.

Кроме того, среда по настоящему изобретению в дополнение к источнику углерода предпочтительно включает источник фосфора и источник азота. В качестве источника фосфора можно использовать калий дигидрофосфат, дикалий гидрофосфат и т.д., полимеры фосфорной кислоты, такие как пирофосфорная кислота.

Кроме того, в дополнение к источнику углерода и источнику азота, среда по настоящему изобретению может включать фактор, способствующий росту (питательное вещество, проявляющее эффект стимуляции роста). В качестве фактора, способствующего росту, можно использовать следовые металлы, аминокислоты, витамины, жирные кислоты, нуклеиновые кислоты, а также пептон, казаминовую кислоту, экстракт дрожжей, можно использовать продукт расщепления соевого белка и т.д., содержащий вышеуказанные вещества. В частности, в случае ароматических аминокислот и аминокислот с разветвленной цепью, существуют общепринятые системы биосинтеза, и поэтому можно аттенуировать биосинтез аминокислоты, отличной от рассматриваемой аминокислоты микроорганизма, как описано ниже. В таком случае предпочтительно добавление аминокислоты, в которой аттенуирована система биосинтеза в среде. Например, если расматриваемой аминокислотой является L-лизин, такая аминокислота представляет собой L-метионин, L-треонин, или L-изолейцин.

Примеры следовых металлов включают в себя железо, марганец, магний, кальций и т.д. Примеры витаминов включают в себя витамин B1, витамин B2, витамин B6, никотиновую кислоту, амид никотиновой кислоты, витамин B12, пиридоксин, пантотеновую кислоту и т.д. Указанные факторы, способствующие росту, могут включаются или в стартовой среде или в подпиточной среде.

Кроме того, при использовании ауксотрофного мутантного штамма, который нуждается в аминокислоте или в подобном веществе для его роста, предпочтительно добавлять необходимое питательное вещество к среде, используемой в настоящем изобретении. В частности, поскольку у бактерий, продуцирующих L-аминокислоты, пригодные к употреблению для по настоящему изобретению, часто усилен путь биосинтеза L-аминокислоты, и часто аттенуирована способность к расщеплению L-аминокислоты, как описано ниже, желательно добавлять один или больше типов веществ, выбираемых из L-лизина, L-гомосерина, L-изолейцина и L-метионина. Аналогично, предпочтительно добавлять необходимое вещество в среду для бактерий, продуцирующих нуклеиновую кислоту.

Стартовая среда и подпиточная среда могут иметь аналогичный или разный состав среды. Кроме того, если стартовая среда и подпиточная среда включают затравочные кристаллы, концентрация затравочных кристаллов может быть одинаковой или разной. Кроме того, если подпиточная среда подается на многих этапах, композиция подпиточной среды может быть одинаковой или разной.

Культивирование предпочтительно проводят в условиях аэрации при температуре ферментации от 20 до 45°C, особенно предпочтительно от 30 до 42°C.

Сбор L-аминокислоты из среды после культивирования можно проводить посредством комбинации известных способов сбора, например посредством ионообменных смол, способа преципитации и других известных способов. При накоплении в среде L-аминокислоты ее можно собирать центрифугированием или фильтрацией. Кроме того, при накоплении L-аминокислоты в среде растворенная в среде L-аминокислота может кристаллизовываться, и затем можно вместе выделять накопленную L-аминокислоту и кристаллы.

В настоящем изобретении культивирование микроорганизмов можно проводить с посевом культуры и в основной культуре, чтобы обеспечить накопление L-аминокислоты выше определенного уровня. Посев культуры можно осуществлять с культивированием на шейкере, используя флаконы, или подобное, или периодическое культивирование и основное культивирование можно осуществлять в виде культуры с подпиткой, периодической культуры или непрерывной культуры. Альтернативно, и посев культуры и основное культивирование можно проводить в виде периодической культуры. Кроме того, можно проводить предварительное культивирование однократно, или два раза, или больше перед посевом культуры и основным культивированием, при постепенном увеличением масштаба культуры в ходе таких культивирований.

Согласно упомянутым способам культивирования, при достижении намеченного уровня концентрации L-аминокислоты можно удалять часть L-аминокислоты, и можно добавлять свежую среду для возобновления культивирования. В качестве подпиточной свежей среды предпочтительной является среда, содержащая источник углерода и питательное вещество, обладающее эффектом стимуляции роста (фактор, способствующий росту). В качестве источника углерода подпиточной свежей среды предпочтительны глюкоза, сахароза и фруктоза. В качестве фактора, способствующего росту, предпочтительными являются источники азота, фосфорная кислота, аминокислоты и т.д. В качестве источника азота можно использовать аммиак, соли аммония, такие как сульфат аммония, карбонат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, ацетат аммония и мочевину, нитраты и т.д. Кроме того, в качестве источника фосфорной кислоты можно использовать калия дигидрофосфат и дикалия гидрофосфат. В отношении аминокислот, при использовании ауксотрофного мутантного штамм, предпочтительно для добавок использовать необходимое питательное вещество.

При культивировании с подпиткой или в непрерывной культуре согласно настоящему изобретению можно периодически подавать подпиточную среду таким образом, чтобы временно останавливать введение сахарида или питательных веществ. Введение подпиточной среды предпочтительно останавливают максимум на 30% или меньше, желательно на 20% или меньше, особенно желательно на 10% или меньше от времени подпитки. При периодическом введении подпиточной среды вначале можно добавлять подпиточную среду в течение заданного времени, и второе и последующие добавления можно регулировать таким образом, чтобы их начинать при компьютерном обнаружении повышения уровня pH или повышения концентрации растворенного кислорода при истощении источника углерода в среде ферментации во время периода добавления-остановки перед конкретным этапом добавления среды, и, таким образом, концентрация субстрата в культуральном чане всегда автоматически поддерживается на низком уровне (патент США № 5912113). Источник углерода в подпиточной среде аналогичен описанному выше. Кроме того, подпиточная среда может состоять из одного типа среды, или из смеси двух или больше типов среды. Если используются два или больше типов подпиточной среды, среды можно смешивать и вводить посредством одной фляги для подпитки, или они могут подпитываться с использованием двух или больше фляг для подпитки.

При культивировании с подпиткой подпиточную среду предпочтительно подают при введении сахарида в таком количестве, чтобы количество источника углерода в подпиточной среде или во всей среде ферментации не превышало 30 г/л, и его предпочтительно регулируют до 20 г/л или ниже, более предпочтительно 10 г/л или ниже. В частности, концентрацию сахарида предпочтительно регулируют так, чтобы в конце логарифмической стадии пролиферации микроорганизмов и после нее указанная концентрация находилась в вышеупомянутом диапазоне. Скорость подачи источника углерода можно регулировать посредством способа, описанного в патенте США № 5912113. Кроме того, сахарид и фосфорную кислоту предпочтительно подают в таких концентрациях, что сахарид и фосфорная кислота служат лимитирующими факторами роста бактериальных клеток. Фосфорная кислота может присутствовать в подпиточной среде в количестве 2 или ниже, предпочтительно 1,5 или ниже, более предпочтительно 1 или ниже, при этом указанное количество выражено как соотношение фосфор / углерод (P/C) (см. патент США № 5763230).

При использовании в настоящем изобретении способа непрерывной культуры среду можно удалять и подавать одновременно, или можно удалять часть среды, и затем среду можно подпитывать. Кроме того, способом также может быть способ непрерывной культуры, включающий в себя рециркуляцию клеток, при котором удаляется культуральная среда, содержащая L-аминокислоту и бактериальные клетки, и в ферментер возвращаются только клетки (см. французский патент № 2669935). В качестве способа непрерывного или периодического подпитывания питательным источником применяют тот же способ, что и в культуре с подпиткой.

При периодическом удалении культуральной среды часть L-аминокислот удаляется при достижении заданного уровня концентрации L-аминокислоты, и подается новая среда для продолжения культивирования. Кроме того, культивирование предпочтительно проводят таким образом, чтобы заключительный объем среды после добавления среды был равен объему культуральной среды перед удалением. Термин "равный" означает, что объем среды после добавления среды соответствует примерно 93-107% объема среды перед удалением.

При непрерывном удалении культуральной среды удаление желательно начинают одновременно или после подачи питательной среды. Например, в течение 5 часов, желательно, 3 часов, более желательно, в течение максимум 1 часа после начала подпитки можно начинать удаление. Кроме того, объем удаляемой культуральной среды предпочтительно равен объему подпиточной среды.

Способ непрерывной культуры, включающий в себя рециркуляцию бактериальных клеток, представляет собой способ с периодическим или непрерывным удалением ферментационной среды при достижении заданного уровня концентрации L-аминокислоты, с удалением только L-аминокислоты, и рециркуляцией фильтрационого осадка, содержащего бактериальные клетки или центрифугированием супернатанта в ферментационый чан, и его можно осуществлять, например, со ссылкой на французский патент № 2669935.

Ферментационный бульон, содержащий основную аминокислоту, полученную согласно настоящему изобретению, предпочтительно включает ионы карбоната и/или ионы бикарбоната так, чтобы отношение нормальности, представленное следующим уравнением, составляло от 5 до 100%.

Отношение нормальности = (нормальность ионов бикарбоната и/или ионов карбоната) / (нормальность катионов, главным образом состоящих из основной аминокислоты) × 100

Высвобождение ионов карбоната и ионов бикарбоната в среде происходит после нагревания углекислого газа, и таким образом, увеличивается содержание основной аминокислоты в твердом содержимом ферментационного бульона. Кроме того, поскольку карбонаты можно легко заменить более сильной кислотой, чем угольная кислота, можно выбирать разные формы солей при добавлении указанной кислоты в ферментационный бульон.

ПРИМЕРЫ

Далее приведено более конкретное объяснение по настоящему изобретению со ссылкой на примеры.

Пример 1: Конструирование плазмиды для усиления гена gltP или гена gltS

В настоящее врямя определена полная нуклеотидная последовательность генома (Escherichia coli K-12 штамм) (№ доступа в Genbank U00096, Scitnce, 277, 1453-1474 (1997)). Для амплификации рассматриваемых генов использовали плазмидный вектор pMW118 (Nippopn Gene). Указанная плазмида имеет мультиклонирующий участок для клонирования произвольных генов, и позволяет клонировать ген, задействуя указанный участок и амплификацию гена.

На основе нуклеотидной последовательности гена gltP или gltS в геномной последовательности Escherichia coli и их фланкирующих областей, для амплификации gltP синтезировали синтетический олигонуклеотид, показанный в SEQ ID No: 8 как 5' праймер и синтетический олигонуклеотид, показанный в SEQ ID No: 9 как 3' праймер, и соответственно, для амплификации gltS синтезировали синтетический олигонуклеотид, показанный в SEQ ID No: 10 как 5' праймер и синтетический олигонуклеотид, показанный в SEQ ID No: 11 как 3' праймер. Посредством указанных праймеров проводили ПЦР с геномной ДНК штамма K-12 МГ1655 Escherichia coli в качестве матрицы, чтобы получить генные фрагменты, содержащие гены gltP и gltS, соответственно. Очищенные продукты ПЦР имели тупые концы и лигировались с вектором pMW118, расщеплялись SmaI, чтобы сконструировать плазмиду pMW-gltP для амплификации gltP и плазмиду pMW-gltS для амплификации gltS.

Пример 2: Усиление гена ybjE штамма WC196ΔcadAΔldcC

В качестве родительского штамма L-лизин-продуцирующих бактерий использовали штамм Escherichia coli WC196ΔcadAΔldcC, описанный в Международной патентной публикации WO 2006/078039. Указанный штамм соответствует штамму Escherichia coli WC196, в котором разорваны гены лисиндекарбоксилазы cadA и ldcC посредством Red-зависимой интеграции (Datsenko, K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci USA. 97:6640-6645 (2000)), и система вырезания происходит от λ-фага (J. Bacteriol., 184:5200-5203 (2002)) в комбинации. Указанный штамм был депонирован в независимом административном агентстве Национальный институт National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Международный патентный депозитарий организмов, Tsukuba-Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Япония) 7 октября 2008 года под инвентарным номером FERM BP-11027.

Известно, что способность продуцировать L-лизин улучшается путем повышения активности белка YbjE, обладающего активностью экскреции L-лизина (опубликованная патентная заявка США № 2006/0019355). Поэтому увеличивали экспрессию гена ybjE в штамме WC196ΔcadAΔldcC путем модификации промотора гена ybjE на хромосоме штамма WC196ΔcadAΔldcC в tac промотора, и путем модификации его же участка связывания рибосомы (RBS) в последовательность, полученную из расположенной выше последовательности гена lac, соответственно.

Модификация промотора гена ybjE и последовательности RBS штамма WC196ΔcadAΔldcC была достигнута вышеупомянутым способом, используя Red-зависимую интеграцию и систему вырезания, происходящую из λ-фага, в комбинации. Более конкретно, последовательность 157 пн выше от стартового кодона (нуклеотид, номера от 49 до 51) гена ybjE (SEQ ID No: 5), заменяли на последовательность SEQ ID No: 7. Штамм, в котором осуществляли заданную замену генов, можно выбирать на основе показателя резистентности к канамицину. С помощь ПЦР подтверждали осуществление заданной замены генов в штамме кандидата. Полученный штамм, в котором были модифицированы промотор гена ybjE и последовательности RBS, получил наименование штамм WC196LCY.

Пример 3: Эффект амплификации генов gltP и gltS в штамме L-лизин-продуцирующих бактерии Escherichia

<3-1> Введение плазмиды для продукции лизина в штамм WC196LCY

Штамм WC196LCY был трансформирован плазмидой pCABD2 для продукции лизина (европейский патент № 0733710), несущей гены dapA, dapB и lysC, общепринятым способом для получения штамма WC196LCY/pCABD2. Плазмида pCABD2 включает ДНК, кодирующую дигидропиколинатсинтазу (DDPS) Escherichia coli с мутацией для десенситизации к ингибированию L-лизином по типу обратной связи, ДНК, кодирующую аспартокиназу III из Escherichia с мутацией для десенситизации к ингибированию L-лизином по типу обратной связи, ДНК, кодирующую дигидропиколинатредуктазу Escherichia coli, и ДНК, кодирующую диаминопимелатдегидрогеназу Brevibacterium lactofermentum.

Штамм WC196LCY/pCABD2 трансформирован с плазмидой pMW-gltP для амплификации gltP и плазмидой pMW-gltS для амплификации gltS, которые были получены в примере 1, соответственно, для получения ампициллин-резистентных штаммов. Подтверждали введение заданной плазмиды в каждый трансформант, и затем штамм с введенной плазмидой pMW-gltP для амплификации gltP обозначали как штамм WC196LCY/pCABD2/pMW-gltP, и штамм с введенной плазмидой pMW-gltS для амплификации gltS обозначали как штамм WC196LCY/pCABD2/pMW-gltS. Кроме того, в качестве контроля изготовляли штамм, трансформированный с pMW118, и обозначали его как штамм WC196LCY/pCABD2/pMW118.

Каждый из штаммов, полученных согласно описанию выше, культивировали при 37°C в среде LB, содержащей 25 мг/л стрептомицина и 100 мг/л ампициллина, до достижения OD₆₀₀ культуры примерно 0,6, затем в культуру добавляли равный объем 40% раствора глицерина, смесь перемешивали, разделяли на подходящие объемы и сохраняли при -80°C как стоковый раствор глицерина.

<3-2> лизин-продуцирующая культура

Вышеупомянутые стоковые растворы глицерина оттаивали и равномерно вносили в объеме 500 мкл каждого в L-планшет, содержащий 25 мг/л стрептомицина и 100 мг/л ампициллина, и проводили культивирование при 37°C в течение 24 часов. Клетки в количестве около 1/8 клеток, полученных на одной планшете, инокулировали в 20 мл ферментационной среды, описанной ниже, содержащей 25 мг/л стрептомицина и 100 мг/л ампициллина, которую помещали во флаконы Sakaguchi объемом 500 мл, и культивировали при 37°C в течение 22 часов на культуральном шейкере с возвратно-поступательным. После культивирования накопленное в среде количество L-лизина и L-глутаминовой кислоты измеряли в анализаторе Biotec AS210 (SAKURA SEIKI). Ниже показана композиция среды, используемой для культивирования.

Среда для получения L-лизина

Глюкоза - 40 г/л

(NH₄)₂SO₄ - 24 г/л

KH₂PO₄ - 1,0 г/л

MgSO₄•7H₂O - 1,0 г/л

FeSO₄•7H₂O - 0,01 г/л

MnSO₄•7H₂O - 0,08 г/л

Экстракт дрожжей - 2,0 г/л

L-изолейцин - 0,1 г/л

NaCl - 1,0 г/л

CaCO₃ - 50 г/л

(Японская Фармакопея)

Уровень pH среды регулировали до 7,0 с KOH, и автоклавировали при 115°C в течение 10 минут, за исключением глюкозы и MgSO₄•7H₂O смешиваемых и автоклавированных отдельно от других компонентов. После стерилизации горячим воздухом добавляли CaCO₃.

Выход L-лизина и концентрации L-глутаминовой кислоты, наблюдаемые после 22 часов культивирования, показаны в таблице 3 с относительными значениями, основанными на значениях, полученных для WC196LCY/pCABD2/pMW118 в качестве контроля, которые принимались за 100.

Таблица 3
Эффект амплификации gltP или gltS в L-лизин-продуцирующих бактериях, WC196LCY/pCABD2
Штамм	Выход L-лизина (относительное значение)	Концентрация L-глутаминовой кислоты (относительное значение)
WC196LCY/pCABD2/pMW118	100	100
WC196LCY/pCABD2/pMW-gltP	99	47
WC196LCY/pCABD2/pMW-gltS	100	55

В штамме WC196LCY/pCABD2/pMW-gltP с амплифицированным геном gltP и штамме WC196LCY/pCABD2/pMW-gltS с амплифицированным геном gltS побочно продуцируемое количество L-глутаминовой кислоты уменьшилось по сравнению с количеством в штамме WC196LC/pCABD2/pMW118 в качестве контроля, без снижения выхода L-лизина.

Пример 4: Эффект амплификации гена gltP или gltS в штамме L-треонин-продуцирующих бактерий Escherichia

В качестве L-треонин-продуцирующего штамма использовали штамм ВКПМ B-3996 Escherichia coli (см. патент США № 5175107).

Штамм B-3996 был трансформирован с каждой плазмидой pMW-gltP для амплификации gltP, и с плазмидой pMW-gltS для амплификации gltS, полученных в примере 1, для получения ампициллин-резистентных штаммов. После подтверждения введения заданной плазмиды в каждый трансформант штамм с введенной плазмидой pMW-gltP для амплификации gltP обозначали как штамм B-3996/pMW-gltP, и штамм с введенной плазмидой pMW-gltS для амплификации gltS обозначали как штамм B-3996/pMW-gltS. Кроме того, в качестве контроля изготовляли штамм, трансформированный с pMW118, и обозначали его как штамм B-3996/pMW118.

Каждый из штаммов, полученных согласно описанию выше, культивировали при 37°C в среде LB, содержащей 100 мг/л ампициллина и 20 мг/л стрептомицина, до достижения OD₆₀₀ культуры примерно 0,6, затем в культуру добавляли равный объем 40% раствора глицерина, смесь перемешивали, разделяли на подходящие объемы и сохраняли при -80°C как стоковый раствор глицерина.

Вышеупомянутые стоковые растворы глицерина оттаивали и равномерно вносили в объеме 150 мкл каждого в L-планшет, содержащий 100 мг/л ампициллина и 20 мг/л стрептомицина сульфата, и проводили культивирование при 37°C в течение 24 часов. Клетки в количестве около 1/10 клеток, полученных на одной планшете, инокулировали в 50 мл среды LB, содержащей 100 мг/л ампициллина и 20 мг/л стрептомицина сульфата, которую помещали во флаконы с перегородками объемом и культивировали при 40°C в течение 4 часов при 144 оборотах в минуту как культуру посева.

После завершения культивирования посева в 300 мл главной культуральной среды, описанной ниже, помещенной в ферментационную флягу объемом 1 л, среду из культуры посева инокулировали в объеме 30 мл, что соответствовало 10% объема главной культуральной среды, и проводили культивирование при 40°C и уровне pH 7,0.

Состав главной культуральной среды

Глюкоза - 100 г/л

Экстракт дрожжей - 1,8 г/л

KH₂PO₄ - 1,0 г/л

NaCl - 0,6 г/л

MgSO₄•7H₂O - 0,36 г/л

FeSO₄•7H₂O - 18 мг/л

MnSO₄•7H₂O - 18 мг/л

Стрептомицина сульфат - 20 мг/л

Ампициллин - 100 мг/л

Глюкозу и MgSO₄•7H₂O смешивали и стерилизовали отдельно от других компонентов.

Уровень pH среды регулировали до 7,0 добавлением аммиачного газа.

После культивирования, которое проводили в течение 15,5 часов накопленную в среде концентрацию L-треонина измеряли посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии ВЭЖХ. Кроме того, количество L-глутаминовой кислоты измеряли в анализаторе Biotec AS210 (SAKURA SEIKI). Выход L-треонина и концентрации L-глутаминовой кислоты показаны в таблице 4 с относительными значениями, основанными на контрольных значениях, полученных для B-3996/pMW118, которые приняты за 100.

Таблица 4
Эффект амплификации gltP или gltS в L-треонин-продуцирующих бактериях B-3996
Штамм	Выход L-треонина (относительное значение)	Концентрация L-глутаминовой кислоты (относительное значение)
B-3996/pMW118	100,0	100,0
B-3996/pMW-gltP	103,0	13,4
B-3996/pMW-gltS	99,4	13,4

В штамме 3996/pMW-glt с амплифицированным геном gltP и штамме B-P B-3996/pMW-gltS с амплифицированным геном gltS побочно продуцируемое количество L-глутаминовой кислоты уменьшилось по сравнению с количеством в штамме B-3996/pMW118 в качестве контроля, без снижения выхода L-треонина.

Пример 5: Сравнение эффекта амплификации гена gltP или gltS и эффекта амплификации гена gadC в штамме L-треонин-продуцирующих бактерий Escherichia

Из предшествующих данных относительно способа получения L-аминокислоты с амплификацией белка, обладающего активностью L-глутаматного транспортера, известно, что путем одновременной амплификации gadC, кодирующего белок, который обладает антипортерной активностью L-глутамат/GABA, и gadB, кодирующего белок, который обладает активностью Gluтаматдекарбоксилазы, улучшается продуктивность L-лизина, L-треонина и L-триптофана, (WO 2008/044453). В этой связи сравнивали эффект снижения побочной продукции Gluтаминовой кислоты от амплификации gltP или gltS с эффектом амплификции gadC.

С задачей конструирования плазмиды для амплификации gadC использовали плазмиду pMWPtrp, описанную в WO 2008/044453. Эта плазмида соответствует вектору pMW118 (Nippon Gene), несущему область промотора треонинового оперона (ТреABC) на геноме Escherichia coli между участком HindIII и участком XbaI, и указанная плазмида позволяет амплифицировать ген путем вставки гена ниже от промотора.

На основе нуклеотидной последовательности гена gadC в геномной последовательности Escherichia coli и его фланкирующих областей, изготовляли синтетический олигонуклеотид, показанный в SEQ ID No: 14 как 5' праймер и синтетический олигонуклеотид, показанный в SEQ ID No: 15 как 3' праймер и их использовали с геномной ДНК штамма K-12 W3110 Escherichia coli в качестве матрицы для проведения ПЦР, и таким образом получали генный фрагмент, содержащий ген gadC. Очищенный продукт ПЦР расщепляли SacI и SmaI, лигировали с вектором pMWPthr, чтобы сконструировать плазмиду pMW-gltP для амплификации gltP и плазмиду pMW-gadC для амплификации gadC .

Тем же образом как в примере 4, штамм B-3996 был трансформирован с pMW-gadC, и полученный трансформант обозначали как штамм B-3996/pMW-gadC. Указанный штамм культивировали вместе с B-3996/pMW118, B-3996/pMW-gltP, и B-3996/pMW-gltS тем же образом, что и в примере 4. Концентрации L-глутаминовой кислоты, накопленной в среде, показаны в таблице 5 как относительные значения, на основе контрольных значений, полученных у B3996/pMW118, которые приняты за 100.

Таблица 5
Сравнение эффекта амплификации гена gltP или gltS и эффекта амплификации gadC в штамме B-3996 L-треонин-продуцирующих бактерий
Штамм	Концентрация L-глутаминовой кислоты (относительное значение)
B-3996/pMW118	100,0
B-3996/pMW-gltP	13,4
B-3996/pMW-gltS	13,4
B-3996/pMW-gadC	109,3

В штамм B-3996/pMW-gltP с амплифицированным геном gltP и штамм B-3996/pMW-gltS с амплифицированным геном gltS было заметно уменьшено количество продуцируемой L-глутаминовой кислоты. С другой стороны, в штамме B-3996/pMW-gadC с амплифицированным геном gadC концентрация L-глутаминовой кислоты не уменьшалась, а наоборот, увеличивалась, и таким образом стало очевидно, что амплификация gadC не имеет эффекта снижения концентрации L-глутаминовой кислоты в ферментационной среде.

Пояснение к списку последовательностей

SEQ ID No: 1: генная последовательность gltP

SEQ ID No: 2: аминокислотная последовательность GltP

SEQ ID No: 3: генная последовательность gltS

SEQ ID No: 4: аминокислотная последовательность GltS

SEQ ID No: 5: генная последовательность ybjE

SEQ ID No: 6: аминокислотная последовательность YbjE

SEQ ID No: 7: ybjE выше расположенная последовательность для замены

SEQ ID No: 8: праймер для амплификации gltP (5' сторона)

SEQ ID No: 9: праймер для амплификации gltP (3' сторона)

SEQ ID No: 10: праймер для амплификации gltS (5' сторона)

SEQ ID No: 11: праймер для амплификации gltS (3' сторона)

SEQ ID No: 12: консервативная последовательность gltP

SEQ ID No: 13: консервативная последовательность gltS

SEQ ID No: 14: праймер для амплификации gadC (5' сторона)

SEQ ID No: 15: праймер для амплификации gadC (3' сторона)

Промышленная применимость

При использовании способа по настоящему изобретению можно уменьшать количество побочного продукта при производстве путем ферментации L-лизина, L-треонина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-метионина, L-аланина, L-изолейцина и L-гомосерина.

Claims (12)

1. Способ получения L-аминокислоты, предусматривающий культивирование бактерии, которая принадлежит семейству Enterobacteriaceae и обладает способностью продуцировать L-аминокислоту в среде для получения и накопления L-аминокислоты в среде, и сбор L-аминокислоты из среды, в котором:
бактерия была модифицирована таким образом, чтобы увеличить экспрессию гена gltP или гена gltS, и L-аминокислоту выбирают из группы, состоящей из L-лизина, L-треонина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-метионина и L-изолейцина; и
бактерия представляет собой Escherichia coli.

2. Способ по п.1, в котором ген gltP кодирует белок, показанный в следующих (А) или (В):
(A) белок с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID No: 12 и обладающий активностью L-глутаматного транспортера,
(B) белок с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID No: 12, включающий в себя замены, делеции, вставки, добавления или инверсии одного или нескольких аминокислотных остатков и обладающий активностью L-глутаматного транспортера.

3. Способ по п.2, в котором ген gltP кодирует белок, показанный в следующих (А1) или (В1):
(А1) белок с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID No: 2,
(B1) белок с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID No: 2, включающий в себя замены, делеции, вставки, добавления или инверсии одного или нескольких аминокислотных остатков и обладающий активностью L-глутаматного транспортера.

4. Способ по п.1, в котором ген gltP представляет собой ДНК, показанную в следующих пп. (а) или (b):
(a) ДНК с нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID No: 1,
(b) ДНК, способная к гибридизации с последовательностью, которая комплиментарна нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID No: 1, или зондом, который можно изготовить из нуклеотидной последовательности при жестких условиях, и которая кодирует белок, обладающий активностью L-глутаматного транспортера.

5. Способ по п.1, в котором ген gltS кодирует белок, показанный в следующих (С) или (D):
(C) белок с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID No: 13 и обладающий активностью L-глутаматного транспортера,
(D) белок с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID No: 13, включающий в себя замены, делеции, вставки, добавления или инверсии одного или нескольких аминокислотных остатков и обладающий активностью L-глутаматного транспортера.

6. Способ по п.5, в котором ген gltS кодирует белок, показанный в следующих (С1) или (D1):
(С1) белок с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID No: 4,
(D1) белок с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID No: 4, включающий в себя замены, делеции, вставки, добавления или инверсии одного или нескольких аминокислотных остатков и обладающий активностью L-глутаматного транспортера.

7. Способ по п.1, в котором ген gltS представляет собой ДНК, показанную в следующих (с) или (d):
(c) ДНК с нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID No: 3,
(d) ДНК, способная к гибридизации с последовательностью, которая комплиментарна нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID No: 3, или зондом, который можно изготовить из нуклеотидной последовательности при жестких условиях, и которая кодирует белок, обладающий активностью L-глутаматного транспортера.

8. Способ по п.1, в котором повышена экспрессия гена путем увеличения числа копий гена, или модификации экспрессии контрольной последовательности гена.

9. Способ по п.1, в котором L-аминокислота представляет собой L-лизин, и у бактерии повышена экспрессия гена ybjE.

10. Способ по п.9, в котором ген ybjE кодирует белок, показанный в следующих (Е) или (F):
(Е) белок с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID No: 6, или аминокислотной последовательностью аминокислот от №№17 до 315 в SEQ ID No: 6,
(F) белок с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID No: 6, или аминокислотной последовательностью аминокислот от №№17 до 315 в SEQ ID No: 6, которая включает в себя замены, делеции, вставки, добавления или инверсии одного или нескольких аминокислотных остатков, где белок обладает активностью экскреции L-лизина.

11. Способ по п.9, в котором ген ybjE представляет собой ДНК, показанную в следующих (е) или (f):
(e) ДНК с нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID No: 5, или нуклеотидной последовательностью нуклеотидов от №№49 до 948 в SEQ ID No: 5,
(f) ДНК, способная к гибридизации с последовательностью, которая комплиментарна нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID No: 5, или нуклеотидной последовательностью нуклеотидов от №№49 до 948 в SEQ ID No: 5, или зондом, который можно изготовить из указанных нуклеотидных последовательностей при жестких условиях, и которая кодирует белок, обладающий активностью экскреции L-лизина.

12. Способ по п.1, в котором L-аминокислотой является L-лизин, уровень рН среды регулируют таким образом, чтобы он составлял от 6,0 до 9,0 во время культивирования для продуцирования, и от 7,2 до 9,0 в конце культивирования, для обеспечения периода культивирования, когда в среде присутствуют ионы бикарбоната и/или ионы карбоната в количестве 20 мМ или больше, с тем, чтобы ионы бикарбоната и/или ионы карбоната служили противоионами основной аминокислоты.

Images