CN111621455B

CN111621455B - 一种表达天冬酰胺合成酶的重组枯草芽孢杆菌

Info

Publication number: CN111621455B
Application number: CN202010350864.1A
Authority: CN
Inventors: 罗玮; 许景龙
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-04-28
Filing date: 2020-04-28
Publication date: 2023-01-17
Anticipated expiration: 2040-04-28
Also published as: CN111621455A

Abstract

本发明公开了一种表达天冬酰胺合成酶的重组枯草芽孢杆菌。本发明以表达载体为pMA5，枯草芽孢杆菌WB600(Bacillus subtilis WB600)为宿主，异源表达了来源于唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)的天冬酰胺合成酶，LsaAS‑A的比酶活达到6.585U/mg。以该酶或者可以表达该酶的全细胞作为催化剂，可以将L‑天冬氨酸转化为L‑天冬酰胺，相比于化学法及植物提取法生产过程副反应少，生产过程易控制，能够有效减少成本，污染小，具有很高的应用前景。

Description

一种表达天冬酰胺合成酶的重组枯草芽孢杆菌

技术领域

本发明涉及一种表达天冬酰胺合成酶的重组枯草芽孢杆菌，属于基因工程技术领域。

背景技术

目前工业上生产L-天冬酰胺主要是从植物中提取或者化工合成的方法，直接提取法主要是以白羽扇豆为主，经过发芽、成浆、加热等处理流程后，在pH 不大于6的条件下，经过硅藻土过滤、离心，获得第一步粗品。然后再经过浓缩、结晶获得最后的成品。直接提取法受原料质量的影响较大，工艺复杂不易控制且会造成严重的污染。化学合成法主要是通过氨水和L-天冬氨酸为原料进行酰胺化反应产生L-天冬酰胺，使L-天冬氨酸上的羟基由氨基替代。该方法副反应多，下游提取困难，污染严重；而生物合成法具有生产过程和设备简单，生产效率高，能耗低，污染小，不受原辅料限制等优点。

L-天冬酰胺生物合成法是以天冬酰胺合成酶催化合成天冬酰胺。天冬酰胺合成酶A是一类以NH₄ ⁺为酰胺氨供体将L-天冬氨酸酰胺化生成天冬酰胺的 ATP依赖性酶，天冬酰胺合成酶B的既可以利用NH₄ ⁺也可以以谷氨酰胺作为氨供体。天冬酰胺分两步形成：天冬氨酸的β-羧酸根首先被ATP活化形成氨酰基 -AMP，然后再被铵离子的亲核攻击酰胺化。但是目前天冬酰胺合成酶表达菌株主要以大肠杆菌作为宿主，目前还没有报道以枯草芽孢杆菌作为宿主的表达天冬酰胺合成酶的重组菌，而与大肠杆菌相比枯草芽孢杆菌没有明显的密码子偏好性不容易表达没有活性的包涵体，而且枯草芽孢杆菌没有内毒素，属于食品级微生物；此外，目前利用生物法合成L-天冬酰胺的文献报道中酶活力不够高，导致生产效率不高。

发明内容

为解决上述问题，本发明构建了表达天冬酰胺合成酶的重组枯草芽孢杆菌，实现了LsaAS-A在枯草芽孢杆菌中的表达，LsaAS-A的比酶活达到6.585U/mg。

本发明的第一个目的是提供一种表达天冬酰胺合成酶的重组枯草芽孢杆菌，所述的重组枯草芽孢杆菌异源表达了来源于唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)的天冬酰胺合成酶。

进一步地，所述的天冬酰胺合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述的重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌WB600为宿主。

进一步地，所述的重组枯草芽孢杆菌以pMA5为表达载体。

本发明的第二个目的是提供一种所述的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括如下步骤：

S1、设计引物，从唾液乳杆菌中扩增得到asnA基因；

S2、将扩增得到的asnA基因连接到pMA5载体上得到表达载体；

S3、将表达载体转入枯草芽孢杆菌WB600中，筛选得到所述的重组枯草芽孢杆菌。

本发明的第三个目的是提供一种利用所述的重组枯草芽孢杆菌发酵生产天冬酰胺合成酶的方法，包括如下步骤：

将重组枯草芽孢杆菌接种至种子培养基中培养至OD₆₀₀为0.5～0.8，以 5～10％接种量接种至发酵培养基中，在35～38℃、150～250rpm条件下培养 20～30h。

进一步地，所述的种子培养基为LB/Kana。

进一步地，所述的发酵培养基包括20g/L蔗糖、20g/L玉米浆、25g/L麸皮和3.9g/LK₂HPO₄·3H₂O。

本发明的第四个目的是提供一种所述的重组枯草芽孢杆菌全细胞作为催化剂催化L-天冬氨酸生产L-天冬酰胺的方法。

本发明的第五个目的是提供一种所述的重组枯草芽孢杆菌发酵生产得到的天冬酰胺合成酶作为催化剂催化L-天冬氨酸生产L-天冬酰胺的方法。

本发明对LsaAS-A的酶学性质进行了分析：最适温度为41℃，50℃时酶活下降为0；在30℃处理5h酶活下降10％；最适pH为8.0，在pH为5的缓冲液中最稳定；该酶为金属依赖性酶，不添加金属离子不能合成产物，常见的金属离子中Mg²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺可以激活酶的活性，其中添加Fe²⁺酶活最高，是添加Mg²⁺的酶活1.36倍；加入低浓度(10％以下)的有机溶剂有所抑制，其中添加10％的二硝基亚砜酶活损失最多，为6.2％，加入5％的十二烷基磺酸钠(SDS)导致酶完全失活。

本发明对工程菌Bacillus subtilis WB600/pMA5-Lsa-asnA进行摇瓶发酵培养基成分为：20g/L蔗糖、20g/L玉米浆，25g/L麸皮，4g/L K₂HPO₄·3H₂O。发酵条件为：接种时的种子培养基的生物量为OD₆₀₀＝0.6，接种量为8％，培养温度30℃，摇床转速为200rmp，发酵24h。

本发明的有益效果：在枯草芽孢杆菌中成功表达了天冬酰胺合成酶，

本发明以表达载体为pMA5，枯草芽孢杆菌WB600(Bacillus subtilis WB600)为宿主，成功表达了来自于唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)的，以天冬氨酸为底物，NH₄ ⁺为氨供体的ATP依赖性天冬酰胺合成酶(LsaAS-A)， LsaAS-A的比酶活达到6.585U/mg。以该酶或者可以表达该酶的全细胞作为催化剂，可以将L-天冬氨酸转化为L-天冬酰胺，相比于化学法及植物提取法生产过程副反应少，生产过程易控制，能够有效减少成本，污染小，具有很高的应用前景。

附图说明

图1是Bacillus subtilis WB600/pMA5-Lsa-asnA的基因表达SDS-PAGE分析结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1：天冬酰胺合成酶基因的获得及Bacillus subtilis WB600/pMA5 -Lsa-asnA基因工程菌的构建

利用试剂盒提取Lactobacillus salivarius基因组，以其为模板，用引物 AsnAF(aaagtgaaatcagggggatccATGAAAAAACAATTTATACAAAAACAACA，携带BamHI酶切位点)和引物AsnAR(tctggtacgtaccaagctagcTTAGAGAAGCGA GTCAATTTGATCG，携带NheI酶切位点)来PCR扩增asnA基因。将扩增出的基因与pMA5载体用重组酶连接，转化，挑取转化子，鉴定阳性菌，测序，获得基因工程菌Bacillus subtilis WB600/pMA5-Lsa-asnA。

发明人曾将获得的asnA基因在大肠杆菌中表达，发现无法表达。

实施例2：Bacillus subtilis WB600/pMA5-Lsa-asnA发酵

在摇瓶中进行Bacillus subtilis WB600/pMA5-Lsa-asnA发酵：

将保藏的重组菌划线在LB/Kana平板上，挑取单菌落于种子培养基中(L B/Kana)过夜培养，1％接种于种子培养基中，培养至OD₆₀₀为0.6时8％接种量接种于发酵培养基中(20g/L蔗糖、20g/L玉米浆,25g/L麸皮，4g/L K₂HP O₄·3H₂O)30℃，200rmp，发酵24h。

通过测定不同时间发酵液中天冬酰胺合成酶的活力及菌体量，由发酵结果可以看出，重组枯草芽孢杆菌的发酵能力最高可达到3.58U/ml。在所有测试的 C源中蔗糖的发酵效果最好，可能是由于在单糖中葡萄糖与果糖的酶活最高，而蔗糖可以分解为葡萄糖与果糖；在所有测试的N源中玉米浆的酶活力最高，麸皮的生物量最高，所以选择玉米浆及麸皮作为N源；磷酸盐不仅能够提供菌体生长的P元素，还可以对培养液的pH，所以添加一定的磷酸盐能够提高酶活力；温度对菌体的生长及代谢有影响，通过设置不同温度测定酶活发现30℃的酶活最高；通过检测不同发酵时间菌体的生物量及酶活发现20h生物量基本平稳，24h时酶活达到最高。

实施例4：LsaAS-A酶学性质的研究

酶反应体系：总体系1mL,100mmol·L^-1Tris-HCl Buffer(pH 8.0)，20 mmol·L^- ¹L-Asp，10mmol·L^-1MgCl₂，10mmol·L^-1NH₄Cl(或L-Gln)，10mmol·L^-1 ATP，0.1mL酶液，37℃催化15min，样品煮沸5min，12000r·min^-1，4℃离心 5min，取上清经0.22μm水膜过滤，注入样品瓶中备用。以每分钟催化L-Asp 产生1μmol L-Asn所需的酶量定义为一个酶活单位

天冬酰胺、天冬氨酸及谷氨酰胺的检测方法

测定方法(HPLC)：A相：40mM Na₂HPO₄，pH 7.8；B相：乙腈:甲醇: 水＝40:50:10，Agilent Zorbax Eclipse AAA，4.6×150mm，5μm，控制条件为：柱温40℃，检测波长338nm，流速1.0mL·min^-1，进样体积10μL，分析时间 24min。泵程序为：0-2min内流动相B为5％，2-12min，流动相B由5％升至57％，13min时升至100％维持4min，19min降至5％，维持5min。

最佳反应温度的确定：分别在35、38、41、44、47℃下，测定该温度下酶的催化活力，每个温度做三个平行，取其平均值。最佳反应pH的确定：分别用醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5.0，6.0，7.0)，Tris-HCL(pH 7.0，8.0)，硼酸-硼砂缓冲液(pH 8.0，9.0，10.0)作为缓冲液，在最佳温度下进行反应。金属离子对酶活的影响：在最适反应温度和pH条件下，向反应液分别中添加终浓度为10 mmol·L^-1的Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺测定酶活力，以不添加金属离子粗酶为空白对照。有机溶剂对酶活的影响：粗酶液分别与有机溶剂按1：1均匀混合，4℃放置2h再测定其酶活力，以不添加有机溶剂的粗酶为对照。酶的pH稳定性：分别用醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 5.0，6.0，7.0)，Tris-HCL(pH 7.0，8.0)，硼酸-硼砂缓冲液(pH8.0，9.0，10.0)作为缓冲液，将粗酶与缓冲液1：1配制，4℃放置24h后测定残留酶活力。酶的半衰期检测：将粗酶置于温度分别为30℃的水浴锅中恒温，每隔一段时间测定残留酶活力。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种表达天冬酰胺合成酶的重组枯草芽孢杆菌

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 336

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 1

Leu Asp Leu Ile Ile Pro Lys Asp Tyr Asp Pro Lys Leu Ser Ile Arg

1 5 10 15

Glu Thr Gln Glu Ala Ile Arg Tyr Ile Arg Glu Thr Phe Gln Asp Glu

20 25 30

Phe Gly Lys Glu Met Gly Leu Asn Arg Val Ser Ala Pro Met Tyr Val

35 40 45

Glu Lys Ser Ser Gly Ile Asn Asp Asn Leu Asn Gly Tyr Glu Lys Pro

50 55 60

Val Ser Phe Thr Met Lys Asp Met Pro Gly Glu Thr Ile Glu Val Val

65 70 75 80

His Ser Leu Ala Lys Trp Lys Arg Met Ala Leu Lys Lys Tyr Gly Phe

85 90 95

Gly Leu His Glu Gly Leu Tyr Thr Asn Met Asn Ala Ile Arg Lys Asp

100 105 110

Glu Asp Leu Asp Asn Phe His Ser Ser Tyr Val Asp Gln Trp Asp Trp

115 120 125

Glu Lys Val Ile Ser Lys Asp Glu Arg Asn Glu Lys Thr Leu Lys Glu

130 135 140

Thr Val Glu Leu Ile Phe Lys Val Val Lys His Met Glu His Glu Val

145 150 155 160

Trp Tyr Lys Phe Pro Asn Ala Val Tyr His Leu Pro Asp Lys Ile His

165 170 175

Phe Ile Thr Ser Gln Glu Leu Glu Asp Lys Tyr Pro Glu Leu Glu Asp

180 185 190

Ala Lys Asp Arg Glu Asn Ala Ile Cys Lys Glu Leu Gly Cys Val Phe

195 200 205

Val Met Gln Ile Gly Asp Val Leu Lys Ser Gly Lys Arg His Asp Gly

210 215 220

Arg Ala Pro Asp Tyr Asp Asp Trp Lys Leu Asn Gly Asp Ile Leu Phe

225 230 235 240

Trp Tyr Glu Pro Leu Gln Cys Ala Leu Glu Leu Ser Ser Met Gly Ile

245 250 255

Arg Val Asp Glu Asp Ser Met Val Glu Gln Leu Lys Lys Thr Gly Asp

260 265 270

Glu Asp Arg Leu Lys Leu Gln Tyr His Lys Met Ile Leu Asn Lys Glu

275 280 285

Leu Pro Tyr Thr Ile Gly Gly Gly Ile Gly Gln Ser Arg Leu Cys Met

290 295 300

Leu Leu Leu Gly Lys Ala His Val Gly Glu Val Gln Ala Ser Ile Trp

305 310 315 320

Gln Met Lys Cys Leu Lys Asn Val Lys Lys Met Val Phe Ile Phe Cys

325 330 335

Claims

1.一种表达天冬酰胺合成酶的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌WB600为宿主，异源表达了来源于唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)的天冬酰胺合成酶，所述的天冬酰胺合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的重组枯草芽孢杆菌以pMA5为表达载体。

3.权利要求1或2所述的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、设计引物，从唾液乳杆菌中扩增得到天冬酰胺合成酶基因；

S2、将扩增得到的天冬酰胺合成酶基因连接到pMA5载体上得到表达载体；

4.一种利用权利要求1或2所述的重组枯草芽孢杆菌发酵生产天冬酰胺合成酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将重组枯草芽孢杆菌接种至种子培养基中培养至OD₆₀₀为0.5~0.8，以5~10%接种量接种至发酵培养基中，在35~38^oC、150~250rpm条件下培养20~30h。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的种子培养基为LB/Kana。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基包括20 g/L 蔗糖、20g/L玉米浆、25 g/L麸皮和3.9 g/L K₂HPO₄·3H₂O。

7.一种权利要求1或2所述的重组枯草芽孢杆菌全细胞作为催化剂催化L-天冬氨酸生产L-天冬酰胺的方法。