CN102227504A - 产生l-氨基酸的方法 - Google Patents

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Abstract

将属于肠杆菌科，并具有产生L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-甲硫氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸和L-高丝氨酸的能力，且经修饰而增加了使得gltP基因和/或gltS基因的表达的细菌在培养基中培养，以在培养基或细胞中产生和累积所述L-氨基酸。

Description

产生L-氨基酸的方法
技术领域
本发明涉及使用细菌产生L-氨基酸的方法。L-氨基酸在工业上可用作动物饲料添加剂、健康食物成分、氨基酸输液等。
背景技术
使用微生物通过发酵生产目标物质如L-氨基酸的方法包括使用野生型微生物(野生型菌株)的方法，使用来源于野生型株的营养缺陷型菌株的方法，使用来源于野生型菌株的耐受多种药物的代谢调节突变体菌株的方法，使用兼具营养缺陷型菌株和代谢调节突变体菌株两者性质的菌株的方法等。
近年来，重组DNA技术用于通过发酵产生目标物质。例如，微生物的L-氨基酸生产力可通过增强编码L-氨基酸生物合成酶的表达(专利文献1和2)或通过增强L-氨基酸生物合成系统对碳源的摄入(专利文献3)来提高。
同时，公开了在发酵生产碱性氨基酸的过程中利用碳酸根离子和碳酸氢根离子作为碱性氨基酸的反荷阴离子(counter anion)来替代一部分硫酸根离子或氯离子。作为将碳酸根离子和碳酸氢根离子添加至培养基的方法，这些文献描述了控制发酵罐内部压力在发酵过程中为正压，或向培养基供应二氧化碳或含有二氧化碳的混合气体的方法(专利文献4和5)。
L-天冬氨酸家族氨基酸如L-赖氨酸的常规氨基酸发酵受L-谷氨酸副产物产生的影响，具体而言，如上所述的发酵生产在高pH的条件下有特别显著的L-谷氨酸副产物生成的问题。因为在许多情况下在L-氨基酸生产工艺中必需在发酵生产之后将L-氨基酸纯化至高纯度，副产物的存在是不期望的，其可招致复杂的纯化工艺和产物纯度降低的问题。
迄今为止，作为发现在肠细菌如大肠杆菌(Escherichia coli)中涉及谷氨酸摄入的蛋白质，已知有GltP、GltS(非专利文献1和2)、GadC(非专利文献3)和GltIJKL。
已知在经修饰增强谷氨酸脱羧酶活性的菌株中L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-色氨酸的生产力通过增强谷氨酸/GABA反向转运蛋白的活性(专利文献6)而得到增强。然而，并无使用其中gltP基因或gltS基因扩增的微生物产生L-氨基酸的报道。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利5,168,056号
专利文献2：美国专利5,776,736号
专利文献3：美国专利5,906,925号
专利文献4：美国专利申请公开2002/0025564号
专利文献5：国际专利公开WO2006/038695
专利文献6：国际专利公开WO2008/044453
非专利文献
非专利文献1：J.Bacteriol.，1992Apr；174(7)：2391-3
非专利文献2：J.Biol.Chem.，1990Dec；15；265(35)：21704-8
非专利文献3：J.Bacteriol.，2006Dec；188(23)：8118-27
发明内容
本发明要解决的问题
本发明的一个目标是提供属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，能够在选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-甲硫氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸和L-高丝氨酸的氨基酸的生产中减少副产物L-谷氨酸产生的微生物，以及提供通过使用如上所述的可在氨基酸生产中减少副产物L-谷氨酸产生的微生物来生产如上所述的L-氨基酸的方法。
解决问题的手段
本发明的发明人为实现前述的目标进行了多方研究，结果发现，通过修饰细菌以增加gltP和/或gltS的表达，能够减少L-氨基酸的发酵生产中作为副产物产生的L-谷氨酸，从而完成了本发明。
因此，本发明提供了下述：
1.一种产生L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)并具有L-氨基酸产生能力的细菌以在培养基中产生和累积所述L-氨基酸，并从培养基收集所述L-氨基酸，其中：
所述细菌已经过修饰从而增加了gltP基因和/或gltS基因的表达，且所述L-氨基酸选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-甲硫氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸和L-高丝氨酸。
2.如上所述的方法，其中所述gltP基因编码下述(A)或(B)所示的蛋白质：
(A)具有SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列并具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质，
(B)具有在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质。
3.如上所述的方法，其中所述gltP基因编码下述(A1)或(B1)所示的蛋白质：
(A1)具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白质，
(B1)具有在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质。
4.如上所述的方法，其中所述gltP基因是下述(a)或(b)所示的DNA：
(a)具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA，
(b)能够与同SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列互补的序列或者与可从该核苷酸序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质的DNA。
5.如上所述的方法，其中所述gltS基因编码下述(C)或(D)所示的蛋白质：
(C)具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列并具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质，
(D)具有在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质。
6.如上所述的方法，其中所述gltS基因编码下述(C1)或(D1)所示的蛋白质：
(C1)具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的蛋白质，
(D1)具有在SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质。
7.如上所述的方法，其中所述gltS基因是下述(c)或(d)所示的DNA：
(c)具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的DNA，
(d)能够与同SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列互补的序列或者与可从该核苷酸序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质的DNA。
8.如上所述的方法，其中所述基因的表达是通过增加该基因的拷贝数或通过修饰该基因的表达调控序列而得到增强的。
9.如上所述的方法，其中所述L-氨基酸是L-赖氨酸，且在该细菌中ybjE基因的表达得到增加。
10.根据权利要求9的方法，其中所述ybjE基因编码下述(E)或(F)所示的蛋白质：
(E)具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列或SEQ ID NO：6中第17至315号氨基酸的氨基酸序列的蛋白质，
(F)具有在SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列或SEQ ID NO：6中第17至315号氨基酸的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并具有L-赖氨酸分泌活性的蛋白质。
11.如上所述的方法，其中所述ybjE基因是下述(e)或(f)所示的DNA：
(e)具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列或SEQ ID NO：5中第49至948号核苷酸的核苷酸序列的DNA，
(f)能够与同SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列或SEQ ID NO：5中第49至948号核苷酸的核苷酸序列互补的序列或者与可从这些核苷酸序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有L-赖氨酸分泌活性的蛋白质的DNA。
12.如上所述的方法，其中所述L-氨基酸是L-赖氨酸，将生产培养过程中培养基的pH控制在6.0至9.0，并将培养结束时培养基的pH控制在7.2至9.0，且保证有一段培养期内培养基中存在20mM或更多的碳酸氢根离子和/或碳酸根离子，从而使得所述碳酸氢根离子和/或碳酸根离子充当碱性氨基酸的反荷离子。
13.如上所述的方法，其中所述细菌是埃希氏菌属(Escherichia)细菌。
实施本发明的实施方案
下文中将详细解释本发明。
<1>用于本发明的细菌
本发明的细菌是属于肠杆菌科，具有L-氨基酸产生活性，且经修饰使得gltP基因和/或gltS基因的表达增加的细菌。所述L-氨基酸选自下组：L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-甲硫氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸和L-高丝氨酸。如果这些L-氨基酸是使用微生物通过发酵产生的，在许多情况下产生副产物L-谷氨酸。对于L-谷氨酸副产物的产生而言，只要通过增加gltP基因和/或gltS基因表达的修饰，副产物的产生与未修饰的菌株相比有所减少就足够了，但希望减少40％或更多，优选50％或更多，更优选60％或更多。
本文中提及的L-氨基酸产生能力意指当在培养基中培养本发明的细菌时，该细菌在培养基或细胞中产生L-氨基酸并累积所述L-氨基酸达到所述L-氨基酸可从所述培养基或细胞被收集的程度的能力。本发明的细菌可为具有产生L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-甲硫氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸和L-高丝氨酸之一的能力的细菌，或可为具有产生其中两种或三种能力的细菌。具有L-氨基酸产生能力的细菌可为固有地具有L-氨基酸产生活性的细菌，或可为如下所述的经过使用突变方法或DNA重组技术修饰的具有L-氨基酸产生能力的细菌。
“基因表达的增加”意指所述基因的转录和/或基因翻译的增加。
<1-1>L-氨基酸产生能力的赋予
下文中将例示赋予细菌产生选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-丙氨酸和L-高丝氨酸的L-氨基酸的能力的方法，以及可用于本发明的被赋予了产生如上所述的L-氨基酸的能力的细菌。但是，所述细菌并不限于这些，只要使用的是具有产生L-氨基酸的能力的细菌即可。
用于本发明的细菌并没有特别限制，只要其为选自属于肠杆菌科如埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、泛菌属(Pantotea)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏属菌(Erwinia)、沙门氏菌属(Salmonia)和摩根氏菌属(Morganella)并具有前述L-氨基酸产生能力的细菌即可。具体而言，可以使用那些根据NCBI(美国国立生物技术信息中心，National Center for Biotechnology Information)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg？mode＝Tree&id＝12 36&lvl＝3&keep＝1&srchmode＝1&unlock)中使用的分类法归类为肠杆菌科的细菌。作为用于修饰的肠杆菌科的亲本株，特别理想的是使用埃希氏菌属、肠杆菌属或泛菌属的细菌。
尽管用来获取用于本发明的埃希氏菌属细菌的埃希氏菌属细菌亲本株并无特别限制，具体而言可使用描述于Neidhardt等的著作(Backmann B.J.，1996，Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coliK-12，p.2460-2488，表1，于F.D.Neidhardt(编)，Escherichia coli andSalmonella Cellular and Molecular Biology/第二版，American Society forMicrobiology Press，Washington，D.C.)中的那些细菌。其中，优选大肠杆菌。大肠杆菌的具体实例包括来源于原型野生型菌株K12株的大肠杆菌W3110(ATCC 27325)、大肠杆菌MG1655(ATCC 47076)等。
这些菌株可从例如美国典型培养物保藏中心(P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，United States of America)获得。即，对每个菌株给出登录号，而这些菌株可通过使用这些登录号(参见http://www.atcc.org/)来定购。菌株的登录号列于美国典型培养物保藏中心的目录中。
肠杆菌属细菌的实例包括成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)等，而泛菌属细菌的实例包括Pantoeaananatis。一些成团肠杆菌的菌株最近基于16S rRNA的核苷酸序列分析等重新归类于成团泛菌(Pantoea agglomerans)、Pantoea ananatis或斯氏泛菌(Pantoea stewartii)。在本发明中，可使用属于肠杆菌属或泛菌属的任意细菌，只要其为归类于肠杆菌科的细菌。当通过遗传工程技术培育Pantoea ananatis菌株时，可使用Pantoea ananatis AJ13355株(FERM BP-6614)、AJ13356株(FERM BP-6615)、AJ13601株(FERM BP-7207)及其衍生物。这些菌株在分离时被鉴定为成团肠杆菌，并作为成团肠杆菌保藏。然而，如上所述最近基于16S rRNA测序等将其重新归类为Pantoea ananatis。
下文中描述了赋予属于肠杆菌科的细菌产生选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-甲硫氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸和L-高丝氨酸的L-氨基酸的能力的方法，以及用于增强属于肠杆菌科的细菌产生上述L-氨基酸的能力的方法。
为了赋予产生L-氨基酸的能力，可使用常规用于培育棒状杆菌型细菌或埃希氏菌属细菌的方法(参见″Amino Acid Fermentation″，Gakkai ShuppanCenter(Ltd.)，第1版，1986年5月30日出版，pp.77-100)。此类方法包括通过获得营养缺陷型突变体、L-氨基酸类似物抗性菌株或代谢调节突变体的性质，或通过构建重组菌株使其过表达L-氨基酸生物合成酶的方法。在此，在培育L-氨基酸产生细菌时，可赋予一种或多种上述性质如营养缺陷型、类似物抗性和代谢调节突变。L-氨基酸生物合成酶的表达可单独增强或以两种或更多种的组合来增强。此外，可将赋予如营养缺陷型、类似物抗性或代谢调节突变性质的方法可与生物合成酶的增强相组合。
具有产生L-氨基酸的能力的营养缺陷型突变株、L-氨基酸类似物抗性株或代谢调节突变株可通过对亲本或野生型株进行常规诱变如暴露于X射线或UV辐射或用诱变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和甲磺酸乙酯(EMS)处理，然后从获得的突变株中选择那些呈现营养缺陷型、类似物抗性或代谢调节突变且还具有产生L-氨基酸的能力的菌株来获得。
L-赖氨酸产生细菌
下文中例示了L-赖氨酸产生细菌及其构建方法。
具有L-赖氨酸产生能力的菌株的实例包括例如L-赖氨酸类似物抗性株和代谢调节突变株。L-赖氨酸类似物的实例包括但不限于，氧代赖氨酸(oxalysine)、赖氨酸氧肟酸(lysine hydroxamate)、S-(2-氨基乙基)-半胱氨酸(AEC)、γ-甲基赖氨酸、α-氯代己内酰胺(α-chlorocaprolactam)等。可通过对属于埃希氏菌属的细菌施以常规人工诱变处理，来获得对这些赖氨酸类似物具有抗性的突变体菌株。L-赖氨酸产生细菌的实例包括大肠杆菌AJ11442菌株(FERM BP-1543、NRRL B-12185；参见特开昭56-18596和美国专利4,346,170号)、大肠杆菌VL611菌株(特开1016710号)等。作为L-赖氨酸产生大肠杆菌，也可以使用WC196菌株(参见国际专利公开WO96/17930)。
此外，也可通过增加L-赖氨酸生物合成系统酶的活性来构建L-赖氨酸产生细菌。可通过增加细胞中编码所述酶的基因的拷贝数，或通过修饰表达调控序列，来获得该酶活性的增加。编码L-赖氨酸生物合成系统的酶的基因拷贝数的增加及其表达调控序列的修饰可通过后述那些用于gltP和glts基因的相同方法来获得。
编码L-赖氨酸生物合成酶的基因的实例包括但不限于编码二氨基庚二酸途径酶的基因如二氢吡啶二羧酸合酶基因(dapA)、天冬氨酸激酶基因(lysC)、二氢吡啶二羧酸还原酶基因(dapB)、二氨基庚二酸脱羧酶基因(lysA)、二氨基庚二酸脱氢酶基因(ddh)(对于所有前述基因参见WO96/40934)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)(特开昭60-87788)、天冬氨酸氨基转移酶基因(aspC)(特公平6-102028)和天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)(WO00/61723)，以及编码氨基己二酸途径酶的基因如高乌头酸水合酶基因(特开2000-157276A)。此外，所述亲本株可显示涉及能效的基因(cyo)(欧洲专利公开1170376号)、编码烟酰胺核苷酸转氢酶的基因(pntAB)(美国专利5,830,716号)、编码具有L-赖氨酸分泌活性的蛋白质的ybjE基因(WO2005/073390)、编码谷氨酸脱氢酶的基因(gdhA)(Gene 23：199-209，1983)或其任意组合的表达水平增加。这些基因的缩写示于括号中。
在前述基因中，优选ybjE基因。ybjE基因的实例包括大肠杆菌的ybjE基因及其同源物。大肠杆菌ybjE基因的实例包括编码SEQ ID NO：6中氨基酸编号17至315的氨基酸序列的基因，特别是具有SEQ ID NO：5中核苷酸编号49至948的核苷酸序列的基因。在SEQ ID NO：5中，预计起始密码子为核苷酸编号49至51的核苷酸。尽管SEQ ID NO：5中核苷酸编号1至3的核苷酸构成编码缬氨酸的密码子gtg，其可翻译为Met作为起始密码子，且由ybjE基因编码的蛋白质可为具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的蛋白质(1至315)。在此情况下，优选使用具有SEQ ID NO：5中核苷酸编号1至948的核苷酸序列的DNA。然而，从这些实例显而易见的是，无论该起始密码子提供了何种氨基酸残基，可用于本发明产生方法的微生物都可通过使用含有SEQ ID NO：1中核苷酸编号49至948的核苷酸序列的DNA来获得。
已知来源于大肠杆菌的野生型二氢吡啶二羧酸合酶受L-赖氨酸的反馈抑制的作用，且已知来源于大肠杆菌的野生型天冬氨酸激酶受L-赖氨酸的阻遏(suppression)和反馈抑制。因此，当使用dapA基因和lysC基因时，这些基因优选为编码不受L-赖氨酸的反馈抑制的突变酶的基因。
编码不受L-赖氨酸反馈抑制的突变体二氢吡啶二羧酸合酶的DNA的实例包括编码具有其中118位的组氨酸残基由酪氨酸残基替代的氨基酸序列的蛋白质的DNA。编码不受L-赖氨酸反馈抑制的突变体天冬氨酸激酶的DNA的实例包括编码具有其中352位的苏氨酸残基、323位的甘氨酸残基和318位的甲硫氨酸残基分别由异亮氨酸、天冬酰胺和异亮氨酸残基替代的氨基酸序列的AKIII的DNA(对于这些突变体，参见美国专利5,661,012和6,040,160号)。此类突变体DNA可通过使用PCR的定点诱变等来获得。
广宿主谱(wide host-range)质粒RSFD80、pCAB1和pCABD2已知为含有编码突变体二氢吡啶二羧酸合酶的突变体dapA基因和编码突变体天冬氨酸激酶的突变体lysC基因的质粒(美国专利6,040,160号)。用该质粒转化的大肠杆菌JM109株命名为AJ12396(美国专利6,040,160号)，且该菌株在1993年10月28日以保藏号FERM P-13936保藏于通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(the National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agency ofIndustrial Science and Technology，Ministry of International Trade and Industry)(现为独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology，International PatentOrganism Depositary)，且该保藏在1994年11月1日根据布达佩斯条约的规定转为国际保藏，保藏号为FERM BP-4859。RSFD80可从AJ12396株通过常规方法获得。
此外，L-氨基酸产生细菌中催化从L-氨基酸生物合成途径分支而产生其他化合物的反应的酶的活性可以是降低的，或者该活性可以是缺陷的，或者其负作用于L-氨基酸合成或累积的酶的活性可以是降低的，或者该活性可以是缺陷的。此类涉及L-赖氨酸产生的酶的实例包括高丝氨酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶(cadA，ldcC)、苹果酸酶等，且其中这些酶的活性减少或缺失的菌株公开于WO95/23864、WO96/17930、WO2005/010175等。
优选的是，编码赖氨酸脱羧酶的cadA和ldcC基因两者表达均降低，以降低或消除赖氨酸脱羧酶活性。这两个基因的表达可通过例如WO2006/078039中所述方法来降低。
为了减少或消除这些酶的活性，可通过通常的诱变方法或基因重组技术向基因组上所述酶的基因中引入突变，从而使得所述酶的胞内活性减少或消除。这样的突变引入可通过，例如，利用基因重组消除基因组上编码所述酶的基因，或修饰表达调控序列如启动子或Shine-Dalgarno(SD)序列来达成。其还可通过在基因组上编码所述酶的区域中导入形成氨基酸取代的突变(错义突变)、终止密码子(无义突变)或用于添加或缺失一个或两个核苷酸的译码突变，或者部分或完全缺失所述基因来达成(J.Biol.Chem.，272：8611-8617，1997)。还可通过构建编码其中编码区完全或部分缺失的突变酶的基因并用其通过同源重组等替换基因组上的正常基因，或通过将转座子或IS因子引入所述基因来减少或消除酶活性。
举例而言，为了通过遗传重组引入降低或消除上述酶活性的突变，使用下述方法。通过修饰目标基因的部分序列来制备突变基因，使得其不编码能够正常发挥功能的酶，然后可用含有所述突变基因的DNA转化属于肠杆菌科的细菌以导致基因组上的相应基因与所述突变基因发生重组以使所述突变基因替换基因组上的目标基因。此种使用同源重组基因替换的实例包括使用直链DNA的方法如称作Red驱动整合的方法(Datsenko，K.A和Wanner，B.L.，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：6640-6645)和利用Red驱动整合与来源于λ噬菌体的切出系统组合的方法(Cho，E.H.，Gumport，R.I.，Gardner，J.F.，2002，J.Bacteriol.，184：5200-5203)(参见WO2005/010175)、使用含有温度敏感性复制起点的质粒的方法(美国专利6,303,383号，特开平05-007491)等。此外，如上所述此类基于使用同源重组的基因替换的定点诱变还可通过使用无法在宿主中复制的质粒来实施。
L-赖氨酸产生细菌的优选实例包括大肠杆菌WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2(WO2006/078039)。该菌株是通过将含有赖氨酸生物合成基因的质粒pCABD2(美国专利6,040,160号)引入具有被破坏的编码赖氨酸脱羧酶的cadA和ldcC基因的WC196株来构建的。所述WC196株是从来源于大肠杆菌K-12的W3110株通过用编码突变体天冬氨酸激酶III(其中352位的苏氨酸由异亮氨酸替代)的突变体lysC基因替代W3110株染色体上的野生型lysC基因，从而导致其不受L-赖氨酸的反馈抑制(美国专利5,661,012号)，并对所得的菌株赋予AEC抗性(美国专利5,827,698号)而培育得到的。所述WC196株命名为大肠杆菌AJ13069，在1994年12月6日以保藏号FERMP-14690保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所(the National Institute ofBioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Science andTechnology)(目前为独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，National Institute of Advanced Industrial Science and Technology，InternationalPatent Organism Depositary，地址日本茨城县筑波市东一丁目1-1，筑波中央第6，305-8566)。之后其于1995年9月29日根据布达佩斯条约的规定转为国际保藏，保藏号为FERM BP-5252(美国专利5,827,698号)。WC196ΔcadAΔldcC株本身也是优选的L-赖氨酸产生细菌。WC196ΔcadAΔldcC株被命名为AJ110692，于2008年10月7日作为国际保藏保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所(the National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Science and Technology)(目前为独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology，International Patent Organism Depositary，地址日本茨城县筑波市东一丁目1-1，筑波中央第6，305-8566)，保藏号FERM BP-11027。
质粒pCABD2含有来源于大肠杆菌的编码具有使其不受L-赖氨酸反馈抑制的突变的二氢吡啶二羧酸合酶(DDPS)的突变体dapA基因，来源于大肠杆菌的编码具有使其不受L-赖氨酸反馈抑制的突变的天冬氨酸激酶III的突变体lysC基因，来源于大肠杆菌的编码二氢吡啶二羧酸还原酶的dapB基因，以及来源于乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)的编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因。
L-苏氨酸产生细菌
用于本发明的L-苏氨酸产生细菌的优选实例包括属于肠杆菌科，其中一种或多种L-苏氨酸生物合成系统酶的活性增强的细菌。编码L-苏氨酸生物合成酶的基因的实例包括天冬氨酸激酶III基因(lysC)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)、由thr操纵子编码的天冬氨酸激酶I基因(thrA)、高丝氨酸激酶基因(thrB)和苏氨酸合酶基因(thrC)。可引入这些基因中的两种或更多种。可将编码L-苏氨酸生物合成酶的基因引入苏氨酸分解降低的肠杆菌科细菌。苏氨酸分解降低的埃希氏菌属细菌的实例包括例如苏氨酸脱氢酶活性缺陷的TDH6株(特开2001-346578)等。
L-苏氨酸生物合成酶的酶活性受其终产物L-苏氨酸的抑制。因此，对于L-苏氨酸产生细菌的构建而言，理想的是修饰L-苏氨酸生物合成酶的基因使得所述酶在L-苏氨酸生产株中不受L-苏氨酸的反馈抑制。前述thrA、thrB和thrC基因构成了苏氨酸操纵子，其形成弱化子结构。苏氨酸操纵子的表达受培养基中异亮氨酸和苏氨酸的抑制，且还受弱化作用的阻遏。因此，可通过去除弱化作用区域或弱化子中的前导序列来修饰所述苏氨酸操纵子(参见Lynn，S.P.，Burton，W.S.，Donohue，T.J.，Gould，R.M.，Gumport，R.L和Gardner，J.F.，J.Mol.Biol.194：59-69(1987)；WO02/26993；WO2005/049808)。
苏氨酸操纵子的天然启动子存在于苏氨酸操纵子上游，且可用非天然启动子替代(参见WO98/04715))，或可构建经修饰使得苏氨酸生物合成基因的表达受阻抑物和λ噬菌体启动子调控的苏氨酸操纵子(参见欧洲专利0593792号)。此外，为了修饰埃希氏菌属细菌从而使其不受L-苏氨酸反馈抑制，可选择耐受α-氨基-β-羟基异缬氨酸(AHV)的菌株。
优选的是，经修饰不受L-苏氨酸反馈抑制的苏氨酸操纵子的拷贝数得到增加，或其表达通过将该苏氨酸操纵子连接于强启动子而得到增加。除了使用质粒扩增之外，拷贝数还可通过使用转座子、Mu噬菌体等将所述苏氨酸操纵子转移至基因组来增加。
作为天冬氨酸激酶III基因(lysC)，理想的是使用经修饰而使得所述酶不受L-赖氨酸反馈抑制的基因。此种经修饰使得所述酶不受反馈抑制的lysC基因可通过美国专利5,932,453号中所述的方法来获得。
除了增加L-苏氨酸生物合成基因的表达之外，还可优选增加参与糖酵解途径、TCA循环或呼吸链的基因、调节这些基因表达的基因或参与糖摄取的基因的表达。此类对L-苏氨酸产生有效的基因的实例包括编码转氢酶(pntAB，欧洲专利733712号)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(pepC，WO95/06114)、磷酸烯醇式丙酮酸合酶(pps，欧洲专利877090号)的基因，以及编码来自棒状杆菌或芽孢杆菌属细菌的丙酮酸羧化酶的基因(WO99/18228，欧洲专利公开1092776号)。
L-苏氨酸产生细菌还可优选地通过增强赋予宿主细菌L-苏氨酸抗性的基因和/或赋予宿主细菌L-高丝氨酸抗性的基因之表达，或通过赋予宿主细菌L-苏氨酸抗性或L-高丝氨酸抗性来获得。赋予上述抗性的基因的实例包括rhtA基因(Res.Microbiol.154：123-135(2003))、rhtB基因(欧洲专利公开0994190号)、rhtC基因(欧洲专利公开1013765号)、yfiK基因和yeaS基因(欧洲专利公开1016710号)。赋予宿主细菌L-苏氨酸抗性的示例性方法包括描述于欧洲专利公开0994190号或WO90/04636中的那些。
大肠杆菌VKPM B-3996(美国专利5,175,107号)可作为L-苏氨酸产生细菌的示例。菌株VKPM B-3996在1987年4月7日保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms(VKPM))，GNII Genetika(Russia，117545 Moscow 1，Dorozhny proezd，1)，保藏号为VKPM B-3996。所述VKPM B-3996菌株含有质粒pVIC40(WO90/04636)，其是通过将苏氨酸生物合成基因(苏氨酸操纵子，thrABC)插入含有链霉素抗性标记的广宿主谱的质粒载体pAYC32中(Chistorerdov，A.Y.和Tsygankov，Y.D.，Plasmid，16，161-167(1986))而获得的。在pVIC40中，由苏氨酸操纵子中thrA基因编码的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I不受L-苏氨酸的反馈抑制。
大肠杆菌VKPM B-5318(参见欧洲专利0593792号)也可作为优选的L-苏氨酸产生细菌的示例。VKPM B-5318菌株于1990年5月3日保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms(VKPM)GNII Genetika)，保藏号为VKPM B-5318。VKPM B-5318菌株对于L-异亮氨酸而言是原养型，并携带如下所述构建的重组质粒DNA：在其固有转录调节区域即弱化子区中有缺陷的苏氨酸操纵子(即苏氨酸生物合成基因)被置于源自λ噬菌体的温度敏感性C1阻抑子、PR启动子和编码Cro蛋白N-端的基因之下游，且所述苏氨酸生物合成基因的表达受到所述源自λ噬菌体的阻抑子和启动子的调节。
L-高丝氨酸产生细菌
属于埃希氏菌属的L-高丝氨酸产生细菌的实例包括NZ10(thrB)株，其为来源于已知株C600(thrB、leuB，参见Appleyard R.K.，Genetics，39，440-452，1954)的Leu+回复体。也优选使用经编码天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因转化的NZ10转化株。
如果细菌rhtB基因的拷贝数增加，则细菌变为对L-高丝氨酸耐受，且其对L-高丝氨酸、L-苏氨酸你、L-丙氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸的生产力提高(欧洲专利公开994190A2号)。此外，如果细菌rthC基因的拷贝数增加，则细菌变为对L-高丝氨酸和L-苏氨酸耐受，且其对L-高丝氨酸、L-苏氨酸和L-亮氨酸的生产力提高(欧洲专利公开1013765A1号)。
此外，还可使用大肠杆菌44菌株(以保藏号VKPM B-2175保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心)。
L-甲硫氨酸产生细菌
属于埃希氏菌属的L-甲硫氨酸产生细菌的实例包括菌株如大肠杆菌AJ11539(NRRL B-12399)、AJ11540(NRRL B-12400)、AJ11541(NRRLB-12401)、AJ11542(NRRL B-12402、GB 2075055)、218(VKPM B-8125，欧洲专利1239041号)等。
L-天冬氨酸产生细菌
属于埃希氏菌属的L-天冬氨酸产生细菌的实例包括其中从延胡索酸生成L-天冬氨酸的天冬氨酸酶活性增强的大肠杆菌菌株(特开昭38-6588)。
L-丙氨酸产生细菌
L-丙氨酸通过天冬氨酸的β-脱羧产生。因此，属于埃希氏菌属的L-丙氨酸产生细菌的实例包括其中天冬氨酸β-脱羧酶增强的大肠杆菌菌株(特开平2-242690)。
L-异亮氨酸产生细菌
用于衍生L-异亮氨酸产生细菌的亲本株的实例包括但不限于耐受6-二甲基氨基嘌呤的突变体(特开平5-304969)，耐受异亮氨酸类似物如硫代异亮氨酸(thiaisoleucine)和异亮氨酸氧肟酸(isoleucine hydroxamate)的突变体，和另外还耐受DL-乙硫氨酸(ethionine)和/或精氨酸氧肟酸(arginine hydroxamate)的突变体(特开平5-130882)。此外还使用经编码参与L-乙硫氨酸生物合成的蛋白质如苏氨酸脱胺酶和乙酰羟酸合酶的基因转化的重组株作为亲本株(特开平2-458，FR 0356739和美国专利5,998,178号)。
L-天冬酰胺产生细菌
天冬酰胺通过将氨基基团转移至天冬氨酸来产生(Boehlein，S.K.，Richards，N.G.J.，& Schuster，S.M.(1994a)，J.Biol.Chem.，269，7450-7457)。因此，属于埃希氏菌属的L-天冬酰胺产生细菌的实例包括其中天冬酰胺合成酶增强的产生L-天冬氨酸的大肠杆菌。
本发明的细菌可以通过下述方式获得：如上所述地修饰此类具有产生选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-甲硫氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸和L-高丝氨酸的L-氨基酸的能力的细菌从而使得其gltP基因和/或gltS基因表达增加。或者，本发明的细菌还可通过赋予经修饰而增加了gltP基因和/或gltS基因表达的细菌以产生该L-氨基酸的能力来获得。
“经修饰而增加了gltP基因和/或gltS基因的表达”的状态对应于与未修饰的菌株如野生型或亲本株相比每个细胞由gltP基因和/或gltS基因编码的分子数增加或每个分子由这些基因编码的GltP蛋白或GltS蛋白的活性提高的状态。优选细菌经修饰从而使得每个细胞的GltP蛋白或GltS蛋白的活性增加至未修饰菌株活性的150％或更多，更优选200％或更多，仍更优选300％或更多。充当上述比较的参照的未修饰菌株，如属于肠杆菌科的微生物的野生型株的实例包括例如大肠杆菌MG1655株(ATCC 47076)、W3110株(ATCC 27325)、Pantoea ananatis AJ13335株(FERM BP-6614)等。GltP和GltS蛋白的活性是指负责将L-谷氨酸从细胞外摄入细菌细胞的活性，并在本说明书中称作“L-谷氨酸转运蛋白活性”。L-谷氨酸转运蛋白活性可通过将L-谷氨酸摄入本发明微生物的速度与相应的未修饰菌株的L-谷氨酸摄入速度相比较来确证。L-谷氨酸摄入的速度可通过例如将活细胞与用RI标记一定时间的L-谷氨酸反应，并检测细胞中的放射性来测量(Wallace，B；Yang，YJ；Hong，JS；Lum，D，J.Bacteriol.，1990 Jun；172(6)：3214-3220)。
gltP基因和/或gltS基因的表达与未修饰株如亲本或野生型株的表达相比的增加，可通过将所述基因的mRNA量与野生型或未修饰株的mRNA量相比较来确证。用于确证表达量的方法的实例包括Northern杂交和逆转录PCR(RT-PCR，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，USA，2001)。表达可增加至任何水平，只要所述水平与未修饰株的水平相比增加即可，例如，期望与例如未修饰株的水平相比增加至不少于1.5倍，更优选不少于2倍，进一步优选不少于3倍。此外，由gltP基因和/或gltS基因编码的蛋白质活性的增强也可基于靶蛋白量与未修饰株中的靶蛋白量相比的增加来确证，且可通过例如使用抗体的Western印迹来对其进行检测(Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，USA，2001)。
本发明的gltP和gltS基因意指属于肠杆菌科的微生物的gltP和gltS基因或其同源物。作为大肠杆菌的gltP基因，可以以编码具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的基因(SEQ ID NO：1)作为示例(b4077，GenBank登录号NP_418501.[gi：16131903])。作为大肠杆菌的gltS基因，可以以编码具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的基因(SEQ ID NO：3))作为示例(b3653，GenBank登录号NP_418110.[gi：16131524])。
gltP或gltS基因的同源物意指这样的基因：其来源于另一种微生物，但与埃希氏菌属细菌的gltP基因或gltS基因显示高度结构相似性，且当被引入宿主时，编码具有在产生选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-甲硫氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸和L-高丝氨酸的L-氨基酸的L-氨基酸时减少L-谷氨酸副产物产生量的活性以及将谷氨酸摄入细胞的活性的蛋白质。gltP或gltS基因的同源物的实例包括例如那些在GenBank登记的基因，包括来自志贺氏菌属和肠杆菌属细菌的基因。此外，gltP基因和/或gltS基因可以是基于与上文例示的基因的同源性从链霉菌属(Streptomyces)细菌如天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)或从乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)等属的乳酸细菌克隆到的基因。可使用任何显示与埃希氏菌属细菌的gltP基因和/或gltS基因的高同源性的基因，即使该基因可能被给予不同的基因名称。gltP基因和/或gltS基因同源物包括例如能够使用合成寡核苷酸SEQ ID NO：8和9，或SEQ ID NO：10和11克隆的基因。
此外，作为gltP和/或gltS基因同源物，显示高同源性的基因可从已知数据库基于前述序列信息来获得。氨基酸序列和核苷酸序列的同源性可通过使用例如Karlin和Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873(1993))的算法BLAST或FASTA(Methods Enzymol.，183，63(1990))来确定。已基于该算法BLAST开发了称为BLASTN和BLASTX的程序(参见www.ncbi.nlm.nih.gov)。
在本说明书中，术语“同源性”也可用于指“同一性”。
与大肠杆菌gltP或gltS基因显示高度同源性的同源物与其同源度、细菌名称和基因序列数据库中的登录号一同如下所述：
Figure BDA0000064207350000171
Figure BDA0000064207350000181
Figure BDA0000064207350000191
Figure BDA0000064207350000211
在前述同源物中保守的氨基酸序列示于SEQ ID NO：12(GltP)和SEQ IDNO：13(GltS)。
此外，用于本发明的GltP基因和/或GltS基因并不限于野生型基因，其可为编码具有在SEQ ID NO：2、4、12或13中一个或多个位置上包含一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加等而得到的氨基酸序列的蛋白质的突变体或人工修饰基因，只要所编码的蛋白质的功能即L-谷氨酸转运蛋白活性并未降低。
尽管本文中使用的术语“一个或几个”意指的数目可根据氨基酸在蛋白质三维结构中的位置或其类型而有所不同，但具体而言，其可为1至20，优选1至10，更优选1至5。前述一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加相当于维持L-谷氨酸转运蛋白活性的保守突变。所述保守突变通常为保守取代。所述保守取代是这样的取代，其中如果取代位置是芳族氨基酸，则取代在Phe、Trp、Tyr之间相互发生；如果取代位置是疏水氨基酸，则在Leu、Ile和Val之间相互发生；如果是极性氨基酸，则在Gln和Asn之间相互发生；如果是碱性氨基酸，则在Lys、Arg和His之间相互发生；如果是酸性氨基酸，则在Asp和Glu之间相互发生；而如果是具有羟基的氨基酸，则取代在Ser和Thr之间相互发生。认为是保守取代的具体取代实例包括用Ser或Thr取代Ala；用Gln、His或Lys取代Arg；用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn；用Asn、Glu或Gln取代Asp；用Ser或Ala取代Cys；用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln；用Gly、Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu；用Pro取代Gly；用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His；用Leu、Met、Val或Phe取代Ile；用Ile、Met、Val或Phe取代Leu；用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys；用Ile、Leu、Val或Phe取代Met；用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe；用Thr或Ala取代Ser；用Ser或Ala取代Thr；用Phe或Tyr取代Trp；用His、Phe或Trp取代Tyr；和用Met、Ile或Leu取代Val。如上所述的氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加、倒位等突变还包括基于具有gltP基因和/或gltS基因(突变体或变体)等的微生物的个体差异、种间差异而天然发生的突变。具有此种突变的基因可通过藉由例如定点诱变修饰SEQ ID NO：1或2或其同源物的核苷酸序列从而使得在编码的蛋白质的特定位点处包含氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加来获得。
此外，作为gltP基因和/或gltS基因，可使用编码与SEQ ID NO：2、4、12或13的全氨基酸序列显示80％或更多同源性，优选90％或更多同源性，更优选95％或更多同源性，特别优选97％或更多同源性并具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质的基因。
此外，gltP基因和/或gltS基因的密码子可用方便gltP基因和/或gltS基因引入的宿主使用的那些密码子替代。而且，只要维持L-谷氨酸转运蛋白活性，由gltP基因或gltS基因编码的蛋白质可为其中N-或C-端序列延长或缺失的蛋白质。要延长或缺失的氨基酸序列长度可为按氨基酸残基数计50个或更少，优选20个或更少，更优选10个或更少，特别优选5个或更少。更具体而言，所述蛋白质可为具有SEQ ID NO：2在N-端侧具有5至50个氨基酸残基的延长或缺失或在C-端侧具有5至50个氨基酸残基的延长或缺失的氨基酸序列的蛋白质。
而且，修饰的gltP基因和/或gltS基因还可通过下述常规已知的突变处理来获得。所述突变处理的实例包括在体外用羟胺等处理一种或多种gltP基因和/或gltS基因的方法，以及用紫外线辐射或用于通常突变处理的诱变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或甲磺酸乙酯(EMS)处理含有所述基因的微生物例如埃希氏菌属细菌的方法。此种修饰的基因是否编码具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质可通过例如让所述基因在适当细胞中表达，并检查该蛋白质是否具有L-谷氨酸转运蛋白活性来确证。
而且，gltP基因和/或gltS基因还可为在严格条件下能够分别与SEQ IDNO：1或3的核苷酸序列互补的序列，或可从此类序列制备的探针杂交，并编码具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质的DNA。本文中所指的“严格条件”意指形成特异性杂交体但不形成非特异性杂交体的条件。尽管难以用数字确定地定义该条件，但其实例包括例如彼此显示高度同源性的DNA，例如显示不少于80％同源性，优选不少于90％同源性，更优选不少于95％同源性，特别优选不少于97％同源性的DNA彼此杂交，而具有低于上述水平的同源性的DNA不彼此杂交的条件，以及一般Southern杂交中的洗涤条件，即在60℃下1x SSC，0.1％SDS，优选60℃下0.1x SSC，0.1％SDS，更优选68℃下0.1x SSC，0.1％SDS的盐浓度和温度洗涤一次，优选两次或三次的条件。
作为探针，还可使用SEQ ID NO：1的序列的互补序列的一部分。此种探针可通过PCR使用基于SEQ ID NO：1的互补序列制备的寡核苷酸作为引物和含有该核苷酸序列的DNA片段作为模板来生成。举例而言，当使用具有约300bp长度的DNA片段作为探针时，杂交之后的洗涤条件可以以50℃下2xSSC，0.1％SDS作为示例。
用于增强一种或多种gltP基因和/或gltS基因的表达的修饰可通过利用例如基因重组技术增加所述基因在细胞中的拷贝数来获得。举例而言，可通过将含有gltP基因和/或gltS基因的DNA片段连接于在宿主微生物中起作用的载体(优选多拷贝载体)，制备重组DNA并将其引入细菌以转化细菌，来增加基因的拷贝数。
当使用大肠杆菌的gltP基因作为gltP基因时，其可通过PCR(聚合酶链式反应，参见White，T.J.等，Trends Genet.，5，185(1989))使用基于SEQ ID NO：1的核苷酸序列制备的引物例如SEQ ID NO：3和4所示的引物以及大肠杆菌基因组DNA作为模板来获得。来源于其他属于肠杆菌科的细菌的gltP基因也可从每种微生物的基因组DNA或基因组DNA文库使用基于该细菌或另一物种的细菌已知的gltP基因或由gltP基因编码的蛋白质的氨基酸序列信息制备的寡核苷酸作为引物通过PCR，或通过使用基于如上所述此类序列信息制备的寡核苷酸作为探针的杂交来获得。基因组DNA可从充当DNA供体的微生物通过例如Saito和Miura的方法(Saito H.和Miura K.，Biochem.Biophys.Acta，72，619，1963；Experiment Manual for Biotechnology，edited by The Society forBiotechnology，Japan，pp.97-98，Baifukan Co.，Ltd.，1992)等来制备。
然后，将通过PCR扩增的gltP基因和/或gltS基因连接于可在宿主细菌的细胞中起作用的载体DNA以制备重组DNA。可在宿主细菌的细胞中起作用的载体的实例包括可在宿主细菌的细胞中自主复制的载体。可在大肠杆菌细胞中自主复制的载体的实例包括pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pACYC184(pHSG和pACYC系列可得自Takara Bio Inc.)、RSF1010、pBR322、pMW219(pMW219可得自Nippon Gene Co.，Ltd.)、pSTV29(可得自Takara Bio Inc.)等。
为了将如上所述制备的重组DNA引入细菌，可使用迄今为止报道的任何已知的转化方法。举例而言，一种方法是用氯化钙处理受体细胞以增加其对DNA的渗透性，该方法已经在大肠杆菌K-12中有报道(Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))，还有一种方法是使用从生长细胞制备的感受态细胞，并将DNA引入该细胞，该方法已经在枯草芽孢杆菌中有报道(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.和Young，F.E.，Gene，1，153(1977))。使得DNA受体细胞变为易于摄入重组DNA的原生质体或球状体，并将重组DNA引入其中的方法也是适用的，该方法已知适用于枯草芽孢杆菌、放线菌和酵母(Chang，S.和Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.和Hopwood，O.A.，Nature，274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.和Fink，G.R.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978))。
还可通过将如上所述一种或多种gltP基因和/或gltS基因的多重拷贝整合入细菌基因组来增加一种或多种gltP基因和/或gltS基因的拷贝数。为了将一种或多种gltP基因和/或gltS基因的多重拷贝整合入细菌基因组，通过靶向在基因组DNA中以多重拷贝存在的序列来实施同源重组。作为在基因组上以多重拷贝数存在的序列，可使用重复DNA或可转座元件末端存在的反向重复序列。可将所述基因以串联形式连接于基因组上存在的gltP基因和/或gltS基因旁侧，或者也可将所述基因引入基因组中的非必需基因中从而使得所述基因以多拷贝数存在。此种基因转移可通过使用温度敏感性载体或整合载体(integration vector)来获得。
或者，如特开平2-109985所公开的，还可能将gltP基因和/或gltS基因掺入转座子，并容许其被转移，以将所述基因的多重拷贝引入基因组DNA。所述基因是否已经转移入基因组可通过使用gltP基因和/或gltS基因的一部分作为探针实施Southern杂交来确证。
此外，除了如上所述通过增加基因拷贝数之外，还可根据WO00/18935中所述的方法通过用更强的启动子来替代基因组DNA或质粒上gltP基因和/或gltS基因的表达调控序列如启动子、修饰-35区和-10区序列使该序列变为共同序列、扩增可增加gltP基因和/或gltS基因表达的调节子，或者删除或减弱可减少gltP基因和/或gltS基因表达的调节子来增强gltP基因和/或gltS基因的表达。举例而言，已知lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、araBA启动子、lambda噬菌体PR启动子和PL启动子、tet启动子、T7启动子、Φ10启动子等为强启动子。还可使用来源于大肠杆菌苏氨酸操纵子的启动子或SEQ ID NO：7的tac启动子的启动子。
还可通过引入核苷酸取代等手段来修饰gltP基因和/或gltS基因的启动子区、RBS(核糖体结合序列)或SD区，使之变得更强。一个含有tac启动子和lac基因的RBS的DNA片段的核苷酸序列示于SEQ ID NO：7。用于评估启动子强度的方法和强启动子描述于Goldstein等(Prokaryotic promoters inbiotechnology，Biotechnol.Annu.Rev.，1，105-128(1995))的论文等。此外，已知在核糖体结合位点(RBS)与起始密码子之间的间隔序列中，特别是起始密码子紧邻上游的序列中的几个核苷酸的取代可极大地影响mRNA翻译效率，因此可修饰该序列。gltP基因和/或gltS基因的表达调控区如启动子可通过使用启动子探测载体或基因分析软件如GENETYX来鉴别。通过如上所述的此类启动子取代或修饰，可增强gltP基因和/或gltS基因的表达。表达调控序列的取代还可通过例如使用温度敏感性质粒或Red驱动整合(WO2005/010175)的方法来获得。
前面涉及基因和蛋白质的同源物，以及增加基因表达的记载还可类似地适用于gltP基因和/或gltS基因之外的基因，例如，用于赋予L-氨基酸产生活性的基因、ybjE基因及其表达产物。
<2>用于产生L-氨基酸的方法
用于产生本发明的L-氨基酸的方法的特征在于在培养基中培养本发明的细菌以在培养基中产生并累积选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-甲硫氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸和L-高丝氨酸的L-氨基酸，并从培养基或细胞收集所述L-氨基酸。
作为所用的培养基，可使用常规供使用细菌通过发酵生产L-氨基酸的方法的培养基。即，可使用含有碳源、氮源、无机离子以及任选地其他视需要的有机成分的通常培养基。作为碳源，可使用糖如葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖和淀粉水解物；醇如甘油和甘露醇；以及有机酸如延胡索酸、柠檬酸和琥珀酸。特别优选使用葡萄糖、果糖或蔗糖作为碳源。此外，对于不具有蔗糖同化能力的菌株，如果将蔗糖同化基因引入此类菌株，就有可能使用蔗糖作为碳源(美国专利5,175,107号)。作为氮源，可使用无机铵盐如硫酸铵、氯化铵和磷酸铵，有机氮如大豆水解物、氨气、氨水等。作为有机痕量营养源，理想的是培养基含有适当量的必需物质如维生素B1和L-高丝氨酸，酵母提取物等。除了上述之外，根据需要添加少量磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。此外，用于本发明的培养基还可为天然培养基或合成培养基，只要使用含有碳源、氮源和无机离子，以及根据需要含有其他的有机痕量成分的培养基即可。
而且，可添加促进生长和生产力的L-氨基酸。在L-赖氨酸发酵的场合，优选添加L-苏氨酸、L-高丝氨酸和/或L-异亮氨酸，而在L-苏氨酸发酵的情况下，优选添加L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-高丝氨酸等。添加的浓度约为0.01至10g/L。
培养优选在有氧条件下实施1至7日。培养温度优选为24至37℃，且培养过程中pH优选为5至9。对于pH调整，可使用无机或有机酸性或碱性物质、氨气等。从发酵培养基收集L-氨基酸通常可通过已知方法(如离子交换树脂方法和沉淀方法)的组合来实现。当L-氨基酸在细胞中累积时，可用例如超声波等破碎细胞，并可从通过离心从细胞破碎悬液中去除细胞而得的上清液中通过离子交换树脂方法等收集L-氨基酸。
当生产碱性氨基酸如L-赖氨酸时，可通过这样的方法来实施该生产：其中在培养过程中将培养基pH控制为6.5至9.0，而培养结束时将培养基pH控制为7.2至9.0，并确保存在培养基含有20mM或更多碳酸氢根离子和/或碳酸根离子的培养期间，从而使得这些碳酸氢根离子和/或碳酸根离子充当所述碱性氨基酸的反荷离子，然后收集目标碱性氨基酸的方法(特开2002-65287，美国专利公开2002/0025564号，欧洲专利公开1813677号)。
当在有氧条件下在培养基中培养具有碱性氨基酸产生能力的微生物时，可将碳酸根离子、碳酸氢根离子或其二者用作所述碱性氨基酸的主要反荷离子。为了提供充当所述碱性氨基酸反荷离子所需量的碳酸根离子和/或碳酸氢根离子，已知可将培养基pH在培养期间控制为6.5至9.0，优选6.5至8.0，而在培养结束时可控制为7.2至9.0，且可控制发酵罐中的压力使得在发酵过程中为正压，或向培养基供应二氧化碳或含有二氧化碳的混合气体(特开2002-65287，美国专利公开2002/0025564号，欧洲专利公开1813677号)。
在本发明中，发酵罐中的压力可在发酵过程中控制为正压，且同时可向培养基供应二氧化碳气或含有二氧化碳气的混合气体。上述两个操作均优选如此实施，使得有一段培养期中培养基中存在优选20mM或更多，更优选30mM或更多，特别优选40mM或更多的碳酸氢根离子和/或碳酸根离子。发酵罐的内部压力、二氧化碳或含有二氧化碳的混合气体的供应量，或受限的气体供应体积可通过例如测量培养基中的碳酸氢根离子或碳酸根离子，或培养基的pH或氨浓度来确定。
在上述实施方案中，在培养过程中将培养基的pH控制为6.0至9.0，优选6.5至8.0，在培养结束时控制为7.2至9.0。根据上述实施方案，可在确保存在作为反荷离子所需的量的碳酸氢根离子和/或碳酸根离子的同时，使培养基的pH比常规方法更低。当用氨控制pH时，供应氨以增加pH，且其可充当所述碱性氨基酸的氮源。除了所述碱性氨基酸之外培养基中阳离子的实例包括来自培养基组分的K、Na、Mg、Ca等。这些优选以总阳离子的50％或更少的量存在。
此外，在发酵过程中发酵罐的内部压力可通过例如使气体供应压力高于排气压力而成为正压。通过使得发酵罐内部压力为正压，发酵生成的二氧化碳溶解于培养基中以生成碳酸氢根离子或碳酸根离子，且这些可充当所述碱性氨基酸的反荷离子。发酵罐的起始压力以表压(相对于大气压的压差)计具体为0.03至0.2MPa，优选0.05至0.15MPa，更优选0.1至0.3MPa。而且，通过向培养基供应二氧化碳或含有二氧化碳的混合气体，可将二氧化碳溶解于培养基。此外，当向培养基供应二氧化碳或含有二氧化碳的混合气体时，可将发酵罐的内压调整为正压。
发酵罐的内压可通过例如使得供气压力高于排气压力来调整为正压。此外，当向培养基供应二氧化碳时，例如，可将纯二氧化碳或含有5％体积或更多二氧化碳的混合气体鼓泡到培养基中。
前述将碳酸氢根离子和/或碳酸根离子溶解于培养基的方法可单独使用，或可将其两种或更多种组合使用。
在常规方法中，通常将足量的硫酸铵或氯化铵添加至培养基以充当要产生的碱性氨基酸的反荷离子。蛋白质等的硫酸或盐酸分解产物也被添加到培养基中作为营养组分，因此由其生成的硫酸根离子和氯离子存在于培养基中。因此，在培养过程中弱酸性的碳酸根离子的浓度极低，即处于ppm级。本发明的上述实施方案的特征在于减少了这些硫酸根离子和氯离子，而在发酵过程中由微生物释放的二氧化碳以前述发酵环境溶解于培养基中，并被用作反荷离子。因此，在本发明的上述实施方案中，无需向培养基添加多于生长所需的量的硫酸根离子或氯离子。优选的是，在培养早期将适当量的硫酸铵等添加至培养基，并在培养中期停止该添加。或者，可添加硫酸铵等并同时维持其与培养基中溶解的碳酸根离子或碳酸氢根离子的平衡。而且，作为所述碱性氨基酸的氮源，可向培养基中加入氨。氨可独立向培养基供应，或可与其他气体一同供应。
更加优选的是，培养基中除了碳酸氢根离子和/或碳酸根离子之外的阴离子的浓度较低，只要它们以微生物生长所需的量存在。此类阴离子的实例包括氯离子、碳酸根离子、磷酸根离子、离子化有机酸、氢氧根离子等。这些其他离子的总摩尔浓度优选通常为900mM或更低，更优选700mM或更低，仍更优选500mM或更低，进一步优选300mM或更低，特别优选200mM或更低。
减少所需的硫酸根离子和/或氯离子的量是本发明上述实施方案的一个目标，且培养基中含有的硫酸根离子的总量或氯离子的总量或二者的总量通常为700mM或更低，优选500mM或更低，更优选300mM或更低，仍更优选200mM或更低，特别优选100mM或更低。
如果将硫酸铵作为碱性氨基酸的反荷离子源添加至培养基，培养基中的二氧化碳通常被硫酸根离子消除。然而，在本发明的上述实施方案中，无需向培养基添加过量的硫酸铵，因此二氧化碳可容易地溶解于发酵培养基中。
此外，在本发明的上述实施方案中，优选控制培养基中的总氨浓度至“不抑制碱性氨基酸产生”的程度。用于获得此种状态的条件的实例包括，例如，提供相当于在最适条件下生产所述碱性氨基酸可获得的产率和/或生产力的优选50％或更多，更优选70％或更多，特别优选90％或更多的产率或生产力的条件。具体而言，培养基中的总氨浓度优选300mM或更低，更优选250mM或更低，特别优选200mM或更低。氨的解离度随着pH变高而减少。未解离的氨与铵离子相比对细菌更具毒性。因此，总氨浓度的上限还应根据培养基的pH来确定。即，随着培养基pH的增加，可接受的总氨浓度降低。因此，前述“不抑制碱性氨基酸产生的”总氨浓度优选就每个具体的pH值来确定。然而，可以用在发酵过程中最高pH水平下可以接受的总氨浓度范围作为整个培养期间总氨浓度的上限。
在另一方面，作为微生物生长和碱性物质产生所需的氮源起作用的氨的总浓度并无特别限制，并且可以合适地予以确定，只要所述氮源的降低的水平(其可导致培养过程中氨的持续消耗)不致于降低所述微生物对目标物质的生产力即可。举例而言，可于培养过程中随时间测量氨浓度，而如果培养基中的氨耗竭，则向培养基添加少量氨。尽管添加氨之后的总氨浓度并无特别限制，总氨浓度可为例如优选1mM或更高，更优选10mM或更高，特别优选20mM或更高。
用于本发明的培养基可为任何培养基，只要其为含有碳源和氮源作为营养源的培养基。对于本发明的方法，可使用任何分批培养、分批补料培养和连续培养。
前述分批补料培养指将培养基连续或间歇地补加到培养中的容器中，而在培养完成之前不将培养基从容器取出的培养方法。连续培养指将培养基连续或间歇地补加到培养中的容器中，并将培养基从培养中的容器取出(通常，取出的量等于补加的培养基量)的方法。在本说明书中，术语“起始培养基”意指用于在分批补料培养或连续培养中补加补料培养基之前的分批培养所使用的培养基，而术语“补料培养基”意指当实施分批补料培养或连续培养时供应给发酵罐的培养基。补料培养基可含有微生物生长所需的全部或部分组分。在本说明书中，术语“发酵培养基”意指发酵罐中含有的培养基，而目标物质从该发酵培养基收集。此外，在本说明书中，术语“发酵罐”意指其中进行碱性氨基酸产生的容器，其形状并无限制。可使用发酵槽或发酵缸。此外，发酵罐的体积并无制限，只要可产生并收集目标物质即可。
作为用于本发明的培养基中含有的碳源，可使用糖如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物和糖蜜，且特别优选葡萄糖和蔗糖。此外，还可单独使用或与其他碳源组合使用有机酸(如乙酸和柠檬酸)以及醇(如乙醇和甲醇)。此外，作为碳源的原材料，可使用甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、高级糖蜜(high test molasses)、柑橘糖蜜和转化糖。且还可使用天然原材料(如纤维素、淀粉、玉米、谷物和木薯淀粉)的水解物。此外，溶解于培养基中的二氧化碳也可用作碳源。这些碳源可用于起始培养基和补料培养基中。所述培养基可含有这些碳源中的一种或两种或更多种。此外，起始培养基和补料培养基可使用相同碳源，或者补料培养基的碳源可与起始培养基的碳源不同。举例而言，可使用葡萄糖作为起始培养基的碳源，而可使用蔗糖作为补料培养基的碳源。
作为本发明的培养基中含有的氮源，可使用氨、铵盐如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵、乙酸铵和尿素，硝酸盐等。用于调节pH的氨气和氨水也可利用来作为氮源。此外，还可使用蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆水解物等。所述培养基可含有一种或两种或更多种这些氮源。这些氮源可用于起始培养基和补料培养基两者。此外，相同氮源可用作起始培养基和补料培养基，或补料培养基的碳源可与起始培养基的碳源不同。
此外，本发明的培养基优选除了含有碳源和氮源之外还含有磷源。作为磷源，可使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸盐聚合物如焦磷酸等。
此外，本发明的培养基除了含有碳源和氮源之外还可含有生长促进因子(显示生长促进作用的营养物)。作为生长促进因子，可使用痕量金属、氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸以及含有前述物质的蛋白胨、酪蛋白水解物、酵母提取物、大豆蛋白降解产物等。具体而言，在芳族氨基酸和支链氨基酸的场合，其生物合成系统是共通的，因此微生物除了目标氨基酸外的其他氨基酸的生物合成可如后所述地减弱。在此种情况下，优选将其生物合成系统被减弱的氨基酸添加至培养基。举例而言，当目标氨基酸是L-赖氨酸时，此种氨基酸为L-甲硫氨酸、L-苏氨酸或L-异亮氨酸。
痕量金属的实例包括铁、锰、镁、钙等。维生素的实例包括维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、烟酰胺、维生素B12、吡哆醇、泛酸等。这些生长促进因子可包含于起始培养基或补料培养基中。
此外，当使用其生长需要氨基酸等的营养缺陷型突变株时，优选向本发明中使用的培养基补充所需营养物。具体而言，由于在如后所述的可用于本发明的L-氨基酸产生细菌中，通常L-氨基酸生物合成途径被增强且L-氨基酸降解能力被减弱，期望添加一种或多种选自L-赖氨酸、L-高丝氨酸、L-异亮氨酸和L-甲硫氨酸的物质。类似地，还优选将所需物质添加至用于核酸产生细菌的培养基。
起始培养基和补料培养基可具有相同或不同的培养基组成。此外，当起始培养基和补料培养基含有晶种时，晶种浓度可为相同的或不同的。此外，当补料培养基以多个阶段给料时，补料培养基的组成可为相同的或不同的。
培养优选在通气培养下在20至45℃，特别优选30至42℃的发酵温度实施。
培养后L-氨基酸从培养基的收集可通过已知的收集方法(例如离子交换树脂法、沉淀法和其他已知方法)的组合来实施。当L-氨基酸沉积于培养基中时，其可通过离心或过滤来收集。而且，当L-氨基酸沉积于培养基中时，可使溶解于培养基中的L-氨基酸结晶，然后可将沉积的L-氨基酸和所述晶体一同分离。
在本发明中，微生物培养可通过种子培养和主培养来实施以确保L-氨基酸的累积高于一定水平。种子培养可作为振荡培养使用烧瓶等来实施，或作为分批培养来实施，而主培养可作为分批补料培养、分批培养或连续培养来实施。或者，种子培养和主培养两者均可作为分批培养来实施。此外，可在所述种子培养和主培养之前实施一次或两次或更多次预培养，在这些培养过程中逐渐增加培养的规模。
在这些培养方法中，当L-氨基酸浓度达到预定水平时，可取出部分L-氨基酸，且可新添加培养基以重复培养。作为新添加的培养基，优选含有碳源和具有生长促进作用的营养物(生长促进因子)的培养基。作为待添加的培养基的碳源，优选葡萄糖、蔗糖和果糖。作为生长促进因子，优选氮源、磷酸、氨基酸等。作为氮源，可使用氨、铵盐如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵、乙酸铵和尿素，硝酸盐等。此外，作为磷酸源，可使用磷酸二氢钾和磷酸氢二钾。作为氨基酸，当使用营养缺陷型突变株时，优选补充添加所需的营养物。
当根据本发明实施分批补料培养或连续培养时，可间歇地给予补料培养基从而使得糖或营养物的供应暂时停止。补料培养基的供应停止的时间优选为补料时间的最多30％或更少，理想的是20％或更少，特别理想的是10％或更少。当补料培养基是间歇给料时，可首先添加预定时间的补料培养基，然后可控制第二次和后续的添加，使得发酵培养基中的碳源在特定培养基添加期间之前的添加停止期内耗尽，计算机检测到pH或溶解氧浓度的上升时开始添加，这样培养罐中的底物浓度总是自动维持在低水平(美国专利5,912,113号)。补料培养基的碳源与上文所述相同。此外，补料培养基可由一种培养基或两种或更多种培养基的混合物组成。当使用两种或更多种补料培养基时，可混合所述培养基并通过使用一个补料罐补加，或其可通过使用两个或更多个补料罐补加。
当实施分批补料培养时，优选补加补料培养基使得糖以这样的量被补加，以至于补料培养基或整个发酵培养基中碳源的量不超过30g/L，且优选其控制为20g/L或更低，更优选10g/L或更低。具体而言，优选控制糖浓度，使得其在微生物的对数增殖期结束或之后在前述浓度范围中。碳源的给料速率可使用美国专利5,912,113号中的方法来控制。此外，糖和磷酸优选以这样的浓度补加，使得所述糖和磷酸充当细菌细胞生长的限制因素。磷酸可以存在于以磷/碳(P/C)比2或更低，优选1.5或更低，更优选1或更低的量补料培养基中(参见美国专利5,763,230号)。
当在本发明中使用连续培养方法时，可同时取出和补加培养基，或可取出部分培养基，然后补加培养基。此外，所述方法还可为包括再循环细胞的连续培养方法，其中取出含有L-氨基酸和细菌细胞的培养基，并仅将细胞送回发酵罐(参见法国专利2669935号)。作为连续或间歇地给予营养源的方法，使用与用于分批补料培养的相同的方法。
当培养培养基是间歇地取出时，当L-氨基酸浓度达到预定水平时取出部分L-氨基酸，并补加新鲜培养基以继续培养。此外，优选实施所述培养使得添加培养基之后培养基的终体积等于取出之前培养培养基的体积。术语“等于”意指添加培养基之后培养基的体积相当于取出之前培养基的体积的约93至107％。
当培养培养基是连续地取出时，期望在补加营养培养基的同时或之后启动取出过程。举例而言，在起始补料之后5小时内，优选3小时内，更优选1小时内，可开始取出。此外，培养培养基的取出体积优选等于给料的培养基体积。
包括再循环细菌细胞的连续培养方法是当L-氨基酸浓度达到预定水平间歇地或连续地取出发酵培养基，仅取出L-氨基酸，并将含有细菌细胞的过滤残留物或离心上清重新循环入发酵容器的方法，且其可通过参照例如法国专利2669935号来实施。
含有通过本发明获得的碱性氨基酸的发酵液优选包含碳酸根离子和/或碳酸氢根离子从而使得由下述等式表示的当量浓度比为5至100％：
当量浓度比＝(碳酸氢根离子和/或碳酸根离子的当量浓度)/(主要由碱性氨基酸组成的阳离子的当量浓度)x100
在加热时，培养基中的碳酸根离子和碳酸氢根离子作为二氧化碳释放，由此增加了发酵液固形物成分中的碱性氨基酸含量。此外，由于碳酸根可通过将比碳酸更强的酸添加至发酵液而为置换为该酸，可选择多种盐形式。
实施例
下文中，通过参照实施例更加具体地解释本发明。
实施例1：构建用于增强gltP基因或gltS基因的质粒
已经阐明了大肠杆菌K-12株的全基因组核苷酸序列(Genbank登录号U00096，Science，277，1453-1474(1997))。为了扩增目标基因，使用质粒载体pMW118(Nippon Gene)。该质粒具有用于克隆任意基因的多克隆位点，它是能够使用该位点克隆基因并扩增该基因的质粒。
基于在大肠杆菌基因组序列中的gltP基因或gltS基因及其两侧区域中的核苷酸序列，分别合成了如SEQ ID NO：8所示的合成寡核苷酸作为5’引物和如SEQ ID NO：9所示的合成寡核苷酸作为3’引物以供扩增gltP，以及如SEQID NO：10所示的合成寡核苷酸作为5’引物和如SEQ ID NO：11所示的合成寡核苷酸作为3’引物以供扩增gltS。通过使用这些引物，用大肠杆菌K-12MG1655株的基因组DNA作为模板实施PCR获得分别含有gltP和gltS基因的片段。将纯化后的PCR产物平端化，并与经SmaI消化的载体pMW118连接，构建用于gltP扩增的质粒pMW-gltP，以及用于gltS扩增的质粒pMW-gltS。
实施例2：增强WC196ΔcadAΔldcC株的ybjE基因
作为L-赖氨酸产生细菌的亲本株，使用描述于国际专利公开WO2006/078039中的WC196ΔcadAΔldcC株。该株相当于使用Red驱动整合(Datsenko，K.A.和Wanner B.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97：6640-6645(2000))和来源于λ噬菌体的切出系统(J.Bacteriol.，184：5200-5203(2002))的组合破坏了赖氨酸脱羧酶基因cadA和ldcC的大肠杆菌WC196株。该菌株于2008年10月7日被保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本茨城县筑波市东一丁目1-1，筑波中央第6，305-8566)，保藏号为FERMBP-11027。
已知通过增强具有L-赖氨酸分泌活性的YbjE蛋白活性来促进L-赖氨酸产生活性(美国专利申请公开2006/0019355号)。因此，分别通过将WC196ΔcadAΔldcC株的染色体上的ybjE基因启动子修饰为tac启动子，并将相同基因的核糖体结合位点(RBS)修饰为来源于lac基因上游序列的序列来增强ybjE基因在WC196ΔcadAΔldcC株中的表达。
WC196ΔcadAΔldcC株的ybjE基因的启动子和RBS序列的修饰是通过前述方法使用Red驱动整合和来源于λ噬菌体的切出系统的组合来获得的。具体而言，将ybjE基因(SEQ ID NO：5)起始密码子上游157bp的序列(核苷酸数49至51)用SEQ ID NO：7的序列置换。其中发生了该目的基因置换的菌株可基于卡那霉素抗性作为指标来选择。通过PCR确证目的在候选株中发生了基因置换。所获得的其中ybjE基因的启动子和RBS序列经修饰的菌株命名为WC196LCY株。
实施例3：gltP和gltS基因扩增在埃希氏菌属细菌L-赖氨酸生产株中的作用。
<3-1>将用于赖氨酸产生的质粒引入WC196LCY株
将WC196LCY株用携带dapA、dapB和lycC基因的赖氨酸产生用质粒pCABD2(欧洲专利0733710号)以常规方式转化以获得WC196LCY/pCABD2株。pCABD2含有编码具有导致其不受L-赖氨酸反馈抑制的突变的大肠杆菌二氢吡啶二羧酸合酶(DDPS)的DNA，编码具有导致其不受L-赖氨酸反馈抑制的突变的大肠杆菌天冬氨酸激酶III的DNA，编码大肠杆菌二氢吡啶二羧酸还原酶的DNA，和编码乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)二氨基庚二酸脱氢酶的DNA。
WC196LCY/pCABD2株用分别在实施例1中产生的供gltP扩增的质粒pMW-gltP和供gltS扩增的质粒pMW-gltS来转化以获得氨苄青霉素抗性株。当确证预定的质粒引入每个转化体之后将引入了供gltP扩增的质粒pMW-gltP的菌株命名为WC196LCY/pCABD2/pMW-gltP株，而将引入了供gltS扩增的质粒pMW-gltS的菌株命名为WC 196LCY/pCABD2/pMW-gltS株。而且，制备了用pMW118转化的菌株作为对照，并命名为WC196LCY/pCABD2/pMW118株。
将上述产生的每个菌株在含有25mg/L链霉素和100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中培养直至培养物的OD600变为约0.6，然后将等体积的40％甘油溶液添加至培养物，并搅拌混合物，将其分为适当体积，并作为甘油储液储藏于-80℃。
<3-2>赖氨酸产生培养
将上述甘油储液解冻，并均匀地以500μL的体积分别涂布于含有25mg/L链霉素和100mg/L氨苄青霉素的L板上，并在37℃实施培养24小时。将相当于从一个板上获得的细胞的1/8的量的细胞接种于500ml容积的坂口烧瓶中所含的20mL含有25mg/L链霉素和100mg/L氨苄青霉素的下述发酵培养基中，并在37℃在往复振荡的培养装置中培养22小时。在培养之后，用Biotec Analyzer AS210(SAKURA SEIKI)测量培养基中累积的L-赖氨酸和L-谷氨酸的量。用于培养的培养基组成如下所示：
L-赖氨酸产生培养基
Figure BDA0000064207350000361
(日本药典)
将培养基用KOH调整至pH 7.0，并在115℃蒸汽灭菌10分钟，但是葡萄糖和MgSO4·7H2O混合并与其他成分分开进行灭菌。CaCO3在热空气灭菌之后添加。
在培养22小时之后观察到的L-赖氨酸产率和L-谷氨酸浓度示于表3，其相对值是基于作为对照设为100的WC196LCY/pCABD2/pMW118的观测值。
图3：在L-赖氨酸产生细菌WC196LCY/pCABD2中gltP或gltS扩增的作用
Figure BDA0000064207350000362
在扩增了gltP基因的WC196LCY/pCABD2/pMW-gltP株和扩增了gltS基因的WC196LCY/pCABD2/pMW-gltS株中，与作为对照的WC196LC/pCABD2/pMW118相比L-谷氨酸副产物的产生量减少，而L-赖氨酸的产率不减少。
实施例4：gltP或gltS基因扩增在埃希氏菌属细菌L-苏氨酸产生株中的作用
作为L-苏氨酸生产株，使用大肠杆菌VKPM B-3996株(参见美国专利5,175,107号)。
用在实施例1中产生的供gltP扩增的pMW-gltP质粒和供gltS扩增的pMW-gltS质粒分别转化B-3996以获得氨苄青霉素抗性株。在确证了预定的质粒引入每个转化体之后，将引入了供gltP扩增的pMW-gltP质粒的株命名为B-3996/pMW-gltP株，而引入了供gltS扩增的pMW-gltS质粒的株命名为B-3996/pMW-gltS株。而且，制备了用pMW118转化的株作为对照，并命名为B-3996/pMW118株。
将上述产生的每个株在37℃在含有100mg/L氨苄青霉素和20mg/L链霉素硫酸盐的LB培养基中培养至培养物的OD600变为约0.6，然后将等体积的40％甘油溶液添加至培养物，搅拌混合物，然后将其分为适当体积，并作为甘油储液储藏于-80℃。
将上述甘油储液解冻，并以150μL的体积均匀地分别涂布于含有100mg/L氨苄青霉素和20mg/L链霉素硫酸盐的L-板上，并在37℃实施培养24小时。将相当于一个板上获得的细胞的约1/10的量的细胞接种于带挡板的烧瓶中50mL含有100mg/L氨苄青霉素和20mg/L链霉素硫酸盐的LB培养基中，并在40℃以144rpm培养4小时作为种子培养。
在完成了种子培养之后，将种子培养培养基以30ml体积(相当于主培养培养基体积的10％)接种于1L体积发酵缸中所含的300mL下述主培养培养基中，并在40℃和pH 7.0实施培养。
主培养培养基组成
Figure BDA0000064207350000371
Figure BDA0000064207350000381
将葡萄糖和MgSO4·7H2O混合，并与其他组分分开进行灭菌。
在培养过程中，通过添加氨气将培养基调整为pH 7.0。
在实施培养15.5小时之后，通过HPLC测量培养基中累积的L-苏氨酸浓度。而且，用Biotec Analyzer AS210(SAKURA SEIKI)测量L-谷氨酸的量。L-苏氨酸产率和L-谷氨酸浓度示于表4，其相对值是基于作为对照的B-3996/pMW118的观测值(设为100)。
表4：在L-苏氨酸产生细菌B-3996中gltP或gltS扩增的作用
Figure BDA0000064207350000382
在扩增了gltP基因的B-3996/pMW-gltP株和扩增了gltS基因的B-3996/pMW-gltS株中，与作为对照的B-3996/pMW118相比L-谷氨酸副产物的产生量减少，而L-苏氨酸的产率不减少。
实施例5：埃希氏菌属细菌的L-苏氨酸产生株中gltP或gltS基因扩增的作用和gadC基因扩增的作用的比较
作为关于扩增具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质的L-氨基酸产生方法的现有认识，已知通过同时扩增编码具有L-谷氨酸/GABA反向转运蛋白活性的蛋白质的gadC以及编码具有谷氨酸脱羧酶活性的蛋白质的gadB，可促进L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-色氨酸的生产力(WO2008/044453)。因此，将gltP或gltS扩增对于减少谷氨酸副产物产量的作用与gadC扩增的作用进行比较。
为了构建用于扩增gadC的质粒，使用描述于WO2008/044453中的质粒pMWPthr。该质粒相当于载体pMW118(Nippon Gene)的HindIII位点和XbaI位点之间具有大肠杆菌基因组上的苏氨酸操纵子(thrABC)启动子区，在该启动子下游可插入基因使得基因能够被扩增。
基于大肠杆菌基因组中gadC基因的核苷酸序列及其两侧区域，制备了示如SEQ ID NO：14所示的合成寡核苷酸作为5’引物和如SEQ ID NO：15所示的合成寡核苷酸作为3’引物，用它们对作为模板的大肠杆菌K-12W3110株的基因组DNA实施PCR，由此获得含有gadC基因的基因片段。将纯化的PCR产物用SacI和SmaI消化，并与经SacI和SmaI消化的载体pMWPthr连接以构建用于gadC扩增的质粒pMW-gadC。
以与实施例4相同的方式用pMW-gadC转化B-3996，并将所得的转化体命名为B-3996/pMW-gadC株。将该株与B-3996/pMW118、B-3996/pMW-gltP和B-3996/pMW-gltS以实施例4中相同的方式一同培养。培养基中累积的L-谷氨酸浓度以基于作为对照的B3996/pMW118的观测值(取为100)的相对值的形式示于表5。
图5：L-苏氨酸产生细菌菌株B-3996中gltP或gltS基因扩增的作用和gadC扩增的作用的比较。
在gltP基因扩增的B-3996/pMW-gltP菌株和gltS基因扩增的菌株B-3996/pMW-gltS菌株中，L-谷氨酸副产物产量显著减少。另一方面，在gadC扩增的菌株B-3996/pMW-gadC中，L-谷氨酸浓度并未减少，反而增加，因此显然gadC的扩增并不具有降低发酵培养基中L-谷氨酸浓度的作用。
序列表释义
SEQ ID NO：1：gltP基因序列
SEQ ID NO：2：GltP氨基酸序列
SEQ ID NO：3：gltS基因序列
SEQ ID NO：4：GltS氨基酸序列
SEQ ID NO：5：ybjE基因序列
SEQ ID NO：6：YbjE氨基酸序列
SEQ ID NO：7：用于取代的ybjE上游序列
SEQ ID NO：8：用于gltP扩增的引物(5′侧)
SEQ ID NO：9：用于gltP扩增的引物(3′侧)
SEQ ID NO：10：用于gltS扩增的引物(5′侧)
SEQ ID NO：11：用于gltS扩增的引物(3′侧)
SEQ ID NO：12：gltP保守序列
SEQ ID NO：13：gltS保守序列
SEQ ID NO：14：用于gadC扩增的引物(5′侧)
SEQ ID NO：15：用于gadC扩增的引物(3′侧)
产业应用性
通过使用本发明的方法，可在L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-甲硫氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸和L-高丝氨酸的发酵生产中减少副产物。
Figure IDA0000064207440000011
Figure IDA0000064207440000021
Figure IDA0000064207440000031
Figure IDA0000064207440000061
Figure IDA0000064207440000071
Figure IDA0000064207440000081
Figure IDA0000064207440000101
Figure IDA0000064207440000111
Figure IDA0000064207440000121
Figure IDA0000064207440000131
Figure IDA0000064207440000141
Figure IDA0000064207440000151

Claims (13)

1.一种产生L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)并具有L-氨基酸产生能力的细菌以在培养基中产生和累积所述L-氨基酸，并从培养基收集所述L-氨基酸，其中：
所述细菌已经过修饰从而增加了gltP基因和/或gltS基因的表达，且所述L-氨基酸选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-甲硫氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸和L-高丝氨酸。
2.根据权利要求1的方法，其中所述gltP基因编码下述(A)或(B)所示的蛋白质：
(A)具有SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列并具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质，
(B)具有在SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质。
3.根据权利要求2的方法，其中所述gltP基因编码下述(A1)或(B1)所示的蛋白质：
(A1)具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白质，
(B1)具有在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述gltP基因是下述(a)或(b)所示的DNA：
(a)具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA，
(b)能够与同SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列互补的序列或者与可从该核苷酸序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质的DNA。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述gltS基因编码下述(C)或(D)所示的蛋白质：
(C)具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列并具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质，
(D)具有在SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质。
6.根据权利要求5的方法，其中所述gltS基因编码下述(C1)或(D1)所示的蛋白质：
(C1)具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的蛋白质，
(D1)具有在SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述gltS基因是下述(c)或(d)所示的DNA：
(c)具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的DNA，
(d)能够与同SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列互补的序列或者与可从该核苷酸序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有L-谷氨酸转运蛋白活性的蛋白质的DNA。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述基因的表达是通过增加该基因的拷贝数或通过修饰该基因的表达调控序列而得到增强的。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述L-氨基酸是L-赖氨酸，且在该细菌中ybjE基因的表达得到增加。
10.根据权利要求9的方法，其中所述ybjE基因编码下述(E)或(F)所示的蛋白质：
(E)具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列或SEQ ID NO：6中第17至315号氨基酸的氨基酸序列的蛋白质，
(F)具有在SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列或SEQ ID NO：6中第17至315号氨基酸的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并具有L-赖氨酸分泌活性的蛋白质。
11.根据权利要求9或10的方法，其中所述ybjE基因是下述(e)或(f)所示的DNA：
(e)具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列或SEQ ID NO：5中第49至948号核苷酸的核苷酸序列的DNA，
(f)能够与同SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列或SEQ ID NO：5中第49至948号核苷酸的核苷酸序列互补的序列或者与可从这些核苷酸序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有L-赖氨酸分泌活性的蛋白质的DNA。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述L-氨基酸是L-赖氨酸，将生产培养过程中培养基的pH控制在6.0至9.0，并将培养结束时培养基的pH控制在7.2至9.0，且保证有一段培养期内培养基中存在20mM或更多的碳酸氢根离子和/或碳酸根离子，从而使得所述碳酸氢根离子和/或碳酸根离子充当碱性氨基酸的反荷离子。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述细菌是埃希氏菌属(Escherichia)细菌。
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