BRPI0921655A2 - método para produzir um l-aminoácido - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA PRODUZIR UM L-AMINOÁCIDO. L-lisina, L-treonina, L-asparagina, L-ácido aspártico, L- metionina, L-alanina, L-isoleucina ou L-homoserina podem ser produzidos 5 cultivando uma bactéria em um meio de cultura para produzir e acumular o L- aminoácido no meio de cultura ou uma célula da bactéria, em que a bactéria é capaz de produzir o L-aminoácido pertence à família Enterobacteriaceae e é assim modificado, de modo que a expressão do gene gltP e/ou do gene gltS seja aumentada.

Description

“MÉTODO PARA PRODUZIR UM L-AMINOÁCIDO” Campo Técnico A presente invenção refere-se a um método para produção de um L-aminoácido usando uma bactéria.

L-aminoácidos são industrialmente 5 úteis como aditivos para ração, ingredientes alimentícios para a saúde, infusões de aminoácido e assim por diante.

Fundamentos da Técnica Métodos para produção de uma substância alvo, tal como um L-aminoácido, através de fermentação usando um microorganismo incluem métodos de uso de um microorganismo do tipo silvestre (uma cepa do tipo silvestre), métodos de uso de uma cepa auxotrófica derivada de uma cepa do tipo silvestre, métodos de uso de uma cepa mutante de regulação metabólica derivada de uma cepa do tipo silvestre como uma cepa resistente a vários fármacos, métodos de uso de uma cepa tendo propriedades de uma cepa auxotrófica e uma cepa mutante de regulação metabólica e assim por diante.

Em anos recentes, técnicas de DNA recombinante são usadas na produção de substâncias alvo por meio de fermentação.

Por exemplo, a produtividade de L-aminoácido de um microorganismo é aprimorada intensificando a expressão de um gene que codifica uma enzima biossintética de L-aminoácido (Documentos de Patente 1 e 2) ou intensificando a captação de uma fonte de carbono em um sistema de biossíntese de L-aminoácido (Documento de Patente 3). Entretanto, é divulgado um método de utilização, na produção de um aminoácido básico através de fermentação, de íons de carbonato e íons de bicarbonato como contra ânions do aminoácido básico para substituir uma parte dos íons de sulfato ou íons de cloreto.

Essas referências descrevem, como um método para adição de íons de carbonato e íons de bicarbonato ao meio, um método de controle da pressão interna do tanque de fermentação para ser positiva durante a fermentação ou fornecimento de dióxido de carbono ou um gás misto contendo dióxido de carbono ao meio (Documentos de Patente 4 e 6). A fermentação de aminoácido convencional para aminoácidos da família do ácido L-aspártico, tal como L-lisina, sofre de um problema pela 5 sub-produção de ácido L-glutâmico e, em particular, tal produção fermentativa, conforme descrito acima, sob condições de alto pH sofre de um problema de sub-produção especialmente acentuada de ácido L-glutâmico.

Uma vez que é necessário, em muitos casos, purificar L-aminoácidos em alta pureza após a produção fermentativa no processo de produção de L- aminoácido, a presença de subprodutos não é desejada, o que pode evitar problemas de um processo de purificação complicado e redução da pureza do produto.

Até o momento, proteínas envolvidas na captação de ácido glutâmico as quais foram descobertas em enterobactérias, tal como Escherichia coli, GltP, GltS (Documentos de Não-patente 1 e 2), GadC (Documento de Não-patente 3) e GltIJKL são conhecidas.

Sabe-se que a produtividade para L-lisina, L-treonina e L- triptofano de uma cepa a qual foi modificada de modo que a atividade de decarboxilase de glutamato é aprimorada intensificando a atividade anti- porter de glutamato/GABA (Documento de Patente 6). Contudo, não há relato de produção de L-aminoácido usando um microorganismo no qual o gene gltP ou o gene gltS é amplificado.

Referências da Técnica Anterior Documento de Patentes Documento de Patente 1: Patente U.S.

No. 5.168.056 Documento de Patente 2: Patente U.S.

No. 5.776.736 Documento de Patente 3: Patente U.S.

No. 5.906.925 Documento de Patente 4: Pedido de Patente U.S.

Publicado No. 2002/0025564

Documento de Patente 5: Publicação de Patente Internacional WO2006/038695 Documento de Patente 6: Publicação de Patente Internacional WO2008/044453 5 Documento de Não-patentes Documento de Não-patente 1: J.

Bacteriol., Abril de 1992; 174 (7): 2391-3 Documento de Não-patente 2: J.

Biol.

Chem., Dezembro de 1990; 15; 265 (35): 21704-8 Documento de Não-patente 3: J.

Bacteriol., Dezembro de 2006; 188 (23): 8118-27 Sumário da Invenção Objetivo a ser Atingido pela Invenção Um objetivo da presente invenção é proporcionar um microorganismo pertencendo à família Enterobacteriaceae que pode reduzir a produção de ácido L-glutâmico como um subproduto na produção de um aminoácido selecionado de L-lisina, L-treonina, L-asparagina, L-ácido aspártico, L-metionina, L-alanina, L-isoleucina e L-homoserina e um método para a produção de tal L-aminoácido conforme descrito acima usando tal microorganismo conforme descrito acima, o qual pode reduzir o ácido L- glutâmico como um subproduto na produção do aminoácido.

Meios para Obtenção do Objetivo Os inventores da presente invenção conduziram várias pesquisas de forma a atingir o objetivo antes mencionado, como um resultado, descobriu-se que o ácido L-glutâmico sub-produzido na produção fermentativa de L-aminoácidos poderia ser reduzido modificando uma bactéria, de modo que expressão de gltP e/ou gltS é aumentada e, assim, concretizou a presente invenção.

A presente invenção, assim, proporciona o seguinte:

(1) Um método para produção de um L-aminoácido compreendendo um L-aminoácido compreendendo cultura de uma bactéria a qual pertence à família Enterobacteriaceae e tem uma capacidade de produção de L-aminoácido em um meio para produzir e acumular o L- 5 aminoácido no meio e coleta do L-aminoácido do meio, em que a bactéria foi modificada de modo que expressão do gene gltP e/ou gltS é aumentada e o L- aminoácido é selecionado do grupo consistindo de L-lisina, L-treonina, L- asparagina, L-ácido aspártico, L-metionina, L-alanina, L-isoleucina e L- homoserina. (2) O método conforme descrito acima em que o gene gltP codifica uma proteína mostrada em (A) ou (B) a seguir: (A) uma proteína tendo a seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 12, (B) uma proteína tendo a seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 12 incluindo substituições, deleções, inserções, adições ou inversões de um ou vários resíduos de aminoácido e tendo uma atividade de transportador de L-glutamato. (3) O método conforme descrito acima em que o gene gltP codifica uma proteína mostrada em (A1) ou (B1) a seguir: (A1) uma proteína tendo a seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 2, (B1) uma proteína tendo a seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 2 incluindo substituições, deleções, inserções, adições ou inversões de um ou vários resíduos de aminoácido e tendo uma atividade de transportador de L-glutamato. (4) O método conforme descrito acima em que o gene gltP é um DNA mostrado em (a) ou (b) a seguir: (a) um DNA tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 1,

(b) um DNA o qual é capaz de hibridizar com uma seqüência complementar à seqüência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 1 ou uma sonda a qual pode ser preparada a partir da seqüência de nucleotídeo sob condições estringentes e codifica uma proteína tendo uma atividade de 5 transportador de L-glutamato. (5) O método conforme descrito acima, em que o gene gltS codifica uma proteína mostrada em (C) ou (D) a seguir: (C) uma proteína tendo a seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO:13, (D) uma proteína tendo a seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 13 incluindo substituições, deleções, inserções, adições ou inversões de um ou vários resíduos de aminoácido e tendo uma atividade de transportador de L-glutamato. (6) O método conforme descrito acima em que o gene gltS codifica uma proteína mostrada em (C1) ou (D1) a seguir: (C1) uma proteína tendo a seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 4, (D1) uma proteína tendo a seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 4 incluindo substituições, deleções, inserções, adições ou inversões de um ou vários resíduos de aminoácido e tendo uma atividade de transportador de L-glutamato. (7) O método conforme descrito acima em que o gene gltS é um DNA mostrado em (c) ou (d) a seguir: (c) um DNA tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 3, (d) um DNA o qual é capaz de hibridizar com uma seqüência complementar à seqüência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 3 ou uma sonda a qual pode ser preparada a partir da seqüência de nucleotídeo sob condições estringentes e codifica uma proteína tendo uma atividade de transportador de L-glutamato. (8) O método conforme descrito acima em que expressão do gene é intensificada por aumento do número de cópia do gene ou modificando uma seqüência de controle de expressão do gene. 5 (9) O método conforme descrito acima em que o L-aminoácido é L-lisina e expressão do gene ybjE é aumentada na bactéria. (10) O método conforme descrito acima, em que o gene ybjE codifica uma proteína mostrada em (E) ou (F) a seguir: (E) uma proteína tendo a seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 6 ou a seqüência de aminoácido dos aminoácidos números 17 a 315 em SEQ ID NO: 6, (F) uma proteína tendo a seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 6 ou a seqüência de aminoácido dos aminoácidos números 17 a 315 em SEQ ID NO: 6 incluindo substituições, deleções, inserções, adições ou inversões de um ou vários resíduos de aminoácido e tendo uma atividade de excreção de L-lisina. (11) O método conforme descrito acima, em que o gene ybjE é um DNA mostrado em (e) ou (f) a seguir: (e) um DNA tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 5 ou a seqüência de nucleotídeo dos nucleotídeos números 49 a 948 em SEQ ID NO: 5, (f) um DNA o qual é capaz de se hibridizar com uma seqüência complementar à seqüência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 5 ou a seqüência de nucleotídeo dos nucleotídeos números 49 a 948 em SEQ ID NO: 5 ou uma sonda a qual pode ser preparada a partir da seqüência de nucleotídeo sob condições estringentes e codifica uma proteína tendo uma atividade de excreção de L-lisina. (12) O método conforme descrito acima, em que o L- aminoácido é L-lisina, o pH do meio é controlado para ser 6,0 a 9,0 durante cultura para a produção e 7,2 a 9,0 no final da cultura e é mantido um período de cultura onde 20 mM ou mais de íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato estão presentes no meio, de modo que os íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato servem como contra-íons do aminoácido básico. 5 (13) O método conforme descrito acima, em que a bactéria é uma bactéria Escherichia.

Modalidades para Realização da Invenção Aqui depois, a presente invenção será explicada em detalhes. <1> Bactéria usada para a presente invenção A bactéria da presente invenção é uma bactéria a qual pertence à família Enterobacteriaceae, tem uma capacidade de produção de L- aminoácido e foi modificada de modo que expressão do gene gltP e/ou do gene gltS é aumentada.

O L-aminoácido é selecionado do grupo consistindo de L-lisina, L-treonina, L-ácido aspártico, L-asparagina, L-metionina, L- alanina, L-isoleucina e L-homoserina.

Se esses L-aminoácidos são produzidos por meio de fermentação usando um microorganismo, ácido L-glutâmico é sub-produzido em muitos casos.

Conforme para a sub-produção de ácido L- glutâmico, é suficiente que a sub-produção seja reduzida quando comparado com aquela observada em uma cepa não modificada mediante modificação, para aumento de expressão, do gene gltP e/ou do gene gltS, mas é, desejavelmente, reduzida em 40% ou mais, de preferência 50% ou mais, mais preferivelmente 60% ou mais.

A capacidade de produção de L-aminoácido referida aqui significa uma capacidade da bactéria da presente invenção de produzir um L- aminoácido em um meio ou células e acumular o L-aminoácido até um ponto em que o L-aminoácido pode ser coletado do meio ou células quando a bactéria é cultivada no meio.

A bactéria da presente invenção pode ser uma bactéria tendo uma capacidade de produzir um de L-lisina, L-treonina, L- ácido aspártico, L-asparagina, L-metionina, L-alanina, L-isoleucina e L-

homoserina ou pode ser uma bactéria tendo uma capacidade de produzir dois ou três tipos dos mesmos.

A bactéria tendo uma capacidade de produção de L- aminoácido pode ser uma bactéria tendo, inerentemente, uma capacidade de produção de L-aminoácido ou pode ser uma bactéria tal como descrito abaixo 5 a qual foi modificada para ter uma capacidade de produção de L-aminoácido usando um método de mutação ou técnicas de recombinação de DNA.

O “aumento de expressão de um gene” significa aumento de transcrição e/ou tradução do gene. <1-1> Transmissão da capacidade de produção de L- aminoácido Métodos para conferir uma capacidade de produzir um L- aminoácido selecionado de L-lisina, L-treonina, L-ácido aspártico, L- asparagina, L-metionina, L-isoleucina, L-alanina e L-homoserina a uma bactéria e bactérias dotadas de uma capacidade de produzir os L-aminoácidos descritos acima, as quais podem ser usadas para a presente invenção, serão exemplificados abaixo.

Contudo, a bactéria não está limitada a essas, contanto que uma bactéria tendo capacidade de produzir um L-aminoácido seja usada.

A bactéria usada para a presente invenção não está particularmente limitada, contanto que seja escolhida uma bactéria pertencendo à família Enterobacteriaceae, tal como aqueles dos gêneros Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Salmonella e Morganella e tendo a capacidade de produzir o L-aminoácido antes mencionado.

Especificamente, aquelas classificadas na família Enterobacteriaceae de acordo com a taxonomia usada no banco de dados NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id =1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock) podem ser usadas.

Como uma cepa parental da família Enterobacteriaceae usada para a modificação, é desejável usar, especialmente, uma bactéria do gênero Escherichia,

Enterobacter ou Pantoea.

Embora cepas parentais de bactéria Escherichia usadas para obtenção de bactérias Escherichia usadas para a presente invenção não estejam particularmente limitadas, especificamente, aquelas descritas no 5 trabalho de Neidhardt et al. (Backmann B.J., 1996, Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, páginas 2460-2488, Tabela 1, em F.D.

Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Segundo Edição, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.) podem ser usadas.

Dentre essas, Escherichia coli é preferida.

Exemplos específicos de Escherichia coli incluem Escherichia coli W3110 (ATCC 27325), Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076) e assim por dia, derivadas da cepa do tipo silvestre protótipo, a cepa K12. Essas cepas estão disponíveis, por exemplo, da American Type Culture Collection (Caixa Postal 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos da América). Isto é, números de registro são fornecidos a cada uma das cepas e as cepas podem ser pedidas usando esses números de registro (refira-se a http://www.atcc.org/). Os números de registro das cepas são listados no catálogo da American Type Culture Collection.

Exemplos de bactérias Enterobacter incluem Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes e assim por diante e exemplos das bactérias Pantoea incluem Pantoea ananatis.

Algumas cepas de Enterobacter agglomerans foram recentemente re-classificadas em Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis ou Pantoea stewartii com base em análise da seqüência de nucleotídeo por 16S rRNA, etc.

Na presente invenção, uma bactéria pertencendo a qualquer um dos gêneros Enterobacter ou Pantoea pode ser usada, contanto que ela seja uma bactéria classificada na família Enterobacteriaceae.

Quando uma cepa de Pantoea ananatis sofre melhoramento genético por meio de técnicas de engenharia genética, a cepa

AJ13355 (FERM BP-6614), cepa AJ13356 (FERM BP-6615), cepa AJ13601 (FERM BP-7207) de Pantoea ananatis e derivados das mesmas podem ser usados.

Essas cepas foram identificadas como Enterobacter agglomerans quando elas foram isoladas e depositadas como Enterobacter agglomerans. 5 Contudo, elas foram recentemente re-classificadas como Pantoea ananatis com base em seqüenciamento de nucleotídeo por 16S rRNA e assim por diante, conforme descrito acima.

Métodos para conferir uma capacidade de produzir um L- aminoácido selecionado de L-lisina, L-treonina, L-ácido aspártico, L- asparagina, L-metionina, L-alanina, L-isoleucina e L-homoserina à bactérias pertencendo à família Enterobacteriaceae e métodos para intensificar a capacidade de bactérias pertencendo à família Enterobacteriaceae de produzir os L-aminoácidos mencionados acima são descritos abaixo.

Para conferir a capacidade de produzir um L-aminoácido, métodos convencionalmente empregados em melhoramento genético de bactérias corineformes ou bactérias do gênero Escherichia (vide “Amino Acid Fermentation”, Gakkai Shuppan Center (Ltda.), 1ª Edição, publicado em 30 de Maio de 1986, páginas 77-100) podem ser usados.

Tais métodos incluem aquisição das propriedades de um mutante auxotrófico, uma cepa resistente a análogo de L-aminoácido ou um mutante de regulação metabólico ou construção de uma cepa recombinante, de modo que ela superexpressa uma enzima de biosintese de L-aminoácido.

Aqui, no melhoramento genético de bactérias que produzem L-aminoácido, uma ou mais das propriedades descritas acima, tais como auxotrofia, resistência a análogo e mutação de redução metabólica, podem ser conferidas.

A expressão de enzima(s) de biosintese de L-aminoácido pode ser intensificada isoladamente ou em combinações de duas ou mais.

Além disso, os métodos para conferir propriedades tais como auxotrofia, resistência a análogo ou mutação de regulação metabólica, podem ser combinados com intensificação das enzimas biossintéticas.

Uma cepa mutante auxotrófica, cepa resistente a análogo de L- aminoácido ou cepa mutante de regulação metabólica com a capacidade de produzir um L-aminoácido pode ser obtida submetendo uma cepa parental ou 5 do tipo silvestre à mutagênese convencional, tal como exposição a raios X ou irradiação UV ou tratamento com um mutágeno, tal como N-metil-N'-nitro-N- nitrosoguanidina (NTG) e etil metano-sulfonato (EMS), então, seleção daquelas as quais exibem autotrofia, resistência a análogo ou uma mutação de regulação metabólica e as quais também têm a capacidade de produzir um L- aminoácido a partir das cepas mutantes obtidas.

Bactérias que produzem L-lisina Bactérias que produzem L-lisina e métodos para construção das mesmas são exemplificados abaixo.

Exemplos de cepas tendo capacidade de produção de L-lisina incluem, por exemplo, cepas resistentes a análogo de L-lisina e cepas mutantes de regulação metabólica.

Exemplos de análogo de L-lisina incluem, mas não estão limitadas a, oxalisina, hidroxamato de lisina, S-(2-aminoetil)- L-cisteína (AEC), γ-metillisina, α-clorocaprolactame e assim por diante.

Cepas mutantes tendo resistência a esses análogos de lisina podem ser obtidas submetendo uma bactéria pertencendo à família Enterobacteriaceae a um tratamento de mutagênese artificial convencional.

Exemplos específicos de bactérias que produzem L-lisina incluem Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185, vide Patente Japonesa Depositada Em-Aberto No. 56-18596 e Patente U.S.

No. 4.346.170), a cepa VL611 de Escherichia coli (Patente Japonesa Depositada Em-Aberto No. 2000-189180) e assim por diante.

Como uma Escherichia coli que produz L-lisina, a cepa WC196 pode também ser usada (vide Publicação de Patente Internacional WO96/17930). Além disso, uma bactéria que produz L-lisina pode também ser construída aumentando a atividade de uma enzima do sistema de biossíntese de L-lisina. Aumento de atividade de tal enzima pode ser obtido aumentando o número de cópia do gene que codifica a enzima em células ou modificando uma seqüência de controle de expressão do mesmo. Aumento do número de cópias de um gene que codifica uma enzima do sistema de 5 biossíntese de L-lisina e modificação de uma seqüência de controle de expressão do mesmo podem ser obtidos através do mesmo método conforme aquele para os genes gltP e gltS descritos depois. Exemplos de genes que codificam enzimas biossintéticas de L- lisina incluem genes que codificam enzimas da via de diaminopimelato, tais como o gene de sintase de dihidrodipicolinato (dapA), gene de aspartoquinase (lysC), gene de reductase de dihidrodipicolinato (dapB), gene de decarboxilase de diaminopimelato (lysA), gene de dehidrogenase de diaminopimelato (ddh) (WO96/40934 para todos os genes precedentes), gene de carboxilase de fosfoenolpiruvato (ppc) (Patente Japonesa Depositada Em- Aberto No. 60-87788), gene de aminotransferase de aspartato (aspC) (Publicação de Patente Japonesa (Kokoku) No. 6-102028) e gene de dehidrogenase de semialdeído de aspartato (asd) (WO00/61723) e genes que codificam enzimas da via de ácido aminoadípico, tal como o gene de hidratase de homoaconitato (Patente Japonesa Depositada Em-Aberto No. 2000-157276). Além disso, a cepa parental pode mostrar um nível aumentado de expressão do gene envolvido em eficiência de energia (cyo) (Patente Européia Depositada Em-Aberto No. 1170376), o gene que codifica transhidrogenase de nucleotídeo de nicotinamida (pntAB) (Patente U.S. No.

5.830.716), o gene ybjE que codifica uma proteína tendo atividade de excreção de L-lisina (WO2005/073390), o gene que codifica dehidrogenase de glutamato (gdhA) (Gene 23:199-209, 1983) ou uma combinação arbitrária desses. Abreviações para os genes são mostradas entre parênteses. Dentre os genes antes mencionados, o gene ybjE é preferido. Exemplos do gene ybjE incluem o gene ybjE de Escherichia coli e homólogos do mesmo.

Exemplos do gene ybjE de Escherichia coli incluem um gene que codifica a seqüência de aminoácido dos aminoácidos números 17 a 315 em SEQ ID NO: 6, especificamente um gene tendo a seqüência de nucleotídeo dos nucleotídeos números 49 a 948 em SEQ ID NO: 5. Em SEQ ID NO: 5, 5 estima-se que o códon inicial seja dos nucleotídeos números 49 a 51. Embora os nucleotídeos números 1 a 3 em SEQ ID NO: 5 constituam o códon que codifica Val, gtg, ele pode ser traduzido como Met como o códon inicial e a proteína codificada pelo gene ybjE pode ser uma proteína tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 6 (1 a 315). Em tal caso, é preferível usar um DNA tendo a seqüência de nucleotídeo dos nucleotídeos números 1 a 948 em SEQ ID NO: 5. Contudo, está claro a partir dos exemplos que, a despeito de qual resíduo de aminoácido é proporcionado pelo códon inicial, um microorganismo utilizável para o método de produção da presente invenção pode ser obtido usando um DNA contendo a seqüência de nucleotídeo dos nucleotídeos números 49 a 948 em SEQ ID NO: 1. Sabe-se que a sintase de dihidrodipicolinato do tipo silvestre derivada de Escherichia coli é submetida à inibição de feedback pela L-lisina e também se sabe que a aspartoquinase do tipo silvestre derivada de Escherichia coli é submetida à supressão e inibição de feedback pela L-lisina.

Portanto, quando o gene dapA e o gene lysC são usados, esses genes são, de preferência, genes que codificam enzimas mutantes desensibilizados à inibição de feedback pela L-lisina.

Exemplos de DNA que codificam uma sintetase de dihidrodipicolinato mutante desensibilizado à inibição de feedback pela L- lisina incluem um DNA que codifica tal proteína tendo uma seqüência de aminoácido na qual o resíduo de histidina na posição 118 é substituído por um resíduo de tirosina.

Exemplos de DNA que codificam uma aspartoquinase mutante desensibilizada à inibição de feedback pela L-lisina incluem um DNA que codifica uma AKIII tendo uma seqüência de aminoácido na qual o resíduo de treonina na posição 352, o resíduo de glicina na posição 323 e o resíduo de metionina na posição 318 são substituídos por resíduos de isoleucina, asparagina e isoleucina, respectivamente (para esses mutantes, vide Patentes U.S.

Nos. 5.661.012 e 6.040.160). Tais DNAs mutantes podem 5 ser obtidos por meio de mutagênese sítio-específica usando PCR ou semelhante.

Plasmídeos com ampla faixa de hospedeiro RSFD80, pCAB1 e pCABD2 são conhecidos como plasmídeos contendo um gene dapA mutante que codifica uma sintase de dihidrodipicolinato e um gene lysC mutante que codifica uma aspartoquinase mutante (Patente U.S.

No. 6.040.160). A cepa JM109 de Escherichia coli transformada com o plasmídeo foi denominada AJ12396 (Patente U.S.

No. 6.040.160) e a cepa foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (atualmente National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary) em 28 de Outubro de 1993 e atribuído o número de acesso FERM P-13936 e o depósito foi, então, convertido a um depósito internacional sob as condições do Tratado de Budapeste em 1 de Novembro de 1994 e atribuído um número de acesso de FERM BP-4859. RSFD80 pode ser obtido da cepa AJ12396 por meio de um método convencional.

Além disso, bactérias que produzem L-aminoácido podem ter atividade reduzida de uma enzima que catalisa uma reação derivada de uma via biossintética de L-aminoácido e produz outro composto ou podem ser deficiente em tal atividade ou elas podem ter atividade reduzida de uma enzima que atua negativamente sobre a síntese ou acúmulo de L-aminoácido ou podem ser deficientes em tal atividade.

Exemplos de tais enzimas envolvidas na produção de L-lisina incluem dehidrogenase de homoserina dehidrogenase, decarboxilase de lisina (cadA, ldcC), enzima málica e assim por diante e cepas nas quais as atividades dessas enzimas são diminuídas ou deletadas são divulgados nos documentos WO95/23864, WO96/17930, WO2005/010175 e assim por diante.

É preferido que as expressões de ambos os genes cadA e ldcC 5 que codificam decarboxilase de lisina sejam diminuídas de forma a diminuir ou deletar a atividade de decarboxilase de lisina.

Expressão de ambos os genes pode ser diminuída, por exemplo, por meio do método descrito no documento WO2006/078039. De forma a reduzir ou eliminar as atividades dessas enzimas, uma mutação pode ser introduzida nos genes das enzimas sobre um genoma através de um método de mutagênese ou técnica de recombinação gênica usual, de modo que as atividades intracelulares das enzimas sejam reduzidas ou eliminadas.

Tal introdução de uma mutação pode ser obtida, por exemplo, usando recombinação genética para eliminar os genes que codificam as enzimas sobre o genoma ou modificar uma seqüência de controle de expressão, tal como um promotor ou a seqüência de Shine-Dalgarno (SD). Ela também pode ser obtida mediante introdução de uma mutação para substituição de aminoácido (mutação “missense”), um códon terminal (mutação “nonsense”) ou uma mutação de desvio de quadro para adição ou deleção de um ou dois nucleotídeos em regiões que codificam as enzimas sobre o genoma ou deleção parcial ou total dos genes (J.

Biol.

Chem., 272: 8611-8617, 1997). As atividades enzimáticas também podem ser diminuídas ou eliminadas construindo um gene que codifica uma enzima mutante no qual a região de codificação é total ou parcialmente deletada e substituição do mesmo por um gene normal sobre um genoma por meio de recombinação homóloga ou semelhante e introdução de um transposon ou um fator no gene.

Por exemplo, de forma a introduzir uma mutação que diminui ou elimina as atividades das enzimas mencionadas acima por meio de recombinação genética, os métodos a seguir são usados.

Um gene mutante é preparado modificando uma seqüência parcial de um gene alvo, de modo que ele não codifique uma enzima que pode funcionar normalmente e, então, uma bactéria pertencendo à família Enterobacteriaceae pode ser transformada com um DNA contendo o gene mutante para causar recombinação de um gene 5 correspondente sobre o genoma com o gene mutante para substituir o gene mutante pelo gene alvo no genoma.

Exemplos de tal substituição gênica usando recombinação homóloga incluem métodos de uso de um DNA linear, tal como o método denominado Red-Driven Integration (Datsenko, K.A e Wanner, B.L., 2000, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA, 97: 6640-6645) e o método utilizando Red Driven Integration em combinação com um sistema de excisão derivado do fago λ (Cho, E.H., Gumport, R.I., Gardner, J.F., 2002, J.

Bacteriol., 184: 5200-5203) (refira-se ao documento WO2005/010175), um método de uso de um plasmídeo contendo uma origem de replicação sensível à temperatura (Patente U.S.

No. 6.303.383, Patente Japonesa Depositada Em- Aberto No. 05-007491) e assim por diante.

Além disso, tal mutagênese sítio- específica baseada em substituição gênica usando recombinação homóloga conforme descrito acima pode também ser realizada usando um plasmídeo o qual não é capaz de reproduzir em um hospedeiro.

Exemplos preferidos de bactérias que produzem L-lisina incluem Escherichia coli WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2 (WO2006/078039). A cepa foi construída introduzindo o plasmídeo pCABD2 contendo genes de biossíntese de lisina (Patente U.S.

No. 6.040.160) na cepa WC196 tendo genes cadA e ldcC rompidos, os quais codificam decarboxilase de lisina.

A cepa WC196 foi produzida a partir da cepa W3110, a qual foi derivada de Escherichia coli K-12, substituindo o gene lysC do tipo silvestre sobre o cromossomo da cepa W3110 por um gene lysC mutante que codifica uma aspartoquinase III mutante na qual a treonina na posição 352 foi substituída por isoleucina, resultando em desensibilização da inibição de feedback do mesmo pela L-lisina (Patente U.S.

No. 5.661.012) e conferindo resistência a

AEC à cepa resultante (Patente U.S.

No. 5.827.698). A cepa WC196 foi designada Escherichia coli AJ13069, depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (atualmente a agencia administrativa independente, National 5 Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba- shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) em 6 de Dezembro de 1994 e atribuído um número de acesso de FERM P-14690. Então, foi convertido a um depósito internacional sob as condições do Tratado de Budapeste em 29 de Setembro de 1995 e atribuído um número de acesso de FERM BP-5252 (Patente U.S.

No. 5.827.698). A cepa WC196ΔcadAΔldcC em si é também uma bactéria que produz L-lisina preferida.

A cepa WC196ΔcadAΔldcC foi designada AJ110692 e depositada no National Institute of Bioscience and Human- Technology, Agency of Industrial Science and Technology (atualmente uma agencia administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305- 8566, Japão) em 7 de Outubro de 2008 como um depósito internacional e atribuído um número de acesso de FERM BP-11027. O plasmídeo pCABD2 contém um gene dapA mutante derivado de Escherichia coli e que codifica uma sintase de dihidrodipicolinato (DDPS) tendo uma mutação para desensibilização à inibição de feedback pela L-lisina, um gene lysC mutante derivado de Escherichia coli e que codifica aspartoquinase III tendo uma mutação para desensibilização à inibição de feedback pela L-lisina, o gene dapB derivado de Escherichia coli e que codifica reductase de dihidrodipicolinato e o gene ddh derivado de Brevibacterium lactofermentum e que codifica dehidrogenase de diaminopimelato.

Bactérias que produzem L-Treonina

Exemplos preferidos de bactérias que produzem L-treonina usados para a presente invenção incluem bactérias pertencendo à família Enterobacteriaceae nas quais uma ou mais atividades de enzimas do sistema de biossíntese de L-treonina são intensificadas.

Exemplos de genes que 5 codificam enzimas biossintéticas de L-treonina incluem o gene de aspartoquinase III (lysC), gene de dehidrogenase de semiladeído de aspartato (asd), gene de aspartoquinase I (thrA), gene de quinase de homoserina (thrB) e gene de sintase de treonina (thrC) codificado pelo óperon thr.

Dois ou mais tipos desses genes podem ser introduzidos.

Os genes que codificam as enzimas de biosíntese de L-treonina podem ser introduzidas em uma bactéria Enterobacteriaceae com decomposição diminuída de treonina.

Exemplos da bactéria Escherichia com decomposição diminuída de treonina incluem, por exemplo, a cepa TDH6, a qual é deficiente em atividade de dehidrogenase de treonina (Patente Japonesa Depositada Em-Aberto No. 2001-346578) e assim por diante.

As atividades enzimáticas das enzimas biossintéticas de L- treonina são inibidas pelo subproduto L-treonina.

Portanto, para construção de cepas que produzem L-treonina, é desejável que os genes para as enzimas biossintéticas de L-treonina sejam modificados de modo que as enzimas sejam desensibilizadas à inibição de feedback pela L-treonina nas cepas que produzem L-treonina.

Os genes thrA, thrB e thrC antes mencionados constituem o óperon de treonina, o qual forma uma estrutura atenuadora.

A expressão do óperon de treonina é inibida pela isoleucina e treonina no meio de cultura e também suprimida por atenuação.

Portanto, o óperon de treonina pode ser modificado removendo a seqüência líder na região de atenuação ou o atenuador (refira-se a Lynn, S.P., Burton, W.S., Donohue, T.J., Gould, R.M., Gumport, R.L e Gardner, J.F., J.

Mol.

Biol. 194: 59-69 (1987); WO02/26993; WO2005/049808). O promotor nativo do óperon de treonina está presente a montante do óperon de treonina e pode ser substituído por um promotor não nativo (refira-se ao documento WO98/04715) ou pode ser construído um óperon de treonina o qual tenha sido modificado de modo que expressão do gene de biossíntese de treonina é controlada pelo repressor e promotor do 5 fago λ (refira-se à Patente Européia No. 0593792). Além disso, de forma a modificar uma bactéria Escherichia de modo que ela seja desensibilizada à inibição de feedback pela L-treonina, uma cepa resistente ao ácido α-amino-β- hidroxi isovalérico (AHV) pode ser selecionada.

É preferível que o número de cópia do óperon de treonina que é modificado para desensibilizar à inibição de feedback pela L-treonina seja aumentado ou a expressão do óperon de treonina seja aumentada por meio de ligação do mesmo a um promotor potente.

O número de cópia pode também ser aumentado, além de amplificação usando um plasmídeo, transferindo o óperon de treonina para um genoma usando um transposon, Mu-fago ou semelhante.

Assim como o gene de aspartoquinase III (lysC), é desejável usar um gene modificado de modo que a enzima seja desensibilizada à inibição de feedback pela L-lisina.

Tal gene lysC modificado de modo que a enzima seja desensibilizada à inibição de feedback pode ser obtido através do método descrito na Patente U.S.

No. 5.932.453. Outro que não aumento de expressão dos genes biossintéticos de L-treonina, expressão dos genes envolvidos na via glicolítica, ciclo de TCA ou cadeia respiratória, os genes que regulam a expressão desses genes ou genes envolvidos em captação de açúcar também pode ser preferivelmente aumentado.

Exemplos de tais genes eficazes para a produção de L-treonina incluem os genes que codificam transhidrogenase (pntAB, Patente Européia No. 733712), carboxilase de fosfoenolpiruvato (pepC, WO95/06114), sintase de fosfoenolpiruvato (pps, Patente Européia No. 877090) e um gene que carboxilase de piruvato de bactérias corineformes ou bactéria Bacillus

(WO99/18228, Patente Européia Depositada Em-Aberto No. 1092776). Bactérias que produzem L-treonina podem também ser obtidos, de preferência, intensificando a expressão de um gene que confere resistência à L-treonina e/ou um gene que confere resistência à L-homoserina 5 ou conferindo resistência à L-treonina e/ou resistência à L-homoserina à bactéria hospedeira.

Exemplos de genes que conferem a resistência mencionada acima incluem o gene rhtA (Res.

Microbiol. 154: 123-135 (2003)), gene rhtB (Patente Européia Depositada Em-Aberto No. 0994190), gene rhtC (Patente Européia Depositada Em-Aberto No. 1013765), gene yfiK e gene yeaS (Patente Européia Depositada Em-Aberto No. 1016710). Métodos exemplificativos para conferir resistência à L-treonina a uma bactéria hospedeira incluem aqueles descritos na Patente Européia Depositada Em-Aberto No. 0994190 ou WO90/04636. E. coli VKPM B-3996 (Patente U.S.

No. 5.175.107) pode ser exemplificada como uma bactéria que produz L-treonina.

A cepa VKPM B- 3996 foi depositada em 7 de Abril de 1987 na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika (Rússia, 117545 Moscou 1, Dorozhny proezd, 1) sob o número de registro VKPM B-3996. A cepa VKPM B-3996 contém o plasmídeo pVIC40 (WO90/04636), o qual foi obtido inserindo os genes biossintéticos de treonina (óperon de treonina, thrABC) em um vetor de plasmídeo pAYC32 com ampla faixa de hospedeiro contendo o marcador de resistência à estreptomicina (Chistorerdov, A.Y. e Tsygankov, Y.D., Plasmid, 16, 161-167 (1986)). Em pVIC40, a dehidrogenase I de aspartoquinase I-homoserina codificada pelo gene thrA no óperon de treonina é desensibilizada à inibição de feedback pela L-treonina.

E. coli VKPM B-5318 (refira-se à Patente Européia No. 0593792) pode também ser exemplificado como uma bactéria que produz L- treonina preferida.

A cepa VKPM B-5318 foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) GNII Genetika em 3 de

Maio de 1990 sob o número de registro de VKPM B-5318. A cepa VKPM B- 5318 é prototrófica com relação à L-isoleucina e abriga um DNA de plasmídeo recombinante de modo que o óperon de treonina, isto é, genes de biossíntese de treonina, deficientes na região atenuadora, a qual é uma região 5 de regulação de transcrição originalmente contida, esteja localizada a jusante do repressor C1 sensível à temperatura derivado do fago λ, promotor PR e o gene que codifica o N-término da proteína Cro e a expressão dos genes de biossíntese de treonina é regulada pelo repressor e o promotor derivado do fago λ.

Bactérias que produzem L-Homoserina Exemplos de bactérias que produzem homoserina pertencendo ao gênero Escherichia incluem a cepa NZ10(thrB), a qual é uma cepa invertida Leu+ derivada da cepa C600 conhecida (thrB, leuB, refira-se a Appleyard R.K., Genetics, 39, 440-452, 1954). Uma cepa transformante NZ10 transformada com o gene thrA que codifica dehidrogenase I de aspartoquinase-homoserina pode também ser preferivelmente usada.

Se o número de cópia do gene rhtB de uma bactéria é aumentado, a bactéria se torna resistente à L-homoserina e a produtividade da mesma para L-homoserina, L-treonina, L-alanina, L-valine e L-isoleucina é aprimorada (Patente Européia Depositada Em-Aberto No. 994190 A2). Além disso, se o número de cópia do gene rthC de uma bactéria é aumentado, a bactéria se torna resistente à L-homoserina e L-treonina e a produtividade para L-homoserina, L-treonina e L-leucina é aprimorada (Patente Européia Depositada Em-Aberto No. 1013765 A1). Além disso, a cepa Escherichia coli 44 (depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms com um número de registro de VKPM B-2175) pode também ser usada.

Bactérias que produzem L-Metionina Exemplos de bactérias que produzem L-metionina pertencendo ao gênero Escherichia incluem cepas tais como Escherichia coli AJ11539 (NRRL B-12399), AJ11540 (NRRL B-12400), AJ11541 (NRRL B-12401), AJ11542 (NRRL B-12402, GB 2075055), 218 (VKPM B-8125, Patente Européia No. 1239041) e assim por diante. 5 Bactérias que produzem ácido L-aspártico Exemplos de bactérias que produzem ácido L-aspártico pertencendo ao gênero Escherichia incluem a cepa de Escherichia coli na qual a atividade de aspartase para geração de ácido L-aspártico a partir de ácido fumárico é intensificada (Publicação de Patente Japonesa No. 38-6588). Bactérias que produzem L-Alanina L-Alanina é produzida por meio de β-decarboxilação de ácido aspártico.

Portanto, exemplos de bactérias que produzem L-alanina pertencendo ao gênero Escherichia incluem a cepa de Escherichia coli na qual a β-decarboxilase de aspartato é intensificada (Patente Japonesa Depositada Em-Aberto No. 2-242690). Bactérias que produzem L-Isoleucina Exemplos de cepas parentais as quais são usadas para derivar bactérias que produzem L-isoleucina incluem, mas não estão limitados a, mutantes os quais são resistentes à 6-dimetilaminopurina (Patente Japonesa Depositada Em-Aberto No. 5-304969), mutantes os quais são resistentes a análogos de isoleucina, tais como tiaisoleucina e hidroxamato de isoleucina e mutantes os quais são adicionalmente resistente à DL-etionina e/ou hidroxamato de arginina (Patente Japonesa Depositada Em-Aberto No. 5- 130882). Além disso, cepas recombinantes transformadas com genes que codificam proteínas envolvidas em biossíntese de L-isoleucina, tais como deaminase de treonina e sintase de acetohidroxato, são também usadas como cepas parentais (Patente Japonesa Depositada Em-Aberto No. 2-458, FR 0356739 e Patente U.S.

No. 5.998.178). Bactérias que produzem L-Asparagina

L-Asparagina é produzida transferindo o grupo amino para ácido aspártico (Boehlein, S.K., Richards, N.G.J., & Schuster, S.M. (1994a), J.

Biol.

Chem., 269, 7450-7457). Portanto, exemplos de bactérias que produzem L-asparagina pertencendo ao gênero Escherichia incluem cepas de 5 Escherichia coli que produzem ácido L-aspártico nas quais a sintetase de asparagina é intensificada.

A bactéria da presente invenção pode ser obtida modificando tal bactéria tendo uma capacidade de produzir um L-aminoácido selecionado de L-lisina, L-treonina, L-ácido aspártico, L-asparagina, L-metionina, L- alanina, L-isoleucina e L-homoserina, conforme descrito acima, de modo que expressão do gene gltP e/ou do gene gltS da mesma seja aumentada.

Alternativamente, a bactéria da presente invenção pode também ser obtida conferindo uma capacidade de produzir tal L-aminoácido a uma bactéria a qual tenha sido modificada de modo que expressão do gene gltP e/ou do gene gltS da mesma seja aumentada.

O estado de “ser modificado de modo que expressão do gene gltP e/ou do gene gltS da mesma seja aumentada” corresponde a um estado onde o número de moléculas codificadas pelo gene gltP e/ou o gene gltS por célula aumenta ou a atividade da proteína GltP ou da proteína GltS codificada por esses genes por molécula aprimora quando comparado com uma cepa não modificada, tal como uma cepa do tipo silvestre ou parental.

A bactéria é, de preferência, modificada de modo que a atividade da proteína GltP ou da proteína GltS por célula aumente para 150% ou mais, mais preferivelmente 200% ou mais, ainda mais preferivelmente 300% ou mais da atividade de uma cepa não modificada.

Exemplos de uma cepa não modificada que serve como uma referência para a comparação acima, tal como uma cepa do tipo silvestre de um microorganismo pertencendo à família Enterobacteriaceae incluem, por exemplo, a cepa MG1655 de Escherichia coli (ATCC 47076), cepa W3110 (ATCC 27325), cepa AJ13335 de Pantoea ananatis (FERM BP-

6614) e assim por diante.

As atividades das proteínas GltP e das proteínas GltS referem-se à atividades responsáveis pela captação de ácido L-glutâmico em células bacterianas externamente às células e são referidas como “atividade de transportador de L-glutamato” no presente relatório descritivo. 5 A atividade de transportador de L-glutamato pode ser confirmada comparando a velocidade de captação de L-glutamato em células do microorganismo da presente invenção com a velocidade de captação de L- glutamato de uma cepa não modificada correspondente.

A velocidade de captação de L-glutamato pode ser medida, por exemplo, reagindo células vivas com ácido L-glutâmico rotulado com RI durante um determinado período de tempo e detectando-se a radioatividade nas células (Wallace, B; Yang, YJ; Hong, JS; Lum, D, J.

Bacteriol., Junho de 1990; 172(6): 3214-3220). Aumento de expressão do gene gltP e/ou do gene gltS quando comparado com aquela de uma cepa não modificada, de modo que uma cepa parental ou do tipo silvestre pode ser confirmado comparando a quantidade de mRNA do gene com aquela da cepa do tipo silvestre ou não modificada.

Exemplos do método para confirmação da quantidade de expressão incluem hibridização de Northern e PCR por transcriptase reversa (RT-PCR, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, EUA, 2001). A expressão pode ser aumentada para qualquer nível, na medida em que o nível seja aumentado quando comparado com aquela de uma cepa não modificada e, por exemplo, é desejavelmente aumentada não menos do que 1,5 vezes, mais preferivelmente não menos do que 2 vezes, ainda mais preferivelmente não menos do que 3 vezes, quando comparado com aquele, por exemplo, de uma cepa não modificada.

Além disso, intensificação das atividades das proteínas codificadas pelo gene gltP e/ou o gene gltS pode também ser confirmada com base no aumento da quantidade da proteína alvo quando comparado com aquela em uma cepa não modificada e pode ser detectada, por exemplo, através de Western blotting usando um anticorpo (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, EUA, 2001). Os genes gltP e gltS da presente invenção significam os genes 5 gltP e gltS de um microorganismo pertencendo à família Enterobacteriaceae ou homólogos dos mesmos.

Como o gene gltP de Escherichia coli, um gene que codifica uma proteína tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 1) pode ser exemplificado (b4077, GenBank Acesso No.

NP_418501. [gi:16131903]). Como o gene gltS de Escherichia coli, um gene que codifica uma proteína tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 3) pode ser exemplificado (b3653, GenBank Acesso No.

NP_418110. [gi:16131524]). Um homólogo do gene gltP ou gltS significa um gene derivado de outro microorganismo, mas mostrando alta similaridade estrutural ao gene gltP ou o gene gltS de uma bactéria Escherichia e que codifica uma proteína tendo a atividade de redução da quantidade de sub-produção de ácido L- glutâmico no momento de produção de um L-aminoácido selecionado de L- lisina, L-treonina, L-ácido aspártico, L-asparagina, L-metionina, L-alanina, L- isoleucina e L-homoserina e a atividade de captação de ácido glutâmico nas células, quando o gene é introduzido em um hospedeiro.

Exemplos do homólogo do gene gltP ou gltS incluem, por exemplo, aqueles genes registrados no GenBank, incluindo aqueles de bactérias Shigella e Enterobacter.

Além disso, o gene gltP e/ou o gene gltS pode ser um gene clonado de uma bactéria Streptomyces, tal como Streptomyces coelicolor ou uma bactéria de ácido láctico do gênero Lactococcus, Lactobacillus ou semelhante com base na homologia aos genes exemplificados acima.

Qualquer gene mostrando alta homologia ao gene gltP e/ou ao gene gltS de uma bactéria Escherichia pode ser usado, mesmo embora um nome de gene diferente possa ser fornecido ao gene.

Os homólogos do gene gltP e/ou gene gltS incluem, por exemplo, genes que podem ser clonados usando os oligonucleotídeos sintéticos de SEQ ID NOS: 8 e 9 ou SEQ ID NOS: 10 e 11. Além disso, como um homólogo do gene gltP e/ou gltS, um gene mostrando alta homologia pode ser obtido de um banco de dados 5 conhecido com base na informação de seqüência antes mencionada.

A homologia de seqüências de aminoácido e seqüências de nucleotídeo pode ser determinada usando, por exemplo, o algoritmo BLAST de Karlin e Altschul (Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA, 90, 5873 (1993)) ou FASTA (Methods Enzymol., 183, 63 (1990)). Programas denominados BLASTN e BLASTX foram desenvolvidos com base nesse algoritmo BLAST (refira-a a www.ncbi.nlm.nih.gov). No presente relatório descritivo, o termo “homologia” pode também ser usado para referir-se à “identidade”. Homólogos mostrando alta homologia ao gene gltP ou gltS de Escherichia coli são descritos abaixo com homologias, nomes de bactérias e números de registro em bancos de dados de seqüência gênica.

Tabela 1 Identidade Fonte Ac.

No.

Identidade Fonte Ac.

No.

EMBL; M32488; EMBL; CP000243; 100% Escherichia coli (cepa K12) 99% Escherichia coli (cepa UTI89 / UPEC) AAA23832.1 ABE10076.1 EMBL; AAKB02000001; 99% Escherichia coli CP000247 99% Escherichia coli 53638 EDU65993.1 EMBL; CP000802; 99% Shigella boydii (Sb227) CP000034-CP000039 99% Escherichia coli O9:H4 (cepa HS) ABV08482.1 Escherichia coli O139:H28 (cepa EMBL; CP000800; 99% Shigella sonnei (Ss046) CP000034-CP000039 99% E24377A / ETEC) ABV17642.1 EMBL; AE005174; EMBL; AE005674; 99% Escherichia coli O157:H7 99% Shigella flexneri AAG59275.1 AAN45560.1 EMBL; AE014075; Shigella flexneri sorotipo 5b EMBL; CP000266; 99% Escherichia coli O6 99% AAN83500.1 (cepa 8401) BF06119.1 EMBL; CP000038; EMBL; ABKX01000015; 99% Shigella sonnei (cepa Ss046) 98% Escherichia albertii TW07627 AAZ90754.1 EDS90170.1 Shigella boydii sorotipo 4 EMBL; CP000036; Citrobacter koseri (cepa ATCC BAA-895 / CDC 4225-83 EMBL; CP000822; 99% 95% (cepa Sb227) ABB68540.1 / SGSC4696) ABV14881.1 Escherichia coli O6:K15:H31 EMBL; CP000247; EMBL; CP000886; 99% 94% Salmonella paratyphi B (cepa ATCC BAA-1250 / SPB7) (cepa 536 / UPEC) ABG72258.1 ABX70555.1 Shigella boydii sorotipo 18 EMBL; CP001063; EMBL; AE008901; 99% 94% Salmonella typhimurium

27 (cepa CDC 3083-94 / BS512) ACD08193.1 AAL23107.1 Escherichia coli O157:H7 cepa EMBL; ABHQ01000005; EMBL; CP000026; 99% 94% Salmonella paratyphi A EC4076 EDU70808.1 AAV79845.1 Escherichia coli O157:H7 cepa EMBL; ABHP01000005; Salmonella arizonae (cepa ATCC EMBL; CP000880; 99% 93% EC4113 EDU55567.1 BAA-731 / CDC346-86 / RSK2980) ABX23224.1 Escherichia coli O157:H7 cepa EMBL; ABHO01000008; EMBL; AE014613; 99% 93% Salmonella typhi EC4196 EDU33758.1 AAO71654.1 EMBL; CP000970; EMBL; CP000653; 99% Escherichia coli (cepa SMS-3-5 /SECEC) 93% Enterobacter sp. (cepa 638) ACB19931.1 ABP58966.1 Escherichia coli (cepa ATCC EMBL; CP000946; EMBL; AE017220; 99% 93% Salmonella choleraesuis 8739 / DSM 1576 / Crooks) ACA79551.1 AAX68069.1 EMBL; Klebsiella pneumoniae subsp.

EMBL; CP000647; 99% Escherichia coli (UTI89) 93% CP000243/CP000244 pneumoniae (cepa ATCC 700721 / MGH78578) ABR79835.1 EMBL; CP000468; EMBL; CP000783; 99% Escherichia coli O1:K1 / APEC 90% Enterobacter sakazakii (cepa ATCC BAA-894) ABJ03557.1 ABU75428.1

Tabela 2 Identidade Fonte Ac. No. Identidade Fonte Ac. No.

EMBL; ABKX01000002; 100% Escherichia coli 99% Escherichia albertii TW07627 EDS93075.1 EMBL; BA000007; 99% Escherichia coli O157:H7 98% Escherichia coli 536 CP000247 BAB37952.1 Escherichia coli O157:H7 cepa EMBL; EMBL; AE014075; 99% 98% Escherichia coli O6 EC4076 ABHQ01000003;EDU71328.1 AAN82914.1 Escherichia coli O157:H7 cepa EMBL; Escherichia coli O6:K15:H31 EMBL; CP000247; 99% 98% EC4113 ABHP01000008;EDU54990.1 (cepa 536 / UPEC) ABG71723.1 Escherichia coli O157:H7 cepa EMBL; EMBL; AE005174; 99% 99% Escherichia coli O157:H7 EC4196 ABHO01000001;EDU35455.1 AAG58798.1 Escherichia coli O9:H4 EMBL; CP000802; EMBL; AE017220; 99% 93% Salmonella choleraesuis (cepa HS) ABV08069.1 AAX67576.1 Escherichia coli O139:H28 EMBL; CP000800; EMBL; CP000026; 99% 93% Salmonella paratyphi A (cepa E24377A / ETEC) ABV17638.1 AAV79398.1 EMBL; CP000970; EMBL; CP000886; 99% Escherichia coli (cepa SMS-3-5 / SECEC) 93% Salmonella paratyphi B (cepa ATCC BAA-1250 / SPB7) ACB18417.1 ABX69959.1 EMBL; EMBL; AE008874; 99% Escherichia coli 53638 92% Salmonella typhimurium 28 AAKB02000001;EDU64770.1 AAL22605.1 Salmonella arizonae (cepa ATCC EMBL; CP000880; 99% Escherichia coli D00626 93% BAA-731 / CDC346-86 / RSK2980) ABX23688.1 Ac.No.CP000243/ EMBL; AE014613; 99% Escherichia coli UTI89 93% Salmonella typhi CP000244 AAO71256.1 EMBL; CP000468; EMBL; AL627280; 99% Escherichia coli O1:K1 / APEC 92% Salmonella typhi ABJ03124.1 CAD03248.1 EMBL; CP000243; 99% Escherichia coli (cepa UTI89 / UPEC) ABE09626.1

A seqüência de aminoácidos conservada nos homólogos antes mencionados é mostrada em SEQ ID NO: 12 (GltP) e SEQ ID NO: 13 (GltS). Além disso, o gene gltP e/ou o gene gltS usados para a presente invenção não estão limitados a um gene do tipo silvestre e pode ser 5 um gene mutante ou artificialmente modificado que codifica uma proteína tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4, 12 ou 13 incluindo substituições, deleções, inserções, adições ou semelhante de um ou mais resíduos de aminoácido em uma ou mais posições, na medida em que a função da proteína codificada, isto é, a atividade de transportador de L- glutamato, não seja degradada.

Embora o número considerado pelo termo “um ou vários” usado aqui possa diferir dependendo das posições na estrutura tridimensional da proteína ou tipos de resíduos de aminoácido, especificamente, ele pode ser 1 a 20, de preferência 1 a 10, mais preferivelmente 1 a 5. As substituições, deleções, inserções ou adições antes mencionadas de um ou mais resíduos de aminoácido correspondem a uma mutação conservativa que mantém a atividade de transportador de L-glutamato.

A mutação conservativa é, tipicamente, uma substituição conservativa.

A substituição conservativa é uma substituição em que a substituição ocorre mutuamente entre Phe, Trp e Tyr, se o local de substituição é um aminoácido aromático; entre Leu, Ile e Val, se a substituição é um aminoácido hidrofóbico; entre Gln e Asn, se ele é um aminoácido polar; entre Lys, Arg e His, se ele é um aminoácido básico; entre Asp e Glu, se ele é um aminoácido ácido; e entre Ser e Thr, se ele é um aminoácido tendo grupo hidroxila.

Exemplos específicos de substituição consideradas substituição conservativa incluem: substituição de Ser ou Thr por Ala; substituição de Gln, His ou Lys por Arg; substituição de Glu, Gln, Lys, His ou Asp por Asn; substituição de Asn, Glu ou Gln por Asp; substituição de Ser ou Ala por Cys; substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg por Gln; substituição de Gly, Asn, Gln, Lys ou Asp por Glu;

substituição de Pro por Gly; substituição de Asn, Lys, Gln, Arg ou Tyr por His; substituição de Leu, Met, Val ou Phe por Ile; substituição de Ile, Met, Val ou Phe por Leu; substituição de Asn, Glu, Gln, His ou Arg por Lys; substituição de Ile, Leu, Val ou Phe por Met; substituição de Trp, Tyr, Met, 5 Ile ou Leu por Phe; substituição de Thr ou Ala por Ser; substituição de Ser ou Ala por Thr; substituição de Phe ou Tyr por Trp; substituição de His, Phe ou Trp por Tyr; e substituição de Met, Ile ou Leu por Val.

A mutação para tal substituição, deleção, inserção, adição, inversão ou semelhante de resíduos de aminoácido conforme descrito acima também inclui uma mutação que ocorre naturalmente baseado em diferenças individuais, diferenças na espécie de microorganismo tendo o gene gltP e/ou o gene gltS (mutante ou variante) e assim por diante.

Um gene tendo tal mutação pode ser obtido modificando a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1 ou 3 ou um homólogo do mesmo, por exemplo, mutagênese sítio-específica, de modo que substituição, deleção, inserção ou adição de um resíduo ou resíduos de aminoácido seja incluída a proteína codificada em um sítio específico.

Além disso, como o gene gltP e/ou o gene gltS, um gene que codifica uma proteína mostrando uma homologia de 80% ou mais, de preferência 90% ou mais, mais preferivelmente 95% ou mais, particularmente de preferência 97% ou mais, com a seqüência de aminoácido total de SEQ ID NO: 2, 4, 12 ou 13 e tendo a atividade de transportador de L-glutamato pode ser usado.

Além disso, códons do gene gltP e/ou do gene gltS podem ser substituídos por aqueles facilmente usados por um hospedeiro no qual o gene gltP e/ou o gene gltS é introduzido.

Além disso, contanto que a atividade de transportador de L-glutamato seja mantida, a proteína codificada pelo gene gltP ou o gene gltS pode ser uma proteína na qual a seqüência N- ou C- terminal é alongada ou deletada.

O comprimento da seqüência de aminoácido a ser alongada ou deletada pode ser 50 ou menos, de preferência 20 ou menos,

mais preferivelmente 10 ou menos, particularmente de preferência 5 ou menos em termos do número de resíduos de aminoácido.

Mais especificamente, a proteína pode ser uma proteína tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 com alongamento ou deleção de 5 a 50 5 resíduos de aminoácido sobre o lado N-terminal ou 5 a 50 resíduos de aminoácido sobre o lado C-terminal.

Além disso, um gene gltP e/ou gene gltS modificado pode também ser obtido por meio de tratamento de mutação convencionalmente conhecido descrito abaixo.

Exemplos do tratamento de mutação incluem um método de tratamento de um ou mais do gene gltP e/ou do gene gltS com hidroxilamina ou semelhante in vitro e um método de tratamento de um microorganismo, por exemplo, bactérias Escherichia, contendo o gene com irradiação com raios ultravioleta ou um mutágeno usado em um tratamento de mutação usual, tal como N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) ou etil metano-sulfonato (EMS). Se tal gene modificado codifica uma proteína tendo a atividade de transportador de L-glutamato pode ser confirmado, por exemplo, permitindo expressão do gene em uma célula apropriada e examinando se a proteína tem atividade de transportador de L-glutamato.

Além disso, o gene gltP e/ou o gene gltS pode também ser um DNA o qual é passível de hibridização com uma seqüência complementar à seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1 ou 3, respectivamente ou uma sonda que pode ser preparada a partir de tais seqüências sob condições estringentes e que codificam uma proteína tendo the atividade de transportador de L-glutamato.

As “condições estringentes” mencionadas aqui significam condições sob as quais híbridos específicos são formados, mas híbridos não específicos não são formados.

Embora seja difícil definir precisamente a condição com números, exemplos incluem, por exemplo, condições sob as quais DNAs mostrando alta homologia uns aos outros, DNAs mostrando uma homologia de não menos do que 80%, de preferência não menos do que 90%, mais preferivelmente não menos do que 95%, particularmente de preferência não menos do que 97%, se hibridizam uns aos outros e DNAs tendo uma homologia menor do que o nível acima não se hibridizam uns aos outros e uma condição de lavagem em hibridização de 5 Southern comum, isto é, uma condição de lavagem uma vez, de preferência duas ou três vezes, em concentrações de sal e temperatura de 1 x SSC, SDS a 0,1% a 60°C, de preferência 0,1 x SSC, SDS a 0,1% a 60°C, mais preferivelmente 0,1 x SSC, SDS a 0,1% a 68°C.

Como a sonda, uma parte da seqüência complementar da seqüência de SEQ ID NO: 1 pode também ser usada.

Tal sonda pode ser produzida através de PCR usando oligonucleotídeos preparados com base na seqüência complementar de SEQ ID NO: 1 como iniciadores e um fragmento de DNA contendo a seqüência de nucleotídeo como um template.

Por exemplo, quando um fragmento de DNA tendo um comprimento de cerca de 300 bp é usado como a sonda, a condição de lavagem após hibridização pode ser exemplificada por 2 x SSC, SDS a 0,1% a 50°C.

A modificação para intensificação de expressão de um ou mais do gene gltP e/ou do gene gltS pode ser obtida aumentando o número de cópia do gene em células utilizando, por exemplo, técnicas de recombinação gênica.

Por exemplo, o número de cópias do gene pode ser aumentado ligando um fragmento de DNA contendo o gene gltP e/ou o gene gltS a um vetor o qual funciona em uma bactéria hospedeira, de preferência um vetor com múltiplas cópias, para preparar um DNA recombinante e introduzi-lo em uma bactéria para transformar a bactéria.

Quando o gene gltP de Escherichia coli é usado como o gene gltP, ele pode ser obtido através de PCR (reação em cadeia de polimerase, refira-se a White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) usando iniciadores preparados com base na seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1, Por exemplo, os iniciadores mostrados em SEQ ID NOS: 8 e 9 e um DNA genômico de Escherichia coli como um template.

Os genes gltP derivados de outras bactérias pertencendo à família Enterobacteriaceae também podem ser obtidos a partir de um DNA genômico de cada microorganismo ou uma biblioteca de DNA genômico através de PCR usando, como iniciadores, 5 oligonucleotídeos preparados baseado no gene gltP conhecidos pela bactéria ou uma bactéria de outra espécie ou a informação de seqüência de aminoácido da proteína codificada pelo gene gltP ou hibridização usando um oligonucleotídeo preparado baseado em tal informação de seqüência, conforme descrito acima, como uma sonda.

Um DNA genômico pode ser preparado a partir de um microorganismo que serve como um doador de DNA, por exemplo, através do método de Saito e Miura (Saito H. e Miura K., Biochem.

Biophys.

Acta, 72, 619, 1963; Experiment Manual for Biotechnology, editado pela The Society for Biotechnology, Japão, páginas 97-98, Baifukan Co., Ltda., 1992) ou semelhante.

Então, o gene gltP e/ou o gene gltS amplificado através de PCR é ligado a um DNA de vetor o qual pode funcionar em células de uma bactéria hospedeira para preparar um DNA recombinante.

Exemplos do vetor os quais funcionam em células de uma bactéria hospedeira incluem vetores de replicação autônoma em células da bactéria hospedeira.

Exemplos de vetores de replicação autônoma em células de Escherichia coli incluem pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184, (vetores da série pHSG e pACYC estão disponíveis da Takara Bio Inc.), RSF1010, pBR322, pMW219 (pMW219 está disponível da Nippon Gene Co., Ltda.), pSTV29 (disponível da Takara Bio Inc.) e assim por diante.

De forma a introduzir um DNA recombinante preparado conforme descrito acima em uma bactéria, qualquer método de transformação reportado até o momento pode ser empregado.

Por exemplo, há um método de tratamento de células recipientes com cloreto de cálcio de modo a aumentar a permeabilidade ao DNA, o qual foi reportado para Escherichia coli K-12

(Mandel, M. e Higa, A., J.

Mol.

Biol., 53, 159 (1970)) e um método de uso de células competentes preparadas a partir de células em crescimento e introdução de DNA nas mesmas, o qual foi reportado para Bacillus subtilis (Duncan, C.H., Wilson, G.A. e Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977)). Também 5 aplicável é um método para produzir células recipientes de DNA em protoplastos ou esferoplastos, os quais captam facilmente um DNA recombinante e introdução de um DNA recombinante nos mesmos, o qual é conhecido para Bacillus subtilis, actinomicetes e leveduras (Chang, S. e Choen, S.N., Molec.

Gen.

Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward, J.M. e Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J.B. e Fink, G.R., Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA, 75, 1929 (1978)). O número de cópias de um ou mais do gene gltP e/ou do gene gltS também pode ser aumentado integrando múltiplas cópias de um ou mais dos genes gltP e/ou genes gltS descritos acima em um DNA genômico de uma bactéria, de forma a integrar múltiplas cópias de um ou mais dos genes gltP e/ou genes gltS em um DNA genômico de uma bactéria, recombinação homóloga é realizada objetivando uma seqüência a qual está presente em múltiplas cópias sobre o DNA genômico.

Como a seqüência presente sobre o DNA genômico em um múltiplo número de cópias, um DNA repetitivo ou repetição invertida presente na extremidade de um elemento passível de transposição pode ser usado.

O gene pode ser ligado junto com o gene gltP e/ou o gene gltS o qual está presente no genoma aleatoriamente ou o gene também pode ser introduzido em um gene desnecessário no genoma, de modo que o gene esteja presente em um múltiplo número.

Tal transferência gênica pode ser obtida usando um vetor sensível à temperatura ou um vetor de integração.

Alternativamente, conforme divulgado na Patente Japonesa Depositada Em-Aberto No. 2-109985, também é possível incorporar o gene gltP e/ou o gene gltS em um transposon e deixa-lo ser transferido para introduzir múltiplas cópias do gene em um DNA genômico.

Se o gene foi transferido para um genoma pode ser confirmado realizando hibridização de Southern usando uma parte do gene gltP e/ou o gene gltS como uma sonda.

Ainda, além de aumento do número de cópias do gene descrito 5 acima, expressão do gene gltP e/ou do gene gltS pode também ser intensificada de acordo com o método descrito no documento WO00/18935 substituindo a seqüência de controle de expressão, tal como um promotor do gene gltP e/ou do gene gltS sobre um DNA genômico ou um plasmídeo por um promotor forte, modificando as seqüências da região -35 e da região -10 de modo que as seqüências se tornem seqüências de consenso, amplificação de um regulador que aumenta a expressão do gene gltP e/ou do gene gltS ou deletando ou atenuando um regulador que diminui a expressão do gene gltP e/ou do gene gltS.

Por exemplo, o promotor lac, promotor trp, promotor trc, promotor tac, promotor araBA, promotor PR e promotor PL do fago lambda, promotor tet, promotor T7, promotor Φ10 e assim por diante são conhecidos como promotores fortes.

Um promotor derivado do promotor do óperon de treonina de E. coli ou o promotor tac pode também ser usado.

Uma região promotora, RBS (seqüência de ligação a ribossoma - Ribosome Binding Sequence) ou região SD do gene gltP e/ou o gene gltS pode também ser modificada de modo a se tornar mais forte mediante introdução de uma substituição de nucleotídeo ou semelhante.. Exemplos de método para avaliação da resistência de um promotor e promotores fortes são descritos no paper de Goldstein et al. (Prokaryotic Promoters in Biotechnology, Biotechnol.

Annu.

Rev., 1, 105-128 (1995)) e assim por diante.

Além disso, sabe-se que substituição de vários nucleotídeos em um espaçador entre o sítio de ligação de ribossomo (RBS) e o códon inicial, especialmente uma seqüência imediatamente a montante do códon inicial, afeta grandemente a eficiência de tradução de mRNA e, portanto, essa seqüência pode ser modificada.

Regiões de controle de expressão do gene gltP e/ou do gene gltS, tal como o promotor, podem ser identificadas usando um vetor de sonda de 5 promotor ou um software de análise gênica, tal como GENETYX.

Mediante tal substituição ou modificação de promotor conforme descrito acima, expressão do gene gltP e/ou do gene gltS é intensificada.

Substituição de uma seqüência de controle de expressão pode também ser obtida, por exemplo, através de um método usando um plasmídeo sensível à temperatura ou Red Driven Integration (WO2005/010175). As descrições antes mencionadas referentes a homólogos de genes e proteínas e aumento de expressão gênica também são similarmente aplicadas a outros genes que não os genes gltP e genes gltS, por exemplo, o gene usado para conferir uma capacidade de produção de L-aminoácido, o gene ybjE e produtos de expressão dos mesmos. <2> Método para produção de L-aminoácido O método para produção de um L-aminoácido da presente invenção é caracterizado por cultura da bactéria da presente invenção em um meio para produzir e acumular um L-aminoácido selecionado de L-lisina, L- treonina, L-asparagina, L-ácido aspártico, L-metionina, L-alanina, L- isoleucina e L-homoserina ao meio e coletar o L-aminoácido do meio às células.

Como o meio a ser usado, meios convencionalmente usados para a produção de L-aminoácidos através de fermentação usando bactérias pode ser usado.

Isto é, meios usuais contendo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, íons inorgânicos e opcionalmente outros componentes orgânicos, conforme requerido, podem ser usados.

Como a fonte de carbono, sacarídeos, tais como glicose, lactose, galactose, frutose e hidrolisatos de amidos; alcoóis, tais como glicerol e sorbitol; e ácidos orgânicos, tais como ácido fumárico, ácido cítrico e ácido succínico, podem ser usados.

É especialmente preferível usar glicose, frutose ou sacarose como a fonte de carbono.

Além disso, conforme para uma cepa não tendo capacidade de assimilação de sacarose, se um gene de assimilação de sacarose é introduzido 5 em tal cepa, se torna possível usar sacarose como uma fonte de carbono (Patente U.S.

No. 5.175.107). Como a fonte de nitrogênio, sais de amônio inorgânicos, tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio e fosfato de amônio, nitrogênio orgânico, tal como hidrolisato de soja, gás amônia, amônia gasosa e assim por diante podem ser usados.

Como as fontes nutrientes residuais, é desejável que o meio contenha substâncias requeridas, tais como vitamina B1 e L-homoserina, extrato de levedura e assim por diante em quantidades apropriadas.

Outros que não os acima, fosfato de potássio, sulfato de magnésio, íons de ferro, íons de manganês e assim por diante são adicionados em pequenas quantidades, conforme requerido.

Além disso, o meio usado para a presente invenção pode ser um meio natural ou um meio sintético, contanto que um meio contendo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio e íons inorgânicos e contendo outros componentes residuais orgânicos conforme requerido seja usado.

Além disso, um L-aminoácido que aprimora o crescimento e produtividade pode ser adicionado.

No caso de fermentação de L-lisina, é preferível adicionar L-treonina, L-homoserina e/ou L-isoleucina e, no caso de fermentação de L-treonina, é preferível adicionar L-isoleucina, L-lisina, L- homoserina, etc.

A concentração de adição é cerca de 0,01 a 10 g/L.

A cultura é, de preferência, realizada durante 1 a 7 dias sob condições aeróbicas.

A temperatura de cultura é, de preferência, 24 a 37 °C e o pH durante a cultura é, de preferência, 5 a 9. Para ajuste de pH, substâncias alcalinas ou ácidas inorgânicas ou orgânicas, gás amônia e assim por diante podem ser usados.

Coleta do L-aminoácido do meio de fermentação pode usualmente ser obtida por meio de uma combinação de métodos conhecidos,

tal como o método de resina de troca de íons e o método de precipitação.

Quando o L-aminoácido é acumulado nas células, as células podem ser rompidas, por exemplo, com ondas super-sônicas ou semelhante e o L- aminoácido pode ser coletado através do método de resina de troca de íons ou 5 semelhante do sobrenadante obtido mediante remoção das células da suspensão com células rompidas através de centrifugação.

Quando um aminoácido básico tal como L-lisina é produzido, a produção pode ser realizada através de um método no qual fermentação é realizada controlando o pH do meio durante cultura para ser 6,5 a 9,0 e o pH do meio no final de cultura para ser 7,2 a 9,0 assegurando um período de cultura onde o meio contém 20 mM ou mais de íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato, de modo que esses íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato servem como contra-íons do aminoácido básico e o aminoácido básico alvo é, então, coletado (Patente Japonesa Depositada Em-Aberto No. 2002-65287, Pedido de Patente U.S.

Publicado No. 2002/0025564, Patente Européia Depositada Em-Aberto No. 1813677). Quando um microorganismo tendo uma capacidade de produção de aminoácido básico é cultivada em um meio sob condições aeróbicas, íons de carbonato, íons de bicarbonato ou ambos podem ser usados como principais contra-íons do aminoácido básico.

Para proporcionar íons de carbonato e/ou íons de bicarbonato em uma quantidade requerida para servir como contra-íons do aminoácido básico, sabe-se que o pH do meio pode ser controlado para ser 6,5 a 9,0, de preferência 6,5 a 8,0 durante a cultura e pode ser controlado para ser 7,2 a 9,0 no final da cultura e a pressão no tanque de fermentação pode ser controlada de modo a ser positiva durante fermentação ou dióxido de carbono ou um gás misto contendo dióxido de carbono podem ser fornecidos ao meio (Patente Japonesa Depositada Em-Aberto No. 2002- 65287, Pedido de Patente U.S.

Publicado No. 2002/0025564, Patente Européia Depositada Em-Aberto No. 1813677).

Na presente invenção, a pressão no tanque de fermentação pode ser controlada para ser positiva durante a fermentação e, ao mesmo tempo, gás dióxido de carbono ou um gás misto contendo gás dióxido de carbono pode ser fornecido ao meio.

Ambas as operações acima são, de 5 preferência, realizadas de modo que haja um período de cultura quando, de preferência, 20 mM ou mais, mais preferivelmente 30 mM ou mais, particularmente de preferência 40 mM ou mais de íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato estão presentes no meio.

A pressão interna do tanque de fermentação, a quantidade fornecida de dióxido de carbono ou gás misto contendo dióxido de carbono ou o volume limitado de fornecimento de gás podem ser determinados, por exemplo, medindo-se os íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato no meio ou o pH ou a concentração de amônia do meio.

Na modalidade acima, o pH do meio é controlado para ser 6,0 a 9,0, de preferência 6,5 a 8,0, durante a cultura e 7,2 a 9,0 no final da cultura.

De acordo com a modalidade acima, o pH do meio pode ser tornado menor quando comparado com os métodos convencionais, com presença de íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato em uma quantidade requerida como contra-íons.

Quando o pH é controlado com amônia, amônia é fornecida de forma a aumentar o pH e pode servir como uma fonte de nitrogênio para o aminoácido básico.

Exemplos de outros cátions que não o aminoácido básico no meio incluem K, Na, Mg, Ca, etc. originários em componentes do meio.

Esses estão, de preferência, presentes em uma quantidade de 50% ou menos dos cátions totais.

Além disso, a pressão interna do tanque de fermentação durante fermentação pode ser tornada positiva, por exemplo, tornando a pressão de fornecimento de gás maior do que a pressão de exaustão.

Tornando a pressão interna do tanque de fermentação positiva, o dióxido de carbono gerado pela fermentação dissolve no meio de cultura para gerar íons de bicarbonato ou íons de carbonato e esses podem servir como contra-íons do aminoácido básico.

A pressão interna do tanque de fermentação é, especificamente, 0,03 a 0,2 MPa, de preferência 0,05 a 0,15 MPa, mais preferivelmente 0,1 a 0,3 MPa, em termos da pressão diferencial (diferença de 5 pressão com relação à pressão atmosférica). Além disso, fornecendo dióxido de carbono ou um gás misto contendo dióxido de carbono ao meio de cultura, dióxido de carbono pode ser dissolvido no meio.

Além disso, quando de fornecimento de dióxido de carbono ou um gás misto contendo dióxido de carbono ao meio, a pressão interna do tanque de fermentação pode ser ajustada para ser positiva.

A pressão interna do tanque de fermentação pode ser ajustada para ser positiva, por exemplo, tornando a pressão de fornecimento de gás maior do que a pressão de exaustão.

Além disso, quando dióxido de carbono é fornecido ao meio, por exemplo, dióxido de carbono puro ou um gás misto contendo 5% em volume ou mais de dióxido de carbono pode ser borbulhado no meio.

Os métodos antes mencionados para dissolução de íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato no meio podem ser usados independentemente ou dois ou mais deles podem ser usados em combinação.

Nos métodos convencionais, uma quantidade suficiente de sulfato de amônio ou cloreto de amônio é usualmente adicionada ao meio para servir como contra-ânions do aminoácido básico a ser produzido.

Produtos da decomposição de ácido sulfúrico ou ácido clorídrico de proteínas, etc. são também adicionados ao meio como um componente nutriente e, assim, íons de sulfato e íons de cloreto gerados a partir desses estão presentes no meio.

Portanto, a concentração dos íons fracamente ácidos de carbonato é extremamente baixa durante a cultura, isto é, da ordem de ppm.

A modalidade acima da presente invenção é caracterizada pelo fato de que esses íons de sulfato e íons de cloreto são reduzidos e o dióxido de carbono liberado pelo microorganismo durante fermentação é dissolvido no meio no ambiente de fermentação antes mencionado e usado como contra-íons.

Portanto, na modalidade acima da presente invenção, não é requerido adicionar íons de sulfato ou íons de cloreto ao meio em uma quantidade maior do que a 5 quantidade requerida para o crescimento.

É preferido que uma quantidade apropriada de sulfato de amônio ou semelhante seja adicionada ao meio em um estágio inicial da cultura e a adição seja terminada no meio da cultura.

Alternativamente, sulfato de amônio ou semelhante pode ser adicionado enquanto se mantém o equilíbrio com os íons de carbonato ou íons de bicarbonato dissolvidos no meio.

Além disso, como uma fonte de nitrogênio do aminoácido básico, amônia pode ser adicionada ao meio.

Amônia pode ser fornecida ao meio independentemente ou junto com outros gases.

Menores concentrações de outros ânions que não íons de bicarbonato e/ou íons de carbono no meio são mais preferidas, contanto que eles estejam presentes em quantidades que são requeridas para o crescimento do microorganismo.

Exemplos de tais ânions incluem íons de cloreto, íons de sulfato, íons de fosfato, ácidos orgânicos ionizados, íons de hidróxido e assim por diante.

A concentração molar total desses outros íons é, de preferência, usualmente 900 mM ou menor, mais preferivelmente 700 mM ou menor, ainda mais preferivelmente 500 mM ou menor, ainda mais preferivelmente 300 mM ou menor, particularmente de preferência 200 mM ou menor.

Reduzir as quantidades necessárias de íons de sulfato e/ou íons de cloreto é um dos objetivos da modalidade acima da presente invenção e a quantidade total de íons de sulfato ou íons de cloreto ou ambos contidos no meio é, usualmente, 700 mM ou menor, de preferência 500 mM ou menor, mais preferivelmente 300 mM ou menor, ainda mais preferivelmente 200 mM ou menor, particularmente de preferência 100 mM ou menor.

Se sulfato de amônio é adicionado ao meio como uma fonte de contra-íons de um aminoácido básico, dióxido de carbono no meio de cultura é usualmente eliminado por íons de sulfato.

Contudo, na modalidade acima da presente invenção, não é necessário adicionar uma quantidade em excesso de sulfato de amônio ao meio e, portanto, dióxido de carbono pode ser facilmente dissolvido no meio de fermentação. 5 Além disso, na modalidade acima da presente invenção, é preferível controlar a concentração total de amônia no meio em um ponto tal que “produção do aminoácido básico não seja inibida”. Exemplos das condições para obter tal estado incluem, por exemplo, condições que proporcionam um rendimento e/ou produtividade correspondendo, de preferência, a 50% ou mais, mais preferivelmente 70% ou mais, particularmente de preferência 90% ou mais do rendimento e/ou produtividade obtenível na produção do aminoácido básico sob condições ótimas.

Especificamente, a concentração total de amônia no meio é, de preferência, 300 mM ou menos, mais preferivelmente 250 mM ou menos, particularmente de preferência 200 mM ou menos.

O grau de dissociação da amônia diminui à medida que o pH se torna maior.

Amônia não-dissociada é mais tóxica para bactérias quando comparado com íons de amônio.

Portanto, o limite máximo da concentração total de amônia deverá ser determinado também dependendo do pH do meio de cultura.

Isto é, à medida que o pH do meio de cultura aumenta, a concentração total de amônia aceitável diminui.

Portanto, a concentração total de amônia antes mencionada “a qual não inibe a produção de aminoácido básico” é, de preferência, determinada para cada valor de pH específico.

Contudo, a faixa de concentração total de amônia que é aceitável no maior nível de pH durante a cultura pode ser usada como o limite máximo da concentração total de amônia por todo o período de cultura.

Por outro lado, a concentração total de amônia a qual funciona como uma fonte de nitrogênio requerida para crescimento do microorganismo e produção da substância básica não está particularmente limitada e pode ser apropriadamente determinada, contanto que um nível reduzido da fonte de nitrogênio a qual pode resultar em depleção contínua de amônia durante a cultura não reduza a produtividade da substância alvo pelo microorganismo.

Por exemplo, a concentração de amônia pode ser medida com o tempo durante a cultura e, se a amônia no meio é esgotada, uma pequena quantidade 5 de amônia pode ser adicionada ao meio.

Embora a concentração total de amônia após a adição de amônia não esteja particularmente limitada, a concentração total de amônia pode ser, por exemplo, de preferência 1 mM ou mais, mais preferivelmente 10 mM ou mais, particularmente de preferência 20 mM ou mais.

O meio usado para a presente invenção pode ser qualquer meio, contanto que ele seja um meio o qual contém uma fonte de carbono e uma fonte de nitrogênio como fontes nutrientes.

Para o método da presente invenção, qualquer um de cultura em batelada, cultura descontínua e cultura contínua pode ser usado.

A cultura descontínua antes mencionada refere-se a um método de cultura de alimentação de um meio contínua ou intermitentemente em um vaso sob cultura e não extração do meio do vaso antes de término da cultura.

A cultura contínua refere-se a um método de alimentação contínua ou intermitentemente de um meio a um vaso sob cultura e extração do meio do vaso sob cultura (normalmente, em uma quantidade equivalente à alimentação do meio). No presente relatório descritivo, o termo “meio inicial” significa um meio usado para cultura descontinua antes que o meio de alimentação seja alimentado à cultura descontínua ou cultura contínua e o termo “meio de alimentação” significa um meio a ser fornecido a um fermentador quando cultura descontínua ou cultura contínua é realizada.

O meio de alimentação pode conter todos ou uma parte dos componentes necessários para o crescimento de um microorganismo.

No presente relatório descritivo, o termo “meio de fermentação” significa um meio contido em um fermentador e uma substância alvo é coletada desse meio de fermentação.

Além disso, no presente relatório descritivo, o termo “fermentador” significa um vaso no qual a produção de aminoácido é realizada e o formato do mesmo não está limitado.

Um tanque de fermentação ou um fermentador com vaso pode ser usado.

Além disso, o volume do fermentador não está limitado, contanto que 5 a substância alvo seja produzida e coletada.

Como a fonte de carbono contida no meio usado para a presente invenção, sacarídeos tais como glicose, glicerol, frutose, sacarose, maltose, manose, galactose, hidrolisato de amido e melaços podem ser usados e glicose e sacarose são particularmente preferidos.

Além disso, ácidos orgânicos, tais como ácido acético e ácido cítrico, e alcoóis, tais como etanol e metanol, também podem ser usados independentemente ou em combinação com outras fontes de carbono.

Além disso, como matéria-prima da fonte de carbono, melaço de cana, melaço de beterraba, melaço altamente doce, melaço cítrico e açúcar invertido podem ser usados e hidrolisatos de matérias- primas naturais, tais como celulose, amido, milho, cereal e tapioca também podem ser usados.

Além disso, dióxido de carbono dissolvido no meio de cultura também pode ser usado como uma fonte de carbono.

Essas fontes de carbono podem ser usadas no meio inicial e meio de alimentação.

O meio pode conter um ou mais tipos dessas fontes de carbono.

Além disso, a mesma fonte de carbono pode ser usada para o meio inicial e o meio de alimentação ou a fonte de carbono do meio de alimentação podem ser diferentes daqueles do meio inicial.

Por exemplo, glicose pode ser adicionada como uma fonte de carbono do meio inicial, enquanto que sacarose pode ser usada como uma fonte de carbono do meio de alimentação.

Como a fonte de nitrogênio contida no meio da presente invenção, amônia, sais de amônio, tais como sulfato de amônio, carbonato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, acetato de amônio e uréia, nitratos e assim pode diante, podem ser usados.

Gás amônia e amônia aquosa usados para ajuste de pH podem também ser utilizados como a fonte de nitrogênio.

Além disso, peptona, extrato de levedo, extrato de carne, extrato de malte, licor de macerado de milho, hidrolisato de soja e assim por diante podem também ser utilizados.

O meio pode conter um ou dois ou mais tipos dessas fontes de nitrogênio.

Essas fontes de nitrogênio podem ser usadas para 5 o meio inicial e o meio de alimentação.

Além disso, a mesma fonte de nitrogênio pode ser usada para o meio inicial e o meio de alimentação ou a fonte de nitrogênio do meio de alimentação pode ser diferente daquela do meio inicial.

Além disso, o meio da presente invenção contém, de preferência, uma fonte de fósforo, além da fonte de carbono e da fonte de nitrogênio.

Como a fonte de fósforo, dihidrogen fosfato de potássio, hidrogen fosfato de dipotássio, polímeros de ácido fosfórico, tal como ácido pirofosfórico e assim por diante podem ser usados.

Além disso, o meio da presente invenção pode conter um fator de promoção de crescimento (nutriente mostrando um efeito de promoção de crescimento) além da fonte de carbono e fonte de nitrogênio.

Como o fator de promoção de crescimento, metais residuais, aminoácidos, vitaminas, ácidos graxos, ácidos nucleicos, bem como peptona, casaminoácido, extrato de levedura, produto da degradação de proteína de soja e assim por diante contendo as substâncias antes mencionadas podem ser usados.

Em particular, no caso de aminoácidos aromáticos e aminoácidos de cadeia ramificada, os sistemas de biossíntese dos mesmos são comuns e, portanto, biossíntese de um outro aminoácido que não o aminoácido alvo do microorganismo pode ser atenuada conforme descrito anteriormente.

Em tal caso, é preferível adicionar um aminoácido no qual o sistema de biossíntese é atenuado ao meio.

Por exemplo, quando o aminoácido alvo é L-lisina, tal aminoácido é L-metionina, L-treonina ou L-isoleucina.

Exemplos dos metais residuais incluem ferro, manganês, magnésio, cálcio e assim por diante.

Exemplos das vitaminas incluem vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, ácido nicotínico, amida de ácido nicotínico, vitamina B12, piridoxina, ácido pantotênico e assim por diante.

Esses fatores de promoção de crescimento podem estar contidos no meio inicial ou no meio de alimentação. 5 Além disso, quando uma cepa mutante auxotrófica que requer um aminoácido ou semelhante para crescimento da mesma é usada, é preferível suplementar um nutriente requerido ao meio usado na presente invenção.

Em particular, uma vez que as vias biossintéticas de L-aminoácido são freqüentemente intensificadas e a capacidade de degradação de L- aminoácido é freqüentemente atenuada nas bactérias que produzem L- aminoácido utilizáveis para a presente invenção conforme descrito anteriormente, um ou mais tipos de substâncias selecionadas de L-lisina, L- homoserina, L-isoleucina e L-metionina são desejavelmente adicionadas.

Similarmente, também é preferível adicionar uma substância requerida ao meio para bactérias que produzem ácido nucleico.

O meio inicial e o meio de alimentação podem ter a mesma ou uma composição de meio diferente.

Além disso, quando o meio inicial e o meio de alimentação contêm cristais cultivados, as concentrações de cristal cultivado podem ser as mesmas ou diferentes.

Além disso, quando o meio de alimentação é alimentado em múltiplos estágios, as composições do meio de alimentação podem ser as mesmas ou diferentes.

A cultura é, de preferência, realizada como cultura de aeração em uma temperatura de fermentação de 20 a 45 °C, particularmente de preferência a 30 a 42 °C.

Coleta do L-aminoácido do meio após a cultura pode ser realizada através de uma combinação de métodos de coleta conhecidos, por exemplo, o método de resina de troca de íons, o método de precipitação e outros métodos conhecidos.

Quando o L-aminoácido se deposita no meio, ele pode ser coletado por meio de centrifugação ou filtração.

Além disso, quando o L-aminoácido se deposita no meio, o L-aminoácido que dissolve no meio pode ser cristalizado e, então, o L-aminoácido e os cristais depositados podem ser isolados juntos.

Na presente invenção, cultura do microorganismo pode ser 5 realizada por meio de cultura cultivada e cultura principal de forma a manter o acúmulo de L-aminoácido maior do que um determinado nível.

A cultura cultivada pode ser realizada como cultura de agitação usando um frasco ou semelhante ou cultura descontínua e a cultura principal pode ser realizada como cultura descontínua, cultura em batelada ou cultura contínua.

Alternativamente, a cultura cultivada e a cultura principal podem ser realizadas como cultura em batelada.

Além disso, pré-cultura pode ser realizada mais uma ou duas vezes antes da cultura cultivada e da cultura principal, com escalonamento gradual da cultura durante essas culturas.

Nesses métodos de cultura, quando a concentração de L- aminoácido atinge um nível pretendido, uma parte do L-aminoácido pode ser extraída e um meio pode ser recentemente adicionado para repetir a cultura.

Como o meio a ser recentemente adicionado, um meio contendo uma fonte de carbono e um nutriente tendo um efeito de promoção de crescimento (efeito de promoção de crescimento) é preferido.

Como a fonte de carbono do meio a ser adicionado, glicose, sacarose e frutose são preferidos.

Como o fator de promoção de crescimento, fontes de nitrogênio, ácido fosfórico, aminoácidos e assim por diante são preferidos.

Como a fonte de nitrogênio, amônia, sais de amônio, tais como sulfato de amônio, carbonato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, acetato de amônio e uréia, nitratos e assim por diante podem ser usados.

Além disso, como a fonte de ácido fosfórico, dihidrogen fosfato de potássio e hidrogen fosfato de dipotássio podem ser usados.

Conforme para aminoácidos, quando uma cepa mutante auxotrófica é usada, é preferível adicionar um nutriente requerido suplementar.

Quando cultura descontínua ou cultura contínua é realizada de acordo com a presente invenção, o meio de alimentação pode ser intermitentemente alimentado, de modo que o fornecimento de sacarídeo ou nutrientes seja temporariamente cessado. O fornecimento do meio de alimentação é, de preferência, cessado durante no máximo 30% ou menos, 5 desejavelmente 20% ou menos, desejavelmente 10% ou menos particularmente do tempo de alimentação. Quando o meio de alimentação é intermitentemente alimentado, o meio de alimentação pode ser inicialmente adicionado durante um tempo predeterminado e a segunda e adições seguintes podem ser controladas de modo que elas sejam iniciadas quando elevação de pH ou elevação da concentração de oxigênio dissolvido é detectada por um computador quando de depleção da fonte de carbono no meio de fermentação durante um período de pausa de adição antes de um determinado período de adição de meio e, assim, a concentração de substrato no tanque de cultura é sempre automaticamente mantida em um baixo nível (Patente U.S. No.

5.912.113). A fonte de carbono do meio de alimentação é a mesma que aquela descrita acima. Além disso, o meio de alimentação pode consistir de um tipo de meio ou uma mistura de dois ou mais tipos de meio. Quando dois ou mais tipos de meio são usados, o meio pode ser misturado e alimentado usando uma ou duas latas de alimentação. Quando cultura descontínua é realizada, o meio de alimentação é, de preferência, alimentado de modo que sacarídeo seja alimentado em uma quantidade tal que a quantidade de fonte de carbono no meio de alimentação ou em todo o meio de fermentação não excede a 30 g/L e é, de preferência, controlada para ser 20 g/L ou menor, mais preferivelmente 10 g/L ou menor. Em particular, a concentração de sacarídeo é, de preferência, controlada de modo que ela esteja na faixa de concentração antes mencionada no final da proliferação logarítmica do microorganismo e depois. A taxa de alimentação da fonte de carbono pode ser controlada usando o método descrito na Patente U.S. No. 5.912.113. Além disso, sacarídeo e ácido fosfórico são, de preferência, alimentados em concentrações tais que o sacarídeo e ácido fosfórico servem como fatores limitativos do crescimento de células bacterianas.

Ácido fosfórico pode estar presente no meio de alimentação em uma quantidade de 2 ou menos, de preferência 1,5 ou menos, mais 5 preferivelmente 1 ou menos, expresso em termos da razão de fósforo/carbono (P/C) (refira-se à Patente U.S.

No. 5.763.230). Quando o método de cultura contínua é usado na presente invenção, o meio pode ser extraído e alimentado simultaneamente ou uma parte do meio pode ser extraída e, então, o meio pode ser alimentado.

Além disso, o método pode também ser um método de cultura contínua incluindo reciclagem de células nas quais o meio de cultura contendo um L-aminoácido e células bacterianas é extraído e apenas as células são retornadas para o fermentador (refira-se à Patente Francesa No. 2669935). Como o método para alimentação contínua ou intermitente de uma fonte de nutrientes, o mesmo método conforme usado na cultura descontínua é usado.

Quando o meio de cultura é intermitentemente extraído, uma parte do L-aminoácido extraído quando a concentração de L-aminoácido atinge um nível predeterminado e um meio fresco é alimentado para continuar a cultura.

Além disso, a cultura é, de preferência, realizada de modo que o volume final do meio após adição do meio seja igual ao volume do meio de cultura antes da extração.

O termo “igual” significa que o volume do meio após adição do meio corresponde a cerca de 93 a 107% do volume do meio após a extração.

Quando o meio de cultura é continuamente extraído, a extração é, desejavelmente, iniciada ao mesmo tempo que ou após a alimentação do meio nutriente.

Por exemplo, dentro de 5 horas, desejavelmente 3 horas, mais desejavelmente 1 hora no máximo após o início da alimentação, a extração pode ser iniciada.

Além disso, o volume de extração do meio de cultura é, de preferência, igual ao volume de alimentação de meio.

O método de cultura contínua incluindo reciclagem de células bacterianas é um método de extração intermitente ou contínua do meio de fermentação quando a concentração de L-aminoácido atinge um nível 5 predeterminado, extraindo apenas o L-aminoácido e re-circulando os resíduos de filtração contendo células bacterianas ou centrifugação do sobrenadante no vaso de fermentação e pode ser realizada referindo-se, por exemplo, à Patente Francesa No. 2669935. Caldo de fermentação contendo um aminoácido básico obtido pela presente invenção compreende, de preferência, íons de carbonato e/ou íons de bicarbonato, de modo que a razão de normalidade representada pela equação a seguir se torna 5 a 100%. Razão de Normalidade = (Normalidade dos íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato)/(Normalidade dos cátions consistindo principalmente de aminoácido básico) x 100 Os íons de carbonato e íons de bicarbonato no meio são liberados como dióxido de carbono quando de aquecimento e o teor de aminoácido básico no conteúdo sólido do caldo de fermentação é, desse modo, aumentado.

Além disso, uma vez que carbonatos podem ser facilmente substituídos por um ácido mais forte do que ácido carbônico adicionando tal ácido ao caldo de fermentação, várias formas de sal podem ser selecionadas.

Exemplos Aqui depois, a presente invenção será mais especificamente explicada com referência aos exemplos.

Exemplo 1: Construção de plasmídeo para intensificação do gene gltP ou gene gltS Toda a seqüência de nucleotídeo genômica da cepa Escherichia coli K-12) já foi elucidada (Genbank Acesso No.U00096, Science, 277, 1453-1474 (1997)). De forma a amplificar os genes alvo, um vetor de plasmídeo pMW118 (Nippon Gene) foi usado.

Esse plasmídeo tem um sítio de clonagem múltipla para clonagem de genes arbitrários e é um plasmídeo que permite clonagem de um gene usando esse sítio e amplificação do gene. 5 Com base na seqüência de nucleotídeo do gene gltP ou gltS na seqüência genômica de Escherichia coli e regiões de flanqueamento da mesma, o oligonucleotídeo sintético mostrado em SEQ ID NO: 8 como um iniciador 5' e o oligonucleotídeo sintético mostrado em SEQ ID NO: 9 como um iniciador 3' foram sintetizados para amplificação de gltP e o oligonucleotídeo sintético mostrado em SEQ ID NO: 10 como um iniciador 5' e o oligonucleotídeo sintético mostrado em SEQ ID NO: 11 como um iniciador 3' foram sintetizados para amplificação de gltS, respectivamente.

Usando esses iniciadores, PCR foi realizada com o DNA genômico da cepa K-12 MG1655 de Escherichia coli como o template para obter fragmentos gênicos contendo os genes gltP e gltS, respectivamente.

Os produtos de PCR purificados tiveram as extremidades cegas e foram ligados com o vetor pMW118 digerido com SmaI para construir um plasmídeo pMW-gltP para amplificação de gltP e um plasmídeo pMW-gltS para amplificação de gltS.

Exemplo 2: Intensificação do gene ybjE da cepa WC196ΔcadAΔldcC Como uma cepa parental de bactéria que produz L-lisina, a cepa WC196ΔcadAΔldcC de Escherichia coli descrita na Publicação de Patente Internacional WO2006/078039 foi usada.

Essa cepa corresponde à cepa WC196 de Escherichia coli na qual os genes de decarboxilase de lisina, cadA e ldcC, são rompidos usando Red Driven Integration (Datsenko, K.A. e Wanner B.L., Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA. 97:6640-6645 (2000)) e o sistema de excisão derivado do fago λ (J.

Bacteriol., 184: 5200-5203 (2002)) em combinação.

Essa cepa foi depositada na agencia administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and

Technology, International Patent Organism Depository (Tsukuba Central 6, 1- 1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) em 7 de Outubro de 2008 e fornecido um número de acesso de FERM BP-11027. Sabe-se que a capacidade de produção de L-lisina é 5 aprimorada intensificando a atividade da proteína YbjE tendo uma atividade de excreção de L-lisina (Pedido de Patente U.S.

Publicado No. 2006/0019355). Portanto, expressão do gene ybjE na cepa WC196ΔcadAΔldcC foi intensificada modificando o promotor do gene ybjE sobre o cromossomo da cepa WC196ΔcadAΔldcC no promotor tac e modificando o sítio de ligação de ribossomo (RBS) da mesma em uma seqüência derivada de uma seqüência a montante do gene lac, respectivamente.

A modificação do promotor do gene ybjE e a seqüência RBS da cepa WC196ΔcadAΔldcC foram obtidos através do método antes mencionado usando Red Driven Integration e um sistema de excisão derivado do fago λ em combinação.

Especificamente, a seqüência de 157 bp a montante do códon inicial (nucleotídeos números 49 a 51) do gene ybjE (SEQ ID NO: 5) foi substituída pela seqüência de SEQ ID NO: 7. Uma cepa na qual a substituição gênica pretendida ocorreu pode ser selecionada com base na resistência à canamicina como um índice.

Foi confirmado, através de PCR, que a substituição gênica pretendida ocorreu na cepa candidata.

A cepa obtida na qual o promotor do gene ybjE e a seqüência RBS foram modificados foi designada da cepa WC196LCY.

Exemplo 3: Efeito de amplificação dos genes gltP e gltS na cepa de bactéria Escherichia que produz L-lisina <3-1> Introdução de plasmídeo para produção de lisina na cepa WC196LCY A cepa WC196LCY foi transformada com um plasmídeo para produção de lisina, pCABD2 (Patente Européia No. 0733710), trazendo os genes dapA, dapB e lysC de uma maneira convencional para obter a cepa WC196LCY/pCABD2. pCABD2 contém um DNA que codifica sintase de dihidrodipicolinato (DDPS) de Escherichia coli tendo uma mutação para desensibilização à inibição de feedback pela L-lisina, um DNA que codifica 5 aspartoquinase III de Escherichia tendo uma mutação para desensibilização à inibição de feedback pela L-lisina, um DNA que codifica reductase de dihidrodipicolinato de Escherichia coli e um DNA que codifica dehidrogenase de diaminopimelato de Brevibacterium lactofermentum.

A cepa WC196LCY/pCABD2 foi transformada com o plasmídeo pMW-gltP para amplificação de gltP e o plasmídeo pMW-gltS para amplificação de gltS, os quais foram produzidos no Exemplo 1, respectivamente, para obter cepas resistentes à ampicilina.

Após introdução do plasmídeo predeterminado em cada transformante ser confirmada, a cepa introduzida com o plasmídeo pMW-gltP para amplificação de gltP foi designada cepa WC196LCY/pCABD2/pMW-gltP e a cepa introduzida com o plasmídeo pMW-gltS para amplificação de gltS foi designada cepa WC196LCY/pCABD2/pMW-gltS.

Além disso, uma cepa transformada com pMW118 foi preparada como um controle e designada cepa WC196LCY/pCABD2/pMW118. Cada uma das cepas produzidas acima foi cultivada a 37°C no meio LB contendo 25 mg/L de estreptomicina e 100 mg/L de ampicilina até que a OD600 da cultura se tornasse cerca de 0,6, então, um volume igual de solução de glicerol a 40% foi adicionado à cultura e a mistura foi agitada, divididas em volumes apropriados e armazenadas a -80°C como estoques de glicerol. <3-2> Cultura de produção de Lisina Os estoques de glicerol acima foram descongelados e uniformemente aplicados em um volume de 500 µL cada a uma L-lâmina contendo 25 mg/L de estreptomicina e 100 mg/L de ampicilina e cultura foi realizada a 37°C durante 24 horas.

As células, em uma quantidade de cerca de 1/8 das células obtidas em uma lâmina, foram inoculadas em 20 mL do meio de fermentação descrito abaixo contendo 25 mg/L de estreptomicina e 100 mg/L de ampicilina, o qual estava contido em um frasco de Sakaguchi com 5 volume de 500 ml e cultivadas a 37°C durante 22 horas em um aparelho de cultura com agitação por movimento recíproco.

Após a cultura, as quantidades de L-lisina e ácido L-glutâmico acumuladas no meio foram medidas com o Biotec Analyzer AS210 (SAKURA SEIKI). A composição do meio usada para a cultura é mostrada abaixo.

Meio de produção de L-Lisina Glicose 40 g/L (NH４)２SO４ 24 g/L KH２PO４ 1,0 g/L MgSO４•7H２O 1,0 g/L FeSO４•7H２O 0,01 g/L MnSO４•7H２O 0,08 g/L Extrato de levedura 2,0 g/L L-Isoleucina 0,1 g/L NaCl 1,0 g/L CaCO３ 50 g/L (Farmacopéia Japonesa) O meio foi ajustado para um pH de 7,0 com KOH e submetido à autoclave a 115°C durante 10 minutos, exceto que glicose e MgSO４•7H２O foram misturados e submetidos à autoclave separadamente dos outros componentes.

CaCO3 foi adicionado após esterilização com ar quente.

Os rendimentos de L-lisina e concentrações de ácido L- glutâmico observados após 22 horas de cultura são mostrados na Tabela 3 com valores relativos baseado nos valores observados para WC196LCY/pCABD2/pMW118 como um controle, os quais são tomados como 100. Tabela 3: Efeito de amplificação de gltP ou gltS na bactéria que produz L- lisina, WC196LCY/pCABD2 Rendimento de L-Lisina Concentração de ácido L- Cepa (valor relativo) Glutâmico (valor relativo) WC196LCY/pCABD2/pMW118 100 100 WC196LCY/pCABD2/pMW-gltP 99 47 WC196LCY/pCABD2/pMW-gltS 100 55

Na cepa WC196LCY/pCABD2/pMW-gltP com gene gltP 5 amplificado e na cepa WC196LCY/pCABD2/pMW-gltS com gene gltS amplificado, a quantidade de sub-produção de ácido L-glutâmico diminuiu quando comparado com aquela de WC196LC/pCABD2/pMW118 como o controle sem redução do rendimento de L-lisina.

Exemplo 4: Efeito de amplificação do gene gltP ou gltS na cepa que produz L-treonina de bactéria Escherichia Como uma cepa que produz L-treonina, a cepa VKPM B-3996 de Escherichia coli (refira-se à Patente U.S.

No. 5.175.107) foi usada.

A cepa B-3996 foi transformada com cada um dos plasmídeos pMW-gltP para amplificação de gltP e o plasmídeo pMW-gltS para amplificação de gltS, os quais foram produzidos no Exemplo 1, para obter cepas resistentes à ampicilina.

Após introdução do plasmídeo predeterminado em cada transformante ser confirmada, a cepa introduzida com o plasmídeo pMW-gltP para amplificação de gltP foi designada cepa B-3996/pMW-gltP e a cepa introduzida com o plasmídeo pMW-gltS para amplificação de gltS foi designada cepa B-3996/pMW-gltS.

Além disso, uma cepa transformada com pMW118 foi preparada com um controle e designada cepa B-3996/pMW118. Cada uma das cepas produzidas acima foi cultivada a 37°C no meio LB contendo 100 mg/L de ampicilina e 20 mg/L de sulfato de estreptomicina até que a OD600 da cultura se tornasse cerca de 0,6, então, um volume igual de solução de glicerol a 40% foi adicionado à cultura e a mistura foi agitada, então, dividida em volumes apropriados e armazenada a -80°C como estoques de glicerol.

Os estoques de glicerol acima foram descongelados e uniformemente aplicados em um volume de 150 µL cada a uma L-lâmina contendo 100 mg/L de ampicilina e 20 mg/L de sulfato de estreptomicina e 5 cultura foi realizada a 37°C durante 24 horas.

As células, em uma quantidade de concentração 1/10 das células obtidas em uma lâmina, foram inoculadas em 50 mL do meio LB contendo 100 mg/L de ampicilina e 20 mg/L de sulfato de estreptomicina em um frasco com defletor e cultivadas a 40°C durante 4 horas a 144 rpm como cultura cultivada.

Após término da cultura cultivada, em 300 mL do meio de cultura principal descrito abaixo contido em um fermentador com vaso com volume de 1 L, o meio de cultura cultivado foi inoculado em um volume de 30 ml, correspondendo a 10% do volume do meio de cultura principal e cultura foi realizada a 40 °C e um pH de 7,0. Composição do meio de cultura principal Glicose 100 g/L Extrato de levedura 1,8 g/L KH２PO４ 1,0 g/L NaCl 0,6 g/L MgSO４•7H２O 0,36 g/L FeSO４•7H２O 18 mg/L MnSO４•4H２O 18 mg/L Sulfato de estreptomicina 20 mg/L Ampicilina 100 mg/L Glicose e MgSO４•7H２O foram misturados e esterilizados separadamente dos outros componentes.

Durante a cultura, o meio de cultura foi ajustado para um pH de 7,0 mediante a adição de gás amônia.

Após a cultura ser realizada durante 15,5 horas, a concentração de L-treonina acumulada no meio foi medida através de HPLC.

Além disso, a quantidade de ácido L-glutâmico foi medida com o Biotec Analyzer AS210 (SAKURA SEIKI). Os rendimentos de L-treonina e as concentrações de ácido L-glutâmico são mostradas na Tabela 4 com valores relativos baseados nos 5 valores observados para B-3996/pMW118 como o controle, os quais são tomados como 100. Tabela 4: Efeito de amplificação de gltP ou gltS na bactéria B-3996 que produz L-treonina Rendimento de L-Treonina (valor Concentração de ácido L- Cepa relativo) Glutâmico (valor relativo) B-3996/pMW118 100,0 100,0 B-3996/pMW-gltP 103,0 13,4 B-3996/pMW-gltS 99,4 13,4

Na cepa B-3996/pMW-gltP com gene gltP amplificado e na cepa B-3996/pMW-gltS com gene gltS amplificado, a quantidade de sub- produção de ácido L-glutâmico diminuiu comparado com aquela da B- 3996/pMW118 como o controle sem redução do rendimento de L-treonina.

Exemplo 5: Comparação de amplificação do gene gltP ou gltS e o efeito de amplificação do gene gadC na cepa que produz L-treonina da bactéria Escherichia Como uma descoberta anterior referente ao método para produção de um L-aminoácido com amplificação de uma proteína tendo a atividade de transportador de L-glutamato, sabe-se que amplificando simultaneamente o gene gadC que codifica uma proteína tendo a atividade de anti-porter de L-glutamato/GABA e gadB que codifica uma proteína tendo a atividade de decarboxilase de glutamato, produtividades de L-lisina, L- treonina e L-triptofana são aprimoradas (WO2008/044453). Portanto, o efeito de redução da quantidade de sub-produção de ácido glutâmico a partir de amplificação de gltP ou gltS foi comparado com o efeito de amplificação de gadC.

De forma a construir um plasmídeo para amplificação de gadC, o plasmídeo pMWPthr descrito no documento WO2008/044453 foi usado.

Esse plasmídeo corresponde ao vetor pMW118 (Nippon Gene) tendo a região promotora do óperon de treonina (thrABC) sobre o genoma de Escherichia coli entre o sítio HindIII e o sítio XbaI e é um plasmídeo que permite amplificação de um gene mediante inserção do gene a jusante do 5 promotor.

Com base na seqüência de nucleotídeo do gene gadC na seqüência genômica de Escherichia coli e regiões de flanqueamento do mesmo, o oligonucleotídeo sintético mostrado em SEQ ID NO: 14 como um iniciador 5' e o oligonucleotídeo sintético mostrado em SEQ ID NO: 15 como um iniciador 3' foram preparados e foram usados com DNA genômico da cepa W3110 de Escherichia coli K-12 como o template para realizar PCR e, desse modo, obter um fragmento gênico contendo o gene gadC.

O produto de PCR purificado foi digerido com SacI e SmaI e ligado com o vetor pMWPthr digerido com SacI e SmaI para construir um plasmídeo pMW-gadC para amplificação de gadC.

Da mesma maneira conforme aquela do Exemplo 4, a cepa B- 3996 foi transformada com pMW-gadC e o transformante obtido foi designado cepa B-3996/pMW-gadC.

Essa cepa foi cultivada junto com B- 3996/pMW118, B-3996/pMW-gltP e B-3996/pMW-gltS da mesma maneira conforme aquela do Exemplo 4. As concentrações de ácido L-glutâmico acumulado no meio são mostradas na Tabela 5 em termos de valores relativos baseado no valor observado com B3996/pMW118 como o controle, o qual é tomado como 100. Tabela 5: Comparação do efeito de amplificação do gene gltP ou gltS e efeito de amplificação de gadC na cepa B-3996 da bactéria que produz L-treonina Cepa Concentração de ácido L-glutâmico (valor relativo) B-3996/pMW118 100,0 B-3996/pMW-gltP 13,4 B-3996/pMW-gltS 13,4 B-3996/pMW-gadC 109,3

Na cepa B-3996/pMW-gltP com gene gltP amplificado e na cepa B-3996/pMW-gltS com gene gltS amplificado, a quantidade de sub-

produção de ácido L-glutamico foi acentuadamente diminuída.

Por outro lado, na cepa B-3996/pMW-gadC com gene gadC amplificado, a concentração de ácido L-glutâmico não diminui mas, inversamente, aumentou e, assim, se torna claro que amplificação de gadC não tem um efeito de redução da 5 concentração de ácido L-glutâmico no meio de fermentação.

Explicação da Listagem de Seqüência SEQ ID NO: 1: seqüência do gene gltP SEQ ID NO: 2: seqüência de aminoácido de GltP SEQ ID NO: 3: seqüência do gene gltS SEQ ID NO: 4: seqüência de aminoácido de GltS SEQ ID NO: 5: seqüência do gene ybjE SEQ ID NO: 6: seqüência de aminoácido de YbjE SEQ ID NO: 7: seqüência de ybjE a montante para substituição SEQ ID NO: 8: Iniciador para amplificação de gltP (extremidade 5') SEQ ID NO: 9: Iniciador para amplificação de gltP (extremidade 3') SEQ ID NO: 10: Iniciador para amplificação gltS (extremidade 5') SEQ ID NO: 11: Iniciador para amplificação de gltS (extremidade 3') SEQ ID NO: 12: seqüência conservada de gltP SEQ ID NO: 13: seqüência conservada de gltS SEQ ID NO: 14: Iniciador para amplificação de gadC (extremidade 5') SEQ ID NO: 15: Iniciador para amplificação de gadC (extremidade 3') Aplicabilidade Industrial

Usando o método da presente invenção, o subproduto pode ser reduzido na produção de L-lisina, L-treonina, L-asparagina, L-ácido aspártico, L-metionina, L-alanina, L-isoleucina e L-homoserina através de fermentação.

Claims (13)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para produzir um L-aminoácido caracterizado pelo fato de compreender cultura de uma bactéria a qual pertence à família Enterobacteriaceae e tem uma capacidade de produção de L-aminoácido em 5 um meio para produzir e acumular o L-aminoácido no meio e coleta do L- aminoácido do meio, em que: a bactéria foi modificada de modo que expressão do gene gltP e/ou do gene gltS é aumentada e o L-aminoácido é selecionado do grupo consistindo de L-lisina, L-treonina, L-asparagina, L-ácido aspártico, L- metionina, L-alanina, L-isoleucina e L-homoserina.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o gene gltP codifica uma proteína mostrada em (A) ou (B) a seguir: (A) uma proteína tendo a seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 12, (B) uma proteína tendo a seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 12 incluindo substituições, deleções, inserções, adições ou inversões de um ou vários resíduos de aminoácido e tendo uma atividade de transportador de L-glutamato.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o gene gltP codifica uma proteína mostrada em (A1) ou (B1) a seguir: (A1) uma proteína tendo a seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 2, (B1) uma proteína tendo a seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 2 incluindo substituições, deleções, inserções, adições ou inversões de um ou vários resíduos de aminoácido e tendo uma atividade de transportador de L-glutamato.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

3, caracterizado pelo fato de que o gene gltP é um DNA mostrado em (a) ou (b) a seguir: (a) um DNA tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 1, 5 (b) um DNA o qual é capaz de se hibridizar com uma seqüência complementar à seqüência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 1 ou uma sonda a qual pode ser preparada a partir da seqüência de nucleotídeo sob condições estringentes e codifica uma proteína tendo uma atividade de transportador de L-glutamato.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o gene gltS codifica uma proteína mostrada em (C) ou (D) a seguir: (C) uma proteína tendo a seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 13, (D) uma proteína tendo a seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 13 incluindo substituições, deleções, inserções, adições ou inversões de um ou vários resíduos de aminoácido e tendo uma atividade de transportador de L-glutamato.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o gene gltS codifica uma proteína mostrada em (C1) ou (D1) a seguir: (C1) uma proteína tendo a seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 4, (D1) uma proteína tendo a seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 4 incluindo substituições, deleções, inserções, adições ou inversões de um ou vários resíduos de aminoácido e tendo uma atividade de transportador de L-glutamato.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o gene gltS é um DNA mostrado em (c) ou

(d) a seguir: (c) um DNA tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 3, (d) um DNA o qual é capaz de se hibridizar com uma 5 seqüência complementar à seqüência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 3 ou uma sonda a qual pode ser preparada a partir da seqüência de nucleotídeo sob condições estringentes e codifica uma proteína tendo uma atividade de transportador de L-glutamato.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a expressão do gene é intensificada aumentando o número de cópias do gene ou modificando uma seqüência de controle de expressão do gene.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido é L-lisina e expressão do gene ybjE é aumentada na bactéria.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o gene ybjE codifica uma proteína mostrada em (E) ou (F) a seguir: (E) uma proteína tendo a seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 6 ou a seqüência de aminoácido dos aminoácidos números 17 a 315 em SEQ ID NO: 6, (F) uma proteína tendo a seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 6 ou a seqüência de aminoácido dos aminoácidos números 17 a 315 em SEQ ID NO: 6 incluindo substituições, deleções, inserções, adições ou inversões de um ou vários resíduos de aminoácido e tendo uma atividade de excreção de L-lisina.

11. Método de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o gene ybjE é um DNA mostrado em (e) ou (f) a seguir:

(e) um DNA tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 5 ou a seqüência de nucleotídeo dos nucleotídeos números 49 a 948 em SEQ ID NO: 5, (f) um DNA o qual é capaz de se hibridizar com uma 5 seqüência complementar à seqüência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 5 ou a seqüência de nucleotídeo dos nucleotídeos números 49 a 948 em SEQ ID NO: 5 ou uma sonda a qual pode ser preparada a partir dessas seqüências de nucleotídeo sob condições estringentes e codifica uma proteína tendo uma atividade de excreção de L-lisina.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido é L-lisina, pH do meio é controlado para ser 6,0 a 9,0 durante cultura para a produção e 7,2 a 9,0 no final da cultura e é mantido um período de cultura onde 20 mM ou mais de íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato estão presentes no meio, de modo que os íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato servem como contra-íons do aminoácido básico.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a bactéria é uma bactéria Escherichia.