DE69534848T2

DE69534848T2 - Mikroorganismen und Verfahren zur Überproduktion von DAHP mittels klonierten PPSGens

Info

Publication number: DE69534848T2
Application number: DE69534848T
Authority: DE
Inventors: C. James College Station LIAO
Original assignee: Texas A&M University System
Current assignee: Texas A&M University System
Priority date: 1994-09-16
Filing date: 1995-09-15
Publication date: 2006-11-23
Anticipated expiration: 2015-09-16
Also published as: CA2199853A1; US5906925A; DK0782621T3; DE69534848D1; EP0782621A1; EP0782621B1; CA2199853C; WO1996008567B1; ATE319834T1; MX9702011A; WO1996008567A1

Description

Diese Arbeit wurde teilweise durch die National Science Foundation (Grant BCS-9257351), die Welch Foundation (Grant A-1251) und das Texas Higher Education Coordinating Board (Grant 999903-084) unterstützt. Die Regierung der Vereinigten Staaten kann nicht-exklusive Rechte an und für die Erfindung besitzen.
Die vorliegende Erfindung betrifft die biosynthetische Herstellung von organischen chemischen Verbindungen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Erhöhung der Ausbeute von 3-Desoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphat (DAHP) in Mikroorganismen durch genetische Veränderungen. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Verbesserung der Produktion von zyklischen und aromatischen Metaboliten, die von DAHP abgeleitet sind, in Mikroorganismen durch genetische Veränderungen. Zum Beispiel ist die Biosynthese von DAHP der erste Schritt im gemeinsamen aromatischen Syntheseweg, aus dem Tyrosin, Tryptophan, Phenylalanin, und andere aromatische Metaboliten gebildet werden. Auch stellen Synthesewege, die sich von dem gemeinsamen aromatischen Syntheseweg abzweigen, solche brauchbaren chemischen Produkte wie Catechol und Chinoidorganische Verbindungen, wie zum Beispiel Chininsäure, Benzochinon und Hydrochinon zur Verfügung. Zusätzlich können Aspartam und Indigo aus Produkten hergestellt werden, die sich aus dem gemeinsamen aromatischen Syntheseweg ableiten.
Die Herstellung von chemischen Verbindungen aus Mikroorganismen war lange eine wichtige Anwendung der Biotechnologie. Typischerweise schließen die an der Entwicklung eines Mikroorganismus Produktions-Stammes beteiligten Schritte, (i) die Auswahl eines geeigneten Wirtsmikroorganismus, (ii) die Eliminierung von metabolischen Synthesewegen, die zu Neben-Produkten führen, (iii) die Deregulierung von solchen Synthesewegen auf sowohl dem Enzymaktivitätsniveau und dem transkriptionellen Niveau und (iv) die Überexpression von geeigneten Enzymen in den gewünschten Synthesewegen ein.
Die letzten drei Schritte können nun durch die Verwendung einer Vielzahl von in vivo- und in vitro-Verfahren erreicht werden. Diese Verfahren sind besonders anwenderfreundlich in gut untersuchten Mikroorganismen, wie zum Beispiel Escherichia coli (E. coli). Daher wurden viele Beispiele von veränderten Mikroorganismen für die physiologische Charakterisierung und Metabolitherstellung veröffentlicht.
In den meisten Fällen ist das erste Ziel für Veränderung der terminate Syntheseweg, der zu dem gewünschten Produkt führt, und die Ergebnisse sind gewöhnlicherweise erfolgreich. Jedoch erfordern weitere Verbesserungen von Produktivität (Produktbildungsrate) und Ausbeute (Prozent Konversion) von gewünschten Produkten die Veränderung von zentralen Stoffwechsel-Synthesewegen, die erforderliche Vorläufer und die Energie für die gewünschten Biosynthesen dieser Produkte zur Verfügung stellen.
Zyklische und aromatische Metaboliten, wie zum Beispiel Tryptophan, Phenylalanin, Tyrosin, Chinone und ähnliche führen ihre Biosynthese auf die Kondensationsreaktionen von Phosphoenolpyruvat (PEP) und D-Erythrose-4-phospat (E4P) zurück, um DAHP zu bilden. Die DAHP-Biosynthese ist der erste wesentliche Schritt im gemeinsamen aromatischen Syntheseweg. Die DAHP-Biosynthese wird durch drei DAHP-Synthasen oder Isoenzyme vermittelt. Diese Isoenzyme werden durch die Gene aroF, aroG und aroH kodiert, deren Genprodukte durch jeweils Tyrosin, Phenylalanin und Tryptophan feed-back inhibiert werden.
Nach der DAHP-Biosynthese wird einiges DAHP in Chorismat überführt. Chorismat ist ein Zwischenprodukt im biosynthetischen Synthesewegen, die letztendlich zur Herstellung von aromatischen Verbindungen wie zum Beispiel Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin, Folat, Melanin, Ubichinon, Menachinon, Prephensäure (in der Herstellung des Antibiotikums Bacylisin verwendet) und Enterochelin führen. Aufgrund der großen Zahl von biosynthetischen Synthesewegen, die von Chorismat abhängig sind, ist der biosynthetische Syntheseweg der von Organismen verwendet wird um Chorismat herzustellen, oft als der „gemeinsame aromatische Syntheseweg" bekannt.
Neben seiner Verwendung in der Chiosmat-Herstellung kann DAHP auch zu Chininsäure, Hydrochinon, Benzohydrochinon oder Catechol konvertiert werden, wie beschrieben durch Draths et al. (Draths, K. M., Ward, T. L., Frost, J. W., „Biocatalysis and Nineteenth Century Organic Chemistry: conversion of D-Glucose into Quinoid Organics," J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1925-26). Diese biosynthetischen Synthesewege zweigen von dem gemeinsamen aromatischen Syntheseweg ab, bevor Shikimat gebildet wird.
Die effiziente Herstellung von DAHP durch einen Mikroorganismus ist für die Herstellung von aromatischen Metaboliten wichtig, da DAHP der Vorläufer in hauptsächlichen Synthesewegen ist, die die aromatischen Metaboliten herstellen. Die drei aromatischen Aminosäuren, neben der Tatsache, dass sie wesentliche Bausteine für Proteine sind, sind brauchbare Vorläuferchemikalien für andere Verbindungen, wie zum Beispiel Aspartam, das Phenylalanin benötigt. Zusätzlich kann der Tryptophan-Syntheseweg genetisch modifiziert werden, um Indigo herzustellen.
Die Produktion von Tryptophan und Phenylalanin durch E. coli wurde gut dokumentiert. Zum Beispiel berichteten Aiba et al. (Aiba, S., H. Tsunekawa, and T. Imanaka, „New Approach to Tryptophan Production by Escherichia coli: Genetic Manipulation of Composite Plasmids In Vitro," Appl. Env. Microbioll. 1982, 43:289-297) einen Tryptophan-Überproduzierer, der überexprimierte Gene in dem Tryptophanoperon enthält in einem Wirtsstamm der trpR und tna (das Tryptophanase kodiert) negativ ist. Darüber hinaus wurden verschiedene Enzyme mutiert, wie zum Beispiel das trpE Genprodukt, um einer feed-back-Inhibierung zu widerstehen. Über ähnliche Arbeit wurde für die Phenylalanin-Produktion berichtet.
In der Vergangenheit wurde die verstärkte Beteiligung von zellulären Kohlenstoffquellen, die in den gemeinsamen aromatischen Signalweg eintreten und durch ihn hindurch laufen, mit nur geringerem Erfolg erreicht (d. h. solche Versuche blieben weit hinter der theoretischen Ausbeute zurück). Typischerweise wurden die Verstärkungen durch Transferieren von genetischen Elementen, die für Enzyme kodieren, die den Kohlenstoff-Fluss in und/oder durch den gemeinsamen aromatischen Signalweg richten, in Wirtszellen erreicht. Solche genetischen Elemente können in der Form von extrachromosomalen Plasmiden, Cosmiden, Phagen, oder anderen Replikons vorliegen, die in der Lage sind, genetische Elemente in die Wirtszelle zu transformieren.
United States Patent Nr. 5,168,056 von Frost beschreibt die Verwendung eines genetischen Elements, das einen Expressionsvektor enthält und ein Gen, das für Transketolase (Tkt) kodiert, das tkt-Gen. Dieses genetische Element kann in das Chromosom des Mikroorganismus integriert werden, um eine Überexpression des Tkt-Enzyms zur Verfügung zu stellen.
Zusätzliche Beispiele schließen ein: Miller et al. (Miller, J. E., K. C. Backman, J. M. O'Connor, and T. R. Hatch, „Production of phenylalanine and organic acids by PEP carboxy lase-deficient mutants of Escherichia coli," J. Ind. Microbiol., 1987, 2:143-149), die versuchten, einen stärkeren Kohlenstoff-Fluss in den Aminosäure-Syntheseweg zu richten, durch die Verwendung einer Phosphatenolpyruvatcarboxylase-(kodiert durch ppc)defizienten Mutante; Draths et al. (Draths, K. M., D. L. Pompliano, D. L. COnley, J. W. Frost, A. Berry, G. L. Disbrow, R. J. Staversky, and J. C. Lievense, „Biocatalytic synthesis of aromatics from D-glucose: The role of transketolase," J. Am. Chem. Soc., 1992, 114:3956-3962), die berichteten, dass die Überexpression von Transketolase (kodiert durch tktA) und einer feed-back resistente DAHP-Synthase (kodiert durch aroG^fbr) zu einer erhöhten Produktion von DAHP aus Glukose führte.
Die Überproduktion von Transketolase in tkt-transformierten Zellen wurden als einen verstärkten Fluss von Kohlenstoffquellen in den gemeinsamen aromatischen Syntheseweg zur Verfügung stellend gefunden, relativ zur Kohlenstoffquellenverwendung in Gesamtzellen, die nicht solche genetischen Elemente beinhalten. Jedoch kann der erhöhte Kohlenstoff-Fluss durch zusätzliche Manipulation des Wirtsstammes weiter verstärkt werden.
Daher ist es wünschenswert, genetisch veränderte Stämme von Mikroorganismen zu entwickeln, die in der Lage sind, die Produktion von DAHP auf nahezu theoretische Ausbeute zu erhöhen. Solche genetisch veränderten Stämme können dann für die selektive Produktion von DAHP verwendet werden oder in Kombination mit anderen inkorporierten genetischem Material zur selektiven Produktion von gewünschten Metaboliten. Die effiziente und kosteneffektive biosynthetische Produktion von Chorismat, Chininsäure, Hydrochinon, Benzohydrochinon, Catechol oder Derivaten von diesen Chemikalien erfordert, dass die Kohlenstoffquellen, wie zum Beispiel Glukose, Laktose, Galaktose, Xylose, Ribose oder andere Zucker in hoher Ausbeute in das gewünschte Produkt überführt werden können. Demzufolge ist es vom Standpunkt der industriellen biosynthetischen Produktion von Metaboliten wertvoll, den Einstrom von Kohlenstoffquellen für die Zellbiosynthese von DAHP und seinen Derivaten zu erhöhen.
Die vorliegende Erfindung stellt genetisch veränderte Stämme von Mikroorganismen zur Verfügung, die das pps Gen überexprimieren, um die Produktion von DAHP auf nahezu theoretische Ausbeuten zu erhöhen. Die vorliegende Erfindung stellt auch genetisch veränderte Stämme von Mikroorganismen zur Verfügung, wo mindestens eines der Plasmide pPS341, pPSL706, pPS706 oder Derivate davon in einen Mikroorganismus transformiert ist, um die Produktion von DAHP auf nahezu theoretische Ausbeuten zu erhöhen.
Die vorliegende Beschreibung stellt weiterhin ein Verfahren zur Erhöhung des Kohlenstoffflusses für die Biosynthese von DAHP in einer Wirtszelle zur Verfügung, umfassend die Schritte von transformieren in die Wirtszelle einer rekombinanten DNA, umfassend ein pps Gen, so dass Pps bei verstärkten Spiegeln relativ zu Wildtyp-Wirtszellen exprimiert wird, konzentrieren der transformierten Zellen durch Zentrifugation, resuspendieren der Zellen in einem minimalen, Nährstoff-armen Medium, fermentieren der resuspendierten Zellen und isolieren von DAHP aus dem Medium.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren zur Erhöhung von Kohlenstoff-Fluss in den gemeinsamen aromatischen Syntheseweg einer Wirtszelle zur Verfügung, umfassend die Schritte von Transformieren der Wirtszelle mit rekombinanter DNA umfassend ein pps Gen, so dass Pps an dem geeigneten Punkt in dem Stoffwechselsyntheseweg in erhöhten Spiegeln relativ zu Wildtyp-Wirtszellen exprimiert wird.
Die vorliegende Beschreibung stellt weiterhin Verfahren zur Erhöhung der biosynthetischen Produktion von Verbindungen in einer Wirtszelle zur Verfügung, die von dem gemeinsamen aromatischen Syntheseweg abgeleitet sind, relativ zu der biosynthetischen Produktion von solcher Verbindung in Wildtyp-Wirtszellen, wobei das Verfahren den Schritt der Erhöhung der Expression in einer Wirtszelle eines Proteins umfaßt, das die Konversion von Pyruvat zu PEP katalysiert.
Die vorliegende Beschreibung stellt auch Verfahren zur Überexpression von Pps in Mikroorganismen-Stämmen zur Verfügung, die DAHP bei der Produktion von DAHP aus Metaboliten verwenden.
Die vorliegende Beschreibung stellt weiterhin eine Kultur zur Verfügung, die einen Mikroorganismus enthält, der durch die Überexpression von Pps gekennzeichnet ist, wobei die Kultur in der Lage ist, DAHP Metaboliten nahe theoretischer Ausbeuten nach Fermentation in einem wässrigen Resuspensions-, minimalen, Nährstoff-armen Medium, enthaltend verstoffwechselbare Kohlenstoffquellen, Stickstoff und anorganische Substanzen, zur Verfügung.
Die vorliegende Beschreibung stellt weiterhin ein genetisches Element zur Verfügung, umfassend ein pps Gen und eines oder mehrere Gene ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem aroF Gen, aroG Gen, aroH Gen und einem apoB Gen.
Die vorliegende Beschreibung stellt weiterhin ein DNA Molekül zur Verfügung, das einen Vektor umfaßt, der ein Gen trägt, das für Pps kodiert.
1 Überexpression von Pps erhöht die Produktion von DAHP. Der verwendete Wirtsstamm war AB2847 und die verwendeten Plasmide sind wie in der Figur markiert. Beachte, dass pPSXI und pUHE jeweils pPS341X1 und pUHE23-2 bezeichnen. Diese Stämme wurden zuerst in dem YE Medium (einem reichen Medium) bis zur späten stationären Phase kultiviert und dann gewaschen und in einem Minimalmedium resuspendiert. (A) DAHP Konzentrationen gemessen bei 10 und 27 Stunden nach Resuspendierung. (B) Die Aktivitäten von DAHP Synthase (aroG) und Pps, gemessen bei 27 Stunden nach Resuspendierung.
2 DAHP Produktion bei 10 und 27 Stunden nach Resuspendierung. (A) Stamm AB2847 mit Plasmiden, wie in der Abszisse markiert. pPSXI und pUHE bezeichnen jeweils pPS341X1 und pUHE23-2. (B) Stämme AB2847 (markiert als AB), JCL1283 ppc::Km (markiert als ppc) und JCL1362 pps::MudK (markiert als pps) mit Plasmiden, die in der Abszisse angegeben sind.
3 Reaktionssynthesewege für die maximale Konversion von Glukose in DAHP für (A) Stämme ohne Pps, (B) Stämme, die Pps überexprimieren. Die Zahlen sind die relativen Flussraten, die für die Umwandlung von 7 Mol an Glukose in DAHP erforderlich sind. Die Abkürzungen sind: G6P, Glukose 6-P; F6P, Fruktose 6-P; 1,6FDP, 1,6-Fruktosediphosphat; DHAP, Dihydroxyazetonphosphat; GAP, Glyzeraldehyd 3-P; R5P, Ribose 5-P; X5P, Xylulose 5-P; S7P, Sedoheptulose 7-P.
4 Der gemeinsame aromatische Syntheseweg ist gezeigt, wobei E4P und PEP einer Kondensationsreaktion unterzogen werden, um den gemeinsamen aromatischen Syntheseweg zu beginnen.
5 Konstruktion von pPSL706. Die Plasmide pPS706 und pGS103 wurden mit EcoRI und ScaI geschnitten. Die Fragmente, die pps aus pPS706 enthalten und das Fragment, das luxl' enthält, wurden gereinigt und ligiert, um pPSL706 zu erzeugen. Das Plasmid pPS706 wurde durch Einführen eines pps PCR Fragments in 9 des Klonierungsvektors pJF118EH konstruiert.
6 Effekte der Pps Aktivität auf DAHP Produktion aus Glukose bei verschiedenen IPTG- und Autoinduzierer-Konzentrationen. Die Stämme sind AB2847/pPSL706/pAT1 und AB2847/pPSL706/pRW5. Das Plasmid pGS104 wurde verwendet, um pPSL706 als eine Kontrolle zu ersetzen, und die Daten sind die am meisten linksseitigen Punkte in jedem Graphen.
Viele Mikroorganismen synthetisieren aromatische Vorläufer und aromatische Verbindungen aus der Kondensationsreaktion von PEP und E4P, um DAHP herzustellen. Diese Kondensationsreaktion, um DAHP zu bilden, ist der erste beteiligte Schritt in dem biosynthetischen Syntheseweg, der als der gemeinsame aromatische Syntheseweg bekannt ist. Aus diesem Synthesenweg synthetisieren die Zellen viele zyklische Metaboliten, prä-aromatische Metaboliten und aromatische Metaboliten, wie z.B. die aromatischen Aminosäuren, Chinon-Biomoleküle und verwandte aromatische und zyklische Moleküle.
Der Erfinder hat gefunden, dass Zelllinien entwickelt werden können, die den Kohlenstoff-Fluss in die DAHP Produktion erhöhen und nahezu theoretische Spiegel von DAHP durch die Überexpression von Phospoenolpyruvatsynthase (Pps) in den Zelllinien erreichen. Die Überexpression von Pps kann die finale Konzentration und Ausbeute von DAHP um bis zu zweifach erhöhen, auf eine nahezu theoretisches Maximum, verglichen mit Wildtyp-Zelllinien. Die Überexpression von Pps wird durch transformieren einer Zellline mit rekombinanter DNA erreicht, die ein pps Gen umfasst, so dass Pps in erhöhtem Spiegel relativ zu der Wildtyp-Zellline exprimiert wird, und so dass die Ausbeute von DAHP sich an seinen theoretischen Wert annähert.
Im allgemeinen verbessert die vorliegende Erfindung die Expression einer Wirtszelle von Pps relativ zu einer Wildtyp-Wirtszelle entweder durch den Transfer und die stabile Inkorporation eines extrachromosomalen genetischen Elements in die Wirtszelle oder durch den Transfer des genetischen Elements in das Genom der Wirtszelle. Die exprimierten Genprodukte sind Enzyme, die so aufgebaut sind, um geeignete katalytische Zentren für die Substratkonversion von Verbindungen des gemeinsamen aromatischen Synthesewegs zur Verfügung zustellen.
Neben der Verwendung des pps Gens stellt die vorliegende Erfindung auch den Transfer von genetischen Elementen zur Verfügung, die das tkt Gen umfassen. Die vorliegende Beschreibung stellt auch den Transfer von genetischen Elementen zur Verfügung, die das Gen umfassen, das für DAHP Synthase (aroF in E. coli) kodiert, das Gen, das für 3-Dehydrochinatsynthase (aroG in E. coli) kodiert, oder andere Gene, die für Enzyme kodieren, die Reaktionen im gemeinsamen aromatischen Syntheseweg katalysieren. Solch eine Zelltransformation kann durch transferieren von einem oder mehreren Plasmiden erreicht werden, die Gene enthalten, die für Enzyme kodieren, die den Kohlenstoff-Fluß für die DAHP Synthese erhöhen und für die anschließende Synthese von anderen erwünschten zyklischen, präaromatischen und aromatischen Metaboliten. Als ein Ergebnis dieses Transfers von genetischem Element(en) tritt mehr Kohlenstoff ein und bewegt sich durch den gemeinsamen aromatischen Syntheseweg, relativ zu Wildtyp-Wirtszellen, die nicht die genetischen Elemente der vorliegenden Erfindung enthalten. In einer Ausführungsform umfaßt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Kohlenstoff-Flusses in den gemeinsamen aromatischen Syntheseweg einer Wirtszelle durch Erhöhen der Produktion von DAHP durch die Überexpression von Pps an dem geeigneten Punkt im gemeinsamen aromatischen Syntheseweg, um zusätzliches PEP an dem Punkt zur Verfügung zustellen, wo PEP mit E4P kondensiert. Ein erhöhter Kohlenstoff-Fluss erfordert den Schritt von Transformieren der Wirtszelle mit rekombinanter DNA, die ein pps Gen enthält, so dass Pps bei erhöhten Spiegeln relativ zu Wildtyp-Wirtszellen überexprimiert wird. DAHP wird dann durch Fermentation der transformierten Zelle in einem Nährstoffmedium hergestellt, wobei das DHAP aus dem Medium auf eine Chargen-Weise oder ein kontinuierliches Extraktionsverfahren extrahiert werden kann.
In einer anderen Ausführungsform schließt die vorliegende Erfindung die co-Überexpression eines pps Gens und anderer Gene ein, die für Enzyme des gemeinsamen aromatischen Synthesewegs kodieren, wobei weiteres genetisches Material in die Wirtszelle transformiert wird. In der vorliegenden Beschreibung können die Gene, die transferiert werden, das tkt Gen, das DAHP Synthasegen und DHQ Synthasegen (bevorzugterweise jeweils die aroF oder aroB Gene) einschließen. Obwohl die jetzige Arbeit sich auf die Transformation von bestimmten Wirtzzellstämmen von E. coli, wie z.B. AB2847 aroB gerichtet hat, kann diese bestimmte Wirtszelle nicht die bevorzugte Wirtszelle für die kommerzielle Herstellung von DAHP oder DAHP Metaboliten durch die Überexpression von Pps sein.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Erhöhung der biosynthetischen Produktion einer Wirtszelle von Verbindungen, die aus dem gemeinsamen aromatischen Syntheseweg abgeleitet sind. Dieses Verfahren schließt den Schritt von Erhöhen der Expression von Pps in der Wirtszelle relativ zu einer Wildtyp-Wirtszelle ein. Der Schritt von Erhöhen der Expression von Pps kann ein Transferieren in die Wirtszelle eines Vektors einschließen, der das pps Gen trägt. Die Überexpression von Pps führt zum hineinzwingen eines erhöhten Kohlenstoff-Flusses in die Biosynthese von DAHP.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Beschreibung wird ein Verfahren zur Erhöhung der biosynthetischen Produktion einer Wirtszelle von Verbindungen, die aus dem gemeinsamen aromatischen Syntheseweg abgeleitet sind, relativ zur biosynthetischen Produktion einer Wildtyp-Wirtszelle einer solchen Verbindung zur Verfügung gestellt. Dieses Verfahren erfordert den Schritt der Erhöhung einer Expression in einer Wirtszelle eines Proteins, das die Überführung von Pyruvat in PEP katalysiert. Die Expression eines solchen Proteins kann ein Transferieren von rekombinanter DNA, die ein pps Gen einschließt, in die Wirtszelle einschließen.
In einer andern bevorzugten Ausführungsform umfaßt die vorliegende Beschreibung ein genetisches Element, umfassend das pps Gen und ein Gen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem aroF Gen, einem aroB Gen und einem tkt Gen. Solch ein genetisches Element kann Plasmid pPS341, einen Vektor der ein pps Gen trägt, umfassen.
Um mehr Kohlenstoff-Fluss in den gemeinsamen aromatischen Syntheseweg zu leiten, hat der Erfinder gefunden, dass die PEP Produktion einer gegebenen Zelllinie erhöht werden muss. Diese Erhöhung kann durch Deaktivieren von Synthesewegen erreicht werden, die um PEP kompetitiv sind, oder durch ein Recycling von Pyruvat zurück in PEP erreicht werden.
Neben der Tatsache, dass es in der Biosynthese von DAHP verwendet wird, wird PEP als ein Phosphatdonor im Phosphotransferase-System (PTS) verwendet, das für die Glukoseaufnahme verantwortlich ist. Zusätzlich kann PEP durch Pyruvatkinasen in Pyruvat überführt werden und Oxalazetat durch Phosphoenolpyruvatcarboxylase. Alle solche kompetitiven Synthesewege begrenzen die Erhältlichkeit von PEP für die Biosynthese von DAHP und allen Metaboliten, die vom gemeinsamen aromatischen Syntheseweg abgeleitet sind oder von Synthesewegen, die davon abzweigen.
Sobald PEP durch entweder PTS oder Pyruvatkinasen in Pyruvat überführt ist, wird Pyruvat im Allgemeinen auf Grund hoher Energiekosten nicht in PEP zurück recycelt. Als ein Ergebnis wird eine große Menge von Kohlenstoff-Fluss von PEP durch Pyruvat geleitet und letztendlich zu organischen Säuren, Kohlenstoffdioxid oder Zellmasse.
PEP ist für die Biosynthese von DAHP und DAHP-Metaboliten kritisch, einschließlich aller Metaboliten aus dem gemeinsamen aromatischen Syntheseweg. Der erste beteiligte Schritt des gemeinsamen aromatischen Synthesewegs schließt die Bildung von DAHP aus der Kondensation von E4P und PEP ein. Diese Kondensation involviert eine Aldol-Kondensation zwischen einem Zwischenprodukt-Karbanion von C-3 von PEP und dem Carbonyl C-1 von E4P. Die Hauptzahl der PEP-Moleküle reagiert stereospezifisch im Hinblick auf die Konfiguration C-3.
Eine Schlüsselkomponente der Verfahren der vorliegenden Erfindung, die auf eine erhöhte Kohlenstoff-Flussbeteiligung für DAHP und DAHP-Metaboliten gerichtet sind, ist das Recycling von Pyruvat zu PEP. Pyruvat ist in Wirtszellen als ein Endprodukt der Glykolyse erhältlich.
In der Glykolyse wird die freie Energie des Abbaus von Glucose zu Pyruvat verwendet, um ATP zu synthetisieren. Allgemein gesprochen, beinhaltet dieser Prozess eine Investition von ATP, um eine Phosporyl-Verbindung (FBP) aus Glukose zu bilden, die dann in zwei C-3-Einheiten gespalten wird. Die freie Energie dieser Reaktion wird in der Oxidation von GAP verwendet, das dann verwendet wird, um ein Acylphosphat zu synthetisieren, ein „Hochenergie" Zwischenprodukt (1,3-BPG). 1,3-BPG wird verwendet, um ADP zu ATP zu phosphorylieren. Die zweite „Hochenergie"-Verbindung des Synthesewegs, PEP, die aus 2PG hergestellt wird, phophoryliert auch ADP zu ATP. Daher produziert der Abbau von Glukose über den glykolytischen Syntheseweg Pyruvat. Die gesamte Reaktion der Glykolyse ist daher: Glukose + 2ADP + 2P + 2NAD+ > 2 Pyruvat + 2 ATP + 2NADH + 4H +2H2O
Der erste Schritt der Glykolyse ist der Transfer einer Phosporylgruppe von ATP auf Glukose, um Glukose-6-Phophat (G6P) zu bilden, in einer Reaktion, die durch Hexokinase katalysiert wird. Hexokinase ist ein relativ unspezifisches Enzym, das in allen Zellen enthalten ist, das die Phosphorylierung von Hexosen katalysiert, wie zum Beispiel D-Glukose, D-Mannose und D-Fruktose. Das zweite Substrat für Hexokinase, wie für andere Kinasen, ist ein Mg²⁺-ATP-Komplex. In der Tat ist nicht komplexiertes ATP ein potenter kompetitiver Inhibitor von Hexokinase.
Hexokinase weist einen Zufalls-Bi-Bi-Mechanismus auf, in dem das Enzym einen ternären Komplex mit Glukose und Mg²⁺-ATP bildet, bevor die Reaktion stattfindet. Durch Komplexierung mit den Phosphat-Sauerstoff-Atomen wird von dem Mg²⁺ angenommen, das es deren negative Ladungen abschottet, was das Phosphor-Atom für den nukleophilen Angriff der C(6)-OH-Gruppe von Glukose besser zugänglich macht.
Als nächstes wird G6P durch Phospho-Glukose-Isomerase (PGI) in Fruktose-6-phosphat (F6P) überführt. Diese Reaktion ist eine Isomerisierung einer Aldose in eine Ketose. Da G6P und F6P beide hauptsächlich in ihren Ringformen existieren, erfordert die Reaktion eine Ringöffnung, gefolgt von Isomerisierung und anschließendem Ringschluss. Von der Gesamtreaktion wird angenommen, dass sie durch Enzym-vermittelte allgemeine Säure-Base-Katalyse stattfindet.
Als nächstes phosphoryliert Phospho-Fruktokinase (PFK) F6P, um Fruktose-1,6-bisphosphat (FBP oder F1,6P) zu ergeben. PFK katalysiert den nukleophilen Angriff durch die C(1)-OH-Gruppe von F6P auf dem elektrophilen γ-Phosphor-Atom des Mg²⁺-ATP-Komplexes.
PFK spielt eine Rolle in der Glykolyse, da es eine der Geschwindigkeits-bestimmenden Reaktionen des Synthesewegs katalysiert. In vielen Organismen wird die Aktivität von PFK allosterisch durch mehrere Substrate verstärkt, einschließlich AMP, und allosterisch durch verschiedene andere Substrate, einschließlich ATP und Citrat inhibiert. Die regulatorischen Eigenschaften von PFK sind insbesondere komplex.
Aldolase katalysiert dann die Spaltung von FBP, um die zwei Triosen Glyceraldehyd-3-phosphat (GAP) und Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) zu bilden. Diese Reaktion ist eine Aldolspaltung (das Gegenteil einer Aldolkodensation). Die Allodolspaltung zwischen C(3) und C(4) von FBP erfordert ein Carbonyl an C(2) und Hydroxyl an C(4).
Nur eines der Produkte der Aldolspaltungsreaktion, GAP, fährt entlang des glykolytischen Synthesewegs fort. Jedoch sind DHAP und GAP Ketose-Aldose-Isomere, genau wie F6P und G6P dies sind. Die Interkonversion von GAP und DHAP ist daher über ein Enediolat-Zwischenprodukt, analog zu der Phospho-Glucomutase-Reaktion möglich. Triosephosphat-Isomerase (TIM) katalysiert diesen Prozess.
An diesem Punkt hat die Glukose, die in zwei GAPs transformiert wurde, die präparatorische Phase der Glykolyse beendet. Dieser Prozess hat die Ausgabe von zwei ATPs erfordert. Jedoch hat diese Investition zur Überführung einer Glukose in zwei C₃-Einheiten geführt, von denen jede eine Phosphorylgruppe aufweist, die mit ein wenig chemischer Kunst in eine „Hochenergie"-Verbindung überführt werden kann, dessen freie Energie der Hydrolyse an die ATP-Synthese gekoppelt werden kann. Diese Energie-Investition wird in der finalen Phase der Glykolyse zweifach zurückgezahlt, worin die zwei phosphorylierten C₃-Einheiten in zwei Pyruvate mit der gekoppelten Synthese von vier ATPs pro Glukose transformiert werden.
Der nächste Schritt in der Glykolyse ist die Oxidation und Phosporylierung von GAP durch NAD+ und P, wie durch Glyceraldehyd-3-phosphat-hydrogenase (GAPDH) katalysiert. In dieser Reaktion treibt die Aldehydoxidation, eine exergonische Reaktion, die Synthese des Acylphosphats 1,3-Diphosphylglycerat (1,3-BPG).
Die nächste Reaktion des glykolytischen Synthesewegs führt zur ersten Bildung von ATP zusammen mit 3-Phosphoglycerat (3PG) in einer Reaktion, die durch Phosphoglyceratkinase (PGK) katalysiert wird:
3P wird dann durch die Phosphoglyceratmutase (PGM) in 2-Phosphoglycerat (2PG) konvertiert. Diese Reaktion ist eine erforderliche Vorbereitung für die nächste Reaktion in der Glykolyse, die eine „Hochenergie" Phosphoryl-Verbindung zur Verwendung in der ATP-Synthese erzeugt.
Anschließend wird 2PG zu Phosphoenolpyruvat (PEP) dehydriert, in einer Reaktion, die durch Enolase katalysiert wird. Das Enzym bildet einen Komplex mit einem divalenten Kation, wie zum Beispiel Mg²⁺, bevor das Substrat gebunden wird. Das Fluoridion inhibiert die Glykolyse mit einer Ansammlung von 2PG und 3PG. Es tut dies durch eine starke Inhibierung von Enolase in der Anwesenheit von P_i. Die inhibitorische Spezies ist Fluorphosphation (FPO₃ ^3-), was möglicherweise das Enzym-gebundene Mg²⁺ komplexiert, wodurch das Enzym inaktiviert wird. Das Substrat der Enolase 2PG häuft sich daher an und wird, während es diese tut, mit 3PG und PGM äquilibriert.
Zuletzt koppelt die Pyruvatkinase (PK) die freie Energie der PEP-Hydrolyse mit der Synthese von ATP, um Pyruvat zu bilden. An diesem Punkt hat die Glykolyse PEP hergestellt, einem der Vorläufer der DAHP-Produktion und dem Eintrittsweg in den gemeinsamen aromatischen Syntheseweg.
Neben PEP hängt die DAHP-Biosynthese, sowie die von anderen Produkten, die aus dem gemeinsamen aromatischen Syntheseweg und Synthesewegen, die davon abzweigen, abgeleitet sind, von der Biosynthese von E4P ab.
In Bezug auf 4 ist E4P ein biosynthetisches Zwischenprodukt des Pentose-Phosphase-Syntheseweg. Der Pentose-Phosphase-Syntheseweg liegt zwischen der Glykolyse und einer Vielzahl von verschiedenen biosynthetischen Kaskaden. Dieser Syntheseweg ergibt E4P über einen nicht-oxidativen Zweigs des Synthesewegs. Der nicht-oxidative Pentose-Phosphat-Syntheseweg überführt D-Fruktose-6-phosphat in variierende Äquivalente von D-Ribose-5-phosphat, D-Sedoheptulose-7-phosphat und E4P. Die ersten zwei Endprodukte sind jeweils mit der Biosynthese von Nukleotiden und Gram-negativen bakteriellen Lipopolysacchariden assoziiert, während E4P ein Vorläufer der aromatischen Aminosäuren ist: Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan.
Der anfängliche Engpass von Zwischenprodukten aus der Glykolyse durch den Pentose-Phosphat-Syntheseweg schließt den Transketolase-Transfer einer Ketol-Gruppe von D-Fruktose-6-phosphat auf D-Glyceraldehyd-3-phosphat ein, um E4P und D-Xylulose-5-phosphat zu bilden. Die Pentose-Phosphat-Epimerase überführt dann das D-Xylulose-5-phosphat in D-Ribulose-5-phosphat, gefolgt durch die Pentose-Phosphat-Isomerase vermittelte Transformation des D-Ribulose-5-phosphats in D-Ribose-5-phosphat.
Zu dieser Phase kann das D-Ribose-5-phosphat durch die Transketolase als ein Akzeptor einer Ketol-Gruppe, die von einem anderen Molekül an D-Fruktose-6-phosphat abgeleitet ist, ausgebeutet werden, wobei ein zweites Molekül von E4P und D-Sedoheptulose-7-phosphat gebildet wird. Zuletzt katalysiert das Enzym Transaldolase den Transfer einer Dihydroxyace ton-Gruppe von dem D-Sedoheptulose-7-phosphat auf D-Glyceraldehyd-3-phosphat, was das dritte Molekül von E4P und D-Fruktose-6-phosphat ergibt. Daher erreicht der nicht-oxidative Pentose-Phosphat-Syntheseweg die Nettoüberführung von zwei Molekülen von D-Fruktose-6-phosphat in drei Moleküle von E4P.
Die Kondensation von PEP und E4P wird durch das Enzym DAHP-Synthase katalysiert. Viele Mikroorganismen einschließlich E. coli, produzieren drei DAHP Synthase-Isoenzyme: Phenylalanin-sensitive DAHP Synthase (phe), Thyrosin-sensitive DAHP Synthase (tyr) und Tryptophan-sensitive DAHP Synthase (trp). Die tetramere DAHP Synthase (phe) weist ein Untereinheiten-Molekulargewicht von 35.000 auf. Die dimere DAHP Synthase (tyr) und DAHP Synthase (trp) weisen Untereinheiten-Molekulargewichte auf, die nahe bei 40.000 liegen. Die nativen Formen der Enzyme sind möglicherweise Protein-PEP Addukte. In E. coli sind die strukturellen Gene für DAHP Synthese (tyr), DAHP Synthase (phe), und DAHP Synthase (trp) jeweils aroF, aroG und aroH. Diese Gene sind jeweils bei 56, 17 und 37 Minuten auf der E. coli „linkage" Karte lokalisiert.
In Wildtyp E. coli wird 80 % der gesamten DAHP Synthaseaktivität durch das Phenylalaninsenitive Isoenzym beigetragen, während 20 % durch das Tyrosin-senitive Isoenzym beigetragen wird. Es gibt nur Spuren der DAHP Synthase (trp) in E. coli.
Nach der Kondensation von PEP und E4P ist die nächste Reaktion des gemeinsamen aromatischen Synthesewegs ein Intramolekularaustausch des DAHP Ringsauerstoffs mit C-7, begleitet von einer Oxidation an C-6 und einer Reduktion an C-2. Die Spaltung des Phospoesters stellt die treibende Kraft zur Verfügung, um 3-Dehydrochinat (DAH) zu bilden. Diese Reaktion wird durch die Hydrochinatsynthase (DAH Synthase) katalysiert.
Reine DAH Synthase ist eine einzelne Polypeptidkette, die ein Molekulargewicht von 40.000 – 44.000 aufweist. Das Enzym erfordert Co und NAD für seine Aktivität, das Letztgenannte in katalytischen Mengen. Die Bildung von 3-Dehydrochinat aus DAHP ist stereospezifisch und schreitet mit einer Inversion an dem C-7 von DAHP ohne Austausch von Wasserstoff mit dem Wachstumsmedium fort.
Chinoid organische Verbindungen werden aus Synthesewegen gebildet, die von dem gemeinsamen aromatischen abzweigen und verwenden DAH. Eine sterospezifische syn- Dehydrierung von 3-Deyhdrochinat führt die erste Doppelbindung des aromatischen Ringsystems ein, um 3-Dehydrochinat zu bilden. Die Reaktion wird durch 3-Dehydrochinat-Dehydratase katalysiert. Die Bildung der Schiff'schen Base zwischen dem Enzym und dem Substrat verursacht eine Konformationsänderung in dem Substrat (verdrehtes Boot), die zum stereospezifischen Verlauf der Reaktion führt.
Die Shikimat-Biosynthese des 3-Dehydroshikimats wird durch Shikimat-Dehydrogenase katalysiert. Diese NADP-spezifische Enzym erleichtert den Wasserstofftransfer von der A-Stelle von NADPH.
Shikimat wird durch Shikimatkinase zu Shikimat-3-phospat phosphoryliert. Shikimatkinase ist ein Polypeptid von 10.000 Dalton, das mit der bifunktionellen DAHP Synthase – Chorismatmutase komplexiert wird. Die Kinase, die nur im Komplex aktiv ist, wurde bis auf Homogenität gereinigt. Da das Enzym durch Chorismat, Prephenat, ADP inhibiert wird, und 5-Enolpyruvoylshikimat-3-phosphat durch das Wachstum auf limitierendem Tyrosin dereprimiert wird, wird von der Shikimatkinase geglaubt, dass sie einen Schlüssel allosterischen Kontrollpunkt des Synthesewegs in einigen Typen von Wirtszellen darstellt.
Shikimat-3-phosphat reagiert mit PEP, um 5-Enolpyuvoylshikimat-3-phosphat und anorganisches Phosphat zu bilden. Die reversible Enzym-katalysierte Reaktion ist ein Transfer einer unveränderten Enolpyruvoylgruppe aus PEP. Die Protonierung von C-3 von PEP, kombiniert mit einem nukleophilen Angriff auf das 5-Hydroxyl von Shikimat führt zu einem vermuteten Zwischenprodukt, von dem 5-Enolpyruvoylshikimat-3-phosphat in einer 1,2-Eliminierung von Orthophosphat erhalten wird. Die Reaktion wird durch 5-Enolpyruvoylshikimat-3-phosphatsynthase katalysiert.
Die zweite Doppelbindung in dem aromatischen Ringsystem wird durch eine Trans-1,4 Eliminierung von Orthophosphat von 5-Enolpyruvoylshikimat-3-phosphat eingeführt, um Chorismat zu ergeben. Die Reaktion wird durch Chorismatsynthase katalysiert.
Aus Chorismat, dem Endpunkt des gemeinsamen aromatischen Synthesewegs, ist die Biosynthese einer diversen Zahl von aromatischen Verbindungen möglich. Z.B., wie in 4 angegeben, können die aromatischen Aminosäuren Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin aus Chorismat entlang ihrer jeweiligen biosynthetischen Synthesewege synthetisiert werden. Wie früher angegeben, schließen andere kommerziell wichtige aromatische Verbindungen, die auch aus Chorismat hergestellt werden, Folate, Aspartam, Melanin, Prephensäure und Indigo ein.
Zusätzlich zu dem gemeinsamen aromatischen Syntheseweg produzieren andere Synthesewege, die DAHP verwenden, andere aromatische Metaboliten. Z.B. können Katechol und Chinoid-organische Verbindungen, wie z.B. Chininsäure, Bezochinon und Hydrochinon aus Synthesewegen produziert werden, die von dem gemeinsamen aromatischen Syntheseweg abzweigen.
Gemäß theoretischen Analysen glaubt der Erfinder, dass die maximale Ausbeute von DAHP und aromatischen Aminosäuren aus Glukose zweifach erhöht werden kann, wenn Pyruvat zu PEP zurück recycelt wird. Die maximale Ausbeute kann durch die Annahme berechnet werden, dass die abzweigenden Synthesewege blockiert sind und dass der Kohlenstoff-Fluss durch die am meisten effizienten Synthesewege gerichtet wird, mit einem minimalen Verlust von Kohlendioxid und anderen Metaboliten. Unter diesen Bedingungen und unter Steady State Bedingungen kann der relative Fluss durch jeden Schritt durch balancieren der Einstrom- und Ausgabeflüsse aus jedem Metabolitenpool berechnet werden.
Wie in 3A gezeigt, sind für eine maximale Ausbeute an DAHP Produktion durch Stämme ohne Pps Überproduktion 7 Mol an Glukose erforderlich, und 3 Mol an DAHP herzustellen (43 % molare Ausbeute) und 7 Mol von Pyruvat, das weiter metabolisiert wird. Der relative Fluss durch jeden Zwischenproduktschritt ist auch in 3A gezeigt. Die Bildung von Pyruvat ist auf Grund der Stöchiometrie des Phosophotranferasesystems für die Glukoseaufnahme erforderlich.
In der Anwesenheit von Glukose wird Pyruvat nicht effizient zu PEP zurück recycelt, da das Enzym Pps nicht induziert wird. Der Erfinder hat gefunden, dass Pyruvat effizient zu PEP über überexprimierte Pps recycelt wird, sogar in Anwesenheit von Glukose, was zu einem zweifachen Anstieg an DAPH führt, der sich den theoretischen Spiegeln für die DAHP Synthese annähert, wenn ihn nicht sogar erreicht.
Wie in 3B gezeigt können am theoretischen Maximum 6 Mol von DAHP aus 7 Mol an Glukose hergestellt werden (86 % molare Ausbeute). Der nichtoxidative Teil des Pentose synthesewegs stellt E4P zur Verfügung, während die Überexpression von Pps Pyruvat zurück zu PEP recycelt.
Die oben beschriebenen Daten und diejenigen wie in 3A und 3B gezeigt, sind in Übereinstimmung mit diesem Flussverteilungsmodel. Kontrollen mit inaktiviertem Pps und mit keinem Pps zeigen, dass eine erhöhte Aktivität durch Überexpression von Pps erforderlich ist, um hohe Ausbeuten von DAHP zu erreichen und, natürlich, DAHP Metaboliten, einschließlich Metaboliten des gemeinsamen aromatischen Synthesewegs.
In vorangegangener Arbeit zeigte der Erfinder, dass die Überexpression von Pps in Wirtszellen, die auf Nährstoff-reichem Glukose-enthaltendem Medium kultiviert wurden, zu einer Wachstumsinhibierung, einem erhöhten Glukoseverbrauch und der Exkretion von Pyruvat und Azetat führte. Ihre vorangegangene Untersuchung zeigte auch, dass die Effekte von Pps Überexpression auf die DAHP Produktion in aktiv wachsenden Kulturen nicht so signifikant sind und dass die nachteiligen Effekte der Pps Überexpression auf das Zellwachstum jeden vorteilhaften Effekt auf die DAHP Produktion beseitigten.
Die Stimulierung von Glukoseverbrauch in der vorangegangen Arbeit wurde dem veränderten PEP/Pyruvatverhältnis zugeordnet. Es wurde angenommen, dass ein erhöhtes PEP/Pyruvatverhältnis das Phosphotransferasesystem zu einem erhöhten Glukoseverbrauch stimulierte, was im Gegenzug zur Exkretion von Pyruvat führte.
Der Erfinder entdeckte, dass das Problem der Wachstumsbeeinträchtigung durch die Verwendung von Hochdichte-Resuspendierungskulturen, angezogen in Nährstoff-armem Glukosemedium, überwunden werden konnte. Solche Resuspendierungskulturen erreichen eine hohe metabolische Aktivität mit niedrigen Wachstumsraten. Diese Entdeckung führte zu DAHP Spiegeln, die sich theoretischen Werten annäherten.
In der vorliegenden Erfindung wurde PEP in den aromatischen Syntheseweg zurück geführt und daher nahm das PEP/Pyruvatverhältnis ab. Die Flusszurückrichtung erklärt die Insensivität der spezifischen Glukoseverbrauchsrate gegenüber Pps Überexpression in dem experimentellen System der vorliegenden Erfindung. Die erhöhte DAHP Produktion aus Glukose, verursacht durch Pps Überexpression, lässt auch vermuten, dass Pps wirklich in seiner physiologi schen Richtung (von Pyruvat zu PEP) in vivo funktioniert, sogar unter glykolytischen Bedingungen.
PEP ist auch ein Vorläufer der Synthesewege, die das Ppc Enzym verwenden, das durch das ppc Gen kodiert wird. Es wurde berichtet, dass die Deletion von ppc die Produktion von Phenylalanin und Azetat erhöhte. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Überexpression von Ppc in einem Wildtypstamm die Azetatproduktion verringert. Beide Ergebnisse können anzeigen, dass der Fluss durch Ppc (von PEP zu OAA) unter diesen Bedingungen annehmbar signifikant ist und daher die Modulation der Ppc Expressionsspiegel die Verwendung von PEP beinträchtigen kann. Jedoch hatte in der vorliegenden Erfindung die Deletion des chromosomalen ppc Gens keinen positiven Effekt auf die DAHP Produktion, was vermuten ließ, dass der Fluss durch Ppc in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht wichtig ist.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt die Modifizierung einer Wirtszelle, um eine Überexpression eines Enzyms zu verursachen, das die katalytischen Eigenschaften von natürlich abgeleitetem Pps aufweist und dadurch Maximieren der Ausbeute von DAHP auf nahezu theoretische Ausbeuten. Enzyme, die die katalytische Aktivität von Pps aufweisen, schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf, Pps, hergestellt durch Expression eines natürlich abgeleiteten Pps-Gens in Gesamtzellen, Enzyme, hergestellt durch Expression in Gesamtzellen eines natürlich abgeleiteten Pps-Gens, modifiziert durch Sequenzdeletion oder -addition, so dass das exprimierte Enzym einer Aminosäuresequenz aufweist, die von nicht-modifiziertem Pps abweicht, Abzyme, so hergestellt, um katalytische Stellen mit sterischen und elektronischen Eigenschaften aufzuweisen, die den katalytischen Stellen von Pps entsprechen, oder andere Proteine, hergestellt, um die Fähigkeit aufzuweisen, die Konversion von Pyruvat zu PEP durch irgendein im Stand der Technik anerkanntes anderes Mittel zu katalysieren.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform hat der Erfinder beobachtet, dass der Pps-Effekt auf die DAHP-Produktion durch die gleichzeitige Überexpression von Tkt verstärkt wird. Solche gleichzeitige Überexpression stellt sicher, dass beide für die DAHP-Biosynthese erforderlichen Vorläufer überproduziert werden. Obwohl die gleichzeitige Überexpression von Pps und Tkt erforderlich sein kann, um nahezu theoretische Ausbeuten von DAHP zu erreichen, verstärkt die Überexpression von Pps allein in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung signifikant die DAHP-Produktion über die Tkt Überexpression allein (2A)
Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass ohne ein durch Pps vermitteltes Pyruvatrecycling (3A) ein ausreichender PEP-Fluss zu der DAHP-Synthese nicht erreicht werden kann.
Zusätzlich kann die Transformation von DNA, einschließlich des Pps-Gens, in Mikroorganismen, die für die Überexpression von anderen Substraten verändert sind, und/oder eine Überexpression oder Derepression von Enzymen im Pentosephosphat- oder gemeinsamen aromatischen Syntheseweg verwendet werden, um dem Mikroorganismus so anzupassen, um nahezu theoretische Ausbeuten von solchen DAHP-Metaboliten, wie Tyrosin, Tryptophan, Phenylalanin und andere aromatische Metaboliten, wie z.B. Indigo, Catechol und Chinoid organische Verbindungen, wie z.B. Chininsäure, Benzochinon und Hydrochinon zu erreichen.
Enzyme, die Reaktionen in dem Pentosephosphat- oder gemeinsamen aromatischen Syntheseweg katalysieren schließen diejenigen Enzyme ein, die durch Expression in Gesamtzellen von natürlich abgeleiteten Pentosephosphat- oder gemeinsamen aromatischen Syntheseweg-Genen hergestellt werden, Enzyme, die durch Expression von natürlichen abgeleiteten Pentosephosphat- oder gemeinsam aromatischen Syntheseweg-Genen hergestellt werden, die durch Sequenzdeletion oder -addition modifiziert wurden, so dass das exprimierte Enzym eine Aminosäuresequenz aufweist, die sich von dem natürlichen Enzym unterscheidet, oder Abzyme, die katalytische Stellen mit sterischen und elektronischen Eigenschaften aufweisen, die katalytischen Stellen auf einem natürlichen Enzym in dem gemeinsamen aromatischen oder Pentosephosphatsyntheseweg entsprechen.
Pps oder Enzyme, die eine Pps-ähnliche katalytische Aktivität aufweisen, können relativ zur Pps-Produktion in Wildtypzellen überexprimiert sein (wie durch Standard-PEP-Synthaseaktivitätstest, die im Stand der Technik bekannt sind und wie beschrieben in Beispiel 1 gemessen) in Verbindung mit irgendeiner Zahl von anderen Enzymen im gemeinsamen aromatischen Syntheseweg oder Synthesewegen, die davon abzweigen. Zum Beispiel kann die Überexpression von Pps, DAHP-Synthase und Transketolase; Pps, DHQ-Synthase und Transketolase; Pps, DAHP-Synthase, DHQ-Synthase und Transketolase; Pps, Transketolase und Shikimatkinase; Pps, Transketolase (Tkt) und Chorismatmutase oder irgendeinem anderen Enzym des gemeinsamen aromatischen Synthesewegs in Verbindung mit Pps-Überproduktion den Kohlenstoffquellen einen Fluss in und/oder durch den gemeinsamen aromatischen Syntheseweg verstärken.
Die verstärkte Expression von Genen, die für Proteine kodieren, die enzymatische Funktionen des Pentosephosphat- oder gemeinsamen aromatischen Synthesewegs durchführen oder kontrollieren, wird durch genetische Elemente vermittelt, die in eine Wirtszelle transferierbar sind. Genetische Elemente wie hier definiert schließen Nukleinsäuren (im allgemeinen DNA oder RNA) ein, die exprimierbare kodierende Sequenzen für Produkte wie z.B. Proteine, aufweisen, Apoproteine oder Antisens-RNA, die enzymatische Funktionen dem Pentosephosphat- oder gemeinsamen aromatischen Synthesewegs durchführen oder kontrollieren können. Die exprimierten Proteine können als Enzyme als Repressor oder dereprimierende Mittel fungieren oder um die Enzymexpression zu kontrollieren.
Die Nukleinsäure, die für die exprimierbaren Sequenzen codieren, können entweder chromosomal (z.B. in ein Wirtszellchromosom durch homologe Rekombination integriert) oder extrachromosomal (z.B. homologe Rekombination integriert) oder extrachromosomal (z.B. durch Plasmide, Cosmide usw. getragen) vorliegen. Zusätzlich werden genetische Elemente als optionale Expressionskontrollsequenzen einschließend definiert, einschließlich Promotoren, Repressoren und Enhancer, die wirken, um die Expression oder Derepression von kodierenden Sequenzen für Proteine, Apoproteine oder Antisens-RNA zu kontrollieren. Zum Beispiel können solche Kontrollsequenzen in Wildtypwirtszellen eingeführt werden, um eine Überexpression von ausgewählten Enzymen zu unterstützen, die bereits im Wirtszellgenom kodiert werden oder alternativ können sie dazu verwendet werden, um die Synthese von extrachromosomal ckodierten Enzymen zu kontrollieren.
Die genetischen Elemente der vorliegenden Erfindung können in eine Wirtszelle durch ein genetisches Mittel eingeführt werden, das einschließt, jedoch nicht begrenzt ist auf Plasmide, Cosmide, Phagen, Hefe künstliche Chromosomen oder andere Vektoren, die einen Transfer der genetischen Elemente in eine Wirtszelle vermitteln, oder Gemische davon. Diese Vektoren können eine Replikationsursprung zusammen mit cis-wirkenden Kontrollelementen einschließen, die die Replikation des Vektors und der genetischen Elemente, die durch den Vektor getragen werden, kontrollieren. Ausgewählte Marker können auf dem Vektor vorhanden sein, um bei der Identifizierung von Wirtszellen zu helfen, in die die genetischen Elemente eingeführt wurden. Zum Beispiel können selektierbare Marker Gene sein, die Resistenz gegenüber bestimmten Antibiotika, wie z.B. Tetracyclin, Ampicillin, Chloramphenicol, Kanamycin oder Neomycin übertragen.
Ein bevorzugtes Mittel zum Einführen von genetischen Elementen in eine Wirtszelle verwendet einen extrachromosomalen Multi-Kopienplasmidvektor, in dem genetische Elemente in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung eingeführt wurden. Die Plasmidvermittelte Einführung des genetischen Elements in Wirtszellen schließt eine anfängliche Spaltung eines Plasmids mit einem Restriktionsenzym ein, gefolgt von Ligation des Plasmids und den genetischen Elementen in Übereinstimmung mit der Erfindung. Nach Rezirkularisierung des ligierten rekombinanten Plasmids, wird Transformation oder andere Mechanismen für Plasmidtransfer (z.B. Elektroporation, Mikroinjektion, usw.) verwendet, um das Plasmid in die Wirtszelle zu transferieren.
Plasmide, die für die Einführung von genetischen Elementen in die Wirtszelle geeignet sind schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, pBR322 und seine Derivate, wie z.B. pAT153, pXf3, pBR325 und PBRR327, pUC-Vektoren, pACYC und seine Derivate, pSC101 und seine Derivate, und ColE1. U.S. Patent Nr. 5,168,056, hier durch Bezugnahme aufgenommen, lehrt die Inkorporation des Tkt-Gens, das für das Enzym Tkt codiert, in eine Wirtszelle. Tkt katalysiert die Überführung der Kohlenstoffquelle D-Fructose-6-phosphat zu E4P, einem DAHP-Vorläufer.
Geeignete Wirtszellen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind Mitglieder der Stämme, die in der Lage sind, für die industrielle biosynthetische Herstellung von gewünschten aromatischen Verbindungen verwendet zu werden. Demzufolge können Wirtszellen Prokaryonten einschließen, die zu den Genera Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter, Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Staphylococcus oder Serratia gehören. Eukaryontische Wirtszellen können auch verwendet werden, wobei Hefen des Genus Saccharomyces oder Schizosaccharomyces bevorzugt sind.
Genauer gesagt schließen prokaryontische Wirtszellen, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium herculis, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Baccillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus mesentericus, Bacillus pumilis, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas angulata, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas tabacii, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, Streptomyces kasugensis, Strep tomyces lavendulae, Streptomyces lipmanii, Streptomyces lividans, Staphylococcus epidermitis, Staphylococcus saprophyticus oder Serratia marcescens und deren genetisch veränderte Stämme oder Gemische davon. Bevorzugte eukaryotische Wirtszellen schließen Saccharomyces cerevisiae oder Sccharomyces cardsbergensis und deren genetisch veränderte Stämme oder Gemische davon ein.
Für die industrielle Herstellung von Primärmetaboliten, die von Chorismat abgeleitet sind (wie z.B. aromatische Aminosäuren), sind deregulierte Mutantenstämme der oben angegebenen Spezies, denen die feed-back Inhibierung von einem oder mehreren Enzymen in dem metabolischen biosynthetischen Syntheseweg fehlen, bevorzugt. Solche Stämme können durch zufällige oder gerichtete Mutagenese erzeugt werden oder sind käuflich erhältlich. Beispiele von E. coli-Stämmen, die eine DAHP-Synthase, Prephenatdehydratase oder Chorismatmutase entfernte feed-back Inhibierung aufweisen, sind in U.S. Patent Nr. 4,681,852 von Tribe und U.S. Patent Nr. 4,753,883 von Backmann et al., die hier durch Bezugnahme aufgenommen sind, beschrieben.
Um die stöchiometrischen Begrenzungen in der Kondensation von E4P und PEP zu überwinden, überexprimiert die vorliegende Erfindung Pps in der Anwesenheit von Glukose und richtet mehr Kohlenstoff-Fluss in die Produktion von DAHP.

Die folgende Liste von Abkürzungen für Verbindungen, die häufig in der Beschreibung und den Beispielen angegeben sind, wird wie folgt präsentiert:

DHQ	3-Dehydrochinat
DAH	3-Desoxy-D-arabino-heptulosoninsäure
DAHP	3-Desoxy-D-arabino-heptulosoninsäure-7-phosphat
TSP	3-(Trimethylsilyl)propion-2,2,3,3-d-sub-4-säure, Natriumsalz
PEP	Phosphoenolpyruvat
NADH	Beta-Nikotinamidadenindinucleotidphosphat, reduzierte Form
Kan	Kanamycin
Ap	Ampicillin
Tc	Tetracyclin
Cm	Chloramphenicol

Stämme und Ptasmide
Escherichia coli AB2847 aroB mal T6', erhalten von E. coli Genetic Stock Center, Yale University, wurde als der bevorzugte Wirtsstamm für die DAHP Produktion verwendet. BJ502 tkt-2 fhuA22 garB10 ompF627 fadL701 relA1 pit-10 spoT1 mcrB1 phoM510, auch aus dem E. coli Genetic Stock Center, wurde bei der Identifizierung des tkt Klons verwendet. JCL1242 ppc::Km wurde wie früher beschrieben konstruiert, durch Einführen einer Kanamycin-Kassette in ein kloniertes ppc-Gen, welches dann durch homologe Rekombination in das Chromosom integriert wurde.
Plasmid pPS341 (erhältlich vom Department of Chemical Engineering, Texas A & M University, College Station, Texas, USA) wurde durch klonieren eines Fragments von E. coli chromosomaler DNA, das das pps Gen enthielt, in einen IPTG-induzierbaren Expressionsvektor pUHE23-2 (ein pBR322 Derivativ), wie durch Patnaik et al. gelehrt, dessen Inhalt hier durch Bezugnahme aufgenommen sind, konstruiert. Ein Plasmid pPS341X1, das das inaktivierte Genprodukt von pps erhielt, wurde durch Codon-Insertionsmutagenese konstruiert, deren Details vollständig in Patnaik et al. beschrieben sind. Das pps-Gen auf pPS341 wurde mit einem Mu dII17341ac⁺ Km^r (MudK) gemäß dem von Castiho et al. publizierten Protokoll intertiert, dessen Inhalte hier durch Bezugnahme aufgenommen sind. Kurz wurde ein Mu-Lysat von einem Donorstamm POII1734/pPS341 hergestellt, der durch das Mini-Mu-Element und ein Mu cts lysogeniert wurde. Das Lysat wurde verwendet, um ein Mu-Lysogen von HG4 pps pck zu infizieren, und Kolonien wurden auf Ap^r und Km^r gleichzeitig selektiert, um sicherzustellen, dass das Mini-Mu-Element auf das Plasmid sprang. Kolonien wurden weiterhin auf Pps – Phänotyp (Unfähigkeit auf Pyruvat zu wachsen) gescreent. Die Restriktionsanalyse der Plasmid-DNA bestätigte weiter die Insertion des MudK-Elements in das pps-Gen auf Plasmid pPS341. 20 % dieser selektierten Kolonien zeigten IPTG-abhängige Expression von β-Galactosidase, was eine In-Leserasterinsertion anzeigte. Plasmid aus einer solchen Kolonie wurde pPS1734 benannt, das dann an der ScaI-Stelle linearisiert wurde und dann in Stamm JC7623 recB21 recC22 sbcB15 transformiert wurde. Transformanten wurden auf Km^r selektiert und auf die Ap-Sensitivität hin bewertet. Solche Kolonien erhielten vermuteterweise pps::MudK auf dem Chromosom. Durch Verwendung von P1-Transduktion wurde dieser Lokus zu AB2847 übertragen und Km'-Transduktanten wurden weiter auf ihre Unfähigkeit hin gescreent, auf Pyruvat zu wachsen. Eine solche Kolonie wurde JCL1362 bezeichnet und für weitere Untersuchungen verwendet. Die MudK-Insertion in chromosomales pps wurde weiterhin durch Kotransduktionsfrequenz (89 %) mit Tet^r-Marker aus Stamm CAG12151 zdh-925::Tn10 bestätigt.
Plasmid pRW5, Genencor International, South San Francisco, CA, ist ein pACYC-Derivat und enthält aroG^fbr. Dieses Plasmid enthält auch ein lacI-Gen und das aroG^fbr wird von einem lac-Promotor exprimiert. Um Plasmid pAT1 zu konstruieren, das sowohl aroG^fbr und tktA enthielt, wurde ein 5-Kb BamH1-Fragment von E. coli-DNA aus Seite 473 des Kohara Miniset (National Institute of Genetics, Japan) ausgeschnitten und in die BamH1-Stelle von pRW5 insertiert. Dieses Fragment wurde als das tktA-Gen enthaltend berichtet und wurde durch seine Fähigkeit, einen tkt-Stamm (BJ502) auf Wachstum auf Ribose zu komplementieren und auch aus der Migrationsentfernung des Genprodukts bestätigt, wie auf einem 12 % SDS-PAGE beurteilt (Molekulargewicht, ca. 72.500).
Konstruktion von pPS706 und der Kontrolle
Das Plasmid pPS706 wurde durch Einführen eines 2,4 kb PCR-Fragments, das das Promotorlose pps-Gen enthielt, in den Vektor pJF118EH konstruiert. Die Primer wurden aus der veröffentlichten pps-Sequenz aufgebaut und enthielten eine EcoRI-Stelle und eine ϕ10 Ribosomenbindungsstelle stromaufwärts von der pps-Sequenz und eine BamH1-Stelle stromabwärts der Sequenz. Das PCR-Produkt wurde dann in die EcoR1- und BamHI-Stellen von pJF118EH kloniert. Positive Klone wurden basierend auf Komplementation von HG4 pps für Wachstum auf Pyruvat selektiert. Die Expression von pps aus diesem Konstrukt wird durch den lac-Promotor kontrolliert, der durch IPTG induzierbar ist.
Das Plasmid pPSL706 wurde dann von pPS706 konstruiert, wie in 5 gezeigt. Kurz, wurde ein ScaI/EcoRI-Fragment, das das pps-Gen enthielt, aus pPS706 ausgeschnitten und von dem Restriktionspuffer gereinigt. Dieses Fragment wurde dann in ein gereinigtes ScaI-ECORI-Fragment kloniert, das den luxI'-Promotor von pGS103 enthielt, der freundlicherweise dem Erfinder von Tom Baldwin gegeben wurde, Department of Biochemistry and Biophysics, Texas A&M University. Die Expression unter Verwendung dieses Systems wird durch den Autoinduzierer (AI) in dem Kulturmedium kontrolliert. pPSL706 ist Ampicillin-resistent und kompatibel mit anderen pACYCl84-Derivaten, wie z.B. pRW5 und pATI. Die Stämme und Plasmide wie verwendet sind in Tabelle I und Tabelle II zusammengefasst. TABELLE I Bakterielle Stämme
TABELLE II Plasmide
Medien und Wachstumsbedingungen
Alle Klonierungsverfahren wurden in Luria-Bertani-Medien durchgeführt. YE-Medium enthielt K₂HPO₄ (14 g/l), KH₂PO₄ (16 g/l), (NH₄)₂SO₄ (5 g/l), MgSO₄(1 g/l), Hefeextrakt (15 g/l) und D-Glukose (15 g/l). Für die Hoch-Zelldichteresuspensionskultur verwendetes Minimalmedium enthielt pro Liter, K₂HPO₄ (14 g), KH₂PO₄ (16 g), (NH₄)₂SO₄ (5 g) MgSO₄ (1 g), D-Glukose (15 g) und wurde auch mit Thiamin (1 mg), Shikiminsäure (50 mg), L-Tyrosin (8 mg), L-Phenylalanin (8 mg) und L-Tryptophan (4 mg) ergänzt. Das Minimalmedium wurde mit Succinat (0,1 g/l) ergänzt, wenn die ppc-Mutante und seine Kontrolle angezogen wurden. Für ein stabiles Beibehalten von Plasmiden wurden Ampicillin (100 mg/ml), Chloramphenicol (50 mg/ml) zu dem Kulturmedium hinzugefügt. Die Konzentration der Antibiotika wurde um die Hälfte verringert, wenn Minimalmedium verwendet wurde.
Übernachtkulturen in YE-Medium wurden bei 37°C in einer Rolltrommel angezogen und dann in demselben Medium mit geeigneter Durchführbarkeit subkultiviert. Die Kulturen wurden in 250 ml Schüttelflaschen bei 37°C angezogen, in einem gyratorischen Wasserbad, das bei 200 U/min geschüttelt wurde. Nach vier Stunden Inkubation (OD₅₅₀:2-3) wurden die Kulturen mit Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid, IPTG (1 mM) induziert. Die Zellen wurden aus der späten stationären Phase durch Zentrifugation bei 6000 × G geerntet und wurden zweimal mit Minimalmedium gewaschen, vor der Resuspendierung in demselben Minimalmedium, ergänzt mit geeigneter Ergänzung und IPTG (1 nM). Die anfänglichen OD₅₅₀ aller Hoch-Dichteresuspendierungskulturen war ungefähr 4,0. Die optische Dichte kann größer als 4,0 sein. Anders gesagt, das Medium kann mindestens 5 × 10⁹ Zellen/mL enthalten. Proben aus den Resuspendierungskulturen wurden regelmäßig zum Testen von DAH(P) und Glukosekonzentration in dem Medium abgenommen.
Bestimmung von Glukose und DAHP
Die Zellen wurden aus den Proben durch Zentrifugation entfernt und die Überstände wurden bei 4°C gelagert, bis alle Proben gesammelt wurden. Restliche Glukose in dem Mediumüberstand wurde durch den Dinitrosalicylsäuretest auf gesamt reduzierende Zucker bestimmt. Für zusätzliche Information über diesen Test, siehe Miller (Miller, G. L. 1958. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars. Anal. Chem. 31:426-426) und Patnaik et al. (Patnaik, R., W. D. Roof, R.F. Young, and J.C. Liao. 1992. Stimulation of glucose catabolism in Escherichia coli by a potential futile cycle. J. Bacteriol. 174;7527-7532), deren Inhalte hier durch Bezugnahme aufgenommen sind. Die Konzentration von DAH(P) im Überstand wurde durch den Thiobarbiturattest bestimmt. Für zusätzliche Information über diesen Test, siehe Draths et al. und Gollub et al. (Gollub, E., H. Zalkin, und D. B. Sprinson. 1971. Assay for 3-Deoxy D-arabino-heptulosonic Acid 7-phosphate Synthase. Methods in Enzymology 17A:349-350), deren Inhalte hier durch Bezugnahme aufgenommen sind. Dieser Test unterscheidet nicht zwischen DAH und DAHP.
Enzymtests
Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 6000 × g geerntet und wurden in Kaliumphosphatpuffer (50 mM) pH 7 oder 5 mM Tris-Cl-1 mM MgCl₂ (pH 7,4) für jeweils den DAHP-Synthase oder PEP-Synthase (Pps) Test resuspendiert. Die Zellextrakte wurden durch Aufbrechen der Zellen durch eine French Druckkammer (SLM Aminco, Urbana, III.) bei 160.000 Ib/in² präpariert. Die DAHP-Synthaseaktivität wurde durch das Verfahren von Schoner getestet, wie weiter beschrieben in Schoner et al. (Schoner, R. und K. M. Herrmann. 1976. 3-Deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphat Synthase. J. Biol. Chem. 251:5440-5447), dessen Inhalte hier durch Bezugnahme aufgenommen sind. Die Pps-Aktivität wurde wie früher beschrieben getestet. Gesamtprotein in den Extrakten wurde mit dem Bio-Rad-Farbreagenz (Bradford-Test) mit Rinderserumalbumin als dem Standard bestimmt.
Effekte von Pps auf DAHP-Produktion aus Glukose
Der Zweck der Konstruktion von pPS706 war es, Pps mit einem induzierbaren Promotor zu exprimieren, der nicht durch IPTG beeinträchtigt wurde. Dieses Plasmid, zusammen mit pRW5, stellte ein Mittel zur Verfügung, um die Aktivitäten der Enzyme Pps und AroG unabhängig unter der Kontrolle von zwei verschiedenen Promotoren zu variieren. Das dritte Enzym, TktA, war unter der Kontrolle seines natürlichen Promotor und daher nur in einem An/Aus-Modus (Anwesenheit oder Abwesenheit des Gens) variabel. Dieses System ermöglichte dann die Untersuchung des Pps-Effekts über einen breiteren Bereich an Bedingungen. Darüber hinaus ist es möglich, dass dieses System einen optimalen Punkt zeigen würde, wo die Enzymaktivitäten hoch genug wären, um eine maximale Produktion von DAHP zur Verfügung zu stellen, jedoch nicht zu hoch, um eine Proteinbeladung des Systems zu bewirken, die eine abnehmende DAHP-Produktion als Ergebnis hätte. Die Erfinder maßen daher die DAHP-Produktion durch AB2847/pRW5/pPS706 und AB2847/pATUpPS706 in einem Glukosemedium bei variierenden IPTG und Autoinduzierer (N-(3-xox-Hexanoyl)-homoserinlakton) Konzentrationen.
6 zeigt den Effekt von Pps bei verschiedenen AI- und IPTG-Konzentrationen in Glukosemedium. Bei geringen IPTG-Konzentrationen (geringe AroG-Aktivitäten) hat Pps keinen oder wenig Effekt. Wenn die IPTG-Konzentration 50 mM überstieg, fing ein Pps-Effekt an, sich zu zeigen. Plasmid pGS104, isogen mit pPS706 mit Ausnahme des pps-Lokus, wurde als eine Kontrolle verwendet und es zeigte keinen Effekt mit oder ohne der Hinzufügung von AI. Der Pps-Effekt war in dem Stamm, der TktA überexprimierte signifikanter und war nicht auf einer Variation in den AroG- und TktA-Aktivitäten begründet, da die AroG und TktA-Aktivitäten als mit oder ohne Pps-Überexpression konstant gezeigt wurden. Aus der Messung von restlicher Glukose (Daten nicht gezeigt), erreichten die Ausbeuten von DAHP aus Glukose 100 %, was nach Einstellung auf die Überbestimmung von DAHP 70–80 % entspricht. Der letztgenannte Wert stimmt mit dem überein, der durch die stöchiometrische Analyse vorhergesagt wurde, was eine maximale theoretische Ausbeute von 86 % aus Glukose anzeigte, wenn Pyruvat durch Pps zu PEP recycelt wird. Obwohl Zunahmen in den DAHP-Spiegeln und den Ausbeuten mit Pps-Aktivität beobachtet wurden, wurde ein Abfall mit einer höheren Pps-Aktivität, die einen Peak zur Verfügung gestellt hätte, nicht beobachtet. Statt dessen scheinen die Spiegel an DAHP eine Sättigung zu erreichen, mit weiterer Induktion von Pps.
Bildung von Nebenprodukten
Um Einsicht in die metabolische Flussverteilung zu erhalten, wurde das Kulturmedium durch die Verwendung von HPLC auf Fermentationsnebenprodukte hin analysiert. Proben wurden von Kulturen in Glukosemedien mit verschiedenen Aktivitäten von Pps, AroG und TktA genommen. Die Ergebnisse zeigen, dass der Wirtsstamm AB2847 Acetat, Succinat und Format als die hauptsächlichen Nebenprodukte produzierte, wenn weder AroG noch Pps überexprimiert wurde. Die Produktion dieser Säuren nahm im allgemeinen mit dem Ansteigen an IPTG-Konzentration ab, mit der Ausnahme von Format. Diese Abnahme korreliert mit dem Anstieg in der DAHP-Produktion. Wenn AB2847/pAG1/pPS706 in Glukose mit IPTG-Konzentration von oberhalb von 50 mM kultiviert wurde, wies das Medium nicht nachweisbare Spiegel dieser Säuren auf (Daten nicht gezeigt). Während die Spiegel von Ameisen- und Essigsäure mit dem Ansteigen der Pps-Aktivität abnahmen, blieb Succininsäure entweder konstant (0 μM IPTG) oder nahm zu (10,50 μm IPTG) mit einem Anstieg an Pps-Aktivität. Dieser Anstieg könnte einem Pps-induzierten Anstieg im PEP-Spiegel zugeordnet werden, der durch PEP-Carboxylase und eventuell durch Succinat überschießt.
BEISPIEL 1
Herstellung von DAHP
Dieses Beispiel zeigt, dass E. coli AB2847 nicht in der Lage ist, DAHP zu verwenden und DAHP im Medium ansammelt, wenn die DAHP-Synthase überexprimiert wird. Dieser Stamm wurde als ein Wirt zum Nachweis des Flusses verwendet, der den aromatischen Synthesewegen zugeordnet ist. Weil Draths et al. (Draths, K. M., D. L. Pompliano, D. L. Conley, J. W. Frost, A. Berry, G. L. Disbrow, R. J. Staversky, und J. C. Lievense, "Biocatalytic synthesis of aromatics from D-glucose: The role of transketolase," J. Am. Chem. Soc., 1992 114, 3956-3962) eine mögliche Begrenzung bei der Herstellung von DAHP durch E4P gezeigt haben, wurde pAT1 (enthaltend sowohl aroG^frb und tktA) in AB2847 transformiert, um die Begrenzung durch E4P zu beseitigen. Um zu testen, ob die PEP-Zufuhr die DAHP-Produktion begrenzt, wurde die PEP-Synthase (Pps) in AB2847/pAT1 überexprimiert, durch Transformieren von Plasmid pPS341 in diesen Stamm. 20–70 Kopien des pps-Gens wurden in den Wirtszellen exprimiert. Als eine Kontrolle wurde pPS341 durch pPS341X1 substituiert, das für ein inaktives jedoch stabiles pps-Genprodukt codiert. Die Verwendung der inaktiven Pps-Kontrolle ermöglicht eine Unterscheidung zwischen dem Effekt der Pps-Aktivität und dem an Proteinüberexpression. AB2847/pAT1/pUHE23-2 und AB2847/pAT1 wurden auch ohne irgendwelche anderen Plasmide als zusätzliche Kontrollen verwendet, um den Effekt der Klonierungsvektor, pUHE23-2 auf die DAHP-Produktion zu identifizieren.
Wie oben beschrieben, wurden die Stämme in einem reichen Medium (YE) mit IPTG angezogen und in einem Minimalmedium resuspendiert. Da die Überexpression von Pps unter glykolytischen Bedingungen eine Wachstumsinhibierung verursachen kann, wurden Resuspendierungskulturen verwendet, um den Effekt des Zellwachstums auf die biokatalytische Konversion zu minimieren. Nach Resuspendierung wurden das exkretierte DAHP und Restglukose regelmäßig gemessen. Bei 27 Stunden nach Resuspendierung wurden Proben für Pps und AroG-Tests genommen. 1A zeigt, dass der Stamm, der aktives Pps überexprimiert, die DAHP-Produktion um fast Zweifach erhöht. Die Stämme, die pPS341X1 oder pUHE23-2 enthielten, produzierten dieselbe Menge von DAHP wie derjenige, der nur pAT1 enthält. 1B zeigt, dass, wie erwartet, die Pps-Aktivität in dem Stamm zehnfach überexprimiert war, der pPS341 enthielt, während die aroG-Aktivität in allen Stämmen fast konstant blieb. Diese Daten lassen stark vermuten, dass die Aktivität von Pps für den Anstieg in der DAHP-Produktion verantwortlich ist, wohingegen das inaktive Pps oder der Klonierungsvektor keinen beobachtbaren Effekt auf die DAHP-Produktion aufweist.
Die spezifischen Glukoseverbrauchsraten der Stämme wurden nicht durch die Anwesenheit von aktivem oder inaktivem Pps oder den Klonierungsvektor (Daten nicht gezeigt) beeinflusst. Daher zeigte der Stamm, der Pps überexprimierte, einen fast zweifachen Anstieg an Gesamt-DAHP-Ausbeute (ca. 90 % molar), verglichen zu den Kontrollen (ca. 52 % molar), was vermuten lässt, dass Pps sowohl die Produktivität und die Ausbeute von DAHP-Produktion verbessert. Die maximale theoretische Ausbeute von Glukose zu DAHP ist 86 %, was leicht geringer ist als die gemessene Ausbeute aus dem Stamm, der Pps überexprimiert. Da sowohl Glukose und DAHP-Messungen sinnvoll reproduzierbar waren, kann die Diskrepanz der Ungenauigkeit des Extinktionskoeffizienten zugeordnet werden, der verwendet wurde, um die DAHP-Konzentration zu berechnen. Jedoch wurde der Extinktionskoeffizient durch biosynthetisierte DAHP aus Zellextrakt und bekannten Mengen von E4P und PEP kalibriert. Die Ergebnisse zeigen, dass der Extinktionskoeffizient zu ungefähr 30 % genau ist. Daher liegt die Ausbeute von DAHP sinnvoll nahe an dem theoretischen Maximum, obwohl sie geringer als der theoretische Wert sein kann und möglicherweise ist.
Um zu bestimmen, ob der Pps-Effekt auch eine überexprimierte Transketolase (Tkt) erfordert, wurde Plasmid pRW5, das nur aroG^frb enthält, anstelle von pAT1 in den obigen Experimenten verwendet. Es wurde gefunden, dass die Überexpression von Pps die DAHP-Produktion nicht erhöhte (2A), ohne die erhöhte Tkt-Aktivität. Daher, soweit die Begrenzung von kleinen Molekülen in der Biosynthese von DAHP betroffen ist, entsteht die erste Begrenzung aus der Zufuhr an E4P. Dieser Engpass verschiebt sich zur Zufuhr von PEP, wenn Tkt überexprimiert wird, von dem geglaubt wird, dass es die Zufuhr von E4P erhöht.
BEISPIEL 2
Wie oben gezeigt, verbesserte die Pps-Überexpression die DAHP-Produktion aus Glukose. Wir waren daran interessiert, zu erfahren, ob die Basalspiegel der Pps-Expression in Glukosemedium zur Produktion von DAHP beitrugen. Daher wurde das chromosomale pps-Gen in Stamm AB2847 ausgeschaltet. Der sich ergebende Stamm (JCL1362) wurde als ein Wirt verwendet, um die oben genannten Experimente zu wiederholen. Die Ergebnisse zeigen, daß die Inaktivierung von chromosomalem pps nicht signifikant die DAHP-Produktion in Stämmen beeinträchtigte, die pRW5 oder pAT1 enthalten (2B). Daher trugen die Basalspiegel von pps-Expression in Glukosemedium nicht zur DAHP-Produktion bei.
Da PEP auch durch Ppc in OAA überführt wird, kann die Deletion dieses Enzyms die Zufuhr von PEP erhöhen. Daher wurde das ppc-Gen auf dem Chromosomen von AB2847 inaktiviert, um zu bestimmen, ob die DAHP-Produktion ohne Pps-Überexpression erhöht werden könnte. Dieses wurde durch transduzieren von AB2847 mit einem P1-Lysat, angezogen auf JCL1242 ppc::Km durchgeführt. Die sich ergebende Transduktante, JCL1283 aroB ppc::Km wurde dann mit pAT1 oder pRW5 transformiert und auf die DAHP-Produktion in der Resuspensionskultur, wie oben beschrieben, getestet. Um die Begrenzung von OAA in dem ppc-Stamm zu vermeiden, wurde das Kulturmedium mit Succinat ergänzt, von dem gezeigt wurde, dass es keinen Effekt auf die DAHP-Produktion hat (Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz zu der Erwartung, erhöhte die ppc-Mutation nicht die Produktion von DAHP (2B), was vermuten ließ, dass der metabolische Fluss von PEP zu OAA unter den hier getesteten experimentellen Bedingungen nicht signifikant war. In der Tat ließ die ppc-Mutation aus unbekannten Gründen die DAHP-Produktion abnehmen.
BEISPIEL 3
Herstellung von Tryptophan
Existierende Technologien zur Herstellung von Tryptophan verwenden entweder natürlich auftretende Mikroorganismen, mutierte Mikroorganismen oder genetisch veränderte Mikroorganismen. Diese Mikroorganismen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Escherichia coli, Brevibacteria, Corynebacteria und Hefe. Die veränderten Synthesewege können einschließen: (1) Deletion von Synthesewegen, die zu Phenylalanin und Tyrosin abzweigen; (2) Deletion von Pyruvatkinase (pyk); (3) Deletion von PEP-Carboxylase (ppc); (4) Deletion von Phosphoglukoseisomerase (pgi); (5) Desensitivieren der Feedbackinhibierung von Enzymen in dem Chorismatsyntheseweg und dem trp-Operon; (6) Deletion des Repressors, trpR, und der Attenuationssequenz in dem trp-Operon; (7) Deletion von Tryptophan-abbauenden Enzymen; (8) Überexpression der trp-Operonenzyme; (9) Überexpression des Wildtyps oder Feedback-resistenten AroF, AroG oder AroH oder irgendeines Enzyms in dem Chorismatsyntheseweg; (10) Überexpression von SerA; und (11) Überexpression von TktA oder TktB.
Um Tryptophan herzustellen, kann der Stamm ATCC31743 als Wirt verwendet werden, der chromosomale Marker enthält wie z.B. trpR Δ(trpAE) tna. Dieser Stamm enthält auch ein Plasmid pSC102trp, das das trpAE-Operon enthält. Plasmide pATI und pPS341 (oder pPS706 oder pPSL706) können in diesen Stamm transformiert werden. Das serA-Gen kann in irgendeines dieser Plasmide kloniert werden. Alternativ können diese klonierten Gene (trpAE, aroG, tktt, pps oder serA) auf einem oder zwei Plasmiden konsolidiert werden. Der sich ergebende Stamm wurde in MT-Medium wachsengelassen, das pro Liter enthält: KH₂PO₄, 3 g: K₂HPO₄, 3 g; K₂HPO₄, 7 g; NH₄CL, 3 g; MgSO₄ 0,2 g; FeSO₄ 7H₂O, 10 mg Glukose, 0 bis 30 g.
Die Pps-Technologie ist mit all den oben genannten Veränderungen im Stoffwechsel kompatibel. Veränderungen, die die Zufuhr von E4P favorisieren, wie z. B. die Deletion von Phosphoglukoseisomerase können den Bedarf an Überexpression von Tkt, assoziiert mit Pps in der bevorzugten Ausführungsform, beseitigen. Höher AroG-Spiegel können auch den Bedarf für die Überexpression von Tkt beseitigen. Die Pps-Technologie kann in Mikroorganismen z. B. Brevibacteria und Corynebacteria verwendet werden.
BEISPIEL 4
Herstellung von Phenylalanin
Die Veränderungen des Synthesewegs zur Herstellung von Phenylalanin sind ähnlich den oben genannten, außer an den terminalen Synthesewegen, die zu Phenylalanin führen. Diese schließen ein: (1) die Überexpression der Enzyme von chorismatischem Phenylalanin; (2) Deletion des trp-Operons; und (3) Deletion von Phenylalanin-abbauenden Enzymen und (4) Desensitivieren aller der Enzyme von DAHP zu Phenylalanin, so dass sie nicht durch das Letztgenannte inhibiert werden.
Um Phenylalanin herzustellen, kann eine E. coli-Mutante (W3110 Δtrp Δtyr Δphe) (Ref: Forberg, Eliaeson, und Haggstrom, 1988) verwendet werden. Die Plasmide pAT1 und pPS341 (oder pPS706, pPSL706) können dann in diesen Stamm transformiert werden. Zusätzlich kann das pheA^fbr-Gen aus Plasmid pJN6 (dieselbe Referenz) ausgeschnitten werden und in entweder pPS341 oder pAT1 ligiert werden. Der sich ergebende Stamm kann in dem folgenden Medium kultiviert werden, das pro Liter enthält; NH₄CL, 5g; K₂SO₄, 0,8 g; KH₂PO₄, 0,5 g; Na₂HPO₄, 1 g; Na-Zitrat, 2,5 g; FeCL₃ 6H₂O, 0,01 g; CaCl₂ 2H₂O, 0,20; MgCl₂ 6H₂O, 0,8 g; Tyrosin, 0,05 g; Tryptophan, 0,025 g, Glukose 10-30 g.
BEISPIEL 5
Herstellung von Tyrosin
Die Syntheseweg-Veränderungen zur Herstellung von Tyrosin sind ähnlich zu den oben genannten, außer an dem terminalen Syntheseweg, der zu Tyrosin führt. Diese schließen ein (1) die Überexpression von Enzymen von Chorismat zu Tyrosin; (2) Deletion von trp-Operon und dem Phenylalaninzweig; (3) Deletion von Tyrosin-abbauenden Enzymen; und (4) Desensitivieren aller der Enzyme von DAHP zu Tyrosin, so dass sie nicht durch das zuletzt Genannte inhibiert werden.
BEISPIEL 6
Herstellung von Indigo
Die Herstellung von Indigo kann durch Überführen von Tryptophan oder einem Zwischenprodukt aus dem trp-Syntheseweg zu Indigo, entweder in vitro oder in vivo erreicht werden. Da die Pps-Technologie die Produktion von DAHP erhöht, wird sie auch die Zufuhr jedes Metaboliten erhöhen, der als der Vorläufer für Indigo dient. Um Indigo herzustellen, kann der oben beschriebene Tryptophan-produzierende Stamm als ein Wirt verwendet werden. Jedoch muss der Stamm tna+ gemacht werden und die Naphthalindioxygenase aus Pseudomonas putida überexprimieren. In diesem Stamm wird Tryptophan, das hergestellt wird durch Tryptophanase zu Indol abgebaut werden, das dann zu cis-Indol-2,3-dihydrodiol durch die klonierte Naphthalindioxygenase überführt wird. Das hergestellte cis-Indol-2,3-dihydrodiol wird spontan in der Anwesenheit von Sauerstoff zu Indigo überführt. ATCC31743 ist der bei der Überführung von DAHP zu Tryptophan verwendete Stamm.
BEISPIEL 7
Herstellung von Chinoid organischen Verbindungen
Chinoid organische Verbindungen können von Dehydrochinat abgeleitet werden, das ein Stromabwärts-Metabolit von DAHP ist. Um Chininsäure herzustellen, kann E. coli AB2848 aroD, das pTW8090A enthält, das das Gen qad (Chininsäuredehydrogenase von Klebsiella pneumoniae) (Ref: Draths, Ward und Frost, 1992, JACS, 114, 9725-9726) enthält und pKD136 (Referenz wie oben), das die tkt, aroF und aroB-Gene enthält, als Wirt verwendet werden. Das pps-Gen kann in eines dieser Plasmide kloniert werden und gleichzeitig überexprimiert werden. Es wurde berichtet, dass mindestens 80 mM von D-Glukose in 25 mM an Chininsäure überführt werden kann. Nach der Zellentfernung kann Chininsäure im Überstand in Benzochinon überführt werden nach der Hinzugabe von Schwefelsäure und Mangan (IV) Dioxid technischen Grads und Erhitzen bei 100°C für eine Stunde. In der Abwesenheit von Ansäuerung, wurden wässrige Lösungen von gereinigter Chininsäure mit 10 % Ausbeute zu Hydrochinon überführt, nach Erhitzen bei 100°C für 18 Stunden mit Mangandioxid technischen Grads.
BEISPIEL 8
Herstellung von Catechol
Die Herstellung von Catechol kann durch Transformieren von pps in E. coli erreicht werden, das pKD136 exprimiert. Da die Pps-Technologie die Produktion von DAHP erhöht, wird sie auch die Zufuhr jedes Metaboliten erhöhen, der als Vorläufer für Catechol dient.
BEISPIEL 9
Charakterisierung von luxI'-angetriebener pps-Expression
Um die luxI'-angetriebene pps-Expression zu charakterisieren, wurde pPS706 in AB2847/pRW5 und AB2847/pAT1 transformiert und die Pps-Aktivität wurde gemessen, wenn die Stämme entweder in Glukose oder Xylosemedium kultiviert wurden. Die Pps-Aktivität erhöhte sich mit der Autoinduzierer(N-(3-xox-Hexanoyl)-homoserinlakton)-Konzentration und erreichte Sättigung, wenn 1 μM Autoinduzierer verwendet wurde. Die Pps-Aktivität in demselben Stamm, der in Xylosemedium wuchs, war dieselbe wie in Glukose. Die Pps-Aktivität war unabhängig von der IPTG-Konzentration (Daten nicht gezeigt). Daher erreichte der Erfinder die unabhängige Modulation von drei Schlüsselenzymen in der Produktion von aromatischen Verbindungen: AroG (IPTG-induzierbar), TktA (An/Aus oder Anwesenheit/Abwesenheit) und Pps (Autoinduzierer-induzierbar).
Während in Übereinstimmung mit den Patentstatuten die beste Ausführungsform und bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beschrieben wurden, soll es verstanden werden, dass die Erfindung nicht darauf begrenzt ist, sondern durch den Bereich und die Bedeutung der beigefügten Ansprüche gemessen werden muss.

Claims

Verfahren zur Herstellung von 3-Desoxy-D-arabino-heptulosonat 7-Phosphat (DAHP), umfassend die Schritte von: (a) Plazieren eines Mikroorganismus mit genetischen Elementen umfassend pps und tkt Gene, wobei die Gene durch den Mikroorganismus exprimiert werden, in ein Medium umfassend eine Glukoselösung; (b) Überexprimieren der pps und tkt Gene des Mikroorganismus in dem Glukosemedium; und (c) Aufreinigen des DAHP aus dem Medium.
Verfahren nach Anspruch 1, das einen hinzugefügten Schritt von Wachsen von Mikroorganismen in einem Wachstumsmedium bis zu einer Dichte von 5 × 10⁹ Zellen/ml einschließt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das pps Gen operativ mit einem tac Promotor verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus Escherichia coli AB2847 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus das Plasmid pPS341 umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus ein Stamm von E. coli ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Stamm von E. coli AB2847 aroB ist.
Verfahren zur Herstellung von Tryptophan, umfassend die Schritte von: (a) Plazieren eines Mikroorganismus mit genetischen Elementen umfassend pps, tkt und serA Gene, wobei die Gene durch den Mikroorganismus exprimiert werden, in ein Medium umfassend eine Glukoselösung; (b) Überexprimieren der pps, tkt und serA Gene des Mikroorganismus in dem Glukosemedium; und (c) dadurch Produzieren von Tryptophan.
Verfahren nach Anspruch 8, das einen hinzugefügten Schritt von Wachsen von Mikroorganismen in einem Wachstumsmedium bis zu einer Dichte von 5 × 10⁹ Zellen/ml einschließt.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das pps Gen operativ mit einem tac Promotor verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Mikroorganismus Escherichia coli AB2847 ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Mikroorganismus das Plasmid pPS341 umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Mikroorganismus ein Stamm von E. coli ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Stamm von E. coli AB2847 aroB ist.
Verfahren zur Herstellung von Phenylalanin, umfassend die Schritte von: (a) Plazieren eines Mikroorganismus mit genetischen Elementen umfassend pps, tkt und pheA^fbr Gene, wobei die Gene durch den Mikroorganismus exprimiert werden, in ein Medium umfassend eine Glukoselösung; (b) Überexprimieren der pps, tkt und pheA^fbr Gene des Mikroorganismus in dem Glukosemedium; und (c) dadurch Produzieren von Phenylalanin.
Verfahren nach Anspruch 15, das einen hinzugefügten Schritt von Wachsen von Mikroorganismen in einem Wachstumsmedium bis zu einer Dichte von 5 × 10⁹ Zellen/ml einschließt.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das pps Gen operativ mit einem tac Promotor verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Mikroorganismus Escherichia coli AB2847 ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Mikroorganismus das Plasmid pPS341 umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Mikroorganismus ein Stamm von E. coli ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Stamm von E. coli AB2847 aroB ist.
Verfahren zur Herstellung von Chinasäure, umfassend die Schritte von: (a) Plazieren eines Mikroorganismus mit genetischen Elementen umfassend pps, tkt und qad Gene, wobei die Gene durch den Mikroorganismus exprimiert werden, in ein Medium umfassend eine Glukoselösung; (b) Überexprimieren der pps, tkt und qad Gene des Mikroorganismus in dem Glukosemedium; und (c) dadurch Produzieren von Chinasäure.
Verfahren nach Anspruch 22, das einen hinzugefügten Schritt von Wachsen von Mikroorganismen in einem Wachstumsmedium bis zu einer Dichte von 5 × 10⁹ Zellen/ml einschließt.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das pps Gen operativ mit einem tac Promotor verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei der Mikroorganismus Escherichia coli AB2847 ist.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei der Mikroorganismus das Plasmid pPS341 umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei der Mikroorganismus ein Stamm von E. coli ist.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei der Stamm von E. coli AB2847 aroB ist.
Verfahren nach Anspruch 1, das den Schritt von Weiterverarbeiten von DAHP, um Derivatprodukte zu erhalten, einschließt.