DE60029786T2

DE60029786T2 - GLOBALER REGULATOR, VERWENDET ZUR ERHöHUNG DER SYNTHESE VON AROMATISCHEN SUBSTANZEN

Info

Publication number: DE60029786T2
Application number: DE60029786T
Authority: DE
Inventors: Tony Arlington ROMEO; Matthew Fort Worth TATARKO
Original assignee: University of North Texas; University of North Texas Health Science Center
Current assignee: University of North Texas; University of North Texas Health Science Center
Priority date: 1999-05-28
Filing date: 2000-05-26
Publication date: 2007-10-18
Anticipated expiration: 2020-05-27
Also published as: CA2375128A1; AU5299000A; EP1187930A4; EP1187930B1; ATE335087T1; DE60029786D1; EP1187930A1; WO2000073484A1

Description

ERKLÄRUNG ZU RECHTEN AN ERFINDUNGEN, DIE UNTER STAATLICH GEFÖRDERTER FORSUCHUNG GEMACHT WERDEN
Diese Erfindung wurde mit Mitteln der National Science Foundation unterstützt (MCB 9726197), und die Regierung der Vereinigten Staaten kann bestimmte Rechte an der Erfindung geltend machen.
FACHGEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Mikroorganismus, der genetisch verändert ist, um den Kohlenstofffluss in die Produktion von Vorläufern und Stoffwechsel-Intermediaten des „common aromatic pathway" und davon abzweigender Wege zu erhöhen, wie auch Verfahren zur Erhöhung eines derartigen Kohlenstoffflusses.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Versuchsansätze für die metabolische Veränderung von Mikroorganismen haben eine Eliminierung von zu Nebenprodukten führenden Enzymen, Deregulation allosterischer Enzyme, Derepression oder Überexpression von am Stoffwechselweg beteiligten spezifischen Genen und die Einführung von Genen anderer Organismen unter Verwendung rekombinanter DNA und anderer Versuchsansätze umfasst. Bailey (1991) Science 252:1668-1675. Zum Teil sind diese Maßnahmen erforderlich, um endogene Regulationsmechanismen zu überwinden, die der Anpassung des Flusses durch spezifische Stoffwechselwege an die unmittelbaren Bedürfnisse des Organismus dienen. Freilebende Bakterien regulieren ähnlich den Stoffwechsel bei spezifischen Schritten der einzelnen Wege, koordinieren aber ebenfalls den Fluss durch mehrere Wege mit Hilfe globaler regulatorischer Netzwerke. Globale regulatorische Systeme modulieren die Expression zahlreicher im bakteriellen Genom befindlicher Gene, was dem gesamten physiologischen, metabolischen und entwickelten Status des Organismus erlaubt, schnell und gelegentlich drastisch auf Veränderungen in der Umgebung zu reagieren. Neidhardt und Savageau (1996) Regulation beyond the Operon. In Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, Bd. 2, 2. Ausgabe, Neidhardt et al. Hrsg. Am. Soc. Microbiol. Washington, D. C. Seiten 1310-1324. Das Potenzial dieser leistungsfähigen regulatorischen Systeme ist nun für die Konstruktion mikrobieller Stämme erkannt worden.
Die biologische Produktion aromatischer Aminosäuren und verwandter Verbindungen besitzt klare Vorteile gegenüber einer chemischen Synthese; z.B. sind die biologischen Prozesse umweltverträglicher und nutzen erneuerbare Ressourcen. Berry (1996) Trends Biotechnol. 14:250-256. Allerdings sind die mikrobiellen Prozesse durch die bescheidene Ausbeute, mit der das Substrat zum Endprodukt umgewandelt wird, begrenzt. Bakterien nutzen den Shikimatweg oder „common aromatic pathway" für die Synthese aromatischer Aminosäuren, Folate und anderer aromatischer Metabolite. Draths et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:3956-3962. Dieser Weg beginnt mit der Kondensation der zentralen Kohlenstoff-Intermediate Phosphoenolpyruvat (PEP) und Erythrose-4-phosphat (E4P) zur Bildung von 3-Desoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphat (DAHP), in einer Reaktion, die von drei Isoenzymen der DAHP-Synthase katalysiert wird, die entweder von Phenylalanin (AroG), Tyrosin (AroF) oder Tryptophan (AroH) Feedback-gehemmt sind. Ein zweites PEP-Molekül wird in einem späteren Schritt eingebaut, um das Intermediat 5-Enol-pyruvoylshikimat-3-phosphat (EPSP) zu bilden. Erst wenn EPSP in Chorismat umgewandelt ist, erlaubt diese zentrale Weggabelung die Biosynthese von Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan. Bei der Phenylalanin-Synthese wird die Bildung von Prephenat aus Chorismat von Chorismat-Mutase (PheA) katalysiert, die ebenfalls einer Feedback-Hemmung von Phenylalanin unterliegt.
Der aromatische Weg von Escherichia coli ist Gegenstand einer früheren gentechnischen Veränderung gewesen, um die Produktivität und Ausbeute zu erhöhen und das Synthesespektrum auf nicht-native Verbindungen, wie Indigo, Indolessigsäure, Catechine und Chinon-Derivate, auszuweiten. Berry (1996); und Flores et al. (1996) Nature Biotechnol. 14:620-623. Die regulatorischen Enzyme des Shikimatweges sind überproduziert worden und ihre Feedback-Mechanismen sind dereguliert worden.
U.S. Patent Nr. 4.681.652. Enzyme, welche die zentralen Kohlenstoff-Vorläufer von aromatischen Verbindungen, PEP und E4P, erzeugen, sind einzeln überproduziert worden, d.h. PEP-Synthetase (Pps) und Transketolase (TktA). Patnaik und Liao (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:3903-3908; U.S. Patent Nr. 5.906.925; beziehungsweise Draths et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:3956-3962. Systeme, die PEP verringern, sind zerstört worden, einschließlich zweier Pyruvatkinasen (PykF und PykA) (Gosset et al. (1996) J. Ind. Microbiol. 17:47-52), die PEP zu Pyruvat umwandeln, und das PEP:Glucose-Phosphotransferasesystem (PTS) (Flores et al. (1996), das ein PEP pro transportierter Glucose verbraucht. Weil die Wege des zentralen Kohlenstoffmetabolismus miteinander in Verbindung stehen, können zahlreiche weitere Stoffwechselreaktionen diese Vorläufer beeinflussen.
In den letzten zurückliegenden Jahren haben die Erfinder ein globales regulatorisches System, das den Stofffluss durch die zentralen Kohlenstoffwege kontrolliert, wie auch viele weitere physiologischen Eigenschaften des E. coli Csr oder Kohlenstoffspeicher-Regulators aufklären können. Romeo (1998) Mol. Microbiol. 29:1321-1330 und EP-Anmeldung Nr. 98733282.0. Der Effektor dieses regulatorischen Systems ist ein als CsrA bekanntes kleines Protein, dessen neuartiger Mechanismus für eine globale Regulation eher die Bindung an spezifische mRNAs als an spezifische DNA-Sequenzen umfasst. Liu et al. (1995) J. Bacteriol. 177:2663-2672; Liu et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:17502-17510; und Liu und Romeo (1997) J. Bacteriol. 179:4639-4642. Eine Zerstörung des csrA-Gens erhöht die Levels von gluconeogenen und glycogenen Biosyntheseenzymen, verringert glycolytische Enzyme und stört folglich die zellulären Konzentrationen zentraler Kohlenstoff-Intermediate. Sabnis et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:29096-29104. CsrA moduliert drei Enzyme, die direkt am PEP-Stoffwechsel beteiligt sind; PykF ist posity reguliert, während PEP-Carboxykinase (PckA) und PEP-Synthetase (Pps), die PEP aus Oxalacetat beziehungsweise Pyruvat bilden, negativ reguliert sind. Einige Enzyme, die PEP direkt beeinflussen, sind ebenfalls von CsrA reguliert. Folglich verursacht eine CsrA-Mutation eine Zunahme von PEP. Bemerkenswert ist, dass csrA nur eine geringe oder keine Wirkung auf zwei Gene des Pentosephosphatweges zeigt, der E4P bildet. Sabnis et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:29096-29104.
OFFENLEGUNG DER ERFINDUNG
Es ist nun festgestellt worden, dass genetische Elemente, die für eine Zerstörung des csrA-Gens sorgen, zusammen mit genetischen Elementen, die eine erhöhte E4P-Produktion hervorrufen, für eine signifikant erhöhte Produktion von Verbindungen des aromatischen Weges, einschließlich der von diesem Weg stammenden nativen und nicht-nativen Verbindungen, und insbesondere Verbindungen, deren Vorläufer Chorismat ist, vorteilhafterweise eingesetzt sein können. In einer bestimmten Anmeldung dieses Verfahrens ist festgestellt worden, dass bei einer Zerstörung von csrA hinreichend PEP gebildet wird, um eine erhöhte Menge an E4P, die aus einer Überexpression des Transketolasegens resultiert, zu DAHP umzuwandeln (in einer ersten Kondensationsreaktion), wie auch hinreichend PEP gebildet wird, um EPSP aus Shikimat-3-phosphat (in einer zweiten Kondensationsreaktion) in Stämmen zu bilden, die für eine Optimierung des aromatischen Weges, einschließlich Kohlenstofffluss durch Shikimat-3-Phosphat und EPSP zu Chorismat, verändert sind.
Dementsprechend kann eine Zerstörung des csrA-Gens in Kombination mit einer Überexpression von Transketolase zusammen mit anderen Mutationen, die den Shikimatweg optimieren, vorteilhaft eingesetzt sein, um den Kohlenstofffluss durch Chorismat (oder einem Vorläufer von Chorismat) zu optimieren, wo PEP sonst in limitierenden Mengen verfügbar ist, zum Beispiel in Stämmen, die für eine Phenylalanin-Produktion oder für die Produktion anderer aromatischer Aminosäuren optimiert sind. Zum Beispiel führt in Stämmen, die für eine Produktion von Phenylalanin optimiert sind, die kombinierte Wirkung einer csrA-Zerstörung und E4P-Überexpression zu einem mehr als doppelten Anstieg der Phenylalanin-Produktion.
Gemäß einem Aspekt betrifft die Erfindung einen Mikroorganismus, der genetisch angepasst ist, um unter geeigneten Kulturbedingungen, insbesondere einer geeigneten Nährstoffversorgung, erhöhte Mengen an Verbindungen zu produzieren, die durch den „common aromatic pathway" durch wenigstens Shikimat-3-phosphat und 5-Enolpyruvoylshikimat-3-phosphat (EPSP) fließen, wobei dieser Mikroorganismus ein erstes genetisches Element, das die Menge an funktionellem CsrA-Protein vermindert, und ein zweites genetisches Element umfasst, das die Menge an D-Erythrose-4-phosphat erhöht. Der Mikroorganismus ist darauf hin angepasst, hinrei chende Mengen an PEP zu produzieren, um eine erhöhte Menge an E4P zu DAHP umzuwandeln (in einer ersten Kondensationsreaktion), und das resultierende Shikimat-3-phosphat zu EPSP umzuwandeln (in einer zweiten Kondensationsreaktion). Außerdem ist der Mikroorganismus aufgrund dieser Kombination von genetischen Elementen angepasst, um hinreichende Mengen an PEP für beide Kondensationsreaktionen in einem Mikroorganismus zu produzieren, der für eine Optimierung des Shikimatweges verändert ist; zum Beispiel ein Mikroorganismus, in dem DAHP-Synthase von einer oder mehreren aromatischen Aminosäuren Feedbackdereprimiert ist und in dem zum Beispiel erhöhte Mengen an DAHP-Synthase und Shikimatkinase produziert werden, um einen Fluss durch den Weg zu EPSP und vorzugsweise Chorismat zu optimieren; oder zum Beispiel in einem Mikroorganismus, in dem der Weg von Chorismat zu einer aromatischen Aminosäure, zum Beispiel Phenylalanin, ebenfalls optimiert ist, wie es unten noch umfassender diskutiert ist.
Der Ausdruck „funktionell", der mit Bezug auf ein CsrA-Protein (Genprodukt) verwendet wird, bezieht sich auf ein Protein, das in der Lage ist, seine normale Funktion zu erfüllen, nämlich die Verminderung der Levels von gluconeogenen Enzymen und glycogenen Biosyntheseenzymen etc., und insbesondere in der Lage ist, Enzyme und Moleküle zu beeinflussen, die wiederum die Produktionslevels von PEP beeinflussen.
Der Ausdruck „erhöhen" oder „vermindern" oder ähnlich Ausdrücke, die mit Bezug auf Enzyme verwendet sind, bezieht sich auf die Aktivität, Levels oder Mengen an Molekülen, die aus einer Expression oder Einführung genetischer Elemente resultieren, und ist, sofern nicht anders angegeben oder mit einbezogen, ein relativer Ausdruck, der im Vergleich zu normalen Wildtyp-Levels für den Wildtyp-Organismus oder einen spezifischen Referenzorganismus, der gemäß der Erfindung verändert worden ist, verwendet wird. Sofern nicht anders angegeben oder mit einbezogen, könnte sich eine derartige Erhöhung oder Verminderung direkt oder indirekt auf die Aktivität, Produktion oder Kontrollmechanismen für das fragliche Molekül auswirken.
Der Ausdruck „dereprimiert" und verwandte Formen dieses Ausdrucks, wenn er mit Bezug auf die Feedback-Inhibitionsmechanismen verwendet ist, wird verwendet, um eine Verminderung oder Verhinderung einer derartigen Feedback-Inhibition zu bezeichnen.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung einen Mikroorganismus, der genetisch angepasst ist, um gesteigerte Mengen an Verbindungen zu produzieren, die durch den „common aromatic pathway" zu einer Zielverbindung fließen, die ein Intermediat in dem Weg zwischen DAHP und EPSP ist, wobei dieser Mikroorganismus ein erstes genetisches Element, das die verfügbare Menge an funktionellem CsrA-Protein vermindert, und ein zweites genetisches Element umfasst, das die Expression von E4P erhöht (bezogen auf den Wildtyp-Mikroorganismus), wobei dieser Mikroorganismus angepasst ist, überschüssiges PEP in die Produktion dieser Zielverbindung unter Bedingungen einer geeignet erhöhten Produktion von E4P, DAHP-Synthase und vorzugsweise anderen Enzymen innerhalb des zu der Zielverbindung führenden Weges zu lenken.
Der Ausdruck „genetisches Element", wie er hier verwendet ist, umfasst ohne Einschränkung ein Gen oder einen Teil davon (z.B. Promotor) einer extrachromosomalen Nukleinsäure, zum Beispiel ein oder mehrere Plasmide etc., eine Nukleinsäure, die in das Genom des Mikroorganismus eingebaut ist oder mit diesem interagiert, zum Beispiel eine Transposon-Insertion, oder eine Mutation, die in einem oder mehreren veränderten oder zusätzlichen Basenpaaren eingefügt ist, oder eine Deletion (zum Beispiel innerhalb eines vorhandenen genetischen Elementes, was tatsächlich ein neues genetisches Element bildet). Der Ausdruck ist nicht auf Nukleinsäuren beschränkt, sondern kann ein Protein oder ein anderes Molekül umfassen, zum Beispiel ein in das Nährmedium zugegebenes oder ein von einem co-kultivierten Mikroorganismus stammendes Molekül. Der Mikroorganismus ist vorzugsweise E. coli. Für die Phenylalanin-Produktion ist der Mikroorganismus vorzugsweise NST74 (ATCC #31884), wie unten noch umfassender diskutiert.
Das genetische Element, das eine Überexpression von E4P hervorruft, ist vorzugsweise das Transketolasegen, wie in U.S. Patent Nr. 5.168.056 offen gelegt. Das für die Verminderung der Menge an csrA-Genprodukt verantwortliche genetische Element ist gegebenenfalls die TR1-5 Transposon-Insertion. Wie unten erörtert, wird allerdings klar werden, dass beliebige andere Verfahren, die in die Expression oder Verfügbarkeit von funktionellem CsrA-Protein zur Erfüllung seiner nativen Funktion eingreifen, für diesen Zweck in Betracht gezogen werden können.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer erhöhten Menge an Stoffwechselprodukten des Shikimatweges, einschließlich EPSP und vorzugsweise Chorismat, durch Kultivierung, unter geeigneten Kulturbedingungen, insbesondere geeigneten Nährstoff-Bedingungen, eines Mikroorganismus, der ein genetisches Element, das die Menge an funktionellem CsrA-Protein vermindert, und ein genetisches Element umfasst, das eine Expression von E4P hervorruft, wobei dieser Mikroorganismus genetisch angepasst ist, um hinreichende Mengen an PEP zu produzieren, um E4P zu DAHP umzuwandeln und resultierendes Shikimat-3-phosphat zu EPSP umzuwandeln.
Die Bedeutung und Implementierung geeigneter Kulturbedingungen ist, wenn auch nicht ausdrücklich, in der gesamten Offenlegung und allen Ansprüchen mit einbezogen.
In noch einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bereitstellung gesteigerter Mengen an Verbindungen, die durch den „common aromatic pathway" zu einer Zielverbindung fließen, die ein Intermediat in dem Weg zwischen DAHP und EPSP ist, durch Kultivieren eines Mikroorganismus unter geeigneten Nährstoff-Bedingungen, wobei dieser Mikroorganismus ein erstes genetisches Element, das die Menge an funktionellem CsrA-Protein vermindert, und ein zweites genetisches Element umfasst, das die Menge an E4P erhöht, wobei dieser Mikroorganismus genetisch angepasst ist, überschüssiges PEP in die Produktion dieser Zielverbindung unter Bedingungen einer geeignet erhöhten Produktion oder nicht limitierender Mengen an E4P, DAHP-Synthese und bevorzugt anderer Enzyme innerhalb des zu der Zielverbindung führenden Weges zu lenken. Vorzugsweise ist das Enzym, das für die Katalyse der Synthese der nächsten Verbindung im Shikimatweg von der Zielverbindung verantwortlich ist, durch eine Mutation oder anderweitig blockiert.
Der Ausdruck „Kultur" und verwandte Ausdrücke schließt kein in der Technik bekanntes Verfahren zur Anzucht und/oder Halten von Mikroorganismen zur Produktion von erwünschten Endprodukten aus.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Bevorzugte Anwendungsformen der Erfindung werden nun unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben, von denen:
1 eine graphische Darstellung des Stoffwechsels ist, die die regulatorischen Effekte von csrA auf den intermediären Kohlenstoffmetabolismus veranschaulicht.
2 eine graphische Darstellung des Shikimatweges ist.
3 eine graphische Darstellung ist, welche die Produktion von Phenylalanin und Tyrosin aus Chorismat veranschaulicht.
4 die Glucose-Aufnahme und die Produktion von DAHP und Phenylalanin in E. coli-Stämmen zeigt, die aromatische Enzyme überproduzieren. Stammidentitäten sind die folgenden: NST (
), NST[pAT1] (☐), NST CSR (csrA::kanR) (
) und NST CSR[pAT1] (O). Die Kulturen waren in 100 ml modifiziertem MOPS-Medium gewachsen, das 0,2% Glucose als Kohlenstoffquelle enthielt. Datenpunkte stellen den Durchschnitt dreier Bestimmungen dar; Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar.
5 die Phenylalanin-Produktion (A) und Gewichts-prozentuale Ausbeute bezogen auf die Glucose-Konzentration (B) zeigt. Die Stämme waren in 1 ml modifiziertem MOPS-Medium angezogen, das die angegebenen Glucose-Konzentrationen enthielt. Stammidentitäten waren die folgenden: NST (
), NST[pAT1] (
), NST CSR (
) und NST CSR[pAT1] (
).
6 die PEP-Levels in E. coli Stämmen zeigt, die Enzyme des aromatischen Weges überproduzieren. Die Stämme waren bis zur Mitte der exponentiellen Phase (OD600 1,0; mittlere log-Phase) oder bis zur frühen stationären Phase in MOPS-Medium angezogen, das 0,2% Glucose enthielt. PEP und Protein-Levels wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, getestet.
BESTE AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG
Einige wenige globale regulatorische Faktoren vermitteln viele der umfassenden Veränderungen in der Genexpression, die dann erfolgen, wenn E. coli in die stationäre Phase eintritt. Einer der Stoffwechselwege, der in der stationären Phase transkriptionell aktiviert wird, ist der Glycogen-Biosyntheseweg. Das csrA-Gen übt pleiotrope Effekte nicht nur durch die Kontrolle der Glycogen-Biosynthese, sondern auch durch die Kontrolle der Gluconeogenese aus, und zeigt somit Wirkungen auf Zellgröße, Oberflächeneigenschaften (Adhärenz) und Motilität. E. coli csrA codiert folglich einen globalen regulatorischen Faktor.
Die Nukleotidsequenz von E. coli csrA ist in 9 (SEQ ID NR: 1) des U.S. Patentes Nr. 5.684.144 (nachstehend das '144 Patent) dargestellt. 9 (SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 2 und SEQ ID NR: 3) des '144 Patents zeigt die Nukleotidsequenz des csrA-Gens und der daraus abgeleiteten Aminosäuresequenz des im Gen codierten offenen Leserahmens (ORF). Ein Pfeil markiert die Stelle der TR1-5-Insertionsmutation, die zwischen 421 und 422 bp liegt und zur Aktivierung des csrA-Gens für die unten und in Beispiel 1 beschriebenen Versuche genutzt wurde. Die TR1-5-Insertionsmutation ist in Romeo et al. (1993) J. Bacteriol. 175:4744-4755 umfassender beschrieben. Die Insertionsmutation wird hier ganz unterschiedlich als „TR1-5", „(csrA::kanR)" oder „CSR" bezeichnet (wenn sie sich auf einen Mikroorganismus mit der Mutation bezieht). „NST" wird zur Bezeichnung des E. coli Stammes NST74 verwendet, der für eine Produktion von Phenylalanin optimiert ist. NST74 ist in U.S. Patent Nr. 4.681.852 beschrieben.
Wie im '144 Patent umfassender beschrieben, hemmt ein Plasmidklon des nativen csrA-Gens, der in der Lage ist, das 61 Aminosäuren umfassende csrA-Genprodukt zu exprimieren, die Glycogen-Akkumulierung stark und beeinflusst die Fähigkeit der Zellen, bestimmte Kohlenstoffquellen für ihr Wachstum zu verwerten. Die regulierte Expression des csrA-Gens und seines Genproduktes sind für eine Steigerung der Expression von Produkten zweckdienlich, die von alternativen Wegen gebildet werden. Derartige Produkte umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Antibiotika, Metaboliten, organische Säuren, Aminosäuren und ein großes Spektrum industriell wichtiger Produkte, die in bakteriellen Fermentationssystemen produziert werden.
E. coli csrA-Gen und seine Wirkungen
Die Glycogensynthese ist einer von mehreren Stoffwechselwegen, die in Bakterien induziert werden, zum Beispiel in der stationären Phase von E. coli. Die Anhäufung von Glycogen in der frühen stationären Phase spiegelt wenigstens zwei Regulationsniveaus wider, die allosterische Regulation des Schlüsselschrittes des biochemischen Weges und eine gesteigerte Expression der Strukturgene für diesen Weg.
Wie im '144 Patent umfassender beschrieben, codiert das csrA-Gen einen transwirkenden negativen Regulator der Expression sowohl von glgC als auch glgB, essentiellen Enzymen des Glycogenweges. Die csrA-Mutation ist pleiotrop, was darauf hindeutet, dass csrA einen globalen regulatorischen Faktor codiert.
Die Glycogensynthese ist über die Effekte des Genprodukts von csrA (CsrA) auf die Expression der Operons glgCAY(P) und glgBX negativ kontrolliert. Die csrA::kanR Transposon-Insertion erhöhte die Expression von glgC und glgB; allerdings veränderte sie nicht die Induktion zeitlich oder ändert nicht die Form der Induktionskurven für diese Gene. Dies weist darauf hin, dass CsrA zusätzlich zu den Faktoren wirkt, welche die Wachstumsphasenreaktion vermitteln.
Wie im '144 Patent umfassender beschrieben, ist csrA an der Regulation der Gluconeogenese beteiligt. Die TR1-5-Mutation in csrA verursachte eine Überexpression des pckA-Gens, wie es durch eine zweifache Überexpression einer pckA-lacZ transkriptionellen Fusion gezeigt wurde. Die TR1-5-Mutation allerdings änderte nicht die Form der pckA-lacZ-Induktionskurve, eine Reaktion, die derjenigen der glg-Gene ähnlich war.
Unter Bezugnahme auf die Figuren zeigt 1 die regulatorischen Effekte von csrA auf den intermediären Kohlenstoffmetabolismus. Zum Beispiel ist PEP ein Vorläufer von Glucose-6-phosphat über die Gluconeogenese. Glucose-6-phosphat ist wiederum ein Voräufer von Glycogen. Die Gluconeogenese und Glycogensynthese sind in der csrA-Mutante ebenfalls erhöht und würden mit dem Shikimatweg konkurrieren, der an der Synthese aromatischer Aminosäuren beteiligt ist. Wie in 1 gezeigt, reguliert das csrA-Gen die Gluconeogenese und die Glycogensynthese negativ und reguliert die Glycolyse positiv. Eine Zerstörung des csrA-Gens steigert die Levels der gluconeogenen und glycogenen Biosyntheseenzyme, vermindert die glycolytischen Enzyme und stört folglich die zellulären Konzentrationen zentraler Kohlenstoff-Intermediate.
CsrA moduliert drei Enzyme, die am PEP-Metabolismus direkt beteiligt sind; wie in 1 gezeigt, ist PykF positiv reguliert, während PEP-Carboxykinase (PckA) und PEP-Synthetase (Pps), die PEP aus Oxalacetat beziehungsweise Pyruvat bilden, negativ reguliert sind. Verschiedene Enzyme, die PEP indirekt beeinflussen, sind ebenfalls von CsrA reguliert. Folglich verursacht eine csrA-Mutation eine signifikante Erhöhung intrazellulärer PEP-Pools. Anzumerken ist allerdings, dass csrA nur einen geringen oder keinen Effekt auf zwei Gene des Pentosephosphatweges zeigt, der E4P bildet.
Wie in 2 gezeigt, vereinigt sich PEP, ein Vorläufer aromatischer Aminosäuren (Tyrosin, Phenylalanin und Tryptophan) und anderer Stoffwechselprodukte, mit E4P in einer ersten Konsensationsreaktion, um DAHP in einer von der DAHP-Synthase katalysierten Reaktion zu bilden. DAHP wird wiederum zu 3-Dehydrochinat, dann zu 3-Dehydroshikimat, dann zu Shikimat, dann zu Shikimat-3-phosphat von der Shikimatkinase und dann zu EPSP in einer zweiten Kondensationsreaktion mit PEP und schließlich zu Chorismat umgewandelt.
Wie unten umfassender beschrieben, war, trotz einer Zunahme von E4P, die durch Einführen des Plasmids pAT1 (einschließlich des Transketolasegens) in den Stamm NST74 (ATCC Nr. 31884, siehe U.S. Patent Nr. 4.681.852 – das '852 Patent) hergestellt wurde, der für eine optimale Phenylalanin-Produktion (einschließlich der tyrR-Genmutation, welche die Expression unter anderem der DAHP-Synthase und Shikimatkinase erhöht) verändert wurde, die Menge an PEP, die von der TR1-5 Mutation gebildet wurde, sowohl für die erste als auch zweite Kondensationsreaktion hinreichend und führte zu einer 2,2 bis 2,4-fachen Zunahme der Phenylalanin-Produktion. Wie unten umfassender beschrieben und in 4 gezeigt, lässt das Ausbleiben einer DAHP-Zunahme vermuten, dass das intrazelluläre PEP in den csrA-Mutanten für eine vollständige Umwandlung von endogenem DAHP zu EPSP und letzten Endes zu Phenylalanin hinreichend war.
Die Zunahme der Phenylalanin-Produktion in den Stämmen, welche die csrA-Mutation enthalten, könnte an einer Erhöhung der intrinsischen Wirkung von Enzymen in dem zur Phenylalanin-Produktion führenden Weg liegen. Zwei Schlüsselenzyme in der Biosynthese von Phenylalanin, DAHP-Synthase und Chorismat-Mutase, wurden auf ihre Aktivität getestet. Diese zeigten keine Aktivitätserhöhung in csrA-Mutanten (2). Diese Feststellung stützt die Hypothese, dass die Zunahme der Phenylalanin-Produktion auf Zunahmen bei Vorläufermetaboliten zurückzuführen sind, die aus dem zentralen Kohlenstoffmetabolismus stammen.
Wie unten ausführlicher beschrieben und in Tabelle 1 gezeigt, wurde das Intermediat DAHP, das üblicherweise als das Maß für die Festlegung des Flusses in den aromatischen Weg genutzt wurde, wie auch die Phenylalanin-Produktion und Glucose-Aufnahme über die gesamten Wachstumskurven verschiedener Stämme getestet. Sowohl die csrA-Mutation als auch pAT1 verminderten die Wachstumsrate, was sich in den Kinetiken der Glucose-Aufnahme und der Phenylalanin-Akkumulation widerspiegelte. Die Verdoppelungszeiten von NST, NST[pAT1], NST CSR und NST CSR[pAT1] in einem definierten Medium (MOPS) betrugen ungefähr 1,38, 1,85, 2,08, beziehungsweise 3,35 Stunden. Nichtsdestotrotz war der Proteinertrag am Ende in diesen Stämmen unbeeinflusst, und nach 28 Stunden Kultivierung lagen 970 ± 51, 954 ± 67, 974 ± 70 beziehungsweise 1024 ± 34 μg/ml Gesamtprotein vor.
Wie in 4D gezeigt, ist die Produktion von Phenylalanin über die Zeit in Batch-Kulturen von E. coli, in das die csrA-Mutation oder pAT1 oder beide eingeführt worden waren, deutlich unterschiedlich. Das Plasmid, pAT1, das die Transketolase tkt + Cm und aroG codierte und zwei hintereinanderliegende lac Promotoren besaß, erhöhte die Phenylalanin-Produktion auf 119% (160 mg/l) gegenüber dem elterlichen Stamm, benötigte aber die weitere Mutation in csrA für maximale Mengen von 250% (338 mg/l). Eine Zerstörung von csrA(csrA::kanR) allein in einem NST führte zu einer um 167% verbesserten Produktion (226 mg/l). Wie in 4A gezeigt, wurde festgestellt, dass die Phenylalanin-Produktion während des Wachstums des Organismus erfolgte, und es wurde nicht festgestellt, dass es ein sekundärer oder idiophasischer Metabolit ist. Maximale Raten der Phenylalanin-Produktion waren kurz nach dem Ende der log-Phase erreicht.
Zusammengefasst produzierte die csrA-Mutante fast doppelt so viel Phenylalanin wie der elterliche Stamm; die Effekte von pAT1 waren etwas bescheidener (~1,4-fach); während die kombinierten Effekte sich ungefähr addierten (~2,2 bis 2,4-fach). In diesen Stämmen erreichte die Phenylalanin-Akkumulation ihre höchsten Raten in der mittleren bis späten exponentiellen Wachstumsphase und setzte sich wenige Stunden in der stationären Phase fort.
Mutanten von NST glgC und NST ergaben beide eine durchschnittliche Ausbeute von 218 mg/l Phenylalanin. Doppelmutanten, die sowohl die glgC-Zerstörung als auch eine csrA-Mutation enthielten, ergaben eine Ausbeute von 139,5 mg/l verglichen mit einer Ausbeute von 288 mg/l in NST CSR.
Wie in 4A gezeigt, war das Wachstum von der csrA-Mutation (csrA::kanR) und pAT1 beeinflusst. Dies spiegelte sich ebenfalls in der Rate der Phenylalanin-Produktion und Glucose-Verwertung wider. Die durchschnittlichen Generationszeiten unter diesen Bedingungen waren 1,38 Stunden für NST, 1,85 Stunden für NSTpAT1, 2,08 Stunden für NSTCsrA und 3,35 Stunden für NSTCSRpAT1. Die Kombination der csrA-Mutation und des Plasmids pAT1 ergab das langsamste Wachstum, und folglich scheint es, dass diese beiden Mutationen eine metabolische Senke bei den Bakterien sind. Obwohl NSTCSR und NSTCSRpAT1 die langsamsten Wachstumsraten besaßen, zeigten sie auch die höchste Phenylalanin-Produktionsrate.
Wie in 4C gezeigt, war die DAHP-Produktion kein Indikator oder Vorhersageinstrument für eine Phenylalanin-Produktion. Die Zellen, welche die beste DAHP-Produktion zeigten, waren diejenigen, die nur das pAT1-Plasmid enthielten. Die höchsten DAHP-Werte sind ebenfalls in Stämmen mit einem anderen genetischen Hintergrund (Patnik und Liao (1994); und Gosset et al. (1996)), aber mit dem gleichen Plasmid, beobachtet worden. In Wildtyp-Bakterien, NST, steht die DAHP-Produktion im Gleichgewicht mit den Wachstumsanforderungen. Die Einführung des Plasmids pAT1, das für Transketolase und AroGfbr codiert, würde erwarten lassen, dass ein Kohlenstofffluss in Richtung der Bildung von DAHP und in Richtung seiner Akkumulation hervorgerufen wird, wie es bei NSTpAT1 festzustellen ist. Die Zerstörung des csrA-Gens beseitigte diese Akkumulation von DAHP und begünstigte stattdessen die Phenylalanin-Produktion.
Die Vorläufer des Shikimatweges sind ein E4P und zwei PEP-Moleküle. Es war ein Km für PEP von ~5,8 μM für DAHP-Synthasen genannt (AroF und AroG), war aber mit 16 μM für die EPSP-Synthase signifikant höher. Pittard (1996) Cell. Mol. Biol. Vol. 2, 2. Ausgabe, Neidhardt et al. (eds.) American Society for Microbiology, Washington, D.C. Folglich war das erhöhte PEP in den csrA-Mutanten hinreichend für eine vollständige Umwandlung von endogenem DAHP zu EPSP und letzten Endes zu Phenylalanin. Diese Ergebnisse zeigen eine potenzielle Falle zum Messen eines einzelnem Intermediats als einen Hinweis auf einen Stoffwechselweg-Fluss in metabolisch-veränderten Stämmen, wie es oftmals durchgeführt ist. Die Festlegung eines Vorläufers auf einen Biosyntheseweg entspricht nicht notwendigerweise einem Fluss durch den Stoffwechselweg und zum gewünschten Endprodukt.
Wie in 5 gezeigt, war die Phenylalanin-Produktion von Kohlenstoff beeinflusst. Glucose-Konzentrationen von bis zu 0,4% ergaben ein hoch übereinstimmendes Muster der relativen Produktivität für die Stämme: NST < NST[pAT1] < NST CSR < NST CSR[pAT1]. Bei über 0,4% Glucose nahm die Produktivität bei jedem Stamm zu, aber das Muster war weniger regelmäßig. Die Phenylalanin-Synthese in diesen Stämmen führte zu einer Einstellung der Biomasseproduktion, wenn das Kohlenstoffsubstrat limitierend wurde. Bei einem Kohlenstoffeintrag von größer 1 können die Effekte sowohl von der Zerstörung des csrA-Gens als auch von dem Einführen des Plasmids pAT1 durch die höhere Phenylalanin-Produktion erkannt werden. Die produzierte Phenylalanin-Gesamtmenge war bei den höheren Glucose-Konzentrationen größer. Theoretische Betrachtungen zeigen, dass nicht wachsende E. coli maximal 3 mol DAHP/7 mol Glucose (0,43) ohne Regenerierung von Pyruvat zu PEP oder 6 mol/7 mol Glucose mit einer Regenerierung synthetisieren können. Patnaik und Liao (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:3903-3908; und Patnaik et al. (1995) Biotech. Bioeng. 46:361-370. Die Phenylalanin-Synthese erfordert ein weiteres PEP und die maximale theoretische Ausbeute fällt auf 3 mol/10 mol Glucose, oder 6 mol/10 mol Glucose mit Pyruvat-Regenerierung. Eine Substratumwandlung zu Phenylalanin oder Ausbeute erreichte ~43% Gewichts-bezogen in NST CSR[pAT1] bei der kleinsten Glucose-Konzentration (5B) oder ~0,39 mol Phenylalanin/mol Glucose. Folglich war die maximale Phenylalanin-Ausbeute, die in diesen wachsenden (d.h. Biomasse produzierenden) Kulturen festgestellt wurde, größer als das theoretische Maximum, das in einer nicht-wachsenden Kultur (Biokatalysator) ohne Pyruvat-Regenerierung erreichbar ist.
Die Effizienz der Phenylalanin-Produktion über einen Konzentrationsbereich von Glucose ist in 5B gezeigt. Es scheint einen optimalen Bereich zwischen 0,3% und 0,2% Glucose zu geben. Dies liegt dem Wert von 0,375% sehr nahe, bei dem erwartet werden würde, dass Glucose das wachstumslimitierende Substrat werden wird. Die effizienteste Phenylalanin-Produktion erfolgt unter Bedingungen, bei denen Glucose das wachstumslimitierende Substrat ist.
Obwohl die regulatorischen Enzyme, DAHP-Synthase und Chorismat-Mutase, überproduziert sind und gegenüber der Feedback-Hemmung in dem NST-Stamm-Hintergrund desensibilisiert sind, war es doch denkbar, dass die gesteigerte Phenyalanin-Produktion in den csrA-Mutanten durch eine weitere Zunahme dieser regulatorischen Enzyme teilweise hervorgerufen sein kann. Wie in Tabelle 1 unten gezeigt, waren in der Tat die spezifischen Aktivitäten dieser Enzyme in csrA-Mutanten sowohl bei NST als auch NST[pAT1] und bei csrA-Mutanten von prototrophen E. coli Stämmen (z.B. MG1655) etwas geringer. Folglich beschränkten diese Enzyme nicht den aromatischen Fluss in den NST-Stämmen. Tabelle 1. Regulatorische Enzyme der Phenylalanin-Biosynthese.

^aSpezifische Aktivitäten von Chorismat-Mutase und DAHP-Synthase in NST waren 447 ± 70 beziehungsweise 103 ± 15 μMol/min mg Protein. Relative spezifische Aktivitäten von Chorismat-Mutase und DAHP-Synthase waren aus 3 beziehungsweise 4 unabhängigen Bestimmungen gemittelt.

Um den Kohlenstofffluss in die erwünschten Produkte noch weiter zu optimieren, ist eine Veränderung von Gluconeogenese, Glycogen-Biosynthese und möglicherweise anderen Wegen erwünscht. Eine Mutation in fbp, das Fructose-1,6-biphosphatase codiert, würde theoretisch einen Verlauf der Gluconeogenese über die Synthese von Fructose-1,6-biphosphat hinaus verhindern. Eine Mutation in glgC (ADP-Glucose-Pyrophosphyrolase) oder glgA (Glycogen-Synthase) verhindert, dass restliche Glucose-Derivate, die aus dem Medium erhalten sind oder im Zellinnern gebildet sind, für die Glycogensynthese genutzt werden. Jede dieser Mutationen sind bereits bekannt und könnten in eine Zelle entweder über eine P1-Transduktion von bestehenden Mutanten eingeführt sein oder neue Mutationen können in geeigneten, im Handel erhältlichen E. coli Stämmen erzeugt werden. Die Synthese von einer erwünschten Aminosäure oder einer anderen aromatischen Verbindung könnte noch weiter durch Einführen von Mutationen gesteigert werden, welche die Synthese einer oder zwei der drei aromatischen Aminosäuren blockieren, was aber voraussetzt, dass die Wachstumsanforderungen von dem Wachstumsmedium erfüllt werden.
Die Hypothese, dass die Produktion eines erwünschten Produkts eines nicht direkt von csrA regulierten Biosyntheseweges durch die Blockierung des Kohlenstoffflusses in einen konkurrierenden Weg hinein erhöht werden kann, der von csrA kontrolliert ist, wurde unter einer Reihe von Wachstumsbedingungen für die Phenylalanin-Produktion getestet.
Die csrA-Mutation leitet den Kohlenstofffluss in die Glycogensynthese um, die mit der Produktion aromatischer Aminosäuren konkurrieren kann. Allerdings beeinflusst die Zerstörung der ADP-Glucose-Phyrophosphorylase- und Glycogensynthase-Gene (glgCA) mit einer polaren Transposon-Insertion nicht die Phenylalanin-Produktion in NST CSR und war in geringem Maße etwas hemmend in NST CSR[pAT1]. Diese Ergebnisse werden durch die Beobachtung erklärt, dass die NST-Stämme, einschließlich der csrA-Mutanten, wenig oder kein Glycogen auf dem modifizierten MOPS-Medium synthetisierten, das für die Phenylalanin-Bestimmungen eingesetzt wurde. Allerdings akkumulierten sie Glycogen unter CsrA-Kontrolle auf Kornberg-Agar und prototrophe Stämme von E. coli akkumulierten Glycogen auf modifiziertem MOPS-Medium. Offensichtlich kann der Glycogen-Biosyntheseweg nicht mit dem Shikimatweg auf MOPS-Medium in diesen veränderten Stämmen konkurrieren.
Obwohl genetische Regulationen bei Veränderungen der Stoffwechselschemata nach unserem Wissen genutzt worden sind, ist dies das erste Beispiel für eine Verwendung eines globalen regulatorischen Weges. Weil globale regulatorische Netzwerke praktisch alle Stoffwechselaktivitäten und Entwicklungswege der Zelle koordinieren, sollten diese wirkungsvollen und leicht zu manipulierenden Systeme attraktive Ziele für eine Stammverbesserung darstellen. In unserem Versuchsansatz wurde ein Effektorprotein zerstört, um die globale Kontrolle zu verändern. Allerdings könnten Sensorproteine, Liganden, Antagonisten (z.B. CsrB) oder andere die Regulation beeinflussende Moleküle als Ziele dienen. Eine Überexpression eines Regulators oder eine Modifikation seiner Spezifität könnte ebenfalls ein Mittel für eine Veränderung der globalen Kontrolle darstellen. Folglich sollte es möglich sein, wichtige physiologische Reaktionen oder Entwicklungsverschiebungen entweder hervorzurufen oder zu blockieren, die Produktausbeuten in verschiedenen Spezies beeinflussen (z.B. Antworten auf Nährstoffmangel, Anaerobiose, Populationsdichte oder Sporula tion Gram-positiver Bakterien). Weil globale Regulatoren zahlreiche Schritte des Stoffwechsels modulieren, kann die genetische Veränderung eines einzigen globalen regulatorischen Gens viele oder alle Reaktionen eines zweckdienlichen Weges verändern. Dies sollte bestimmte Nachteile von Versuchsansätzen umgehen, die sich auf bestimmte Enzyme konzentrieren. Zum Beispiel ist es nicht ungewöhnlich festzustellen, dass mehrere Schritte eines gegebenen Weges den Fluss bestimmen, oder dass die erhöhte Expression eines geschwindigkeitslimitierenden Enzyms einfach die Kontrolle des Flusses zu anderen Schritten des Weges verschiebt. Schließlich üben CsrA und bestimmte andere globale Regulatoren gegensätzliche Wirkungen auf ganz verschiedene Stoffwechselwege aus, was es ermöglicht, durch die Veränderung eines einzigen Gens gleichzeitig einen erwünschten Weg zu verstärken und konkurrierende Wege zu blockieren. Sabnis et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:29096-29104; und Saier et al. (1996) Cell. Molec. Biol. Vol. 2, 2. Ausgabe, Neidhardt et al. (eds.) American Society for Microbiology, Washington, D.C.
Verschiedene Komponenten von NST74 werden nun mit Bezug auf 2 und 3 beschrieben. Wie es ausführlicher beschrieben im '852 Patent dargelegt ist, erfolgt die erhöhte Phenylalanin-Produktion, falls hohe Levels an Feedback-Hemmung desensibilisierter DAHP-Synthase in Kombination mit einer Beseitigung von sowohl reprimierenden als auch hemmenden Kontrollen bei wenigstens dem ersten Schritt in den terminalen Phenylalanin-Wegen vorliegen. Der Fachmann weiß, dass eine Hemmung eines Enzyms sich auf die Verringerung der Enzymaktivität bezieht, während eine Repression der Bildung eines Enzyms sich auf eine Verringerung der Syntheserate eines Enzyms in einem Mikroorganismus bezieht.
Das Wildtyp-E. coli produziert DAHP-Synthase in wenigstens drei Formen, die jeweils einer Feedback-Hemmung durch Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan unterliegen. Es ist festgestellt worden, dass die genetische Ausstattung des Mikroorganismus verändert werden kann, so dass wenigstens eine Form des Enzyms, d.h ein Isoenzym produziert wird, das nicht der Feedback-Hemmung durch eine der drei oben erwähnten Aminosäuren unterliegt. Es ist bevorzugt, dass die Feedback-Hemmung sowohl von Phenylalanin als auch Tyrosin beseitigt wird, die durch eine Mutation ihrer jeweiligen Strukturgene aroG und aroF erreicht werden kann, um die Gene aroG(FBI^®) beziehungsweise aroF(FBI^®) zu ergeben.
Die Bildung der verschiedenen Formen der DAHP-Synthase unterliegt der Repression im Wildtyp-Bakterium als Folge der Produktion eines regulatorischen Proteins von dem Mikroorganismus, das ein Produkt einer Kontrolle oder des regulatorischen Gens tyrR ist. Diese Repression kann durch eine Mutation des Gens tyrR überwunden werden, um die Repression zu beseitigen. Es ist dem Fachmann klar, dass die Erhöhung der Enzymlevels, die unter Verwendung von tyrR-Mutanten erhalten werden, ohne weiteres mit einem alternativen Versuchsansatz erhalten werden können. Ein Beispiel ist die Verwendung von multi-copy-Plasmiden mit den entsprechenden Strukturgenen für die Produktion des Enzyms. Falls das letztere Verfahren angewandt ist, würde die Repression noch immer vorliegen, aber die Enzymlevels können auf einen befriedigenden Level angehoben werden, da die Strukturgene mehrfach vorhanden sind und jedes davon bei der Bildung des erwünschten Enzyms aktiv ist. Alternativ kann die offene codierende Region des Gens von einem heterologen Promotor exprimiert werden, der nicht von TyrR reguliert wird.
Das tyrR-Gen kontrolliert die Produktion zweier Formen der DAHP-Synthase, welche die DAHP-Synthase Phe und DAHP-Synthase Tyr umfassen. Es ist bevorzugt, dass jede Mutation des Kontrollgens tyrR den Effekt haben sollte, eine Repression dieser beiden Formen der DAHP-Synthase zu beseitigen.
Ein erwünschter Mikroorganismus kann die mutierte Form von tyrR, welche eine Repression der Produktion einer der Formen der DAHP-Synthase beseitigt, wie die Produktion der DAHP-Synthase Phe, oder multi-copy-Plasmide, welche die Strukturgene für die Produktion der anderen Formen des Enzyms enthalten, wie auch Plasmide, die das aroF enthalten, das die DAHP-Synthase Tyr codiert (oder weitere bekannte Mechanismen einer erhöhten Expression des Gens, z.B. über einen Promotor etc.), besitzen.
Wie in 3 gezeigt, produziert Wildtyp-E. coli das Enzym Chorismat-Mutase-P-Prephenatdehydratase (CMP-PDH), das die ersten beiden Schritte im terminalen Syntheseweg katalysiert, der Phenylalanin aus Chorismat produziert. Dieses Enzym im Wildtyp-Mikroorganismus unterliegt einer Phenylalanin-Hemmung. Dieses Enzym ist von dem Strukturgen pheA codiert und eine Mutation dieses Gens zu pheA(FBI^®) ermöglicht dem Organismus, das Enzym in einer Form zu produzieren, die nicht dieser Feedback-Hemmung durch Phenylalanin unterliegt.
Die Bildung von CMP-PDH unterliegt einer Repression im Wildtyp-E. coli, die auf das Vorhandensein der Kontrollsequenz pheAo zurückzuführen ist. Diese Hemmung kann, wie es oben erklärt worden ist, durch eine Mutation von pheAo oder zum Beispiel durch die Verwendung von pheA-Gene tragenden multi-copy-Plasmiden überwunden werden.
Die Substanzen Erythrose-4-phosphat (E4P) und Phosphoenolpyruvat (PEP) und das Zwischenprodukt Shikimat sind Vorläufer-Metaboliten für die Produktion von Chorismat. Ein weiteres Zwischenprodukt bei der Bildung von Chorismat ist Shikimat-3-phosphat, das aus Shikimat in einer von dem Enzym Shikimatkinase katalysierten Reaktion gebildet wird. Die Produktion des Enzyms Shikimatkinase unterliegt einer Repression, die das Produkt des Gens tyrR in einer oben dargestellten Weise bezüglich der Repression der Bildung von DAHP-Synthase Phe und DAHP-Synthase Tyr mit einschließt. Diese Repression kann entweder durch eine zerstörende Mutation in tyrR, mit oder ohne einer gleichzeitigen Wirkung auf die Repression eines oder mehrerer DAHP-Synthase-Isoenzyme, oder zum Beispiel durch die Verwendung von multi-copy-Plasmiden umgangen werden.
In bevorzugten Anwendungsformen dieser Erfindung, die sich auf die Phenylalanin-Produktion beziehen, können die Mikroorganismen gemäß dieser Erfindung außerdem modifiziert sein, um die Stoffwechselwege zu blockieren, die vom Chorismat zu anderen Endprodukten als Phenylalanin führen. Eine Mutation in dem Gen tyrA kann die Produktion von Tyrosin aus Chorismat blockieren, während eine Mutation in trpE die Produktion von Tryptophan blockieren kann.
Die erhöhte Verfügbarkeit von PEP, die der Zerstörung des csrA-Gens zuzuschreiben ist, kann in Kombination mit einem genetischen Element, das die E4P- Produktion erhöht, verwendet sein. Der resultierende veränderte Mikroorganismus wird für einen Kohlenstofffluss durch EPSP und Chorismat (WEG A) oder einen Kohlenstofffluss über eine frühere Verzweigungsstelle, die vor EPSP liegt (WEG B), weiter optimiert. Siehe 1. Zum Beispiel 3-Dehydroshikimat; 3-Dehydroshikimat ist die Verzweigungsstelle für den Kohlenstofffluss zu Protocatechuat für Catechin oder verwandte Produkte. Im letzteren Fall wird eine übermäßige Verfügbarkeit von PEP, das anderweitig in einer zweiten Kondensationsreaktion mit Shikimat-3-phophat Verwendung findet, durch eine weiter zunehmende E4P- und DAHP-Produktion abgefangen. Zum Beispiel durch eine Zunahme der Expression von Transketolase beziehungsweise DAHP-Synthase und anderer einschlägiger Enzyme, wie erforderlich, z.B. 3-Hydrochinat-Synthase und 3-Dehydrochinat-Dehydratase.
In diesem Zusammenhang, abhängig von der Verzweigungsstelle zu Weg B, wäre es nicht erforderlich oder erwünscht, die Shikimatkinase wie im Falle von Weg A zu dereprimieren (Fluss durch EPSP). Mechanismen für die Blockierung des Weges könnten implementiert werden. Zum Beispiel könnte das AroE-Gen in einer in der Technik bekannten Weise mutiert werden, um den Fluss oberhalb von 3-Dehydroshikimat zu blockieren und den Mikroorganismen in einem aromatische Aminosäuren enthaltenden komplexen Medium wachsen zu lassen. Es ist zu verstehen, dass aufgrund des vergleichsweise geringen Km der EPSP-Synthase im Verhältnis zur DAHP-Synthase eine erhöhte Menge an PEP natürlicherweise zu DAHP fließen würde und von der Repression oder Derepression der Shikimat-Dehydrogenase nicht grundlegend beeinflusst wäre. Nichtsdestotrotz kann eine optimierte Strategie, die keine spezifischen Blockierungen in diesem Weg mit einbezieht, Auswirkungen auf die Wahl von implementierenden tyrR-Mutationen haben, soweit sie sich stark auf die Derepression der Shikimatkinase auswirken. Im Gegenteil, eine Beseitigung der Feedback-Hemmung und Repression der DAHP-Synthase wäre für einen weiteren Verlauf entweder über WEG A oder B wichtig.
Dementsprechend definieren Weg A und B alternative Versuchsansätze zum Gewinnen des überschüssigen PEP, entweder in Gestalt von EPSP oder in Gestalt von noch größeren Mengen an DAHP und seinen EPSP vorausgehenden Derivaten. Für eine praktische Anwendung von WEG B, siehe speziell beispielsweise U.S. Patent, Nr. 5.798.236, das sich auf die Produktion von Chininsäure bezieht und nur den Kohlenstofffluss durch Dehydrochinat offen legt, wobei der Shikimatweg durch Eliminierung oder Hemmung der Dehydrochinat-Dehydratase blockiert ist. In diesem Zusammenhang besteht ein Bezug zu U.S. Patenten, Nr. 5.272.07, 5.847.987, 5.616.496, 5.629.181, die sich auf die Herstellung verschiedener Produkte beziehen, wie Catechin, Adipinsäure und Chininsäure. Hinsichtlich Weg A gibt es ebenfalls einen Bezug zu U.S. Patent, Nr. 5.939.295, das sich auf die Herstellung von Tryptophan bezieht.
In einer bevorzugten Anwendungsform der Erfindung, die sich auf die zu Chorismat führende EPSP-Produktion bezieht, ist es erwünscht, die Mutationen von tyrR und aroF und vorzugsweise beide AroF (FBI^®) AroG (FBI^®) Mutanten einzusetzen. Alternativ könnten zum Beispiel multi-copy-Plasmide sowohl für die DAHP-Synthase als auch Shikimatkinase anstelle einer tyrR-Mutation eingesetzt sein. Für eine Phenylalanin-Produktion sind Mutationen in pheA und pheAo zusätzlich erwünscht. Demgemäß ist NST74 für die Phenylalanin-Produktion bevorzugt.
Die TR1-5-Mutation oder beliebig andere Mutationen, die csrA inaktivieren oder herabregulieren, können verwendet sein, um PEP-Levels zu erhöhen, was zu einer erhöhten Synthese der erwünschten Endprodukte führt. Andere Möglichkeiten für eine Herabregulierung von csrA umfassen eine Regulation durch das csrB-Gen, wie es ausgiebiger in EP-Anmeldung, Nr. 98933282.0; und Romeo (1998) Mol. Microbiol. 29:1321-1330 beschrieben ist, und Antisense-Nukleinsäuren mit der Fähigkeit, spezifisch an csrA-Nukleotidsequenzen zu binden. Siehe z.B. EPO-Publikation 431523A2.
Geeignete Kulturbedingungen
Die Produktion von Phenylalanin (siehe in Beispiel 1 beschriebene Verfahren), unten in Beispiel 1 beschrieben, schwankte mit der Verfügbarkeit des Kohlenstoffsubstrats.
Geeignete Kohlenstoffquellen und andere Nährstoffanforderungen können durch den Genotyp des Wirtsorganismus eingeschränkt sein. Schemata für eine Bewertung und Optimierung geeigneter Kulturbedingungen sind dem Fachmann wohl vertraut.
Allgemeine Beschreibung der Techniken
Sofern nicht anders angegeben, verwendet die Durchführung und die Anwendung der hier beschriebenen Erfindung Techniken, die dem Fachmann wohl vertraut sind und/oder in Handbüchern, wissenschaftlichen Abhandlungen und anderen Quellen gut beschrieben sind und für diese Personen ohne weiteres verfügbar sind und von ihnen verstanden werden.
Techniken für die Manipulation von Nukleinsäuren sind allgemein, zum Beispiel in Sambrook et al. (1989) oder Ausubel et al. (1987), beschrieben. Reagenzien, die bei einer Anwendung derartiger Techniken zweckdienlich sind, wie Restriktionsenzyme und ähnliches, sind in der Technik weit bekannt und im Handel von Lieferanten erhältlich, einschließlich, aber hierauf nicht beschränkt, New England BioLabs, Boehringer Mannheim, Amersham, Promega Biotec, U.S. Biochemicals, New England Nuclear und einer Reihe weiterer Quellen.
Sonden, Primer und Antisense-Nukleinsäuren
Nukleinsäuresonden und Primer, die auf csrA-Sequenzen basieren, können mit Standardtechniken hergestellt sein. Eine derartige Sonde oder ein derartiger Primer umfasst eine isolierte Nukleinsäuresequenz. Im Falle von Sonden umfasst die Nukleinsäure außerdem eine Markierung (z.B. ein Radionuklid, wie ³²P oder ³⁵S) oder ein Reportermolekül (z.B. einen Liganden, wie Biotin, oder ein Enzym, wie Meerrettichperoxidase). Sonden können zur Identifizierung des Vorhandenseins einer hybridisierenden Nukleinsäuresequenz, z.B. einer csrA mRNA in einer Probe oder einer cDNA oder eines genomischen Klons in einer Bibliothek, verwendet sein. Primer können zum Beispiel für die Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen, z.B. mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), verwendet sein. Siehe z.B. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis, M., et al., eds., Academic Press: San Diego (1990). Die Präparation und Verwendung von Sonden und Primern sind in Sambrook et al. (1989) oder Ausubel et al. (1987) beschrieben.
Nukleinsäuren können in größeren Mengen mittels Replikation eines geeigneten rekombinanten Vektors in einer kompatiblen Wirtszelle produziert sein. Alternativ können diese Moleküle chemisch synthetisiert sein, z.B. mit Hilfe eines beliebigen, in der Technik bekannten Verfahrens, einschließlich, aber hierauf nicht beschränkt, der Phosphoramidit-Methode, die von Beaucage und Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22:1859-1862 beschrieben ist, und der Triester-Methode nach Matteucci et al. (1981) J. Am. Chem. Soc. 103:3185, vorzugsweise mit Hilfe im Handel erhältlicher automatischer Synthetisierer.
DNA-Konstrukte, die für eine Einführung in einen prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt präpariert sind, umfassen üblicherweise ein vom Wirt erkanntes Replikationssystem, welches das erwünschte DNA-Fragment umfasst, welches das erwünschte Polypeptid codiert, und vorzugsweise ebenfalls regulatorische Sequenzen der Transkription und Translationsinitiation umfasst, die an das Polypeptid codierenden Abschnitt funktionsfähig geknüpft sind. Expressionsvektoren können zum Beispiel einen Replikationsursprung oder autonom replizierende Sequenzen (ARS) und Expressionskontrollsequenzen, einen Promotor, einen Enhancer und notwendige Processing-Informationsstellen, wie Ribosom-bindende Stellen, Transkriptionsterminationssequenzen, und mRNA stabilisierende Sequenzen umfassen. Sekretionssignale von zu sezernierenden Polypeptiden können ebenfalls enthalten sein, um dem Polypeptid ein Durchqueren und/oder Aufenthalt in Zellmembranen oder eine Sekretion von der Zelle zu erlauben. Derartige Vektoren können mit Hilfe rekombinanter Standardtechniken hergestellt sein, die zum Beispiel in Sambrook et al. (1989) oder Ausubel et al. (1987) diskutiert sind.
Einen geeigneten Promotor und andere erforderliche Vektorsequenzen sind so ausgewählt, dass sie im Wirt funktionsfähig sind und, wenn geeignet, sie diejenigen umfassen können, die mit den csrA-Genen natürlicherweise assoziiert sind. Beispiele für funktionsfähige Kombinationen von Zelllinien und Expressionsvektoren sind in Sambrook et al. (1989) oder Ausubel et al. (1987) beschrieben; siehe ebenfalls Metzger et al. (1988) Nature 334:31-36. Viele zweckdienliche Vektoren sind in der Technik bekannt und können von Lieferanten erhalten werden, einschließlich, aber hierauf nicht beschränkt, Stratagene, New England BioLabs, Promega Biotech und weitere.
Promotoren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf trp, lac und PhagenPromotoren, tRNA-Promotoren und Promotoren für glycolytische Enzyme können in pro karyotischen Wirten Verwendung finden. Während Expressionsvektoren vorzugsweise autonom replizierend sind, können sie auch in das Genom der Wirtszelle mit Hilfe in der Technik bekannter Verfahren inseriert sein. Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten vorzugsweise einen selektierbaren Marker, der ein Gen ist, das ein für das Überleben oder Wachsen einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle erforderliches Protein codiert. Das Vorhandensein dieses Gens stellt das Wachstum ausschließlich derjenigen Wirtszellen sicher, welche die Inserts exprimieren. Übliche Gene zur Selektion sind in der Technik bekannt und umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, Gene, die Proteine codieren, die (a) eine Resistenz gegen Antibiotika oder andere toxische Substanzen verleihen, z.B. Ampicillin, Tetracyclin, Kanamycin, Chloramphenicol, etc.; (b) auxotrophe Mängel komplementieren oder (c) wichtige Nährstoffe liefern, die in komplexen Medien nicht enthalten sind, z.B. das Gen, das D-Alanin-Razemase für Bacilli codiert. Die Wahl des geeigneten selektierbaren Markers hängt von der Wirtszelle ab und geeignete Marker für verschiedene Wirtszellen sind bekannt.
Die genetischen Elemente der vorliegenden Erfindung können in die Wirtszellen mit Hilfe eines beliebigen, in der Technik bekannten Verfahrens eingeführt sein. Derartige Elemente hängen von der Art der Wirtszelle ab und umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, Elektroporation, Transfektion mit Hilfe von Calciumchlorid, Rubidiumchlorid, Calciumphosphat, DEAE-Dextran oder anderen Substanzen; Mikroprojektil-Bombardement; Lipofektion; Infektion (wo der Vektor ein infektiöses Agens ist, wie ein retrovirales Genom) und andere Verfahren. Siehe allgemein Sambrook et al. (1989) und Ausubel et al. (1987). Die Zellen, in die diese Nukleinsäuren eingeführt worden sind, umfassen ebenfalls die Nachkommen dieser Zellen.
Mutationen können von einem Bakterienstamm zu einem anderen mittels Transduktion unter Verwendung von z.B. plvir übertragen werden, wie es für csrA::kanR im '144 Patent beschrieben ist.
Die folgenden Beispiel sollen die Erfindung erläutern und nicht beschränken.
Beispiel 1
Erhöhte Phenylalanin-Produktion
Der E. coli K-12 Stamm NST 74 (ATCC 31884) oder NST besaß den folgenden relevanten Genotyp: aroF394 aroG397 tnR366 pheA101 pheO352 malT384. U.S. Patent Nr. 4.681.852. Die Bezeichnung CSR gibt an, dass das Wildtyp csrA-Allel mit csrA::kanR unter Verwendung einer P1 vir-Transduktion ersetzt war. Romeo et al. (1993) J. Bacteriol. 175:4744-4755; und das '144 Patent. Das Plasmid pAT1 enthielt das Transketolase codierende tktA und aroG^fbr, das über zwei hintereinanderliegende lac-Promotoren exprimiert wurde und ein großzügiges Geschenk von James C. Liao (University of California, Los Angeles) war. U.S. Patent, Nr. 5.906.925; 5.985.617; 5.168.056 und 5.776.736; Patnaik et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:3903 und Patnaik et al. Biotech. Bioeng. 46:361-370.
Übernachtkulturen wurden in LB-Medium angezogen. Miller (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. Für alle Experimente wurden die Übernachtkulturen zum Beimpfen (mit 1:100 Verdünnung) eines chemisch definierten Mediums, MOPS (12), verwendet, das modifiziert war und 1,32 mM KH₂PO₄, 7,125 mM NH₄Cl, 2 mg/ml Thiamin und 0,2% Glucose enthielt, außer anderes ist angegeben. Das Wachstum in diesem Medium sollte aufgrund der Verfügbarkeit von Phosphat limitiert sein. Batch-Kulturen wuchsen bei 37°C und Rotationsrühren mit 250 rpm. Die pAT1 enthaltenden Stämme wuchsen unter antibiotischer Selektion mit Chloramphenicol mit 20 μg/ml. Das Koloniewachstum für die Detektion endogenen Glykogens erfolgte auf Kornberg-Medium. Liu et al. (1995) J. Bacteriol. 177:2663-2672.
Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden die Kulturen für eine Bestimmung der Phenylalanin-Produktion oder des Glucose-Verbrauchs zentrifugiert, um die Zellen zu entfernen, und die Überstände wurden entweder sofort untersucht oder gefroren aufbewahrt (–20°C). Die Bestimmung von Glucose erfolgte mit der Methode von Dubois et al. (1956) Anal. Chem. 18:350-356 und Phenylalanin wurde mit HPLC untersucht. Proben, die auf Gesamtprotein und DAHP untersucht werden sollen, wurden mit Trichloressigsäure (TCA) in einer Endkonzentration von 10% behandelt und bis zur Analyse gefroren aufbewahrt (–20°C). Protein in den TCA-Präzipitaten wurde mittels Zentrifugation gesammelt und mit dem Bicinchoninsäure-Vertahren unter Ver wendung von bovinem Serumalbumin als Standard quantifiziert. Smith et al. (1985) Anal. Biochem. 150:76-85. DAHP im Überstand wurde mit der Thiobarbitursäure-Methode untersucht. Halbquantitatives Färben von Glycogen in Kolonien mit loddampf wurde, wie bereits beschrieben, durchgeführt. Liu et al. (1995). Die analytische HPLC wurde auf einem Rainin Rabbit System durchgeführt, das mit einem Knauer UV-Detektor (Rainin Instrument Co, Woburn, MA) ausgestattet war. Die Trennung von Phenylalanin wurde unter Verwendung einer Supelco Sil LC 18 Säule (4,6 × 250 mm) (Supelco Inc., Bellefonte, PA) mit einer isokratischen Elution mit 1,0 ml/min in 40% Methanol in Wasser, das 0,2% Trifluoressigsäure enthielt, durchgeführt.
Zellen für eine Enzymanalyse wurden aus 1I Kulturen mittels Zentrifugation in der mittleren exponentiellen Wachstumsphase geerntet und bei –80°C aufbewahrt. Die Zellen wurden aufgetaut, mittels Beschallung in wenigstens 4-fachem Überschuss an Phosphatpuffer (100 mM, pH 6,4) lysiert und die Zelltrümmer wurden mittels Zentrifugation entfernt. Das zellfreie Präparat wurde auf Gesamtaktivität der Chorismat-Mutase (Dopheide et al. (1972) J. Biol. Chem. 247:4447-4452) und DAHP-Synthase (Doy und Brown (1965)) getestet. Werte der Enzymaktivitäten wurden innerhalb des linearen Bereichs bezogen auf die Menge an zugegebenem Zellextrakt bestimmt.
Die Konzentration von Phosphoenolpyruvat (PEP) wurde mit dem von Lamprecht und Heinz (1988) In, Methods of Enzymatic Analysis, Vol. VI, Bergmeyer et al. Eds. VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Bundesrepublik Deutschland, Seiten 555-561, beschriebenen Verfahren bestimmt. Bakterienmasse (0,25 ml) wurde mittels Beschallung in Gegenwart von 1,0 M Perchlorsäure (0,5 ml) extrahiert, die lösliche Fraktion wurde mittels Zentrifugation gesammelt und die Prozedur diesesmal mit 0,25 ml Perchlorsäure wiederholt. Das Gesamtvolumen eines jeden Extrakts betrug 1,0 ml. Die löslichen Gesamtextrakte wurden mit einer minimalen Menge Kaliumcarbonat neutralisiert und 0,5 ml wurde auf PEP mit Hilfe einer gekoppelten Reaktion von Pyruvatkinase und anschließend Lactatdehydrogenase getestet. Der Test maß die Abnahme der Absorption bei 339 nm aufgrund der Oxidation von NADH (Molar = 6290).
Obwohl die vorangehende Erfindung mit Hilfe von Abbildungen und Beispielen zum Zwecke von Klarheit und Verständnis detailliert beschrieben worden ist, ist es dem Fachmann offensichtlich, dass bestimmte Modifikationen daran vorgenommen werden können. Deshalb sollten die Beschreibung und Beispiele nicht als eine Beschränkung des Rahmens der Erfindung aufgefasst werden, der durch die anhängigen Ansprüche beschrieben ist.

Claims

Mikroorganismus, umfassend ein erstes genetisches Element, welches die verfügbare Menge an funktionellem CsrA-Protein herabsetzt, und ein zweites genetisches Element, welches die Menge an D-Erythrose-4-phosphat (E4P) erhöht, wobei der Mikroorganismus genetisch angepasst ist, um, unter geeigneter Nährstoffzufuhr, ausreichende Mengen an Phosphoenolpyruvat (PEP) zu produzieren, um E4P zu 3-Desoxy-D-arabino-heptulosonat-8-phosphat (DAHP) und das resultierende Shikimat-3-phosphat zu 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat (EPSP) umzuwandeln.
Mikroorganismus nach Anspruch 1, welcher genetisch angepasst ist, um eine ausreichende Menge an PEP zu produzieren, um E4P zu DAHP und das resultierende Shikimat-3-phosphat zu EPSP unter Bedingungen einer erhöhten Produktion oder nicht-beschränkender Mengen an DAHP-Synthase und anderer Enzymen, die in der Synthese von Verbindungen beteiligt sind, die Intermediate im Weg zwischen DAHP und EPSP darstellen, umzuwandeln.
Mikroorganismus nach Anspruch 1 oder 2, der zur Spezies E. coli gehört.
Mikroorganismus nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das zweite genetische Element ein Plasmid ist, das das Transketolasegen (tktA) codiert.
Mikroorganismus nach einem der vorangehenden Ansprüche, umfassend ein zusätzliches genetisches Element, welches ein Isozym der DAHP-Synthase Feedback-dereprimiert und/oder welches die Expression von DAHP-Synthase erhöht.
Mikroorganismus nach einem der vorangehenden Ansprüche, umfassend ein erstes zusätzliches genetisches Element, das die Menge an Shikimatkinase erhöht.
Mikroorganismus nach Anspruch 5 oder 6, worin das zusätzliche genetische Element AroF (FB1), AroG (FB1) oder eine tyrR-Mutante ist.
Mikroorganismus nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Nährstoffzufuhr Glucose als einer primären Kohlenstoffquelle umfasst oder in welcher Glucose in einer Menge zwischen 0,2% und 0,4% vorhanden ist.
Mikroorganismus nach einem der vorangehenden Ansprüche, umfassend ein zweites zusätzliches genetisches Element, das Chorismat-Mutase-P-Prephenat-Dehydratase (CMP-PDH) dereprimiert.
Mikroorganismus nach Anspruch 6 oder 9, welches CMP-PDH Feedbackdereprimiert.
Mikroorganismus nach Anspruch 9 oder 10, worin das zweite zusätzliche genetische Element eine pheAo-Mutante oder pheA (FBI) ist.
Mikroorganismus nach einem der vorangehenden Ansprüche, welcher genetisch angepasst ist von dem Stamm NST 74, bezeichnet als ATCC 31884, dem Mutantenstamm von E. coli NST 37 und bezeichnet als ATCC 31882 oder dem Mutantenstamm von E. coli NST 70 und bezeichnet als ATCC 31883.
Mikroorganismus nach Anspruch 1, welcher ein Stamm von E. coli mit einer veränderten Produktion von 3-Desoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphatase (DAHP)-Synthase und Chorismat-Mutase-P-Prephenat-Dehydratase (CMP-PDH) ist, worin i) die DAHP-Synthase keiner Feedback-Hemmung durch Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan unterliegt, die innerhalb des Mikroorganismus' vorhanden sind, und die DAHP-Synthase entweder a) keiner Repression durch Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan unterliegt; oder b) in größeren Mengen produziert wird als sie durch Wildtyp-E. coli produziert wird; oder ii) die CMP-PDH keiner Feedback-Hemmung durch Phenylalanin unterliegt und die CMP-PDH entweder a) keiner Repression durch Phenylalanin unterliegt; oder b) in größeren Mengen produziert wird als sie durch Wildtyp-E. coli produziert wird.
Mikroorganismus nach Anspruch 1, welcher ein Stamm von E. coli mit einer veränderten Produktion von Shikimatkinase ist, worin i) die Shikimatkinase nicht durch Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan reprimiert wird; oder ii) die Menge an produzierter Shikimatkinase größer ist als die durch ein Wildtyp-E. coli produzierte Menge.
Mikroorganismus nach Anspruch 1, welcher ein Stamm von E. coli ist und worin: a) die DNA des Mikroorganismus so konstruiert ist, dass die DAHP-Synthase des Mikroorganismus desensibilisiert ist gegenüber der Hemmung sowohl durch Phenylalanin als auch Tyrosin; b) die Bildung der DAHP-Synthase im Mikroorganismus desensibilisiert ist gegenüber der Repression durch die Mutation des Kontrollgens tyrR des Mikroorganismus; und/oder c) die Stoffwechselwege des Mikroorganismus durch die Mutation des Gens tyrR zur Blockierung der Produktion von Tyrosin oder die Mutation des Gens trpE zur Blockierung des Produktion von Tryptophan blockiert sind.
Mikroorganismus nach Anspruch 1, 5 oder 12, welcher ein Stamm von E. coli ist, umfassend multi-copy-Plasmide, wobei jedes der multi-copy-Plasmide ein Strukturgen für die Produktion von wenigstens einem Mitglied der Gruppe, bestehend aus DAHP-Synthase, CMP-PDH und Shikimatkinase, aufweist.
Mikroorganismus, der genetisch angepasst ist, um eine erhöhte Menge an Produkt zu produzieren, das aufgebaut ist aus Kohlenstoffquellen, die durch den Shikimatweg über EPSP fließen, welcher Mikroorganismus genetische Elemente umfasst, ausgewählt aus zumindest den folgenden: a) einem ersten genetischen Element, welches die Menge an funktionellem CsrA-Protein herabsetzt; b) einem zweiten genetischen Element, welches die Menge an E4P erhöht; c) einem oder mehreren zusätzlichen genetischen Elementen, deren Feedback ein oder mehrere Isozyme der DAHP-Synthase dereprimiert; d) einem oder mehreren zusätzlichen genetischen Elementen, welche die Menge an DAHP-Synthase erhöhen; e) einem oder mehreren zusätzlichen genetischen Elementen, welche die Menge an Shikimatkinase erhöhen; und f) einer Mutation im tyrR-Gen; wobei der Mikroorganismus wenigstens die ersten und zweiten genetischen Elemente umfasst.
Mikroorganismus, der genetisch angepasst ist, um erhöhte Mengen an Verbindungen zu produzieren, die durch den „common aromatic pathway" zu einer Zielverbindung fließen, die ein Intermediat im Weg zwischen DAHP und EPSP ist, welcher Mikroorganismus ein erstes genetisches Element, das die Menge an funktionellem CsrA-Protein herabsetzt, und ein zweites genetisches Element um fasst, welches die Menge an E4P erhöht, wobei der Mikroorganismus zum Kanalisieren von überschüssigem PEP in die Produktion der Zielverbindung unter Bedingungen erhöhter oder nicht-beschränkender Mengen an E4P, DAHP-Synthase und vorzugsweise anderer Enzyme innerhalb des Wegs, der zu der Zielverbindung führt, angepasst ist.
Verfahren zur Produktion von Phenylalanin, umfassend die Schritte des Züchtens eines Stamms von E. coli in einem Medium, das eine Kohlenstoffquelle enthält, und Rückgewinnens des Phenylalanins, wobei der Stamm von E. coli Folgendes aufweist: a. ein erstes genetisches Element, welches CsrA-Protein vermindert; b. ein zweites genetisches Element, welches D-Erythrose-4-phosphat (E4P) erhöht; und c. eine veränderte Produktion von 3-Desoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphat (DAHP)-Synthase und Chorismat-Mutase-P-Prephenat-Dehydratase (CMP-PDH), worin i) die DAHP-Synthase keiner Feedback-Hemmung durch Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan unterliegt, die innerhalb des Mikroorganismus' vorhanden sind, und die DAHP-Synthase entweder a) keiner Repression durch Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan unterliegt; oder b) in größeren Mengen produziert wird als sie durch Wildtyp-E. coli produziert wird; und ii) die CMP-PDH keiner Feedback-Hemmung durch Phenylalanin unterliegt und die CMP-PDH entweder a) keiner Repression durch Phenylalanin unterliegt; oder b) in größeren Mengen produziert wird als sie durch Wildtyp-E. coli produziert wird.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Kohlenstoffquelle Glucose, Glycerol, Xylose, Maltose, Lactose, Lactat oder Essigsäure umfasst, oder der DNA-Mikroorganismus weiter modifziert worden ist, um die Produktion aus Chorismat von anderen Endprodukten als Phenylalanin zu verhindern.
Verfahren zur Produktion einer erhöhten Menge an Stoffwechselprodukten des Shikimatwegs einschließlich EPSP und vorzugsweise Chorismat durch Züchten, unter geeigneten Kulturbedingungen, insbesondere geeigneten Nährstoff-Bedingungen, eines Mikroorganismus, umfassend ein genetisches Element, welches die Menge an verfügbarem csrA-Genprodukt herabsetzt, und ein genetisches Element, welches einen Anstieg der Menge an E4P bewirkt, wobei der Mikroorganismus genetisch angepasst ist, um ausreichende Mengen an PEP zu produzieren, um E4P zu DAHP umzuwandeln und um resultierendes Shikimat-3-phosphat zu EPSP umzuwandeln.
Verfahren zur Produktion erhöhter Mengen an an Verbindungen, die durch den „common pathway" zu einer Zielverbindung fließen, welche ein Intermediat im Weg zwischen DAHP und EPSP ist, durch Züchten, unter geeigneten Nährstoffbedingungen, eines Mikroorganismus, umfassend ein erstes genetisches Element, welches die Menge an funktionellem CsrA-Protein herabsetzt, und ein zweites genetisches Element, welches die Menge an E4P erhöht, wobei der Mikroorganismus zum Kanalisieren von überschüssigem PEP in die Produktion der Zielverbindung unter Bedingungen einer erhöhten Produktion oder nicht-beschränkender Mengen an E4P, DAHP-Synthase und wahlweise anderer Enzyme innerhalb des Wegs, der zu der Zielverbindung führt, angepasst ist.
Mikroorganismus, der genetisch angepasst worden ist, um die Synthese von aromatischen Substanzen zu erhöhen, umfassend ein erstes genetisches Element, welches die verfügbare Menge an funktionellem CsrA-Protein herabsetzt, und ein zweites genetisches Element, welches die Menge an D-Erythrose-4-phosphat (E4P) erhöht