DE60011974T2 - Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren mittels Fermentation eines Escherichia Stammes, transformiert mit einem Pyruvat-carboxylase Gen aus Bacillus subtilis - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren mittels Fermentation eines Escherichia Stammes, transformiert mit einem Pyruvat-carboxylase Gen aus Bacillus subtilis Download PDF

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure, insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von L-Threonin, L-Glutaminsäure, L-Homoserin, L-Methionin, L-Arginin, L-Prolin oder L-Isoleucin unter Einsatz eines Bakteriums der Gattung Escherichia.
  • Hintergrund der Erfindung
  • L-Aminosäuren, wie L-Threonin und L-Glutaminsäure sind herkömmlich durch Fermentationsverfahren grundsätzlich unter Einsatz coryneformer Bakterien der Gattung Brevibakterium, Corynebakterium, und von Mikrobakterien oder Mutanten davon hergestellt worden ("Amino Acid Fermentation", Gakkai Shuppan Center, S. 195-215, 1986).
  • Andererseits sind Verfahren zur Züchtung von L-Aminosäure produzierenden Bakterien der Gattung Escherichia unter Einsatz genetischer Rekombinationstechniken offenbart worden.
  • Beispielsweise wurde ein Verfahren zur Produktion von L-Lysin unter Einsatz von Escherichia coli offenbart, worin Gene, die für Dihydrodipicolinatsynthetase und Aspartokinase von der Rückkopplungshemmung durch L-Lysin und L-Threonin befreit sind, und worin Diaminopimelatdehydrogenase (oder Tetrahydrodipicolinatsuccinylase und Succinyldiaminopimelatdeacylase) verstärkt sind (WO 95/16042).
  • Obwohl die Produktivität für L-Aminosäuren durch Züchtung solcher Mikroorganismen, wie vorstehend beschrieben, oder durch Produktionsverfahren verbessert worden ist, besteht immer noch ein Bedarf an der Entwicklung eines effizienteren Verfahrens zur Produktion von L-Aminosäuren, den zukünftig erwarteten erhöhten Bedarf an L-Rminosäuren zu befriedigen.
  • Pyruvatcarboxylase [Pyruvat: Kohlendioxidligase (ADP-bildend), EC 6.4.1.1] ist ein Biotin enthaltendes Enzym. Es katalysiert die Carboxylierung von Pyruvat unter Bildung von Oxalacetat. Pyruvatcarboxylase ist nicht in Escherichia coli bekannt, jedoch haben Bacillus subtilis (Diesterhaft, M. D. and Freese, E., J. Biol. Chem., 248, Nr. 17, 6062-6070 (1973)) und Corynebakterium glutamicum (Peters-Wendisch, P. G. et al., Microbiology, 144, 915-927 (1998)) Pyruvatcarboxylase, und die Nucleotidsequenzen der für diese Enzyme kodierenden Gene sind berichtet worden.
  • Außerdem ist Corynebakterium glutamicum bekannt, worin die Aktivität von Pyruvatcarboxylase verstärkt ist, oder Corynebakterium glutamicum, worin Pyruvatcarboxylasegene inaktiviert sind (Peters-Wendisch, P. G. et al., Microbiology, 144, 915-927 (1998)).
  • WO 99/18228 offenbart die verstärkte Produktion von L-Treonin, L-Homoserin und L-Glutaminsäure durch Überexpression des Pyruvatcarboxylase kodierenden Gens von Corynebakterium glutamicum. WO 99/53035 offenbart, dass die Expression des Pyruvatcarboxylase kodierenden Gens aus Rhizobium etli eine verstärkte Threoninproduktion in Escherichia coli bewirkt.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung wurde ausgehend von dem vorstehenden Beschriebenen gemacht, und die Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure, insbesondere L-Threonin, L-Glutaminsäure oder L-Homoserin in hoher Effizienz zu produzieren.
  • Als Ergebnis eingehender Untersuchungen zur Lösung der vorstehend genannten Aufgabe haben die Erfinder der vorliegenden Er findung gefunden, dass die Einführung eines Gens, das für Pyruvatcarboxylase kodiert (im Folgenden als "pyc-Gen" bezeichnet), in ein Bakterium der Gattung Escherichia die L-Aminosäureproduktivität des Bakteriums verbessern kann. Auf diese Weise wurde die vorliegende Erfindung gemacht.
  • Das heißt, die vorliegende Erfindung betrifft ein Bakterium der Gattung Escherichia, das mit einem Gen, das für Pyruvatcarboxylase kodiert, transformiert ist und L-Aminosäure produziert, worin die Pyruvatcarboxylase die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:4 umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch das vorstehend beschriebene Bakterium bereit, worin das für Pyruvatcarboxylase kodierende Gen von einem Bakterium der Gattung Bacillus abgeleitet ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin das vorstehend beschriebene Bakterium bereit, worin das für die Pyruvatcarboxylase kodierende Gen in das Bakterium in geringer Kopienzahl eingeführt ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem das vorstehend beschriebene Bakterium bereit, worin die L-Aminosäure aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus L-Threonin, L-Glutaminsäure und L-Homoserin besteht.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Produktion einer L-Aminosäure bereit, welches das Kultivieren des vorstehenden Bakteriums in einem Medium, die Produktion und das Akkumulieren der L-Aminosäure in dem Medium und das Gewinnen der L-Aminosäure aus dem Medium umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem das vorstehend beschriebene Verfahren bereit, worin die L-Aminosäure aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus L-Threonin, L-Glutaminsäure und L-Homoserin besteht.
  • Der Ausdruck "L-Aminosäureproduktivität" bedeutet die Fähigkeit, dass ein Bakterium die L-Aminosäure in einem Medium in einer größeren Menge als der entsprechende Wildtypstamm produziert und akkumuliert.
  • Erfindungsgemäß kann die L-Aminosäureproduktivität, wie für L-Threonin, L-Glutaminsäure oder L-Homoserin, in einem Bakterium der Gattung Escherichia verbessert werden. Außerdem kann die vorliegende Erfindung eingesetzt werden, um einen L-Aminosäure produzierenden Stamm der Gattung Escherichia zu züchten.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt ein Schema zur Konstruktion des Bacillus subtilis pycA::KmR-Empfängerstammes zur Klonierung des pycA-Gens.
  • 2 zeigt ein Schema zur Klonierung des pycA-Gens aus Bacillus subtilis 168.
  • 3 zeigt ein Schema zur Konstruktion des Plasmids, welches das pycA-Gen enthält.
  • Genaue Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung wird nachstehend eingehend erklärt.
  • <1> Bakterium der Gattung Escherichia, das mit dem pyc-Gen transformiert ist.
  • Ein Bakterium der Gattung Escherichia gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Bakterium, das mit dem pyc-Gen transformiert ist: Als Bakterium der Gattung Escherichia kann beispielhaft Escherichia coli genannt werden. Während das in der vorliegenden Erfindung eingesetzte pyc-Gen nicht besonders eingeschränkt ist, solange es für ein Protein mit Pyruvatcarboxylaseaktivität kodieren kann, umfassen Beispiele des pyc-Gens das pyc-Gen, das aus Bakterien der Gattung Bacillus abgeleitet ist, oder das pyc-Gen aus coryneformen Bakterien. Die Nucleo tidsequenz des aus Bacillus subtilis abgeleiteten pyc-Gens (Genbank/EMBL/DDBJ Accession Z97025, NID g2224758) und des aus Corynebakterium glutamicum abgeleiteten pyc-Gens (Peters-Wendisch, P. G. et al., Microbiology, 144, 915-927 (1998)) wurden berichtet. Deshalb kann das pyc-Gen durch PCR (polymerase Kettenreaktion: White, T. J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) unter Einsatz von Primern, die gemäß den Nucleotidsequenzen aus der chromosomalen DNA von Bakterien der Gattung Bacillus, wie Bacillus subtilis, oder von coryneformen Bakterien, wie Corynebakterium glutamicum, synthetisiert wurden, als Matrize erhalten werden.
  • Eine Transformante von Escherichia coli 44/pMW119-pycA, welches das Plasmid pMW119-pycA enthält, welches das pyc-Gen von Bacillus subtilis trägt, ist in der Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) Depositary, GNIIgenetika; 1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Moskau, Russland, am 30. August 1999 unter der Hinterlegungsnummer VKPM B-7822 hinterlegt worden und am 1. September 2000 aus der ursprünglichen Hinterlegung in eine internationale Hinterlegung gemäß dem Budapester Vertrag überführt worden.
  • Eine Transformante von Escherichia coli MG442/pMW119-pycA, welche das Plasmid pMW119-pycA trägt, welches das pyc-Gen von Bacillus subtilis enthält, ist in der Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) Depositary, GNIIgenetika; 1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Moskau, Russland, am 30. August 1999 unter der Hinterlegungsnummer VKPM B-7821 hinterlegt worden und am 1. September 2000 aus der ursprünglichen Hinterlegung in eine internationale Hinterlegung gemäß dem Budapester Vertrag überführt worden.
  • Übrigens ist das Gen, das für die Pyruvatcarboxylase aus Bacillus subtilis kodiert (pycA-Gen), wie nachstehend beschrie ben in einem Verfahren zur Durchführung der vorliegenden Erfindung kloniert worden.
  • Zunächst wurde ein Stamm von Bacillus subtilis, der das pycA-Gen nicht enthielt, konstruiert. Dann wurde unter Verwendung des Stammes als Empfänger das pycA-Gen durch Isolieren eines DNA-Fragments, welches die Citrat- oder Aspartatauxotrophie des Stammes komplementiert, aus einer genomischen DNA-Bibliothek eines Wildtypstammes von Bacillus subtilis kloniert. Da Bacillus subtilis Oxalacetat durch Pyruvatcarboxylase bildet, kann Bacillus subtilis auf einem Minimalmedium nicht wachsen, wenn es dieses Enzym nicht enthält. Das Wachstum wird jedoch durch Zugabe von L-Aspartat, L-Glutamat, Citrat oder Succinat wieder hergestellt. Die Nucleotidsequenz des pycA-Gens und die Aminosäuresequenz, die durch dieses Gen kodiert wird, sind in den SEQ ID NO: 3 und 4 gezeigt.
  • Der Stamm, der das pycA-Gen nicht enthält, wird beispielsweise wie nachstehend beschrieben erhalten. Ein Teil-DNA-Fragment des ylaP-Gens, das unmittelbar nach dem pycA-Gen auf dem Chromosom liegt, wird durch PCR erhalten. Als Primer für die PCR können beispielsweise Oligonucleotide der SEQ ID NO: 1 und 2 eingesetzt werden. Dann wird ein Wildtypstamm von Bacillus subtilis mit einer Plasmid-DNA, die das erhaltene DNA-Fragment und ein Markergen enthält, transformiert, und danach wird die Plasmid-DNA in das ylaP-Gen auf der chromosomalen DNA durch homologe Rekombination integriert. Dann wird eine chromosomale DNA-Bibliothek des erhaltenen Stammes unter Einsatz eines Restriktionsenzyms konstruiert, welches eine Restriktionsschnittstelle innerhalb des pycA-Gens erkennt, beispielsweise PstI. Das rekombinante Plasmid, welches das Markergen und das Teil-pycA-Genfragment enthält, kann durch Transformieren eines Wildtypstammes von Bacillus subtilis mit der Bibliothek und durch Selektieren von Klonen, die das Markergen exprimieren, erhalten werden. Dann wird ein Wildtypstamm von Bacillus sub tilis mit dem linearisierten rekombinanten Plasmid transformiert, und Klone, die das Markergen exprimieren, werden selektiert, wobei ein Stamm, der das pycA-Gen nicht enthält und worin die Plasmid-DNA in das pycA-Gen auf der chromosomalen DNA des Stammes integriert ist, selektiert wird.
  • Die Transformation eines Bakteriums der Gattung Escherichia mit dem pyc-Gen kann durch Einführen des pyc-Gens in einen geeigneten Vektor, der in einem Bakterium der Gattung Escherichia funktionsfähig ist, zur Konstruktion eines rekombinanten Vektors und durch Einführen des rekombinanten Vektors in ein Bakterium der Gattung Escherichia durchgeführt werden.
  • Der Vektor ist beispielsweise ein Plasmid, wie pBR322, pMW118, pMW119, pUCl8, pUCl9 oder dergleichen, ein Phagenvektor, wie λ1059, λBF101, M13mp9 oder dergleichen, und ein Transposon, wie Mu, Tn10, Tn5 oder dergleichen. In der vorliegenden Erfindung ist jedoch ein Plasmid mit geringer Kopienzahl, wie pMW118 und pMW119, bevorzugt, weil eine den Vektor tragende Transformante instabil sein kann, wenn ein Mehrkopienplasmid eingesetzt wird, um das pycA-Gen einzuführen.
  • Die Einführung einer DNA in ein Bakterium der Gattung Escherichia kann beispielsweise durch ein Verfahren von D. A. Morrison (Methods in Enzymology 68, 326 (1979)) oder durch ein Verfahren durchgeführt werden, worin Empfänger-Bakterienzellen zur Erhöhung der Permeabilität der DNA mit Calciumchlorid behandelt werden (Mandel, M. und Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)) und dergleichen.
  • Die Herstellung der genomischen DNA, die Konstruktion einer genomischen DNA-Bibliothek, wie Hybridisierung, PCR, Präparation der Plasmid-DNA, Verdauung und Ligation von DNA, die Transformation und dergleichen werden nach Verfahren durchgeführt, die dem Fachmann bekannt sind. Solche Verfahren wurden in Sambrook, J., Fritsche, E. F., Maniatis, T. in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21 (1989) beschrieben.
  • Die L-Aminosäureproduktivität eines Bakteriums der Gattung Escherichia kann durch Übertragen oder Verstärken der Pyruvatcarboxylaseaktivität des Bakteriums durch Transformieren des Bakteriums mit einem pyc-Gen verbessert werden. Dies geschieht wahrscheinlich dadurch, dass Oxalessigsäure nicht nur aus Phosphoenolbrenztraubensäure, sondern auch aus Brenztraubensäure gebildet wird. Das heißt, der Transport von Glucose (oder Saccharose) in eine Bakteriumzelle, der durch das Phosphoenolbrenztraubensäure-System vermittelt wird, läuft durch Verbrauchen eines Moleküls Phosphoenolbrenztraubensäure unter Bildung eines Moleküls Brenztraubensäure ab.
  • Als Bakterium der Gattung Escherichia, worin das pyc-Gen eingeführt werden soll, wird ein Stamm mit der Fähigkeit zur Produktion einer gewünschten L-Aminosäure eingesetzt. Alternativ dazu kann ein Bakterium der Gattung Escherichia, das mit dem pyc-Gen transformiert ist, mit der L-Rminosäureproduktivität versehen werden. Übrigens ist das pyc-Gen von Escherichia coli nicht bekannt, wenn das Gen jedoch in Escherichia coli gefunden werden sollte, kann dieses Gen eingesetzt werden.
  • Beispiele für L-Aminosäure produzierende Bakterien der Gattung Escherichia werden im Folgenden beschrieben.
  • (1) L-Threonin produzierende Bakterien
  • Die L-Threonin produzierenden Bakterien der Gattung Escherichia sind beispielsweise der Stamm MG442 (hinterlegt bei der Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) Depositary, GNIIgenetika; 1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Moskau, Russland, unter der Hinterlegungsnummer VKPM B-1628) (USP 4,278,765; Guayatiner M. M. et al., Genetika (in Russisch), 14, 947-956 (1978)). Der Stamm MG442 wurde als Mut ante erhalten, die gegen das L-Threoninanalogon, nämlich 2-Amino-3-hydroxyvaleriansäure, resistent ist, wobei dieser Stamm auch eine unvollständige Isoleucinauxotrophie (leaky type) aufwies. Er produziert L-Threonin und L-Glutamat als Nebenprodukt.
  • Alternativ dazu kann eine Transformante von MG442, die mit pVIC40 (USP 5,175,107) transformiert ist, vorzugsweise als L-Threonin produzierender Stamm eingesetzt werden.
  • (2) L-Lysin produzierende Bakterien
  • Die L-Lysin produzierenden Bakterien der Gattung Escherichia sind beispielsweise verschiedene Bakterien, die in WO95/16042 beschrieben sind. Die L-Lysin produzierenden Bakterien sind beispielsweise ein Bakterium, worin die Aspartokinaseaktivität und die Dihydrodipicolinat-Reduktaseaktivität erhöht sind, wie W3110(tyrA)RSFD80+pdapB.
  • (3) L-Homoserin produzierende Bakterien
  • Die L-Homoserin produzierenden Bakterien der Gattung Escherichia sind beispielsweise der Stamm 44 (thrB). Dieser Stamm wurde von dem bekannten Stamm C600 (thrB, leuB) abgeleitet (Appleyard R. K., Genetics, 39, 440-452 (1954)), nämlich als Leu+-Revertante. Ein transformierter Stamm 44, der mit einem Plasmid transformiert ist, das ein thrA-Gen, welches für die Aspartokinasehomoserindehydrogenase I kodiert, enthält, kann vorzugsweise eingesetzt werden.
  • Ein Stamm von Escherichia coli 44 wurde bei der Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) Depositary, GNIIgenetika; 1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Moskau, Russland, am 23. September 1980 unter der Hinterlegungsnummer VKPM B-2175 hinterlegt und am 1. September 2000 von der ursprünglichen Hinterlegung in eine internationale Hinterlegung gemäß dem Budapester Vertrag überführt.
  • (4) L-Glutaminsäure produzierende Bakterien
  • Die L-Glutaminsäure produzierenden Bakterien der Gattung Escherichia sind beispielsweise ein Stamm, der gegen L-Valin resistent ist, beispielsweise Escherichia coli B11, K-12 (ATCC10798), B (ATCC11303) und W (ATCC9637).
  • (5) L-Isoleucin produzierende Bakterien
  • Die L-Isoleucin produzierenden Bakterien der Gattung Escherichia sind beispielsweise ein Stamm TDH6/pVIC40, pMWD5 (Hashiguchi, K. et al., Biosci. Biotechnol.. Biochem., 63(4), 672-679 (1999)) oder AJ12919, beschrieben in EP0 685 555 A1.
  • <2> Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure
  • Eine L-Aminosäure kann durch Kultivieren eines Bakteriums der Gattung Escherichia, das wie vorstehend beschrieben mit dem pycA-Gen transformiert ist und in einem geeigneten Medium eine L-Aminosäure produzieren kann, durch Produzieren und Akkumulieren der L-Aminosäure in dem Medium und durch Gewinnen der L-Aminosäure aus dem Medium effizient hergestellt werden.
  • Die L-Aminosäure ist beispielsweise vorzugsweise L-Threonin, L-Lysin, L-Glutaminsäure, L-Homoserin, L-Methionin, L-Arginin, L-Prolin und L-Isoleucin. Die L-Aminosäure kann durch das erfindungsgemäße Verfahren entweder allein oder als ein Gemisch von mehr als zwei Arten der L-Aminosäuren produziert werden.
  • In der vorliegenden Erfindung kann die Kultivierung des Bakteriums der Gattung Escherichia, das Gewinnen und das Reinigen der Aminosäure aus dem flüssigen Medium auf ähnliche Weise wie herkömmlich für die Produktion einer Aminosäure durch Fermentation unter Einsatz eines Bakteriums durchgeführt werden. Ein für die Kultivierung eingesetztes Medium kann entweder ein synthetisches Medium oder ein natürliches Medium sein, solange das Medium eine Kohlenstoff- und eine Stickstoff-Quelle und Mineralien und, falls erforderlich, Nährstoffe enthält, welche für ein ausreichendes Wachstum des Bakteriums erforderlich sind. Die Kohlenstoffquelle kann verschiedene Kohlenhydrate, wie Glucose und Saccharose, und verschiedene organische Säuren enthalten. In Abhängigkeit von der assimilatorischen Aktivität des eingesetzten Bakteriums kann Alkohol, wie Ethanol und Glycerin, eingesetzt werden. Als Stickstoffquelle können Ammoniak, verschiedene Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, andere Stickstoffverbindungen, wie Amine, eine natürliche Stickstoffquelle, wie Pepton, Sojabohnenhydrolysat und verdaute fermentierte Bakterien eingesetzt werden. Als Mineralien können Monokaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisensulfat, Mangansulfat, Calciumcarbonat eingesetzt werden.
  • Die Kultivierung wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen durchgeführt, wie in einer Schüttelkultur und in einer Belüftungskultur und Rührkultur. Die Temperatur der Kultur ist üblicherweise 20 bis 40°C, vorzugsweise 30 bis 38°C. Der pH-Wert der Kultur ist üblicherweise zwischen 5 und 9, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,2. Der pH-Wert der Kultur kann mit Ammoniak, Calciumcarbonat, verschiedenen Säuren, verschiedenen Basen und Puffern eingestellt werden. Üblicherweise führt eine 1bis 3-tägige Kultivierung zur Akkumulation der Ziel-L-Aminosäure in dem Medium.
  • Das Gewinnen und Reinigen der L-Aminosäure kann durch Entfernen von Feststoffen, wie Zellen, aus dem Medium durch Zentrifugation oder Membranfiltration nach der Kultivierung, anschließender Ionenauschtausch, Konzentration und durch Kristallfraktionierungsverfahren und dergleichen durchgeführt werden.
  • Beste Ausführungsform der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung wird anhand der Beispiele eingehender beschrieben.
  • Beispiel 1: Klonierung des pycA-Gens aus Bacillus subtilis Stamm 168
  • <1> Konstruktion des Empfängerstammes B. subtilis pycA::KmR zum Klonieren
  • Der Empfängerstamm B. subtilis wurde durch Insertionsmutagenese des pycA-Gens konstruiert. Das Fragment des pycA-Gens wurde in zwei Stufen kloniert (vergleiche 1 und 2).
  • In einer Datenbank wurde ein Leserahmen (ylap) aus dem Bacillus-subtilis-Genomsequenzierungsprojekt als pycA-Gen, welches für Pyruvatcarboxylase kodiert, identifiziert. Die Region unmittelbar nach dem pycA-Genterminator wurde durch PCR-Rmplifizierung unter Einsatz des folgenden Oligonucleotidpaares kloniert:
  • Figure 00120001
  • Das 269bp große DNA-Fragment wurde mit einem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase-I mit glatten Enden versehen und in die ScaI-Schnittstelle des Plasmids pBR322 in einen E.-coli-Stamm kloniert. Das erhaltene Plasmid pBRPYCA11 wurde durch ClaI verdaut und an ein 1628bp großes DNA-Fragment, welches das cat-Gen trägt, das durch Verdauen von pC194 mit ClaI erhalten wurde, ligiert. Dann wurde unter Einsatz des erhaltenen Plasmids pBRPYCA11CmR3 der Bacillus-subtilis-Stamm 168 trpC2 transformiert, und CmR-Klone wurden selektiert. Das Plasmid pBRPYCA11CmR3 kann in einem Bakterium der Gattung Bacillus nicht autonom replizieren, es kann jedoch in das Chromosom neben das pycA-Gen durch die Homologie mit dem 269bp großen DNA-Fragment integrieren. Der Stamm wurde als B. subtilis trpC2 xyz::pBRPYCACmR3 bezeichnet. Dieser Stamm trug ein pBR322-Replicon, das für die Resistenz gegen Tetracyclin kodierende tet-Gen, abgeleitet von pBR322, und einen CmR-Marker.
  • Chromosomale DNA von B. subtilis trpC2 xyz::pBRPYCACmR3 wurde isoliert und eingesetzt, um den entfernten Teil des pycA-Gens zu klonieren. Die chromosomale DNA, die mit PstI verdaut wurde, wurde mit sich selbst ligiert und in den E.-coli-Stamm TG1 transformiert. Rekombinanten, die gegen Tetracyclin und Chloramphenicol resistent waren, wurden selektiert. Das Plasmid wurde aus einer der Rekombinanten gewonnen und pPYC1 bezeichnet. Das Plasmid pPYC1 enthielt eine einzelne BglII-Restriktionsschnittstelle, die in dem pycA-Genfragment enthalten war.
  • Diese Stelle wurde verwendet, um das 1818bp große DNA-Fragment, das einen Kanamycinresistenzmarker für B. subtilis enthielt, einzuführen. Das Plasmid pPYC1 wurde mit BglII verdaut und mit pUC7KmR verbunden, das mit BamHI verdaut wurde, wobei ein Plasmid pPYC1::KmR erhalten wurde.
  • Die Inaktivierung des pycA-Gens in einem Wildtypstamm B. subtilis 168 trpC2 wurde durch Transformation desselben Stammes mit einem linearisierten Plasmid pPYC1::KmR durch ein einstufiges Verfahren erhalten, und danach wurde auf einem Luriabroth-Medium, das mit Kanamycin versetzt war, selektiert. Der KmR-Marker wurde in ein pycA-Gen auf der chromosomalen DNA durch homologe Doppelkreuzrekombination eingeführt.
  • Der konstruierte Stamm von B. subtilis pycA::Km trpC2 wuchs nicht in Spizizen-Minimalmedium (Anagnostopoulos, C und Spizizen, J., J. Bacteriol., 81, 741-746 (1961)) mit Tryptophan, wenn Citrat oder Aspartat nicht zu dem Medium gegeben wurden. (Zusammensetzung des Spizizen-Minimalmediums)
    K2HPO4 · 3H2O 18,3 g/l
    KH2PO4 6,0 g/l
    (NH4)2SO4 2,0 g/l
    Natriumcitrat · 5H2O 1,2 g/l
    MgSO4 . 7H2O 0,2 g/l
    Glucose 10,0 g/l
    pH 7,0
  • Der Stamm B. subtilis trpC2 pycA::Km recE::TcR wurde durch Transduktion des inaktivierten Allels des recE-Gens aus B. subtilis recE::TcR mit dem Phagen E40 konstruiert (2). Es war erforderlich, die Rekombination in dem Empfängerstamm für die Klonierung des pycA-Gens aus B. subtilis zu inaktivieren. Der konstruierte Stamm B. subtilis trpC2 pycA::KmR recE::TcR wurde als Empfängerstamm zum Klonieren des pycA-Gens eingesetzt.
  • <2> Klonierung des nativen pycA-Gens aus B. subtilis durch Komplementation
  • Das pycA-Gen wurde aus dem Stamm B. subtilis 168 trpC2 kloniert. Chromosomale DNA, hergestellt aus dem Stamm 168 trpC2, wurde mit EcoRI teilweise verdaut und an pCB20 (EmR) ligiert (zur Verfügung gestellt von Dr. Yu Jomantas, vergleiche "Genetic transformation and expression " L. O. Butler, et al. Herausgeber, Intercept Ltd., PO Box 402, Wimborne, Dorset, BH229T2, Großbritannien, 1989, S. 269-281), welches mit EcoRI verdaut wurde. Dann wurde der Empfängerstamm trpC2 pycA::KmR recE::TcR mit dem Ligationsgemisch transformiert (2). Die Klone Asp+, EmR, KmR wurden auf Spizizen-Minimalmedium ohne Citrat- oder Aspartatzugabe, jedoch mit Zugabe von Tryptophan, Erythromycin und Kanamycin selektiert. Das Plasmid pPYCR3, das in einem der selektierten Klone enthalten war, komplementierte eine pycA-Mutation, hatte die vorhergesagte Struktur und übertrug den Phenotyp als Asp+, EmR nach der zweiten Transformation.
  • <3> Klonierung eines DNA-Fragments, welches das pycA-Gen aus B. subtilis 168 trpC2 enthielt, in ein Mehrkopienplasmid pUCl8 und pUC19
  • Das Plasmid pPYCR3 wurde mit HindII und ScaI verdaut, und das HindII-ScaI-Fragment (4414 bp), welches das pycA-Gene mit der stromaufwärtigen Sequenz am 5'-Ende enthielt (einschließlich dem Promotor und der Ribosomenbindungsstelle, wurde in pUCl8, verdaut mit SmaI, kloniert. Somit wurde das Plasmid pUCl8-pycA erhalten (3, Oberseite). Die Ligationsreaktion wurde wie folgt durchgeführt. 90 ng des mit SmaI verdauten pUCl8 und 300 ng des HindII-ScaI-Fragments (4414 bp), welches das pycA-Gen trug und durch Agarosegelelektrophorese gereinigt wurde, wurden mit 2 Einheiten T4 DNA-Ligase (Pharmacia, Sweden) in 45 µl eines Reaktionsgemisches, das 1x One-Phor-All-Puffer (Pharmacia, Schweden) und 1 mM ATP enthielt, ligiert.
  • E. coli TG1 wurde mit pUCl8-pycA transformiert. Erhaltene Transformanten wurden unter Verwendung von KpnI-, XbaI-, Bam-HI-, HindIII- und EcoRI-Endonucleasen analysiert. Alle Klone trugen das pycA-Gen in entgegengesetzter Richtung zum lac-Promotor des pUCl8-Plasmids. Die pycA-Gene, die in pUC18 kloniert waren, kennen unter der Kontrolle des inhärenten Promotors des Gens exprimiert werden.
  • Dann wurde, um das pycA-Gen unter die Kontrolle des lac-Promotors zu bringen, das KpnI-XbaI-Fragment von pUC18-pycA in pUC19, verdaut mit KpnI-XbaI, kloniert. Die erhaltenen Klone waren jedoch instabil, und das rekombinante Plasmid wurde innerhalb kurzer Zeit (6-8 Stunden) der Kultivierung eliminiert.
  • <4> Klonierung eines DNA-Fragments, welches das pycA-Gen enthält, in ein Plasmid pMW119 mit geringer Kopienzahl
  • Das KpnI--XbaI-Fragment von pUC18-pycA wurde in das Plasmid mit geringer Kopienzahl pMW119, verdaut mit KpnI und XbaI, ligiert (3, Unterseite). Die Ligationsreaktion wurde in 50 µl eines Reakiionsgemisches, das 60 ng pMW119, verdaut mit KpnI-XbaI, 120 ng KpnI-XbaI-Fragment von pUC18-pycA, das durch Agarosegelelektrophorese gereinigt worden war, 1x One-Phor-All- Puffer (Pharmacia, Schweden), 1 mM ATP und 1 Einheit T4-DNA-Ligase (Pharmacia, Schweden) enthielt, durchgeführt.
  • Unter Verwendung des Ligationsgemisches wurde E. coli TG1 transformiert. Die erhaltenen Transformanten wurden unter Verwendung von SacI, KpnI, XbaI, BamHI, HindIII und EcoRI analysiert. Alle Klone trugen das pycA-Gen unter der Kontrolle des lac-Promotors von pMW119 und ihres eigenen Promotors. Der so erhaltene Klon wurde TG1(pMW119-pycA) bezeichnet, und auf diesem Klon wurde das Plasmid pMW119-pycA erhalten.
  • Beispiel 2: Produktion von L-Threonin und L-Glutaminsäure
  • Der E.-coli-Stamm MG442 wurde mit dem Plasmid pMW119-pycA transformiert, und 10 Ampr-Kolonien wurden selektiert. Die Produktivitäten für L-Threonin und L-Glutaminsäure der Klone wurden unter Verwendung des folgenden Fermentationsmediums untersucht. (Zusammensetzung des Fermentationsmediums)
    Glucose (getrennt sterilisiert) 60 g/l
    (NH4)2SO4 15,0 g/l
    KH2PO4 1,5 g/l
    MgSO4 · 7H2O 1,0 g/l
    L-Isoleucin 100 mg/l
    Thiamin 0,1 mg/l
    CaCO3 (getrennt sterilisiert) 20 g/l
  • Die Fermentation wurde in Teströhrchen (20 x 300 mm) bei 32°C während 72 Stunden unter Verwendung eines Rotationsschüttlers durchgeführt. Eine Impföse mit jeweils einem der 10 Klone wurde in das Teströhrchen, das 2,0 ml des Fermentationsmediums enthielt, eingeimpft. Als Kontrolle wurden 10 einzelne Kolonien des Plasmid-freien Stammes MG442 eingesetzt. Nach der Fermentation wurden die Konzentrationen von L-Threonin und L-Glutaminsäure, akkumuliert in dem Medium, durch Dünnschicht chromatografie gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
  • Tabelle 1
    Figure 00170001
  • Beispiel 3: Produktion von L-Homoserin
  • Der L-Homoserin produzierende Stamm E. coli 44 wurde mit dem Plasmid pMWl19-pycA transformiert, und 5 Ampicilin-resistente Klone wurden selektiert. Die Produktion von L-Homoserin wurde untersucht wie in Beispiel 1 beschrieben, das Fermentationsmedium wurde jedoch mit 0,5 g/l L-Threonin versetzt. Als Kontrolle wurden 5 Kolonien des Plasmid-freien Stammes 44 eingesetzt. Nach der Fermentation waren die mittleren L-Homoserin-Konzentrationen 4,5 g/l (Stamm 44) und 5,7 g/l (Stamm 44 mit dem Plasmid pMW119-pycA).
  • Es kann auch eine Wirkung des pycA-Gens auf die Produktion von L-Lysin erwartet werden, weil das pycA-Gen dafür bekannt ist, dass es eine positive Wirkung auf die Produktion von L-Threo nin und L-Homoserin hat, welche teilweise denselben Biosyntheseweg wie L-Lysin haben.
  • Sequenzliste
  • Figure 00190001
  • Figure 00200001
  • Figure 00210001
  • Figure 00220001
  • Figure 00230001
  • Figure 00240001
  • Figure 00250001
  • Figure 00260001
  • Figure 00270001
  • Figure 00280001
  • Figure 00290001
  • Figure 00300001
  • Figure 00310001

Claims (10)

  1. Bakterium der Gattung Escherichia, welches mit einem Gen transformiert ist, das für eine Pyruvatcarboxylase kodiert, und L-Aminosäureproduktivität hat, wobei die Pyruvatcarboxylase die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:4 enthält.
  2. Bakterium der Gattung Escherichia, welches mit einem Gen transformiert ist, das für eine Pyruvatcarboxylase kodiert, und L-Aminosäureproduktivität hat, wobei das Gen die Nucleotidsequenz der SEQ ID NO:3 enthält oder das Gen aus der chromosomalen DNA eines Bakteriums der Gattung Bacillus durch PCR mit Oligonucleotidprimern, die auf der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO:3 basieren, erhältlich ist.
  3. Bakterium nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Gen, welches für die Pyruvatcarboxylase kodiert, in einer geringen Kopienzahl in das Bakterium eingebracht ist.
  4. Bakterium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welches eine größere Menge an L-Aminosäure produziert als das Bakterium, welches das Gen nicht enthält.
  5. Bakterium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welches L-Threonin in einer Konzentration produziert, die mindestens 100 % höher als die Konzentration an L-Threonin ist, die durch ein Bakterium produziert wird, welches das Gen nicht enthält.
  6. Bakterium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welches L-Glutaminsäure in einer Konzentration produziert, die mindestens 50 % höher als die Konzentration an L- Glutaminsäure ist, die durch ein Bakterium produziert wird, welches das Gen nicht enthält.
  7. Bakterium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welches L-Homoserin in einer Konzentration produziert, die mindestens 25 % höher als die Konzentration von L-Homoserin ist, die durch ein Bakterium produziert wird, welches das Gen nicht enthält.
  8. Bakterium mit der Hinterlegungsnummer VKPM B-7821.
  9. Bakterium mit der Hinterlegungsnummer VKPM B-7822.
  10. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure, welches das Kultivieren des Bakteriums nach einem der Ansprüche 1 bis 9 in einem Medium, das Herstellen und Akkumulieren der L-Aminosäure in dem Medium und das Gewinnen der L-Aminosäure aus dem Medium umfasst.
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