DE10352801A1

DE10352801A1 - Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Methanol-Assimilierenden Bakterien

Info

Publication number: DE10352801A1
Application number: DE10352801A
Authority: DE
Inventors: Yoshiya Kawasaki Gunji; Hisashi Kawasaki Yasueda
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2002-11-20
Filing date: 2003-11-12
Publication date: 2004-07-15
Also published as: JP4120364B2; FR2847262A1; FR2847262B1; US7335506B2; CN1502690A; US20050003495A1; JP2004166594A

Abstract

DNA, die eine Variante eines Proteins codiert, wobei das Protein einen Loop-Bereich und sechs hydrophobe Helices aufweist, und an der Sekretion von L-Lysin zur Außenseite einer Zelle beteiligt ist, wobei die DNA eine Variante eines Proteins codiert, welches den Loop-Bereich nicht enthält, und die Sekretion von L-Lysin, L-Arginin oder beider dieser L-Aminosäuren zur Außenseite eienr Zelle eines Methanol-assimilierenden Bakteriums erleichtert, wenn die DNA in das Bakterium eingeführt ist, insbesondere wenn lysE24 in ein Methylobacillus-Bakterium eingeführt ist, um die L-Aminosäureproduktivität, insbesondere die L-Lysin- und L-Arginin-Produktivitäten, zu verbessern.

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft in der Mikroorganismus-Industrie einsetzbare Verfahren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin oder L-Arginin durch Fermentation, sowie einen in dem Herstellungsverfahren verwendeten Mikroorganismus.
Stand der Technik
Aminosäuren wie L-Lysin, L-Glutaminsäure, L-Threonin, L-Leucin, L-Isoleucin, L-Valin und L-Phenylalanin werden industriell durch Fermentation unter Verwendung von Mikroorganismen hergestellt, die zur Gattung Brevibacterium (Corynebacterium), Bacillus, Escherichia, Streptomyces, Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Penicillium, Candida oder ähnlichen gehören. Bakterienstämme, die aus der Natur isoliert werden, oder künstliche Mutanten dieser sind verwendet worden, um die Produktivität dieser Mikroorganismen zu verbessern. Weiterhin sind verschiedene Verfahren zur Steigerung der L-Aminosäureproduktionsfähigkeiten offenbart worden, wie beispielsweise rekombinante DNA-Techniken zur Verstärkung von L-Aminosäure-Biosyntheseenzymen.
Die L-Aminosäureproduktion ist durch Züchten von Mikroorganismen wie den oben Erwähnten mit verbesserten Herstellungsverfahren beträchtlich erhöht worden. Um jedoch in der Zukunft auf weitere Steigerungen des Bedarfs zu reagieren, ist die Entwicklung von Verfahren, welche eine effizientere Herstellung von L-Aminosäuren bei niedrigeren Kosten bereitstellen, immer noch eindeutig notwendig, und stellt daher ein Bedürfnis in der Technik dar.
Methanol ist ein bekanntes Fermentations-Ausgangsmaterial, welches in großen Mengen bei geringen Kosten erhältlich ist. Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren durch Fermentation unter Verwendung von Methanol sind bekannt und beinhalten Verfahren unter Verwendung von Mikroorganismen, die zu der Gattung Achromobacter oder Pseudomonas (japanische Patentoffenlegung (Kokai) Nr. 45-25273), Protaminobacter (japanische Patentveröffentlichung (Kokoku) Nr. 49-125590), Protaminobacter oder Methanomonas (japanische Patentoffenlegung Nr. 50-25790), Mikrocyclus (japanische Patentoffenlegung Nr. 52-18886), Methylobacillus (japanische Patentoffenlegung Nr. 4-91793), Bacillus (japanische Patentoffenlegung Nr. 3-505284) usw. gehören. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren durch Züchten von Methylophilus-Bakterien entwickelt, wobei künstliche Mutagenese- und rekombinante DNA-Techniken verwendet werden (WO 00/61723).
In den letzten Jahren wurden Proteine identifiziert, die eine Funktion des spezifischen Ausscheidens einer L-Aminosäure zur Außenseite einer Zelle eines Mikroorganismus aufweisen, sowie die Gene, welche diese Proteine codieren. Insbesondere haben Vrljic et al. ein Gen identifiziert, das an der Sekretion von L-Lysin zur Außenseite einer Zelle beteiligt ist und aus Corynebacterium glutamicum R127 stammt (Vrljic M., Sahm H., Eggeling L., Molecular Microbiology 22: 815-826 (1996)). Dieses Gen wurde als lysE bezeichnet, und es wurde berichtet, dass die L-Lysinproduktionsfähigkeit von Corynebacterium-Bakterien verbessert werden konnte, indem die Expression dieses Gens in Corynebacterium-Bakterien verstärkt wurde (WO 97/23597). Von dem lysE-Gen ist bekannt, dass es nicht nur L-Lysin, sondern auch L-Arginin sekretiert (Bellmann A., Vrljic M., Patek M., Sahm H., Kramer R., Eggeling L., Molecular Microbiology 147: 1765-1774 (2001)). Es ist weiterhin bekannt, dass die Produktion einiger L-Aminosäuren durch Erhöhung der Expressionsmengen von Aminosäure-sekretierenden Proteinen in Escherichia coli verbessert werden kann (japanische Patentoffenlegung Nr. 2000-189180). Es wurde beispielsweise berichtet, dass die Herstellung von Cystin, Cystein usw. durch Verstärkung der Expression des ORF306-Gens in Escherichia coli verbessert werden kann ( EP 885962 ).
Es gibt jedoch bis heute keine Berichte, die darauf hinweisen, dass der Prozess der Aminosäuresekretion entweder positiv oder negativ an der Aminosäureproduktion durch Fermentation von Methanol unter Verwendung eines Methanolassimilierenden Bakteriums beteiligt ist. Es gibt weiterhin keine Berichte, die auf ein Aminosäure-Sekretionsgen hinweisen, das eine Sekretionsaktivität in einem Methanol-assimilierenden Bakterium bereitstellen kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur effizienten Herstellung von L-Lysin oder L- Arginin unter Verwendung von Methanol bereitzustellen, welches im Überfluss vorhanden und kostengünstig erhältlich ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Bakterium bereitzustellen, das zur Gattung Methylobacillus gehört, in welches eine exprimierbare DNA eingeführt ist, wobei das Bakterium die Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin oder L-Arginin aufweist, wobei die DNA eine Variante eines Proteins codiert, wobei das Protein einen Loop-Bereich und sechs hydrophobe Helices aufweist und an der Sekretion von L-Lysin zur Außenseite einer Zelle beteiligt ist, und wobei die Variante diesen Loop-Bereich nicht enthält und die Sekretion von L-Lysin, L-Arginin oder von beiden zur Außenseite eines Methanol-assimilierenden Bakteriums erleichtert bzw. fördert, wenn die DNA in das Methanol-assimilierende Bakterium eingeführt wird.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, das oben beschriebene Bakterium bereitzustellen, worin das mutierte Protein im Wesentlichen nur aus den hydrophoben Helices besteht.
Es ist noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, das oben beschriebene Bakterium bereitzustellen, worin die Variante sechs hydrophobe Helices aufweist.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, das oben beschriebene Bakterium bereitzustellen, worin die Variante ein Komplex ist, umfassend ein Peptid, das die ersten, zweiten und dritten hydrophoben Helices relativ zum N-Terminus enthält, und ein Peptid, das die vierten, fünften und sechsten hydrophoben Helices relativ zum N-Terminus enthält.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, das oben beschriebene Bakterium bereitzustellen, worin das Protein das LysE-Protein ist.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, das oben beschriebene Bakterium bereitzustellen, worin das LysE-Protein von einem Coryneform-Bakterium abgeleitet ist bzw. stammt.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Bakterium bereitzustellen, dass zur Gattung Methylobacillus gehört, in welches eine exprimierbare DNA eingeführt ist, und welches die Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin oder L-Arginin aufweist, wobei die DNA ein Protein codiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:

(A) einem Protein, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 10 umfasst, und
(B) einem Protein, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 10 umfasst, einschließlich einer Substitution, Deletion, Insertion oder Addition einer oder mehrerer Aminosäurereste,

Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin oder L-Arginin bereitzustellen, umfassend das Kultivieren des wie oben beschriebenen, zur Gattung Methylobacillus gehörenden Bakteriums in einem Medium, um L-Lysin oder L-Arginin in der Kultur zu produzieren und zu akkumulieren, und Gewinnen von L-Lysin oder L-Arginin aus der Kultur.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, das oben beschriebene Verfahren zur Herstellung von L-Lysin oder L-Arginin bereitzustellen, worin das Medium Methanol als Hauptkohlenstoffquelle enthält.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die L-Aminosäureproduktion, insbesondere von L-Lysin und L-Arginin, unter Verwendung eines Methanol-assimilierenden Bakteriums verbessert werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt Konstruktionen eines Plasmids pRStac, welches den tac-Promoter und Plasmide pRS1ysE und pRS1ysE24 aufweist, bestehend aus dem Plasmid pRStac, in welches das lysE-Gen oder lysE24-Gen insertiert ist.
2 zeigt eine Konstruktion eines Plasmids pRSlysEdapA, welches das lysE24-Gen und das dapA*-Gen aufweist.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben ernsthafte Untersuchungen durchgeführt, um die oben erwähnten Gegenstände bzw. Ziele zu erreichen. Zunächst haben sie gefunden, dass eine L-Aminosäureproduktion durch Methanol-assimilie renden Bakterien, insbesondere das Methylobacillus-Bakterium, nicht möglich war, da der L-Aminosäure-Sekretionsprozess zur Außenseite der Zellen nicht funktionierte. Anschließend haben sie erfolgreich ein Gen isoliert, das eine Aminosäuresekretionsaktivität bereitstellte, insbesondere in dem Mikroorganismus, was die Ermöglichung einer effizienten Aminosäureproduktion unterstützte.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben ein aus einem Brevibacterium lactofermentum 2256-Stam abgeleitetes Gen, welches ein Homologes des bekannten lysE-Gens aus dem Corynebacterium glutamicum R127 ist, in ein Methanol-assimilierendes Bakterium eingeführt und dessen Wirkung auf die Aminosäureproduktion untersucht.
Es sollte angemerkt werden, dass Bakterien, die in der Gattung Brevibacterium klassifiziert waren, in der Gattung Corynebacterium vereinigt wurden (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)).
Es wurde gefunden, dass die Einführung des lysE-Gens in ein Methanol-assimilierendes Bakterium zu einer Mutation oder Deletion führte und das LysE-Protein somit nicht funktionieren konnte. Für die Sekretion verantwortliche Proteine müssen typischerweise in die Zellmembran einbezogen sein, um zu funktionieren. Daher müssen die Protein- und Membranbedingungen, wie beispielsweise die Lipidzusammensetzung, füreinander geeignet sein. Es wurde geschlossen, dass es schwierig sein würde, ein heterologes Membranprotein wie LysE so zu exprimieren, dass das Protein funktionieren kann, wobei diese Folgerung wurde durch das zuvor erwähnte Ergebnis gestützt wurde.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben daher bei der Forschung an den zuvor erwähnten L-Aminosäuresekretionsgenen ein mutiertes Gen gefunden, dass in einem Methanol-assimilierenden Bakterium funktionieren konnte. Weiterhin haben sie eine merkliche Wirkung bei Verwendung dieses mutierten Gens in der Aminosäureproduktion unter Verwendung eines Methanolassimilierenden Bakteriums gefunden.
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung ausführlich beschrieben.
DNA der vorliegenden Erfindung
Die DNA der vorliegenden Erfindung ist eine DNA, welche die Sekretion von L-Lysin, L-Arginin oder beiden zur Außenseite einer Zelle fördert, wenn sie in ein Methanol-assimilierendes Bakterium eingeführt wird, und ist eine DNA, die eine Variante eines Proteins codiert, welches an der Sekretion von L-Lysin zur Außenseite einer Zelle des Mikroorganismus beteiligt ist.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck „Erleichterung bzw. Förderung der Sekretion von L-Lysin, L-Arginin oder beiden zur Außenseite einer Zelle", dass bei Kultivierung eines Methanol-assimilierenden Bakteriums, welches die DNA der vorliegenden Erfindung enthält, in einem Medium, dieses eine erhöhte Menge von in das Medium sekretiertem L-Lysin, L-Arginin oder beiden bereitstellt im Vergleich mit einem Methanol-assimilierenden Bakterium, das die DNA der vorliegenden Erfindung nicht enthält. Die erhöhte Sekretion der L-Aminosäuren von der Innenseite zur Außenseite der Zelle wird dadurch demonstriert, dass die L-Aminosäureanhäufung in dem Medium während der Kultivierung des die DNA der vorliegenden Erfindung enthaltenden Methanol-assimilierenden Bakteriums erhöht wird, verglichen mit der Anhäufung, die beobachtet wird, wenn ein Methanol-assi-milierendes Bakterium kultiviert wird, welches die DNA der vorliegenden Erfindung nicht enthält. Weiterhin kann die erhöhte Sekretion der L-Aminosäuren zur Außenseite einer Zelle auch als Abnahme der intrazellulären Konzentrationen der L-Aminosäuren beobachtet werden, wenn die DNA der vorliegenden Erfindung in ein Methanol-assimilierendes Bakterium eingeführt wird.
Das Methylobacillus-Bakterium der vorliegenden Erfindung ist ein Bakterium, das zur Gattung Methylobacillus gehört und unter Verwendung von Methanol als Hauptkohlenstoffquelle wachsen kann, und in welchem die Sekretion einer L-Aminosäure wie L-Lysin oder L-Arginin durch Einführung der DNA der vorliegenden Erfindung erleichtert ist. Spezifische Beispiele hierfür sind Methylobacillus glycogenes, Methylobacillus flagellatum usw., sind jedoch nicht hierauf beschränkt. Beispiele für Methylobacillus glycogenes sind der T-11-Stamm (NCIMB 11375), der ATCC 21276-Stamm, der ATCC 21371-Stamm, der ATR80-Stamm (siehe Appl. Microbiol. Biotechnol., 42, 67-72 (1994)), der A513-Stamm (siehe Appl. Microbiol. Biotechnol., 42, 67-72 (1994)) usw., sind jedoch nicht hierauf beschränkt. Der Methylobacillus glycogenes NCIMB 11375-Stamm ist von den National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB Lts., Torry Research Station, 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom) erhältlich. Beispiele für Methylobacillus flagellatum sind der KT-Stamm (siehe Arch. Microbiol., 149, 441-446 (1988)) usw., sind jedoch nicht hierauf beschränkt.
Das Methylobacillus-Bacterium der vorliegenden Erfindung kann erhalten werden, indem eine DNA eingeführt wird, die eine Variante eines Proteins mit einem Loop-Bereich und sechs hydrophoben Helices codiert, welches an der Sekretion von L-Lysin zur Außenseite einer Zelle beteiligt ist, wobei die DNA eine Mutation aufweist, die zur Deletion des Loop-Bereichs führt und/oder zu einer Proteinvariante führt, die im Wesentlichen nur aus den hydrophoben Helices besteht. Der Ausdruck „im Wesentlichen nur aus den hydrophoben Helices bestehend" bedeutet, dass das mutierte LysE eine vollständige Defizienz des Loop-Bereichs aufweist oder das meiste des Loop-Bereichs in einem solchen Ausmaß fehlt, dass die Funktion des mutierten LysE nicht beeinflusst werden sollte.
Eine der Ausführungsformen des Methylobacillus-Bakteriums der vorliegenden Erfindung ist ein Methylobacillus-Bakterium, in welches die in den Beispielen beschriebene, als lysE24 bezeichnete DNA eingeführt wurde. Das Gen lysE24 ist ein aus dem Brevibacterium lactofermentum 2256-Stamm isoliertes mutiertes Gen und ist ein Homologes des bekannten lysE-Gens aus dem Corynebacterium glutamicum R127-Stamm. Die in das Methylobacillus-Bakterium der vorliegenden Erfindung eingeführte DNA kann daher der Einfachheit halber auch als „mutiertes lysE" bezeichnet werden.
Das durch das lysE-Gen codierte LysE-Protein weist sechs hydrophobe Helixbereiche auf. Von einiger dieser hydrophoben Bereiche wird angenommen, dass es Transmembrandomänen sind. Es wird weiterhin angenommen, dass ein Bereich zwischen den dritten und vierten Bereichen vom N-Terminus hydrophil ist und eine Loop-Struktur aufweist. In der vorliegenden Erfindung wird dieser hydrophile Bereich Loop-Bereich genannt. Die Nukleotidsequenz des Wildtyp-lysE und die Aminosäuresequenz des LysE-Proteins, abgeleitet aus dem Brevibacterium lactofermentum 2256-Stamm, sind jeweils in den SEQ ID NO: 7 und 8 gezeigt. In dieser Aminasäuresequenz entsprechen die hydrophoben Helixbereiche den Rminosäurenummern 5-20, 37-58, 67-93, 146-168, 181-203 und 211-232. Der Loop-Bereich entspricht den Aminosäurenummern 94-145.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben ermittelt, dass das lysE-Gen in einem Methanol-assimilierenden Bakterium letal war, dass jedoch eine DNA, die eine Variante des LysE-Proteins codiert, welche den Loop-Bereich nicht aufweist, oder im Wesentlichen nur aus den hydrophoben Helices besteht, die Sekretion von L-Lysin und/oder L-Arginin zur Außenseite einer Zelle des Methanol-assimilierenden Bakteriums erhöhte. Die DNA der vorliegenden Erfindung codiert ein solches mutiertes LysE-Protein, das den zuvor erwähnten Loop-Bereich nicht aufweist, oder das im Wesentlichen nur aus den hydrophoben Helices besteht.
Das zuvor erwähnte mutierte LysE ist nicht besonders eingeschränkt, solange es ein oder mehrere hydrophobe Helices aufweist und bei Exprimierung zu einer erhöhten Sekretion von L-Lysin, L-Arginin oder beidem führt, wenn es in ein Methanol-assimilierendes Bakterium eingeführt wird. Insbesondere ist eine DNA umfasst, die ein mutiertes LysE codiert, welches sämtliche der ersten bis sechsten hydrophoben Helices vom N-Terminus an aufweist. Insbesondere ist eine DNA umfasst, die ein Peptid codiert, das die ersten bis dritten hydrophoben Helices relativ zum N-Terminus codiert, und ein Peptid codiert, das die vierten bis sechsten hydrophoben Helices relativ zum N-Terminus enthält. Das zuvor erwähnte lysE24 ist ein Beispiel des mutierten LysE, das ein Peptid codiert, welches die ersten bis dritten hydrophoben Helices enthält, sowie ein Peptid, das die vierten bis sechsten hydrophoben Helices enthält. Das lysE24-Gen wird durch eine Mutation mit einem Stoppcodon stromabwärts des für die dritte hydrophobe Helix codierenden Bereichs eingeführt. Wenn ein Bereich stromabwärts dieses Stoppcodons wie in den Beispielen beschrieben deletiert wurde, bewirkte das mutierte lysE24-Gen nicht, dass sich L-Lysin in dem Medium bei Exprimierung in Methylobacillus glycogenes NCIMB 11375-Stämmen akkumulierte. Daher wird angenommen, dass ein Peptid, dass die ersten bis dritten hydrophoben Helices enthält, und ein Peptid, das die vierten bis sechsten hydrophoben Helices enthält, separat translatiert werden und Methylobacillus glycogenes funktionieren. Die Ergebnisse zeigen, dass die Einführung des lysE24-Gens in ein Methylobacillus-Bakterium zu einer Verbesserung der Produktion von L-Lysin oder L-Arginin führt.
Jeder Mikroorganismus kann zur Erzeugung einer DNA, die ein an der Sekretion von L-Lysin zur Außenseite einer Zelle beteiligtes Protein codiert, d.h. des lysE-Gens oder dessen homologer Gene, verwendet werden, solange es eine Variante des Gens aufweist, das die L-Lysin-Sekretionsaktivität in einem Methanol-assimilierenden Bakterium exprimieren kann. Insbesondere sind Coryneform-Bakterien wie Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermetum), Escherichia-Bakterien wie Escherichia coli, Pseudomonas-Bakterien wie Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium-Bakterien wie Mycobacterium tuberculosis usw. umfasst.
Beispiele des homologen Gens von lysE beinhalten eine DNA, die für ein Protein codiert, welches unter stringenten Bedingungen mit einer Sonde mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 7 oder einem Teil hiervon hybridisierbar ist, und ein Protein codiert, das die Funktion des LysE-Proteins in einem Methanol-assimilierenden Bakterium als ein Ergebnis der zuvor erwähnten Aminosäuresubstitution aufweist. Die zuvor erwähnten „stringenten Bedingungen" beinhalten Bedingungen, unter welchen ein sogenanntes spezifisches Hybrid gebildet wird und ein nicht-spezifisches nicht gebildet wird. Es ist schwierig, diesen Zustand unter Verwendung eines numerischen Werts klar auszudrücken. Die stringenten Bedingungen beinhalten jedoch beispielsweise eine Bedingung, unter welcher DNA mit hoher Homologie, beispielsweise DNA mit einer Homologie von 80 % oder mehr, bevorzugt 90 % oder mehr, bevorzugter 95 % oder mehr, miteinander hybridisieren, wohingegen DNA mit einer niedrigeren Homologie als oben nicht miteinander hybridisieren. Alternativ werden stringente Bedingungen beispielhaft durch Bedingungen ausgedrückt, bei denen DNA miteinander bei einer Salzkonzentration bei üblichen Waschbedingungen in der Southern-Hybridisierung miteinander hybridisieren, d.h. 1 × SSC, 0,1 × SDS, bevorzugt 0,1 × SSC, 0,1% SDS, bei 60°C.
Eine Teilsequenz der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 7 kann als die Sonde verwendet werden. Eine solche Sonde kann durch PCR unter Verwendung von Oligonukleotiden, basierend auf der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 7 als Primer, und einem DNR-Fragment, welches die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 7 enthält, als Templat, hergestellt werden. Wenn ein DNA-Fragment mit einer Länge von ungefähr 300 bp als Sonde verwendet wird, können die Waschbedingungen der Hybridisierung beispielsweise 2 × SSC, 0,1% SDS bei 50°C sein.
Um die Expression des Aminosäuresekretionsgens in einem Methylophilus-Bakterium zu verstärken, wird das lysE-Gen enthaltende Genfragment an einen Vektor ligiert, welcher in der Lage ist, in dem Methylophilus-Bakterium zu funktionieren, vorzugsweise einen Vektor mit hoher Kopienzahl, um eine rekombinante DNA herzustellen, welche dann zur Transformierung eines Wirts, wie beispielsweise eines Methylophilus-Bakteriums, verwendet wird. Alternativ kann das Gen in ein Transposon einbezogen und in das Chromosom eingeführt werden. Weiterhin kann ein Promoter, der eine potente Transkription in einem Methylophilus-Bakterium induziert, stromaufwärts des Gens ligiert werden.
Die Referenz WO 97/23597 offenbart lysE und zeigt nur das lysE-Gen des Coryneform-Bakteriums, das in ein Coryneform-Bakterium eingeführt wurde. Weiterhin wird nur L-Lysin als sekretierte Aminosäure erwähnt, und es wird ein neues Proteinsekretionssystem offenbart, einschließlich LysE mit einer Struktur, die sechs Transmembranhelices enthält. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung bestätigten jedoch, dass aus Coryneform-Bakterien stammendes LysE in Methanol-assimilierenden Bakterien überhaupt nicht funktionierte.
Weiterhin ist der erhaltene Faktor ein neuer L-Lysinsekretionsfaktor, welcher eine von dem bekannten LysE von Coryneform-Bakterien mit sechs Transmembranhelices auf einem Polypeptid verschiedene Grundstruktur aufweist, wobei dieser Faktor aus der Offenbarung der zuvor erwähnten Patent beschreibung, in der LysE offenbart ist, keineswegs erwartet werden kann.
Methylobacillus-Bakterium der vorliegenden Erfindung
In das Methylobacillus-Bakterium der vorliegenden Erfindung wird die DNA der vorliegenden Erfindung eingeführt, welche exprimierbar ist, und es weist die Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin oder L-Arginin auf. Es kann erhalten werden, indem die DNA der vorliegenden Erfindung in ein Methylobacillus-Bakterium eingeführt wird, welches eine L-Lysin- oder L-Arginin-Produktionsfähigkeit aufweist. Das Methylobacillus-Bakterium der vorliegenden Erfindung kann auch erhalten werden, indem einem Methylobacillus-Bakterium, in das die DNA der vorliegenden Erfindung eingeführt wurde, eine L-Lysin- oder L-Arginin-Produktionsfähigkeit verliehen wird. Das Methylobacillus-Bakterium der vorliegenden Erfindung kann auch erhalten werden, indem durch Einführung der DNA der vorliegenden Erfindung, welche exprimierbar ist, eine L-Lysin- oder L-Arginin-Produktionsfähigkeit verliehen wird.
Ein Methylobacillus-Bakterium mit L-Lysin- oder L-Arginin-Produktionsfähigkeit kann erhalten werden, indem einem Wildtypstamm eines Methylobacillus-Bakteriums eine L-Lysin- oder L-Arginin-Produktionsfähigkeit verliehen wird. Üblicherweise zum Züchten von Coryneform-Bakterien, Escherichia-Bakterien usw. verwendete Verfahren können verwendet werden, um eine L-Lysin- oder L-Arginin-Produktionsfähigkeit zu verleihen. Solche Verfahren beinhalten beispielsweise den Erwerb bzw. die Gewinnung auxotropher mutierter Stämme, Analogon-resistenter Stämme oder von Stämmen mit einer Mutation der Stoffwechsel-regulation, die Erzeugung rekombinanter Stämme, in welchen ein L-Lysin- oder L-Arginin-Biosynthesesystemenzym verstärkt ist (siehe „Amino Acid Fermentation", the Japan Scientific Societies Press [Gakkai Shuppan Center], 1. Ausgabe, veröffentlicht am 30. Mai 1986, S. 77 bis 100) usw., sind jedoch nicht hierauf beschränkt. Die Eigenschaften der Auxotrophie, Analogonresistenz, Mutation der Stoffwechsel-regulation usw. können individuell verliehen werden oder zwei oder mehrere können in Kombination beim Züchten von L-Lysin- oder L-Arginin-erzeugenden Bakterien verliehen werden. Das Biosynthesesystemenzym kann einzeln verstärkt werden, oder zwei oder mehrere hiervon können in Kombination verstärkt werden. Weiterhin kann das Verleihen der Eigenschaften, einschließlich Auxotrophie, Analogonresistenz, Mutation der Stoffwechselregulation usw. mit der Verstärkung des Biosyn-thesesystemenzyms kombiniert werden.

Zum Beispiel können L-Lysin-erzeugende Bakterien so gezüchtet werden, dass sie auxotroph für L-Homoserin oder L-Threonin und L-Methionin sind (japanische Patentveröffentlichungen Nrn. 48-28078 und 56-6499), oder auxotroph für Inositol oder Essigsäure sind (japanische Patentoffenlegungen Nrn. 55-9784 und 56-8692), oder resistent gegen Oxalysin, Lysinhydroxamat, S-(2-Aminoethyl)-cystein, γ-Methyllysin, α-Chlorcaprolactam, DL-α-Amino-ε-caprolactam, α-Amino-lauryllactam, einem Asparaginsäure-Analogon, einem Sulfa-Arzneimittel, einem Chinoid oder N-Lauroylleucin sind.

L-Arginin-erzeugende Bakterien können so gezüchtet werden, dass sie resistent gegen ein bestimmtes Mittel sind, beispielsweise ein Sulfa-Arzneimittel, 2-Thiazolalanin, α-Amino-β-hydroxyvaleriansäure oder ähnliche; auxotroph für L- Histidin, L-Prolin, L-Threonin, L-Isoleucin, L-Methionin oder L-Tryptophan zusätzlich zur Resistenz gegen 2-Thiazolalanin (japanische Patentoffenlegung Nr. 54-44096); resistent gegen Ketomalonsäure, Fluormalonsäure oder Monofluoressigsäure (japanische Patentoffenlegung Nr. 57-1989); resistent gegen Argininol (japanische Patentoffenlegung Nr. 62-24075); resistent gegen X-Guanidin (X bezeichnet ein Derivat einer Fettsäure oder eine aliphatische Kette, japanische Patentoffenlegung Nr. 2-186995); resistent gegen 5-Azauracil, 6-Azaurazil, 2-Thiouracil, 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Azacytosin, 6-Azacytosin usw.; resistent gegen Argininhydroxamat und 2-Thiouracil; resistent gegen Argininhydroxamat und 6-Azauracil (siehe japanische Patentoffenlegung Nr. 57-150381); resistent gegen ein Histidin-Analogon oder Tryptophan-Analogon (siehe japanische Patentoffenlegung Nr. 52-114092); auxotroph für mindestens eines von Methionin, Histidin, Threonin, Prolin, Isoleucin, Lysin, Adenin, Guanin und Uracil (oder einen Uracil-Vorläufer) (siehe japanische Patentoffenlegung Nr. 52-99289); resistent gegen Argininhydroxamat (siehe japanische Patentveröffentlichung Nr. 51-6754); auxotroph für Succinsäure oder resistent gegen ein Nukleinsäurebasenanalogon (siehe japanische Patentoffenlegung Nr. 58-9692); defizient bezüglich der Fähigkeit, Arginin zu metabolisieren und resistent gegen einen Arginin-Antagonisten und Canavanin und auxotroph für Lysin (siehe japanische Patentoffenlegung Nr. 52-8729); resistent gegen Arginin, Argininhydroxamat, Homoarginin, D-Arginin und Canavanin oder resistent gegen Argininhydroxamat und 6-Azauracil (siehe japanische Patentoffenlegung Nr. 53-143288); resistent gegen Canavanin (siehe japanische Patentoffenlegung Nr. 53-3586) usw.

Im Folgenden werden Verfahren zum Verleihen oder Verstärken einer L-Aminosäure-Produktionsfähigkeit durch Verstärken eines L-Aminosäure-Biosyntheseenzymgens beispielhaft beschrieben.

Die L-Lysin-Produktionsfähigkeit kann beispielsweise verliehen werden, indem die Aktivitäten von Dihydrodipicolinatsynthase und Aspartokinase verstärkt werden. Die Aktivitäten von Dihydrodipicolinatsynthase und Aspartokinase in einem Methylophilus-Bakterium können verstärkt werden, indem ein Wirt wie ein Methylophilus-Bakterium mit einer rekombinanten DNA transformiert wird, die durch Ligieren eines Genfragments, welches Dihydrodipicolinatsynthase codiert, und eines Genfragments, welches Aspartokinase codiert, mit einem Vektor, der in dem Methylophilus-Bakterium funktioniert, vorzugsweise einem Vektor mit hoher Kopienzahl, hergestellt wird. Die Erhöhung der Kopienzahl der die Dihydrodipicolinatsynthase und Aspartokinase codierenden Gene in dem transformierten Stamm führt zu einer Verstärkung der Aktivitäten dieser Enzyme. Im Folgenden werden Dihydrodipicolinatsynthase, Aspartokinase und Aspartokinase III jeweils auch als DDPS, AK und AKIII bezeichnet.

Jeder Mikroorganismus kann die Gene bereitstellen, welche DDPS und AK codieren, solange der gewählte Mikroorganismus eine DDPS- und AK-Aktivität in einem Methylobacillus exprimieren kann. Solche Organismen können Wildtyp-Stämme oder hiervon abgeleitete mutierte Stämme sein. Insbesondere beinhalten Beispiele solcher Mikroorganismen den E. coli (Escherichia coli) K-12-Stamm, Methylobacillus glycogenes NCIMB 11375 usw. Da Nukleotidsequenzen für die Gene, die DDPS (dapA, Richaud, F. et al., J. Bacteriol., 297 (1986)) und AKIII (lysC, Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N und Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052 (1986)) codieren, bekannt sind, können diese Gene durch PCR erhalten werden, wobei Primer verwendet werden, die basierend auf den Nukleotidsequenzen dieser Gene synthetisiert werden, und wobei chromosomale DNA eines Mikroorganismus wie E. coli K-12 als Templat verwendet wird. Spezifische Beispiele beinhalten die von E. coli abgeleiteten dapA und lysC, wie hier erläutert, sind jedoch nicht hierauf beschränkt.

Vorzugsweise unterliegen die für die vorliegende Erfindung verwendeten DDPS und AK keiner Rückkopplungshemmung durch L-Lysin. Es ist bekannt, dass aus E. coli abgeleitete Wildtyp-DDPS einer Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unterliegt (siehe US-Patente 5,661,012 und 6,040,160), und dass die von E. coli abgeleitete Wildtyp-AKIII einer Suppression und Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unterliegt. Daher codieren dapA und lysC bevorzugt jeweils DDPS und AKIII, die jeweils eine Mutation enthalten, welche die Rückkopplungshemmung durch L-Lysin bei Einführung in ein Methylophilus-Bakterium ausschaltet. Im Folgenden wird die DDPS, welche eine Mutation enthält, die die Rückkopplungshemmung durch L-Lysin ausschaltet, auch als „mutierte DDPS" bezeichnet, und eine DNA, welche die mutierte DDPS codiert, kann auch als „mutiertes dapA" oder „dapA*" bezeichnet werden. Die von E. coli abgeleitete AKIII, welche eine Mutation enthält, die die Rückkopplungshemmung durch L-Lysin ausschaltet, kann auch als „mutierte AKIII" bezeichnet werden, und die DNA, welche die mutierte AKIII codiert, kann auch als „mutiertes IysC" bezeichnet werden.

Es ist in der vorliegenden Erfindung jedoch nicht immer notwendig, dass DDPS und AK mutiert werden. Beispielsweise ist bekannt, dass die von Corynebacterium abgeleitete DDPS keiner Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unterliegt (siehe koreanische Patentveröffentlichung Nr. 92-8382, US-Patente 5,661,012 und 6,040,160).

Eine aus E. coli stammende Nukleotidsequenz von Wildtyp-dapA ist beispielhaft in SEQ ID NO: 13 gezeigt, und die durch diese Nukleotidsequenz codierte Aminosäuresequenz der Wildtyp-DDPS ist beispielhaft in SEQ ID NO: 14 gezeigt.

Die DNA, welche die mutierte DDPS codiert, die keiner Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unterliegt, kann eine DNA sein, die DDPS mit der Aminosäuresequenz codiert, einschließlich des Austausch des Histidinrests an Position 118 durch einen Tyrosinrest. Weiterhin kann die DNA, welche die mutierte AKIII codiert, die keiner Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unterliegt, eine DNA sein, die AKIII mit der Aminosäuresequenz einschließlich des Austauschs von Threonin an Position 352 durch einen Isoleucinrest codiert (siehe US-Patente 5,661,012 und 6,040,160).

Das zum Genklonieren verwendete Plasmid kann irgendein Plasmid sein, solange es sich in Mikroorganismen wie Escherichia-Bakterien replizieren kann. Insbesondere beinhalten Beispiele solcher Bakterien pBR322, pTWV228, pMW119, pUC19 usw.

Vektoren, die in Methylophilus-Bakterien funktionieren, beinhalten beispielsweise ein Plasmid, das sich autonom in Methylophilus-Bakterien replizieren kann. Insbesondere beinhalten Beispiele RSF1010, welches ein Vektor mit breitem Wirtspektrum ist, sowie Derivate hiervon, pAYC32 (Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D. Plasmid, 16, 161-167 (1986)), pMFY42 (Gene, 44, 53 (1990)), pRP301, pTB70 (Nature, 287, 396, (1980)) usw.

Um eine rekombinante DNR über Ligation von dapA und lysC an einen Vektor, der in einem Methanol-assimilierenden Bakterium funktioniert, herzustellen, wird der Vektor mit einem für den Terminus eines DNA-Fragments, welches dapA und lysC enthält, geeigneten Restriktionsenzym verdaut. Die Ligation wird üblicherweise unter Verwendung einer Ligase wie T4-DNA-Ligase durchgeführt. Die Gene dapA und lysC können einzeln in separate Vektoren oder den gleichen Vektor einbezogen werden.

Ein Plasmid mit breitem Wirtsspektrum RSFD80 ist bekannt (WO 95/16042) und kann in der vorliegenden Erfindung als das Plasmid mit einem mutierten dapA, das eine mutierte DDPS codiert und einem mutierten lysC, das eine mutierte AKIII codiert, verwendet werden. Ein mit diesem Plasmid transformierter E. coli JM109-Stamm wurde als AJ12396 bezeichnet und beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (gegenwärtig die unabhängige Verwaltungsorganisation National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary) am 28. Oktober 1993 hinterlegt, wobei eine Zugangsnummer FERM P-13936 erhalten wurde. Dann wurde die Hinterlegung in eine internationale Hinterlegung unter den Vorschriften des Budapester Vertrags am 1. November 1994 umgewandelt, wobei eine Zugangsnummer FERM BP-4859 erhalten wurde. RSFD80 kann aus dem AJ12396-Stamm durch ein bekanntes Verfahren erhalten werden.

Jedes Verfahren kann verwendet werden, um die wie oben hergestellte rekombinante DNA in ein Methylophilus-Bakterium einzuführen, solange eine ausreichende Transformationseffizienz gewährleistet wird. Beispielsweise kann die Elektroporation verwendet werden (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)).

Die DDPS- und AK-Aktivitäten können auch durch die Gegenwart vielfacher Kopien von dapA und lysC auf der chromosomalen DNA eines Methylobacillus-Bakteriums verstärkt werden. Vielfache Kopien von dapA und lysC können in die chromosomale DNA eines Methylobacillus-Bakteriums durch homologe Rekombination eingeführt werden. Dies kann durchgeführt werden, indem auf eine Sequenz abgezielt wird, die auf chromosomaler DNA in vielfacher Kopienzahl vorliegt. Eine repetitive DNA oder ein invertierter Repeat, der am Ende eines transponiblen Elements vorliegt, kann als Sequenz verwendet werden, die in vielfacher Kopienzahl auf chromosomaler DNA vorliegt. Alternativ können vielfache Kopien von dapA und/oder lysC in die chromosomale DNA eingeführt werden, indem diese in ein Transposon einbezogen werden und dieses transferiert wird, wie in der japanischen Patentoffenlegung Nr. 2-109985 offenbart ist. Bei beiden Verfahren werden die Aktivitäten von DDPS und AK als Ergebnis der erhöhten Kopienzahlen von dapA und lysC in transformierten Stämmen verstärkt.

Neben den obigen Genamplifizierungsverfahren können die DDPS-Aktivität und AK-Aktivität verstärkt werden, indem Expressionskontrollsequenzen, wie Promoter von dapA und lysC, durch stärkere ausgetauscht werden (siehe japanische Patentoffenlegung Nr. 1-215280). Beispiele solcher starker Promoter sind bekannt und beinhalten den lac-Promoter, trp-Promoter, trc-Promoter, tac-Promoter, PR-Promoter und den PL Promoter von Lambdaphagen, den tet-Promoter, amyE-Promoter, spac-Promoter usw. Die Verwendung dieser starken Promoter verstärkt die Expression von dapA und lysC, womit die DDPS-Aktivität und AK-Aktivität verstärkt wird. Solche Genexpressionsverstärkungsverfahren können mit den oben beschriebenen Genamplifizierungsverfahren (Erhöhung der Kopienzahl von dapA und lysC) kombiniert werden.

Die Herstellung einer rekombinanten DNA kann erreicht werden, indem ein Genfragment und ein Vektor ligiert werden, nachdem der Vektor einmal mit einem Restriktionsenzym verdaut wurde, entsprechend dem Terminus des Genfragments. Die Ligation wird üblicherweise durch eine Ligase wie T4-DNA-Ligase durchgeführt. Die dem Fachmann bekannten gewöhnlichen Verfahren können als Verdauungsverfahren verwendet werden, Ligation von DNA, Herstellung chromosomaler DNA, PCR, Herstellung von Plasmid-DNA, Transformation, Konstruktion von Oligonukleotiden, die als Primer verwendet werden, usw. Solche Methoden sind in Sambrook, J., Fritsch, E.F., und Maniatis, T., „Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2. Ausgabe", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) usw. beschrieben.

Zusätzlich zur Verstärkung der DDPS- und AK-Genexpression oder -Aktivität können auch andere Enzyme, die an der L-Lysin-Biosynthese beteiligt sind, verstärkt werden. Solche Enzyme beinhalten Enzyme des Diaminopimelatwegs, wie Dihydrodipicolinatreduktase, Diaminopimelatdecarboxylase, Diaminopimelatdehydrogenase (siehe WO 96/40934 hinsichtlich sämt licher voranstehender Enzyme), Phosphoenolpyruvatcarboxylase (japanische Patentoffenlegung Nr. 60-87788), Aspartataminotransferase (japanische Patentveröffentlichung Nr. 6-102028), Diaminopimelatepimerase und Rspartat-Semialdehyddehydrogenase, Enzyme des Aminoadipatwegs wie Homoaconitathydratase usw.

Aspartokinase, Aspartat-Semialdehyddehydrogenase, Dihydrodipicolinatsynthase, Dihydrodipicolinatreduktase und Diaminopimelatdecarboxylase, abgeleitet von Methylophilus methylotrophus als Methanol-assimilierendem Bakterium, sind in WO 00/61723 beschrieben.

Weiterhin können die Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung eine verminderte Aktivität eines Enzyms aufweisen, welches eine Reaktion zur Bildung einer anderen Verbindung als L-Lysin durch Abzweigung vom Biosyntheseweg für L-Lysin katalysiert, oder ihnen kann ein solches Enzym fehlen. Illustrative Beispiele des Enzyms, welches eine Reaktion zur Bildung einer anderen Verbindung als L-Lysin durch Abzweigung vom Biosyntheseweg für L-Lysin katalysiert, beinhalten Homoserindehydrogenase (siehe WO 95/23864).

Die zuvor erwähnten Verfahren zur Verstärkung der Aktivitäten von an der L-Lysin-Biosynthese beteiligten Enzymen können ähnlich für L-Arginin verwendet werden.

Die Fähigkeit zur Produktion von L-Arginin kann verbessert werden, indem die Acetylornithindeacetylaseaktivität, die N-Acetylglutamat-γ-semialdehyddehydrogenaseaktivität, N-Acetylglutamokinaseaktivität und Argininosuccinaseaktivität verstärkt werden (siehe japanische Patentveröffentlichung Nr. 5-23750).

Die Fähigkeit zur Produktion von L-Arginin kann weiterhin verbessert werden, indem die Aktivität von Glutamatdehydrogenase ( EP 1 057 893 A1 ), Argininosuccinatsynthase ( EP 0 999 267 A1 ), Carbamoylphosphatsynthetase ( EP 1 026 247 A1 ) oder N-Acetylglutamatsynthase (siehe japanische Patentoffenlegung Nr. 57-5693) verstärkt werden, oder indem das Gen, welches einen Argininrepressor codiert (argR), zerstört wird.

Herstellung von L-Lysin oder L-Arginin

L-Lysin oder L-Rrginin können hergestellt werden, indem ein Methylobacillus-Bakterium mit L-Lysin- oder L-Arginin-Produktionsfähigkeit kultiviert wird. L-Lysin oder L-Arginin können wie oben beschrieben bei der Herstellung und Akkumulation aus einem Medium gewonnen werden. L-Lysin oder L-Arginin können dann aus der Kultur gewonnen werden.

Der für die vorliegende Erfindung verwendete Mikroorganismus kann durch ein typischerweise bei der Kultivierung eines Methanol-assimilierenden Mikroorganismus eingesetztes Verfahren kultiviert werden. Das für die vorliegende Erfindung verwendete Medium kann entweder ein natürliches oder ein synthetisches Medium sein, solange es eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Ionen und andere organische Bestandteile in Spurenmengen nach Bedarf enthält.

Wenn Methanol als Hauptkohlenstoffquelle verwendet wird, können L-Lysin oder L-Arginin bei geringen Kosten hergestellt werden. Wenn Methanol als Hauptkohlenstoffquelle verwendet wird, wird es in einer Menge von 0,001 bis 30 % zu einem Medium gegeben. Als Stickstoffquelle wird Ammoniumsulfat oder Ähnliches verwendet, indem dieses dem Medium zugesetzt wird. Weiterhin können Bestandteile in Spurenmengen, wie Kaliumphosphat, Natriumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisensulfat, Mangansulfat usw. in geringen Mengen zugegeben werden.

Die Kultivierung wird üblicherweise unter aeroben Bedingungen unter Schütteln oder unter Belüften beim Schütteln oder Ähnlichem bei einem pH von 5 bis 9 und einer Temperatur von 20 bis 45°C durchgeführt, und ist typischerweise nach 24 bis 120 Stunden beendet.

L-Lysin oder L-Arginin können üblicherweise aus der Kultur durch eine Kombination eines Ionenaustauschharzverfahrens, eines Fällungsverfahrens und anderen bekannten Verfahren gewonnen werden.

Beispiele

Im Folgenden wird die Erfindung ausführlicher mit Bezug auf die folgenden Beispiele erläutert.

Die in den folgenden Beispielen verwendeten Reagenzien wurden von Wako Pure Chemicals oder Nacalai Tesque erhalten, wenn nicht anders angegeben. Die Zusammensetzungen der in jedem Beispiel verwendeten Medien sind unten gezeigt. Der pH wurde für alle Medien mit NaOH oder HCl eingestellt.

LB-Medium:

Trypton Pepton (Difco)	10 g/l
Hefeextrakt (Difco)	5 g/l

NaCl 10	g/l
pH7

Diese wurden bei 120°C für 20 Minuten dampfsterilisiert.

LB-Agarmedium:
LB-Medium
Bacto Agar 15 g/l

Diese wurden bei 120°C für 20 Minuten dampfsterilisiert.

SEII-Medium (siehe Journal of General Microbiology (1989) 125, 135, 3153-3164, Silman N. J., Carver M. A. & Jones C.W.; ein Teil der Zusammensetzung wurde modifiziert):

K₂HPO₄	1,9 g/l
NaH₂PO₄	1,56 g/l
MgSO₄·7H₂O	0, 2 g/l
(NH₄)₂SO₄	5 g/l
CuSO₄·5H₂O	5 μg/l
MnSO₄·5H₂O	25 μg/l
ZnSO₄·7H₂O	23 μg/l
CaCl₂·2H₂O	72 mg/l
FeCl₃·6H₂O	9,7 mg/l
CaCO₃ (Kanto Kagaku)	30 g/l
Methanol	2 % (Vol/Vol)
pH 7,0

Ausgenommen Methanol wurden die Bestandteile bei 121°C für 15 Minuten dampfsterilisiert. Nachdem die Bestandteile ausreichend abgekühlt waren, wurde Methanol zugegeben.

SEII-Agarmedium:

K₂HPO₄	1,9 g/l
NaH₂PO₄	1,56 g/l

MgSO₄·7H₂O	0, 2 g/l
(NH₄)₂SO₄	5 g/l
CuSO₄·5H₂O	5 μg/l
MnSO₄·5H₂O	25 μg/l
ZnSO₄·7H₂O	23 μg/l
CaCl₂·2H₂O	72 mg/l
FeCl₃·6H₂O	9,7 mg/l
Methanol	0,5% (Vol/Vol)
pH 7, 0
Bacto Agar (Difco)	15 g/l

Beispiel 1

Einführung des aus Brevibacterium-Bakterium abgeleiteten lysE-Gens in ein Methylophilus-Bakterium

Ein lysE-Gen, welches ein homologes Gen des für Corynebacterium glutamicum R127 bekannten, die Sekretion von L-Lysin fördernden Gens war, wurde aus einem Brevibacterium lactofermentum 2256-Stamm kloniert, und es wurde die Expression in einem Methylophilus-Bakterium versucht.

(I) Konstruktion von pRSlysE

Um lysE in ein Methylophilus-Bakterium einzuführen, wurde ein bekanntes Plasmid pRS (siehe internationale Patentveröffentlichung in Japanisch (Kohyo) Nr. 3-501682) verwendet, um ein Plasmid pRS1ysE zur Expression von lysE zu konstruieren. pRS ist ein Plasmid, welches das Vektorsegment des pVIC40-Plasmids enthält (internationale Patentveröffentlichung WO 90/04636, internationale Patentveröffentlichung in Japanisch Nr. 3-501682) und wird aus pVIC40 erhalten, indem ein DNA-Bereich deletiert wird, der das in dem Plasmid enthaltene Threoninoperon codiert. Das Plasmid pVIC40 stammt aus einem Vektorplasmid mit einem breiten Wirtsspektrum pAYC32 (Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D., Plasmid, 1986, 16, 161-167), welches ein Derivat von RSF1010 ist.

Zunächst wurde ein den tac-Promoter aufweisendes Plasmid pRStac gemäß dem in 1 gezeigten Schema aus pRS konstruiert. Das pRStac-Plasmid wurde wie folgt konstruiert. Der pRS-Vektor wurde mit Restriktionsenzymen EcoRI und PstI verdaut und einer Phenol/Chloroform-Lösung zugegeben und vermischt, um die Reaktion zu beenden. Nachdem das Reaktionsgemisch zentri-fugiert wurde, wurde die obere Schicht gesammelt, und DNA wurden durch Ethanolfällung gewonnen und auf einem 0,8 % Agarosegel aufgetrennt. Ein DNA-Fragment von 8 Kilobasen-paaren (im Folgenden „kbp") wurde unter Verwendung von EASY TRAP Ver. 2 (DNA collection kit, Takara Shuzo) gewonnen. Alternativ wurde der tac-Promoterbereich durch PCR ampli-fiziert, wobei das pKK223-3-Plasmid (Expressionsvektor, Pharmacia) als Templat sowie die in SEQ ID NO: 1 und 2 gezeigten Primer verwendet wurden (ein Zyklus, bestehend aus Denaturierung bei 94°C für 20 Sekunden, Anneal bei 55°C für 30 Sekunden und Verlängerungsreaktion bei 72°C für 60 Sekunden, wurde für 30 Zyklen wiederholt). Pyrobest DNA-Polymerase (Takara Shuzo) wurde für die PCR verwendet. Das den amplifizierten tac-Promoter enthaltende DNA-Fragment wurde unter Verwendung von PCR prep (Promega) gereinigt und anschließend an den Restriktionsenzymstellen, die zuvor in dem Primern konstruiert wurden, d.h. an den EcoRI- und EcoT22I-Stellen, verdaut. Dann wurde das Reaktionsgemisch einer Phenol/Chloroform-Lösung zugegeben und vermischt, um die Reaktion zu beenden. Nachdem das Reaktionsgemisch zentri-fugiert wurde, wurde die obere Schicht gesammelt, und DNA wurden durch Ethanolfällung gewonnen und auf einem 0,8 % Agarosegel aufgetrennt. Ein DNA-Fragment von ungefähr 0,15 kbp wurde unter Verwendung von EASY TRAP Ver. 2 gewonnen.

Das Verdauungsprodukt des pRS-Vektors und das wie oben beschrieben hergestellte tac-Promoter-bereichfragment wurden unter Verwendung des DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) ligiert. Diese Ligationsreaktionslösung wurde verwendet, um Escherichia coli (E. coli JM109 kompetente Zellen, Takara Shuzo) zu transformieren. Die Zellen wurden auf ein LB-Agarmedium, welches 20 mg/l Streptomycin enthielt, plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die auf dem Agarmedium erschienenen Kolonien wurden jeweils in ein LB-Flüssigmedium geimpft, welches 20 mg/l Streptomycin enthielt, und 8 Stunden unter Schütteln bei 37°C kultiviert. Plasmid-DNA wurde aus jeder Kulturlösung durch das Alkali-SDS-Verfahren extrahiert, und die Struktur jedes Plasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymen bestätigt, wobei pRStac erhalten wurde. Ein Plasmid, bei dem die Transkrip-tionsrichtungen des Streptomycinresistenzgens auf dem pRS-Vektor und des tac-Promoters zueinander identisch waren, wurde als pRStac ausgewählt.

Das wie oben beschrieben erhaltene pRStac wurde mit Sse8387I (Takara Shuzo) und SapI (New England Biolabs) verdaut, einer Phenol/Chloroform-Lösung zugegeben und vermischt, um die Reaktion zu beenden. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert wurde, wurde die obere Schicht gesammelt, DNA wurden durch Ethanolfällung gewonnen und auf einem 0,8 % Agarosegel aufgetrennt, wobei ein DNA-Fragment von ungefähr 9,0 kbp erhalten wurde.

Das lysE-Genfragment wurde ebenfalls mittels PCR unter Verwendung eines Chromosoms, das aus dem Brevibacterium lactofermentum 2256-Stamm (ATCC13869) extrahiert wurde, als Templat, und der in SEQ ID NO: 5 und 6 gezeigten Primer amplifiziert (Denaturierung bei 94°C für 20 Sekunden, Anneal bei 55°C für 30 Sekunden und Verlängerungsreaktion bei 72°C für 90 Sekunden). Pyrobest DNA-Polymerase (Takara Shuzo) wurde für die PCR verwendet. Um eine Expression des lysE-Gens in einem Methylophilus-Bakterium möglich zu machen, wurden die Primer so konstruiert, dass die Nukleotide von 9-15 bp vom Translationsinitiierungscodon des lysE-Gens durch eine Sequenz ausgetauscht sein sollten, von der bekannt ist, dass sie in einem Methylophilus-Bakterium funktioniert (Wyborn, N.R., Mills, J., Williamis, S.G. und Jones, C.W., Euro. J. Biochem., 240, 314-322 (1996)). Das erhaltene Fragment wurde unter Verwendung von PCR prep (Promega) gereinigt und dann mit Sse8387I und SapI verdaut. Das Reaktionsgemisch wurde zu einer Phenol/Chloroform-Lösung gegeben und vermischt, um die Reaktion zu beenden. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert wurde, wurde die obere Schicht gesammelt, und DNA wurde durch Ethanolfällung gewonnen und weiter aus einem 0,8 Agarosegel gewonnen.

Die Verdauungsprodukte des pRStac-Vektors und das wie oben beschrieben hergestellte lysE-Genbereichfragment wurden unter Verwendung des DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) ligiert. Diese Ligationsreaktionslösung wurde verwendet, um Escherichia coli (E. coli JM109 kompetente Zellen, Takara Shuzo) zu transformieren. Die Zellen wurden auf ein LB-Agarmedium plattiert, das 20 mg/l Streptomycin enthielt, und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die auf dem Agarmedium erschienenen Kolonien wurden jeweils in ein LB-Flüssigmedium, welches 20 mg/l Streptomycin enthielt, geimpft und unter Schütteln 8 Stunden bei 37°C kultiviert. Plasmid-DNA wurde aus jeder Kulturlösung durch das Alkali-SDS-Verfahren extrahiert, und die Struktur jedes Plasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymen und Bestimmung der Nukleotidsequenz bestätigt, wobei das Vorliegen von pRSlysE bestätigt wurde (1). In pRSlysE war das lysE-Gen so positioniert, dass dessen Transkriptionsrichtung die gleiche war wie die des tac-Promoters.

(2) Einführung von pRSlysE in ein Methylophilus-Bakterium

Das wie oben beschrieben erhaltene pRSlysE wurde mittels Elektroporation (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)) in den Methylophilus methylotrophus AS1-Stamm (NCIMB10515) eingeführt. Weiterhin wurde pRS auch als Kontrolle auf die gleiche Weise wie für pRSlysE in den AS1-Stamm eingeführt. Als Ergebnis wurden mehrere Tausend Kolonien pro 1 μg DNA bei Verwendung von pRS als Kontrolle erhalten, wohingegen nur einige Kolonien mit pRSlysE erhalten wurden.

Wenn Plasmide aus transformierten Stämmen extrahiert wurden, von denen angenommen wurde, dass in diese pRSlysE eingeführt war, und deren Nukleotidsequenzen untersucht wurden, war bei allen untersuchten Plasmiden eine spontane Mutation in einem lysE-codierenden Bereich eingeführt, und in einigen Fällen war eine Nonsense-Mutation bzw. Nichtsinn-Mutation als Mutation eingeführt, wodurch ein eine Aminosäure codierendes Codon durch ein Stoppcodon ausgetauscht war, was die Translation terminierte. In anderen Plasmiden wurde eine Deletion in dem lysE-Gen beobachtet. In jedem Fall ging die Funktion von lysE in pRSlysE verloren. Wenn jedoch ein Plasmid hergestellt wurde, in welchem ein Teil des lysE codierenden Bereichs absichtlich deletiert war, so dass die Funktion des lysE-Gens ausgeschaltet war (pRSlysE 1) und in Methylophilus methylotrophus eingeführt wurde, konnte es mit einer gleichen Häufigkeit wie bei derjenigen des pRS-Kontrollvektors eingeführt werden.

Das zuvor erwähnte pRSlysE 1 war ein Plasmid, in welchem ein Bereich des PvuI-Orts (erkennt CGATCG der Positionen 203-209 in SEQ ID NO: 7) bis zum MluI-Ort (erkennt ACGCGT der Positionen 485-491 hiervon), der in dem lysE codierenden Bereich vorliegt, deletiert war. Insbesondere wurde pRSlysE durch Verdauung mit PvuI und MluI (Takara Shuzo) konstruiert, einer Phenol-Chloroform-Lösung zugesetzt und vermischt, um die Reaktion zu beenden. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert war, wurde die obere Schicht gesammelt, und DNA wurden durch Ethanolfällung gewonnen und auf einem 0,8 Agarosegel aufgetrennt, wobei ein DNA-Fragment von ungefähr 10 kbp erhalten wurde. Dieses DNA-Fragment wurde unter Verwendung des DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) mit einem glatten Ende versehen. Das Produkt wurde unter Verwendung des DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) selbst-ligiert.

Diese Ligationsreaktionslösung wurde verwendet, um Escherichia coli (E. coli JM109 kompetente Zellen, Takara Shuzo) zu transformieren. Die Zellen wurden auf ein LB-Agarmedium plattiert, das 20 mg/l Streptomycin enthielt, und unter Schütteln 8 Stunden bei 37°C kultiviert. Aus jeder Kulturlösung wurde Plasmid-DNA durch das Alkali-SDS-Verfahren extrahiert, und die Struktur jedes Plasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymen bestätigt, wobei das Plasmid pRSlysE 1 erhalten wurde.

Wie oben beschrieben, war die Einführungshäufigkeit von pRSlysE, das die volle Länge des lysE-Gens trägt, in Methylophilus methylotrophus extrem niedrig, und nur Plasmide mit einem mutierten lysE-Gen, das eine Mutation enthielt, welche die Funktion ausschaltete, konnten eingeführt werden. Unter Berücksichtigung dieser Tatsachen insgesamt wurde angenommen, dass die Einführung des lysE-Gens in Methylophilus methylotrophus letal war. Dies zeigt, dass das lysE-Gen nicht universell zur Sekretion von L-Lysin in heterogenen Bakterien funktionieren kann.

Der Methylophilus methylotrophus AS1-Stamm, der das die oben beschriebene Mutation enthaltende pRSlysE enthielt, wurde auf eine SEII-Platte aufgebracht, die 20 mg/l Streptomycin enthielt, und über Nacht bei 37°C kultiviert. Dann wurden die Zellen von ungefähr 0,3 cm² der Mediumoberfläche abgekratzt, in ein SEII-Produktionsmedium (20 ml), welches 20 mg/l Streptomycin enthielt, eingeimpft, und unter Schütteln 34 Stunden bei 37°C kultiviert. Nach Beendigung der Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifugation entfernt, und die L-Lysin-Konzentration in dem Kulturüberstand wurde unter Verwendung eines Aminosäureanalysators (Nihon Bunko, Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie) bestimmt. Als Ergebnis wurde im Wesentlichen kein Stamm erhalten, in welchem die Sekretion von L-Lysin verstärkt war, trotz Einführung des mutierten lysE-Gens.

Die meisten der mutierten lysE-Gene, welche in Methylophilus-Bakterien enthalten waren, wiesen Mutationen auf, welche die ursprüngliche Funktion des Wildtyp-LysE ausschalteten. Es wird vermutet, dass die mutierten lysE in Methylophilus-Bakterien eingeführt werden konnten, da diese mutierten lysE nicht funktionierten und nicht letal waren. Es sei angemerkt, dass diese mutierten lysE von lysE24 verschieden waren.

Gewinnung eines Gens, das eine L-Lysin-Sekretionsaktivität in Methylophilus-Bakterien bereitstellt

Wie im vorhergehenden Abschnitt beschrieben ist, ist das bekannte lysE-Gen in Methylophilus-Bakterien letal, und als Ergebnis wurden anschließend viele mutierte Gene erhalten, bei denen die Funktion fehlte.

Während der Analyse des eine Mutation enthaltenden pRSlysE wurde ein mutiertes lysE-Gen erhalten, das in Methylophilus-Bakterien funktionierte, jedoch nicht letal war.

Dieses mutierte lysE-Gen wurde als lysE24-Gen bezeichnet. Bei Analyse der Nukleotidsequenz des lysE24-Gens wurde gefunden, dass diese Mutation nicht zu einer Aminosäuresubstitution, sondern zu einer Nonsense-Mutation, bei der ein Stopp-codon um das Zentrum des Translationsbereichs von lysE herum eingeführt war. Es wurde berichtet, dass das lysE-Gen von Corynebacterium-Bakterien ein Membranprotein mit sechs hydrophoben Helices codiert (Vrlijc M., Sahm H. und Eggerling L., Molecular Microbiology 22: 815-826 (1996)). Im Gegensatz dazu wurde gefunden, dass das durch dieses Gen codierte Protein eine von der des Wildtyp-LysE-Protein verschiedene Struktur aufwies, da das obige lysE24-Gen ein Stoppcodon enthielt. Als ein Ergebnis funktionierte die lysE-Mutante aufgrund dieser Struktur in Methylophilus-Bakterien.

Die Nukleotidsequenz von lysE24 und die durch die Nukleotidsequenz codierte Aminosäuresequenz sind jeweils in den SEQ ID NO: 9 und 10 gezeigt. Die Nukleotidsequenz des Wildtyp-LysE und die durch die Nukleotidsequenz codierte Aminosäuresequenz sind in den SEQ ID NO: 7 und 8 gezeigt. In lysE24 war T (Thymin) nach G (Guanin) an der 355. Position des Wildtyp-lysE-Gens inner-tiert. Das Plasmid mit lysE24 wurde als pRSlysE24 bezeichnet (1). Wenn pRSlysE24 erneut in den AS1-Stamm eingeführt wurde, konnte das Plasmid mit einer Häufigkeit eingeführt werden, die im Wesentlichen gleich der von pRS war. In Tabelle 1 ist das Ergebnis der L-Lysin-Konzentrationsmessung für den Kulturüberstand des Stamms, in den das Plasmid eingeführt war, gezeigt, wobei die Messung auf gleiche Weise wie oben durchgeführt wurde (Beispiel 1, Teil (2)).

Tabelle 1

Der mit pRSlysE24 transformierte E. coli JM109-Stamm wurde als AJ13830 bezeichnet, und dieser Stamm wurde bei der unabhängigen Verwaltungsgesellschaft National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, am 4. Juni 2001 hinterlegt und erhielt die Zugangsnummer FERM P-18369. Dann wurde die Hinterlegung in eine internationale Hinterlegung unter den Vorschriften des Budapester Vertrags am 13. Mai 2002 umgewandelt und erhielt die Zugangsnummer FERM BP-8040.

Der AS1-Stamm, der ein Plasmid enthielt, welches aus dem lysE24-Gen durch Deletieren eines Bereichs stromabwärts des Stoppcodons, das durch die zuvor erwähnte Mutation erzeugt wurde, erhalten wurde, das heißt das in Beispiel 1, Teil (1), beschriebene pRSlysE 1-Plasmid, akkumulierte L-Lysin im Medium nicht. Auf Grundlage dieses Ergebnisses wurde angenommen, dass nicht nur die erste Hälfte des Peptids, sondern auch die letztere Hälfte des Peptids von dem lysE-Gen unter Bildung eines Komplexes exprimiert wurde.

Beispiel 2

Wie oben beschrieben, wurde gefunden, dass das lysE-Gen, welches homolog zu dem Gen ist, das die Sekretion von L-Lysin für ein Corynebacterium erleichtert, in Methylophilus-Bakterien überhaupt nicht funktionierte, wohingegen dessen Variante lysE24 in Methylophilus-Bakterien funktionierte. Entsprechend wurde untersucht, ob das lysE-Gen eines Corynebacteriums und das in Beispiel 1 erhaltene lysE24 in einem Methylobacillus-Bakterium funktionierten.

(1) Konstruktion von pRSlysE-Tc

Um das von einem Corynebacterium abgeleitete Wildtyp-lysE-Gen in ein Methylobacillus-Bakterium einzuführen, wurde zunächst der Arzneimittelresistenzmarker des in Beispiel 1 konstruierten pRSlysE von einem Streptomycinresistenzgen zu einem Tetracyclinresistenzgen geändert. Dies beruhte darauf, dass eine Streptomycinresistenz nicht als Marker verwendet werden kann, da Methylobacillus-Bakterien ursprünglich eine Resistenz gegen Streptomycin aufwiesen.

Insbesondere wurde pRSlysE zunächst mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut, zu einer Phenol/Chloroform-Lösung gegeben und vermischt, um die Verdauungsreaktion zu beenden. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert war, wurde die Lösung der oberen Schicht gesammelt, und DNA-Fragmente wurden durch Ethanolfällung gewonnen und durch eine 0,8 % Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt. Unter Verwendung von EASY TRAP Ver. 2 (DNA Collection Kit, Takara Shuzo) wurde ein DNA-Fragment von ungefähr 10 kbp gewonnen.

Der Tetracyclinresistenzgenbereich wurde durch PCR unter Verwendung von pRK 310 (Journal of Molecular Biology 239, 623-663 (1994)) als Templat-DNA und den in SEQ ID NO: 11 und 12 gezeigten DNA-Primern amplifiziert (ein Zyklus, bestehend aus einer Denaturierung bei 94°C für 20 Sekunden, einem Anneal bei 55°C für 30 Sekunden und einer Verlängerungsreaktion bei 72°C für 60 Sekunden, wurde für 30 Zyklen wiederholt). Pyrobest DNA-Polymerase (Takara Shuzo) wurde für die PCR verwendet. Das das amplifizierte Tetracyclinresistenzgen enthaltende DNA-Fragment wurde unter Verwendung von PCR prep (Promega) gereinigt und dann durch Ethanolfällung gewonnen. Dieses Fragment wurde an den zuvor in den Primern konstruierten Restriktionsorten weiterverdaut, d.h. an der EcoRI-Stelle verdaut, und einer Phenol/Chloroform-Lösung zugegeben und vermischt, um die Reaktion zu beenden. Anschließend wurde, nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert wurde, die obere Schicht gesammelt, und DNA wurden durch Ethanolfällung gewonnen. Dann wurde das Ziel-DNA-Fragment durch 0,8 Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt, wobei ein DNA-Fragment von ungefähr 1,5 kbp erhalten wurde.

Das Tetracyclinresistenzgen kann auch auf die gleiche Weise wie oben beschrieben durch PCR unter Verwendung eines anderen Plasmids anstelle von pRK310 erhalten werden, beispielsweise des pRK2-Plasmids, einem Mutterplasmid von pRK310 (erhältlich als NICMB11968 von NICMB, siehe Science, 190, 1226-1228 (1975) oder Plasmid, 5, 10-19 (1981)), als Templat.

Das wie oben beschrieben hergestellte, von pRSlysE abgeleitete DNA-Fragment und das DNA-Fragment, das den Tetracyclin-resistenzgenbereich enthielt, wurden unter Verwendung des DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) ligiert. Dieses Reaktions-gemisch wurde zur Transformierung von kompetenten E. coli JM109-Zellen (Takara Shuzo) verwendet. Die Zellen wurden auf ein LB-Agarmedium plattiert, welches 20 mg/l Streptomycin und 15 mg/l Tetracyclin enthielt, und über Nacht bei 37°C kultiviert. Die auf dem Agarmedium erschienenen Kolonien wurden jeweils in ein LB-Flüssigmedium geimpft, das 20 mg/l Streptomycin und 15 mg/l Tetracyclin enthielt, und 8 Stunden unter Schütteln bei 37°C kultiviert. Plasmid-DNA wurde aus dieser Kulturlösung durch das Alkali-SDS-Verfahren extra-hiert, und die Struktur jedes Plasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymen bestätigt, wobei pRSlysE-Tc erhalten wurde.

(2) Einführung von pRSlysE-Tc in ein Methylobacillus-Bakterium

Das wie oben beschrieben erhaltene pRSlysE-Tc wurde in den Methylobacillus glycogenes NCIMB11375-Stamm durch Elektro poration (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)) eingeführt. Als Kontrolle wurde pRK310 auf die gleiche Weise wie für pRSlysE-Tc in den NCIMB13375-Stamm eingeführt. Als Ergebnis wurden mehrere Tausend Kolonien pro 1 μg DNA bei Verwendung von pRK310 als Kontrolle erhalten, wohingegen nur einige Kopien mit pRSlysE-Tc erhalten wurden. So wurde gefunden, dass das von einem Corynebacterium-Bakterium abgeleitete lysE-Gen in Methylobacillus-Bakterien wie in Methylophilus-Bakterien nicht funktionierte.

(3) Konstruktion von pRSlysE24-Tc

Anschließend wurde, um zu untersuchen, ob lysE24 in Methylobacillus-Bakterien funktionierte, der Arzneimittelresistenzmarker des in Beispiel 1 konstruierten pRSlysE24-Plasmids vom Streptomycinresistenzgen zu einem Tetracyclinresistenzgen verändert.

Insbesondere wurde pRSlysE zunächst mit einem Restriktionsenzym EcoRI verdaut, zu einer Phenol/Chloroform-Lösung gegeben und vermischt, um die Verdauungsreaktion zu beenden. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert war, wurde die Lösung der oberen Schicht gesammelt, und DNA-Fragmente wurden durch Ethanolfällung gewonnen und durch eine 0,8 % Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt. Unter Verwendung von ERSY TRAP Ver. 2 (DNA Collection Kit, Takara Shuzo) wurde ein DNA-Fragment von ungefähr 10 kbp gewonnen.

Weiterhin wurde das Tetracyclinresistenzgenfragment auf die gleiche Weise wie oben beschrieben erhalten, indem der Genbereich von pRK310 durch PCR unter Verwendung der in SEQ ID NO: 11 und 12 gezeigten Primer amplifiziert wurde, und das Fragment mit EcoRI verdaut wurde.

Das wie oben beschrieben hergestellte, von pRSlysE24 stammende DNA-Fragment und das den Tetracyclinresistenzgenbereich enthaltende DNA-Fragment wurden unter Verwendung des DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) ligiert. Dieses Reaktionsgemisch wurde verwendet, um kompetente E. coli JM109-Zellen (Takara Shuzo) zu transformieren. Die Zellen wurden auf ein LB-Agarmedium plattiert, welches 20 mg/l Streptomycin und 15 mg/l Tetracyclin enthielt, und über Nacht bei 37°C kultiviert. Die auf dem Agarmedium erschienenen Kolonien wurden jeweils in ein LB-Flüssigmedium geimpft, das 20 mg/l Streptomycin und 15 mg/l Tetracyclin enthielt, und 8 Stunden unter Schütteln bei 37°C kultiviert. Plasmid-DNA wurde aus dieser Kulturlösung durch das Alkali-SDS-Verfahren extrahiert, und die Struktur jedes Plasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymen bestätigt, wobei pRSlysE24-Tc erhalten wurde.

(4) Einführung von pRSlysE24-Tc in das Methylobacillus-Bakterium

Das wie oben beschrieben erhaltene pRSlysE24-Tc wurde in den Methylobacillus glycogenes NCIMB11375-Stamm durch Elektroporation eingeführt (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)). Weiterhin wurde als Kontrolle pRK310 in den NCIMB11375-Stamm eingeführt. Als Ergebnis konnte pRSlysE24-Tc mit im Wesentlichen der gleichen Häufigkeit wie bei der Kontrolle pRK310 eingeführt werden. Die Ergebnisse der Messung der L-Lysin-Konzentration für Kulturüberstände der Stämme, in die das Plasmid eingeführt wurde, sind in Tabelle 2 gezeigt, wobei die Messung auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1, Teil (2), durchgeführt wurde.

Tabelle 2

Es wurde gefunden, dass die Einführung des lysE24-Gens in den Methylobacillus glycogenes NICMB11375-Stamm zu einer Anhäufung von L-Lysin im Medium führte. Es wurde ermittelt, dass dies auf der Verstärkung der Sekretion von L-Lysin beruhte. Wenn weiterhin die Konzentrationen anderer L-Aminosäuren in dem Kulturüberstand untersucht wurden, war L-Arginin bei dem NCIMB11375/pRSlysE24-Tc-Stamm akkumuliert, und es wurde so gefunden, dass lysE24 eine Aktivität zur Sekretion nicht nur von L-Lysin, sondern auch von L-Arginin aufwies.

Aus der obigen Untersuchung wurde gefunden, dass lysE24, welches in Methylophilus-Bakterien funktionierte, auch in Methylobacillus-Bakterien funktionierte.

Beispiel 3: Einführung des L-Lysin-Biosynthesesystemenzymgens und des lysE24-Gens in Methylobacillus glycogenes

Es wurde gefunden, dass das lysE24-Gen bei Einführung in den Methylobacillus glycogenes NCIMB11375-Stamm L-Lysin im Medium akkumulierte. Es wurde angenommen, dass dies auf der Verstärkung der Sekretion von L-Lysin beruhte. Daher wurde die Wirkung der Einführung des lysE24-Gens in Methylobacillus glycogenes auf die Verstärkung des L-Lysin-Biosynthesegens untersucht.

<1> Konstruktion des Plasmids pRSdapA mit einem dapA*-Gen

Ein Plasmid mit einem Dihydrodipicolinatsynthase codierenden Gen, welches keiner Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unterlag (dapA*), wurde als L-Lysin-Biosynthesesystemenzymgen hergestellt.

Das in Beispiel 1 hergestellte pRStac wurde mit Sse8387I und XbaI verdaut und zu einer Phenol/Chloroform-Lösung zugesetzt und vermischt, um die Reaktion zu beenden. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert wurde, wurde die obere Schicht gesammelt und DNA wurden durch Ethanolfällung gesammelt und auf einem 0,8% Agarosegel getrennt, wobei ein DNA-Fragment von ungefähr 9 kbp gewonnen wurde.

Das dapA*-Genfragment wurde mittels PCR unter Verwendung des bekannten Plasmids RSFD80 (siehe WO 90/16042), welches dieses Gen als Templat enthielt, und den in SEQ ID NO: 3 und 4 gezeigten Primern, amplifiziert (Denaturierung bei 94°C für 20 Sekunden, Anneal bei 55°C für 30 Sekunden und Verlängerungsreaktion bei 72°C für 60 Sekunden). Pyrobest DNA-Polymerase (Takara Shuzo) wurde zur PCR verwendet. Das erhaltene dapA*-Fragment wurde unter Verwendung von PCR prep (Promega) gereinigt und dann mit den Restriktionsenzymen Sse8387I und XbaI verdaut. Das Reaktionsgemisch wurde zu einer Phenol/ Chloroform-Lösung gegeben und vermischt, um die Reaktion zu beenden. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert wurde, wurde die obere Schicht gesammelt und DNA wurden durch Ethanolfällung gewonnen und auf einem 0,8 % Agarosegel getrennt, wobei ein DNA-Fragment von ungefähr 0,1 kbp gewonnen wurde.

Das Verdauungsprodukt des pRStac-Vektors und das wie oben beschrieben hergestellte dapA*-Genbereichfragment wurden unter Verwendung des DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) ligiert. Diese Ligationsreaktionslösung wurde zur Transformation von Escherichia coli (E. coli JM109 kompetente Zellen, Takara Shuzo) verwendet. Die Zellen wurden auf ein LB-Agarmedium plattiert, das 20 mg/l Streptomycin enthielt, und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die auf dem Agarmedium erschienenen Kolonien wurden jeweils in ein LB-Flüssigmedium geimpft, das 20 mg/l Streptomycin enthielt, und für 8 Stunden bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Plasmid-DNA wurde aus jeder Kulturlösung durch das alkalische SDS-Verfahren extrahiert, und die Struktur jedes Plasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymen und Bestimmung der Nukleotidsequenz bestätigt, wobei das Vorliegen des pRSdapA-Plasmids bestätigt wurde. In dem pRSdapA-Plasmid war das dapA*-Gen so positioniert, dass dessen Transkriptionsrichtung die gleiche war wie die des tac-Promoters.

Der mit dem pRSdapA-Plasmid transformierte E. coli JM109-Stamm wurde als AJ13831 bezeichnet, und dieser Stamm wurde bei der unabhängigen Verwaltungsgesellschaft National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, am 4. Juni 2001 hinterlegt und erhielt die Zugangsnummer FERM P-18370. Dann wurde die Hinterlegung in eine internationale Hinterlegung unter den Vorschriften des Budapester Vertrags am 13. Mai 2002 umgewandelt und erhielt die Zugangsnummer FERM BP-8041.

<2> Konstruktion eines Plasmids mit lysE24 und dapA*, SlysE24-dapA-Tc

Ein Plasmid mit pRSlysE24, worin das dapA*-Gen insertiert war, wurde gemäß dem in 2 gezeigten Schema konstruiert, um die Wirkung der Kombination von lysE24 und dapA* zu bewerten.

Das in Beispiel 1 hergestellte pRSlysE24 wurde mit einem Restriktionsenzym SapI verdaut und unter Verwendung des DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) mit einem glatten Ende versehen. Das dapA* aufweisende Plasmid pRSdapA wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und SapI verdaut, und ein Fragment von ungefähr 1 kbp, welches den tac-Promoter und den dapA*-Bereich enthielt, wurde auf einem 0,8 % Agarosegel aufgetrennt. Dieses Fragment wurde unter Verwendung von EASY TRAP Ver. 2 (Takara Shuzo) gewonnen. Dieses Fragment wurde wie oben beschrieben mit einem glatten Ende versehen und an das zuvor erwähnte Verdauungsprodukt von pRSlysE24 unter Verwendung des DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) ligiert.

Die zuvor erwähnte Ligationsreaktionslösung wurde verwendet, um Escherichia coli (E. coli JM109 kompetente Zellen, Takara Shuzo) zu transformieren. Die Zellen wurden auf ein LB-Agarmedium plattiert, das 20 mg/l Streptomycin enthielt, und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die auf dem Agarmedium erschienenen Kolonien wurden jeweils in ein LB-Flüssigmedium geimpft, das 20 mg/l Streptomycin enthielt, und unter Schütteln 8 Stunden bei 37°C kultiviert. Plasmid-DNA wurde aus dieser Kulturlösung durch das Alkali-SDS-Verfahren extrahiert, und die Struktur jedes Plasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymen und Bestimmung der Nukleotidsequenz bestätigt, wobei die Gegenwart des pRSlysEdapA-Plasmids bestätigt wurde.

Der mit dem pRSlysEdapA-Plasmid transformierte Stamm E. coli JM109 wurde als AJ13832 bezeichnet, und dieser Stamm wurde bei der unabhängigen Verwaltungsgesellschaft National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary am 4. Juni 2001 hinterlegt und erhielt die Zugangsnummer FERM P-18371. Dann wurde die Hinterlegung in eine internationale Hinterlegung unter den Vorschriften des Budapester Vertrags am 13. Mai 2002 umgewandelt und erhielt die Zugangsnummer FERM BP-8042.

Dann wurde das Arzeimittelresistenz-Markergen des pRSlysEdapA-Plasmids von einem Streptomycinresistenzgen zu einem Tetracyclinresistenzgen verändert. Zunächst wurde das pRSlysEdapA-Plasmid mit einem Restriktionsenzym EcoRI verdaut, einer Phenol/Chloroform-Lösung zugegeben und vermischt, um die Verdauungsreaktion zu beenden. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert wurde, wurde die Lösung der oberen Schicht gesammelt, und DNA-Fragmente wurden durch Ethanolfällung gewonnen und durch 0,8% Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt. Ein DNA-Fragment von ungefähr 11 kbp wurde unter Verwendung von EASY TRAP Ver. 2 (DNA Collection Kit, Takara Shuzo) gewonnen.

Das Tetracyclinresistenzgen-Fragment wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 erhalten, indem der Genbereich von pRK310 mittels PCR unter Verwendung der in SEQ ID NO: 11 und 12 gezeigten Primer amplifiziert wurde, und das Amplifizierungsprodukt mit EcoRI verdaut wurde.

Das DNA-Fragment, das von dem wie oben beschrieben hergestellten pRSlysEdapA abgeleitet war, und das DNA-Fragment, das den Tetracyclinresistenzgenbereich enthielt, wurden unter Verwendung des DNA Ligation Kit Ver. 2-(Takara Shuzo) ligiert. Dieses Reaktionsgemisch wurde verwendet, um kompetente E. coli JM109-Zellen (Takara Shuzo) zu transformieren. Die Zellen wurden auf ein LB-Rgarmedium plattiert, das 20 mg/l Streptomycin und 15 mg/l Tetracyclin enthielt, und über Nacht bei 37°C kultiviert. Die auf dem Agarmedium erschienenen Kolonien wurden jeweils in ein LB-Flüssigmedium geimpft, das 20 mg/l Streptomycin und 15 mg/l Tetracyclin enthielt, und 16 Stunden unter Schütteln bei 37°C kultiviert. Plasmid-DNA wurde aus dieser Kulturlösung durch das Alkali-SDS-Verfahren extrahiert, und die Struktur jedes Plasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymen bestätigt, wobei die Gegenwart von pRSlysE-dapA-Tc bestätigt wurde.

(2) Einführung von pRSlysE-dapA-Tc in den Methylobacillus glycogenes NCIMB111375-Stamm und Produktion von Aminosäuren

Das durch das obige Verfahren erhaltene Plasmid pRSlysE-dapA-Tc wurde mittels Elektroporation in den Stamm Methylobacillus glycogenes NCIMB111375 eingeführt. Der erhaltene transformierte Stamm (im Folgenden auch als „NCIMB111375/pRSlysEdapA-Tc" bezeichnet), der Stamm, bei dem das zuvor erwähnte pRSlysE24-Tc eingeführt war (im Folgenden auch als „NCIMB111375/pRSlysE-Tc" bezeichnet), und der Stamm mit dem eingeführten pRK310 als Kontrolle (im Folgenden auch als „NCIMB111375/pRK310" bezeichnet) wurden wie folgt kultiviert, um die L-Aminosäurekonzentrationen in dem Kulturüberstand zu untersuchen.

Jeder transformierte Stamm wurde auf eine SEII-Platte aufgebracht, die 15 mg/l Tetracyclin enthielt, und für 2 Tage bei 30°C kultiviert. Dann wurden die Zellen auf ungefähr 10 cm² der Mediumoberfläche abgekratzt, in ein SEII-Produktionsmedium (20 ml) eingeimpft, das 15 mg/l Tetracyclin enthielt, und bei 37°C für 60 Stunden unter Schütteln kultiviert. Nach Beendigung der Kultur wurden die Zellen durch Zentrifugation entfernt, und die L-Lysin-Konzentration im Kulturüberstand wurde unter Verwendung eines Aminosäureanalysators (Nikon Buko, Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Es wurde gefunden, dass die in dem Medium akkumulierte Menge an L-Lysin in dem NCIMB/pRSlysE-dapA-Tc-Stamm im Vergleich mit dem Stamm mit pRSlysE24-Tc weiter verbessert war. Das heißt, es wird vermutet, dass die Geschwindigkeits- bzw. Anteillimitierung betreffend die Sekretion durch Einführung des lysE-Gens ausgelöscht war, und sich der dapA*-Gen-verstärkende Effekt auf synergistische Weise zeigte.

Tabelle 3

Obwohl die Erfindung ausführlich mit Bezug auf bevorzugte Ausführungsformen hiervon beschrieben wurde, ist dem Fachmann klar, dass verschiedene Änderungen vorgenommen und Äquivalente eingesetzt werden können, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Jedes der zuvor erwähnten Dokumente sowie das ausländische Prioritätsdokument JP2002336340 sind durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit hier aufgenommen.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Zur Gattung Methylobacillus gehörendes Bakterium, in welches eine exprimierbare DNA eingeführt ist, und welches eine Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin oder L-Arginin aufweist, wobei die DNA eine Variante eines Proteins codiert, das Protein einen Loop-Bereich und sechs hydrophobe Helices aufweist und an der Sekretion von L-Lysin zur Außenseite einer Zelle beteiligt ist, und wobei die Variante den Loop-Bereich nicht enthält und die Sekretion von L-Lysin, L-Arginin oder beiden zur Außenseite eines Methanol-assimilierenden Bakteriums fördert, wenn die DNA in das Methanol-assimilierende Bakterium eingeführt ist.
Bakterium nach Anspruch 1, wobei die Variante eines Proteins im Wesentlichen nur aus den hydrophoben Helices besteht.
Bakterium nach Anspruch 1, worin die Variante sechs hydrophobe Helices aufweist.
Bakterium nach Anspruch 1, worin die Variante ein Komplex ist, der ein Peptid umfasst, welches die ersten, zweiten und dritten hydrophoben Helices relativ zum N-Terminus enthält, sowie ein Peptid, das die vierten, fünften und sechsten hydrophoben Helices relativ zum N-Terminus enthält.
Bakterium nach Anspruch 1, wobei das Protein ein LysE-Protein ist.
Bakterium nach Anspruch 5, wobei das LysE-Protein aus einem Coryneform-Bakterium abgeleitet ist.
Zur Gattung Methylobacillus gehörendes Bakterium, in welches eine exprimierbare DNA-eingeführt wurde, und welches eine Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin oder L-Arginin aufweist, wobei die DNA ein Protein codiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: (A) einem Protein, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 10 umfasst, und (B) einem Protein, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 10 umfasst, einschließlich einer Substitution, Deletion, Insertion oder Addition einer oder mehrerer Aminosäurereste, und wobei das Protein eine Aktivität zur Förderung der Sekretion von L-Lysin, L-Arginin oder beiden zur Außenseite eines Methanol-assimilierenden Bakteriums aufweist.
Verfahren zur Herstellung von L-Lysin oder L-Arginin, umfassend das Kultivieren des zur Gattung Methylobacillus gehörenden Bakteriums von Anspruch 1 in einem Medium, um L-Lysin oder L-Arginin in Kultur zu produzieren und zu akkumulieren, und Gewinnen von L-Lysin oder L-Arginin aus der Kultur.
Verfahren zur Herstellung von L-Lysin oder L-Arginin nach Anspruch 8, wobei das Medium Methanol als Hauptkohlenstoffquelle enthält.