CN1502690A - 利用甲醇同化细菌生产l-赖氨酸或l-精氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

将一种编码蛋白变异体的DNA导入到甲基菌(Methylobacillus)中用以提高L－氨基酸的产率，尤其是L－赖氨酸和L－精氨酸的产率；所述蛋白具有一个环形区域以及六个疏水螺旋，并参与L－赖氨酸分泌到细胞外；所述DNA编码一种蛋白变异体，它不具有环形区域，当所述DNA，尤其是lysE24，被导入细菌时，所述蛋白变异体促进L－赖氨酸、L－精氨酸或它们二者分泌到甲醇同化细菌的细胞外部。

Description

利用甲醇同化细菌生产L-赖氨酸 或L-精氨酸的方法

                         背景技术

发明领域

本发明涉及微生物工业技术领域。更具体地说，本发明涉及一种通过发酵生产L-赖氨酸或L-精氨酸的方法，和一种该生产方法中所使用的微生物。

背景技术

氨基酸，例如L-赖氨酸，L-谷氨酸，L-苏氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸，L-缬氨酸和L-苯丙氨酸等，都是用微生物发酵进行工业生产的，这些微生物属于短杆菌属(Brevibacterium)(棒杆菌属，Corynebacterium)，芽孢杆菌属(Bacillus)，埃希氏菌属(Escherichia)，链霉素(Streptomyces)，假单孢菌属(Peudomonas)，节杆菌属(Arthrobacter)，沙雷氏菌属(Serratia)，青霉菌属(Penicillium)，假丝酵母属(Candida)等等。从自然界分离的菌株，或其人工突变体都可用来提高这些微生物的生产力。此外，已经公开了很多可以提高L-氨基酸的生产能力的技术，如增加L-氨基酸生物合成酶活性的重组DNA技术。

用改进的生产方法培养上述的微生物，能相当大程度的提高L-氨基酸的产量。但是，为了适应将来更大的需求量，寻求一种以较小的成本提供更高效的产生L-氨基酸的方法很明显仍然是必要的，而且在这个领域仍然是一种需要。

甲醇是一种众所周知的可大量获得的成本较低的发酵原料。用甲醇发酵生产L-氨基酸的方法，包括用无色杆菌属(Achromobacter)，或假单孢菌属(日本专利待审公开号45-25273(kokai))，精朊菌属(Protaminobacter)(日本专利公开号49-125590)，精朊菌属或甲烷单孢菌属(Methanomonas)(日本专利待审号50-25790)，微环菌属(Microcyclus)(日本专利待审公开号52-18886)，甲基菌属(Methylobacillus)(日本专利待审公开号4-91793)，芽孢杆菌属(日本专利待审公开号3-505284)细菌等微生物的方法是已知的。本发明发明人已研制了一种用人工突变和重组DNA技术培养嗜甲基菌属细菌来生产L-氨基酸的方法(WO 00/61723)。

近年来，已经鉴定了具有能特定地分泌L-氨基酸到微生物细胞外的功能的蛋白，以及编码这些蛋白的基因。尤其是，Vrljic等已经鉴定了从谷氨酸棒杆菌R127衍生的参与分泌L-赖氨酸到细胞外的基因(Vrljic M，Sahm H，Eggeling L，Molecular Microbiology 22：815-826，1996)。这个基因命名为lysE，而且据报道，可以通过增强这个基因在棒杆菌属细菌中的表达来提高棒杆菌属细菌生产L-赖氨酸的能力(WO97/23597)。已知lysE基因不但分泌L-赖氨酸，而且分泌L-精氨酸(Bellmann A.，Vrljic M.，Patek M.，Sahm H.，Kramer R.，Eggeling L.，Microbiology，147：1765-1774，(2001))。通过增加分泌氨基酸的蛋白在大肠杆菌中的表达量来提高一些L-氨基酸的产量也是已知的(日本专利公开号2000-189180)。例如，有报道通过增强ORF306基因在大肠杆菌中的表达可以提高半胱氨酸等氨基酸的产量(EP885962)。

然而，至今还没有任何报道暗示通过用甲醇同化细菌进行甲醇发酵时，氨基酸的分泌过程正向或负向地参与氨基酸的产生。也没有任何报道提示在甲醇同化细菌中能产生分泌活性的氨基酸分泌基因。

发明概述

本发明的一个目的是为了提供一种能利用丰富而且便宜的甲醇高效地生产L-赖氨酸或L-精氨酸的方法。

本发明进一步的目的是为了提供一种属于甲基菌属细菌，其中导入了一种能表达的DNA，并且该细菌能生产L-赖氨酸或L-精氨酸，其中所述的DNA编码蛋白的一个变异体，所述蛋白有环形区域和6个疏水螺旋，并月所述蛋白参与分泌L-赖氨酸到细胞外，其中所述的变异体不包括所说的环形区域，而且当所述的DNA导入到所述的甲醇同化细菌中时，能促进L-赖氨酸，L-精氨酸或二者分泌到甲醇同化细菌外。

本发明更进一步的目的是为了提供上述的细菌，其中所述的蛋白突变体实质上仅由疏水螺旋组成。

本发明更进一步的目的是为了提供上述的细菌，其中所述的蛋白突变体具有6个疏水螺旋。

本发明的更进一步的目的是为了提供上述的细菌，其中所述的变异体是由含有相对N-末端而言第一，第二和第三个疏水螺旋的多肽，和含有相对N-末端而言第四个，第五个和第六个疏水螺旋的多肽组成的复合物。

本发明的更进一步的目的是为了提供上述的细菌，其中所述的蛋白是LysE蛋白。

本发明的更进一步的目的是为了提供上述的细菌，其中所述的LysE蛋白来源于棒杆菌属细菌。

本发明的更进一步的目的是为了提供一种导入了一种能表达的DNA，并能生产L-赖氨酸或L-精氨酸的甲基菌属细菌，其中所述的DNA编码一种选自下面组的蛋白：

(A)一种含有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的蛋白，和

(B)一种含有包括置换，缺失，插入或增加一个或几个氨基酸残基的SEQID NO：10的氨基酸序列的蛋白，

而且其中的蛋白具有促进L-赖氨酸，L-精氨酸或二者分泌到甲醇同化细菌外的活性。

本发明的更进一步的目的是为了提供一种生产L-赖氨酸或L-精氨酸的方法，包括在培养基中培养上述的甲基菌属细菌，来生产和积累L-赖氨酸或精氨酸，并从培养物中收集L-赖氨酸或L-精氨酸。

本发明的更进一步的目的是为了提供一种生产上述的L-赖氨酸或L-精氨酸的方法，其中所述的培养基含有甲醇作为一种主要的碳源。

根据本发明，用甲醇同化细菌可以提高L-氨基酸，尤其是L-赖氨酸和L-精氨酸的产量。

附图简述

图1显示含有tac启动子的质粒pRStac，分别由lysE基因或lysE24基因插入到质粒pRStac构建得到质粒pRSlysE和pRSlysE24的构建图。

图2显示含有lysE24基因和dapA^*基因的质粒pRSlysEdapA的构建。

优选的实施方案的描述

本发明的发明人为了实现上述目标进行了刻苦地研究。首先，他们发现由甲醇同化细菌尤其是甲基菌属细菌生产L-氨基酸是不可能，因为L-氨基酸不能分泌到细胞外。然后他们成功地分离到了一种具有氨基酸分泌活性的基因，尤其是在微生物中，该基因可能有助于高效的生产氨基酸。

本发明的发明者把来源于乳糖发酵短杆菌2256菌株的一个基因，导入到甲醇同化细菌中，研究其对氨基酸产量的影响，该基因与从谷氨酸棒杆菌R127中分离到的已知的lysE基因是同源的。

应该注意的是分类入短杆菌属的细菌，已经归入到棒杆菌属中(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255，(1981))。

已发现由于lysE基因导入到甲醇同化细菌中引起了突变或缺失，从而使LysE蛋白失活。负责分泌的蛋白通常需要进入到细胞膜中才能具有活性。因此，蛋白和膜条件如脂质体的组成必须互相适应。可以得出结论要表达异源膜蛋白如lysE，以便具有活性是困难的，前述的结果也支持这个结论。

因此，本发明的发明者在研究前述的L-氨基酸分泌基因的时候，发现了一个在甲醇同化细菌中的起作用的突变基因。而且，该突变基因在用甲醇同化细菌生产氨基酸中具有很显著的作用。

以下，将对本发明作详细的说明。

本发明的DNA

本发明的DNA是一种当将它导入到甲醇同化细菌中时能促进L-赖氨酸，L-精氨酸或二者分泌到细胞外的DNA，所述的DNA编码参与分泌L-赖氨酸到微生物细胞外的分泌蛋白的一个变异体。

在本发明中，“促进L-赖氨酸，L-精氨酸或二者分泌到细胞外”的术语是指，当在培养基中培养含有本发明的DNA的甲醇同化细菌时，与不含本发明的DNA的甲醇同化细菌相比，分泌到培养基中的L-赖氨酸，L-精氨酸或二者的量都增加了。与培养不含本发明的DNA的甲醇同化细菌的观察到的L-氨基酸的积累相比，含本发明的DNA的甲醇同化细菌的培养基中L-氨基酸的积累的增加，可以证实含本发明的DNA的甲醇同化细菌中从细胞内分泌到细胞外的L-氨基酸的增加。而且，分泌到细胞外的L-氨基酸的增加也可以通过当把本发明的DNA导入到甲醇同化细菌中时，细胞内L-氨基酸的浓度的降低观察到。

本发明的甲基菌属细菌是一种属于甲基菌属的细菌，它能利用甲醇作为主要碳源生长，并且导入本发明的DNA能促进L-赖氨酸或L-精氨酸的分泌。特定的例子包括但不限于糖原甲基菌(Methylobacillus glycogenes)，鞭毛甲基菌(Methylobacillus flagellatum)等。糖原甲基菌的例子包括但不限于T-11菌株(NCIMB 11375)，ATCC 21276菌株，ATCC 21371菌株，ATR80菌株(参见Appl.Microbiol.Biotechnol.，42，67-72，(1994))，A513菌株(参见Appl.Mcrobiol.Biotechnol.，42，67-72，(1994))等。糖原甲基菌NCIMB 11375菌株可从英国国家工业和海洋细菌库得到(NCIMB Lts.，Torry Research Station，135，AbbeyRoad，Aberdeen AB9 8DG，United Kingdom)。鞭毛甲基菌的例子包括但不限于KT菌株(参见Arch.Microbiol.，149，441-446，(1988))等。

本发明的甲基菌，可通过将参与分泌L-赖氨酸到细胞外的含有一个环形区域和6个疏水螺旋的蛋白变体的DNA导入到甲基菌中获得，其中所述的DNA发生突变，导致缺失环形区域，和/或所述的蛋白变体实质上只包含疏水螺旋。“实质上只含有疏水螺旋”的表述是指完全没有环形区域或缺少大部分的环形区域但是不影响突变体lysE的功能的突变LysE。

本发明的甲基菌的实施方案之一是如实施例描述的已经导入了命名为lysE24基因的DNA的一种甲基菌。LysE 24基因分离自乳糖发酵短杆菌2256菌株，和从谷氨酸棒杆菌R217菌株中分离到的已知的lysE同源。因此，为了方便起见，把导入到本发明的甲基菌的所述的DNA称为lysE突变体。

lysE基因编码的LysE蛋白有6个疏水螺旋区域。估计这些疏水区域的一部分可是跨膜域。还推测从N-末端起的第三个和第四个疏水螺旋区域之间的的区域是疏水的，而且有一个环形结构。在本发明中，这个疏水区域称为环形区域。野生型的lysE基因的核苷酸序列和从乳糖发酵短杆菌2256菌株中分离的LysE蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NOS：7和8所示。在所述的氨基酸序列中，疏水螺旋区域对应于氨基酸编号5-20，37-58，67-93，146-168，181-203和211-232。环形区域对应于氨基酸编号94-145。

本发明的发明者发现在甲醇同组成化细菌中lysE基因是失活的，但是编码没有环形区域或实质上仅由疏水螺旋组成的LysE蛋白的变异体的DNA增加了L-赖氨酸和/或L-精氨酸到甲醇同化细菌细胞外的分泌。本发明的DNA编码没有前述的环形区域，或仅由疏水螺旋区域的这样一种突变的LysE蛋白。

前述的lysE突变体没有特别限制，只要有一个或更多的疏水螺旋，且当导入到甲醇同化细菌中表态时就导致增加L-赖氨酸，L-精氨酸或二者的分泌。特别地，是编码具有从N-末端起的所有的第一个到第六个疏水螺旋的lysE突变体的DNA包括在本发明的范围内。更特别地，是编码含有对应于N-末端的第一个到第三个疏水螺旋的多肽的DNA，和编码含有对应于N-末端的第四个到第六个疏水螺旋的多肽的DNA也属于本发明范围。前述的lysE24是lysE突变体的一个例子，它编码含有第一个到第三个疏水螺旋的多肽和含有第四个到第六个疏水螺旋的多肽。LysE24基因是通过在编码第三个疏水螺旋区域下游的一个终止密码子处导入一个突变得到的。当缺失了如实施例所描述的从这个终止密码子起的下游区域时，突变体lysE24基因在糖原甲基菌NCIMB11375菌株中表达时不会引起培养基中L-赖氨酸的积累。因此，推测含有第一个到第三个疏水螺旋的多肽和含有第四个到第六个疏水螺旋的多肽在糖原甲基菌中独立地翻译和起作用。结果显示导入lysE24基因到甲基菌细菌中将导致L-赖氨酸或L-精氨酸的产量提高。

任何微生物就都可用于产生编码参与L-赖氨酸分泌到细胞外的蛋白的DNA，即，lysE基因或它的同源基因，只要它含有在甲醇同化细菌中表达L-赖氨酸分泌活性的基因的一个变体。特别地，棒状杆菌属细菌如谷氨酸棒杆菌(乳糖发酵短杆菌)，埃希氏菌如大肠杆菌，假单孢菌属细菌如铜绿假单孢杆菌，分支杆菌属细菌如肺结核分支杆菌等都属于本发明的范围。

lysE的同源基因的例子包括，编码在严格条件下和具有SEQ ID NO：7或其部分核苷酸序列的探针杂交的蛋白，和编码由于前述氨基酸的替代后在甲醇同化细菌中具有LysE蛋白的功能的蛋白的DNA。前述的“严格条件”包括在该条件下形成特异性的杂合体，不产生非特异性的杂合体。很难用任何数值来清楚的表述这种条件。但是，例如，所述的严格条件包括在该条件下所述的DNA同源性很高，如DNA有80％或更高的同源性，较好的是有80％或更高的同源性，更好的是有95％或更高的同源性，而且能彼此杂交，但低于上述同源性的DNA不能互相杂交。可以选择的情况是，严格条件的例子是在Southern杂交中DNA在常规洗脱条件的盐浓度下互相杂交，即1×SSC，0.1％×SDS，优选的是0.1×SSC，0.1％×SDS，60℃。

SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的部分序列也可用作探针。这种探针可用基于SEQ ID NO：7的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，含有SEQ ID NO：7的核苷酸的DNA片段作为模板通过PCR制备。当长度大约300bp的DNA片断作为探针时，杂交的洗脱条件可以为如2×SSC，0.1％×SDS，50℃。

为了增强氨基酸分泌基因在嗜甲基细菌中的表达，含有lysE基因的基因片段被连接到一个在嗜甲基细菌中有功能的载体中，优选的是一种多拷贝型载体，以制备重组DNA，然后用来转化如嗜甲基细菌的宿主。也可以把该基因整合到一个转座子中然后导入到染色体中。而且，可以把在嗜甲基细菌中诱导转录的启动子连接到该基因的上游。

参考文献WO97/23597描述了lysE，并仅仅显示了把棒状杆菌属细菌的lysE基因导入到棒状杆菌属的细菌中。而且只提到L-赖氨酸作为分泌的氨基酸，并描述了一种新的蛋白分泌系统，包括lysE具有含有6个跨膜螺旋的结构。但是，本发明的发明人证实从棒状杆菌来源的lysE在甲醇同化细菌中完全不起作用。

此外，获得的因子是一个新的L-赖氨酸分泌因子，它具有和棒状杆菌中已知的在一个多肽中有6个跨膜螺旋的lysE不同的基本结构，而且不可能预见该因子能从前述的公开lysE的专利说明中得到。

本发明的甲基菌属细菌

本发明的甲基菌属细菌导入了本发明所述的DNA，该DNA能在宿主中表达并具有生产L-赖氨酸或L-精氨酸的能力。它能通过导入本发明所述的DNA到具有L-赖氨酸或L-精氨酸生产能力的甲基菌属细菌中获得。本发明的甲基菌属细菌也可以通过导入本发明所述的DNA到甲基菌属细菌中，而赋予其生产L-赖氨酸或L-精氨酸的能力。本发明的甲基菌属细菌也可以通过导入本发明所述的能在宿主中表达的DNA到甲基菌属细菌中，而赋予其生产L-赖氨酸或L-精氨酸的能力。

具有L-赖氨酸或L-精氨酸生产能力的甲基菌属细菌，也可以通过赋予甲基菌属细菌的野生型菌株生产L-赖氨酸或L-精氨酸的能力来获得。能很容易地培养棒状杆菌属细菌，埃希氏菌等的方法都能用于赋予其生产L-赖氨酸或L-精氨酸的能力。例如，这些方法包括但不局限于，获得营养缺陷型突变菌株，类似抗性菌株或代谢调控突变菌株，构建了其中的L-赖氨酸或L-精氨酸生物合成系统酶的能力被增强的重组菌株(参见“Amino Acid Fermentation”，日本科学Societies出版社，Gakkai Shuppan Center，第1版，出版于1986年5月30日，pp77-100)等。营养缺陷型，类似抗性，代谢调控突变等特性，可以单独地或两种或更多种组合在一起赋予培养的产生L-赖氨酸或L-精氨酸的细菌。生物合成系统的酶可以单独地增强，或它们中的两种或更多种的组合被增强。而且，赋予细菌包括营养缺陷，类似抗性，代谢调控突变等特性可以和增强生物合成系统酶组合使用。

例如，生产L-赖氨酸的细菌可以培养成为L-高丝氨酸或L-苏氨酸和L-甲硫氨酸(日本专利公开号48-28078和56-6499)营养缺陷型，或成为肌醇或乙酸醇缺陷型(日本专利待审公开号55-9784和56-8692)，或成为具有溶菌素，赖氨酸氧肟酸，S-(2-氨乙基)-半胱氨酸，γ-甲基赖氨酸，α-氯己内酰胺，DL-α-氨基-a-己内酰胺，α-氨基-十二烷基内酰胺，天冬氨酸类似物，磺胺类药物，醌型物或N-十二烷基亮氨酸抗性的细菌。

生产L-精氨酸细菌可以培养成为抗某一种试剂，如磺胺类药剂，2-噻唑丙氨酸，α-氨基-β-羟基戊酸等等的细菌；成为L-组氨酸，L-脯氨酸，L-苏氨酸，L-异亮氨酸，L-甲硫氨酸或L-色氨酸营养缺陷型并附加2-噻唑丙氨酸抗性的细菌(日本专利待审公开号54-44096)；成为抗酮基丙二酸，氟代丙二酸或一氟基乙酸(日本专利待审号57-18989)的细菌；成为抗argininol(日本专利待审号62-24075)的细菌；成为抗X-胍细菌(X表示脂肪酸或脂肪链的衍生物，日本专利待审号2-186995)的细菌；成为抗5-氮尿嘧啶，6-氮尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氮胞核嘧啶，6-氮胞核嘧啶等的细菌；成为抗精氨酸氧肟酸和2-硫尿嘧啶的细菌；成为抗精氨酸氧肟酸和6-氮尿嘧啶(见日本专利待审号57-150381)；成为抗组氨酸类似物或色氨酸类似物的细菌(见日本专利待审号52-114092)；成为甲硫氨酸，组氨酸，苏氨酸，脯氨酸，异亮氨酸，赖氨酸，腺嘌呤，鸟嘌呤和尿嘧啶(或尿嘧啶前体物)中的至少一种营养缺陷型细菌(见日本专利待审号52-99289)；成为抗精氨酸氧肟酸的细菌(见日本专利公开号51-6754)；成为琥珀酸营养缺陷型细菌或一种核酸碱基类似物抗性细菌(日本专利待审号58-9692)；成为缺乏精氨酸代谢能力并抗精氨酸拮抗物和刀豆氨酸及赖氨酸营养缺陷型细菌(见日本专利待审号58-8729)；成为抗精氨酸，精氨酸氧肟酸，高精氨酸，D-精氨酸和刀豆氨酸，或抗精氨酸氧肟酸和6-氮尿嘧啶的细菌(见日本专利待审号53-143288)；成为抗刀豆氨酸细菌(见日本专利待审号53-3586)等等。

后面，列举通过增强L-氨基酸生物合成酶基因来赋予或提高L-氨基酸的生产能力的方法。

可以通过如增强二氢吡啶二羧酸合成酶和天冬氨酸激酶的活性赋予细菌生产L-赖氨酸的能力。可以通过把一个编码二氢吡啶二羧酸合成酶的基因片断，和一个编码天冬氨酸激酶的基因片断，及一个在嗜甲基细菌中有功能的载体，较好的是一个多拷贝载体，连接制备得到的重组DNA转化宿主如嗜甲基细菌，来增强嗜甲基细菌中二氢吡啶二羧酸合成酶和天冬氨酸激酶的活性。增加转化菌株中编码二氢吡啶二羧酸合成酶和天冬氨酸激酶基因的拷贝数可以增强这些酶的活性。后面，二氢吡啶二羧酸合成酶，天冬氨酸激酶和天冬氨酸激酶III也分别称为DDPS，AK和AKIII。

任何微生物只要能在甲基菌中表达DDPS和AK活性，就能提供编码DDPS和AK的基因。这种微生物可以是野生型菌株，或分离到的突变菌株。特别地，这种微生物地例子包括大肠杆菌K-12菌株，糖原甲基菌NCIMB11375等。因为编码DDPS(dapA，Richaud，F.等人，J.Baoteriol.，297，1986)和AKIII(lysC，Cassan，M.，Parsot，C.，Cohen，G.N.and Patte，J.C.，J.Biol.Chem.，261，1052，1986)基因的核苷酸序列是已知的，根据这些基因的核苷酸序列合成引物，用微生物如K-12的染色体DNA作为模板，通过PCR获得这些基因，这里描述的不仅仅限于从大肠杆菌中分离到的dapA和lysC基因。

较好的，本发明的DDPS和AK不会受到L-赖氨酸的反馈抑制。已知从大肠杆菌中分离到的野生型DDPS受到L-赖氨酸的反馈抑制的影响(见US566102和6040160)，从大肠杆菌中分离到的野生型AKIII受到L-赖氨酸的抑制和反馈抑制。因此，adpA和lysC较好地分别编码DDPS和AKIII，而且其中的每一个都包含一个导入嗜甲基菌属细菌中后能消除L-赖氨酸的反馈抑制的突变。后面，含有能消除L-赖氨酸的反馈抑制的突变的DDPS也称为“DDPS突变体”，编码DDPS突变体的DNA也可称为“dapA突变体”，或“dapA^*”。从大肠杆菌中分离到的含有能消除L-赖氨酸的反馈抑制的突变的AKIII也称为“AKIII突变体”，编码AKIII突变体的DNA也称为“lysC突变体”。

然而，在本发明中将DDPS和AK进行突变不总是必要的。因为，已知如棒状杆菌来源的DDPS就不受L-赖氨酸的反馈抑制(见韩国专利公开号92-8382，US专利5661012和6040160)。

从大肠杆菌衍生的野生型dapA的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，由该核苷酸编码的野生型的DDPS的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。

编码不受L-赖氨酸反馈抑制的DDPS突变体的所述DNA可以是一种编码在氨基酸序列的118位用酪氨酸残基替换组氨酸残基的DDPS的DNA。而且，编码不受L-赖氨酸反馈抑制的AKIII突变体的所述DNA，可以是一种编码在氨基酸序列的352位用异亮氨酸残基替换苏氨酸残基的AKIII的DNA(见美国专利5661012和6040160)。

用作基因克隆的质粒，可以是任何质粒，只要它能在微生物如埃希氏菌属(Escherichia)细菌中复制。具体地，这些质粒的例子可以包括pBR322，pTWV228，pMW119，pUC19等。

在甲基菌中有功能的载体包括，如，能在甲基菌中自主复制的质粒。具体地，载体的例子包括RSF1010，它是一种宿主范围很宽的广谱型载体，和由此衍生的载体，如pAYC32(Chistorerdov，A.Y，Tsygankov，Y.D.，Plasmid，16，161-167，1986)，pMFY42(Gene，44，53，1990)，pRP301，pTB70(Nature，287，396，(1980))等。

为了制备通过把dapA和lysC连接到一个在甲基菌中有功能的载体中的重组DNA，载体要用一个与含有dapA和lysC的DNA片断的末端相适应的限制性酶消化。通常用连接酶如T4 DNA连接酶进行连接。dapA和lysC基因可以分别整合到不同的载体或同一个载体中。

宿主范围很宽的广谱型质粒RSFD80是已知的(WO9516042)，可以用于本发明中作为含有编码DDPS的突变体的dapA突变体，和含有编码AKIII突变体的lysC突变体的质粒。用这个质粒转化的大肠杆菌JM109菌株称为AJ12396，于1993年10月28日，保藏在国家生命科学和人体技术研究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology)，工业科学和技术机构(Agency ofIndustrial Science and Technology)，国际贸易和工业部门(Ministry ofInternational Trade and Industry)(目前是，独立的管理机构，国家高级工业科学和技术研究所(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)，国际专利生物体保藏机构(International Patent Organism Depositary))，保藏号为FERM P-13936。然后，按照布达佩斯条约(Budapest Treaty)规定，于1994年11月1日转为国际保藏，保藏号为FERM BP-4859。RSFD80可以通过已知的方法从AJ12396菌株获得。

任何方法只要它能提供足够的转化效率，都能用于把用上述制备的重组DNA导入到嗜甲基菌属细菌中，例如，可以用电穿孔法(Canadian Journal ofMicrobiology，43，197，(1997))。

甲基菌属细菌染色体DNA中存在多拷贝的dapA和lysC基因也可以增强DDPS和AK的活性。可通过同源重组把多拷贝的dapA和lysC基因导入到甲基菌属细菌的染色体DNA上。可通过把一个靶序列以多拷贝整合到染色体DNA上来达到上述目的。一个可转转座元件末端的一个重复的或倒量重复的DNA可用作整合在染色体DNA上的多拷贝序列。可选择地，如日本专利待审号2-109985公开的，可以先把多拷贝的dapA和/或lysC掺入到一个转座子中并且转移，可以导入到宿主的染色体DNA上。两种方法中，由于转化菌株中dapA和lysC的拷贝数的增加，从而扩增了其中DDPS和AK的活性。

除了上述的基因扩增方法之外，也可以通过替换表达调控序列来扩增DDPS和AK的活性，如用强的启动子替换dapA和lysC的启动子(见日本专利待审号1-215280)。已知的强启动子的例子包括，如lac启动子，trp启动子，trc启动子，tac启动子，λ噬菌体的P_R启动子和P_L启动子，tet启动子，amyE启动子，spac启动子等。这些强启动子的使用能增加dapA和lysC的表达，从而扩增DDPS和AK的活性。这种基因表达增加的方法可以和上述的基因扩增(增加dapA和lysC基因的拷贝数)的方法组合使用。

可以通过连接一个基因片断和一个载体来制备重组DNA，其中所述的载体已经用和基因片断末端对应的限制性酶消化过。通常用连接酶如T4 DNA连接酶来进行连接。本领域普通技术人员熟知的常规方法，如消化，DNA连接，染色体DNA制备，PCR，质粒DNA的制备，转化，寡核苷酸引物的设计等方法可用于本发明方法。这些方法描述于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.，分子克隆试验手册第二版，(“Molecular Cloning A Laboratory Manual，SecondEdition”)，冷泉港实验室出版社，(1989)年，等等。

除了增加DDPS和AK基因的表达或活性，也可以增强参与L-赖氨酸生物合成的其它酶的活性。这些酶包括二氨基庚二酸途径中的酶，如二氢吡啶二羧酸还原酶，二氨基庚二酸脱羧酶，二氨基庚二酸脱氢酶(所有前述的酶见WO96/40934)，烯醇丙酮酸磷酸羧化酶(日本专利待审号60-87788)，天冬氨酸氨基转移酶(日本专利公开号6-102028)，二氨基庚二酸差向异构酶和天冬氨酸半醛脱氢酶，氨基己二酸途径的酶如高乌头酸水合酶等。

WO0061723公开了源自甲醇同化细菌中甲基营养型嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)的天冬氨酸激酶，天冬氨酸半醛脱氢酶，二氢吡啶二羧酸合成酶，二氢吡啶二羧酸还原酶和二氨基庚二酸脱羧酶。

此外，本发明的微生物可以有降低的酶活性，其中所述的酶催化L-赖氨酸生物合成途径支路产生除L-赖氨酸以外的化合物的反应，或者缺乏这种酶。这种催化L-赖氨酸生物合成途径支路产生除L-赖氨酸外的化合物的反应的酶的实例，包括高丝氨酸脱氢酶(见WO95/23864)。

前述的增强L-赖氨酸生物合成中参与的酶的活性的技术可以类似地用于L-精氨酸。

可以通过增强乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶活性，N-乙酰谷氨酸-γ-半醛脱氢酶活性，N-乙酰基谷氨酸激酶活性和精氨琥珀酸裂解酶活性来提高L-精氨酸的生产能力(日本专利公开号5-23750)。

也可以通过增强谷氨酸脱氢酶(EP1057893，A1)，精氨琥珀酸裂解酶(EP0999267，A1)，氨甲酰磷酸合成酶(EP1026247，A1)和N-乙酰谷氨酸合成酶(见日本专利待审号57-5693)活性，或通过破坏编码精氨酸阻遇剂的基因(araR)，来提高L-精氨酸的生产能力。

L-赖氨酸或L-精氨酸的生产

L-赖氨酸或L-精氨酸可以通过培养具有生产L-赖氨酸或L-精氨酸能力的甲基菌属细菌来生产。这样，就能够通过如上所述的方式从用以生产和积累的培养基上获得L-赖氨酸或L-精氨酸。然后，就可以从培养物中收集L-赖氨酸或L-精氨酸。

本发明所用到的微生物可以采用在培养具有甲醇同化微生物中通常使用的培养方法进行培养。本发明中所用到的培养基可以是一种天然的或是合成的培养基，只要它含有碳源，氮源，无机离子和所需的其它微量的有机成分。

如果把甲醇作为主要的碳源，L-赖氨酸或L-精氨酸就能以低成本生产了。当把甲醇作为主要的碳源时，在培养基中需要加入0.001-30％的量。硫酸铵等等作为氮源加入到培养基中。除了这些之外，微量成分如磷酸钾，磷酸钠，硫酸镁，硫酸亚铁，硫酸锰等等也可以以小剂量加入到培养基中。

这种培养通常要在有氧条件下振动或是通过通气搅拌等方法在PH5-9，温度20-45℃的条件下进行的，这样的培养通常需要24-120个小时才能全部完成。

通常可以采用离子交换树脂法、沉淀法和其它一些已知的方法结合的方式从培养物中收集L-赖氨酸或L-精氨酸。

实施例

下文中，将结合以下的实施例对本发明作出更加具体的解释。

在以下实施例中所用到的试剂除特别提到的外都来自Wako Pure Chemicals或是Nacalai Tesque。每个实施例中所用到的培养基的成分也在下面列出。所有的培养基的PH值是通过NaOH或是HCl来调节的。

LB培养基：

胰蛋白胨(Difco)           10g/L

酵母浸出物(Difco)          5g/L

NaCl                      10g/L

pH7.0

上述物质经过在120℃下20分钟的蒸汽灭菌

LB琼脂培养基：

LB培养基

细菌用琼脂                15g/L

上述物质在120℃下经过20分钟的蒸汽灭菌SE II培养基(参见Journal of general Microbiology(1989)125，135，3153-3164，Silman N.J.，Carver M.A.&Jones C.W.；一部分成分已经改进)

K₂HPO₄                   1.9g/L

NaH₂PO₄                  1.56g/L

MgSO₄·7H₂O              0.2g/L

(NH₄)₂SO₄               5g/L

CuSO₄·5H₂O              5μg/L

MnSO₄·5H₂O              25μg/L

ZnSO₄·7H₂O              23μg/L

CaCl₂·2H₂O              72mg/L

FeCl₃·6H₂O              9.7mg/L

CaCO₃(Kanto Kagaku)       30g/L

甲醇                        2％(V/V)

pH7.0除甲醇外所有成分都经过121℃下15分钟的蒸汽灭菌。等所有成分都完全冷却之后，再加入甲醇。

SEII琼脂培养基：

K₂HPO₄                1.9g/L

NaH₂PO₄               1.56g/L

MgSO₄·7H₂O           0.2

(NH₄)₂SO₄            5g/L

CuSO₄·5H₂O           5μg/L

MnSO₄·5H₂O           25μg/L

ZnSO₄·7H₂O           23μg/L

CaCl₂·2H₂O           72mg/L

FeCl₃·6H₂O           9.7mg/L

甲醇                     0.5％(V/V)

pH7.0

细菌用琼脂(Difco)       15g/L除甲醇外所有成分都经过121℃下15分钟的蒸汽灭菌。等所有成分都完全冷却之后，再加入甲醇。

实施例1

将衍生于短杆菌属细菌的lysE基因导入到嗜甲基菌中

从乳糖发酵短杆菌2256株中克隆出一种是有助于例如谷氨酸棒杆菌R127分泌L-赖氨酸的基因的同源基因lysE基因，并且尝试在嗜甲基菌属细菌中进行表达。

(1)pRSlysE的构建

为了能将lysE导入到一个嗜甲基菌(Methylophilus)菌中，采用了一种已知的pRS质粒(参见日本国际专利公开(Kohyo)No.3-501682)来构建一个pRSlysE质粒用来表达lysE。pRS是一种有着质粒pVIC40(参见日本国际专利公开号wo90/04636，日本国际专利公开No.3-501682)的载体区段的质粒，它是通过将质粒pVIC40中编码苏氨酸的操纵子的DNA区域缺失后获得的。质粒pVIC40衍生自有着很广的宿主范围的质粒pAYC32(Chistorerdov，A.Y.，Tsygankov，Y.D.，Plasmid，1986，16，161-167)，而质粒pAVC32是RSF1010的衍生物。

首先，由pRS(其结构见图1)构建具有tac启动子的质粒pRStac。质粒pRStac以下述方法构建。用限制性酶EcoR I和Pst I消化pRS载体，然后加入到苯酚/氯仿溶液中，混合以终止该反应。在反应混合液经过离心之后，收集上层，用乙醇沉降法将DNA收集起来，然后在0.8％的琼脂胶上进行分离。用EASYTRAP Ver.2(DNA收集试剂盒，Takara Shuzo)收集了具有8千个碱基对的DNA片段。另一种方式是，以质粒pKK223-3(表达载体，Pharmacia)为模板，SEQID NO：1和2中所示引物进行PCR扩增出tac启动子区域(其中一个循环包括在94℃变性20秒，在55℃退火30秒，在72℃延伸60秒，这样的循环要重复30次)。PCR采用的是Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuro)。含有扩增过的tac启动子的DNA片段用PCR prep(Promega)被纯化出来，然后在事先在引物中设计好的限制酶位点(即EcoR I和EcoT22 I位点)处被消化。然后将反应混合液加入到苯酚/氯仿溶液中，二者混合以结束该反应。在反应混合液经过离心之后，收集上层，用乙醇沉降法将DNA收集起来，然后在0.8％的琼脂糖凝胶上进行分离。用EASY TRAP Ver.2收集了一段具有0.15kbp的DNA片段。

用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuro)将用上述方法制备的pRS载体的消化产物以及tac启动子区域片段连接起来。用此连接反应液转化大肠杆菌(大肠杆菌JM109感受态细胞，Takara Shuro)。这些细胞被涂铺于含有20mg/L链霉素的LB琼脂培养基中，在37℃培养过夜。将在琼脂培养基上出现的菌落逐个接种到含20mg/L链霉素的LB液体培养基上在37℃下振动条件下培养8小时。碱性SDS法从每一肉汤培养物中提取质粒DNA，然后通过限制性酶消化来确定每一个质粒的结构从而获得pRStac。位于pRS载体上链霉素抗性基因的转录方向是与tac启动子的方向一致的质粒就被选为pRStac。

用上述方法获得的pRStac用Sse8387 I(Takara Shuro)和Sap I(NewEnglish Biolabs)进行消化，然后加入到苯酚/氯仿溶液中，混合后以结束该反应。在反应混合液经过离心之后，收集上层，用乙醇沉降法将DNA收集起来，然后在0.8％的琼脂糖凝胶上进行分离，获得一段具有9.0kbp的DNA片段。

lysE基因片段也是以由乳糖发酵短杆菌2256株(ATCC13869)中提取的染色体为模板，用SEQ NO：5和6中所示引物通过PCR扩增(在94℃变性20秒，在55℃退火30秒，在72℃延伸90秒)。PCR采用的是PyrobestDNA聚合酶(Takara Shuro)。为了能够使lysE基因在嗜甲基菌中表达，引物被设计成能使从lysE基因的翻译起始密码子起始的长为9--1 5bp的核苷酸序列被替换成在嗜甲基菌(Wyborn，N.R.，Mills，J.，Williamis，S.G.和Jones，C.W.，Eur.J.Biochem.240，314-322(1996))中已知的有功能的序列。然后用PCR prep(Promega)把得到的片段纯化出来，然后用Sse8387 I和Sap I进行消化。然后将反应混合物加入到苯酚/氯仿溶液中，混合后以结束该反应。在反应混合液经过离心之后，收集上层，用乙醇沉降法将DNA收集起来，然后在0.8％的琼脂糖凝胶上进行进一步收集。

用DNA连接Kit Ver.2(Takara Shuro)将用上述方法制备的pRStac载体的消化产物以及lysE基因片段连接起来。用此连接反应液转化大肠杆菌(大肠杆菌JM109感受态细胞，Takara Shuro)。将这些细胞平铺于含有20mg/L链霉素的LB琼脂培养基中，在37℃下培养过夜。将在琼脂培养基上出现的每一个菌落都接种到含有20mg/L链霉素LB液体培养基中，然后在37℃下振动条件下培养8小时。采用碱性SDS法从每一肉汤培养物中提取质粒DNA，然后通过限制性酶消化以及核苷酸序列的测定来确定每一个质粒的结构从而确定pRSlysE的存在(图1)。在pRSlysE中，确定lysE基因的位置以使得其转录方向与tac启动子的方向一致。

(2)将pRSlysE导入到嗜甲基菌属细菌中

由上述方法获得的pRSlysE通过电穿孔的方法(Canadian Journal ofMicrobiology，43，197(1997))导入到甲基营养型嗜甲基菌属细菌AS1菌株中(NCIMB10515)。此外，pRS也以与pRSlysE同样的方式被导入到AS1菌株中作为对照。结果显示，以作为对照的pRS组中，每1μgDNA获得几千个菌落，而导入pRSlysE的只获得几个菌落。

当从估计导入了pRSlysE的菌株中提取了质粒并且对质粒的核苷酸序列进行了研究，发现被研究的所有质粒编码lysE的区域中都引入了一个自发的突变。并且在某些菌株中，引入的是无义突变，即一个编码氨基酸的密码子被替换成一个能中止翻译的终止密码子。在其它的质粒中，发现在lysE基因中存在缺失。其它的情况还有，在pRSlysE中的lysE的功能丧失。然而，当将编码lysE区域的一部分有目的地缺失以消除lysE基因(pRSlysE1)的功能而制备的质粒导入到甲基营养型嗜甲基菌属细菌中，质粒就会以对照组的pRS载体相同的频率被导入。

前面提到的pRSlysE1是一种编码lysE区域中存在的从Pvu I位点(识别SEQ ID NO：7的第203-209位的CGATCG)到MluI位点(识别SEQ ID NO：7的第485-491位的ACGCGT)的区域被缺失的质粒。具体地说，pRSlysE是经过Pvu I和Mlu I(Takara Shuro)消化，然后加入到苯酚/氯仿溶液中，混合以结束该反应而构建的。在反应混合液经过离心之后，收集上层，用乙醇沉降法将DNA收集起来，然后在0.8％的琼脂糖凝胶上进行分离，获得一段大约10kbp的DNA片段。这段DNA片段用DNA平端化试剂盒(Takara Shuro)进行平端化。其产物用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo)进行自我连接。

这种连接反应液转化大肠杆菌(大肠杆菌JM109感受态细胞，TakaraShuro)。这些细胞被平铺于含有20mg/L链霉素的LB琼脂培养基中，在37℃下培养过夜。将在琼脂培养基上出现的每一个菌落都接种到含有20mg/L链霉素的LB液体培养基中，然后在37℃下振动条件下培养8小时。采用碱性SDS法从每一培养液中提取质粒DNA，然后通过限制性酶消化来确定每一个质粒的结构从而获得质粒pRSlysE1。

如上所述，带有全长LysE基因的pRSlysE导入到甲基营养型嗜甲基菌属细菌中的频率是很低的，只有含有lysE突变(含有致使功能消除的突变)基因的质粒才能被导入。考虑到这些因素，估计将lysE基因导入到甲基营养型嗜甲基菌属细菌中是致死的。这表明lysE基因一般不能在异源细菌中起到分泌L-赖氨酸的作用。

将载有含有上述突变的pRSlysE的甲基营养型嗜甲基菌属细菌AS1菌株涂到含有20mg/L链霉素的SE II平板上，在37℃下培养过夜。然后，将培养基表面的大约0.3cm²的细胞刮落下来，然后接种到含有20mg/L链霉素的SE II生产培养基(20ml)中，然后在37℃下振动条件下培养34小时。在培养完成之后，用离心的方式将细胞除去，然后用一种氨基酸分析仪(Nihon Bunko，highspeed liquid chromatography)对培养液上层的L-赖氨酸的浓度进行测定。结果显示，尽管导入了突变的lysE基因，实质上仍没有获得提高了分泌L-赖氨酸能力的菌株。

绝大多数被锚定于嗜甲基菌属细菌的突变lysE基因有着能消除野生型LysE的原始功能的突变。因此认为，突变lysE能被导入到嗜甲基菌属细菌中，因为突变lysE没有功能并且也不是致命的。因此，应该认识到这些突变lysE是不同于lysE24的。

嗜甲基菌属细菌中提供分泌L-赖氨酸能力的基因的获得

如上述章节描述的，已知的lysE基因在嗜甲基菌属细菌中是致命的，结果由此得到了许多功能丧失的突变基因。

在分析含有突变的pRSlysE的过程中，获得了一种在嗜甲基菌属细菌中有功能但并不致命的突变lysE基因。

这种突变lysE基因被命名为lysE24基因。当分析lysE24基因的核苷酸序列时发现，这种突变并没有导致一个核酸的替代而是导致了一个无义突变，即引入了一个在lysE基因的翻译区中心周围的终止密码子。有报道称，棒杆菌属细菌中的lysE基因编码了具有六个疏水螺旋的膜蛋白(Vrlijc M.，Sahm H.，和Eggeling L.，Molecular Microbiology 22：815-826(1996))。与之相反，发现由于上述lysE24基因含有一个终止密码子，这个基因编码的蛋白具有一种与野生型LysE蛋白不同的结构。因此结果表明，由于该结构，LysE突变体在嗜甲基菌属细菌中有功能。

lysE24的核苷酸序列和由该核苷酸序列编码的氨基酸序列分别由SEQ IDNO：9和10表示。野生型lysE的核苷酸序列和由该核苷酸序列编码的核酸序列分别由SEQ ID NO：7和8表示。在lysE24中，在野生型lysE基因的第355位的G(鸟嘌呤)之后插入T(胸腺嘧啶)。将含有lysE24的质粒命名为pRSlysE24(图1)。

当pRSlysE24重新导入到AS1菌株时，该质粒能够以与pRS大体相等的频率被导入。在表1中，列出了导入质粒的菌株的培养物的上清液中L-赖氨酸浓度的测量结果。测量方法与前述方法(实施例1第(2)部分)一致。

                             表1

菌株	L-赖氨酸的产量(g/L)
		AS1/pRS	＜0.01
AS1/pRSlysE24	0.1

经pRSlysE24转化的大肠杆菌JM109菌株被命名为AJ13830，该菌株被保存在独立的管理机构(国家高级工业科技研究所)，国际专利生物体保藏机构，保藏日期是2001年6月4日，保藏号是FERM P-18369。而后，在2002年5月13日依据布达佩斯条约，转变成为国际保藏，得到保藏号FERM BP-8040。

携带通过将前述突变产生的终止密码子下游区域从lysE24基因缺失获得的质粒得的质粒(即实施例1部分(1)中所描述的质粒pRSlysE1)的AS1菌株，并不能使得培养基中的L-赖氨酸积累。基于这种结果，估计不仅该肽的前半部分而且后半部分都被lysE24基因表达以形成一个复合物。

实施例2

如上所述，发现lysE基因(与具有有助于棒杆菌属细菌中L-赖氨酸分泌的基因同源的基因)在嗜甲基菌属细菌中根本没有功能。而它的变异体lysE24在嗜甲基菌属细菌中却是有功能的。因此，对棒杆菌属细菌中的lysE基因和在实施例1中获得的lysE24能否在甲基菌属细菌中有功能进行研究。

(1)pRSlysE-Tc的构建

为了能将来自棒杆菌属细菌的野生型lysE基因导入到一个甲基菌属细菌中，首先将实施例1中构建pRSlysE时采用的抗药性标记由原来的链霉素抗性基因替换成四环素抗性基因。这是因为在甲基菌中链霉素抗性不能作为标记使用，因为甲基菌菌属细菌本身就具有链霉素抗性。

具体是，pRSlysE先被限制性酶EcoR I消化，然后将其加入到苯酚/氯仿溶液中，二者混合以结束消化反应。在反应混合液经过离心之后，收集上层溶液，用乙醇沉降法将DNA片段收集起来，然后在0.8％的琼脂糖凝胶上进行分离。用EASY TRAP Ver.2(DNA收集试剂盒，Takara Shuzo)收集了一段具有10kbp的DNA片段。

以质粒pRK310(Journal of Molecular Biology239，623-663(1994))为模板，SEQ NO：11和12中所示DNA引物进行PCR扩增四环素抗性基因区域。其中一个循环包括在94℃变性20秒，在55℃退火30秒，在72℃延伸反应60秒，这样的一个循环要重复30次。PCR采用的是PyrobestDNA聚合酶(TakaraShuro)。用PCR prep(Promega)将含有扩增的四环素抗性基因的DNA片段进行纯化，然后用乙醇沉降法将该DNA片段收集起来，然后在事先在引物中设计好的限制酶位点(如EcoR I)处被消化。然后反应混合液被加入到苯酚/氯仿溶液中，二者混合以结束该反应。接下来，在反应混合液经过离心之后，收集上层，用乙醇沉降法将DNA收集起来，然后目的DNA片段经0.8％的琼脂糖凝胶得到分离，得一段具有1.5kbp的DNA片段。

四环素抗性基因也能以与前述方法同样的方式以另一个质粒取代pRK310作为模板，例如pRK2质粒(一种质粒pRK310(以NICMB11968从NICMB获得，参见Science，190，1226-1228(1975)，或Plasmid，5，10-19(1981))的父代质粒))进行PCR获得。

用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuro)将衍生自用上述方法制备的pRSlysE的DNA片段以及含有四环素抗性基因区域的DNA片段连接起来。用此连接反应液转化大肠杆菌JM109感受态细胞(Takara Shuro)。将这些细胞平铺于含有20mg/L链霉素和15mg/L四环素的LB琼脂培养基中，在37℃下培养过夜。将琼脂培养基上出现的每一个菌落接种到含有20mg/L链霉素和15mg/L四环素的LB液体培养基中，然后在37℃下振动条件下培养8小时。用碱性SDS法从肉汤培养物中提取质粒DNA，然后通过限制性酶消化来确定每一个质粒的结构从而获得pRSlysE-Tc。

(2)将pRSlysE-Tc导入到甲基菌中

由上述方法获得的pRSlysE-Tc通过电穿孔的方法(Canadian Journal ofMicrobiology，43，197(1997))被导入到糖原甲基菌(Methylobacillusglycogenes)NCIMB11375菌株中。作为对照，将pRK310也以与pRSlysE-Tc同样的方式导入到NCIMB11375菌株中。结果显示，作为对照的pRK310组中，每1μgDNA获得几千个菌落，而导入pRSlysE-Tc的只有几个菌落。因此发现，来自于棒杆菌(Corynebacterium)的lysE基因在甲基菌(Methylobacillus)中并不像在嗜甲基菌中那样有功能。

(3)pRSlysE24-Tc的构建

随后，为了研究lysE24能否在甲基菌(Methylobacillus)中有功能，将实施例1中构建pRSlysE24质粒时采用的抗药性标记由原来的链霉素抗性基因改变成四环素抗性基因。

具体是，pRSlysE先用限制性酶EcoR I消化，然后将其加入到苯酚/氯仿溶液中，二者混合以结束该反应。在反应混合液经过离心之后，收集上层溶液，用乙醇沉降法将DNA收集起来，然后用0.8％的琼脂糖凝胶电泳进行分离。用EASY TRAP Ver.2(DNA收集试剂盒，Takara Shuzo)收集了一段具有10kbp的DNA片段。

接下来，通过利用显示于SEQ ID NOS：11和12的引物，以上面所述的，扩增pRK 310的基因区域同样的方式进行PCR，用EcoRI消化该片段，可以获得四环素抗性基因片段。

用DNA连接酶试剂盒Ver.2(Takara Shuro)将衍生自用上述方法制备的pRSlysE24的DNA片段以及含有四环素抗性基因区域的DNA片段连接起来。用此连接反应液转化大肠杆菌JM109感受态细胞(Takara Shuro)。这些细胞被平铺于含有20mg/L链霉素和15mg/L四环素的LB琼脂培养基中，在37℃下培养过夜。将在琼脂培养基上出现的每一个菌落都接种到含有20mg/L链霉素和15mg/L四环素的LB液体培养基中，然后在37℃下振动条件下培养8小时。用碱性SDS法从肉汤培养物中提取质粒DNA，然后通过限制性酶消化来确定每一个质粒的结构从而获得pRSlysE24-Tc。

(4)将pRSlysE24-Tc导入到甲基菌(Methylobacillus)中

将由上述方法获得的pRSlysE24-Tc通过电穿孔的方法(Canadian Journal ofMicrobiology，43，197(1997))导入到糖原甲基菌(Methylobacillusglycogenes)NCIMB11375菌株中。另外，将pRK310也以与pRSlysE-Tc同样的方式导入到NCIMB11375中。结果显示，pRSlysE24-Tc能够以与对照pRK310大体相等的频率导入。在表2中，列出了经质粒导入的菌株的培养物的上清液中L-赖氨酸浓度的测量结果。测量方法与前述方法(实施例1第(2)部分)一致。

                        表2

菌株	L-赖氨酸的产量(g/L)	L-精氨酸的产量(g/L)
			NCIMB11375/pRK310	＜0.01	＜0.01
NCIMB11375/pRSlysE24-Tc	1.57	0.16

发现lysE24基因导入到糖原甲基菌(Methylobacillus glycogenes)NCIMB11375菌株中会导致培养基中L-赖氨酸增加。这被确定为是由于提高了L-赖氨酸的分泌量引起的。而且，当研究培养物的上清液的其它L-氨基酸的浓度时，发现NCIMB11375/pRSlysE24-Tc菌株中积累L-精氨酸，因此发现lysE24基因不仅具有分泌L-赖氨酸还有L-精氨酸的功能。

从以上研究看来，在嗜甲基菌(Methylophilus)菌中有功能的lysE24在甲基菌(Methylobacillus)中同样有功能。

实施例3L-赖氨酸生物合成系统酶基因以及lysE24基因导入到糖原甲基菌中

发现当lysE24基因导入到糖原甲基菌(Methylobacillus glycogenes)NCIMB11375菌株中时，培养基中L-赖氨酸积累。这被认为是由于提高了L-赖氨酸的分泌量而造成的。因此对lysE24基因导入糖原甲基菌(Methylobacillusglycogenes)中对L-赖氨酸生物合成基因的增强的作用进行了研究。

(1)具有dapA^*基因的质粒pRS dapA的构建

制备具有编码二氢吡啶二羧酸合酶的基因而不是L-赖氨酸生物合成系统酶基因的质粒。这个质粒并不是受L-赖氨酸(dapA^*)的反馈抑止。

将实施例1中制备的pRStac用Sse8387 I和Xba I进行消化，然后加入到苯酚/氯仿溶液中，混合后以结束该反应。在反应混合液经过离心之后，收集上层，用乙醇沉降法将DNA收集起来，然后在0.8％的琼脂糖凝胶上进行分离，收集一段具有9kbp的DNA片段。

用含有dapA^*基因片段的已知质粒RSFD80(见WO90/16042)作为模板，用用SEQ NO：3和4中所示引物进行PCR以扩增dapA^*基因片段(在94℃变性20秒，在55℃退火30秒，在72℃延伸60秒)。PCR采用的是PyrobestDNA聚合酶(Takara Shuro)。所得的dapA^*片段用PCR prep(Promega)纯化出来，然后用限制酶Sse8387 I和Xba I进行消化。然后反应混合液被加入到苯酚/氯仿溶液中，二者混合以结束该反应。在反应混合液经过离心之后，收集上层，用乙醇沉降法将DNA收集起来，然后在0.8％的琼脂糖凝胶上进行分离。收集了一段具有0.1kbp的DNA片段。

用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuro)将用上述方法制备的pRStac载体的消化产物以及dapA^*基因片段连接起来。用此连接反应液转化大肠杆菌(大肠杆菌JM109感受态细胞，Takara Shuro)。将这些细胞平铺于含有20mg/L链霉素的LB琼脂培养基中，在37℃下振动条件下培养过夜。将在琼脂培养基上出现的每一个菌落都接种到含有20mg/L链霉素LB液体培养基中，然后在37℃下振动条件下培养8小时。碱性SDS法从每一肉汤培养基中提取质粒DNA，然后通过限制性酶消化以及核苷酸序列的测定来确定每一个质粒的结构从而确定质粒pRSdapA^*的存在。在pRSdapA中，dapA^*基因被定位为使得其转录方向与tac启动子的方向一致。

经pRSdapA质粒转化的大肠杆菌JM109菌株被命名为AJ13831，该菌株被保存在独立的管理机构(国家高级工业科技技术研究所)国际专利生物体绿芷机构，保藏日期是2001年6月4日，保藏号是FERM P-18370。而后，依据布达佩斯条约在2002年5月13日转变成为国际保藏，得到保藏号FERM BP-8041。

(2)具有lysE24和dapA^*基因的质粒，SlysE24-dapA-Tc的构建

具有插入了dapA^*基因pRS lysE24的质粒以图2所示方案构建。该质粒用以评价lysE24和dapA^*结合的效果。

将实施例1中制备的pRS lysE24用限制性酶Sap I消化然后用DNA平端化试剂盒(Takara Shuro)进行平端化。具有dapA^*的质粒pRSdapA用限制性酶EcoR I和Sap I进行消化，通过0.8％的琼脂糖凝胶上进行分离得到一段1kbp长的含有tac启动子和dapA^*区域的片段。用EASY TRAP Ver.2(DNA收集试剂盒，Takara Shuzo)收集了该片段。该片段以上述方法平端化并且通过DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo)和前面所提到的pRS lysE24的消化产物进行连接。

将前面提到的连接反应液转化大肠杆菌(大肠杆菌JM109感受态细胞，Takara Shuro)。将这些细胞平铺于含有20mg/L链霉素的LB琼脂培养基中，在37℃条件下培养过夜。将在琼脂培养基上出现的每一个菌落都接种到含有20mg/L链霉素LB液体培养基中，然后在37℃下振动条件下培养8小时。碱性SDS法从每一肉汤培养基中提取质粒DNA，然后通过限制性酶消化以及核苷酸序列的测定来确定每一个质粒的结构从而确定质粒pRSlysEdapA的存在。

经pRSlysEdapA质粒转化的大肠杆菌JM109菌株被命名为AJ13832，该菌株被保存在独立的管理机构(国家高级工业科技研究所)国际专利生物体绿芷机构，保藏日期是2001年6月4日，保藏号是FERM P-18371，而后，依据布达佩斯条约在2002年5月13日转变成为国际保藏，得到保藏号FERM BP-8042。

接下来，将pRSlysEdapA质粒的抗药性标记基因由原来的链霉素抗性基因替换成四环素抗性基因。首先，质粒pRSlysEdapA先用限制性酶EcoR I消化，然后将其加入到苯酚/氯仿溶液中，二者混合以结束该反应。在反应混合液经过离心之后，收集上层溶液，用乙醇沉降法将DNA收集起来，然后在通过0.8％的琼脂糖凝胶电泳进行分离。用EASY TRAP Ver2(DNA收集试剂盒，TakaraShuzo)收集了一段具有11kbp的DNA片段。

四环素抗性基因的片段通过与实施例1中同样的方法获得，即以SEQ NO：11和12中所示引物进行PCR法从质粒pRK310中扩增所需基因区域，而后用限制酶EcoR I对扩增产物进行消化。

用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuro)将衍生自用上述方法制备的pRSlysEdapA的DNA片段以及含有四环素抗性基因区域的DNA片段连接起来。用此连接反应液转化大肠杆菌JM109感受态细胞(Takara Shuro)。将这些细胞平铺于含有20mg/L链霉素和15mg/L四环素的LB琼脂培养基中，在37℃下培养过夜。将在琼脂培养基上出现的每一个菌落都接种到含有20mg/L链霉素和15mg/L四环素的LB液体培养基中，然后在37℃下振动条件下培养16小时。用碱性SDS法从肉汤培养基提取质粒DNA，然后通过限制性酶消化来确定每一个质粒的结构从而获得pRSlysE-dapA-Tc。(2)将pRSlysE-dapA-Tc导入到糖原甲基菌NCIMB11375菌株中以及氨基酸的生产

将由上述方法获得的pRSlysE-dapA-Tc通过电穿孔的方法导入到糖原甲基菌NCIMB111375菌株中。培养所得到的被转化的菌株(此后称为NCIMB111375/pRSlysE-dapA-Tc)，导入了前面提到的pRSlysE24-Tc的菌株(此后称为NCIMB111375/pRSlysE-Tc)，以及作为对照的导入了pRK310的菌株(此后称为NCIMB111375/pRSlysE-Tc)这三种菌株，用以研究在培养物上清液中的L-氨基酸浓度。

每一株转化菌株涂到一个含有15mg/L四环素的SE II平板上，在30℃下培养两天。然后，将培养基表面的大约10cm²的细胞刮落下来，然后接种到含有15mg/L四环素的SEII生产培养基(20ml)中，然后在37℃下振动培养60小时。在培养完成之后，用离心的方式将细胞除去，然后用一种氨基酸分析仪(Nihon Bunko，high speed liquid chromatography)对培养液上上清液的L-赖氨酸的浓度进行鉴定。结果列在表3中。发现与具有pRSlysE24-Tc菌株相比，在NCIMB/pRSlysE-dapA-Tc菌株中，培养基中积聚的L-赖氨酸有所增加。因此认为lysE24基因的导入删除了与分泌相关的速率限制。而dapA^*基因的促进作用是一种协同作用。

                                   表3

菌株	L-赖氨酸的产量(g/L)	L-精氨酸的产量(g/L)
			NCIMB11375/pRK310	＜0.02	＜0.01
NCIMB11375/pRSlysE24-Tc	1.57	0.16
			NCIMB11375/pRSlysE-dapA-Tc	1.72	0.14

虽然以优选的具体例子对本发明进行了详尽的描述，但是对本领域普通技术人员来说有许多改变和相应的替代是显而易见可以做到的。而这并不超出本发明范围的。前面所提到的每一篇文献，就像外国优先权文件JP2002336340，被完整的采用作为参考文件。

                          序列表

<110>味之素公司

<120>利用甲醇同化细菌生产L-赖氨酸或L-精氨酸的方法

<130>0P1628

<150>JP 2002-336340

<151>2002-11-20

<160>14

<170>PatentIn Ver.2.0

<210>1

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>1

agggaattcc ccgttctgga taatgttttt tgcgccgac                         39

<210>2

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>2

cggatgcatc tagagttaac ctgcagggtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacac    58

<210>3

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>3

tgacctgcag gtttgcacag aggatggccc atgtt                            35

<210>4

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>4

cattctagat ccctaaactt tacagcaaac cggcat                           36

<210>5

<211>64

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>5

catttcctgc aggcaaagga gatgagcgta atggtgatca tggaaatctt cattacaggt 60

ctgc                                                              64

<210>6

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>6

gggcgagcta gaagagctcc aaaacccgcg aaaactaacc catcaacatc            50

<210>7

<211>711

<212>DNA

<213>乳糖发酵短杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(711)

<400>7

atg gtg atc atg gaa atc ttc att aca ggt ctg ctt ttg ggg gcc agt    48

Met Val Ile Met Glu Ile Phe Ile Thr Gly Leu Leu Leu Gly Ala Ser

  1               5                  10                  15

ctt tta ctg tcc atc gga ccg cag aat gta ctg gtg att aaa caa gga    96

Leu Leu Leu Ser Ile Gly Pro Gln Asn Val Leu Val Ile Lys Gln Gly

             20                  25                  30

att aag cgc gaa gga ctc att gcg gtt ctt ctc gtg tgt tta att tct    144

Ile Lys Arg Glu Gly Leu Ile Ala Val Leu Leu Val Cys Leu Ile Ser

         35                  40                  45

gac gtc ttt ttg ttc atc gcc ggc acc ttg ggc gtt gat ctt ttg tcc    192

Asp Val Phe Leu Phe Ile Ala Gly Thr Leu Gly Val Asp Leu Leu Ser

     50                  55                  60

aat gcc gcg ccg atc gtg ctc gat att atg cgc tgg ggt ggc atc gct    240

Asn Ala Ala Pro Ile Val Leu Asp Ile Met Arg Trp Gly Gly Ile Ala

 65                  70                  75                  80

tac ctg tta tgg ttt gcc gtc atg gca gcg aaa gac gcc atg aca aac    288

Tyr Leu Leu Trp Phe Ala Val Met Ala Ala Lys Asp Ala Met Thr Asn

                 85                  90                  95

aag gtg gaa gcg cca cag atc att gaa gaa aca gaa cca acc gtg ccc    336

Lys Val Glu Ala Pro Gln Ile Ile Glu Glu Thr Glu Pro Thr Val Pro

            100                 105                 110

gat gac acg cct ttg ggc ggt tcg gcg gtg gcc act gac acg cgc aac    384

Asp Asp Thr Pro Leu Gly Gly Ser Ala Val Ala Thr Asp Thr Arg Asn

        115                 120                 125

cgg gtg cgg gtg gag gtg agc gtc gat aag cag cgg gtt tgg gta aag    432

Arg Val Arg Val Glu Val Ser Val Asp Lys Gln Arg Val Trp Val Lys

    130                 135                 140

ccc atg ttg atg gca atc gtg ctg acc tgg ttg aac ccg aat gcg tat    480

Pro Met Leu Met Ala Ile Val Leu Thr Trp Leu Asn Pro Asn Ala Tyr

145                 150                 155                 160

ttg gac gcg ttt gtg ttt atc ggc ggc gtc ggc gcg caa tac ggc gac    528

Leu Asp Ala Phe Val Phe Ile Gly Gly Val Gly Ala Gln Tyr Gly Asp

                165                 170                 175

acc gga cgg tgg att ttc gcc gct ggc gcg ttc gcg gca agc ctg atc    576

Thr Gly Arg Trp Ile Phe Ala Ala Gly Ala Phe Ala Ala Ser Leu Ile

            180                 185                 190

tgg ttc ccg ctg gtg ggt ttc ggc gca gca gca ttg tca cgc ccg ctg    624

Trp Phe Pro Leu Val Gly Phe Gly Ala Ala Ala Leu Ser Arg Pro Leu

        195                 200                 205

tcc agc ccc aag gtg tgg cgc tgg atc aac gtc gtc gtg gca gtt gtg    672

Ser Ser Pro Lys Val Trp Arg Trp Ile Asn Val Val Val Ala Val Val

    210                 215                 220

atg acc gca ttg gcc atc aaa ctg atg ttg atg ggt tag           711

Met Thr Ala Leu Ala Ile Lys Leu Met Leu Met Gly

225                 230                 235

<210>8

<211>236

<212>PRT

<213>乳糖发酵短杆菌

<400>8

Met Val Ile Met Glu Ile Phe Ile Thr Gly Leu Leu Leu Gly Ala Ser

  1               5                  10                  15

Leu Leu Leu Ser Ile Gly Pro Gln Asn Val Leu ValIle Lys Gln Gly

             20                  25                 30

Ile Lys Arg Glu Gly Leu Ile Ala Val Leu Leu Val Cys Leu Ile Ser

         35                  40                  45

Asp Val Phe Leu Phe Ile Ala Gly Thr Leu Gly Val Asp Leu Leu Ser

     50                  55                  60

Asn Ala Ala Pro Ile Val Leu Asp Ile Met Arg Trp Gly Gly Ile Ala

 65                  70                  75                  80

Tyr Leu Leu Trp Phe Ala Val Met Ala Ala Lys Asp Ala Met Thr Asn

                 85                  90                  95

Lys Val Glu Ala Pro Gln Ile Ile Glu Glu Thr Glu Pro Thr Val Pro

            100                 105                 110

Asp Asp Thr Pro Leu Gly Gly Ser Ala Val Ala Thr Asp Thr Arg Asn

        115                 120                 125

Arg Val Arg Val Glu Val Ser Val Asp Lys Gln Arg Val Trp Val Lys

    130                 135                 140

Pro Met Leu Met Ala Ile Val Leu Thr Trp Leu Asn Pro Asn Ala Tyr

145                 150                 155                 160

Leu Asp Ala Phe Val Phe Ile Gly Gly Val Gly Ala Gln Tyr Gly Asp

                165                 170                 175

Thr Gly Arg Trp Ile Phe Ala Ala Gly Ala Phe Ala Ala Ser Leu Ile

            180                 185                 190

Trp Phe Pro Leu Val Gly Phe Gly Ala Ala Ala Leu Ser Arg Pro Leu

        195                 200                 205

Ser Ser Pro Lys Val Trp Arg Trp Ile Asn Val Val Val Ala Val Val

    210                 215                 220

Met Thr Ala Leu Ala Ile Lys Leu Met Leu Met Gly

225                 230                 235

<210>9

<211>712

<212>DNA

<213>乳糖发酵短杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(375)

<400>9

atg gtg atc atg gaa atc ttc att aca ggt ctg ctt ttg ggg gcc agt    48

Met Val Ile Met Glu Ile Phe Ile Thr Gly Leu Leu Leu Gly Ala Ser

  1               5                  10                  15

ctt ttg ctg tcc atc gga ccg cag aat gta ctg gtg att aaa caa gga    96

Leu Leu Leu Ser Ile Gly Pro Gln Asn Val Leu Val Ile Lys Gln Gly

             20                  25                  30

att aag cgc gaa gga ctc att gcg gtt ctt ctc gtg tgt tta att tct   144

Ile Lys Arg Glu Gly Leu Ile Ala Val Leu Leu Val Cys Leu Ile Ser

         35                  40                  45

gac gtc ttt ttg ttc atc gcc ggc acc ttg ggc gtt gat ctt ttg tcc   192

Asp Val Phe Leu Phe Ile Ala Gly Thr Leu Gly Val Asp Leu Leu Ser

     50                  55                  60

aat gcc gcg ccg atc gtg ctc gat att atg cgc tgg ggt ggc atc gct   240

Asn Ala Ala Pro Ile Val Leu Asp Ile Met Arg Trp Gly Gly Ile Ala

 65                  70                  75                  80

tac ctg tta tgg ttt gcc gtc atg gca gcg aaa gac gcc atg aca aac   288

Tyr Leu Leu Trp Phe Ala Val Met Ala Ala Lys Asp Ala Met Thr Asn

                 85                  90                  95

aag gtg gaa gcg cca cag atc att gaa gaa aca gaa cca acc gtg ccc   336

Lys Val Glu Ala Pro Gln Ile Ile Glu Glu Thr Glu Pro Thr Val Pro

            100                 105                 110

gat gac acg cct ttg ggc gtg ttc ggc ggt ggc cac tga cacgcgcaac    385

Asp Asp Thr Pro Leu Gly Val Phe Gly Gly Gly His

        115                 120                 125

cgggtgcggg tggaggtgag cgtcgataag cagcgggttt gggtgaagcc catgttgatg 445

gcaatcgtgc tgacctggtt gaacccgaat gcgtatttgg acgcgtttgt gtttatcggc 505

ggcgtcggcg cgcaatacgg cgacaccgga cggtggattt tcgccgctgg cgcgttcgcg 565

gcaagcctga tctggttccc gctggtgggt ttcggcgcag cagcattgtc acgcccgctg 625

tccagcccca aggtgtggcg ctggatcaac gtcgtcgtgg cagttgtgat gaccgcattg 685

gccatcaaac tgatgttgat gggttag                                     712

<210>10

<211>124

<212>PRT

<213>乳糖发酵短杆菌

<400>10

Met Val Ile Met Glu Ile Phe Ile Thr Gly Leu Leu Leu Gly Ala Ser

  1               5                  10                  15

Leu Leu Leu Ser Ile Gly Pro Gln Asn Val Leu Val Ile Lys Gln Gly

             20                  25                  30

Ile Lys Arg Glu Gly Leu Ile Ala Val Leu Leu Val Cys Leu Ile Ser

         35                  40                  45

Asp Val Phe Leu Phe Ile Ala Gly Thr Leu Gly Val Asp Leu Leu Ser

     50                  55                  60

Asn Ala Ala Pro Ile Val Leu Asp Ile Met Arg Trp Gly Gly Ile Ala

 65                  70                  75                  80

Tyr Leu Leu Trp Phe Ala Val Met Ala Ala Lys Asp Ala Met Thr Ash

                 85                  90                  95

Lys Val Glu Ala Pro Gln Ile Ile Glu Glu Thr Glu Pro Thr Val Pro

            100                 105                 110

Asp Asp Thr Pro Leu Gly Val Phe Gly Gly Gly His

        115                 120

*<210>11

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>11

aaagaattcg cacggatcac tgtattcggc tgcaacttt                     39

<210>12

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>12

aaagaattcg ccgtgttgct aggatggttg ttcttggatc a                  41

*<210>13

<211>1197

<212>DNA

<2t3>大肠杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(272)..(1153)

<400>13

ccaggcgact gtcttcaata ttacagccgc aactactgac atgacgggtg atggtgttca   60

caattccacg gcgatcggca cccaacgcag tgatcaccag ataatgtgtt gcgatgacag  120

tgtcaaactg gttattcctt taaggggtga gttgttctta aggaaagcat aaaaaaaaca  180

tgcatacaac aatcagaacg gttctgtctg cttgctttta atgccatacc aaacgtacca  240

ttgagacact tgtttgcaca gaggatggcc c atg ttc acg gga agt att gtc     292

                                   Met Phe Thr Gly Ser Ile Val

                                     1               5

gcg att gtt act ccg atg gat gaa aaa ggt aat gtc tgt cgg gct agc    340

Ala Ile Val Thr Pro Met Asp Glu Lys Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser

         10                  15                  20

ttg aaa aaa ctg att gat tat cat gtc gcc agc ggt act tcg gcg atc    388

Leu Lys Lys Leu Ile Asp Tyr His Val Ala Ser Gly Thr Ser Ala Ile

     25                  30                  35

gtt tct gtt ggc acc act ggc gag tcc gct acc tta aat cat gac gaa    436

Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser Ala Thr Leu Asn His Asp Glu

 40                  45                  50                  55

cat gct gat gtg gtg atg atg acg ctg gat ctg gct gat ggg cgc att    484

His Ala Asp Val Val Met Met Thr Leu Asp Leu Ala Asp Gly Arg Ile

                 60                  65                  70

ccg gta att gcc ggg acc ggc gct aac gct act gcg gaa gcc att agc    532

Pro Val Ile Ala Gly Thr Gly Ala Asn Ala Thr Ala Glu Ala Ile Ser

             75                  80                  85

ctg acg cag cgc ttc aat gac agt ggt atc gtc ggc tgc ctg acg gta    580

Leu Thr Gln Arg Phe Asn Asp Ser Gly Ile Val Gly Cys Leu Thr Val

         90                  95                 100

acc cct tac tac aat cgt ccg tcg caa gaa ggt ttg tat cag cat ttc    628

Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gln Glu Gly Leu Tyr Gln His Phe

    105                 110                 115

aaa gcc atc gct gag cat act gac ctg ccg caa att ctg tat aat gtg    676

Lys Ala Ile Ala Glu His Thr Asp Leu Pro Gln Ile Leu Tyr Asn Val

120                 125                 130                 135

ccg tcc cgt act ggc tgc gat ctg ctc ccg gaa acg gtg ggc cgt ctg    724

Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Leu Leu Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu

                140                 145                 150

gcg aaa gta aaa aat att atc gga atc aaa gag gca aca ggg aac tta    772

Ala Lys Val Lys Asn Ile Ile Gly Ile Lys Glu Ala Thr Gly Asn Leu

            155                 160                 165

acg cgt gta aac cag atc aaa gag ctg gtt tca gat gat ttt gtt ctg    820

Thr Arg Val Asn Gln Ile Lys Glu Leu Val Ser Asp Asp Phe Val Leu

        170                 175                 180

ctg agc ggc gat gat gcg agc gcg ctg gac ttc atg caa ttg ggc ggt   868

Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu Asp Phe Met Gln Leu Gly Gly

    185                 190                 195

cat ggg gtt att tcc gtt acg act aac gtc gca gcg cgt gat atg gcc   916

His Gly Val Ile Ser Val Thr Thr Asn Val Ala Ala Arg Asp Met Ala

200                 205                 210                 215

cag atg tgc aaa ctg gca gca gaa gaa cat ttt gcc gag gca cgc gtt   964

Gln Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Glu His Phe Ala Glu Ala Arg Val

                220                 225                 230

att aat cag cgt ctg atg cca tta cac aac aaa cta ttt gtc gaa ccc  1012

Ile Asn Gln Arg Leu Met Pro Leu His Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro

            235                 240                 245

aat cca atc ccg gtg aaa tgg gca tgt aag gaa ctg ggt ctt gtg gcg  1060

Asn Pro Ile Pro Val Lys Trp Ala Cys Lys Glu Leu Gly Leu Val Ala

        250                 255                 260

acc gat acg ctg cgc ctg cca atg aca cca atc acc gac agt ggt cgt  1108

Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr Pro Ile Thr Asp Ser Gly Arg

    265                 270                 275

gag acg gtc aga gcg gcg ctt aag cat gcc ggt ttg ctg taa          1150

Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Lys His Ala Gly Leu Leu

280                 285                 290

agtttaggga gatttgatgg cttactctgt tcaaaagtcg cgcctgg              1197

<210>14

<211>292

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>14

Met Phe Thr Gly Ser Ile Val Ala Ile Val Thr Pro Met Asp Glu Lys

  1               5                  10                  15

Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser Leu Lys Lys Leu Ile Asp Tyr His Val

             20                  25                  30

Ala Ser Gly Thr Ser Ala Ile Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser

         35                  40                  45

Ala Thr Leu Asn His Asp Glu His Ala Asp Val Val Met Met Thr Leu

     50                  55                  60

Asp Leu Ala Asp Gly Arg Ile Pro Val Ile Ala Gly Thr Gly Ala Asn

 65                  70                  75                  80

Ala Thr Ala Glu Ala Ile Ser Leu Thr Gln Arg Phe Asn Asp Ser Gly

                 85                  90                  95

Ile Val Gly Cys Leu Thr Val Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gln

            100                 105                 110

Glu Gly Leu Tyr Gln His Phe Lys Ala Ile Ala Glu His Thr Asp Leu

        115                 120                 125

Pro Gln Ile Leu Tyr Asn Val Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Leu Leu

    130                 135                 140

Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu Ala Lys Val Lys Asn Ile Ile Gly Ile

145                 150                 155                 160

Lys Glu Ala Thr Gly Asn Leu Thr Arg Val Asn Gln Ile Lys Glu Leu

                165                 170                 175

Val Ser Asp Asp Phe Val Leu Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu

            180                 185                 190

Asp Phe Met Gln Leu Gly Gly His Gly Val Ile Ser Val Thr Thr Asn

        195                 200                 205

Val Ala Ala Arg Asp Met Ala Gln Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Glu

    210                 215                 220

His Phe Ala Glu Ala Arg Val Ile Asn Gln Arg Leu Met Pro Leu His

225                 230                 235                 240

Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro Asn Pro Ile Pro Val Lys Trp Ala Cys

                245                 250                 255

Lys Glu Leu Gly Leu Val Ala Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr

            260                 265                 270

Pro Ile Thr Asp Ser Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Lys His

        275                 280                 285

Ala Gly Leu Leu

    290

Claims (9)

1、一种属于甲基菌属的细菌，其中导入了一种能被表达的DNA，所述细菌具有产生L-赖氨酸或L-精氨酸的能力，所述DNA编码一种蛋白的变异体，所述蛋白有1个环形区域和6个疏水螺旋，并且参与将L-赖氨酸分泌到细胞外，而所述变异体不含有所述环形区域，当所述DNA被导入到所述甲醇同化细菌时，能促进L-赖氨酸、L-精氨酸或它们二者分泌到甲醇同化细菌的外部。

2、根据权利要求1所述的细菌，其中所述的蛋白变异体实质上只由疏水螺旋组成。

3、根据权利要求1所述的细菌，其中所述的变异体有6个疏水螺旋。

4、根据权利要求1所述的细菌，其中所述的变异体是一种复合物，它包括一个含有相对N-末端而言第1、第2和第3疏水螺旋的肽，以及一个含有相对N-末端而言第4、第5和第6疏水螺旋的肽。

5、根据权利要求1所述的细菌，其中所述的蛋白是LysE蛋白。

6、根据权利要求5所述的细菌，其中所述LysE蛋白来源于棒状杆菌。

7、一种属于甲基菌属的细菌，其中导入了一种能被表达的DNA，所述细菌具有产生L-赖氨酸或L-精氨酸的能力，所述DNA编码一种选自下列的蛋白：

(A)包括SEQ ID NO：10的氨基酸序列的蛋白，以及

(B)包括在SEQ ID NO：10的氨基酸序列中包括置换、缺失、插入或是增加一个或几个氨基酸残基的氨基酸序列的蛋白，

其中所述蛋白具有促进L-赖氨酸、L-精氨酸或它们二者分泌到甲醇同化细菌外部的活性。

8、一种生产L-赖氨酸或L-精氨酸的方法，包括在培养基中培养权利要求1的属于甲基菌属的细菌，在培养物中产生和积聚L-赖氨酸或L-精氨酸，并且从培养物中收集L-赖氨酸或L-精氨酸。

9、根据权利要求8的生产L-赖氨酸或L-精氨酸的方法，其中培养基中含有甲醇作为主要的碳源。

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