CN1918283A

CN1918283A - 使用肠细菌科菌株制备l－氨基酸的方法

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Publication number: CN1918283A
Application number: CNA2005800040826A
Authority: CN
Inventors: 梅希特西尔德·里平; 尼克尔·杜施
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2004-02-06
Filing date: 2005-01-27
Publication date: 2007-02-21
Anticipated expiration: 2025-01-27
Also published as: CN1918283B; WO2005075627A1; EP1711593B1; US20050176112A1; ES2327430T3; DK1711593T3; DE102004005836A1; EP1711593A1; ATE433483T1; DE602005014846D1; US7575905B2

Abstract

本发明涉及一种通过发酵肠细菌科的重组微生物制备L－氨基酸的方法，其中：a)将产生所需的L－氨基酸的微生物在所需的L－氨基酸被富集在培养基或者细胞中的条件下培养，所述微生物中yibDORF或编码其基因产物的核苷酸序列或等位基因是增强的、特别是过表达的，及b)分离所需L－氨基酸，发酵肉汤的成分和/或全部或部分(≥0至100％)生物量任选地被保留在分离的产物中或者被完全除去。

Description

使用肠细菌科菌株制备L-氨基酸的方法

发明领域

本发明涉及一种使用肠细菌科(Enterobacteriaceae)的重组微生物制备L-氨基酸、特别是L-苏氨酸的方法，其中yibD所示开放读框(ORF)是增强的、特别是过表达的，本发明还涉及所述微生物。

背景技术

L-氨基酸，特别是L-苏氨酸用于人类药品及制药工业，用于食品业，特别用于动物营养。

已知L-氨基酸是通过发酵肠细菌菌株，尤其大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)和粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)而生产的。由于L-氨基酸的极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。方法的改良可涉及有关发酵技术的措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组分，如发酵期间的糖浓度，或产物形式的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。

为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变、选择及突变体选择等方法以获得对抗代谢物例如苏氨酸类似物α-氨基-β-羟基戊酸(AHV)有抗性的菌株，或者对于调节重要性代谢物是营养缺陷的、及产生L-氨基酸例如L-苏氨酸的菌株。

一段时间以来，重组DNA技术的方法也已经用于生产L-氨基酸的肠细菌科菌株的改良，通过扩增各个氨基酸生物合成基因并研究对生产的作用而进行。关于大肠杆菌和沙门氏菌的细胞和分子生物学的综述见于Neidhardt(ed)：Escherichia coli and Salmonella，Cellular and Molecular Biology，2nd Edition，ASM Press，Washington，D.C.，USA(1996)。

发明目的

本发明人提供了改良通过发酵制备L-氨基酸、特别是L-苏氨酸的新方法。

发明概述

本发明提供了肠细菌科的重组微生物，其含有增强的或过表达的、编码称作推定的糖基转移酶的多肽的yibD开放读框或者编码其基因产物的核苷酸序列，且所述微生物以改良的方式生产L-氨基酸，特别是L-苏氨酸。

在所有情况中，对于yibD ORF未重组的及含有未增强的yibDORF的微生物作为对比的出发点。

这些微生物特别包括肠细菌科的微生物，其中编码一种多肽的多核苷酸是增强的，所述多肽的氨基酸序列与选自包括SEQ ID No：4和SEQ ID No：6的组中的氨基酸序列至少90％、特别是至少95％、优选至少98％或者至少99％、特别优选99.7％、非常特别优选100％相同。

优选与SEQ ID No：4或SEQ ID No：6的序列相同的氨基酸序列。

所述微生物含有增强的或过表达的选自如下的多核苷酸：

a)具有SEQ ID No：3或SEQ ID No：5所示核苷酸序列的多核苷酸；

b)具有在遗传密码简并范围内相应于SEQ ID No：3或SEQ IDNo：5的核苷酸序列的多核苷酸；

c)具有在严格条件下与互补于SEQ ID No：3或SEQ ID No：5的序列杂交的序列的多核苷酸序列；

d)具有含有中性有义突变的SEQ ID No：3或SEQ ID No：5序列的多核苷酸，

其中所述多核苷酸编码推定的糖基转移酶。

本发明还提供了一种使用肠细菌科的重组微生物制备L-氨基酸，特别是L-苏氨酸的发酵方法，所述微生物特别已经生产L-氨基酸并且其中至少称作yibD的开放读框(ORF)或者编码其基因产物的核苷酸序列是增强的。

优选应用所述的微生物。

当下文提及术语“L-氨基酸”或“氨基酸”是指选自如下的一或多种氨基酸，包括其盐：L-天冬酰胺、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-高丝氨酸。特别优选L-苏氨酸。

文中术语“增强”描述了微生物中由适当的DNA编码的一或多种酶或蛋白质的胞内活性或浓度的增加，例如通过使基因或ORF的拷贝数增加至少1个拷贝、将强启动子与所述基因功能性连接，或者使用编码具有高活性的适当的酶/蛋白质的基因、等位基因或ORF进行，任选组合这些措施。

开放读框(ORF)是指编码或者可以编码根据现有技术不能确定其功能的蛋白质/多肽或者核糖核酸的核苷酸序列的节段(segment)。在确定所研究的核苷酸序列节段的功能后，其通常被称作基因。等位基因一般是指给定基因的另一种形式。通过核苷酸序列中的差异区别这些形式。

由核苷酸序列即ORF、基因或等位基因编码的蛋白质或者编码的核糖核酸一般称作基因产物。

通过增强措施，特别是过表达，基于野生型蛋白质或者所述适当酶或蛋白质未重组的微生物或亲代菌株中所述蛋白质的活性或浓度，适当蛋白质的活性或浓度一般增加至少10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％，直至最大1000％或2000％。未重组的微生物或亲代菌株是指对其进行本发明的措施的微生物。

本发明提供了通过发酵肠细菌科的重组微生物制备L-氨基酸的方法，其中：

a)将产生所需L-氨基酸的微生物在所需L-氨基酸被富集在培养基或者细胞中的条件下在培养基中培养，其中yibD开放读框或编码基因产物的核苷酸序列或者等位基因是增强的、或者特别是过表达的：及

b)分离所需L-氨基酸，发酵肉汤的成分和/或生物量的全部或部分(≥0-100％)，任选被保留在分离的产物中或者被完全除去。

本发明还提供了具有增强或者过表达的称作yibD的开放读框(ORF)的微生物，特别是重组微生物，其可以从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜，任选淀粉或任选纤维素或者从甘油和乙醇中生产L-氨基酸。所述微生物是选自埃希氏菌(Escherichia)属欧文氏菌属(Erwinia)、普罗威登斯菌属(Providencia)和沙雷氏菌属的肠细菌科代表性菌株。优选埃希氏菌属和沙雷氏菌属。在埃希氏菌属和沙雷氏菌属中可以提及的分别是大肠杆菌菌种及粘质沙雷氏菌菌种。

重组微生物一般是通过转化、转导或接合，或者组合这些方法，使用含有所需的ORF、所需的基因、这种ORF或基因或其一部分的等位基因和/或其增强该ORF或基因表达的启动子而产生。这种启动子可以是通过增强所述基因或ORF上游的固有调节序列突变的启动子，或者是已与该基因或ORF融合的有效启动子。

埃希氏菌属、特别是大肠杆菌菌种的合适菌株、特别是生产L-苏氨酸的菌株的例子是：

-大肠杆菌H4581(EP 0 301 572)

-大肠杆菌KY10935(Bioscience，Biotechnology andBiochemistry 61(11)：1877-1882(1997)

-大肠杆菌VNIIgenetika MG442(US-A-4278,765)

-大肠杆菌VNIIgenetika M1(US-A-4,321,325)

-大肠杆菌VNIIgenetika 472T23(US-A-5,631,157)

-大肠杆菌BKIIM B-3996(US-A-5,175,107)

-大肠杆菌kat 13(WO 98/04715)

-大肠杆菌KCCM-10132(WO 00/09660)。

沙雷氏菌属、特别是粘质沙雷氏菌菌种的生产L-苏氨酸的合适菌株的例子是：

-粘质沙雷氏菌HNr21(Applied and Environmental Microbiology38(6)：1045-1051(1979))

-粘质沙雷氏菌TLr156(Gene 57(2-3)：151-158(1987))

-粘质沙雷氏菌T-2000(Applied Biochemistry and Biotechnology37(3)：255-265(1992))

肠细菌科生产L-苏氨酸的菌株优选具有选自如下的一或多种遗传或表型特征：α-氨基-β-羟戊酸抗性，硫赖氨酸(thialysine)抗性，乙硫氨酸抗性，α-甲基丝氨酸抗性，二氨基琥珀酸抗性，α-氨基丁酸抗性，疏螺旋体素抗性，环戊烷羧酸抗性，利福平抗性，缬氨酸类似物例如缬氨酸氧肟酸抗性，嘌呤类似物例如6-二甲基氨基嘌呤抗性，需要L-甲硫氨酸，任选部分及可补偿地需要L-异亮氨酸，需要内消旋-二氨基庚二酸，含有苏氨酸的二肽营养缺陷，L-苏氨酸抗性，苏氨酸萃余物抗性，L-高丝氨酸抗性，L-赖氨酸抗性，L-甲硫氨酸抗性，L-谷氨酸抗性，L-天冬氨酸抗性，L-亮氨酸抗性，L-苯丙氨酸抗性，L-丝氨酸抗性，L-半胱氨酸抗性，L-缬氨酸抗性，氟丙酮酸敏感性，缺陷的苏氨酸脱氢酶，任选蔗糖利用能力，苏氨酸操纵子的增强，高丝氨酸脱氢酶I-天冬氨酸激酶I的增强，优选反馈抗性形式，高丝氨酸激酶的增强，苏氨酸合酶的增强，天冬氨酸激酶的增强，任选反馈抗性形式，天冬氨酸半醛脱氢酶的增强，磷酸烯醇丙酮酸羧酶的增强，任选反馈抗性形式，磷酸烯醇丙酮酸合酶的增强，转氢酶的增强，RhtB基因产物的增强，RhtC基因产物的增强，YfiK基因产物的增强，丙酮酸羧化酶的增强，及乙酸形成的弱化。

已经发现在yibD基因或开放读框(ORF)或其等位基因过表达后，肠细菌科的微生物改良生产L-氨基酸，特别是L-苏氨酸。

大肠杆菌该基因或开放读框(ORF)的核苷酸序列属于现有技术范畴，也可取自Blattner等公布的大肠杆菌基因组序列(Science 277：1453-1462(1997))。己知N末端氨基酸甲硫氨酸可以通过宿主特异性酶(甲硫氨酸氨基肽酶)而裂解掉。

同样从也属于肠细菌科的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)中已知yibD ORF的核苷酸序列。

大肠杆菌K12的yibD ORF通过如下数据描述：

名称：开放读框

功能：推定的糖基转移酶

描述：yibD开放读框编码40.5kDa蛋白质；等电点为9.4；yibDORF位于染色体上，例如在大肠杆菌K12 MG1655的情况中位于编码假想蛋白的yibQ开放读框与编码苏氨酸脱氢酶的tdh基因的基因间区域。

参考文献：Blattner et al.，Science 277(5331)，1453-1474(1997)

登录号：AE000439

另一种基因名称：b3615

核苷酸序列可取自国立医学图书馆(National Library ofMedicine)的国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI))))(Bethesda，MD，USA)的数据库；欧洲分子生物学实验室的核苷酸序列数据库(EMBL，Heidelberg，Germany或Cambridge，UK)或者日本的DNA数据库(DDBJ，Mishima，Japan)。

为了更加清楚，大肠杆菌yibD ORF的已知序列示于SEQ IDNo：3，鼠伤寒沙门氏菌的yibD ORF的已知序列示于SEQ ID No：5。由这些读框编码的蛋白质示于SEQ ID No：4和SEQ ID No：6。

根据本发明可以使用所引用的参考文献中描述的开放读框。也可以使用得自遗传密码的简并性或者中性有义突变的基因或者开放读框的等位基因。优选使用内源基因或者内源开放读框。

术语“内源基因”或者“内源核苷酸序列”是指一个物种群中存在的基因、开放读框或等位基因或核苷酸序列。

含有中性有义突变的yibD ORF的等位基因包括导致其编码的蛋白质中有至多40个、至多30个、或者至多20个、优选至多10或至多5个、特别优选至多3个、或者至多2个或者至少1个保守氨基酸置换。

在芳香族氨基酸的情况中，保守置换是指苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸的彼此互换。在疏水性氨基酸的情况中，保守置换是指亮氨酸，异亮氨酸和缬氨酸的彼此互换。在极性氨基酸的情况中，保守置换是指谷氨酰胺和天冬酰胺的彼此互换。在碱性氨基酸的情况中，保守置换是指精氨酸，赖氨酸和组氨酸的彼此互换。在酸性氨基酸的情况中，保守置换是指天冬氨酸和谷氨酸的彼此互换。在含有羟基的氨基酸的情况中，保守置换是指丝氨酸和苏氨酸的彼此互换。

同样，可以使用编码所述蛋白质变体的核苷酸序列，其另外在N或C末端延长或缩短至少1个氨基酸。这种延长或缩短不超过50，40，30，20，10，5，3或2个氨基酸或者氨基酸残基。

合适的等位基因还包括编码其中插入或缺失至少一个氨基酸的的蛋白质的那些基因。这种称作indels的改变的最大数目可涉及2，3，5，10或20个氨基酸，但不超过30个氨基酸。

合适的等位基因还包括通过杂交，特别是在严格条件下，使用SEQ ID No：3或SEQ ID No：5或其一部分，特别是编码区或与其互补的序列可获得的那些基因。

通过杂交鉴别DNA序列的指导可见于Boehringer MannheimGmbH(Mannheim，Germany，1993)的“The DIG System User’sGuide for Filter Hybridization”及Liebl等(International Journal ofSystematic Bacteriology 41：255-260(1991))所述。杂交在严格条件下发生，也就是说只有其中探针和靶序列(即用探针处理的多核苷酸)是至少80％相同的杂交体形成。已知杂交的严格性，包括洗涤步骤，可通过改变缓冲液成分、温度和盐浓度而影响或决定。杂交反应通常在与洗涤步骤相比相对低的严格条件下进行(HybaidHybridisation Guide，Hybaid Limited，Teddington，UK，1996)。

可以在大约50℃-68℃的温度应用相应于5×SSC缓冲液的缓冲液进行杂交反应。探针也可以和与其序列低于80％相同的多核苷酸杂交。这种杂交体不太稳定，在严格条件下通过洗涤除去。这可以例如通过如下而实现：使盐浓度降低至2×SSC及任选随后为0.5×SSC(The DIG System User′s Guide for Filter Hybridisation，Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany，1995)，温度设为大约50℃-68℃，大约52℃-68℃，大约54℃-68℃，大约56℃-68℃，大约58℃-68℃，大约60℃-68℃，大约62℃-68℃，大约64℃-68℃，或大约66℃-68℃。优选大约64℃-68℃或者大约66℃-68℃的温度范围。任选可以使盐浓度降低至相应于0.2×SSC或0.1×SSC的值。通过使杂交温度从50℃逐步(每步大约1-2℃)升高至68℃，可以分离与所应用的探针的序列或者与SEQ ID No：3或SEQID No：5所示核苷酸序列例如至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％相同的多核苷酸片段。关于杂交的进一步指导可以试剂盒形式商购(例如DIG Easy Hyb，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，Catalogue No.1603558)。

例如可以通过增加基因、开放读框或等位基因的表达或者增强蛋白质的催化性质而实现增强。可任选组合这两种措施。

过表达可以例如通过增加适当基因或开放读框的拷贝数或者突变结构基因上游的启动子和调节区或者核糖体接合位点而实现。掺入结构基因上游的表达盒以同样方式发挥作用。诱导型启动子另外可以在经发酵生产L-苏氨酸期间增加表达；使用用于基因表达的启动子可以造成另外的暂时基因表达，这也是有利的。延长mRNA寿命的措施也改良表达。另外，酶活性也通过防止酶蛋白的降解而增强。所述ORF、基因或基因构建体可以存在于不同拷贝数目的质粒中，或者可以整合进染色体中并扩增。或者，所述基因的过表达也可以通过改变培养基的成分和培养技术而实现。

过表达的方法在现有技术领域中充分描述，例如由Makrides etal.(Microbiological Reviews 60(3)，512-538(1996))所描述。使用载体增加拷贝数至少1个。质粒例如US 5,538,873所述那些质粒可以用作载体。噬菌体，例如EP 0332448所述的噬菌体mu或者噬菌体lambda(λ)也可以用作载体。拷贝数的增加也可以通过在染色体的另外位点掺入另外的拷贝而实现，例如掺入噬菌体λ的att位点中(Yuand Court，Gene 223，77-81(1998))。US 5,939,307描述了通过掺入表达盒或者启动子，例如将tac启动子、trp启动子、lpp启动子或者噬菌体λ的P_L启动子和P_R-启动子掺入例如染色体苏氨酸操纵子的上游来增加表达。噬菌体T7的启动子，gearbox启动子或者nar启动子可以同样方式使用。这种表达盒或启动子也可以用于过表达质粒结合的基因，如EP 0 593 792所述。通过使用lacI^Q等位基因也可对质粒结合的基因的表达加以控制(Glascock and Weickert，Gene 223，221-231(1998))。另外，启动子的活性可以通过插入和/或缺失而置换一或多个核苷酸，从而修饰其序列而增加。另外的暂时基因表达可以例如Walker et al.(Journal of Bacteriology 181：1269-80(1999))所述，通过使用生长期依赖性fis启动子而实现。

本领域技术人员可在一下文献中发现相关的全面指导：Changand Cohen(Journal of Bacteriology 134：1141-1156(1978))，Hartleyand Gregori(Gene 13：347-353(1981))，Amann and Brosius(Gene 40：183-190(1985))，de Broer et al.(Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America 80：21-25(1983))，LaVallieet al.(BIO/TECHNOLOGY 11：187-193(1993))，PCT/US97/13359，Llosa et al.(Plasmid 26：222-224(1991))，Quandt and Klipp(Gene 80：161-169(1989))，Hamilton et al.(Journal of Bacteriology 171：4617-4622(1989))，Jensen and Hammer(Biotechnology and Bioengineering58：191-195(1998))和已知的遗传学和分子生物学教科书。

可以使用在肠细菌中可复制的质粒载体，例如衍生自pACYC184(Bartoloméet al.；Gene 102：75-78(1991))，pTrc99A(Amann et al.；Gene 69：301-315(1988))的克隆载体或者pSC101衍生物(Vocke and Bastia；Proceedings of the National Academy ofSciences USA 80(21)：6557-6561(1983))。在本发明的方法中可以使用用质粒载体转化的菌株，所述质粒载体携带编码yibD ORF或其基因产物或等位基因的至少一个核苷酸序列。

术语“转化”是指分离的核酸被宿主(微生物)摄取。

也可以通过序列置换(Hamilton et al.；Journal of Bacteriology171：4617-4622(1989))、接合或转导，将影响适当基因或开放读框表达的突变转移至不同菌株中。

关于遗传学和分子生物学概念的更详细的解释见于熟知的遗传学和分子生物学教科书，例如Birge(Bacterial and BacteriophageGenetics，4th ed.，Springer Verlag，New York(USA)，2000)或者Berg，Tymoczko and Stryer(Biochemistry，5th ed.，Freeman andCompany，New York(USA)，2002)或者Sambrook et al.(MolecularCloning，A Laboratory Manual，(3 volume set)，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor(USA)，2001)。

另外，对于使用肠细菌科的菌株生产L-氨基酸，特别是L-苏氨酸，有益的是不但增强yibD开放读框，而且增强已知苏氨酸生物合成途径的一或多种酶或者添补代谢的酶或者生产还原的烟碱腺嘌呤二核苷酸磷酸的酶或者糖酵解酶或者PTS酶或者硫代谢的酶。一般优选使用内源基因。

因此，例如可以同时增强或者特别是过表达选自如下的一或多个基因：

●编码天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶的thrABC操纵子的至少一个基因(US-A-4,278,765)，

●谷氨酸棒杆菌的pyc基因，其编码丙酮酸羧化酶(WO 99/18228)，

●pps基因，其编码磷酸烯醇丙酮酸合酶(Molecular and GeneralGenetics 231(2)：332-336(1992))，

●ppc基因，其编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(WO 02/064808)，

●pntA和pntB基因，其编码转氢酶的亚基(European Journal ofBiochemistry 158：647-653(1986))，

●rhtB基因，其编码赋予高丝氨酸抗性的蛋白质(EP-A-0 994 190)，

●rhtC基因，其编码赋予苏氨酸抗性的蛋白质(EP-A-1 013 765)，

●谷氨酸棒杆菌的thrE基因，其编码苏氨酸输出载体蛋白(WO01/92545)，

●gdhA基因，其编码谷氨酸脱氢酶(Nucleic Acids Research 11：5257-5266(1983)；Gene 23：199-209(1983))，

●pgm基因，其编码葡糖磷酸变位酶(WO 03/004598)，

●fba基因，其编码果糖二磷酸醛缩酶(WO 03/004664)，

●ptsHIcrr操纵子的ptsH基因，其编码磷酸转移酶系统PTS的磷酸组氨酸蛋白己糖磷酸转移酶(WO 03/004674)，

●ptsHIcrr操纵子的ptsI基因，其编码磷酸转移酶系统PTS的酶I(WO03/004674)，

●ptsHIcrr操纵子的crr基因，其编码磷酸转移酶系统PTS的葡萄糖特异性IIA成分(WO 03/004674)，

●ptsG基因，其编码葡萄糖特异性IIBC成分(WO 03/004670)，

●lrp基因，其编码亮氨酸调节子的调节物(WO 03/004665)，

●fadR基因，其编码fad调节子的调节物(WO 03/038106)，

●iclR基因，其编码主要中间代谢(central intermediarymetabolism)的调节物(WO 03/038106)，

●ahpCF操纵子的ahpC基因，其编码烷基过氧化氢还原酶的小亚基(WO 03/004663)，

●ahpCF操纵子的ahpF基因，其编码烷基过氧化氢还原酶的大亚基(WO 03/004663)，

●cysK基因，其编码半胱氨酸合酶A(WO 03/006666)，

●cysB基因，其编码cys调节子的调节物(WO 03/006666)，

●cysJIH操纵子的cysJ基因，其编码NADPH亚硫酸还原酶的黄素蛋白(WO 03/006666)，

●cysJIH操纵子的cysI基因，其编码NADPH亚硫酸还原酶的血蛋白(WO 03/006666)，

●cysJIH操纵子的cysH基因，其编码腺苷酰硫酸还原酶(WO03/006666)，

●rseABC操纵子的rseA基因，其编码具有抗sigmaE活性的膜蛋白(WO 03/008612)，

●rseABC操纵子的rseC基因，其编码sigmaE因子的全局调节物(global regulator)(WO 03/008612)，

●sucABCD操纵子的sucA基因，其编码2-酮戊二酸脱氢酶的脱羧酶亚基(WO 03/008614)，

●sucABCD操纵子的sucB基因，其编码2-酮戊二酸脱氢酶的二氢硫辛酸转琥珀酸酶(dihydrolipoyl transsuccinase)E2亚基(WO03/008614)，

●sucABCD操纵子的sucC基因，其编码琥珀酰-CoA合成酶的β-亚基(WO 03/008615)，

●sucABCD操纵子的sucD基因，其编码琥珀酰-CoA合成酶的α-亚基(WO 03/008615)，

●aceE基因，其编码丙酮酸脱氢酶复合物的El成分(WO03/076635)，

●aceF基因，其编码丙酮酸脱氢酶复合物的E2成分(WO03/076635)，

●rseB基因，其编码sigmaE因子活性的调节物(MolecularMicrobiology 24(2)：355-371(1997))，

●大肠杆菌的开放读框(ORF)yodA的基因产物(Accession NumberAE000288，国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)，DE10361192.4)，

●大肠杆菌的开放读框(ORF)yaaU的基因产物(Accession NumberAE005181，国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)，DE10361268.8)，

●malT基因，其编码麦芽糖调节子的阳性转录激活物(Gene 42：201-208(1986)，及

●eno基因，其编码烯醇化酶(The Journal of Biological Chemistry246(22)，6797-6802(1971))。

对于L-氨基酸、特别是L-苏氨酸的生产，有益的是不但增强yibD开放读框，而且弱化、特别是消除选自如下的一或多个基因或降低其表达：

●tdh基因，其编码苏氨酸脱氢酶(Journal of Bacteriology 169：4716-4721(1987))，

●mdh基因，其编码苹果酸脱氢酶(E.C.1.1.1.37)(Archives inMicrobiology 149：36-42(1987))，

●大肠杆菌的开放读框(orf)yjfA的基因产物(Accession NumberAAC77180，国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)，WO 02/29080))，

●大肠杆菌的开放读框(orf)ytfP的基因产物(Accession NumberAAC77179，国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)，WO 02/29080))，

●pckA基因，其编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(carboxykinase)(WO02/29080)，

●poxB基因，其编码丙酮酸氧化酶(WO 02/36797)，

●dgsA基因，其编码磷酸转移酶系统的DgsA调节物(WO02/081721)，也称作mlc基因，

●fruR基因，其编码果糖阻抑物(WO 02/081698)，也称作cra基因，

●rpoS基因，其编码sigma³⁸因子(WO 01/05939)，也称作katF基因，及

●aspA基因，其编码天冬氨酸铵裂合酶(WO 03/008603)。

文中术语“弱化”是指降低或消除(switching-off)微生物中由适当的DNA编码的一或多种酶/蛋白质的胞内活性或浓度，例如通过使用比在适当酶/蛋白质未重组的微生物或亲代菌株中弱的启动子、或者编码具有低活性的适当酶/蛋白质的基因或等位基因、或者使适当的酶/蛋白质、开放读框或者基因失活及任选组合这些措施进行。

弱化措施通常降低适当蛋白质的活性或浓度至野生型蛋白质或者适当酶/蛋白质未重组的微生物或亲代菌株中所述蛋白质的活性或浓度的0-75％，0-50％，0-25％，0-10％或者0-5％。未重组的微生物或亲代菌株是指对其进行本发明措施的微生物。

弱化例如可以通过降低或消除基因或开放读框的表达或者酶蛋白的催化性质而实现。可任选组合这两种措施。

可通过合适的培养技术，通过遗传修饰(突变)基因表达的信号结构或者也可以通过反义RNA技术降低基因表达。基因表达的信号结构是例如阻抑物基因、激活物基因、操纵基因(operator)、启动子、弱化子、核糖体结合位点、起始密码子和终止子。本领域技术人员例如可从以下文献中发现相关信息：Jensen and Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58：191-195(1998))，Carrier andKeasling(Biotechnology Progress 15：58-64(1999))，Franch andGerdes(Current Opinion in Microbiology 3：159-164(2000))及已知的遗传学和分子生物学教科书，例如Knippers(″Molekulare Genetik″，6th edition，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)或者Winnacker(From Genes to Clones，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)的教科书。

本领域已知导致酶蛋白催化性质修饰或降低的突变。可提及的例子是Qiu and Goodman(Journal of Biological Chemistry 272：8611-8617(1997))，Yano et al.(Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 95：5511-5515(1998))和Wenteand Schachmann(Journal of Biological Chemistry 266：20833-20839(1991))的文章。概括描述可见于已知的遗传学和分子生物学教科书，例如Hagemann(″Allgemeine Genetik″，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)的教科书。

可能的突变是转换、颠换、插入和缺失至少1个碱基对/核苷酸。根据突变所致氨基酸置换对酶活性的作用，使用术语“错义突变”或“无义突变”。错义突变导致蛋白质中给定的氨基酸置换为另一个氨基酸，所述氨基酸置换特别是非保守的。这损害了蛋白质的功能性或活性，将其降低至0-75％，0-50％，0-25％，0-10％或者0-5％。无义突变在基因的编码区中导致终止密码子并因此导致翻译过早终止。在基因中插入或缺失至少一个碱基对导致移码突变，这样导致掺入不正确的氨基酸或者翻译过早终止。如果终止密码子由于突变的结果在编码区内形成，这样也导致翻译的过早终止。至少一或多个密码子的缺失典型地也导致酶活性的完全丧失。

关于产生这种突变的指导为本领域所己知，可见于已知的遗传学和分子生物学教科书，例如Knippers(″Molekulare Genetik″，6thedition，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)；Winnacker(From Genes to Clones，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)或者Hagemann(″Allgemeine Genetik″，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。

基因中合适的突变可以通过基因或等位基因置换而掺入合适的菌株中。

常用的方法是借助于条件性复制pSC 101衍生物pMAK705的基因置换，如Hamilton等所述(Journal of Bacteriology 171，4617-4622(1989))。也可以同样使用本领域描述的其它方法，例如Martinez-Morales等(Journal of Bacteriology 181，7143-7148(1999))或Boyd等(Journal of Bacteriology 182，842-847(2000))。

也可以通过接合或者转导将特定基因中的突变或者影响特定基因或开放读框表达的突变移至不同菌株中。

不但增强yibD开放读框而且消除非所需的副反应对于L-氨基酸、特别是L-苏氨酸的生产是有益的(Nakayama：″Breeding of AminoAcid Producing Microorganisms″，in：Overproduction of MicrobialProducts，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(eds.)，Academic Press，London，UK，1982)。

根据本发明产生的微生物可通过分批法，补料分批法或重复补料分批法或者连续方法(DE102004028859.3或者US5,763,230)培养。已知的培养方法见Chmiel(Bioprozesstechnik 1.Einführung in dieBioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或者Storhas(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))的教科书中所述。

所用培养基必须以适当地符合特定菌株的要求。关于不同微生物的培养基的阐述见于美国细菌学会的“Manual of Methods forGeneral Bacteriology”(Washington D.C.，USA，1981)。

可使用的碳源是糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和任选纤维素，油和脂肪，如大豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸，如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇，如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸。这些物质可单独或混合使用。

可使用的氮源是有机氮化合物，如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽汁，玉米浸液(corn steep liquor)，大豆粉和尿素，或无机化合物，如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或混合使用。

可使用的磷源是磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应钠盐。培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素。此外，可将适当前体加入培养基中。可以一次向培养基中添加所有所述补料物质或在培养期间适当补加。

发酵通常在pH5.5-9.0进行，特别是在pH6.0-8.0进行。可以适当使用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸控制培养物的pH值。抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫产生。加入适当的选择性作用物质例如抗生素至培养基中可保持质粒的稳定性。将氧气或含氧混合气，例如空气充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在25℃～45℃，优选30℃-40℃。持续培养直至L-氨基酸或L-苏氨酸的形成达到最大量。此目的通常在10～160小时范围内达到。

L-氨基酸可以通过阴离子交换层析随后茚三酮衍生化作用进行分析，如Spackman等(Analytical Chemistry，30，1190-1206，(1958))所述，或者可以通过反相HPLC进行，如Lindroth等(AnalyticalChemistry 51：1167-1174(1979))所述。

本发明的方法用于经发酵生产L-氨基酸，例如L-苏氨酸，L-异亮氨酸，L-缬氨酸，L-甲硫氨酸，L-高丝氨酸，L-色氨酸和L-赖氨酸，特别是L-苏氨酸。

如下微生物根据布达佩斯条约保藏在德国微生物保藏中心(DSMZ，Braunswick，Germany)：

●大肠杆菌菌株E.coli MG442，保藏号DSM 16574。

本发明借助于如下实施例得以更详细地说明。

用于大肠杆菌的基本培养基(M9)和完全培养基(LB)由J.H.Miller(A Short Course in Bacterial Genetics(1992)，Cold Spring HarborLaboratory Press)描述。从大肠杆菌中分离质粒DNA及所有限制、连接、Klenow处理和碱性磷酸酶处理技术均根据Sambrook等(Molecular Cloning-A Laboratory Manual(1989)，Cold Spring HarborLaboratory Press)所述方法进行。除非特别说明，则大肠杆菌的转化通过Chung等(Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 86：2172-2175(1989))所述方法进行。

菌株制备和转化的保温温度为37℃。

实施例1：

表达质粒pTrc99AyibD的构建

将大肠杆菌K12的yibD基因使用聚合酶链反应(PCR)和合成的寡核苷酸扩增。大肠杆菌K12 MG1655(登录号AE000439，Blattner etal.(Science 277：1453-1474(1997))的yibD ORF的核苷酸序列作为起始物质合成PCR引物(MWG Biotech，Ebersberg，Germany)。对引物的序列加以修饰以提供限制酶的识别位点。对于yibD-ex1引物选择SacI识别序列，对于yibD-ex2引物选择HindIII识别序列，所述序列在下列核苷酸序列中以下划线标示：

yibD-ex1：

5′-GATCTA GAGCTCGTCAGGATAACTTCAGAGG-3′(SEQ ID No.1)

yibD-ex2：

5′-GATCT AAGCTTAGCCCGAAGCGGCGAAGTTTA-3′(SEQ ID No.2)

用于PCR的大肠杆菌K12 MG1655的染色体DNA使用QiagenGenomic-tips 100/G(QIAGEN，Hilden，Germany)根据厂商指导进行分离。使用特异性引物在标准PCR条件(Innis et al.(1990)PCRProtocols.A Guide to Methods and Applications，Academic Press)下使用Vent DNA聚合酶(New England BioLabs GmbH，Frankfurt，Germany)可以扩增大约为1114bp的DNA片段(SEQ ID No：3)。

将扩增的yibD片段与载体pCR-Blunt II-TOPO(Zero TOPO TACloning Kit，Invitrogen，Groningen，The Netherlands)根据厂商指导进行连接，并转化进大肠杆菌菌株TOP10中。在补加50μg/ml卡那霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。在分离质粒DNA之后，将该载体在用酶PvuI和HindIII/SacI切割后，在0.8％琼脂糖凝胶中检测，称作pCRBluntyibD。

然后将载体pCRBluntyibD用酶HindIII和SacI切割，在0.8％琼脂糖中分离后，从凝胶中分离(QIAquick Gel Extraction Kit，QIAGEN，Hilden，Germany)yibD片段并与已经用酶HindIII和SacI消化的载体pTrc99A(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)连接。将大肠杆菌菌株XL1Blue MRF′(Stratagene，La Jolla，USA)用该连接混合物转化，并在补加50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。

在通过用酶PvuI对照切割，分离质粒DNA之后，可表明成功克隆。

该质粒称作pTrc99AyibD(图1)。

实施例2：

用菌株MG442/pTrc99AyibD制备L-苏氨酸

生产L-苏氨酸的大肠杆菌菌株MG442在专利US-A-4,278,765中描述，根据布达佩斯条约以保藏号CMIM B-1628保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM，俄罗斯莫斯科)及以保藏号DSM 16574保藏在德国微生物保藏中心(DSMZ，Brunswick，Germany)。

将菌株MG442用实施例1所述的表达质粒pTrc99AyibD和载体pTrc99A转化，在补加50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。这个程序产生了菌株MG442/pTrc99AyibD和MG442/pTrc99A。然后在具有如下成分的基本培养基上增殖选择的各个菌落：3.5g/l Na₂HPO₄·2H₂O，1.5g/l KH₂PO₄，1g/l NH₄Cl，0.1g/l MgSO₄·7H₂O，2g/l葡萄糖，20g/l琼脂，50mg/l氨苄青霉素。在于100ml锥形瓶中10ml分批培养物中检测L-苏氨酸的形成。为此，接种含有如下成分的10ml预培养培养基：2g/l酵母提取物，10g/l(NH₄)₂SO₄，1g/l KH₂PO₄，0.5g/l MgSO₄·7H₂O，15g/l CaCO₃，20g/l葡萄糖，50mg/l氨苄青霉素，并在37℃以180rpm在KühnerAG(Birsfelden，Switzerland)的ESR培养箱中保温16小时。将这些预培养物250μl移至10ml生产培养基中(25g/l(NH₄)₂SO₄，2g/lKH₂PO₄，1g/l MgSO₄·7H₂O，0.03g/l FeSO₄·7H₂O，0.018g/lMnSO₄·1H₂O，30g/l CaCO₃，20g/l葡萄糖，50mg/l氨苄青霉素)，在37℃保温48小时。以相同方式研究原始菌株MG442中L-苏氨酸的形成，但是培养基中不加入氨苄青霉素。在保温后，培养悬浮液的光密度(OD)使用Dr.Lange(Düsseldorf，Germany)的LP2W光度计在660nm测定波长测定。

然后在灭菌过滤的培养上清中使用Eppendorf-BioTronik(Hamburg，Germany)氨基酸分析仪经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定形成的L-苏氨酸的浓度。

实验结果示于表1。

表1

菌株	OD(660nm)	L-苏氨酸g/l
菌株	OD(660nm)	L-苏氨酸g/l	MG442	5.6	1.4
MG442/pTrc99A	3	1.3	MG442	5.6	1.4
MG442/pTrc99A	3	1.3	MG442/pTrc99AyibD	4.6	3.0

附图简述：

图1：含有yibD ORF的质粒pTrc99AyibD图谱。

长度数据是大约值。所用缩写和名称具有如下含义：

●bla：编码氨苄青霉素抗性的基因

●lac Iq：trc启动子的阻抑蛋白基因

●trc：trc启动子区域，IPTG-诱导型

●yibD：yibD基因的编码区

●5S：5S rRNA区域

●rrnBT：rRNA终止子区域

限制酶的缩写具有如下含义：

●PvuI：来自普通变形菌(Proteus vulgaris)的限制性核酸内切酶

序列表

<110>德古萨股份公司

<120>使用肠细菌科菌株制备L-氨基酸的方法

<130>030375 BT

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>31

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<221>Primer

<222>(1)..(31)

<223>yibD-exl

<400>1

gatctagagc tcgtcaggat aacttcagag g 31

<210>2

<211>32

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<221>Primer

<222>(1)..(32)

<223>yibD-ex2

<400>2

gatctaagct tagcccgaag cggcgaagtt ta 32

<210>3

<211>1114

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<220>

<221>PCR product

<222>(1)..(1114)

<223>yibD PCR product

<220>

<221>CDS

<222>(45)..(1079)

<223>yibD coding region

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(31)

<223>Primer yibD-exl

<220>

<221>primer_bind

<222>(1083)..(1114)

<223>Primer yibD-ex2

<400>3

gatctagagc tcgtcaggat aacttcagag gtcgtcggta attt atg atg aac agc 56

Met Met Asn Ser

1

acc aat aaa ctt agt gtt att att ccg tta tat aat gcg ggc gat gat 104

Thr Asn Lys Leu Ser Val Ile Ile Pro Leu Tyr Asn Ala Gly Asp Asp

5 10 15 20

ttc cgc act tgt atg gaa tct tta att acg caa acc tgg act gct ctg 152

Phe Arg Thr Cys Met Glu Ser Leu Ile Thr Gln Thr Trp Thr Ala Leu

25 30 35

gaa atc att att att aac gat ggt tca acg gat aat tct gtt gaa ata 200

Glu Ile Ile Ile Ile Asn Asp Gly Ser Thr Asp Asn Ser Val Glu Ile

40 45 50

gca aag tat tac gca gaa aac tat ccg cac gtt cgt ttg ttg cat cag 248

Ala Lys Tyr Tyr Ala Glu Asn Tyr Pro His Val Arg Leu Leu His Gln

55 60 65

gcg aat gct ggc gca tcg gtg gcg cgt aat cgt ggg att gaa gtg gca 296

Ala Asn Ala Gly Ala Ser Val Ala Arg Asn Arg Gly Ile Glu Val Ala

70 75 80

acg ggc aaa tat gtc gct ttt gtc gat gct gac gat gaa gtc tat ccc 344

Thr Gly Lys Tyr Val Ala Phe Val Asp Ala Asp Asp Glu Val Tyr Pro

85 90 95 100

acc atg tac gaa acg ctg atg acc atg gcg tta gag gac gac ctc gac 392

Thr Met Tyr Glu Thr Leu Met Thr Met Ala Leu Glu Asp Asp Leu Asp

105 110 115

gtg gcg cag tgc aac gct gac tgg tgt ttt cgt gaa acg gga gaa acc 440

Val Ala Gln Cys Asn Ala Asp Trp Cys Phe Arg Glu Thr Gly Glu Thr

120 125 130

tgg caa tcc atc ccc acc gat cgc ctt cgc tca acc ggc gta tta acc 488

Trp Gln Ser Ile Pro Thr Asp Arg Leu Arg Ser Thr Gly Val Leu Thr

135 140 145

ggc ccg gac tgg ctg cgg atg ggg ctt tct tcg cgc cgt tgg act cac 536

Gly Pro Asp Trp Leu Arg Met Gly Leu Ser Ser Arg Arg Trp Thr His

150 155 160

gtt gtc tgg atg ggg gtt tat cgc cgt gat gtt att gtt aaa aat aac 584

Val Val Trp Met Gly Val Tyr Arg Arg Asp Val Ile Val Lys Asn Asn

165 170 175 180

att aaa ttt att gcc gga tta cat cat cag gat att gtc tgg aca aca 632

Ile Lys Phe Ile Ala Gly Leu His His Gln Asp Ile Val Trp Thr Thr

185 190 195

gaa ttc atg ttt aac gcg ctg cgt gcg cga tat acc gag caa tca tta 680

Glu Phe Met Phe Asn Ala Leu Arg Ala Arg Tyr Thr Glu Gln Ser Leu

200 205 210

tat aaa tat tat ctg cat aat acg tca gtg agt cgg ttg cat aga caa 728

Tyr Lys Tyr Tyr Leu His Asn Thr Ser Val Ser Arg Leu His Arg Gln

215 220 225

ggg aat aaa aac ctt aat tat caa cgt cac tat att aag att acc cgc 776

Gly Asn Lys Asn Leu Asn Tyr Gln Arg His Tyr Ile Lys Ile Thr Arg

230 235 240

ctg ctg gag aaa tta aat cga aat tat gcc gac aaa att atg att tat 824

Leu Leu Glu Lys Leu Asn Arg Asn Tyr Ala Asp Lys Ile Met Ile Tyr

245 250 255 260

ccg gaa ttt cat cag caa ata act tac gag gca ttg cgt gtt tgc cat 872

Pro Glu Phe His Gln Gln Ile Thr Tyr Glu Ala Leu Arg Val Cys His

265 270 275

gcg gtg cgc aaa gag ccg gat att ctt acc cgc caa cgg atg att gcc 920

Ala Val Arg Lys Glu Pro Asp Ile Leu Thr Arg Gln Arg Met Ile Ala

280 285 290

gag ata ttt act tcc ggt atg tat aag cgc ctg att acc aat gtg cgc 968

Glu Ile Phe Thr Ser Gly Met Tyr Lys Arg Leu Ile Thr Asn Val Arg

295 300 305

agc gtg aag gtc ggt tac cag gcg tta ctg tgg tct ttc cgc tta tgg 1016

Ser Val Lys Val Gly Tyr Gln Ala Leu Leu Trp Ser Phe Arg Leu Trp

310 315 320

caa tgg cgc gac aaa acg cgg tcg cac cat cgc att acg cgt agc gcc 1064

Gln Trp Arg Asp Lys Thr Arg Ser His His Arg Ile Thr Arg Ser Ala

325 330 335 340

ttt aat ttg cgc tag cgttaaactt cgccgcttcg ggctaagctt agatc 1114

Phe Asn Leu Arg

<210>4

<211>344

<212>PRT

<213>Escherichia coli

<400>4

Met Met Asn Ser Thr Asn Lys Leu Ser Val Ile Ile Pro Leu Tyr Asn

1 5 10 15

Ala Gly Asp Asp Phe Arg Thr Cys Met Glu Ser Leu Ile Thr Gln Thr

20 25 30

Trp Thr Ala Leu Glu Ile Ile Ile Ile Asn Asp Gly Ser Thr Asp Asn

35 40 45

Ser Val Glu Ile Ala Lys Tyr Tyr Ala Glu Asn Tyr Pro His Val Arg

50 55 60

Leu Leu His Gln Ala Asn Ala Gly Ala Ser Val Ala Arg Asn Arg Gly

65 70 75 80

Ile Glu Val Ala Thr Gly Lys Tyr Val Ala Phe Val Asp Ala Asp Asp

85 90 95

Glu Val Tyr Pro Thr Met Tyr Glu Thr Leu Met Thr Met Ala Leu Glu

100 105 110

Asp Asp Leu Asp Val Ala Gln Cys Asn Ala Asp Trp Cys Phe Arg Glu

115 120 125

Thr Gly Glu Thr Trp Gln Ser Ile Pro Thr Asp Arg Leu Arg Ser Thr

130 135 140

Gly Val Leu Thr Gly Pro Asp Trp Leu Arg Met Gly Leu Ser Ser Arg

145 150 155 160

Arg Trp Thr His Val Val Trp Met Gly Val Tyr Arg Arg Asp Val Ile

165 170 175

Val Lys Asn Asn Ile Lys Phe Ile Ala Gly Leu His His Gln Asp Ile

180 185 190

Val Trp Thr Thr Glu Phe Met Phe Asn Ala Leu Arg Ala Arg Tyr Thr

195 200 205

Glu Gln Ser Leu Tyr Lys Tyr Tyr Leu His Asn Thr Ser Val Ser Arg

210 215 220

Leu His Arg Gln Gly Asn Lys Asn Leu Asn Tyr Gln Arg His Tyr Ile

225 230 235 240

Lys Ile Thr Arg Leu Leu Glu Lys Leu Asn Arg Asn Tyr Ala Asp Lys

245 250 255

Ile Met Ile Tyr Pro Glu Phe His Gln Gln Ile Thr Tyr Glu Ala Leu

260 265 270

Arg Val Cys His Ala Val Arg Lys Glu Pro Asp Ile Leu Thr Arg Gln

275 280 285

Arg Met Ile Ala Glu Ile Phe Thr Ser Gly Met Tyr Lys Arg Leu Ile

290 295 300

Thr Asn Val Arg Ser Val Lys Val Gly Tyr Gln Ala Leu Leu Trp Ser

305 310 315 320

Phe Arg Leu Trp Gln Trp Arg Asp Lys Thr Arg Ser His His Arg Ile

325 330 335

Thr Arg Ser Ala Phe Asn Leu Arg

340

<210>5

<211>1035

<212>DNA

<213>Salmonella typhimurium

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1035)

<223>yibD-Orf

<400>5

atg aaa aat agt aaa acc aaa gtg agt atc att gtc ccg tta tat aat 48

Met Lys Asn Ser Lys Thr Lys Val Ser Ile Ile Val Pro Leu Tyr Asn

1 5 10 15

gcg gga gcg gat ttt aat gct tgc atg gcg tcg tta atc gcg caa acg 96

Ala Gly Ala Asp Phe Asn Ala Cys Met Ala Ser Leu Ile Ala Gln Thr

20 25 30

tgg tcg gcg ctg gaa att att att gtg aat gat gga tcg acg gat cat 144

Trp Ser Ala Leu Glu Ile Ile Ile Val Asn Asp Gly Ser Thr Asp His

35 40 45

tcc gtt gag ata gca aaa cat tac gcg gaa cat tac cca cat gtt cga 192

Ser Val Glu Ile Ala Lys His Tyr Ala Glu His Tyr Pro His Val Arg

50 55 60

ctg ctt cat cag gcc aat gct ggc gca tct gtc gcc cgt aat ctt ggc 240

Leu Leu His Gln Ala Asn Ala Gly Ala Ser Val Ala Arg Asn Leu Gly

65 70 75 80

ctg caa gcg gcg acc ggc gat tat gtc gcc ttt gtc gat gcg gat gac 288

Leu Gln Ala Ala Thr Gly Asp Tyr Val Ala Phe Val Asp Ala Asp Asp

85 90 95

cag gtc tac ccg aag atg tat gaa acg ctg atg act atg gcg ctt aac 336

Gln Val Tyr Pro Lys Met Tyr Glu Thr Leu Met Thr Met Ala Leu Asn

100 105 110

gat gat ctg gac gtt gcg cag tgt aat gcg gac tgg tgc gtc cga aaa 384

Asp Asp Leu Asp Val Ala Gln Cys Asn Ala Asp Trp Cys Val Arg Lys

115 120 125

acc ggg cac gcc tgg caa tct att ccg acc gat cgt ctg cgt tcc acc 432

Thr Gly His Ala Trp Gln Ser Ile Pro Thr Asp Arg Leu Arg Ser Thr

130 135 140

ggg gta tta agc gga ccg gat tgg ttg cgt atg gcg ttg gcc tcg cgg 480

Gly Val Leu Ser Gly Pro Asp Trp Leu Arg Met Ala Leu Ala Ser Arg

145 150 155 160

cgc tgg acg cat gtt gtc tgg atg ggc gtt tat cga cgt gcg tta att 528

Arg Trp Thr His Val Val Trp Met Gly Val Tyr Arg Arg Ala Leu Ile

165 170 175

acc gat aac aat att act ttc gtt ccc gga cta cat cat cag gac ata 576

Thr Asp Asn Asn Ile Thr Phe Val Pro Gly Leu His His Gln Asp Ile

180 185 190

tta tgg tcg acg gaa gtt atg ttt aat gcc acg cgc gta cgt tat acc 624

Leu Trp Ser Thr Glu Val Met Phe Asn Ala Thr Arg Val Arg Tyr Thr

195 200 205

gaa caa tca tta tat aaa tat ttc ctg cat gat aat tcg gta agc cgt 672

Glu Gln Ser Leu Tyr Lys Tyr Phe Leu His Asp Asn Ser Val Ser Arg

210 215 220

ttg caa aga caa ggc aat aaa aat ctt aat tat cag cgg cat tat att 720

Leu Gln Arg Gln Gly Asn Lys Asn Leu Asn Tyr Gln Arg His Tyr Ile

225 230 235 240

aaa att acg cga tta tta gaa aag ctc aat cgt gat tat gcc cgt cgt 768

Lys Ile Thr Arg Leu Leu Glu Lys Leu Asn Arg Asp Tyr Ala Arg Arg

245 250 255

att ccg att tac ccg gaa ttt cgc cag caa att acc tgg gaa gcg tta 816

Ile Pro Ile Tyr Pro Glu Phe Arg Gln Gln Ile Thr Trp Glu Ala Leu

260 265 270

cgc gtt tgt cat gcg gta cgt aaa gag cct gat att ttg acc cgc cag 864

Arg Val Cys His Ala Val Arg Lys Glu Pro Asp Ile Leu Thr Arg Gln

275 280 285

cgt atg att gcc gaa att ttt act tct ggc atg tat aga cgg atg atg 912

Arg Met Ile Ala Glu Ile Phe Thr Ser Gly Met Tyr Arg Arg Met Met

290 295 300

gct aac gtc cgc agc gcg aaa gca gct tat cag acg ctg ctc tgg tcc 960

Ala Asn Val Arg Ser Ala Lys Ala Ala Tyr Gln Thr Leu Leu Trp Ser

305 310 315 320

ttc cgg ctg tgg caa tgg cgc gac aaa acc ttg tcg cac cgt cgt atg 1008

Phe Arg Leu Trp Gln Trp Arg Asp Lys Thr Leu Ser His Arg Arg Met

325 330 335

gcc cgt aag gcg ctc aat ctg tct tag 1035

Ala Arg Lys Ala Leu Asn Leu Ser

340

<210>6

<211>344

<212>PRT

<213>Salmonella typhimurium

<400>6

Met Lys Asn Ser Lys Thr Lys Val Ser Ile Ile Val Pro Leu Tyr Asn

1 5 10 15

Ala Gly Ala Asp Phe Asn Ala Cys Met Ala Ser Leu Ile Ala Gln Thr

20 25 30

Trp Ser Ala Leu Glu Ile Ile Ile Val Asn Asp Gly Ser Thr Asp His

35 40 45

Ser Val Glu Ile Ala Lys His Tyr Ala Glu His Tyr Pro His Val Arg

50 55 60

Leu Leu His Gln Ala Asn Ala Gly Ala Ser Val Ala Arg Asn Leu Gly

65 70 75 80

Leu Gln Ala Ala Thr Gly Asp Tyr Val Ala Phe Val Asp Ala Asp Asp

85 90 95

Gln Val Tyr Pro Lys Met Tyr Glu Thr Leu Met Thr Met Ala Leu Asn

100 105 110

Asp Asp Leu Asp Val Ala Gln Cys Asn Ala Asp Trp Cys Val Arg Lys

115 120 125

Thr Gly His Ala Trp Gln Ser Ile Pro Thr Asp Arg Leu Arg Ser Thr

130 135 140

Gly Val Leu Ser Gly Pro Asp Trp Leu Arg Met Ala Leu Ala Ser Arg

145 150 155 160

Arg Trp Thr His Val Val Trp Met Gly Val Tyr Arg Arg Ala Leu Ile

165 170 175

Thr Asp Asn Asn Ile Thr Phe Val Pro Gly Leu His His Gln Asp Ile

180 185 190

Leu Trp Ser Thr Glu Val Met Phe Asn Ala Thr Arg Val Arg Tyr Thr

195 200 205

Glu Gln Ser Leu Tyr Lys Tyr Phe Leu His Asp Asn Ser Val Ser Arg

210 215 220

Leu Gln Arg Gln Gly Asn Lys Asn Leu Asn Tyr Gln Arg His Tyr Ile

225 230 235 240

Lys Ile Thr Arg Leu Leu Glu Lys Leu Asn Arg Asp Tyr Ala Arg Arg

245 250 255

Ile Pro Ile Tyr Pro Glu Phe Arg Gln Gln Ile Thr Trp Glu Ala Leu

260 265 270

Arg Val Cys His Ala Val Arg Lys Glu Pro Asp Ile Leu Thr Arg Gln

275 280 285

Arg Met Ile Ala Glu Ile Phe Thr Ser Gly Met Tyr Arg Arg Met Met

290 295 300

Ala Asn Val Arg Ser Ala Lys Ala Ala Tyr Gly Thr Leu Leu Trp Ser

305 310 315 320

Phe Arg Leu Trp Gln Trp Arg Asp Lys Thr Leu Ser His Arg Arg Met

325 330 335

Ala Arg Lys Ala Leu Asn Leu Ser

340

Claims

1.重组的肠细菌科微生物，其含有增强的或过表达的、称作推定的糖基转移酶的yibD ORF，并以改良的方式生产L-氨基酸。

2.权利要求1的微生物，其中一种多核苷酸被增强，所述多核苷酸编码一种氨基酸序列与选自包括SEQ ID No：4和SEQ ID No：6的组中的氨基酸序列至少90％相同的多肽。

3.权利要求2的微生物，其含有一种过表达的或增强的相应于yibD ORF并选自如下一组的多核苷酸：

a)具有SEQ ID No：3或SEQ ID No：5核苷酸序列的多核苷酸；

c)具有在严格条件下与互补于SEQ ID No：3或SEQ ID No：5的序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸；

d)具有含有中性有义突变的SEQ ID No：3或SEQ ID No：5序列的多核苷酸。

4.权利要求2的微生物，其中所述多肽具有与选自包括SEQ IDNo：4和SEQ ID No：6的组中的序列至少95％相同的氨基酸序列。

5.权利要求2的微生物，其中所述多肽具有与SEQ ID No：4或SEQ ID No：6所示序列100％相同的氨基酸序列。

6.权利要求1-5任一项的微生物，其中它们是用含有yibDORF、这个ORF的等位基因或其部分、和/或启动子的载体通过转化、转导或接合或者组合这些方法产生的。

7.权利要求1-6任一项的微生物，其中yibD ORF或所述等位基因的拷贝数增加至少1个。

8.权利要求7的微生物，其中yibD ORF的拷贝数增加至少1个是通过将ORF或等位基因整合进微生物的染色体中而实现的。

9.权利要求7的微生物，其中yibD ORF的拷贝数增加至少1个是通过染色体外复制载体实现的。

10.权利要求1或2的微生物，其中通过如下方法实现增强：

a)突变yibD ORF上游的启动子和调节区或者核糖体结合位点，或者

b)将表达盒或启动子掺入yibD ORF的上游。

11.权利要求1或2的微生物，其中yibD ORF是在增强该基因表达的启动子的控制下。

12.权利要求1-11任一项的微生物，其中基于针对yibD ORF未重组的微生物或亲代菌株中yibD基因产物的活性或浓度，yibD ORF的增强使该基因产物(蛋白质)的浓度或活性增加至少10％。

13.权利要求1-12任一项的微生物，其中所述微生物选自埃希氏菌属、欧文氏菌属、普罗威登斯菌属和沙雷氏菌属。

14.权利要求13的微生物，其中所需的L-氨基酸生物合成途径的其它基因被另外增强，或特别是过表达。

15.权利要求1-14任一项的微生物，其中所述微生物生产L-苏氨酸。

16.通过发酵肠细菌科的重组微生物制备L-氨基酸的方法，其中：

a)将产生所需的L-氨基酸的微生物在所需的L-氨基酸被富集在培养基或者细胞中的条件下培养，所述微生物中yibD ORF、或者编码其基因产物的核苷酸序列、或等位基因是增强的、或者特别是过表达的；及

b)分离所需的L-氨基酸，发酵肉汤的成分和/或全部或部分生物量(＞0-100％)被保留在分离的产物中或被完全除去。

17.权利要求16的方法，其中应用权利要求1-15任一项的微生物。

18.权利要求16或17的方法，其中为制备L-苏氨酸，发酵其中选自如下的一或多个基因另外被同时增强、或者特别是过表达的肠细菌科微生物：

18.1：编码天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶的thrABC操纵子的至少一个基因；

18.2：谷氨酸棒杆菌的pyc基因，其编码丙酮酸羧化酶；

18.3：pps基因，其编码磷酸烯醇丙酮酸合酶；

18.4：ppc基因，其编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；

18.5：pntA和pntB基因，其编码嘧啶转氢酶亚基；

18.6：rhtB基因，其编码赋予高丝氨酸抗性的蛋白质；

18.7：rhtC基因，其编码赋予苏氨酸抗性的蛋白质；

18.8：谷氨酸棒杆菌的thrE基因，其编码苏氨酸输出载体蛋白；

18.9：gdhA基因，其编码谷氨酸脱氢酶；

18.10：pgm基因，其编码葡糖磷酸变位酶；

18.11：fba基因，其编码果糖二磷酸醛缩酶；

18.12：ptsH基因，其编码磷酸组氨酸蛋白己糖磷酸转移酶；

18.13：ptsI基因，其编码磷酸转移酶系统的酶I；

18.14：crr基因，其编码葡萄糖特异性IIA成分；

18.15：ptsG基因，其编码葡萄糖特异性IIBC成分；

18.16：lrp基因，其编码亮氨酸调节子的调节物；

18.17：fadR基因，其编码fad调节子的调节物；

18.18：iclR基因，其编码主要中间代谢的调节物；

18.19：ahpC基因，其编码烷基过氧化氢还原酶的小亚基；

18.20：ahpF基因，其编码烷基过氧化氢还原酶的大亚基；

18.21：cysK基因，其编码半胱氨酸合酶A；

18.22：cysB基因，其编码cys调节子的调节物；

18.23：cysJ基因，其编码NADPH亚硫酸还原酶的黄素蛋白；

18.24：cysI基因，其编码NADPH亚硫酸还原酶的血蛋白；

18.25：cysH基因，其编码腺苷酰硫酸还原酶；

18.26：rseA基因，其编码具有抗-sigmaE活性的膜蛋白；

18.27：rseC基因，其编码sigmaE因子的全局调节物；

18.28：sucA基因，其编码2-酮戊二酸脱氢酶的脱羧酶亚基；

18.29：sucB基因，其编码2-酮戊二酸脱氢酶的二氢硫辛酸转琥珀酸酶E2亚基；

18.30：sucC基因，其编码琥珀酰-CoA合成酶的β-亚基；

18.31：sucD基因，其编码琥珀酰-CoA合成酶的α-亚基；

18.32：aceE基因，其编码丙酮酸脱氢酶复合物的E1成分；

18.33：aceF基因，其编码丙酮酸脱氢酶复合物的E2成分；

18.34：rseB基因，其编码sigmaE因子活性的调节物；

18.35：大肠杆菌的开放读框(ORF)yodA的基因产物；

18.36：大肠杆菌的开放读框(ORF)yaaU的基因产物；

18.37：malT基因，其编码麦芽糖调节子的阳性转录激活物；和

18.38：eno基因，其编码烯醇化酶。

19.权利要求16-18任一项的方法，其中应用其中降低所需L-氨基酸形成的代谢途径至少被部分弱化的微生物。

20.权利要求19的方法，特征在于为了制备L-苏氨酸，发酵其中选自如下的一或多个基因另外同时被弱化、或者特别是被消除或降低其表达的肠细菌科微生物：

20.1：tdh基因，其编码苏氨酸脱氢酶；

20.2：mdh基因，其编码苹果酸脱氢酶；

20.3：大肠杆菌的开放读框(ORF)yjfA的基因产物；

20.4：大肠杆菌的开放读框(ORF)ytfP的基因产物；

20.5：pckA基因，其编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；

20.6：poxB基因，其编码丙酮酸氧化酶；

20.7：dgsA基因，其编码磷酸转移酶系统的DgsA调节物；

20.8：fruR基因，其编码果糖阻抑物；

20.9：rpoS基因，其编码sigma³⁸因子；及

20.10：aspA基因，其编码天冬氨酸铵裂合酶。

21.权利要求16-20任一项的方法，其中制备的L-氨基酸选自包含L-天冬酰胺、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-高丝氨酸的组中。

22.权利要求21的方法，其中制备的L-氨基酸选自包含L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-高丝氨酸、L-色氨酸和L-赖氨酸的组中。