CN1228445C

CN1228445C - 生产l－氨基酸的细菌及方法

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Publication number: CN1228445C
Application number: CNB991275225A
Authority: CN
Inventors: V·A·利夫希茨; N·P·扎卡塔瓦; 中西一夫; V·V·阿列申; P·V·特罗申; I·L·托克马科瓦
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1998-12-30
Filing date: 1999-12-30
Publication date: 2005-11-23
Anticipated expiration: 2019-12-30
Also published as: US7524656B2; EP1589096A1; DE69942160D1; BR9906287B1; KR20000048465A; CN1332021C; BRPI9917718B8; US20050202543A1; ATE461270T1; ZA997767B; ID24398A; BRPI9917718B1; AU6449399A; BR9906287A; US7399617B1; EP1598416A1; EP1580262B1; CA2291895A1; BR9917719B1; CN1261626A

Abstract

本发明涉及具有产生L-氨基酸能力的埃希氏菌属细菌和使用该细菌生产L-氨基酸的方法，其中所述细菌产生L-氨基酸的能力通过增加L-氨基酸分泌蛋白的表达量得以提高。

Description

生产L-氨基酸的细菌及方法

本发明涉及生产氨基酸的方法。具体而言，本发明涉及属于埃希氏菌属的产L-氨基酸细菌和使用该细菌生产L-氨基酸的方法，更具体而言是生产L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸的方法。

为了通过发酵生产L-氨基酸，使用了分离自自然界的菌株或该菌株的人工突变体来提高产量。例如，在生产L-赖氨酸时，已知有多种产L-赖氨酸的人工突变体，其中大多数是S-2-氨乙基半胱氨酸(AEC)抗性突变体，属于短杆菌属、棒杆菌属、芽孢杆菌属或埃希氏菌属。而且，已提出了一些增加氨基酸产量的途径，如使用通过重组DNA法获得的转化体(美国专利4,278,765)。

这些途径多数基于提高参与氨基酸生物合成途径的酶的活性，使该酶转变成对抑制不敏感等(关于埃希氏菌属细菌，参见日本专利申请公开号56-18596(1981)和国际公开WO 95/16042)。

另一方面，作为通过增加氨基酸分泌蛋白而提高氨基酸产率的例子，已知有一种属于棒杆菌属的细菌，其中L-赖氨酸分泌蛋白基因LysE被增加。然而，对于属于埃希氏菌的细菌，甚至还不知道是否存在L-氨基酸分泌蛋白。因此，使用埃希氏菌属细菌时，不知道增加L-氨基酸分泌蛋白对L-氨基酸生产是否有效。

尽管属于埃希氏菌属的大肠杆菌K-12菌株的全部核苷酸序列已经确定(Science，277，1453-1474，1997)，但其中有大量蛋白的功能还不知道。

本发明的目的是获得参与L-氨基酸分泌的蛋白，从而提供L-氨基酸产率提高的菌株和通过发酵生产L-氨基酸的改良方法。

发明人已对参与L-氨基酸分泌的蛋白进行了筛选。结果，发明人发现当增强一种特定基因时，基于消耗的糖的L-氨基酸产量增加了。基于这一发现完成了本发明。

因此，本发明提供了具有产生L-氨基酸能力的埃希氏菌属细菌，其中产L-氨基酸的能力通过增加至少一种选自以下(A)到(H)的蛋白的表达量而得到提高(以下称为“本发明的细菌”)：

(A)具有序列表中SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的蛋白；

(B)具有在序列表中SEQ ID NO：10所示氨基酸序列中有一个或几个氨基酸缺失、置换、插入、增加或倒位的氨基酸序列的蛋白，该蛋白具有增加含该蛋白的细菌产生L-氨基酸的能力的活性；

(C)具有序列表中SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的蛋白；

(D)具有在序列表中SEQ ID NO：12所示氨基酸序列中有一个或几个氨基酸缺失、置换、插入、增加或倒位的氨基酸序列的蛋白，该蛋白具有增加含该蛋白的细菌产生L-氨基酸的能力的活性；

(E)具有序列表中SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列的蛋白；

(F)具有在序列表中SEQ ID NO：14所示氨基酸序列中有一个或几个氨基酸缺失、置换、插入、增加或倒位的氨基酸序列的蛋白，该蛋白具有增加含该蛋白的细菌产生L-氨基酸的能力的活性；

(G)具有序列表中SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的蛋白；或

(H)具有在序列表中SEQ ID NO：16所示氨基酸序列中有一个或几个氨基酸缺失、置换、插入、增加或倒位的氨基酸序列的蛋白，该蛋白具有增加含该蛋白的细菌产生L-氨基酸的能力的活性。

本发明的细菌优选一种产L-赖氨酸细菌，其中选自(A)到(D)，(G)和(H)的至少一种蛋白的表达量增加；一种产L-谷氨酸细菌，其中选自(A)到(H)的至少一种蛋白的表达量增加；一种产L-丙氨酸细菌，其中选自(C)和(D)的至少一种蛋白的表达量增加；一种产L-缬氨酸细菌，其中选自(C)和(D)的至少一种蛋白的表达量增加；一种产L-组氨酸细菌，其中选自(C)到(F)的至少一种蛋白的表达量增加；一种产L-脯氨酸细菌，其中选自(A)到(F)的至少一种蛋白的表达量增加；一种产L-苏氨酸细菌，其中选自(E)和(F)的至少一种蛋白的表达量增加；一种产L-精氨酸细菌，其中选自(G)和(H)的至少一种蛋白的表达量增加；或一种产L-异亮氨酸细菌，其中选自(C)和(D)的至少一种蛋白的表达量增加。

优选，本发明的细菌中编码细胞中所述蛋白的DNA的拷贝数量增加。该DNA优选携带于细胞中的多拷贝质粒或转座子上。

本发明还提供了生产L-氨基酸的方法，包括以下步骤：

在培养基中培养本发明的细菌，在培养基中产生和积累L-氨基酸；

由培养基中回收L-氨基酸(以下也称为“本发明的细菌”)。

本发明的方法优选一种使用产L-赖氨酸细菌生产L-赖氨酸的方法，所述细菌中选自(A)到(D)，(G)和(H)的至少一种蛋白的表达量增加；一种使用产L-谷氨酸细菌生产L-谷氨酸的方法，所述细菌中选自(A)到(H)的至少一种蛋白的表达量增加；一种使用产L-丙氨酸细菌生产L-丙氨酸的方法，所述细菌中选自(C)和(D)的至少一种蛋白的表达量增加；一种使用产L-缬氨酸细菌生产L-缬氨酸的方法，所述细菌中选自(C)和(D)的至少一种蛋白的表达量增加；一种使用产L-组氨酸细菌生产L-组氨酸的方法，所述细菌中选自(C)到(F)的至少一种蛋白的表达量增加；一种使用产L-脯氨酸细菌生产L-脯氨酸的方法，所述细菌中选自(A)到(F)的至少一种蛋白的表达量增加；一种使用产L-苏氨酸细菌生产L-苏氨酸的方法，所述细菌中选自(E)和(F)的至少一种蛋白的表达量增加；一种使用产L-精氨酸细菌生产L-精氨酸的方法，所述细菌中选自(G)和(H)的至少一种蛋白的表达量增加；或一种使用产L-异亮氨酸细菌生产L-异亮氨酸的方法，所述细菌中选自(C)和(D)的至少一种蛋白的表达量增加。

优选，本发明的方法中编码细菌细胞中所述蛋白的DNA的拷贝数量增加。该DNA优选携带于细胞中的多拷贝质粒或转座子上。

根据本发明，埃希氏菌属细菌产L-氨基酸的能力可以被提高。生产L-氨基酸的方法的L-氨基酸的产率也可以被提高。

以下详述本发明。以下除非另外说明氨基酸指L-构型。

(1)本发明的细菌

本发明的细菌是具有产生氨基酸能力的埃希氏菌属细菌，其中产生氨基酸的能力通过增加一种蛋白的表达量得以提高，所述蛋白具有增加所述细菌产生氨基酸能力的活性，或增加对氨基酸或氨基酸类似物的抗性的活性。以下，为方便起见该蛋白被称为“氨基酸分泌蛋白”。但使用该术语并不意味着该蛋白的功能仅限于氨基酸分泌。

氨基酸分泌蛋白的实例包括具有SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的蛋白，具有SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的蛋白，具有SEQ ID NO：14所示氨基酸序列的蛋白，具有SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的蛋白。

氨基酸分泌蛋白对氨基酸可以具有选择性。适合于每一种氨基酸的氨基酸分泌蛋白可以通过以下方法确定：让氨基酸分泌蛋白在属于埃希氏菌属并具有产氨基酸能力的细菌中表达，测定氨基酸产量的增加或者氨基酸或氨基酸类似物的最小抑制浓度(MIC)的增加。

例如，在氨基酸为赖氨酸时，具有SEQ ID NO：10，12或16所示氨基酸序列的蛋白是有效的；在氨基酸为谷氨酸时，具有SEQ IDNO：10，12，14或16所示氨基酸序列的蛋白是有效的；在氨基酸为丙氨酸时，具有SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的蛋白是有效的；在氨基酸为缬氨酸时，具有SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的蛋白是有效的；在氨基酸为组氨酸时，具有SEQ ID NO：12或14所示氨基酸序列的蛋白是有效的；在氨基酸为脯氨酸时，具有SEQ ID NO：10，12或14所示氨基酸序列的蛋白是有效的；在氨基酸为苏氨酸时，具有SEQ ID NO：14所示氨基酸序列的蛋白是有效的；在氨基酸为精氨酸时，具有SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的蛋白是有效的；在氨基酸为异亮氨酸时，具有SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的蛋白是有效的。

本文中术语“表达量增加”通常是指表达量大于大肠杆菌野生型菌株如MG1655或W3110的表达量。该术语也包括当通过遗传工程技术等手段修饰得到一种菌株时，表达量大于修饰前。氨基酸分泌蛋白的表达量可通过测定氨基酸分泌蛋白直接确定，或通过测定氨基酸或氨基酸类似物的MIC，或者属于埃希氏菌属并具有氨基酸分泌蛋白的细菌的氨基酸产量间接确定。

增加氨基酸分泌蛋白表达量的方法的实例可以是增加细菌细胞中编码氨基酸分泌蛋白的DNA的拷贝数。

为了增加细胞中的拷贝数，编码氨基酸分泌蛋白的DNA片段可以与在埃希氏菌属细菌中有功能的载体连接，产生重组DNA，将其导入宿主中使宿主转化。转化菌株的细胞中编码氨基酸分泌蛋白的基因(氨基酸分泌蛋白基因)的拷贝数增加，从而增加氨基酸分泌蛋白的表达量。该载体优选为多拷贝载体。

在细胞中增加拷贝数可以通过允许宿主染色体DNA上存在氨基酸分泌蛋白基因的多个拷贝实现。向埃希氏菌属细菌染色体DNA上引入氨基酸分泌蛋白基因的多个拷贝可以通过同源重组实现，使用在染色体DNA上有多个拷贝的序列作为靶。在染色体DNA上有多个拷贝的序列可以使用转座因子末端存在的重复DNA和倒转重复。或者，优选如日本专利申请公开号2-109985(1990)中公开的，多个拷贝可以通过以下方法引入染色体DNA：使氨基酸分泌蛋白基因携带于转座子上，让转座子转座。根据上述任一种方法，在转化体菌株中氨基酸分泌蛋白基因的拷贝数增加，从而增加氨基酸分泌蛋白的表达量。

多拷贝载体的实例可以是pBR322，pMW118，pUC19等质粒载体和λ1059，λBF101，M13mp9等噬菌体载体。转座子的实例可以是Mu，Tn10，Tn5等。

向埃希氏菌属细菌引入DNA可以通过以下方法进行：D.M.Morrison(酶学方法68，326，1979)的方法，或受体细菌细胞用氯化钙处理以增加DNA的通透性的方法(Mandel，M.& Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159，1970)等。

除了上述基因扩增方法，增加氨基酸分泌蛋白的表达量也可以通过用作用较强的表达调节序列取代氨基酸分泌蛋白基因的启动子等表达调节序列来实现(参见日本专利申请公开号1-215280(1989))。例如，已知lac启动子、trp启动子、tac启动子、λ噬菌体PR启动子和PL启动子等为强启动子。取代启动子提高了氨基酸分泌蛋白的表达，从而增加了氨基酸分泌蛋白的表达量。表达调节序列的增强可以与增加氨基酸分泌蛋白基因的拷贝数联合使用。

在本发明的细菌中，多种氨基酸分泌蛋白的表达量可以增加。

氨基酸分泌蛋白已知由yahN基因、yeaS基因、yfiK基因和yggA基因编码，其功能还不清楚。因此，编码氨基酸分泌蛋白的DNA可以通过以下方法获得：根据已知序列(例如大肠杆菌K-12菌株的全部核苷酸序列已经确定(Science，277，1453-1474(1997)))合成引物，使用埃希氏菌属细菌的染色体DNA作为模板进行PCR扩增。目标DNA片段也可以根据已知序列制备探针，再通过杂交从埃希氏菌属细菌的染色体DNA文库中选择。或者，编码氨基酸分泌蛋白的DNA可根据已知序列合成。编码氨基酸分泌蛋白的DNA的核苷酸序列的实例见序列表中SEQ ID NO：9，11，13或15。

制备染色体DNA、制备染色体DNA文库、杂交、PCR、制备质粒DNA.消化和连接DNA、转化、选择作为引物的寡核苷酸等的方法可以是本领域技术人员熟知的普通方法。这些方法可参见Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，& Maniatis，T.《分子克隆：实验室指南》第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)等。

氨基酸分泌蛋白可以在一个或多个位置有一个或几个氨基酸的置换、缺失、插入、增加或倒位，只要增加属于埃希氏菌属并含有该蛋白的细菌产氨基酸能力的活性未被破坏即可。“几个”取决于蛋白立体结构中的位置和氨基酸残基的种类可以有所变化。这是因为有些氨基酸如异亮氨酸和缬氨酸彼此高度类似，这些氨基酸之间的差异不会明显影响蛋白的立体结构。

编码作为上述氨基酸分泌蛋白的基本相同蛋白的DNA可以通过以下方法获得：例如利用定点诱变修饰核苷酸序列使得特定位点的一个或多个氨基酸残基发生置换、缺失、插入、增加或倒位。如上修饰的DNA可以通过常规的已知突变处理获得。突变处理包括用羟胺体外处理编码氨基酸分泌蛋白的DNA的方法，和用紫外辐射或N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NG)和亚硝酸等常用于诱变处理的诱变剂处理携带有编码氨基酸分泌蛋白的DNA的微生物的方法，所述微生物如埃希氏菌属细菌。

一个或几个氨基酸残基的置换、缺失、插入、增加或倒位包括天然产生的突变或变异，它是由具有氨基酸分泌蛋白的单个微生物之间和种、菌株等之间的差异产生的。

编码作为氨基酸分泌蛋白的基本相同蛋白的DNA可以通过以下方法获得：让具有上述突变的DNA在属于埃希氏菌属的合适细菌细胞中表达，确定细胞中氨基酸产量的增加。

编码作为氨基酸分泌蛋白的基本相同蛋白的DNA也可以通过以下方法获得：由编码具有突变的氨基酸分泌蛋白的DNA或含所述DNA的细胞中，分离在严紧条件下与具有序列表中SEQ ID NO：9、11、13或15所示核苷酸序列的DNA杂交的DNA，该DNA编码具有增加埃希氏菌属细菌产氨基酸能力的活性的蛋白。本文中“严紧条件”指形成特异杂交体而不形成非特异杂交体的条件。该条件难以用数值明确地表示。但是，严紧条件包括例如彼此具有高同源性的DNA可杂交而低于该同源性的DNA不能杂交的条件，所述高同源性DNA如同源性不低于70％，或相当于普通Southern杂交洗涤条件的60℃，1×SSC，0.1％SDS，优选0.1×SSC，0.1％SDS的盐浓度的条件。

尽管在上述条件下杂交的基因中可能存在终止密码子位于中间的基因，或编码由于活性中心突变而失去活性的蛋白的基因，但这些基因通过以下方法易于消除：将基因与市售活性表达载体连接，确定增加上述埃希氏菌属细菌产生氨基酸能力的活性。

本文中“编码蛋白的DNA”是指双链DNA中一条链编码该蛋白的DNA。

通过在上述属于埃希氏菌属、产氨基酸的细菌中增加氨基酸分泌蛋白的表达量，可增加氨基酸的产生量。作为其中氨基酸分泌蛋白的表达量待增加的埃希氏菌属细菌，使用具有产生所需氨基酸能力(氨基酸生产力)的菌株。此外，可以将产生某种氨基酸的能力赋予其中氨基酸分泌蛋白表达量已增加的细菌。属于埃希氏菌属的产氨基酸细菌的实例包括大肠杆菌AJ13199(法国专利2747689)和可从已知材料获得的菌株(例如以下实施例中所述的大肠杆菌W3110(tyrA)/pCABD2，大肠杆菌VL614，大肠杆菌VL2054，大肠杆菌VL2160，大肠杆菌VL2151，大肠杆菌W3350 argE::Tn10/pKA10)。

作为参考，本发明的氨基酸分泌蛋白如下文所述首次进行鉴定。

发明人鉴定了埃希氏菌属细菌的rhtB和rhtC作为苏氨酸分泌蛋白基因。发明人根据氨基酸分泌蛋白可能具有共同的结构这一设想进行了检索。即对GenBank CDS，PDB，SWISS-PROT，Spupdate和PIR进行了rhtB编码蛋白同源性的BLAST和PSI-BLAST检索(Altschul，S.F.et al.，Nucleic Acid Res.，25，3389-3402(1997))。对未完成的微生物基因组进行了Tblastn检索。对SWALL数据库进行了BLITZ检索(Sturrock，S.S.& Collins，J.F.，Mpsch版本1.3.生物计算机研究小组，爱丁堡大学，英国，1993)。对翻译本和SWISS-PROT数据库进行了SMART检索(Ogiwara，I.et al.，Protein Sci.，5，1991-1999，1996)。从找到的60多个序列样品中，YeaS(相当于GenBank入藏号AE000274的f212)，YahN(相当于GenBank入藏号AE000140的f223)，YfiK(相当于GenBank入藏号AE000344的o195)，YggA(相当于GenBank入藏号AE000375的f211)在来自大肠杆菌的蛋白中为与RhtB功能类似的蛋白。由于这些基因的功能均为未知，实际获得这些基因，其对氨基酸和氨基酸类似物的MIC和氨基酸产生的影响通过提高其活性进行研究。结果，发现YeaS，YfiK，YahN和YggA增加某些氨基酸和类似物的MIC。进一步研究证实，这些基因编码的蛋白具有增加氨基酸积累的作用，但它们可能具有某些氨基酸选择性。

(2)本发明的方法

本发明的方法包括在培养基中培养本发明的细菌，在培养基中产生和积累氨基酸，由培养基中回收氨基酸。

合适的氨基酸包括赖氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、高丝氨酸、脯氨酸和苏氨酸。

本发明的方法中，培养埃希氏菌属细菌、由液体培养基中收集和纯化氨基酸可以按照与使用细菌通过发酵生产氨基酸的常规方法类似的方式进行。培养中使用的培养基可以是合成培养基或天然培养基，只要培养基包括所用的细菌生长必需的适量碳源、氮源和矿物质，必要时含有营养素。碳源可以包括葡萄糖和蔗糖等碳水化合物和各种有机酸。根据所用的细菌的同化能力，包括乙醇和甘油的醇类也可以使用。氮源可以使用氨、硫酸铵等铵盐、胺等含氮化合物、蛋白胨、大豆水解物和消化的发酵微生物等天然氮源。矿物质可以使用磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、碳酸钙。

培养优选在好气条件下进行，如振荡培养、通气培养和搅动培养。培养温度通常为20到40℃，优选30到38℃。培养pH通常为5到9，优选6.5到7.2。培养液的pH可以用氨、碳酸钙、各种酸、各种碱和缓冲剂调节。通常，培养1到3天可在培养基中积累目标氨基酸。

回收氨基酸可按以下方法进行：培养后通过离心或膜过滤除去细胞等固体物质，然后通过离子交换、浓缩和结晶分级等方法收集和纯化目标氨基酸。

以下参考实施例更具体地解释本发明。

实施例1制备编码氨基酸分泌蛋白的DNA片段

大肠杆菌K-12菌株染色体的全部核苷酸序列已经确定(Science，277，1453-1474，1997)。根据报导的核苷酸序列，合成引物，通过PCR扩增yahN，yfiK，yeaS和yggA基因。

(1)使用大肠杆菌MG1655菌株染色体DNA作为模板

通过常规方法制备染色体DNA(Sambrook，J.，Fritsch E.F.&Maniatis T.(1989)《分子克隆：实验室指南》第2版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)。在PCR反应中，使用文献中所述的标准条件(《PCR操作：方法和应用》White，B.A编辑，Humana Press，Totowa，New Jersey，1993)。所得的PCR产物如下所述通过常规方法纯化和用限制酶消化。

使用引物1和引物2扩增yahN基因。

引物1：gtgtggaaccgacgccggat(互补于GenBank入藏号AE000140的登记核苷酸序列1885到1904号碱基，SEQ ID NO：17)，引物2：tgttgtatggtacggggttcgag(上述序列中223到245号碱基，SEQ ID NO：18)。纯化后所得的PCR产物用限制酶PstI和StuI消化，使用连接试剂盒与PstI和EcoRV消化的载体pUC21连接(Vieira，Messing，Gene，100，189-194，1991)。然后用产物转化大肠杆菌TG1感受态细胞(Sambrook，J.，Fritsch E.F.& Maniatis T.(1989)《分子克隆：实验室指南》第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.)，将细胞涂布于含有10mg/mlIPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)和40mg/ml X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)以及100mg/ml氨苄西林的L培养基(10g/l细菌用胰胨，5g/l酵母提取物，5g/l NaCl，15g/l琼脂，pH7.0)，培养过夜。挑取出现的白色菌落，进行单菌落分离以获得转化子。使用碱抽提法由转化子提取质粒，命名为pYAHN。

使用引物3和引物4扩增yeaS基因

引物3：ctttgccaatcccgtctccc(互补于GenBank入藏号AE000274的登记核苷酸序列7683到7702号碱基，SEQ ID NO：19)；引物4：gccccatgcataacggaaag(上述序列中5542到5561号碱基，SEQ ID NO：19)。纯化后所得的PCR产物用限制酶AvaI消化，并与载体pUC19连接。同上转化大肠杆菌TG1后，获得称为pYEAS的质粒。

使用引物5和引物6扩增yfiK基因

引物5：gaagatcttgtaggccggataaggcg(GenBank入藏号AE000344的登记核苷酸序列4155到4177号碱基，在其5’端加上了限制酶BglII位点，SEQ ID NO：21)

引物6：tggttttaccaattggccgc(互补于上述序列的6307到6326号碱基，SEQ ID NO：22)。

纯化后获得的PCR产物用限制酶BglII和MunI消化，并与限制酶BglII和EcoRI消化的载体pUC21连接。同上转化大肠杆菌TG1后，获得称为pYFIK的质粒。

使用引物7和引物8扩增yggA基因

引物7：acttctcccgcgagccagttc(互补于GenBank入藏号AE000375的登记核苷酸序列9606到9626号碱基，SEQ ID NO：23)。

引物8：ggcaagcttagcgcctctgtt(上述序列的8478到8498号碱基，SEQ ID NO：24)。

纯化后获得的PCR产物用限制酶HindIII和ClaI消化，与用同样限制酶消化的载体pOK12连接(Vieira，Messing，Gene，100，189-194，1991)。同上转化大肠杆菌TG1，获得称为pYGGA的质粒。

(2)用大肠杆菌W3110菌株的染色体DNA作为模板

使用引物9(SEQ ID NO：1)和引物10(SEQ ID NO：2)扩增yahN基因。

使用引物11(SEQ ID NO：3)和引物12(SEQ ID NO：4)扩增yeaS基因。

使用引物13(SEQ ID NO：5)和引物14(SEQ ID NO：6)扩增yfiK基因。

使用引物15(SEQ ID NO：7)和引物16(SEQ ID NO：8)扩增yggA基因。

纯化所获得的PCR产物，用限制酶SacI和XbaI(yggA则为EcoRI和PstI)消化，并与质粒pMW118连接(Nippon Gene)。插入了序列与报导的序列相同的DNA片段的质粒称为：

携带yahN：pMW118::yahN

携带yeaS：pMW118::yeaS

携带yfiK：pMW118::yfiK

携带yggA：pMW118::yggA

实施例2某些氨基酸和氨基酸类似物抗性的大肠杆菌中yahN，yeaS，yfiK和yggA DNA片段扩增的作用

yahN，yeaS，yfiK和yggA基因产物与谷氨酸棒杆菌赖氨酸转运者LysE(Vrljic et al.，Mol.Microbiol.，22，815-826，1996)和参与高丝氨酸分泌的RhtB蛋白的同源性，表明这些蛋白的功能类似。已知增加与抗生素和重金属外排有关的基因的表达导致对药物的抗性增加(Nikaido，H.J.Bacteriology，178，5853-5859，1996)。因此，测试了pYEAS，pYAHN，pYFIK和pYGGA质粒对TG1菌株对某些氨基酸和氨基酸类似物敏感性的作用。大肠杆菌TG1/pYEAS，TG1/pYAHN，TG1/pYFIK，TG1/pYGGA和对照菌株TG1/pUC21，TG1/pUC19和TG1/pOK12在含有合适抗生素的M9基本培养基中在摇床上过夜培养(10⁹cfu/ml)，用M9基本培养基1∶100稀释，在同一培养基中再培养5小时。这样获得的对数期培养物稀释，大约10⁴活细胞涂布于含双倍量氨基酸或类似物的M9琼脂的干的测试平板上。获得这些化合物的最小抑制浓度(MIC)。

结果示于表1。由表1可见，多个拷贝的yfiK基因使得对脯氨酸、高丝氨酸、组氨酸、苏氨酸、谷氨酸、赖氨酸、α-氨基-β-羟基戊酸(AHVA)、S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)和α-氨基丁酸的抗性增加；多个拷贝的yahN基因使得对脯氨酸的抗性增加；多个拷贝的yeaS基因使得对苏氨酸、高丝氨酸、赖氨酸、谷氨酸、组氨酸、脯氨酸和α-氨基丁酸的抗性增加；多个拷贝的yggA基因使得对S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、赖氨酸和精氨酸的抗性增加。这些结果表明，除了YahN，每一种推定的转运者均对几种底物(氨基酸和氨基酸类似物)有特异性，或由于扩增显示非特异性作用。

表1

底物	携带质粒的大肠杆菌TG1的MIC(μg/ml)
	携带质粒的大肠杆菌TG1的MIC(μg/ml)					pUC21	pYFIK	pYAHN	pYEAS	pYGGA
	L-高丝氨酸	500	1000	500	1000	pUC21	pYFIK	pYAHN	pYEAS	pYGGA	500
L-苏氨酸	L-高丝氨酸	500	1000	500	1000	30000	40000	30000	50000	30000	500
L-苏氨酸	L-赖氨酸	5000	7500	5000	7500	30000	40000	30000	50000	30000	15000
L-谷氨酸(钠盐)	L-赖氨酸	5000	7500	5000	7500	5000	10000	5000	20000	5000	15000
L-谷氨酸(钠盐)	L-组氨酸	5000	10000	5000	30000	5000	10000	5000	20000	5000	5000
L-缬氨酸	L-组氨酸	5000	10000	5000	30000	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	5000
L-缬氨酸	L脯氨酸	1000	5000	2000	2000	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	1000
L-精氨酸	L脯氨酸	1000	5000	2000	2000	10000	10000	10000	10000	20000	1000
L-精氨酸	AHVA	100	200	100	100	10000	10000	10000	10000	20000	100
AEC	AHVA	100	200	100	100	5	10	5	5	200	100
AEC	α-氨基丁酸	2500	5000	2500	＞10000	5	10	5	5	200	2500
4-氮-DL-亮氨酸	α-氨基丁酸	2500	5000	2500	＞10000	100	100	100	100	100	2500

实施例3yeaS，yahN和yfiK DNA片段扩增对谷氨酸生成的影响

大肠杆菌AJ13199菌株(法国专利2747689)用载体pUC21和质粒pYAHN，pYEAS和pYFIK分别转化。获得菌株AJ13199/pUC21(VKPMB-7728)，AJ13199/pYAHN(VKPM B-7729)，AJ13199/pYEAS(VKPMB-7731)和AJ13199/pYFIK(VKPM B-7730)。

这些菌株在37℃分别于含有100mg/l氨苄西林的营养肉汤中培养18小时，0.3ml所得的培养物接种20×200mm试管中的3ml含有100mg/l氨苄西林的发酵培养基，37℃振荡培养48小时。培养后，通过已知方法确定培养基中积累的谷氨酸量。

发酵培养基的组成(g/l)：

葡萄糖 80

硫酸铵 22

磷酸氢二钾 2

氯化钠 0.8

七水硫酸镁 0.8

七水硫酸亚铁 0.02

五水硫酸锰 0.02

盐酸硫胺素 0.0002

酵母提取物 1.0

碳酸钙 30.0

180℃干热灭菌2小时，葡萄糖和磷酸氢二钾单独灭菌。

所得结果示于表2。如表2所示，菌株AJ13199/pYAHN，AJ13199/pYEAS和AJ13199/pYFIK积累的谷氨酸较氨基酸分泌蛋白的表达量未提高的AJ13199/pUC21更高。

表2

菌株	谷氨酸，g/l
菌株	谷氨酸，g/l	AJ13199/pUC21	21.9
AJ13199/pYAHN	27.9	AJ13199/pUC21	21.9
AJ13199/pYAHN	27.9	AJ13199/pYEAS	29.7
AJ13199/pYFIK	28.4	AJ13199/pYEAS	29.7

实施例4yeaS，yahN和yfiK DNA片段扩增对赖氨酸生成的影响

(1)作为产赖氨酸的埃希氏菌属细菌，使用引入了质粒pCABD2(国际公开WO 95/16042)的大肠杆菌W3110(TyrA)(欧洲专利公开号488424)。具体而言，质粒pCABD2和pMW118::yahN，pMW118::yeaS，pMW118::yfiK和pMW118分别引入大肠杆菌菌株W3110(TyrA)以获得下列菌株：

W3110(tyrA)/pCABD2+pMW118::yahN

W3110(tyrA)/pCABD2+pMW118::yeaS

W3110(tyrA)/pCABD2+pMW118::yfiK

W3110(tyrA)/pCABD2+pMW118

这些菌株的赖氨酸生产力通过培养估计。所用的培养基的组成如下(g/l)：

葡萄糖 40.0

七水硫酸镁 1.0

硫酸铵 16.0

磷酸氢二钾 1.0

七水硫酸亚铁 0.01

七水硫酸锰 0.01

酵母提取物(Difco) 2.0

酪氨酸 0.1

调pH为7.0，115℃高压灭菌10分钟。(葡萄糖和七水硫酸镁单独灭菌)

药用级碳酸钙 25g/l(180℃干热灭菌2小时

根据质粒的种类，加入20mg/l链霉素和50mg/l氨苄西林。在37℃以115rpm振荡培养30小时。结果示于表3。

表3

菌株	赖氨酸(g/l)	产量(％)
菌株	赖氨酸(g/l)	产量(％)	W3110(tyrA)	0.08	0.2
W3110(tyrA)/pCABD2+pMW118	12.2	30.5	W3110(tyrA)	0.08	0.2
W3110(tyrA)/pCABD2+pMW118	12.2	30.5	W3110(tyrA)/pCABD2+pMW118::yahN	13.8	34.5
W3110(tyrA)/pCABD2+pMW118::yeaS	12.7	31.8	W3110(tyrA)/pCABD2+pMW118::yahN	13.8	34.5
W3110(tyrA)/pCABD2+pMW118::yeaS	12.7	31.8	W3110(tyrA)/pCABD2+pMW118::yfiK	12.2	30.5

表3结果表明，由于YahN和YeaS增强，赖氨酸的产生量和基于消耗的糖的产量增加了。

(2)作为产赖氨酸的埃希氏菌属细菌，使用大肠杆菌VL614。该菌株是已知的大肠杆菌VL613(SU Patent No.1354458)的衍生菌株。菌株VL613从已知菌株Gif102(Theze，J.& Saint Girons.J.Bacteriol.，118，990-998，1974)分三步获得：

第一步，选择对2mg/ml S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸有抗性的突变体，其中发现菌株VL611能产生L-赖氨酸。

第二步，利用噬菌体P1介导的转导将参与蔗糖利用、定位于转座子Tn2555(Doroshenko et al.，Mol.Biologiya，22，645-658，1988)的基因引入VL611，获得菌株VL612。

第三步，来自菌株VKPM B-3996的突变rhtA23赋予对苏氨酸和高丝氨酸的抗性(美国专利5,175,107)，通过噬菌体P1转导将其引VL612，获得菌株VL613。

大肠杆菌菌株VL614通过将来自大肠杆菌菌株VKPM B-6204(MG1655 zbi3058::Tn10)rhtA基因的野生型等位基因转导进入VL613获得。转导子在含有10mg/l四环素的L-培养基中选择，其中发现有对10g/l高丝氨酸敏感的菌株VL614(rhtA⁺)。

菌株VL614用pYGGA质粒或pOK12载体转化，获得菌株VL614/pYGGA(VKPM B-7719)和VL614/pOK12(VKPM B-7722)。

这些菌株在37℃分别于含50mg/l卡那霉素的营养肉汤中培养18小时，0.3ml所得的培养物接种20×200mm试管中的3ml含有0.3g/l苏氨酸、0.3g/l甲硫氨酸和50mg/l卡那霉素的发酵培养基(实施例3)，37℃振荡培养48小时。培养后，通过已知方法确定培养基中积累的赖氨酸和谷氨酸量。

结果示于表4。

表4

菌株	赖氨酸(g/l)	谷氨酸(g/l)
菌株	赖氨酸(g/l)	谷氨酸(g/l)	VL614/pOK12	2.6	0.8
VL614/pYGGA	3.6	2.2	VL614/pOK12	2.6	0.8

如表4所示，菌株VL614/pYGGA较yggA基因未增强的菌株VL614/pOK12积累的赖氨酸更多。此外，菌株VL614/pYGGA较菌株VL614/pOK12积累的谷氨酸更多。

实施例5yeaS，yahN和yfiK DNA片段扩增对苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸和异亮氨酸生成的影响

作为产苏氨酸的埃希氏菌属细菌，使用大肠杆菌菌株VL2054。该菌株按如下方法由已知的大肠杆菌菌株VKPM B-3996(美国专利5,175,107)衍生。

最初，新的受体菌株由几个步骤构建：

·菌株VKPM B-3996的无质粒衍生物在自发消除pVIC40质粒后选择。

·来自大肠杆菌菌株VKPM B-6204(MG1655 zbi3058::Tn10)的rhtA基因的野生型等位基因通过实施例4中的噬菌体P1介导的转导引入所得的菌株。

·在NG诱变和选择仍能不降解苏氨酸的卡那霉素敏感细胞后，获得插入tdh基因中的Tn5转座子中kan基因灭活的突变。因而获得VL2053菌株。

另一方面，来自pVIC40的苏氨酸操纵子被克隆进入λ噬菌体的PR启动子控制下的整合Mud载体。此外，赋予对氨霉素抗性的Tn9的cat基因被克隆进同一载体。由此获得的构建物通过已知方法(美国专利5,595,889)插入大肠杆菌C600菌株的染色体，并由所获得的菌株转导进入VL2053，得到新的无质粒产苏氨酸菌株VL2054。该菌株也在培养液中积累丙氨酸、缬氨酸和异亮氨酸。

菌株VL2054用质粒pYEAS，pYFIK和载体pUC21分别转化，获得大肠杆菌菌株VL2054/pYEAS(VKPM B-7707)，VL2054/pYFIK(VKPMB-7712)和VL2054/pUC21(VKPM B-7708)。

这些菌株分别在37℃于含有100mg/l氨苄西林的营养肉汤中培养18小时，0.3ml所得的培养物接种20×200mm试管中含100mg/l氨苄西林的3ml发酵培养基(实施例3)，37℃振荡培养48小时。培养后，培养基中积累的苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸和异亮氨酸量通过已知方法确定。

结果示于表5。

如表5所示，菌株VL2054/pYFIK积累的苏氨酸较yfiK基因未被增强的菌株VL2054/pUC21更多。此外，菌株VL2054/pYEAS积累的丙氨酸、缬氨酸和异亮氨酸较yeaS基因未被增强的菌株VL2054/pUC21更多。

表5

菌株	氨基酸积累，g/l
	氨基酸积累，g/l				苏氨酸	丙氨酸	缬氨酸	异亮氨酸
	VL2054/pUC21	5.8	0.4	0.31	苏氨酸	丙氨酸	缬氨酸	异亮氨酸	0.15
VL2054/pYEAS	VL2054/pUC21	5.8	0.4	0.31	5.2	1.4	0.52	0.45	0.15
VL2054/pYEAS	VL2054/pYFIK	8.8	0.5	0.22	5.2	1.4	0.52	0.45	0.14

实施例6yeaS和yfiK DNA片段扩增对组氨酸生成的影响

作为产组氨酸的埃希氏菌属细菌，使用大肠杆菌菌株VL2160。该菌株是通过噬菌体P1介导将hisG^R突变自菌株CC46转导至已知菌株NK5526 hisG::Tn10(VKPM B-3384)获得，所述突变使ATP磷酸核糖基转移酶脱敏(Astvatsaturianz et al.，Genetika，24，1928-1934，1988)。大肠杆菌菌株VL2160用质粒pYEAS，pYFIK和载体pUC21分别转化获得大肠杆菌菌株VL2160/pYEAS(VKPM B-7753)，VL2160/pYFIK(VKPM B-7754)和VL2160/pUC21(VKPM B-7752)。

这些菌株分别在37℃于含有100mg/l氨苄西林的营养肉汤中培养18小时，0.3ml所得的培养物接种20×200mm试管中含有浓度提高的酵母提取物(3g/l)和100mg/l氨苄西林的3ml发酵培养基(实施例3)，34℃振荡培养68小时。

培养后，培养基中组氨酸的积累量通过已知方法确定。结果示于表6。

表6

菌株	组氨酸，g/l
菌株	组氨酸，g/l	VL2160/pUC21	1.2
VL2160/pYEAS	1.8	VL2160/pUC21	1.2
VL2160/pYEAS	1.8	VL2160/pYFIK	1.4

如表6所示，大肠杆菌菌株VL2160/pYEAS和VL2160/pYFIK积累的组氨酸较yeaS和yfiK基因未被增强的菌株VL2160/pUC21更多。

实施例7yahN，yeaS和yfiK DNA片段扩增对脯氨酸生成的影响

作为产脯氨酸的埃希氏菌属细菌，使用大肠杆菌菌株VL2151(W3350 proB^*ΔputAP Tn10)。该菌株通过以下方法获得：将与Tn10连锁的ΔputAP突变转导进入W3350，选择不能利用脯氨酸作为唯一碳源的四环素抗性转导子。将所获得的菌株W3350ΔputAP Tn10用NG诱变，选择对20mg/l 3，4-脱氢-DL-脯氨酸有抗性的突变体。其中，发现菌株VL2151(W3350 proB^*ΔputAP Tn10)能够产生脯氨酸。

大肠杆菌菌株VL2151用质粒pYEAS，pYFIK，pYAHN和载体pUC21分别转化获得大肠杆菌菌株VL2151/pYEAS(VKPM B-7714)，VL2151/pYFIK(VKPM B-7713)，VL2151/pYAHN(VKPM B-7748)和VL2151/pUC21(VKPM B-7715)。

这些菌株分别在37℃于含有100mg/l氨苄西林的营养肉汤中培养18小时，0.3ml所得的培养物接种20×200mm试管中含有100mg/l氨苄西林的3ml发酵培养基(实施例3)，37℃振荡培养48小时。培养后，培养基中脯氨酸的积累量通过已知方法确定。结果示于表7。

表7

菌株	脯氨酸，g/l
菌株	脯氨酸，g/l	VL2151/pUC21	1.8
VL2151/pYAHN	2.2	VL2151/pUC21	1.8
VL2151/pYAHN	2.2	VL2151/pYEAS	2.1
VL2151/pYFIK	2.5	VL2151/pYEAS	2.1

如表7所示，大肠杆菌菌株VL2151/pYFIK、VL2151/pYAHN和VL2151/pYEAS积累的脯氨酸较yfiK，yahN和yeaS基因未被增强的菌株VL2151/pUC21更多。yfiK基因的扩增效果最明显。

实施例8yggA DNA片段扩增对精氨酸生成的影响

作为产精氨酸的埃希氏菌属细菌，使用大肠杆菌菌株W3350argE::Tn10/pKA10。该菌株携带质粒pKA10，其中含有来自黄色棒杆菌(短杆菌)的DNA区，它至少与受体菌株大肠杆菌K12中的argA和argE突变互补(Kharitonov A.& Tarasov A.P.MolecularGenetics，Microbiology and Virology，No.9，29-33，1986)。

大肠杆菌菌株W3350 argE::Tn10/pKA10用质粒pYGGA或载体pOK12分别转化获得大肠杆菌菌株W3350 argE::Tn10/pKA10，pYGGA(VKPM B-7716)和W3350 argE::Tn10/pKA10，pOK12(VKPM B-7718)。

所得的转化子分别在37℃于含有100mg/l氨苄西林和50mg/l卡那霉素的营养肉汤中培养18小时，0.3ml所得的培养物接种20×200mm试管中含有100mg/l氨苄西林和50mg/l卡那霉素的3ml发酵培养基(实施例3)，37℃振荡培养48小时。培养后，培养基中精氨酸的积累量通过已知方法确定。

结果示于表8.

表8

菌株	精氨酸，g/l
菌株	精氨酸，g/l	W3350 argE::Tn10/pKA10，pOK12	0.11
W3350 argE::Tn10/pKA10，pYGGA	0.46	W3350 argE::Tn10/pKA10，pOK12	0.11

如表7所示，大肠杆菌菌株W3350 argE::Tn10/pKA10，pYGGA积累的精氨酸较yggA基因未被增强的菌株W3350 argE::Tn10/pKA10，pUC21更多。

根据国际保藏的布达佩斯条约，下列大肠杆菌菌株于1998年11月29日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)，括号中为保藏号。

AJ13199/pUC21(VKPM B-7728)

AJ13199/pYAHN(VKPM B-7729)

AJ13199/pYEAS(VKPM B-7731)

AJ13199/pYFIK(VKPM B-7730)

VL614/pYGGA(VKPM B-7719)

VL614/pOK12(VKPM B-7722)

VL2054/pYEAS(VKPM B-7707)

VL2054/pYFIK(VKPM B7712)

VL2054/pUC21(VKPM B7708)

VL2160/pYEAS(VKPM B-7753)

VL2160/pYFIK(VKPM B-7754)

VL2160/pUC21(VKPM B-7752)

VL2151/pYFIK(VKPM B-7713)

VL2151/pYEAS(VKPM B-7714)

VL2151/pYAHN(VKPM B-7748)

VL2151/pUC21(VKPM B-7715)

W3350 argE::Tn10/pKA10，pYGGA(VKPM B-7716)

W3350 argE::Tn10/pKA10，pOK12(VKPM B-7718)

序列表

(110)Livshits，Vitaliy Arkadievich

Zakataeva，Natalia Pavlovna

Nakanishi，Kazuo

Aleshin，Vladimir Veniaminovich

Troshin，Petr Vladimirovich

Tokhmakova，Irina Lyvovna

(120)生产L-氨基酸的方法

(130)

(160)24

(210)1

(211)27

(212)DNA

(213)人工序列

(220)

(223)人工序列描述：扩增大肠杆菌yahN基因的引物

(400)1

ggcgagctcc cagtaaccgg aaataag 27

(210)2

(211)27

(212)DNA

(213)人工序列

(220)

(223)人工序列描述：扩增大肠杆菌yahN基因的引物

(400)2

cgctctagaa aggaccacgc attacgg 27

(210)3

(211)27

(212)DNA

(213)人工序列

(220)

(223)人工序列描述：扩增大肠杆菌yeaS基因的引物

(400)3

ggcgagctca gattggttag catattc 27

(210)4

(211)27

(212)DNA

(213)人工序列

(220)

(223)人工序列描述：扩增大肠杆菌yeaS基因的引物

(400)4

cggtctagaa tcagcgaaga atcaggg 27

(210)5

(211)27

(212)DNA

(213)人工序列

(220)

(223)人工序列描述：扩增大肠杆菌yfiK基因的引物

(400)5

ggcgagctca tgttccgtgt cgggtac 27

(210)6

(211)27

(212)DNA

(213)人工序列

(220)

(223)人工序列描述：扩增大肠杆菌yfiK基因的引物

(400)6

ggctctagat agcaagttac taagcgg 27

(210)7

(211)35

(212)DNA

(213)人工序列

(220)

(223)人工序列描述：扩增大肠杆菌yggA基因的引物

(400)7

ctctgaattc tctcttatta gtttttctga ttgcc 35

(210)8

(211)38

(212)DNA

(213)人工序列

(220)

(223)人工序列描述：扩增大肠杆菌yggA基因的引物

(400)8

cgtgacctgc agcgttctca cagcgcggta gcctttaa 38

(210)9

(211)672

(212)DNA

(213)大肠杆菌

(220)

(221)CDS

(222)(1)..(672)

(400)9

atg atg cag tta gtt cac tta ttt atg gat gaa atc act atg gat cct 48

Met Met Gln Leu Val His Leu Phe Met Asp Glu Ile Thr Met Asp Pro

1 5 10 15

ttg cat gcc gtt tac ctg acc gta gga ctg ttc gtg att act ttt ttt 96

Leu His Ala Val Tyr Leu Thr Val Gly Leu Phe Val Ile Thr Phe Phe

20 25 30

aat ccg gga gcc aat ctc ttt gtg gta gta caa acc agc ctg gct tcc 144

Asn Pro Gly Ala Asn Leu Phe Val Val Val Gln Thr Ser Leu Ala Ser

35 40 45

ggt cga cgc gca ggg gtg ctg acc ggg ctg ggc gtg gcg ctg ggc gat 192

Gly Arg Arg Ala Gly Val Leu Thr Gly Leu Gly Val Ala Leu Gly Asp

50 55 60

gca ttt tat tcc ggg ttg ggt ttg ttt ggt ctt gca acg cta att acg 240

Ala Phe Tyr Ser Gly Leu Gly Leu Phe Gly Leu Ala Thr Leu Ile Thr

65 70 75 80

cag tgt gag gag att ttt tcg ctt atc aga atc gtc ggc ggc gct tat 288

Gln Cys Glu Glu Ile Phe Ser Leu Ile Arg Ile Val Gly Gly Ala Tyr

85 90 95

ctc tta tgg ttt gcg tgg tgc agc atg cgc cgc cag tca aca ccg caa 336

Leu Leu Trp Phe Ala Trp Cys Ser Met Arg Arg Gln Ser Thr Pro Gln

100 105 110

atg agc aca cta caa caa ccg att agc gcc ccc tgg tat gtc ttt ttt 384

Met Ser Thr Leu Gln Gln Pro Ile Ser Ala Pro Trp Tyr Val Phe Phe

115 120 125

cgc cgc gga tta att acc gat ctc tct aac ccg caa acc gtt tta ttt 432

Arg Arg Gly Leu Ile Thr Asp Leu Ser Asn Pro Gln Thr Val Leu Phe

130 135 140

ttt atc agt att ttc tca gta aca tta aat gcc gaa aca cca aca tgg 480

Phe Ile Ser Ile Phe Ser Val Thr Leu Asn Ala Glu Thr Pro Thr Trp

145 150 155 160

gca cgt tta atg gcc tgg gcg ggg att gtg ctc gca tca att atc tgg 528

Ala Arg Leu Met Ala Trp Ala Gly Ile Val Leu Ala Ser Ile Ile Trp

165 170 175

cga gtt ttt ctt agt cag gcg ttt tct ttg ccc gct gtg cgt cgt gct 576

Arg Val Phe Leu Ser Gln Ala Phe Ser Leu Pro Ala Val Arg Arg Ala

180 185 190

tat ggg cgt atg caa cgc gtt gcc agt cgg gtt att ggt gca att att 624

Tyr Gly Arg Met Gln Arg Val Ala Ser Arg Val Ile Gly Ala Ile Ile

195 200 205

ggt gta ttc gcg cta cgc ctg att tac gaa ggg gtg acg cag cgg tga 672

Gly Val Phe Ala Leu Arg Leu Ile Tyr Glu Gly Val Thr Gln Arg

210 215 220

(210)10

(211)223

(212)PRT

(213)大肠杆菌

(400)10

Met Met Gln Leu Val His Leu Phe Met Asp Glu Ile Thr Met Asp Pro

1 5 10 15

Leu His Ala Val Tyr Leu Thr Val Gly Leu Phe Val Ile Thr Phe Phe

20 25 30

Asn Pro Gly Ala Asn Leu Phe Val Val Val Gln Thr Ser Leu Ala Ser

35 40 45

Gly Arg Arg Ala Gly Val Leu Thr Gly Leu Gly Val Ala Leu Gly Asp

50 55 60

Ala Phe Tyr Ser Gly Leu Gly Leu Phe Gly Leu Ala Thr Leu Ile Thr

65 70 75 80

Gln Cys Glu Glu Ile Phe Ser Leu Ile Arg Ile Val Gly Gly Ala Tyr

85 90 95

Leu Leu Trp Phe Ala Trp Cys Ser Met Arg Arg Gln Ser Thr Pro Gln

100 105 110

Met Ser Thr Leu Gln Gln Pro Ile Ser Ala Pro Trp Tyr Val Phe Phe

115 120 125

Arg Arg Gly Leu Ile Thr Asp Leu Ser Asn Pro Gln Thr Val Leu Phe

130 135 140

Phe Ile Ser Ile Phe Ser Val Thr Leu Asn Ala Glu Thr Pro Thr Trp

145 150 155 160

Ala Arg Leu Met Ala Trp Ala Gly Ile Val Leu Ala Ser Ile Ile Trp

165 170 175

Arg Val Phe Leu Ser Gln Ala Phe Ser Leu Pro Ala Val Arg Arg Ala

180 185 190

Tyr Gly Arg Met Gln Arg Val Ala Ser Arg Val Ile Gly Ala Ile Ile

195 200 205

Gly Val Phe Ala Leu Arg Leu Ile Tyr Glu Gly Val Thr Gln Arg

210 215 220

(210)11

(211)639

(212)DNA

(213)大肠杆菌

(220)

(221)CDS

(223)(1)..(639)

(400)11

gtg ttc gct gaa tac ggg gtt ctg aat tac tgg acc tat ctg gtt ggg 48

Met Phe Ala Glu Tyr Gly Val Leu Asn Tyr Trp Thr Tyr Leu Val Gly

1 5 10 15

gcc att ttt att gtg ttg gtg cca ggg cca aat acc ctg ttt gta ctc 96

Ala Ile Phe Ile Val Leu Val Pro Gly Pro Asn Thr Leu Phe Val Leu

20 25 30

aaa aat agc gtc agt agc ggt atg aaa ggc ggt tat ctt gcg gcc tgc 144

Lys Asn Ser Val Ser Ser Gly Met Lys Gly Gly Tyr Leu Ala Ala Cys

35 40 45

ggt gta ttt att ggc gat gcg gta ttg atg ttt ctg gca tgg gct gga 192

Gly Val Phe Ile Gly Asp Ala Val Leu Met Phe Leu Ala Trp Ala Gly

50 55 60

gtg gcg aca tta att aag acc acc ccg ata tta ttc aac att gta cgt 240

Val Ala Thr Leu Ile Lys Thr Thr Pro Ile Leu Phe Asn Ile Val Arg

65 70 75 80

tat ctt ggt gcg ttt tat ttg ctc tat ctg ggg agt aaa att ctt tac 288

Tyr Leu Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Tyr Leu Gly Ser Lys Ile Leu Tyr

85 90 95

gcg acc ctg aag ggt aaa aat agc gag gcc aaa tcc gat gag ccc caa 336

Ala Thr Leu Lys Gly Lys Asn Ser Glu Ala Lys Ser Asp Glu Pro Gln

100 105 110

tac ggt gct att ttt aaa cgc gcg tta att ttg agc ctg act aat ccg 384

Tyr Gly Ala Ile Phe Lys Arg Ala Leu Ile Leu Ser Leu Thr Asn Pro

115 120 125

aaa gcc att ttg ttc tat gtg tcg ttt ttc gta cag ttt atc gat gtt 432

Lys Ala Ile Leu Phe Tyr Val Ser Phe Phe Val Gln Phe Ile Asp Val

130 135 140

aat gcc cca cat acg gga att tca ttc ttt att ctg gcg gcg acg ctg 480

Asn Ala Pro His Thr Gly Ile Ser Phe Phe Ile Leu Ala Ala Thr Leu

145 150 155 160

gaa ctg gtg agt ttc tgc tat ttg agc ttc ctg att ata tct ggt gct 528

Glu Leu Val Ser Phe Cys Tyr Leu Ser Phe Leu Ile Ile Ser Gly Ala

165 170 175

ttt gtc acg cag tac ata cgt acc aaa aag aaa ctg gct aaa gtt ggc 576

Phe Val Thr Gln Tyr Ile Arg Thr Lys Lys Lys Leu Ala Lys Val Gly

180 185 190

aac tca ctg att ggt ttg atg ttc gtg ggt ttc gct gcc cga ctg gcg 624

Asn Ser Leu Ile Gly Leu Met Phe Val Gly Phe Ala Ala Arg Leu Ala

195 200 205

acg ctg caa tcc tga 639

Thr Leu Gln Ser

210

(210)12

(211)212

(212)PRT

(213)大肠杆菌

(400)12

Met Phe Ala Glu Tyr Gly Val Leu Asn Tyr Trp Thr Tyr Leu Val Gly

1 5 10 15

Ala Ile Phe Ile Val Leu Val Pro Gly Pro Asn Thr Leu Phe Val Leu

20 25 30

Lys Asn Ser Val Ser Ser Gly Met Lys Gly Gly Tyr Leu Ala Ala Cys

35 40 45

Gly Val Phe Ile Gly Asp Ala Val Leu Met Phe Leu Ala Trp Ala Gly

50 55 60

Val Ala Thr Leu Ile Lys Thr Thr Pro Ile Leu Phe Asn Ile Val Arg

65 70 75 80

Tyr Leu Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Tyr Leu Gly Ser Lys Ile Leu Tyr

85 90 95

Ala Thr Leu Lys Gly Lys Asn Ser Glu Ala Lys Ser Asp Glu Pro Gln

100 105 110

Tyr Gly Ala Ile Phe Lys Arg Ala Leu Ile Leu Ser Leu Thr Asn Pro

115 120 125

Lys Ala Ile Leu Phe Tyr Val Ser Phe Phe Val Gln Phe Ile Asp Val

130 135 140

Asn Ala Pro His Thr Gly Ile Ser Phe Phe Ile Leu Ala Ala Thr Leu

145 150 155 160

Glu Leu Val Ser Phe Cys Tyr Leu Ser Phe Leu Ile Ile Ser Gly Ala

165 170 175

Phe Val Thr Gln Tyr Ile Arg Thr Lys Lys Lys Leu Ala Lys Val Gly

180 185 190

Asn Ser Leu Ile Gly Leu Met Phe Val Gly Phe Ala Ala Arg Leu Ala

195 200 205

Thr Leu Gln Ser

210

(210)13

(211)588

(212)DNA

(213)大肠杆菌

(220)

(221)CDS

(222)(1)..(588)

(400)13

gtg aca ccg acc ctt tta agt gct ttt tgg act tac acc ctg att acc 48

Met Thr Pro Thr Leu Leu Ser Ala Phe Trp Thr Tyr Thr Leu Ile Thr

1 5 10 15

gct atg acg cca gga ccg aac aat att ctc gcc ctt agc tct gct acg 96

Ala Met Thr Pro Gly Pro Asn Asn Ile Leu Ala Leu Ser Ser Ala Thr

20 25 30

tcg cat gga ttt cgt caa agt acc cgc gtg ctg gca ggg atg agt ctg 144

Ser His Gly Phe Arg Gln Ser Thr Arg Val Leu Ala Gly Met Ser Leu

35 40 45

gga ttt ttg att gtg atg tta ctg tgt gcg ggc att tca ttt tca ctg 192

Gly Phe Leu Ile Val Met Leu Leu Cys Ala Gly Ile Ser Phe Ser Leu

50 55 60

gca gtg att gac ccg gca gcg gta cac ctt ttg agt tgg gcg ggg gcg 240

Ala Val Ile Asp Pro Ala Ala Val His Leu Leu Ser Trp Ala Gly Ala

65 70 75 80

gca tat att gtc tgg ctg gcg tgg aaa atc gcc acc agc cca aca aag 288

Ala Tyr Ile Val Trp Leu Ala Trp Lys Ile Ala Thr Ser Pro Thr Lys

85 90 95

gaa gac gga ctt cag gca aaa cca atc agc ttt tgg gcc agc ttt gct 336

Glu Asp Gly Leu Gln Ala Lys Pro Ile Ser Phe Trp Ala Ser Phe Ala

100 105 110

ttg cag ttt gtg aac gtc aaa atc att ttg tac ggt gtt acg gca ctg 384

Leu Gln Phe Val Asn Val Lys Ile Ile Leu Tyr Gly Val Thr Ala Leu

115 120 125

tcg acg ttt gtt ctg ccg caa aca cag gcg tta agc tgg gta gtt ggc 432

Ser Thr Phe Val Leu Pro Gln Thr Gln Ala Leu Ser Trp Val Val Gly

130 135 140

gtc agc gtt ttg ctg gcg atg att ggg acg ttt ggc aat gtg tgc tgg 480

Val Ser Val Leu Leu Ala Met Ile Gly Thr Phe Gly Asn Val Cys Trp

145 150 155 160

gcg ctg gcg ggg cat ctg ttt cag cga ttg ttt cgc cag tat ggt cgc 528

Ala Leu Ala Gly His Leu Phe Gln Arg Leu Phe Arg Gln Tyr Gly Arg

165 170 175

cag tta aat atc gtg ctt gcc ctg ttg ctg gtc tat tgc gcg gta cgc 576

Gln Leu Asn Ile Val Leu Ala Leu Leu Leu Val Tyr Cys Ala Val Arg

180 185 190

att ttc tat taa 588

Ile Phe Tyr

195

(210)14

(211)195

(212)PRT

(213)大肠杆菌

(400)14

Met Thr Pro Thr Leu Leu Ser Ala Phe Trp Thr Tyr Thr Leu Ile Thr

1 5 10 15

Ala Met Thr Pro Gly Pro Asn Asn Ile Leu Ala Leu Ser Ser Ala Thr

20 25 30

Ser His Gly Phe Arg Gln Ser Thr Arg Val Leu Ala Gly Met Ser Leu

35 40 45

Gly Phe Leu Ile Val Met Leu Leu Cys Ala Gly Ile Ser Phe Ser Leu

50 55 60

Ala Val Ile Asp Pro Ala Ala Val His Leu Leu Ser Trp Ala Gly Ala

65 70 75 80

Ala Tyr Ile Val Trp Leu Ala Trp Lys Ile Ala Thr Ser Pro Thr Lys

85 90 95

Glu Asp Gly Leu Gln Ala Lys Pro Ile Ser Phe Trp Ala Ser Phe Ala

100 105 110

Leu Gln Phe Val Asn Val Lys Ile Ile Leu Tyr Gly Val Thr Ala Leu

115 120 125

Ser Thr Phe Val Leu Pro Gln Thr Gln Ala Leu Ser Trp Val Val Gly

130 135 140

Val Ser Val Leu Leu Ala Met Ile Gly Thr Phe Gly Asn Val Cys Trp

145 150 155 160

Ala Leu Ala Gly His Leu Phe Gln Arg Leu Phe Arg Gln Tyr Gly Arg

165 170 175

Gln Leu Asn Ile Val Leu Ala Leu Leu Leu Val Tyr Cys Ala Val Arg

180 185 190

Ile Phe Tyr

195

(210)15

(211)636

(212)DNA

(213)大肠杆菌

(220)

(221)CDS

(222)(1)..(636)

(400)15

gtg ttt tct tat tac ttt caa ggt ctt gca ctt ggg gcg gct atg atc 48

Met Phe Ser Tyr Tyr Phe Gln Gly Leu Ala Leu Gly Ala Ala Met Ile

1 5 10 15

cta ccg ctc ggt cca caa aat gct ttt gtg atg aat cag ggc ata cgt 96

Leu Pro Leu Gly Pro Gln Asn Ala Phe Val Met Asn Gln Gly Ile Arg

20 25 30

cgt cag tac cac att atg att gcc tta ctt tgt gct atc agc gat ttg 144

Arg Gln Tyr His Ile Met Ile Ala Leu Leu Cys Ala Ile Ser Asp Leu

35 40 45

gtc ctg att tgc gcc ggg att ttt ggt ggc agc gcg tta ttg atg cag 192

Val Leu Ile Cys Ala Gly Ile Phe Gly Gly Ser Ala Leu Leu Met Gln

50 55 60

tcg ccg tgg ttg ctg gcg ctg gtc acc tgg ggc ggc gta gcc ttc ttg 240

Ser Pro Trp Leu Leu Ala Leu Val Thr Trp Gly Gly Val Ala Phe Leu

65 70 75 80

ctg tgg tat ggt ttt ggc gct ttt aaa aca gca atg agc agt aat att 288

Leu Trp Tyr Gly Phe Gly Ala Phe Lys Thr Ala Met Ser Ser Asn Ile

85 90 95

gag tta gcc agc gcc gaa gtc atg aag caa ggc aga tgg aaa att atc 336

Glu Leu Ala Ser Ala Glu Val Met Lys Gln Gly Arg Trp Lys Ile Ile

100 105 110

gcc acc atg ttg gca gtg acc tgg ctg aat ccg cat gtt tac ctg gat 384

Ala Thr Met Leu Ala Val Thr Trp Leu Asn Pro His Val Tyr Leu Asp

115 120 125

act ttt gtt gta ctg ggc agc ctt ggc ggg caa ctt gat gtg gaa cca 432

Thr Phe Val Val Leu Gly Ser Leu Gly Gly Gln Leu Asp Val Glu Pro

130 135 140

aaa cgc tgg ttt gca ctc ggg aca att agc gcc tct ttc ctg tgg ttc 480

Lys Arg Trp Phe Ala Leu Gly Thr Ile Ser Ala Ser Phe Leu Trp Phe

145 150 155 160

ttt ggt ctg gct ctt ctc gca gcc tgg ctg gca ccg cgt ctg cgc acg 528

Phe Gly Leu Ala Leu Leu Ala Ala Trp Leu Ala Pro Arg Leu Arg Thr

165 170 175

gca aaa gca cag cgc att atc aat ctg gtt gtg gga tgt gtt atg tgg 576

Ala Lys Ala Gln Arg Ile Ile Asn Leu Val Val Gly Cys Val Met Trp

180 185 190

ttt att gcc ttg cag ctg gcg aga gac ggt att gct cat gca caa gcc 624

Phe Ile Ala Leu Gln Leu Ala Arg Asp Gly Ile Ala His Ala Gln Ala

195 200 205

ttg ttc agt tag 636

Leu Phe Ser

210

(210)16

(211)211

(212)PRT

(213)大肠杆菌

(400)16

Met Phe Ser Tyr Tyr Phe Gln Gly Leu Ala Leu Gly Ala Ala Met Ile

1 5 10 15

Leu Pro Leu Gly Pro Gln Asn Ala Phe Val Met Asn Gln Gly Ile Arg

20 25 30

Arg Gln Tyr His Ile Met Ile Ala Leu Leu Cys Ala Ile Ser Asp Leu

35 40 45

Val Leu Ile Cys Ala Gly Ile Phe Gly Gly Ser Ala Leu Leu Met Gln

50 55 60

Ser Pro Trp Leu Leu Ala Leu Val Thr Trp Gly Gly Val Ala Phe Leu

65 70 75 80

Leu Trp Tyr Gly Phe Gly Ala Phe Lys Thr Ala Met Ser Ser Asn Ile

85 90 95

Glu Leu Ala Ser Ala Glu Val Met Lys Gln Gly Arg Trp Lys Ile Ile

100 105 110

Ala Thr Met Leu Ala Val Thr Trp Leu Asn Pro His Val Tyr Leu Asp

115 120 125

Thr Phe Val Val Leu Gly Ser Leu Gly Gly Gln Leu Asp Val Glu Pro

130 135 140

Lys Arg Trp Phe Ala Leu Gly Thr Ile Ser Ala Ser Phe Leu Trp Phe

145 150 155 160

Phe Gly Leu Ala Leu Leu Ala Ala Trp Leu Ala Pro Arg Leu Arg Thr

165 170 175

Ala Lys Ala Gln Arg Ile Ile Asn Leu Val Val Gly Cys Val Met Trp

180 185 190

Phe Ile Ala Leu Gln Leu Ala Arg Asp Gly Ile Ala His Ala Gln Ala

195 200 205

Leu Phe Ser

210

(210)17

(211)20

(212)DNA

(213)人工序列

(220)

(223)人工序列描述：扩增大肠杆菌yahN基因的引物

(400)17

gtgtggaacc gacgccggat 20

(210)18

(211)23

(212)DNA

(213)人工序列

(220)

(223)人工序列描述：扩增大肠杆菌yahN基因的引物

(400)18

tgttgtatgg tacggggttc gag 23

(210)19

(211)20

(212)DNA

(213)人工序列

(220)

(223)人工序列描述：扩增大肠杆菌yeaS基因的引物

(400)19

ctttgccaat cccgtctccc 20

(210)20

(211)20

(212)DNA

(213)人工序列

(220)

(223)人工序列描述：扩增大肠杆菌yeaS基因的引物

(400)20

gccccatgca taacggaaag 20

(210)21

(211)26

(212)DNA

(213)人工序列

(220)

(223)人工序列描述：扩增大肠杆菌yfiK基因的引物

(400)21

gaagatcttg taggccggat aaggcg 26

(210)22

(211)20

(212)DNA

(213)人工序列

(220)

(223)人工序列描述：扩增大肠杆菌yfiK基因的引物

(400)22

tggttttacc aattggccgc 20

(210)23

(211)21

(212)DNA

(213)人工序列

(220)

(223)人工序列描述：扩增大肠杆菌yggA基因的引物

(400)23

acttctcccg cgagccagtt c 21

(210)24

(211)21

(212)DNA

(213)人工序列

(220)

(223)人工序列描述：扩增大肠杆菌yggA基因的引物

(400)24

ggcaagctta gcgcctctgt t 21

Claims

1.具有产生L-氨基酸能力的属于大肠杆菌的细菌，其中产生L-氨基酸能力通过增加选自以下(A)到(B)的至少一种蛋白的表达量得到提高：

(A)具有序列表中SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的蛋白；和

(B)具有在序列表中SEQ ID NO：10所示氨基酸序列中有一个或几个氨基酸缺失、置换、插入、增加或倒位的氨基酸序列的蛋白，该蛋白具有增加含该蛋白的细菌产生L-氨基酸的能力的活性。

2.权利要求1的细菌，其中所述L-氨基酸为L-赖氨酸。

3.权利要求1的细菌，其中所述L-氨基酸为L-谷氨酸。

4.权利要求1的细菌，其中所述L-氨基酸为L-脯氨酸。

5.权利要求1到4任一项的细菌，其中细胞中编码所述蛋白的DNA的拷贝数增加。

6.权利要求5的细菌，其中所述DNA携带在细胞中的多拷贝载体上。

7.权利要求5的细菌，其中所述DNA携带在细胞中的转座子上。

8.生产L-氨基酸的方法，包括下列步骤：

在培养基中培养权利要求1的细菌，以在培养基中产生和积累L-氨基酸，和

从培养基中回收L-氨基酸。

9.权利要求8的方法，其中所述L-氨基酸是L-赖氨酸。

10.权利要求8的方法，其中所述L-氨基酸为L-谷氨酸。

11.权利要求8的方法，其中所述L-氨基酸为L-脯氨酸。

12.权利要求8-11中任一项的方法，其中所述细菌细胞中编码所述蛋白的DNA的拷贝数增加。

13.权利要求12的方法，其中所述DNA携带在细胞中的多拷贝载体上。

14.权利要求12的方法，其中所述DNA携带在细胞中的转座子上。