CN1550546A

CN1550546A - 通过发酵生产l—精氨酸或l—赖氨酸的方法

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Publication number: CN1550546A
Application number: CNA2004100330506A
Authority: CN
Inventors: 松崎友美; ��һ; 中村纯; 桥口贤一
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2003-03-03
Filing date: 2004-03-03
Publication date: 2004-12-01
Anticipated expiration: 2024-03-03
Also published as: KR101086205B1; CN100366731C; EP1460128A1; US20050014236A1; KR20040078588A; EP1460128B1

Abstract

培养具有L－精氨酸或L－赖氨酸生产能力的棒状杆菌以获得L－精氨酸或L－赖氨酸，对该菌进行修饰，使得谷氨酰胺合成酶的活性得到提高，例如，在培养基中修饰棒状杆菌，使得谷氨酰胺合成酶活性的腺苷酰化调节作用被消除，从而在培养基中生产并富集L－精氨酸或L－赖氨酸，并从培养基收集L－精氨酸或L－赖氨酸。

Description

通过发酵生产L-精氨酸或L-赖氨酸的方法

技术领域

本发明涉及通过使用棒状杆菌生产L-氨基酸，具体为L-精氨酸和L-赖氨酸的方法。L-精氨酸是工业上有用的氨基酸，可作为肝脏功能促进剂，氨基酸输液，广泛的氨基酸药剂等等的成分，L-赖氨酸同样是工业上有用的氨基酸，可作为动物饲料添加剂，健康食品组分，氨基酸输液等。

背景技术

对微生物的育种和改良已经经常用于通过发酵的L-氨基酸生产中。就是说由于在很多情况下野生型菌株自身生产L-氨基酸的能力非常低，故通过突变赋予营养缺陷或类似物抗性或者赋予代谢调节突变的方法或者联合使用这些方法，这些都已为本领域所知晓。根据上述方法可获得合适产量的L-氨基酸。但为了在工业上以低成本生产L-氨基酸，进一步改进发酵产量是绝对有必要的。

一般认为，为了提高发酵产量，优选的方法是对氨基酸生物合成途径中的酶活性进行优化，即强化从碳源生产氨基酸的生物合成系统。

碱性氨基酸具有特别高的氮含量。精氨酸分子包含6个碳原子和4个氮原子，而赖氨酸分子包含6个碳原子和2个氮原子。

在氨基酸发酵中，一般认为氮代谢的重要程度不低于碳代谢，为了提高发酵产量，对氮代谢过程的修饰与对碳代谢过程的修饰具有同样的重要性。在氨基酸生物合成系统中，是通过包含于谷氨酸中氨基的转氨基作用来加入氮原子的。因此，一般认为增加细胞内谷氨酰胺和谷氨酸的浓度可以提高氨基酸的发酵产量。

编码α-酮戊二酸脱氢酶的odhA基因的缺失已被证明可作为增高谷氨酸浓度的方法(WO95/34672)，增强编码谷氨酰胺合成酶的glnA基因已被证明可作为增高谷氨酰胺浓度的方法(欧洲专利公开号1229121)。此外，现已公开谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化作用的消除是一种能有效增强L-谷氨酰胺供给途径的方法(欧洲专利公开号1229121)。

但是，对棒状杆菌而言，L-谷氨酰胺或L-谷氨酸生物合成的增强对L-精氨酸或L-赖氨酸生产能力的影响还是未知的。

发明内容

本发明的目的之一是通过修饰棒状杆菌氮代谢途径，从而提高L-氨基酸特别是L-精氨酸和L-赖氨酸的发酵产量。

本发明的另一目的是提供一种具有L-精氨酸或L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌，且所述杆菌被修饰以致其谷氨酰胺合成酶活性增强。

本发明的另一目的是提供一种上述棒状杆菌，所述棒状杆菌被修饰以致消除了由腺苷酰化所导致的谷氨酰胺合成酶的活性调节。

本发明的另一目的是提供一种上述棒状杆菌，其中由如下一个或多个特征消除由腺苷酰化所导致的谷氨酰胺合成酶的功能活性：

a)细菌包含谷氨酰胺合成酶，所述酶的由腺苷酰化导致的活性调节被消除，

b)谷氨酰胺合成酶腺苷酰转移酶的胞内活性被降低，

c)PII蛋白的胞内活性被降低，和

d)氮代谢调节蛋白质被修饰以致谷氨酰胺合成酶的胞内活性增强。

本发明的另一目的是提供一种上述棒状杆菌，其中染色体上编码谷氨酰胺合成酶腺苷酰转移酶的基因被破坏。

本发明的另一目的是提供一种上述棒状杆菌，其中所述的氮代谢调节蛋白为amtR基因产物，且由于此基因产物不能发挥正常功能而导致谷氨酰胺合成酶的活性增加。

本发明的另一目的是提供一种上述棒状杆菌，其中染色体上的amtR基因被破坏。

本发明的另一目的是提供一种上述棒状杆菌，其被修饰以致精氨酸阻抑物不能发挥正常功能。

本发明的另一目的是提供一种上述棒状杆菌，其中染色体上编码精氨酸阻抑物的基因被破坏。

本发明的另一目的是提供一种生产L-精氨酸或L-赖氨酸的方法，所述方法包括：

a)在培养基中培养根据(1)至(8)中任一项的棒状杆菌，以生产和积累L-精氨酸或L-赖氨酸，和

b)从该培养基中收集L-精氨酸或L-赖氨酸。

根据本发明，在使用棒状杆菌通过发酵生产L-精氨酸或L-赖氨酸的过程中，L-精氨酸或L-赖氨酸的发酵产量可以通过修饰氮代谢调节从而得以提高。而且，本发明的DNA可被用于繁育能够生产L-精氨酸或L-赖氨酸的棒状杆菌。

具体实施方式

本发明的发明人进行了大量的研究以便达到上述目的。结果，他们发现，在包括谷氨酰胺合成酶腺苷酰化为主要部分的氮代谢调节机制被修饰的棒状杆菌中，由于谷氨酰胺和谷氨酸胞内浓度的增加，表现出超强的发酵生产氨基酸的能力，具体而言为发酵生产L-精氨酸和L-赖氨酸的能力。

下文中，将详细描述本发明。

用于构建本发明细菌的棒状杆菌

棒状杆菌包括已经被划分为短杆菌属，但是目前统一称为棒状杆菌属的那些(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1981))，并且包括属于与棒状杆菌属密切相关的短杆菌属的细菌。这样的棒状杆菌的实例介绍如下：

嗜乙酰乙酸棒状杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)

醋谷棒状杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)

alkanolyticum棒状杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)

美棒状杆菌(Corynebacterium callunae)

谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)

百合花棒状杆菌(Corynebacterium lilium)

melassecola棒状杆菌(Corynebacterium melassecola)

thermoaminogenes棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)

力士棒状杆菌(Corynebacterium herculis)

扩展短杆菌(Brevibacterium divaricatum)

黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)

immariophilum短杆菌(Brevibacterium immariophilum)

乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)

玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)

解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)

生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)

产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)

白色短杆菌(Brevibacterium album)

蜡状短杆菌(Brevibacterium cerinum)

嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)

具体地，下面例举了这些细菌的菌株

嗜乙酰乙酸棒状杆菌ATCC13870

醋谷棒状杆菌ATCC15806

alkanolyticum棒状杆菌ATCC21511

美棒状杆菌ATCC15991

谷氨酸棒状杆菌ATCC13020，ATCC13032，ATCC13060

百合花棒状杆菌ATCC15990

melassecola棒状杆菌ATCC17965

efficiens棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)AJ12340(FERM BP-1539)

力士棒状杆菌ATCC13868

扩展短杆菌ATCC14020

黄色短杆菌ATCC13826，ATCC14067，AJ12418(FERM BP-2205)

immariophilum短杆菌ATCC14068

乳发酵短杆菌ATCC13869

玫瑰色短杆菌ATCC13825

解糖短杆菌ATCC14066

生硫短杆菌ATCC19240

产氨短杆菌ATCC6871，ATCC6872

白色短杆菌ATCC15111

蜡状短杆菌ATCC15112

嗜氨微杆菌ATCC15354

这些菌株可以获自如美国典型培养物保藏中心(美国，VA 20110-2209，Manassas，Boulevard大学10801)。就是说，各个菌株有其指定的保藏号，根据各个菌株的保藏号可以请求提供这些菌株。在美国典型培养物保藏中心的目录中已标明对应于各个菌株的保藏号。

此外，AJ12340菌株于1987年10月27日保藏于通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(现为，独立行政机构，独立行政法人产业技术综合研究所，国际专利生物保藏单位(Chou Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，邮编：305-5466))作为布达佩斯条约下的国际保藏，保藏号为FERM BP-1539。AJ12418菌株于1989年1月5日保藏于通产省工业技术院生命工学工业技术研究所作为布达佩斯条约下的国际保藏，保藏号为FERMBP-2205。

本发明中，术语“生产L-精氨酸的能力”是指在培养基中培养本发明的菌株时，在培养基中积累L-精氨酸的能力。这种生产L-精氨酸的能力可以是棒状杆菌野生菌株自身固有特性，也可以是通过繁育而被赋予或增强的特性。

本发明中，术语“生产L-赖氨酸的能力”是指在培养基中培养本发明的菌株时，在培养基中积累L-赖氨酸的能力。这种生产L-赖氨酸的能力可以是棒状杆菌野生菌株自身固有特性，也可以是通过繁育而被赋予或增强的特性。

具有生产L-赖氨酸或L-精氨酸的能力的棒状杆菌可以通过赋予棒状杆菌野生型菌株生产L-赖氨酸或L-精氨酸的能力而获得。用于繁育棒状杆菌，埃希氏菌等的常规方法可以用于赋予其生产L-赖氨酸或L-精氨酸的能力。例如，所述方法包括，但不限于获得营养缺陷型突变株，类似物抗性株或代谢调节突变株，生成重组株，所述重组株中L-赖氨酸或L-精氨酸的生物合成系统酶得以增强(参见“氨基酸发酵”，the Japan Scientific Societies Press[Gakkai Shuppan中心]，第1版，1986年5月30日出版，77-100页)等。在繁育具有生产L-赖氨酸或L-精氨酸能力的菌株时，营养缺陷型、类似物抗性、代谢调节突变等特性可单独赋予或两项或多项联合赋予。所述生物合成系统酶可单独增强或两个或多个联合增强。此外，营养缺陷型、类似物抗性、代谢调节突变等特性的赋予可与增强生物合成系统酶联合使用。

具有L-精氨酸生产能力的棒状杆菌并非局限性的，只要它们具有生产L-精氨酸的能力即可。所述棒状杆菌的实例包括，但不限于耐特定药剂的棒状杆菌，所述药剂例如为磺胺类药物，2-噻唑丙氨酸，α-氨基-β羟基戊酸等；除耐2-噻唑丙氨酸外，还是L-组氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸或L-色氨酸营养缺陷型的棒状杆菌(日本专利特开平No.54-44096)；耐酮丙二酸、氟丙二酸或单氟乙酸的棒状杆菌(日本专利特开平No.57-18989)，耐精氨醇的棒状杆菌(日本专利特开平No.62-24075)；耐X-胍(X表示脂肪酸或脂肪链的衍生物，日本专利特开平No.2-186995)的棒状杆菌。

能产生L-精氨酸的棒状杆菌可被繁育为耐5-氮尿嘧啶、6-氮尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氮胞苷、6-氮胞苷等；其可被繁育为耐精氨酸氧肟酸(arginine hydroxamate)和耐2-硫脲嘧啶；可被繁育为耐精氨酸氧肟酸(arginine hydroxamate)和耐6-氮尿嘧啶(参见日本专利特开平No.49-126819)；可被繁育为耐组氨酸类似物或色氨酸类似物(参见日本专利特开平No.52-114092)；可被繁育为蛋氨酸、组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、腺嘌呤、鸟嘌呤和尿嘧啶(或尿嘧啶前体)中至少一种的营养缺陷型(参见日本专利特开平No.52-99289)；可被繁育为耐精氨酸氧肟酸(arginine hydroxamate)(参见日本专利公开号51-6754)；可被繁育为琥珀酸营养缺陷型或耐核酸碱基类似物(参见日本专利特开平No.58-9692)；可被繁育为代谢精氨酸能力缺失和被繁育为耐精氨酸拮抗剂及耐刀豆氨酸，以及被繁育为赖氨酸营养缺陷型(参见日本专利特开平No.52-8729)；可被繁育为耐精氨酸、精氨酸氧肟酸(arginine hydroxamate)、高精氨酸、D-精氨酸和刀豆氨酸，或者被繁育为耐精氨酸氧肟酸(arginine hydroxamate)和6-氮尿嘧啶(参见日本专利特开平No.53-143288)；可被繁育为耐刀豆氨酸(参见日本专利特开平No.53-3586)等等。

能生成L-精氨酸的棒状杆菌的具体实例包括如下菌株：

黄色短杆菌AJ11169(FERM P-4161)

乳发酵短杆菌AJ12092(FERM P-7273)

黄色短杆菌AJ11336(FERM P-4939)

黄色短杆菌AJ11345(FERM P-4948)

乳发酵短杆菌AJ12430(FERM BP-2228)

AJ11169株和AJ12092株为耐2-噻唑丙氨酸株，其公开于日本专利特开平No.54-44096中；AJ11336株为耐精氨醇和耐磺胺嘧啶的菌株，其公开于日本专利公开(KOKOKU)号62-24075；AJ11345株为具有耐精氨醇、2-噻唑丙氨酸、磺胺胍和组氨酸营养缺陷型的菌株，其公开于日本专利公开号62-24075；AJ12430株为辛基胍(octylguanidine)和耐2-噻唑丙氨酸的菌株，其公开于日本专利特开平No.2-186995中。

AJ11169菌株于1977年8月3日保藏于通产省工业技术院生命工学工业研究所(现为，独立行政机构，独立行政法人产业技术综合研究所，国际专利生物保藏单位(Chou Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，邮编：305-5466))保藏号为FERM P-4161。随后，根据布达佩斯条约，在1999年9月27号转为国际保藏，保藏号为FERM BP-6892。

AJ12092菌株于1983年9月29日保藏于通产省工业技术院生命工学工业研究所，保藏号为FERM P-7273。随后，根据布达佩斯条约，在1999年10月1号转为国际保藏，保藏号为FERM BP-6906。

AJ11336菌株于1979年4月25日保藏于通产省工业技术院生命工学工业研究所，保藏号为FERM P-4939。随后，根据布达佩斯条约，在1999年9月27号转为国际保藏，保藏号为FERM BP-6893。

AJ11345菌株于1979年4月25日保藏于通产省工业技术院生命工学工业研究所，保藏号为FERM P-4948。随后，根据布达佩斯条约，在1999年9月27号转为国际保藏，保藏号为FERM BP-6894。

AJ12430菌株于1988年12月26日保藏于通产省工业技术院生命工学工业研究所作为布达佩斯条约下的国际保藏，保藏号为FERM BP-2228。

通过下述引入突变的方法可以在繁育中赋予或增强L-赖氨酸的生产能力。所述人工突变体如下述：耐S-(2-氨基乙基)-半胱氨酸(下文中称为”AEC”)的突变体；生长需要某些氨基酸如高丝氨酸的突变体(参见日本专利公开号4828078和566499)；耐AEC及需要如L-亮氨酸、L-高丝氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸等氨基酸的突变体(参见美国专利公开号3,708,395和3,825,472)；耐DL-氨基己内酰胺，氨基十二烷基内酰胺、天冬氨酸类似物、磺胺药物、醌及N-十二烷基亮氨酸的能够生成L-赖氨酸的突变体和耐草酰乙酸脱羧酶或呼吸系统酶抑制剂的能够生成L-赖氨酸的突变体(参见日本专利特开平No.5053588，5031093，52102498，539394，5386089，559783，559759，5632995，5639778，日本专利公开号5343591，531833)；需要肌醇或乙酸的能够生成L-赖氨酸的突变体(参见日本专利特开平559784，568692)；对氟丙酮酸或对34℃或更高温度敏感的能够生成L-赖氨酸的突变体(参见日本专利特开平No.5386090)；属于短杆菌属或棒状杆菌属的细菌的耐乙二醇的能够生成L-赖氨酸的突变体(参见美国专利公开号4,411,997)。

下面将举例说明通过增强L-精氨酸或L-赖氨酸生物合成系统酶活性而赋予或增强L-氨基酸生成能力的方法。

增强酶活性的实现可以通过在编码酶的基因中引入突变，从而使该酶的胞内活性得以增强，或通过应用使用该基因的基因重组技术。

L-精氨酸生物合成途径中的酶可以是选自下述酶中的一种或多种：N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)、鸟氨酸氨甲酰转移酶(argF)、精氨基琥珀酸合成酶(argG)和精氨基琥珀酸裂解酶(argH)、氨甲酰磷酸合成酶(carAB)。编码这些酶的基因命名分别在每个酶后面的圆括号中给出。

可以增强由上述酶编码的蛋白活性的突变实例包括启动子序列突变，或基因编码区突变等，前者增加基因的转录数量，后者增加酶蛋白的比活性等。

而且，对于应用基因重组技术增强酶活性来说，可以通过下述方法实现，例如增加细胞内编码酶的基因的拷贝数。例如，可以通过将含有该基因的DNA片段与在微生物中行使功能的载体(优选多拷贝类型的载体)连接来制备重组DNA，然后用于转化微生物。

除了前述基于基因扩增的方法，增强基因表达还可以通过以下方法实现，如将染色体DNA或质粒上的基因的表达调控序列如启动子置换为更强的启动子(WO00/18935)。强启动子的实例包括lac启动子、trp启动子、trc启动子等。而且，还可以将核苷酸取代等引入lysE基因的启动子区域，使其修饰成为更强的启动子。启动子通过这样的取代或修饰可以增强基因的表达。这种表达调控序列的修饰可以与增加基因的拷贝数共同进行。

L-赖氨酸生物合成系统的基因的实例包括，例如，编码天冬氨酸激酶α-亚基蛋白或β-亚基蛋白的基因，所述亚基的经L-赖氨酸和L-苏氨酸的协同反馈抑制作用被脱敏化(国际专利申请WO94/25605)，来自棒状杆菌的野生型磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因(日本专利特开平No.60-87788)，编码来自棒状杆菌的野生型二氢吡啶二羧酸合成酶的基因(日本专利公开号6-55149)等等。

前述增强L-精氨酸生物合成系统酶活性的方法可同样适用于L-赖氨酸。

此外，可以通过修饰棒状杆菌使细菌细胞中的精氨酸阻抑物不能发挥正常功能，从而赋予或增强L-赖氨酸或L-精氨酸的生产能力。

精氨酸生物合成系统基因例如N-乙酰谷氨酰胺合成酶基因的表达通常会受到培养基中精氨酸的明显抑制。对棒状杆菌而言业已表明，L-精氨酸生物合成途径中一些酶的生成受到L-精氨酸的抑制。而且，有报道指出，虽然L-精氨酸生物合成途径中的一些酶会受到L-精氨酸的抑制，但是L-精氨酸对这些酶的抑制作用在一些棒状杆菌突变株中不存在，而且这些细菌还显示L-精氨酸积累量的增加(Agric.Biol.Chem.，43(1)，105，1979)。

此外，对于大肠杆菌来说，L-精氨酸生物合成系统的阻抑物(精氨酸阻抑物)及编码该阻抑物的基因业已被鉴定(Proc.Natl.Acad.Sci.美国，(1987)，84(19)6697-701)，并对阻抑物蛋白与多种L-精氨酸生物合成途径基因的相互作用进行了研究(Proc.Natl.Acad.Sci.，美国，(1987)，84(19)6697-701，J.Mol.Biol.(1992)，226，367-386)。

精氨酸是通过中间体如鸟氨酸和瓜氨酸经由精氨酸特殊生物合成途径而合成的，而且氨甲酰磷酸也参与该途径中。因此，为了增加精氨酸的发酵产量就有必要增强氨甲酰磷酸的合成途径。

氨甲酰磷酸是用碳酸盐离子，谷氨酰胺和ATP产生的。在棒状杆菌中，碳酸盐离子来自培养液，ATP生成自糖代谢过程中。因此，谷氨酰胺的供应对氨甲酰磷酸的生成是非常重要的。

基于上述内容，考虑L-赖氨酸和L-精氨酸的生产能力可通过将能使得精氨酸阻抑物不能发挥正常功能的修饰和下述的增加谷氨酰胺合成酶活性的方法联合实施从而得以更进一步的加强。

本发明“精氨酸阻抑物”是指具有抑制L-精氨酸生物合成效应的蛋白质，如果微生物中编码该蛋白质的基因表达数量增加，L-精氨酸生产能力即下降，而且如果该基因表达数量下降或者该蛋白消失，L-精氨酸生产能力即得到改善。下文中，编码精氨酸阻抑物的基因又称为argR基因。术语“精氨酸阻抑物不能发挥正常功能”是指与野生型菌株或未修饰菌株相比，精氨酸阻抑物的活性降低或消失。

黄色短杆菌的argR基因的核苷酸序列和其编码的氨基酸序列如SEQ IDNO：15中所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：16中所示。

在本发明中，精氨酸阻抑物为了降低其活性的目的，其可以具有包括在上述精氨酸阻抑物氨基酸序列的一个或多个位点缺失、取代、插入或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

“一个或多个”氨基酸残基数目的变化取决于氨基酸残基在蛋白质三维结构中的位置和氨基酸的类型。这是因为下述原因。就是说，一些氨基酸彼此具有高度同源性，而这些氨基酸之间的差异不会显著影响蛋白质的三维结构。因此，本发明的精氨酸阻抑物突变体可以是与组成精氨酸阻抑物的全部氨基酸残基具有30-50％或更高，优选50-70％或更高，更优选80-90％或更高，最优选95％或更高同源性的且具有精氨酸阻抑物活性的蛋白质。

编码与前述精氨酸阻抑物基本上相同的蛋白质的DNA包括在严格条件下可与argR基因杂交而且其编码的蛋白质具有精氨酸阻抑物活性的DNA。“严格条件”是指在该条件下，形成所谓的特异性杂交体，而不形成非特异性杂交体。应用任何数值来清楚阐明这种条件都是很困难的。但是，例如，严格条件包括这样的条件，在该条件下，具有高同源性的DNA，例如50％或更高同源性，优选70％或更高同源性，更优选80％或更高同源性，最优选90％或更高同源性的DNA可以彼此杂交，但同源性低于上述水平的DNA不能彼此杂交。或者，严格条件包括这样的条件：在该条件下，DNA在对应于Southern杂交的典型条件下，即1×SSC，0.1％SDS，优选0.1×SSC，0.1％ SDS，60℃下可以彼此杂交。

降低棒状杆菌的精氨酸阻抑物活性方法的实例包括：例如用紫外线照射或诱变处理中常用的诱变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸处理棒状杆菌，然后挑选出表现为精氨酸阻抑物活性降低的突变株。除了突变处理，表现为精氨酸阻抑物活性降低的棒状杆菌还可以获自以下方法：通过缺失argR基因的部分序列使得修饰后的编码精氨酸阻抑物的argR基因无法生成正常功能的精氨酸阻抑物，用含有这种argR基因(缺失型argR基因)的DNA转化棒状杆菌，使得上述缺失型argR基因与染色体上的argR基因之间发生重组从而破坏染色体上的argR基因。

后面所描述的glnE基因的基因破坏可以采用关于argR基因的基因破坏的同样方式而实施。

argR基因的来源没有特别限制，只要它具有一定程度的同源性，可以与靶微生物的argR基因进行同源重组。具体地说，棒状杆菌的argR基因包括，但不限于，上述黄色短杆菌的argR基因和谷氨酸棒杆菌的argR基因(GenBank编号AF049897)。这些argR基因高度同源，据信，即使与欲进行argR基因破坏的棒状杆菌分属于不同种属的棒状杆菌的argR基因，也可以用于该基因的破坏。

构建本发明的棒状杆菌

本发明的棒状杆菌为具有上述L-赖氨酸或L-精氨酸产生能力，且被修饰以便胞内谷氨酰胺合成酶(也称为“GS”)活性增强的棒状杆菌。

在对本发明的棒状杆菌繁育中，可首先实施L-赖氨酸或L-精氨酸生产能力的赋予，也可以首先实施GS活性的增强。

术语“修饰以便胞内GS活性增强”是指每个细胞的GS活性高于非修饰的菌株例如野生型棒状杆菌。例如，可指每个细胞中GS分子的数量增加的那些情况，每个GS分子中GS活性增加等等的那些情况。“GS活性”是指通过使用ATP而催化从谷氨酸和氨生成谷氨酰胺的反应的能力。此外，作为比较目的使用的野生型棒状杆菌可为，如乳发酵短杆菌ATCC13869。

具体的，优选GS活性增强的棒状杆菌，例如GS活性表现为100-150nmol/min/mg胞内蛋白或更高的棒状杆菌，或GS活性高于野生株2-3倍的棒状杆菌。但是，本发明的棒状杆菌不限于此。GS活性可以用公开于Journal ofFermentation and Bioengineering，Vol.70，No.3，182-184，1990中的方法进行测定。此外胞内蛋白可以用，如采用牛血清白蛋白标准物的蛋白试验(Bio-Rad)进行定量。

通过如增强编码GS的基因表达可以实现胞内谷氨酰胺合成酶活性增强。通过增加编码GS基因的拷贝数可以获得基因表达数量的增加。例如通过将编码GS的基因片段与在细菌中起作用的载体，优选的是多拷贝型载体连接制备重组DNA并用于转化棒状杆菌。

来自棒状杆菌或来自其它生物体如埃希氏杆菌属细菌的任何GS基因都是可以使用的。其中，由于易于表达而优选来自棒状杆菌的基因。

基因glnA(FEMS Microbiology Letters 81-88(154)，1997)和gln42(日本专利特开平No.2002-300887，EP1229121，L.Nolden等Microbiology Letters，201，(2001)91-98)已被报道为编码棒状杆菌GS的基因。

基因glnA的核苷酸序列及乳发酵短杆菌的该基因编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO：19中，氨基酸序列示于SEQ ID NO：20中。尽管，在SEQ ID Nos：19和20中公开的起始密码子(核苷酸1-3)编码的氨基酸为缬氨酸，但其非常可能为蛋氨酸。基因glnA2的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列公开于日本专利特开平No.2002-300887和EP1229121中。

本发明中，GS可以包括在一个或多个位点缺失、取代、插入或添加一个或多个氨基酸残基，只要GS活性不减低。氨基酸残基“两个或多个”的数量变化取决于根据氨基酸残基在蛋白质的三维结构的位置和氨基酸的类型。但本发明的GS的突变体可以是与组成GS的全部氨基酸残基具有30-50％或更高，优选50-70％或更高，更优选80-90％或更高，最优选95％或更高同源性的且具有GS活性的蛋白质。

编码与前述GS基本上相同的蛋白质的DNA包括在严格条件下可与glnA或glnA2基因杂交而且编码的蛋白质具有GS活性的DNA。严格条件包括这样的条件：在该条件下，具有高同源性例如具有50％或更高同源性，优选70％或更高同源性，更优选80％或更高同源性，最优选90％或更高同源性的DNA相互杂交，但低于上述同源性的DNA相互不杂交。或者，严格条件包括这样的条件：在该条件下，DNA在对应于Southern杂交的典型洗涤条件下，即1×SSC，0.1％SDS，优选0.1×SSC，0.1％SDS，60℃下杂交。

此外，可用修饰细菌而减少或消除谷氨酰胺合成酶腺苷酰化从而使得棒状杆菌的胞内谷氨酰胺合成酶活性增强。

通过腺苷酰化氨基酸序列中的酪氨酸残基，将GS转变为失活形式(Proc.Natl.Acad.Sci.，美国，642-649，(58)1967；J.Biol.Chem.，3769-3771，(243)1968)。所以可以通过消除GS腺苷酰化对其活性的控制，增强细胞内的GS活性。本文所用的腺苷酰化的减少或消除不仅指基本上完全消除腺苷酰化，而且指减少这样的腺苷酰化，从而使细胞内GS的活性增强。“减少”是指与野生型棒状杆菌菌株或未修饰的棒状杆菌菌株相比GS的腺苷酰化减少。作为比较目的使用的野生型棒状杆菌可为，如乳发酵短杆菌ATCC13869。

下文中将举例说明减少消除GS腺苷酰化活性控制的方法。

谷氨酰胺合成酶腺苷酰化位点的修饰

在大肠杆菌等中，GS的腺苷酰化通常会利用谷氨酰胺合成酶腺苷酰转移酶(下文称其为ATase，Proc.Natl.Acad.Sci.，美国，1703-1710页，(58)，1967)。在棒状杆菌中，GS通过谷氨酰胺合成酶腺苷酰转移酶的腺苷酰化而转变为非活性形式(FEMS Microbiology Letters，303-310，(173)，1999；FEMSMicrobiology Letters，201，(2001)，91-98)。有报道指出，在棒状杆菌中，Genebank登记号Y13221的序列所示的glnA基因产物的405位酪氨酸残基发生腺苷酰化(FEMS Microbiology Letters，303-310，(173)，1999)。这种腺苷酰化所引起的GS失活可通过下述方法消除：在glnA基因中导入突变从而使得酪氨酸残基被另一氨基酸残基，如苯丙氨酸残基所取代。

另外，前述glnA2基因产物与glnA基因产物一样都会受到腺苷酰化的活性控制。因此，由glnA2基因所编码的GS的腺苷酰化所导致的失活就可以通过如下方法得以消除，即在glnA2基因中引入突变以使405位酪氨酸残基相应的氨基酸残基被另一氨基酸残基如苯丙氨酸所替代。

编码消除了腺苷酰化所致活性控制的GS的DNA可通过如下方法获得，即修饰glnA或glnA2序列而使该序列包含突变，该突变能消除腺苷酰化对所编码的GS的活性控制。获得的突变基因可采用与前述增强L-精氨酸生物合成系统基因所使用的方法相似的任何方法而被引入棒状杆菌。

除了消除由腺苷酰化所致活性控制的突变以外，腺苷酰化位点被修饰的GS的氨基酸序列还可包含在一个或多个位点上缺失、取代、插入或添加一个或多个氨基酸残基，只要GS活性不减低。

谷氨酰胺合成酶腺苷酰转移酶活性的减低

消除腺苷酰化所致GS的活性控制还可以通过减低胞内谷氨酰胺合成酶腺苷酰转移酶(ATase)的活性而实现。减低ATase的活性这里不仅指完全消除其活性而且也指如下的活性减低，即与棒状杆菌的野生株或非修饰株相比胞内的ATase活性减低。例如，每个细胞内ATase分子的拷贝数量减少的那些情况，每个ATase分子ATase比活性减低等等的那些情况。作为比较目的使用的野生型棒状杆菌可为，如乳发酵短杆菌ATCC13869。

乳发酵短杆菌ATCC 13869株的基因glnE已经被阐明为编码ATase的基因(EP1229121)。该基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO：17中，氨基酸序列示于SEQ ID NO：18中。

在本发明中，为了降低其活性的目的，ATase可以具有包括在上述ATase的氨基酸序列的一个或多个位点缺失、取代、插入或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

氨基酸残基“两个或多个”的数量变化取决于氨基酸残基在蛋白质的三维结构的位置和氨基酸的类型。但本发明的ATase的突变体可以是与组成ATase的全部氨基酸残基具有30-50％或更高，优选50-70％或更高，更优选80-90％或更高，最优选95％或更高同源性的且具有ATase活性的蛋白质。

编码与前述ATase基本上相同的蛋白质的DNA包括在严格条件下与glnE基因杂交而且编码的蛋白质具有ATase活性的DNA。”严格条件”包括这样的条件，在该条件下，具有高同源性的DNA，例如50％或更高同源性，优选70％或更高同源性，更优选80％或更高同源性，最优选90％或更高同源性的DNA可以彼此杂交，但同源性低于上述水平的DNA不能彼此杂交。或者，严格条件包括这样的条件：在该条件下，DNA在对应于Southem杂交的典型洗涤条件下，即1×SSC，0.1％SDS，优选0.1×SSC，0.1％SDS，60℃下可以彼此杂交。

降低棒状杆菌的ATase活性方法的实例包括：例如用紫外线照射或诱变处理中常用的诱变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸处理棒状杆菌，然后挑选出表现为ATase活性降低的突变株。除了突变处理，表现为ATase活性降低的棒状杆菌还可以获自以下方法：通过缺失glnE基因的部分序列使得修饰后的ATase编码基因(glnE)无法生成正常功能的ATase，用含有这种glnE基因(缺失型glnE基因)的DNA转化棒状杆菌，使得上述缺失型glnE基因与染色体上的glnE基因之间发生重组从而破坏染色体上的glnE基因。通过同源重组进行基因取代的基因破坏已被建立，其中有利用线性DNA，含有温度敏感的复制起点的质粒等等的方法。

例如用下列方法可使宿主染色体上的glnE基因被缺失型glnE基因替代。即，通过插入温度敏感性复制起点、突变的glnE基因和对药物如氯霉素有抗性的标记基因制备重组DNA，然后用重组DNA转化棒状杆菌。另外，在温度敏感复制起点不发挥作用的温度下培养得到的转化体菌株，然后在含有药物的培养基中培养转化体菌株，得到染色体DNA中掺入重组DNA的转化体菌株。

在用上述方法将重组DNA掺入染色体DNA的菌株中，突变的glnE基因与原始存在于染色体上的glnE基因重组，并且染色体glnE基因和缺失型glnE基因的两个融合基因插入染色体中，从而重组DNA的其它部分(载体片段，温度敏感复制起点和药物抗性标记)即存在于两个融合基因之间。

在连接到质粒的glnE中，使用不包含任何启动子和起始密码子的内部序列。因此，GlnE的结构基因被重组DNA的其它部分(载体片段，温度敏感复制起点和药物抗性标记)存在于两个融合基因之间的这样的结构所打断，因此GlnE失去功能。

另外，缺失了内部序列的glnE同样可作为缺失型glnE而被使用。在这种情况下，染色体DNA中插入了染色体glnE和缺失型glnE的两个融合基因时，天然的glnE基因占绝对优势，因而转化菌株能够表达正常的ATase。这样，为了在染色体DNA上只保留缺失型glnE基因，采取了通过两个glnE基因重组而将一个拷贝glnE基因连同载体片段(包括温度敏感的复制起点和抗药性标记)从染色体DNA上去除的方法。这种情况下，让天然glnE基因保留在染色体DNA上，而将缺失型glnE基因从染色体上切除，或者相反的，让缺失型glnE基因保留在染色体DNA上，而将天然glnE基因从染色体上切除。在这两种情况下，当在温度敏感的复制起点可以起作用的温度下培养细胞时，被切除的DNA作为质粒保留在细胞中。随后，如果在温度敏感的复制起点不能起作用的温度中培养细胞时，该质粒上的glnE基因会连同质粒一起从细胞中消除。这样，可以通过PCR、Southern杂交或类似的方法选择一种染色体上保留了缺失型glnE基因的菌株，从而获得glnE基因已经被破坏的菌株。

或者，可以使用不能在棒状杆菌中自主复制的质粒代替上述温度敏感质粒进行基因破坏。不能在棒状杆菌中自主复制的质粒的例子包括pHSG299(TaksraShuzo)和pHSG399(Taksra Shuzo)等。

具有被破坏的glnE的菌株可用上述方法获得。

用于基因破坏的glnE基因的来源无具体限制，只要该glnE基因与棒状杆菌中原始包含的glnE基因之间的同源程度足以保证二者之间能够发生重组即可。例如，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的ATases(Genbank登记号为Z70692)和天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的ATases(Genbank登记号为Y17736)与棒状杆菌的Atase之间的同源性分别为51.9％和33.4％。(见日本专利特开平No.2002-300887，EP1229121)

降低PII蛋白活性

也可以通过降低PII蛋白的胞内活性来削弱GS的腺苷酰化失活。已知PII蛋白也参与了ATase对GS的腺苷酰化作用。PII蛋白是一种控制GS活性的信号转移蛋白，据悉它可以被尿苷酰基转移酶(UTase)尿苷酰化。尿苷酰化的PH蛋白可以促进ATase对GS的去腺苷酰化，并且去尿苷酰化的PII蛋白可以促进ATase对GS的腺苷酰化。

还有报道称，在UTase缺陷性菌株中，GS高度腺苷酰化(J.Bacteriology，569-577，(134)1978)。这一过度腺苷酰化的表型可以被PII蛋白的突变抑制(J.Bacteriology，816-822，(164)1985)。也就是说，GS的腺苷酰化失活也可以通过降低PII蛋白活性来削弱。降低PII蛋白的活性意味着降低用ATase促进腺苷酰化的功能。

除活性被完全消除的情况以外，降低PII蛋白的活性意味着，该棒状杆菌的PII蛋白活性比棒状杆菌野生菌株或非修饰菌株的低。例如，每个细胞中PII蛋白分子数目减少了的菌株，每PII蛋白分子的PII蛋白比活性降低了的菌株等，都包括在内。对比用的野生型棒状杆菌的实例包括，例如，乳发酵短杆菌ATCC 13869。已经分离出了编码棒状杆菌PII蛋白的glnB基因，并且表明GS的腺苷酰化对GS的抑制可以通过基因的缺失来削弱(见FEMS MicrobiologyLetters，303-310，(173)1999)。

早有证据表明乳发酵短杆菌的glnB基因就是编码PII蛋白的基因。(见EP1229121)。基团的核苷酸序列及其所编码的氨基酸见SEQ ID NO：23，氨基酸序列见SEQ ID NO：24。

在本发明中，作为降低活性目标的PII蛋白，其氨基酸序列可以包括在前述PH蛋白氨基酸序列的一个或多个位点上缺失、替代、插入或添加一个或者多个氨基酸残基。

“一个或多个”氨基酸残基的数量变化取决于随蛋白质三维结构上的氨基酸残基的位置以及氨基酸的类型。其理由如下。即，某些氨基酸彼此高度同源，他们之间的差别不足以对蛋白质的三维结构产生显著的影响。因而，本发明PII蛋白的突变体可以与构成PII蛋白的全部氨基酸残基之间具有30-50％或更高，优选50-70％或更高，更优选80-90％或更高，最优选95％或更高的同源性，并具有PII蛋白的活性。

编码与前述PII蛋白基本上相同蛋白的DNA，包括那些在严格条件下可与glnB基因杂交并且所编码的蛋白具有PII蛋白的活性的DNA。“严格条件”包括这样的条件，在该条件下，具有高同源性的DNA，例如50％或更高同源性，优选70％或更高同源性，更优选80％或更高同源性，最优选90％或更高同源性的DNA可以彼此杂交，但同源性低于上述水平的DNA不能彼此杂交。或者，严格条件包括这样的条件：在该条件下，DNA在对应于Southern杂交的典型条件下，即1×SSC，0.1％SDS，优选0.1×SSC，0.1％SDS，60℃下可以彼此杂交。

降低棒状杆菌PII蛋白活性方法的实例包括：例如，用紫外线照射或诱变处理中常用的诱变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸处理棒状杆菌，然后挑选出表现为PII蛋白活性降低的突变株。除了突变处理，表现为PII蛋白活性降低的棒状杆菌还可以获自以下方法：通过缺失glnB基因的部分序列使得修饰后的PII蛋白编码基因(glnB)无法生成正常功能的PII蛋白，用含有这种glnB基因(缺失型glnB基因)的DNA转化棒状杆菌，使得上述缺失型glnB基因与染色体上的glnB基因之间发生重组从而破坏染色体上的glnB基因。

这些对glnB基因的基因破坏均可采用前述对glnE基因的基因破坏方法。

(4)氮代谢机制的修饰

当氮代谢调节蛋白不能正常工作时，也可以消除利用GS腺苷酰化作用的活性控制。

“氮代谢调节蛋白”是一种将GS变为非活性状态机制中的的因子，该机制采用了腺苷酰化上述GS氨基酸序列中的酪氨酸残基的方法(谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化是该氮代谢调节机制的主要部分)，并且包括一个正因子和一个负因子。正因子能增加胞内GS的活性，负因子能降低胞内GS的活性。氮代谢调节蛋白不仅能调节GS，还可以调节铵离子掺入基因(amt，amtB)。随着细胞外铵离子浓度的增加，氮代谢调节蛋白降低了诸如amt和amtB等掺入基因的活性，从而抑制了铵离子的掺入。

众所周知，在大肠杆菌中，当胞内谷氨酰胺的浓度下降时，氮代谢调节蛋白的正因子——NRI，与调节glnD基因(该基因编码尿苷酰基转移酶(UTase))表达的启动子相结合，以增加glnD表达的量，尿苷酰化PII蛋白的增加，促进了ATase的去腺苷酰化作用，从而增加了GS的活性(见Mol.Microbaiology，(1998)(2)29，431-447)。

众所周知，在枯草芽孢杆菌中，当胞内谷氨酰胺的浓度下降时，氮代谢调节蛋白的负因子——TnrA或GlnR，从调节glnD基因(该基因编码尿苷酰基转移酶(UTase))表达的启动子解离，并且增加glnD表达的量，尿苷酰化PII蛋白的增加，促进了ATase的去腺苷酰化作用，从而增加了GS的活性。

利用GS腺苷酰化作用作为主要机制的氮代谢控制机制，可以用修饰氮代谢调节蛋白的方式进行修饰，从而恒定地增加GS的活性。当氮代谢调节基因是一个正因子时，可以用增强因子活性的方法来恒定地增加GS的活性，当其是一个负因子时，可以用降低因子活性的方法来恒定地增加GS的活性。

在棒状杆菌中，以GS腺苷酰化作用为主要部分的氮代谢调节机制用amtR基因的产物(AmtR)来控制，该产物是一种氮代谢负调节蛋白(见Mol.Microbiol.，37(4)：964-77，2000年8月)。因而，可以通过修饰amtR基因从而使AmtR不能发挥正常作用的方式增加GS的活性。“AmtR不能发挥正常作用”的含义是指，与棒状杆菌的野生菌株或未修饰菌株相比，AmtR的活性丧失或者降低，并且导致了GS活性的增加。

乳发酵短杆菌的amtR核苷酸序列及其所编码的氨基酸见SEQ ID NO：21，氨基酸序列见SEQ ID NO：22。

在本发明中，作为降低活性目标的AmtR，其氨基酸序列可以包括对前述AmtR氨基酸序列的一个或多个位点上的一个或者多个氨基酸残基的缺失、替代、插入或添加。

“一个或多个”氨基酸残基的数量变化取决于氨基酸残基在蛋白质三维结构上的位置以及氨基酸残基的类型。但是，本发明AmtR的突变体可以是与组成AmtR的全部氨基酸残基具有30-50％或更高，优选50-70％或更高，更优选80-90％或更高，最优选95％或更高同源性的且具有AmtR活性的蛋白质。

编码与前述AmtR基本上相同蛋白的DNA，包括那些在严格条件下与amtR基因杂交并且所编码的蛋白具有AmtR的活性的DNA。上述“严格条件”是指在该条件下，形成所谓的特异性杂交体，而不形成非特异性杂交体。例如，严格条件包括这样的条件，在该条件下，具有高同源性的DNA，例如50％或更高同源性，优选70％或更高同源性，更优选80％或更高同源性，最优选90％或更高同源性的DNA可以彼此杂交，但同源性低于上述水平的DNA不能彼此杂交。或者，严格条件包括这样的条件：在该条件下，DNA在对应于Southern杂交的典型条件下，即1×SSC，0.1％SDS，优选0.1×SSC，0.1％SDS，60℃下可以彼此杂交。

修饰棒状杆菌使其AmtR不能发挥正常功能方法的实例包括，例如，用紫外线照射或者用常用的诱变剂，例如，N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸，处理棒状杆菌，然后筛选具有降低AmtR活性的突变株。除了突变处理，表现为AmtR活性降低的棒状杆菌还可以获自以下方法：通过缺失amtR基因的部分序列使得修饰后的AmtR编码基因amtR无法生成正常功能的AmtR，用含有这种amtR基因(缺失型amtR基因)的DNA转化棒状杆菌，使得上述缺失型amtR基因与染色体上的amtR基因之间发生重组从而破坏染色体上的amtR基因。

这些对AmtR基因的基因破坏均可采用前述对glnE基因的基因破坏方法。

减少或消除GS腺苷酰化作用的方法可以综合两种或多种下述方法来实现：筛选不能被腺苷酰化的GS突变体，降低ATase活性，降低PII蛋白活性以及修饰上述氮代谢调节蛋白。

利用本发明提供的微生物生产L-精氨酸或L-赖氨酸

培养上述方法获得的棒状杆菌，积聚并收集培养基中的L-精氨酸或L-赖氨酸，可以高效的生产这两种氨基酸。

可采用常规方法进行培养，采用典型培养基，其中含有碳源、氮源、矿物盐以及所需要的诸如氨基酸、维生素等微量有机营养物。另外，合成或天然的培养基均可采用。只要菌株可以利用以进行培养，任何碳源和氮源均可采用。

就碳源而言，诸如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物，糖蜜等糖类，以及诸如醋酸、柠檬酸等有机酸，均可以采用。另外，乙醇等醇类也可以单独或者与其他碳源组合使用。

就有机微量营养素而言，氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸，含有蛋白胨、水解酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白分解产物等物质均可采用。当某种营养缺陷型突变株的生长需要一种氨基酸或类似的物质时，优选添加该需要的营养物。

就矿物盐而言，磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等等均可采用。

培养条件优选为有氧。培养温度控制在20-45℃，pH 5-9，培养过程中pH下降时，可以加入碳酸钙或者诸如氨气之类的碱予以中和。用上述方法培养10-120小时后，培养基中就会积聚大量的L-精氨酸或L-赖氨酸。

培养结束后，可以采用常规方法从发酵培养液中收集L-精氨酸或L-赖氨酸。例如，将培养液中的细胞去除后，再将培养液浓缩直至L-谷氨酰胺结晶，就可以收集L-精氨酸或L-赖氨酸。

实施例

下面，结合非限制性实施例对本发明做更为具体的解释。

参考实施例1：构建精氨酸阻抑物缺陷的棒状杆菌

(1)构建用于破坏argR质粒

用黄色短杆菌野生型菌株2247菌株(AJ14067)的染色体DNA作模板进行PCR扩增，所用引物为具有如SEQ ID NO：1(其对应于SEQ ID NO：15的核苷酸编号4-28)和SEQ ID NO：2(与SEQ ID NO：15的核苷酸编号4230-4211的序列互补)所示核苷酸序列的寡核苷酸。PCR循环30次，每次在98℃反应10秒，在58℃反应1分钟，在72℃反应3分钟，采用了Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo)。扩增片段插入到克隆载体pHSG399多克隆位点的SmaI位点上。

为了从插入的DNA片段上去除编码精氨酸阻抑物的整个ORF，PCR采用了具有如SEQ ID NO：3(相应于SEQ ID NO：15的核苷酸编号2372-2395)和SEQ ID NO：4(与SEQ ID NO：15的核苷酸编号1851-1827的序列互补)所示核苷酸序列的寡核苷酸为引物，以插入了扩增片段的pHSG399为模板。PCR产物自我连接，从而得到了pssER。

接下来，把用限制性内切酶SmaI和SalI消化pssER得到的片段与SmaI和SalI消化后的温度敏感质粒pSFKT2(见US6,303,383)连接，得到一种用于破坏argR的质粒pssERT，其在棒状杆菌中的自主复制能力成为温度敏感型。

(2)用同源重组法获得精氨酸阻抑物缺陷的棒状杆菌

将上述获得的pssERT质粒导入乳发酵短杆菌的野生型菌株2256(ATCC13869)中。质粒用电脉冲法导入(见日本专利特开平No.2-207791)。因为该质粒在乳发酵短杆菌中具有温度敏感的自主复制能力，所以只有已经用同源重组法将该质粒掺入染色体中的菌株才能被筛选出来，其作为抗卡那霉素的菌株于34℃被筛选出来，该温度中质粒不能复制。作为抗卡那霉素的菌株，用含有25μg/ml卡那霉素CM2G板(含有10g/L的聚胨，10g/L的酵母提取物，5g/L的葡萄糖，5g/L的氯化钠，15g/L的琼脂于1L水中，pH为7.2)筛选出染色体上掺入了破坏argR质粒的菌株。在该阶段，来源于染色体的天然argR基因与来源于质粒(该质粒去除了ORF)的argG基因串联于染色体质粒部分的两侧。

然后，让上述重组菌株再次同源重组，在34℃筛选出卡那霉素敏感型菌株，该温度下质粒不能复制，从而得到了缺失某个argR基因的菌株。这些菌株中包括了染色体上保留了天然argR基因的菌株，也包括了染色体上保留了破坏后的argR基因的菌株。再从这些菌株中筛选出仅具有破坏后的argR基因的菌株。确定染色体中argR基因是否被破坏的方法如下：于34℃制备卡那霉素敏感型菌株的染色体，用该染色体为模板进行PCR，用具有SEQ ID NO：1和2所示核苷酸序列的寡核苷酸序列为引物，然后确证该PCR产物是否比用来自亲本菌株的染色体为模板进行类似PCR扩增得到的产物短大约600bp。

用上述选择的argR破坏菌株的PCR产物直接测序，即可确认argR基因是否按需要被破坏，这样就得到了2256DR菌株。该菌株与其亲本相比，其L-精氨酸的产量有了显著的提高(见US2002045223 A1)。

实施例1：构建腺苷酰转移酶(GlnE)缺陷菌株

(1)制备为了去除GlnE所用的质粒

黄色短杆菌ATCC 14067的glnE序列早已清楚(见EP1229121 A2)。以报道的核苷酸序列为基础，合成了SEQ ID NOS：5和6所示的引物，用PCR的方法，以乳发酵短杆菌ATCC 13869菌株的染色体DNA为模板扩增了glnE的内部序列。

用细菌基因组DNA纯化试剂盒(Advanced Genetic Technologies Corp.)制备了乳发酵短杆菌ATCC 13869菌株的染色体DNA。PCR循环30次，每次在94℃变性30秒，在55℃退火15秒，在72℃延伸2分钟，并采用了PyrobestDNA聚合酶(Takara Shuzo)。

用常规方法纯化PCR产物，用Blunting试剂盒(Takara Shuzo)平端化。用Ligation试剂盒(Takara Shuzo)将平端PCR产物连接到pHSG299的HincII位点上，并用于转化大肠杆菌JM109(Takara Shuzo)的感受态细胞。所得细胞铺板于含有10μg/ml IPTG，40μg/ml X-Gal和25μg/ml卡那霉素的L-培养基上培养过夜。挑出白色菌落，并将其分散为单菌落，最终获得转化体。

用碱法从上述转化体中制备出质粒，并确证该质粒的结构。将载体中插入了glnE部分片段的质粒命名为pΔATase-299。

前述的pΔATase-299并不包括任何在棒状杆菌中可自主复制的序列。因而，如果用该质粒转化棒状杆菌，则该质粒因同源重组而掺入染色体的菌株表现为转化体，虽然它出现的频率极低。

(2)将pΔATase-299导入精氨酸阻抑物缺陷菌株，并测定氨基酸产量

通过电脉冲法(见日本专利特开平No.2-207791)用质粒pΔATase-299转化参考实施例1获得的精氨酸阻抑物缺陷菌株(2256ΔargR菌株)。将得到的转化体传代培养，并且使用卡那霉素抗性作为标记获得转化体，从而获得卡那霉素敏感菌株。菌株中glnE基因附近的序列用PCR扩增，并破坏其glnE基因，以确保获得2256ΔargR的glnE被破坏的菌株(2256ΔargRΔglnE)。用所获得的转化体2256ΔarRΔglnE生产L-精氨酸和L-赖氨酸的过程如下所述。

在CM2G板培养基中培养，培养基中含有25μg/ml卡那霉素，然后接种到含有40g葡萄糖，65g(NH₄)₂SO₄，1g KH₂PO₄，0.4g MgSO₄.7H₂O，0.01gFeSO₄，0.01g MnSO₄，50μg VB1-HCl，50μg生物素，45mg(N的数量)大豆水解物以及50gCaCO₃于1L纯水中(用KOH调节pH至7.0)的培养基中，于31.5℃中振荡培养，直至耗尽培养基中的糖份，从而获得2256ΔargRΔglnE细胞。

培养结束后，适当稀释培养液，用液相色谱分析其中积聚的L-精氨酸(Arg)的量，用Biotech分析仪(Asahi Chemical Industry)分析其中积聚的L-赖氨酸(Lys)和积聚的L-谷氨酸(Glu)的量，用液相色谱分析其中积聚的L-谷氨酰胺(Gln)和积聚物N-乙酰谷氨酸的量。分析结果见表1。

还分析了上述每一菌株的GS活性。GS活性分析方法如下，在含有100mM咪唑-HCL(pH7.0)，0.1mM NH₄CL，1mM MnCl₂，1mM磷酸烯醇丙酮酸，0.3mM NADH，10U乳酸脱氢酶，25U丙酮酸激酶，1mM ATP，10mM MSG的溶液中加入粗酶溶液，于30℃测定340nm处吸光率的变化，该方法详见Journalof Fermentation and Bioengineering，Vol.70，No.3，182-184，1990。测定空白组时，使用不含MSG的上述反应溶液。粗酶溶液的制备方法如下，先将上述培养液离心分离细胞，得到的细胞用100mM咪唑-HCL(pH7.0)洗涤，再用超声波破碎细胞，用离心法去除未破碎的细胞，从而分离得到粗酶溶液。用Protein Assay(Bio-Rad)测定粗酶溶液中蛋白质的浓度，其中采用牛血清白蛋白作为标准样品。结果如表2所示。

表1

菌株 Arg Lys Glu Gln N-乙酰谷氨酸(g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L)
菌株 Arg Lys Glu Gln N-乙酰谷氨酸(g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L)	2256ΔargR 2.28 0.81 0.32 0.19 0.01532256ΔargRΔglnE 3.18 1.32 0.4 0.2 0.0381

表2

菌株 GS活性(nmol/min/mg)
菌株 GS活性(nmol/min/mg)	2256ΔargR 51.22256ΔargRΔglnE 123.1

与亲本菌株(2256ΔargR)相比，GlnE缺陷菌株的L-精氨酸和L-赖氨酸积聚获得了提高。与亲本菌株相比，GlnE缺陷菌株的GS化活性提高了2.4倍。另外还观察到，作为L-精氨酸前体的N-乙酰谷氨酸和谷氨酸的产量也得到了提高。

2256ΔargRΔglnE菌株的私有编号为AJ110145，保藏于通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(现为，独立行政机构，独立行政法人产业技术综合研究所，国际专利生物保藏单位(Tsukuba Central 6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，邮编：305-5466)，保藏日期为2003年2月18日，保藏号为FERM P-19216。然后，依据布达佩斯条约于2004年2月19日转为国际保藏，保藏号为FERM BP-08630。

实施例2：GS腺苷酰化位点修饰的菌株的评估

(1)构建GlnA腺苷酰化位点修饰的质粒

棒状杆菌glnA基因产物(GlnA)的腺苷酰化位点早已清楚(见FEMSMicrobiology Letters，303-310，(173)1999)。用修饰过GlnA腺苷酰化位点的glnA基因取代染色体上的glnA基因，就获得了GlnA腺苷酰化位点修饰的菌株。下面将对其具体过程进行描述。

首先，用PCR的方法，以乳发酵短杆菌ATCC 13869菌株的染色体DNA为模板，以SEQ ID NOS：7和8所示合成的DNA为引物，获得了glnA基因的N-末端侧扩增产物。另外，为了获得glnA基因的C-末端侧扩增产物，PCR以乳发酵短杆菌ATCC 13869菌株的染色体DNA为模板，以SEQ ID NOS：9和10所示合成的DNA为引物。因为SEQ ID NOS：8和9所示的序列中导入了错配，所以每个扩增产物的末端部分均导入了突变。具体来讲，该突变使得405位上的酪氨酸残基被L-苯丙氨酸所取代。

为了获得导入了突变的glnA基因片段，以等量混合的glnA的N-和C-末端侧的前述基因产物作为模板，以SEQ ID NOS；10和11所示的合成DNA为引物，经PCR获得腺苷酰化位点引入了突变的glnA基因扩增产物。PCR产物用常规方法纯化，用HincII消化，然后插入pHSG299(Takar Shuzo)的HincII位点。该质粒被命名为pGSA2。

因为上述pGSA2并不含有使其可以在棒状杆菌中自主复制的区域，所以当用该质粒转化棒状杆菌时，该质粒因同源重组而掺入染色体的菌株表现为转化体，虽然它出现的频率极低。

(2)将pGSA2导入精氨酸阻抑物缺陷菌株，并测定氨基酸产量

以电脉冲法(见日本专利，特开平No.2-207791)用高浓度的质粒pGSA2转化，参考实施例1描述的源于乳发酵短杆菌ATCC 13869的ArgR缺陷菌株2256ΔR，以抗卡那霉素为标记得到了转化体。然后，将得到的转化体传代培养，以获得卡那霉素敏感菌株。测定每个转化体的glnE基因序列，将序列中腺苷酰化位点被来自pGSA2的glnA中该区域所取代的转化体命名为2256ΔargRAde。用2256ΔargR菌株和2256ΔargRAde菌株培养获得L-精氨酸和L-赖氨酸，以实施例1，(2)的方法测定GS酶活性。结果如表3、4所示。

表3

菌株 Arg Lys Glu Gln N-乙酰谷氨酸(g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L)
菌株 Arg Lys Glu Gln N-乙酰谷氨酸(g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L)	2256ΔargR 2.28 0.81 0.32 0.19 0.01532256ΔargRAde 2.88 1.48 0.49 0.31 0.314

表4

菌株 GS活性(nmol/min/mg)
菌株 GS活性(nmol/min/mg)	2256ΔargR 51.22256ΔargRAde 135.1

与2256ΔargR相比，2256ΔargRAde菌株的L-精氨酸和L-赖氨酸产量获得了提高。另外还观察到，作为L-精氨酸前体的L-谷氨酸、L-谷氨酰胺以及N-乙酰谷氨酸的产量也得到了提高。GS的比活性提高了大约2.6倍。

2256ΔargRAde菌株的私有编号为AJ110146，保藏于通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(现为，独立行政机构，独立行政法人产业技术综合研究所，国际专利生物保藏单位(Tsukuba Central 6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，邮编：305-5466)，保藏日期为2003年2月18日，保藏号为FERM P-19217。然后，依据布达佩斯条约于2004年2月19日转为国际保藏，保藏号为FERM BP-08631。

实施例3：获得和评价AmtR缺陷型菌株

(1)制备用于去除AmtR的质粒

用于去除棒状杆菌AmtR基因产物(AmtR)的质粒，制备如下。

首先，提取乳发酵短杆菌ATCC 13869的染色体DNA，并将其作为模板与SEQ ID NOS：13和14所示的合成DNA一起进行PCR。将得到的DNA片段平端化，并将其插入到pHSG299(Taka Shuzo)的HincII位点。所得到的质粒被命名为pΔAmtRT。

上述pΔAmtR并不含有使其可以在棒状杆菌细胞中自主复制的序列，所以当棒状杆菌被该质粒转化后，该质粒因同源重组而掺入染色体的菌株表现为转化体，虽然它出现的频率极低。

(2)将pΔAmtR导入精氨酸阻抑物缺陷菌株，并测定菌株的培养

用参考实施例1的方法获得精氨酸阻抑物缺陷菌株(2256ΔargR菌株)，该菌株用pΔAmtR转化，以抗卡那霉素为标记得到了转化体。

然后，将得到的转化菌株传代培养，以获得卡那霉素敏感菌株。对每个转化体AmtR基因附近的序列进行测序，并证实破坏了amtR基因，从而得到了2256ΔargR的amtR破坏菌株(2256ΔargRΔAmtR)。用获得的转化体2256ΔargRΔamtR菌株培养获得L-精氨酸和L-赖氨酸，以实施例1，(2)的方法测定其产量。结果如表5、6所示。

表5

菌株 Arg Lys Glu Gln N-乙酰谷氨酸(g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L)
菌株 Arg Lys Glu Gln N-乙酰谷氨酸(g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L)	2256ΔargR 2.28 0.81 0.32 0.19 0.01532256ΔargRΔAmtR 3.16 1.48 0.45 0.41 0.0296

表6

菌株 GS活性(nmol/min/mg)
菌株 GS活性(nmol/min/mg)	2256ΔargR 51.22256ΔargRΔAmtR 132.3

与2256ΔargR相比，2256ΔargRΔamtR的L-精氨酸和L-赖氨酸产量获得了提高。另外还观察到，作为L-精氨酸前体的谷氨酸、N-乙酰谷氨酸和谷氨酰胺的产量也得到了提高。GS的特异性活性提高了大约2.6倍。

2256ΔargRΔAmtR菌株的私有编号为AJ110144，保藏于通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(现为，独立行政机构，独立行政法人产业技术综合研究所，国际专利生物保藏单位(Tsukuba Central 6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，邮编：305-5466)，保藏日期为2003年，2月18日，保藏号为FERM P-19215。然后，依据布达佩斯条约于2004年2月19日转为国际保藏，保藏号为FERM BP-08629。

尽管本发明用优选的实施方案进行了详细的描述，但是很显然本领域的技术人员可作出各种改变，采用等同方案，而不脱离本发明的范围。前述的每一篇文献，包括外国优先权文件，JP 2003-56129，在此整体引入作为参考。

[序列表解释]

SEQ ID NO：1argR基因扩增的引物

SEQ ID NO：2argR基因扩增的引物

SEQ ID NO：3用于扩增含argR基因质粒中除argR基因ORF之外部分的引物

SEQ ID NO：4用于扩增含argR基因质粒中除argR基因ORF之外部分的引物

SEQ ID NO：5用于破坏glnR的引物N

SEQ ID NO：6用于破坏glnR的引物C

SEQ ID NO：7glnA腺苷酰化作用第一PCR引物NN

SEQ ID NO：8glnA腺苷酰化作用第一PCR引物NC

SEQ ID NO：9glnA腺苷酰化作用第一PCR引物CN

SEQ ID NO：10glnA腺苷酰化作用第一PCR引物CC

SEQ ID NO：11glnA第二PCR引物N

SEQ ID NO：12glnA第二PCR引物C

SEQ ID NO：13用于破坏amtR的引物N

SEQ ID NO：14用于破坏amtR的引物C

SEQ ID NO：15argR基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：16上面DNA片段所编码的氨基酸序列

SEQ ID NO：17glnE基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：18上面DNA片段所编码的氨基酸序列

SEQ ID NO：19glnA基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：20上面DNA片段所编码的氨基酸序列

SEQ ID NO：21amtR基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：22上面DNA片段所编码的氨基酸序列

SEQ ID NO：23glnB基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：24上面DNA片段所编码的氨基酸序列

序列表

<110> Ajinomoto，Co.，Inc.

<120> 通过发酵生产L-精氨酸或L-赖氨酸的方法

<130>

<150> JP 2003-056129

<151> 2003-03-03

<160> 24

<170> PatentIn Ver.2.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：用于PCR的引物

<400> 1

cccgggtttt cttctgcaac tcggg 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：用于PCR的引物

<400> 2

gtcgacaagc tcggttgttc ccagc 25

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：用于PCR的引物

<400> 3

cccctagttc aaggcttgtt aatc 24

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：用于PCR的引物

<400> 4

gtcttacctc ggctggttgg ccagc 25

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述；引物

<400> 5

agaactacga gtccgccttt ttg 23

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：引物

<400> 6

cgatcaccag caacccacgc a 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：引物

<400> 7

cttcccagta gcaccatacg ac 22

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：引物

<400> 8

ctggtggcag ttcgaagagg tccttg 26

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：引物

<400> 9

ggacaaggac ctcttcgaac tgccag 26

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：引物

<400> 10

cggcgagacc gtcgattggg aggagc 26

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：引物

<400> 11

gtagcacctt acgaccaaac cg 22

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：引物

<400> 12

ggagccggtc gacgaggagc 20

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：引物

<400> 13

gccccgggca ggcaagaatc ctc 23

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：引物

<400> 14

tccccgggag gctctctgcg g 21

<210> 15

<211> 4235

<212> DNA

<213> 黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)

<220>

<221> CDS

<222> (1852)..(2364)

<400> 15

aaacccgggt tttcttctgc aactcgggcg ccgaagcaaa cgaggctgct ttcaagattg 60

cacgcttgac tggtcgttcc cggattctgg ctgcagttca tggtttccac ggccgcacca 120

tgggttccct cgcgctgact ggccagccag acaagcgtga agcgttcctg ccaatgccaa 180

gcggtgtgga gttctaccct tacggcgaca ccgattactt gcgcaaaatg gtagaaacca 240

acccaacgga tgtggctgct atcttcctcg agccaatcca gggtgaaacg ggcgttgttc 300

cagcacctga aggattcctc aaggcagtgc gcgagctgtg cgatgagtac ggcatcttga 360

tgatcaccga tgaagtccag actggcgttg gccgtaccgg cgatttcttt gcacatcagc 420

acgatggcgt tgttcccgat gtggtgacca tggccaaggg acttggcggc ggtcttccca 480

tcggtgcttg tttggccact ggccgtgcag ctgaattgat gaccccaggc aagcacggca 540

ccactttcgg tggcaaccca gttgcttgtg cagctgccaa ggcagtgctg tctgttgtcg 600

atgacgcttt ctgcgcagaa gttacccgca agggcgagct gttcaaggta cttcttgcca 660

aggttgacgg cgttgtagac gtccgtggca ggggcttgat gttgggcgtg gtgctggagc 720

gcgacgtcgc aaagcaagct gttcttgatg gttttaagca cggcgttatt ttgaatgcac 780

cggcggacaa cattatccgt ttgaccccgc cgctggtgat caccgacgaa gaaatcgcag 840

acgcagtcaa ggctattgcc gagacaatcg cataaaggac ttaaacttat gacttcacaa 900

ccacaggttc gccatttcct ggctgatgat gatctcaccc ctgcagagca ggcagaggtt 960

ttgaccctag ccgcaaagct caaggcagcg ccgttttcgg agcgtccact cgagggacca 1020

aagtccgttg cagttctttt tgataagact tcaactcgta ctcgcttctc cttcgacgcg 1080

ggcatcgctc atttgggtgg acatgccatc gtcgtggatt ccggcagctc acagatgggt 1140

aagggcgaga ccctgcagga caccgcagct gtattgtccc gctacgtgga agcaattgtg 1200

tggcgcacct acgcacacag caatttccac gccatggcgg agacgtccac tgtgccgctg 1260

gtgaactcct tgtccgatga tctgcaccca tgccagattc tggctgatct gcagaccatc 1320

gtggaaaacc tcagccctga agaaggccca gcaggcctta agggtaagaa ggctgtgtac 1380

ctgggcgatg gcgacaacaa catggccaac tcctacatga ttggctttgc caccgcgggc 1440

atggatattt ccatcatcgc tcctgaaggg ttccagcctc gtgcggaatt cgtggagcgc 1500

gcggaaaagc gtggccagga aaccggcgcg aaggttgttg tcaccgacag cctcgacgag 1560

gttgccggcg ccgatgttgt catcaccgat acctgggtat ccatgggtat ggaaaacgac 1620

ggcatcgatc gcaccacacc tttcgttcct taccaggtca acgatgaggt catggcgaaa 1680

gctaacgacg gcgccatctt cctgcactgc cttcctgcct accgcggcaa agaagtggca 1740

gcctccgtga ttgatggacc agcgtccaaa gttttcgatg aagcagaaaa ccgcctccac 1800

gctcagaaag cactgctggt gtggctgctg gccaaccagc cgaggtaaga c atg tct 1857

Met Ser

1

ctt ggc tca acc ccg tca aca ccg gaa aac tta aat ccc gtg act cgc 1905

Leu Gly Ser Thr Pro Ser Thr Pro Glu Asn Leu Asn Pro Val Thr Arg

5 10 15

act gca cgc caa gct ctc att ttg cag att ttg gac aaa caa aaa gtc 1953

Thr Ala Arg Gln Ala Leu Ile Leu Gln Ile Leu Asp Lys Gln Lys Val

20 25 30

acc agc cag gta caa ctg tct gaa ttg ctg ctg gat gaa ggc atc gat 2001

Thr Ser Gln Val Gln Leu Ser Glu Leu Leu Leu Asp Glu Gly Ile Asp

35 40 45 50

atc acc cag gcc acc ttg tcc cgg gat ctc gat gaa ctc ggt gca cgc 2049

Ile Thr Gln Ala Thr Leu Ser Arg Asp Leu Asp Glu Leu Gly Ala Arg

55 60 65

aag gtt cgc ccc gat ggg gga cgc gcc tac tac gcg gtc ggc cca gta 2097

Lys Val Arg Pro Asp Gly Gly Arg Ala Tyr Tyr Ala Val Gly Pro Val

70 75 80

gat agc atc gcc cgc gaa gat ctc cgg ggt ccg tcg gag aag ctg cgc 2145

Asp Ser Ile Ala Arg Glu Asp Leu Arg Gly Pro Ser Glu Lys Leu Arg

85 90 95

cgc atg ctt gat gaa ctg ctg gtt tct aca gat cat tcc ggc aac atc 2193

Arg Met Leu Asp Glu Leu Leu Val Ser Thr Asp His Ser Gly Asn Ile

100 105 110

gcg atg ctg cgc acc ccg ccg gga gct gcc cag tac ctg gca agt ttc 2241

Ala Met Leu Arg Thr Pro Pro Gly Ala Ala Gln Tyr Leu Ala Ser Phe

115 120 125 130

atc gat agg gtg ggg ctg aaa gaa gtc gtt ggc acc atc gct ggc gat 2289

Ile Asp Arg Val Gly Leu Lys Glu Val Val Gly Thr Ile Ala Gly Asp

135 140 145

gac acc gtt ttt gtt ctc gcc cgt gat ccg ctc aca ggt aaa gaa cta 2337

Asp Thr Val Phe Val Leu Ala Arg Asp Pro Leu Thr Gly Lys Glu Leu

150 155 160

ggt gaa tta ctc agc ggg cgc acc act taaagcgccc ctagttcaag 2384

Gly Glu Leu Leu Ser Gly Arg Thr Thr

165 170

gcttgttaat cgcttgttaa tgcaggcagg taaggtataa cccgagtgtt ttttcgagga 2444

ataccaaccc tttcaacaca ataattttct ttaaacatcc ttgctgtcca ccacggctgg 2504

caaggaactt aaaatgaagg agcacacctc atgactaacc gcatcgttct tgcatactcc 2564

ggcggtctgg acaccactgt ggcaattcca tacctgaaga agatgattga tggtgaagtc 2624

atcgcagttt ctctcgacct gggccagggt ggagagaaca tggacaacgt tcgccagcgt 2684

gcattggatg ccggtgcagc tgagtccatc gttgttgatg caaaggatga gttcgctgag 2744

gagtactgcc tgccaaccat caaggcaaac ggcatgtaca tgaagcagta cccactggtt 2804

tctgcaatct cccgcccact gatcgtcaag cacctcgttg aggctggcaa gcagttcaac 2864

ggtacccacg ttgcacacgg ctgcactggt aagggcaacg accaggttcg tttcgaggtc 2924

ggcttcatgg acaccgatcc aaacctggag atcattgcac ctgctcgtga cttcgcatgg 2984

acccgcgaca aggctatcgc cttcgccgag gagaacaacg ttccaatcga gcagtccgtg 3044

aagtccccat tctccatcga ccagaacgtc tggggccgcg ctattgagac cggttacctg 3104

gaagatctgt ggaatgctcc aaccaaggac atctacgcat acaccgagga tccagctctg 3164

ggtaacgctc cagatgaggt catcatctcc ttcgagggtg gcaagccagt ctccatcgat 3224

ggccgtccag tctccgtact gcaggctatt gaagagctga accgtcgtgc aggcgcacag 3284

ggcgttggcc gccttgacat ggttgaggac cgtctcgtgg gcatcaagtc ccgcgaaatc 3344

tacgaagcac caggcgcaat cgcactgatt aaggctcacg aggctttgga agatgtcacc 3404

atcgagcgcg aactggctcg ctacaagcgt ggcgttgacg cacgttgggc tgaggaagta 3464

tacgacggcc tgtggttcgg acctctgaag cgctccctgg acgcgttcat tgattccacc 3524

caggagcacg tcaccggcga tatccgcatg gttctgcacg caggttccat caccatcaat 3584

ggtcgtcgtt ccagccactc cctgtacgac ttcaacctgg ctacctacga caccggcgac 3644

accttcgacc agaccctggc taagggcttt gtccagctgc acggtctgtc ctccaagatc 3704

gctaacaagc gcgatcgcga agctggcaac aactaagcca ccttttcaag catccagact 3764

agaacttcaa gtatttagaa agtagaagaa caccacatgg aacagcacgg aaccaatgaa 3824

ggtgcgctgt ggggcggccg cttctccggt ggaccctccg aggccatgtt cgccttgagt 3884

gtctccactc atttcgactg ggttttggcc ccttatgatg tgttggcctc caaggcacac 3944

gccaaggttt tgcaccaagc agagctactt tctgatgaag atctagccac catgctggct 4004

ggtcttgatc agctgggcaa ggatgtcgcc gacggaacct tcggtccgct gccttctgat 4064

gaggatgtgc acggcgcgat ggaacgcggt ctgattgacc gcgttggtcc tgaggtgggc 4124

ggccgtctgc gcgctggtcg ttcccgcaac gaccaggtgg caaccctgtt ccgcatgtgg 4184

gtccgcgacg cagtgcgcga catcgcgctg ggaacaaccg agcttgtcga c 4235

<210> 16

<211> 171

<212> PRT

<213> 黄色短杆菌

<400> 16

Met Ser Leu Gly Ser Thr Pro Ser Thr Pro Glu Asn Leu Asn Pro Val

1 5 10 15

Thr Arg Thr Ala Arg Gln Ala Leu Ile Leu Gln Ile Leu Asp Lys Gln

20 25 30

Lys Val Thr Ser Gln Val Gln Leu Ser Glu Leu Leu Leu Asp Glu Gly

35 40 45

Ile Asp Ile Thr Gln Ala Thr Leu Ser Arg Asp Leu Asp Glu Leu Gly

50 55 60

Ala Arg Lys Val Arg Pro Asp Gly Gly Arg Ala Tyr Tyr Ala Val Gly

65 70 75 80

Pro Val Asp Ser Ile Ala Arg Glu Asp Leu Arg Gly Pro Ser Glu Lys

85 90 95

Leu Arg Arg Met Leu Asp Glu Leu Leu Val Ser Thr Asp His Ser Gly

100 105 110

Asn Ile Ala Met Leu Arg Thr Pro Pro Gly Ala Ala Gln Tyr Leu Ala

115 120 125

Ser Phe Ile Asp Arg Val Gly Leu Lys Glu Val Val Gly Thr Ile Ala

130 135 140

Gly Asp Asp Thr Val Phe Val Leu Ala Arg Asp Pro Leu Thr Gly Lys

145 150 155 160

Glu Leu Gly Glu Leu Leu Ser Gly Arg Thr Thr

165 170

<210> 17

<211> 3138

<212> DNA

<213> 乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(3138)

<400> 17

atg tca gga ccg tta aga agt gaa cgt aaa gtc gtt ggc ttt gtc aga 48

Met Ser Gly Pro Leu Arg Ser Glu Arg Lys Val Val Gly Phe Val Arg

1 5 10 15

gac cca ctg cca aaa gtt ggt tct tta tcg ctg aaa tct gag cat gcc 96

Asp Pro Leu Pro Lys Val Gly Ser Leu Ser Leu Lys Ser Glu His Ala

20 25 30

caa gca gat cta gag cat ttg ggt tgg cgc aat gtt gag tct ttg gat 144

Gln Ala Asp Leu Glu His Leu Gly Trp Arg Asn Val Glu Ser Leu Asp

35 40 45

ttg ttg tgg ggc ttg tca ggt gca ggc gat ccc gat gtc gcg ctg aac 192

Leu Leu Trp Gly Leu Ser Gly Ala Gly Asp Pro Asp Val Ala Leu Asn

50 55 60

ctt ctt att cgg ctg tat cag gca ctt gaa gca atc ggc gag gat gct 240

Leu Leu Ile Arg Leu Tyr Gln Ala Leu Glu Ala Ile Gly Glu Asp Ala

65 70 75 80

cga aac gag ctt gat caa gag att cgc cag gat gaa gaa cta cga gtc 288

Arg Asn Glu Leu Asp Gln Glu Ile Arg Gln Asp Glu Glu Leu Arg Val

85 90 95

cgc ctt ttt gca ttg ttg ggt ggt tcc tcg gct gtc ggt gat cac ttg 336

Arg Leu Phe Ala Leu Leu Gly Gly Ser Ser Ala Val Gly Asp His Leu

100 105 110

gtc gcc aat cct ttg cag tgg aaa ctc tta aaa ctt gat gcg cca tcg 384

Val Ala Asn Pro Leu Gln Trp Lys Leu Leu Lys Leu Asp Ala Pro Ser

115 120 125

agg gaa gag atg ttt cag gcg ctg ctg gaa tct gtg aaa gct cag cct 432

Arg Glu Glu Met Phe Gln Ala Leu Leu Glu Ser Val Lys Ala Gln Pro

130 135 140

gct gtg ctt gag gtt gag gat ttc agc gat gca cac aac att gcc cga 480

Ala Val Leu Glu Val Glu Asp Phe Ser Asp Ala His Asn Ile Ala Arg

145 150 155 160

gac gat ttg agc acg cct ggt ttt tac acg gct agt gtt acc ggg cct 528

Asp Asp Leu Ser Thr Pro Gly Phe Tyr Thr Ala Ser Val Thr Gly Pro

165 170 175

gaa gca gag cga gtc ttg aaa tgg act tat cgc acg ttg ctg acc cgg 576

Glu Ala Glu Arg Val Leu Lys Trp Thr Tyr Arg Thr Leu Leu Thr Arg

180 185 190

att gct gcg cat gat tta gcg ggt acc tat ccc acc gac atg cgg aga 624

Ile Ala Ala His Asp Leu Ala Gly Thr Tyr Pro Thr Asp Met Arg Arg

195 200 205

aaa ggt ggc gat cct gtt ccg ttt agc aca gtg acc atg cag ctc agc 672

Lys Gly Gly Asp Pro Val Pro Phe Ser Thr Val Thr Met Gln Leu Ser

210 215 220

gac cta gct gat gct gct ttg act gct gct tta gct gtg gca att gcc 720

Asp Leu Ala Asp Ala Ala Leu Thr Ala Ala Leu Ala Val Ala Ile Ala

225 230 235 240

aat gtt tat ggt gaa aag ccg gtt gat tca gct tta tct gtc atc gcg 768

Asn Val Tyr Gly Glu Lys Pro Val Asp Ser Ala Leu Ser Val Ile Ala

245 250 255

atg ggc aaa tgt ggc gcg cag gaa ttg aac tac att tca gat gtg gac 816

Met Gly Lys Cys Gly Ala Gln Glu Leu Asn Tyr Ile Ser Asp Val Asp

260 265 270

gtg gtg ttt gtt gca gag ccg gca aac tct aaa tca aca cgc acc gca 864

Val Val Phe Val Ala Glu Pro Ala Asn Ser Lys Ser Thr Arg Thr Ala

275 280 285

gca gag ctc att cgc atc ggt agc aac tcg ttc ttt gag gtg gat gca 912

Ala Glu Leu Ile Arg Ile Gly Ser Asn Ser Phe Phe Glu Val Asp Ala

290 295 300

gca ctt cgc cca gaa ggt aaa agt ggc gct ctt gtg cgc tct ttg gat 960

Ala Leu Arg Pro Glu Gly Lys Ser Gly Ala Leu Val Arg Ser Leu Asp

305 310 315 320

tcc cat atg gcg tat tac aag cgc tgg gcg gaa acc tgg gaa ttt cag 1008

Ser His Met Ala Tyr Tyr Lys Arg Trp Ala Glu Thr Trp Glu Phe Gln

325 330 335

gca ctg ctg aaa gct cgt ccc atg acg ggt gat att gac ctt ggg cag 1056

Ala Leu Leu Lys Ala Arg Pro Met Thr Gly Asp Ile Asp Leu Gly Gln

340 345 350

tcc tat gtg gat gct ctt tca ccg ttg att tgg gcg gct agc cag cgg 1104

Ser Tyr Val Asp Ala Leu Ser Pro Leu Ile Trp Ala Ala Ser Gln Arg

355 360 365

gaa tca ttt gtc aca gat gtc caa gct atg cgc cgt cga gtg ttg gac 1152

Glu Ser Phe Val Thr Asp Val Gln Ala Met Arg Arg Arg Val Leu Asp

370 375 380

aat gtt ccg gaa gac ttg cgt gat cgt gag ctg aag ctt ggt cgc ggt 1200

Asn Val Pro Glu Asp Leu Arg Asp Arg Glu Leu Lys Leu Gly Arg Gly

385 390 395 400

ggt ttg agg gat gtg gag ttt gct gtc cag ctc ctt cag atg gtg cat 1248

Gly Leu Arg Asp Val Glu Phe Ala Val Gln Leu Leu Gln Met Val His

405 410 415

ggt cgc att gat gag acg ttg cgg gtt cgg tca acg gta aat gct ttg 1296

Gly Arg Ile Asp Glu Thr Leu Arg Val Arg Ser Thr Val Asn Ala Leu

420 425 430

cat gtg ttg gtt gat cag gga tat gtg ggt cgt gaa gac ggg cat aat 1344

His Val Leu Val Asp Gln Gly Tyr Val Gly Arg Glu Asp Gly His Asn

435 440 445

ctc att gag tcg tat gag ttt ttg cgc ctg ttg gag cat cgc ctt caa 1392

Leu Ile Glu Ser Tyr Glu Phe Leu Arg Leu Leu Glu His Arg Leu Gln

450 455 460

ttg gag cgg atc aag cgc act cac ttg tta ccg aaa cct gat gac cga 1440

Leu Glu Arg Ile Lys Arg Thr His Leu Leu Pro Lys Pro Asp Asp Arg

465 470 475 480

atg aat atg cgc tgg ttg gcg cgc gct tct ggg ttt act ggt tcg atg 1488

Met Asn Met Arg Trp Leu Ala Arg Ala Ser Gly Phe Thr Gly Ser Met

485 490 495

gag caa agt tcg gcc aaa gct atg gaa cgg cat ttg cgt aag gtt cgt 1536

Glu Gln Ser Ser Ala Lys Ala Met Glu Arg His Leu Arg Lys Val Arg

500 505 510

ttg cag att cag tcg ttg cat agt cag ctg ttt tat cgg cca ctg ctg 1584

Leu Gln Ile Gln Ser Leu His Ser Gln Leu Phe Tyr Arg Pro Leu Leu

515 520 525

aac tct gtg gtc aac ttg agc gcg gat gcc atc aga ttg tct ccg gat 1632

Asn Ser Val Val Asn Leu Ser Ala Asp Ala Ile Arg Leu Ser Pro Asp

530 535 540

gct gca aag cta caa ttg ggg gca ttg gga tac ctg cat cca tca cgt 1680

Ala Ala Lys Leu Gln Leu Gly Ala Leu Gly Tyr Leu His Pro Ser Arg

545 550 555 560

gct tat gaa cac ctg act gct ctt gca tca gga gct agc cgt aaa gcc 1728

Ala Tyr Glu His Leu Thr Ala Leu Ala Ser Gly Ala Ser Arg Lys Ala

565 570 575

aag att cag gcg atg ttg ctg ccc acg ttg atg gag tgg ctg tct caa 1776

Lys Ile Gln Ala Met Leu Leu Pro Thr Leu Met Glu Trp Leu Ser Gln

580 585 590

aca gct gaa cca gat gcg gga ttg ctg aat tac cgc aag ctt tct gat 1824

Thr Ala Glu Pro Asp Ala Gly Leu Leu Asn Tyr Arg Lys Leu Ser Asp

595 600 605

gct tcc tat gat cgc agc tgg ttt ttg cgc atg ctg cgt gat gag ggc 1872

Ala Ser Tyr Asp Arg Ser Trp Phe Leu Arg Met Leu Arg Asp Glu Gly

610 615 620

gta gtg ggg cag cgg ttg atg cgt att ttg gga aat tct ccc tat att 1920

Val Val Gly Gln Arg Leu Met Arg Ile Leu Gly Asn Ser Pro Tyr Ile

625 630 635 640

tct gaa ctg att atc tcc act ccg gac ttt gtg aaa cag ctg ggt gat 1968

Ser Glu Leu Ile Ile Ser Thr Pro Asp Phe Val Lys Gln Leu Gly Asp

645 650 655

gcg gcg tct ggt cct aaa ttg ctt gct act gca ccg act cag gtt gtg 2016

Ala Ala Ser Gly Pro Lys Leu Leu Ala Thr Ala Pro Thr Gln Val Val

660 665 670

aaa gca atc aag gcg acg gtg tcg cgt cat gag tca cct gat cgg gcg 2064

Lys Ala Ile Lys Ala Thr Val Ser Arg His Glu Ser Pro Asp Arg Ala

675 680 685

atc cag gct gca cga tcg ctg agg agg cag gag ctg gca cgc att gcc 2112

Ile Gln Ala Ala Arg Ser Leu Arg Arg Gln Glu Leu Ala Arg Ile Ala

690 695 700

tct gct gat ttg ctc aac atg ctc act gtt cag gaa gta tgc caa agc 2160

Ser Ala Asp Leu Leu Asn Met Leu Thr Val Gln Glu Val Cys Gln Ser

705 710 715 720

ttg tca cta gtc tgg gat gcg gtg ttg gat gct gcc ttg gat gcg gaa 2208

Leu Ser Leu Val Trp Asp Ala Val Leu Asp Ala Ala Leu Asp Ala Glu

725 730 735

atc cgt gct gca ctt aac gat cca cag aaa cca gat cag cct ctg gcc 2256

Ile Arg Ala Ala Leu Asn Asp Pro Gln Lys Pro Asp Gln Pro Leu Ala

740 745 750

aat att tct gtg atc ggc atg ggc cgt ttg ggt gga gca gaa ctt gga 2304

Asn Ile Ser Val Ile Gly Met Gly Arg Leu Gly Gly Ala Glu Leu Gly

755 760 765

tac ggt tct gat gcc gat gtg atg ttt gta tgc gag ccg gta gcc ggt 2352

Tyr Gly Ser Asp Ala Asp Val Met Phe Val Cys Glu Pro Val Ala Gly

770 775 780

gtg gaa gag cat gag gcc gtc aca tgg tct att gcg atc tgt gat tcc 2400

Val Glu Glu His Glu Ala Val Thr Trp Ser Ile Ala Ile Cys Asp Ser

785 790 795 800

atg cgg tcg agg ctt gcg cag cct tcc ggt gat cca cct ttg gag gtg 2448

Met Arg Ser Arg Leu Ala Gln Pro Ser Gly Asp Pro Pro Leu Glu Val

805 810 815

gat ctg ggg ctg cgt cct gaa ggg aga tct ggt gcg att gtg cgc acc 2496

Asp Leu Gly Leu Arg Pro Glu Gly Arg Ser Gly Ala Ile Val Arg Thr

820 825 830

gtt gat tcc tat gtg aag tac tac gaa aag tgg ggt gaa act tgg gag 2544

Val Asp Ser Tyr Val Lys Tyr Tyr Glu Lys Trp Gly Glu Thr Trp Glu

835 840 845

att cag gcg ctg ctg agg gct gcg tgg gtt gct ggt gat cgt gag ctg 2592

Ile Gln Ala Leu Leu Arg Ala Ala Trp Val Ala Gly Asp Arg Glu Leu

850 855 860

ggc att aag ttc ttg gag tcg att gat cgt ttc cgc tac cca gtt gac 2640

Gly Ile Lys Phe Leu Glu Ser Ile Asp Arg Phe Arg Tyr Pro Val Asp

865 870 875 880

ggg gca acg cag gcg cag ctt cgt gaa gtt cgt cga att aag gcg agg 2688

Gly Ala Thr Gln Ala Gln Leu Arg Glu Val Arg Arg Ile Lys Ala Arg

885 890 895

gtg gat aat gag agg ctt ccg cgc ggg gct gat cga aat acc cat acc 2736

Val Asp Asn Glu Arg Leu Pro Arg Gly Ala Asp Arg Asn Thr His Thr

900 905 910

aag ctg ggt cgg gga gcg tta act gac atc gag tgg act gtg cag ttg 2784

Lys Leu Gly Arg Gly Ala Leu Thr Asp Ile Glu Trp Thr Val Gln Leu

915 920 925

ttg acc atg atg cat gct cat gag att ccg gag ctg cac aat acg tcg 2832

Leu Thr Met Met His Ala His Glu Ile Pro Glu Leu His Asn Thr Ser

930 935 940

acg ttg gaa gtt ctt gaa gtg ctg gaa aag cat cag att att aac cct 2880

Thr Leu Glu Val Leu Glu Val Leu Glu Lys His Gln Ile Ile Asn Pro

945 950 955 960

gtg cag gtg cag acg ctt cgg gaa gcg tgg ctg acg gca acg gct gct 2928

Val Gln Val Gln Thr Leu Arg Glu Ala Trp Leu Thr Ala Thr Ala Ala

965 970 975

agg aat gcg ctt gtg ctg gtc agg ggt aag aga tta gat cag tta cct 2976

Arg Asn Ala Leu Val Leu Val Arg Gly Lys Arg Leu Asp Gln Leu Pro

980 985 990

act cct ggt ccg cac ctt gcg cag gtg gct ggt gcg tct ggt tgg gat 3024

Thr Pro Gly Pro His Leu Ala Gln Val Ala Gly Ala Ser Gly Trp Asp

995 1000 1005

cca aat gag tac cag gag tat ttg gaa aac tat ctg aaa gtg acc agg 3072

Pro Asn Glu Tyr Gln Glu Tyr Leu Glu Asn Tyr Leu Lys Val Thr Arg

1010 1015 1020

aag agt cgt cag gtt gtt gat gaa gtc ttc tgg ggt gtg gac tct atg 3120

Lys Ser Arg Gln Val Val Asp Glu Val Phe Trp Gly Val Asp Ser Met

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gag caa cgt gag ttt tag 3138

Glu Gln Arg Glu Phe

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<210> 18

<211> 1045

<212> PRT

<213> 乳发酵短杆菌

<400> 18

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Asp Pro Leu Pro Lys Val Gly Ser Leu Ser Leu Lys Ser Glu His Ala

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Gln Ala Asp Leu Glu His Leu Gly Trp Arg Asn Val Glu Ser Leu Asp

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Leu Leu Trp Gly Leu Ser Gly Ala Gly Asp Pro Asp Val Ala Leu Asn

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Leu Leu Ile Arg Leu Tyr Gln Ala Leu Glu Ala Ile Gly Glu Asp Ala

65 70 75 80

Arg Asn Glu Leu Asp Gln Glu Ile Arg Gln Asp Glu Glu Leu Arg Val

85 90 95

Arg Leu Phe Ala Leu Leu Gly Gly Ser Ser Ala Val Gly Asp His Leu

100 105 110

Val Ala Asn Pro Leu Gln Trp Lys Leu Leu Lys Leu Asp Ala Pro Ser

115 120 125

Arg Glu Glu Met Phe Gln Ala Leu Leu Glu Ser Val Lys Ala Gln Pro

130 135 140

Ala Val Leu Glu Val Glu Asp Phe Ser Asp Ala His Asn Ile Ala Arg

145 150 155 160

Asp Asp Leu Ser Thr Pro Gly Phe Tyr Thr Ala Ser Val Thr Gly Pro

165 170 175

Glu Ala Glu Arg Val Leu Lys Trp Thr Tyr Arg Thr Leu Leu Thr Arg

180 185 190

Ile Ala Ala His Asp Leu Ala Gly Thr Tyr Pro Thr Asp Met Arg Arg

195 200 205

Lys Gly Gly Asp Pro Val Pro Phe Ser Thr Val Thr Met Gln Leu Ser

210 215 220

Asp Leu Ala Asp Ala Ala Leu Thr Ala Ala Leu Ala Val Ala Ile Ala

225 230 235 240

Asn Val Tyr Gly Glu Lys Pro Val Asp Ser Ala Leu Ser Val Ile Ala

245 250 255

Met Gly Lys Cys Gly Ala Gln Glu Leu Asn Tyr Ile Ser Asp Val Asp

260 265 270

Val Val Phe Val Ala Glu Pro Ala Asn Ser Lys Ser Thr Arg Thr Ala

275 280 285

Ala Glu Leu Ile Arg Ile Gly Ser Asn Ser Phe Phe Glu Val Asp Ala

290 295 300

Ala Leu Arg Pro Glu Gly Lys Ser Gly Ala Leu Val Arg Ser Leu Asp

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Ser His Met Ala Tyr Tyr Lys Arg Trp Ala Glu Thr Trp Glu Phe Gln

325 330 335

Ala Leu Leu Lys Ala Arg Pro Met Thr Gly Asp Ile Asp Leu Gly Gln

340 345 350

Ser Tyr Val Asp Ala Leu Ser Pro Leu Ile Trp Ala Ala Ser Gln Arg

355 360 365

Glu Ser Phe Val Thr Asp Val Gln Ala Met Arg Arg Arg Val Leu Asp

370 375 380

Asn Val Pro Glu Asp Leu Arg Asp Arg Glu Leu Lys Leu Gly Arg Gly

385 390 395 400

Gly Leu Arg Asp Val Glu Phe Ala Val Gln Leu Leu Gln Met Val His

405 410 415

Gly Arg Ile Asp Glu Thr Leu Arg Val Arg Ser Thr Val Asn Ala Leu

420 425 430

His Val Leu Val Asp Gln Gly Tyr Val Gly Arg Glu Asp Gly His Asn

435 440 445

Leu Ile Glu Ser Tyr Glu Phe Leu Arg Leu Leu Glu His Arg Leu Gln

450 455 460

Leu Glu Arg Ile Lys Arg Thr His Leu Leu Pro Lys Pro Asp Asp Arg

465 470 475 480

Met Asn Met Arg Trp Leu Ala Arg Ala Ser Gly Phe Thr Gly Ser Met

485 490 495

Glu Gln Ser Ser Ala Lys Ala Met Glu Arg His Leu Arg Lys Val Arg

500 505 510

Leu Gln Ile Gln Ser Leu His Ser Gln Leu Phe Tyr Arg Pro Leu Leu

515 520 525

Asn Ser Val Val Asn Leu Ser Ala Asp Ala Ile Arg Leu Ser Pro Asp

530 535 540

Ala Ala Lys Leu Gln Leu Gly Ala Leu Gly Tyr Leu His Pro Ser Arg

545 550 555 560

Ala Tyr Glu His Leu Thr Ala Leu Ala Ser Gly Ala Ser Arg Lys Ala

565 570 575

Lys Ile Gln Ala Met Leu Leu Pro Thr Leu Met Glu Trp Leu Ser Gln

580 585 590

Thr Ala Glu Pro Asp Ala Gly Leu Leu Asn Tyr Arg Lys Leu Ser Asp

595 600 605

Ala Ser Tyr Asp Arg Ser Trp Phe Leu Arg Met Leu Arg Asp Glu Gly

610 615 620

Val Val Gly Gln Arg Leu Met Arg Ile Leu Gly Asn Ser Pro Tyr Ile

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Ser Glu Leu Ile Ile Ser Thr Pro Asp Phe Val Lys Gln Leu Gly Asp

645 650 655

Ala Ala Ser Gly Pro Lys Leu Leu Ala Thr Ala Pro Thr Gln Val Val

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Lys Ala Ile Lys Ala Thr Val Ser Arg His Glu Ser Pro Asp Arg Ala

675 680 685

Ile Gln Ala Ala Arg Ser Leu Arg Arg Gln Glu Leu Ala Arg Ile Ala

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Ser Ala Asp Leu Leu Asn Met Leu Thr Val Gln Glu Val Cys Gln Ser

705 710 715 720

Leu Ser Leu Val Trp Asp Ala Val Leu Asp Ala Ala Leu Asp Ala Glu

725 730 735

Ile Arg Ala Ala Leu Asn Asp Pro Gln Lys Pro Asp Gln Pro Leu Ala

740 745 750

Asn Ile Ser Val Ile Gly Met Gly Arg Leu Gly Gly Ala Glu Leu Gly

755 760 765

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Val Glu Glu His Glu Ala Val Thr Trp Ser Ile Ala Ile Cys Asp Ser

785 790 795 800

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820 825 830

Val Asp Ser Tyr Val Lys Tyr Tyr Glu Lys Trp Gly Glu Thr Trp Glu

835 840 845

Ile Gln Ala Leu Leu Arg Ala Ala Trp Val Ala Gly Asp Arg Glu Leu

850 855 860

Gly Ile Lys Phe Leu Glu Ser Ile Asp Arg Phe Arg Tyr Pro Val Asp

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Gly Ala Thr Gln Ala Gln Leu Arg Glu Val Arg Arg Ile Lys Ala Arg

885 890 895

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900 905 910

Lys Leu Gly Arg Gly Ala Leu Thr Asp Ile Glu Trp Thr Val Gln Leu

915 920 925

Leu Thr Met Met His Ala His Glu Ile Pro Glu Leu His Asn Thr Ser

930 935 940

Thr Leu Glu Val Leu Glu Val Leu Glu Lys His Gln Ile Ile Asn Pro

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Val Gln Val Gln Thr Leu Arg Glu Ala Trp Leu Thr Ala Thr Ala Ala

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Arg Asn Ala Leu Val Leu Val Arg Gly Lys Arg Leu Asp Gln Leu Pro

980 985 990

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1010 1015 1020

Lys Ser Arg Gln Val Val Asp Glu Val Phe Trp Gly Val Asp Ser Met

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Glu Gln Arg Glu Phe

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<210> 19

<211> 1434

<212> DNA

<213> 乳发酵短杆菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1434)

<400> 19

gtg gcg ttt gaa acc ccg gaa gaa att gtc aag ttc atc aag gat gaa 48

Val Ala Phe Glu Thr Pro Glu Glu Ile Val Lys Phe Ile Lys Asp Glu

1 5 10 15

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Asn Val Glu Phe Val Asp Val Arg Phe Thr Asp Leu Pro Gly Thr Glu

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Glu Gly Leu Ala Phe Asp Gly Ser Ser Ile Arg Gly Phe Thr Thr Ile

50 55 60

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Asp Glu Ser Asp Met Asn Leu Leu Pro Asp Leu Gly Thr Ala Thr Leu

65 70 75 80

gat cca ttc cgc aag gca aag acc ctg aac gtt aag ttc ttc gtt cac 288

Asp Pro Phe Arg Lys Ala Lys Thr Leu Asn Val Lys Phe Phe Val His

85 90 95

gat cct ttc acc cgc gag gca ttc tcc cgc gac cca cgc aac gta gca 336

Asp Pro Phe Thr Arg Glu Ala Phe Ser Arg Asp Pro Arg Asn Val Ala

100 105 110

cgc aag gca gag cag tac ctg gca tcc acc ggc att gca gac acc tgc 384

Arg Lys Ala Glu Gln Tyr Leu Ala Ser Thr Gly Ile Ala Asp Thr Cys

115 120 125

aac ttc ggc gcc gag gct gag ttc tac ctc ttc gac tcc gtt cgc tac 432

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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Gly Ala Lys Asn Arg Val Lys Gly Gly Tyr Phe Pro Val Ala Pro Tyr

180 185 190

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Asp Gln Thr Val Asp Val Arg Asp Asp Met Val Arg Asn Leu Ala Ala

195 200 205

tcc ggc ttc gct ctt gag cgt ttc cac cac gaa gtc ggt ggc gga cag 672

Ser Gly Phe Ala Leu Glu Arg Phe His His Glu Val Gly Gly Gly Gln

210 215 220

cag gaa atc aac tac cgc ttc aac acc atg ctc cac gcg gca gat gat 720

Gln Glu Ile Asn Tyr Arg Phe Asn Thr Met Leu His Ala Ala Asp Asp

225 230 235 240

atc cag acc ttc aag tac atc atc aag aac acc gct cgc ctc cac ggc 768

Ile Gln Thr Phe Lys Tyr Ile Ile Lys Asn Thr Ala Arg Leu His Gly

245 250 255

aag gct gca acc ttc atg cct aag cca ctg gct ggc gac aac ggt tcc 816

Lys Ala Ala Thr Phe Met Pro Lys Pro Leu Ala Gly Asp Asn Gly Ser

260 265 270

ggc atg cac gct cac cag tcc ctc tgg aag gac ggc aag cca ctc ttc 864

Gly Met His Ala His Gln Ser Leu Trp Lys Asp Gly Lys Pro Leu Phe

275 280 285

cac gat gag tcc ggc tac gca ggc ctg tcc gac atc gcc cgc tac tac 912

His Asp Glu Ser Gly Tyr Ala Gly Leu Ser Asp Ile Ala Arg Tyr Tyr

290 295 300

atc ggc ggc atc ctg cac cac gca ggc gct gtt ctg gcg ttc acc aac 960

Ile Gly Gly Ile Leu His His Ala Gly Ala Val Leu Ala Phe Thr Asn

305 310 315 320

gca acc ctg aac tcc tac cac cgt ctg gtt cca ggc ttc gag gct cca 1008

Ala Thr Leu Asn Ser Tyr His Arg Leu Val Pro Gly Phe Glu Ala Pro

325 330 335

atc aac ctg gtg tac tca cag cgc aac cgt tcc gct gct gtc cgt atc 1056

Ile Asn Leu Val Tyr Ser Gln Arg Asn Arg Ser Ala Ala Val Arg Ile

340 345 350

cca atc acc gga tcc aac cca aag gca aag cgc atc gaa ttc cgc gct 1104

Pro Ile Thr Gly Ser Asn Pro Lys Ala Lys Arg Ile Glu Phe Arg Ala

355 360 365

cca gac cca tca ggc aac cca tac ctg ggc ttc gca gcg atg atg atg 1152

Pro Asp Pro Ser Gly Asn Pro Tyr Leu Gly Phe Ala Ala Met Met Met

370 375 380

gcc ggc ctc gac ggc atc aag aac cgc atc gag cca cac gct cca gtg 1200

Ala Gly Leu Asp Gly Ile Lys Asn Arg Ile Glu Pro His Ala Pro Val

385 390 395 400

gac aag gac ctc tac gaa ctg cca cca gag gaa gct gca tcc att cca 1248

Asp Lys Asp Leu Tyr Glu Leu Pro Pro Glu Glu Ala Ala Ser Ile Pro

405 410 415

cag gca cca acc tcc ctg gaa gca tcc ctg aag gca ctg cag gaa gac 1296

Gln Ala Pro Thr Ser Leu Glu Ala Ser Leu Lys Ala Leu Gln Glu Asp

420 425 430

acc gac ttc ctc acc gag tct gac gtc ttc acc gag gat ctc atc gag 1344

Thr Asp Phe Leu Thr Glu Ser Asp Val Phe Thr Glu Asp Leu Ile Glu

435 440 445

gcg tac atc cag tac aag tac gac aac gag atc tcc cca gtt cgc ctg 1392

Ala Tyr Ile Gln Tyr Lys Tyr Asp Asn Glu Ile Ser Pro Val Arg Leu

450 455 460

cgc cca acc ccg cag gaa ttc gaa ttg tac ttc gac tgc taa 1434

Arg Pro Thr Pro Gln Glu Phe Glu Leu Tyr Phe Asp Cys

465 470 475

<210> 20

<211> 477

<212> PRT

<213> 乳发酵短杆菌

<400> 20

Val Ala Phe Glu Thr Pro Glu Glu Ile Val Lys Phe Ile Lys Asp Glu

1 5 10 15

Asn Val Glu Phe Val Asp Val Arg Phe Thr Asp Leu Pro Gly Thr Glu

20 25 30

Gln His Phe Ser Ile Pro Ala Ala Ser Phe Asp Ala Asp Thr Val Glu

35 40 45

Glu Gly Leu Ala Phe Asp Gly Ser Ser Ile Arg Gly Phe Thr Thr Ile

50 55 60

Asp Glu Ser Asp Met Asn Leu Leu Pro Asp Leu Gly Thr Ala Thr Leu

65 70 75 80

Asp Pro Phe Arg Lys Ala Lys Thr Leu Asn Val Lys Phe Phe Val His

85 90 95

Asp Pro Phe Thr Arg Glu Ala Phe Ser Arg Asp Pro Arg Asn Val Ala

100 105 110

Arg Lys Ala Glu Gln Tyr Leu Ala Ser Thr Gly Ile Ala Asp Thr Cys

115 120 125

Asn Phe Gly Ala Glu Ala Glu Phe Tyr Leu Phe Asp Ser Val Arg Tyr

130 135 140

Ser Thr Glu Met Asn Ser Gly Phe Tyr Glu Val Asp Thr Glu Glu Gly

145 150 155 160

Trp Trp Asn Arg Gly Lys Glu Thr Asn Leu Asp Gly Thr Pro Asn Leu

165 170 175

Gly Ala Lys Asn Arg Val Lys Gly Gly Tyr Phe Pro Val Ala Pro Tyr

180 185 190

Asp Gln Thr Val Asp Val Arg Asp Asp Met Val Arg Asn Leu Ala Ala

195 200 205

Ser Gly PheAla Leu Glu Arg Phe His His Glu Val Gly Gly Gly Gln

210 215 220

Gln Glu Ile Asn Tyr Arg Phe Asn Thr Met Leu His Ala Ala Asp Asp

225 230 235 240

Ile Gln Thr Phe Lys Tyr Ile Ile Lys Asn Thr Ala Arg Leu His Gly

245 250 255

Lys Ala Ala Thr Phe Met Pro Lys Pro Leu Ala Gly Asp Asn Gly Ser

260 265 270

Gly Met His Ala His Gln Ser Leu Trp Lys Asp Gly Lys Pro Leu Phe

275 280 285

His Asp Glu Ser Gly Tyr Ala Gly Leu Ser Asp Ile Ala Arg Tyr Tyr

290 295 300

Ile Gly Gly Ile Leu His His Ala Gly Ala Val Leu Ala Phe Thr Asn

305 310 315 320

Ala Thr Leu Asn Ser Tyr His Arg Leu Val Pro Gly Phe Glu Ala Pro

325 330 335

Ile Asn Leu Val Tyr Ser Gln Arg Asn Arg Ser Ala Ala Val Arg Ile

340 345 350

Pro Ile Thr Gly Ser Asn Pro Lys Ala Lys Arg Ile Glu Phe Arg Ala

355 360 365

Pro Asp Pro Ser Gly Asn Pro Tyr Leu Gly Phe Ala Ala Met Met Met

370 375 380

Ala Gly Leu Asp Gly Ile Lys Asn Arg Ile Glu Pro His Ala Pro Val

385 390 395 400

Asp Lys Asp Leu Tyr Glu Leu Pro Pro Glu Glu Ala Ala Ser Ile Pro

405 410 415

Gln Ala Pro Thr Ser Leu Glu Ala Ser Leu Lys Ala Leu Gln Glu Asp

420 425 430

Thr Asp Phe Leu Thr Glu Ser Asp Val Phe Thr Glu Asp Leu Ile Glu

435 440 445

Ala Tyr Ile Gln Tyr Lys Tyr Asp Asn Glu Ile Ser Pro Val Arg Leu

450 455 460

Arg Pro Thr Pro Gln Glu Phe Glu Leu Tyr Phe Asp Cys

465 470 475

<210> 21

<211> 672

<212> DNA

<213> 乳发酵短杆菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(669)

<400> 21

atg gca gga gca gtg gga cgc ccc cgg aga tca gct ccg cga cgg gca 48

Met Ala Gly Ala Val Gly Arg Pro Arg Arg Ser Ala Pro Arg Arg Ala

1 5 10 15

ggc aag aat cct cgc gag gag att ctt gac gcc tct gct gag ctt ttc 96

Gly Lys Asn Pro Arg Glu Glu Ile Leu Asp Ala Ser Ala Glu Leu Phe

20 25 30

acc cat caa ggc ttc gca aca acc tcc acg cat caa atc gct gat gcc 144

Thr His Gln Gly Phe Ala Thr Thr Ser Thr His Gln Ile Ala Asp Ala

35 40 45

gtg gga atc cgc caa gcc tcg ctg tat tat cac ttc ccg tct aag acg 192

Val Gly Ile Arg Gln Ala Ser Leu Tyr Tyr His Phe Pro Ser Lys Thr

50 55 60

gaa atc ttc ctc acc ctc ctg aaa tct acc gtc gag ccg tcc act gtg 240

Glu Ile Phe Leu Thr Leu Leu Lys Ser Thr Val Glu Pro Ser Thr Val

65 70 75 80

ctc gcc gaa gac tta agc atc ctg gat gca gga cct gag atg cgc ctc 288

Leu Ala Glu Asp Leu Ser Ile Leu Asp Ala Gly Pro Glu Met Arg Leu

85 90 95

tgg gca atc gtt gcc tcc gaa gtg cgt ctg ctg ctg tcc acc aag tgg 336

Trp Ala Ile Val Ala Ser Glu Val Arg Leu Leu Leu Ser Thr Lys Trp

100 105 110

aac gtc ggt cgc ctg tac caa ctc ccc atc gtt ggt tct gaa gag ttc 384

Asn Val Gly Arg Leu Tyr Gln Leu Pro Ile Val Gly Ser Glu Glu Phe

115 120 125

gcc gag tac cac agc cag cgc gaa gcc ctc acc aac atc ttc cgc gac 432

Ala Glu Tyr His Ser Gln Arg Glu Ala Leu Thr Asn Ile Phe Arg Asp

130 135 140

ctc gcc acc gaa atc gtc ggt gac gac ccc cgc gca gaa ctc ccc ttc 480

Leu Ala Thr Glu Ile Val Gly Asp Asp Pro Arg Ala Glu Leu Pro Phe

145 150 155 160

cac atc acc atg tcg gtg atc gaa atg cgt cgc aac gac ggc aag att 528

His Ile Thr Met Ser Val Ile Glu Met Arg Arg Asn Asp Gly Lys Ile

165 170 175

cca agc ccg ctt tcc gca gac agc ctc ccg gag acc gca att atg ctt 576

Pro Ser Pro Leu Ser Ala Asp Ser Leu Pro Glu Thr Ala Ile Met Leu

180 185 190

gcc gac gcc tcc ctc gcc gtc ctc ggc gcg tcg ctg ccc gcc gac cgg 624

Ala Asp Ala Ser Leu Ala Val Leu Gly Ala Ser Leu Pro Ala Asp Arg

195 200 205

gtc gaa aaa acg ctt gaa cta atc aag cag gct gac gcg aaa taa cca 672

Val Glu Lys Thr Leu Glu Leu Ile Lys Gln Ala Asp Ala Lys

210 215 220

<210> 22

<211> 222

<212> PRT

<213> 乳发酵短杆菌

<400> 22

Met Ala Gly Ala Val Gly Arg Pro Arg Arg Ser Ala Pro Arg Arg Ala

1 5 10 15

Gly Lys Asn Pro Arg Glu Glu Ile Leu Asp Ala Ser Ala Glu Leu Phe

20 25 30

Thr His Gln Gly Phe Ala Thr Thr Ser Thr His Gln Ile Ala Asp Ala

35 40 45

Val Gly Ile Arg Gln Ala Ser Leu Tyr Tyr His Phe Pro Ser Lys Thr

50 55 60

Glu Ile Phe Leu Thr Leu Leu Lys Ser Thr Val Glu Pro Ser Thr Val

65 70 75 80

Leu Ala Glu Asp Leu Ser Ile Leu Asp Ala Gly Pro Glu Met Arg Leu

85 90 95

Trp Ala Ile Val Ala Ser Glu Val Arg Leu Leu Leu Ser Thr Lys Trp

100 105 110

Asn Val Gly Arg Leu Tyr Gln Leu Pro Ile Val Gly Ser Glu Glu Phe

115 120 125

Ala Glu Tyr His Ser Gln Arg Glu Ala Leu Thr Asn Ile Phe Arg Asp

130 135 140

Leu Ala Thr Glu Ile Val Gly Asp Asp Pro Arg Ala Glu Leu Pro Phe

145 150 155 160

His Ile Thr Met Ser Val Ile Glu Met Arg Arg Asn Asp Gly Lys Ile

165 170 175

Pro Ser Pro Leu Ser Ala Asp Ser Leu Pro Glu Thr Ala Ile Met Leu

180 185 190

Ala Asp Ala Ser Leu Ala Val Leu Gly Ala Ser Leu Pro Ala Asp Arg

195 200 205

Val Glu Lys Thr Leu Glu Leu Ile Lys Gln Ala Asp Ala Lys

210 215 220

<210> 23

<211> 2076

<212> DNA

<213> 乳发酵短杆菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2076)

<400> 23

atg aat aat cca gcc cag ctg cgc caa gat act gaa aag gaa gtc ctg 48

Met Asn Asn Pro Ala Gln Leu Arg Gln Asp Thr Glu Lys Glu Val Leu

1 5 10 15

gcg ttg ctg ggc tct ttg gtt tta ccc gcc ggc acc gcg ctt gcc gcc 96

Ala Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Pro Ala Gly Thr Ala Leu Ala Ala

20 25 30

acc gga tct ttg gcc agg tcc gaa ctc acg ccg tat tcc gat ttg gac 144

Thr Gly Ser Leu Ala Arg Ser Glu Leu Thr Pro Tyr Ser Asp Leu Asp

35 40 45

ctc att ttg atc cat cca cca ggg gca acc ccg gat ggc gtg gag gat 192

Leu Ile Leu Ile His Pro Pro Gly Ala Thr Pro Asp Gly Val Glu Asp

50 55 60

ttg tgg tac ccg att tgg gac gca aaa aag cgc ctc gac tac tcc gtg 240

Leu Trp Tyr Pro Ile Trp Asp Ala Lys Lys Arg Leu Asp Tyr Ser Val

65 70 75 80

cgc acc cca gat gag tgc gtg gct atg att tct gcg gat tcc act gca 288

Arg Thr Pro Asp Glu Cys Val Ala Met Ile Ser Ala Asp Ser Thr Ala

85 90 95

gcc ctt gcc atg ctt gac ctg cga ttt att gct ggc gat gag gat ctg 336

Ala Leu Ala Met Leu Asp Leu Arg Phe Ile Ala Gly Asp Glu Asp Leu

100 105 110

tgt gcc aaa acg cgc cgg cgc atc gtg gag aag tgg cgc cag gaa ctc 384

Cys Ala Lys Thr Arg Arg Arg Ile Val Glu Lys Trp Arg Gln Glu Leu

115 120 125

aac aaa aac ttc gac gcc gtt gtg gac acc gcg att gcc cgt tgg cgc 432

Asn Lys Asn Phe Asp Ala Val Val Asp Thr Ala Ile Ala Arg Trp Arg

130 135 140

cgc tcc gga ccc gtc gtg gca atg acg cgg cca gat ctt aaa cac ggc 480

Arg Ser Gly Pro Val Val Ala Met Thr Arg Pro Asp Leu Lys His Gly

145 150 155 160

agg gga ggg ctg cgc gat ttc gaa ctg atc aag gcc ctc gcg ctc ggc 528

Arg Gly Gly Leu Arg Asp Phe Glu Leu Ile Lys Ala Leu Ala Leu Gly

165 170 175

cac cta tgc aac gtt cca cag cta gat acg caa cac cag ctg ctt ctc 576

His Leu Cys Asn Val Pro Gln Leu Asp Thr Gln His Gln Leu Leu Leu

180 185 190

gac gcc cgc acc ttg ctg cac gtc cac gcg cga cgc tcc cgc gac gtc 624

Asp Ala Arg Thr Leu Leu His Val His Ala Arg Arg Ser Arg Asp Val

195 200 205

ctt gat ccc gaa ttt gcg gtg gat gtg gcc atg gat ttg ggc ttt gtt 672

Leu Asp Pro Glu Phe Ala Val Asp Val Ala Met Asp Leu Gly Phe Val

210 215 220

gac cgc tat cac tta ggc cgg gag atc gcc gat gca gcc cgc gcc att 720

Asp Arg Tyr His Leu Gly Arg Glu Ile Ala Asp Ala Ala Arg Ala Ile

225 230 235 240

gat gac ggc ctg acc acc gcg ctg gcc acc gcc cgt ggc att ttg cca 768

Asp Asp Gly Leu Thr Thr Ala Leu Ala Thr Ala Arg Gly Ile Leu Pro

245 250 255

cgt cgc acg ggt ttt gct ttt agg aat gct tct cga cgc cca ctt gat 816

Arg Arg Thr Gly Phe Ala Phe Arg Asn Ala Ser Arg Arg Pro Leu Asp

260 265 270

ctt gat gtc gtc gac gcc aac ggc act atc gaa ttg tcc aaa aaa cca 864

Leu Asp Val Val Asp Ala Asn Gly Thr Ile Glu Leu Ser Lys Lys Pro

275 280 285

gat ctt aat gat ccc gca ctt cca ctt cga gtg gcc gca gcc gca gcg 912

Asp Leu Asn Asp Pro Ala Leu Pro Leu Arg Val Ala Ala Ala Ala Ala

290 295 300

acc acc gga ctt ccg gtg gca gaa tca acc tgg gct cga ctt aat gaa 960

Thr Thr Gly Leu Pro Val Ala Glu Ser Thr Trp Ala Arg Leu Asn Glu

305 310 315 320

tgc ccg cca ctt cct gag cca tgg cct gcc aat gca gca ggg gac ttc 1008

Cys Pro Pro Leu Pro Glu Pro Trp Pro Ala Asn Ala Ala Gly Asp Phe

325 330 335

ttt cgg att ctc tcc agt ccg aaa aac tca cgc cga gtg gtg aaa aat 1056

Phe Arg Ile Leu Ser Ser Pro Lys Asn Ser Arg Arg Val Val Lys Asn

340 345 350

atg gat cgc cac gga ttg tgg tcg cgt ttt gtt cca gaa tgg gac cgc 1104

Met Asp Arg His Gly Leu Trp Ser Arg Phe Val Pro Glu Trp Asp Arg

355 360 365

atc aaa ggg ctt atg ccc cgt gaa ccc agc cat att tcc acc atc gat 1152

Ile Lys Gly Leu Met Pro Arg Glu Pro Ser His Ile Ser Thr Ile Asp

370 375 380

gaa cat agt ctg aac act gtt gca gga tgt gcg cta gaa act gtg acc 1200

Glu His Ser Leu Asn Thr Val Ala Gly Cys Ala Leu Glu Thr Val Thr

385 390 395 400

gtc gcg cgc ccc gat ctt tta gtt ttg gga gcc ttg tac cac gac att 1248

Val Ala Arg Pro Asp Leu Leu Val Leu Gly Ala Leu Tyr His Asp Ile

405 410 415

ggc aag ggc ttc ccg cgt cca cac gaa caa gta ggt gca gag atg gtg 1296

Gly Lys Gly Phe Pro Arg Pro His Glu Gln Val Gly Ala Glu Met Val

420 425 430

gcg agg gcc gcg agc cgc atg ggg ttg aac ctt cgc gat cgt gcc agc 1344

Ala Arg Ala Ala Ser Arg Met Gly Leu Asn Leu Arg Asp Arg Ala Ser

435 440 445

gtg caa acg ctg gtc gcc gag cac acc gcg gtg gcc aaa atc gcc gcg 1392

Val Gln Thr Leu Val Ala Glu His Thr Ala Val Ala Lys Ile Ala Ala

450 455 460

cgc ctt gat ccc tcc tcg gag ggc gcc gtc gat aag ctg ctt gat gct 1440

Arg Leu Asp Pro Ser Ser Glu Gly Ala Val Asp Lys Leu Leu Asp Ala

465 470 475 480

gtt agg tat gac ctg gtg aca ttg aat ctg ctt gag gtg cta aca gaa 1488

Val Arg Tyr Asp Leu Val Thr Leu Asn Leu Leu Glu Val Leu Thr Glu

485 490 495

gct gat gcg aaa gcc acg ggg cct ggc gta tgg acg gcg cgt ttg gag 1536

Ala Asp Ala Lys Ala Thr Gly Pro Gly Val Trp Thr Ala Arg Leu Glu

500 505 510

cat gcg ctg cgg att gtg tgc aag cgt gcg cgt gat cgc ctc acc gat 1584

His Ala Leu Arg Ile Val Cys Lys Arg Ala Arg Asp Arg Leu Thr Asp

515 520 525

att cgc ccg gtt gcg ccg atg att gcg ccg cgt agc gaa att ggt ttg 1632

Ile Arg Pro Val Ala Pro Met Ile Ala Pro Arg Ser Glu Ile Gly Leu

530 535 540

gtg gaa cgc gat ggc gtg ttc aca gtg caa tgg cac ggc gaa gac tta 1680

Val Glu Arg Asp Gly Val Phe Thr Val Gln Trp His Gly Glu Asp Leu

545 550 555 560

cat cgg att ctt ggc gta att tat gcc aaa gga tgg aca atc acc gcg 1728

His Arg Ile Leu Gly Val Ile Tyr Ala Lys Gly Trp Thr Ile Thr Ala

565 570 575

gcg cgc atg ctg gcc aat ggt caa tgg agt gcg gaa ttt gat gtc cgc 1776

Ala Arg Met Leu Ala Asn Gly Gln Trp Ser Ala Glu Phe Asp Val Arg

580 585 590

gca aac ggc ccc caa gat ttt gat ccg cag cat ttc ctg cag gca tat 1824

Ala Asn Gly Pro Gln Asp Phe Asp Pro Gln His Phe Leu Gln Ala Tyr

595 600 605

caa tcc ggt gtg ttt tcc gag gtt ccc att cca gca cct ggg ata aca 1872

Gln Ser Gly Val Phe Ser Glu Val Pro Ile Pro Ala Pro Gly Ile Thr

610 615 620

gcc aca ttt tgg cac ggg aac act tta gaa gtg cgc act gag ctt cgc 1920

Ala Thr Phe Trp His Gly Asn Thr Leu Glu Val Arg Thr Glu Leu Arg

625 630 635 640

aca gga gct att ttt gcc ctg ctc aga aca ttg ccc gat gcc ctc tgg 1968

Thr Gly Ala Ile Phe Ala Leu Leu Arg Thr Leu Pro Asp Ala Leu Trp

645 650 655

atc aac gct gtg acc cgc ggt gcg acc ctg att atc cag gca gca ctg 2016

Ile Asn Ala Val Thr Arg Gly Ala Thr Leu Ile Ile Gln Ala Ala Leu

660 665 670

aag ccc ggc ttc gat cga gca acg gtg gaa cgc tcc gta gtc agg tcg 2064

Lys Pro Gly Phe Asp Arg Ala Thr Val Glu Arg Ser Val Val Arg Ser

675 680 685

ttg gca ggt agc 2076

Leu Ala Gly Ser

690

<210> 24

<211> 692

<212> PRT

<213> 乳发酵短杆菌

<400> 24

Met Asn Asn Pro Ala Gln Leu Arg Gln Asp Thr Glu Lys Glu Val Leu

1 5 10 15

Ala Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Pro Ala Gly Thr Ala Leu Ala Ala

20 25 30

Thr Gly Ser Leu Ala Arg Ser Glu Leu Thr Pro Tyr Ser Asp Leu Asp

35 40 45

Leu Ile Leu Ile His Pro Pro Gly Ala Thr Pro Asp Gly Val Glu Asp

50 55 60

Leu Trp Tyr Pro Ile Trp Asp Ala Lys Lys Arg Leu Asp Tyr Ser Val

65 70 75 80

Arg Thr Pro Asp Glu Cys Val Ala Met Ile Ser Ala Asp Ser Thr Ala

85 90 95

Ala Leu Ala Met Leu Asp Leu Arg Phe Ile Ala Gly Asp Glu Asp Leu

100 105 110

Cys Ala Lys Thr Arg Arg Arg Ile Val Glu Lys Trp Arg Gln Glu Leu

115 120 125

Asn Lys Asn Phe Asp Ala Val Val Asp Thr Ala Ile Ala Arg Trp Arg

130 135 140

Arg Ser Gly Pro Val Val Ala Met Thr Arg Pro Asp Leu Lys His Gly

145 150 155 160

Arg Gly Gly Leu Arg Asp Phe Glu Leu Ile Lys Ala Leu Ala Leu Gly

165 170 175

His Leu Cys Asn Val Pro Gln Leu Asp Thr Gln His Gln Leu Leu Leu

180 185 190

Asp Ala Arg Thr Leu Leu His Val His Ala Arg Arg Ser Arg Asp Val

195 200 205

Leu Asp Pro Glu Phe Ala Val Asp Val Ala Met Asp Leu Gly Phe Val

210 215 220

Asp Arg Tyr His Leu Gly Arg Glu Ile Ala Asp Ala Ala Arg Ala Ile

225 230 235 240

Asp Asp Gly Leu Thr Thr Ala Leu Ala Thr Ala Arg Gly Ile Leu Pro

245 250 255

Arg Arg Thr Gly Phe Ala Phe Arg Asn Ala Ser Arg Arg Pro Leu Asp

260 265 270

Leu Asp Val Val Asp Ala Asn Gly Thr Ile Glu Leu Ser Lys Lys Pro

275 280 285

Asp Leu Asn Asp Pro Ala Leu Pro Leu Arg Val Ala Ala Ala Ala Ala

290 295 300

Thr Thr Gly Leu Pro Val Ala Glu Ser Thr Trp Ala Arg Leu Asn Glu

305 310 315 320

Cys Pro Pro Leu Pro Glu Pro Trp Pro Ala Asn Ala Ala Gly Asp Phe

325 330 335

Phe Arg Ile Leu Ser Ser Pro Lys Asn Ser Arg Arg Val Val Lys Asn

340 345 350

Met Asp Arg His Gly Leu Trp Ser Arg Phe Val Pro Glu Trp Asp Arg

355 360 365

Ile Lys Gly Leu Met Pro Arg Glu Pro Ser His Ile Ser Thr Ile Asp

370 375 380

Glu His Ser Leu Asn Thr Val Ala Gly Cys Ala Leu Glu Thr Val Thr

385 390 395 400

Val Ala Arg Pro Asp Leu Leu Val Leu Gly Ala Leu Tyr His Asp Ile

405 410 415

Gly Lys Gly Phe Pro Arg Pro His Glu Gln Val Gly Ala Glu Met Val

420 425 430

Ala Arg Ala Ala Ser Arg Met Gly Leu Asn Leu Arg Asp Arg Ala Ser

435 440 445

Val Gln Thr Leu Val Ala Glu His Thr Ala Val Ala Lys Ile Ala Ala

450 455 460

Arg Leu Asp Pro Ser Ser Glu Gly Ala Val Asp Lys Leu Leu Asp Ala

465 470 475 480

Val Arg Tyr Asp Leu Val Thr Leu Asn Leu Leu Glu Val Leu Thr Glu

485 490 495

Ala Asp Ala Lys Ala Thr Gly Pro Gly Val Trp Thr Ala Arg Leu Glu

500 505 5l0

His Ala Leu Arg Ile Val Cys Lys Arg Ala Arg Asp Arg Leu Thr Asp

515 520 525

Ile Arg Pro Val Ala Pro Met Ile Ala Pro Arg Ser Glu Ile Gly Leu

530 535 540

Val Glu Arg Asp Gly Val Phe Thr Val Gln Trp His Gly Glu Asp Leu

545 550 555 560

His Arg Ile Leu Gly Val Ile Tyr Ala Lys Gly Trp Thr Ile Thr Ala

565 570 575

Ala Arg Met Leu Ala Asn Gly Gln Trp Ser Ala Glu Phe Asp Val Arg

580 585 590

Ala Asn Gly Pro Gln Asp Phe Asp Pro Gln His Phe Leu Gln Ala Tyr

595 600 605

Gln Ser Gly Val Phe Ser Glu Val Pro Ile Pro Ala Pro Gly Ile Thr

610 615 620

Ala Thr Phe Trp His Gly Asn Thr Leu Glu Val Arg Thr Glu Leu Arg

625 630 635 640

Thr Gly Ala Ile Phe Ala Leu Leu Arg Thr Leu Pro Asp Ala Leu Trp

645 650 655

Ile Asn Ala Val Thr Arg Gly Ala Thr Leu Ile Ile Gln Ala Ala Leu

660 665 670

Lys Pro Gly Phe Asp Arg Ala Thr Val Glu Arg Ser Val Val Arg Ser

675 680 685

Leu Ala Gly Ser

690

Claims

1、一种具有生产L-精氨酸或L-赖氨酸能力的棒状杆菌，该棒状杆菌经过修饰使其谷氨酰胺合成酶的活性得到提高。

2、权利要求1所述的棒状杆菌，该棒状杆菌经过修饰，使其通过腺苷酰化对谷氨酰胺合成酶的活性调节作用被减少或消除。

3、权利要求2所述的棒状杆菌，其中通过如下一个或多个特征使其通过腺苷酰化对谷氨酰胺合成酶的活性调节作用被减少或消除：

a)细菌包含谷氨酰胺合成酶，所述酶的通过腺苷酰化进行的活性调节被消除，

b)谷氨酰胺合成酶腺苷酰基转移酶的胞内活性被降低，

c)PII蛋白的胞内活性被降低，以及

4、权利要求3所述的棒状杆菌，其中所述细菌染色体上编码谷氨酰胺合成酶腺苷酰基转移酶的基因被破坏。

5、权利要求3所述的棒状杆菌，其中所述的氨代谢调节蛋白是不能发挥正常作用的amtR基因的产物。

6、权利要求5所述的棒状杆菌，其中所述细菌染色体上的amtR基因被破坏。

7、权利要求1-6任一项所述的棒状杆菌，该棒状杆菌经过修饰，使得精氨酸阻抑物不能发挥正常作用。

8、权利要求7所述的棒状杆菌，其中所述细菌染色体上编码精氨酸阻抑物的基因被破坏。

9、一种生产L-精氨酸或L-赖氨酸的方法，包含下列步骤：

a)在培养基中培养权利要求1-8中任一项所述的棒状杆菌，和

b)在培养基中积聚L-精氨酸或L-赖氨酸，并且

c)从培养基收集L-精氨酸或L-赖氨酸。