CN109370975A - 一种提高钝齿棒杆菌合成l-精氨酸产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高钝齿棒杆菌合成L‑精氨酸产量的方法，属于生物工程技术领域。本发明成功实现了敲除氮转录调控因子AmtR，过量表达铵转运蛋白AmtB的重组钝齿棒杆菌的构建。采用5‑L发酵罐分批发酵策略，优化发酵条件，最终重组钝齿棒杆菌Cc5‑5/pXMJ19‑amtB发酵至96h，重组菌的L‑精氨酸产量达到60.9±1.31g/L，较出发菌株钝齿棒杆菌SYPA5‑5提高了30.56％，生产强度达到0.634g/L·h，并且糖酸转化率为0.36±0.018g/g，实现了L‑精氨酸的高产。同时，该重组钝齿棒杆菌增加了NH4 +的利用，说明敲除氮转录调控因子和过量表达铵转运蛋白对L‑精氨酸的产量具有显著效果。

Description

一种提高钝齿棒杆菌合成L-精氨酸产量的方法
技术领域
本发明涉及一种提高钝齿棒杆菌合成L-精氨酸产量的方法，尤其是一种通过过表达铵转运蛋白AmtB提高钝齿棒杆菌合成L-精氨酸产量的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
生物细胞中N元素为第二大宏元素，是蛋白质和核苷酸的重要组成元素。细胞中物质的合成与N源的吸收和利用密不可分。L-精氨酸中氮素占32.1％，是天然氨基酸中N:C比例最高的氨基酸，可作为生物细胞中重要的氮源供给。L-精氨酸是合成蛋白质和肌酸的重要原料，是人类和动物的半必需氨基酸，是婴儿和幼儿生长发育的必需氨基酸。L-精氨酸具有多种生理功能，是一种重要的工业氨基酸，广泛应用于医药、食品、化工等行业。
L-精氨酸生产方法主要有蛋白水解法、化学合成法和微生物发酵法。由于蛋白水解法操作复杂、费时费力、成本高、产物产量低等弊端，而化学合成法又存在严重的环境污染问题，因而两者都不适合大规模的生产。因此，目前国内外主要采用微生物菌株发酵生产L-精氨酸。目前，韩国Lee,Sang Yup团队采用谷氨酸棒杆菌生产的L-精氨酸产量最高，他们从碳源的角度出发对谷氨酸棒杆菌进行改进，使其在5L和1500L中L-精氨酸产量分别为92.5g/L和81.2g/L。但是，由于发酵水平的限制，国内从碳源的角度出发对谷氨酸棒杆菌进行改造，发酵生产L-精氨酸的水平普遍较低，成本较高，生产水平和产量不能满足国内需求。因此，提高L-精氨酸的发酵生产水平非常重要。
钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)是我国研究者分离得到的一种钝齿状、无芽孢的革兰氏阳性菌，其突变株在国内的氨基酸生产中被广泛应用，但对其遗传背景的研究还处于空白状态。钝齿棒杆菌SYPA5-5是本实验室筛选得到的高产精氨酸突变菌株(菌株保藏编号为CGMCC NO.0890，在公开号为CN1441055A的专利中已公开)。
发明内容
本发明的主要目的是从氮代谢的角度，提高钝齿棒杆菌的L-精氨酸的产量。为此，本发明首先提供了一种重组钝齿棒杆菌，所述重组钝齿棒杆菌是通过敲除氮转录调控因子AmtR和过表达铵转运蛋白AmtB得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述重组钝齿棒杆菌是以钝齿棒杆菌SYPA5-5为出发菌株，敲除了氮转录调控因子AmtR的基因amtR。
编码所述氮转录调控因子AmtR的基因amtR的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
编码所述铵转运蛋白AmtB的基因amtB的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述钝齿棒杆菌是以钝齿棒杆菌SYPA5-5为出发菌株，采用同源重组的方法敲除氮转录调控因子AmtR。以pK18mobsacB基因作为载体，设计两段同源臂，将amtR基因与载体进行连接，完成第一次同源重组后，采用蔗糖平板进行筛选，完成第二次交换，得到AmtR敲除成功的重组钝齿棒杆菌株，命名为钝齿棒杆菌Cc5-5。
编码钝齿棒杆菌SYPA5-5来源的氮转录调控因子AmtR如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种构建重组钝齿棒杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)通过敲除钝齿棒杆菌中氮转录调控因子AmtR的基因amtR，成功构建了钝齿棒杆菌Cc5-5；
(2)以钝齿棒杆菌SYPA5-5的基因组DNA为模板，将编码铵转运蛋白AmtB的基因amtB与穿梭型载体pXMJ19成功连接,获得重组质粒pXMJ19-amtB；
(3)将重组质粒pXMJ19-amtB电转入重组钝齿棒杆菌株Cc5-5，得到重组菌Cc5-5/pXMJ19-amtB。
本发明还检测NH4 +浓度，通过对比检测重组菌Cc5-5/pXMJ19-amtB和野生型钝齿棒杆菌SYPA5-5发酵过程中胞内外NH4 +浓度的变化，明显发现重组菌增加了NH4 +的利用，最终胞外剩余的NH4 +浓度很低。
本发明还提供所述应用重组钝齿棒杆菌生产L-精氨酸的方法，是将种子液按6％接种于发酵培养基中进行发酵培养，发酵温度为30℃，搅拌转速为500～600r/min。发酵过程中，温度与搅拌转速由发酵罐自动控制，pH通过补加50％氨水维持稳定。
所述发酵培养基成分：葡萄糖150g/L，硫酸铵40g/L，酵母提取物15g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，氯化钾1g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，七水合硫酸亚铁0.02g/L，一水合硫酸锰0.02g/L，0.05mM L-精氨酸，去离子水配置，pH 7.0。将上述发酵培养基用50％的氨水调节其pH至7.0，在121℃下高温灭菌30min，葡萄糖分消。
所述种子液的制备方法是从活化平板上挑取单菌落接种于含卡那霉素的LBG培养基中，30℃振荡培养24h，然后全部转接于种子培养基中，30℃培养24h。种子培养基组成：葡萄糖50g/L，硫酸铵25g/L，酵母提取物15g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，去离子水配置，pH 7.0。
有益效果：
本发明成功实现了敲除氮转录调控因子AmtR，过量表达铵转运蛋白AmtB的重组钝齿棒杆菌的构建。采用5-L发酵罐分批发酵策略，优化发酵条件，最终重组钝齿棒杆菌Cc5-5/pXMJ19-amtB发酵至96h，L-精氨酸产量达到60.4g/L，相比出发菌株，L-精氨酸的产量提高了30.56％，生产强度达到0.634g/L·h，并且糖酸转化率为0.36±0.018g/g，实现了L-精氨酸的高产。同时，重组钝齿棒杆菌Cc5-5/pXMJ19-amtB还增加了NH4 +的利用，说明敲除氮转录调控因子和过量表达铵转运蛋白对L-精氨酸的产量具有显著效果。
具体实施方式
下述实施例中涉及的培养基及缓冲液如下：
BHI培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g氯化钠10g，5-10％的葡萄糖。
种子培养基：葡萄糖50g/L，硫酸铵25g/L，酵母提取物15g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，去离子水配置，pH 7.0。
PBS缓冲液：Nacl 8g/L，KCL 0.2g/L，Na2HPO4 1.42g/L，KH2PO4 0.27g/L，NaOH调节PH为7.4。
实施例1：氮转录调控因子AmtR的敲除
以钝齿棒杆菌SYPA5-5的基因组DNA为模板，以amtR F1(序列如SEQ ID NO.3所示)和R1(序列如SEQ ID NO.4所示)、amtR F2(序列如SEQ ID NO.5所示)和R2(序列如SEQ IDNO.6所示)为引物，进行PCR扩增出上下游两段同源臂各500bp左右，进行融合延伸PCR，得到大小为1200bp基因片段，连接至pK18mobsacB载体得到pk18-amtR，将pk18-amtR测序，通过DNAMAN进行序列比对，结果表明基因序列无误。将重组质粒pk18-amtR电转到钝齿棒杆菌SYPA5-5中，将长出的单菌落进行扩大培养，转接至含蔗糖的平板上进行筛选，采用菌落PCR进行验证，筛选得到amtR基因完全敲除的钝齿棒杆菌株，命名为钝齿棒杆菌Cc5-5。
实施例2：铵转运蛋白AmtB在钝齿棒杆菌株Cc5-5中的克隆与表达
以钝齿棒杆菌SYPA5-5的基因组DNA为模板，引物amtBF1/R1进行PCR扩增，得到1317bp的基因片段。用HindIII和EcoRI双酶切后，回收amtB片段，与利用相同酶线性化的pXMJ19连接后转化至大肠杆菌BL21中，挑取阳性转化子提取质粒，利用质粒为模板，进行PCR验证，结果表明质粒pXMJ19-amtB构建成功。将重组质粒pXMJ19-amtB电转化到钝齿棒杆菌株Cc5-5中，得到重组菌Cc5-5/pXMJ19-amtB。
将重组菌Cc5-5/pXMJ19-amtB在装有10mL LBG培养基的50mL容器中培养16-20h，然后按1％-2％的接种量转移到装有50mL LBG培养基的250mL容器中培养3-6h，加入25uL的238mg/mL的IPTG进行诱导，整个培养过程均在30℃，180rpm的往复式摇床中进行。诱导培养10-12h后收集细胞，将细胞利用超声破碎仪进行破碎，离心后收集上清液，验证amtB在钝齿棒杆菌中成功表达。
实施例3：重组菌Cc5-5/pXMJ19-amtB的发酵
(1)种子培养
从活化平板上挑取重组钝齿棒杆菌Cc5-5/pXMJ19-amtB的单菌落接种于10mL LBG培养基(含100mg/ml氯霉素)中，30℃振荡培养24h，然后全部转接于150ml种子培养基中，30℃培养24h。
(2)发酵培养
初始发酵培养体积为2.5L，采用的发酵培养基成分如下：
发酵培养基成分：葡萄糖150g/L，硫酸铵40g/L，酵母提取物15g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，氯化钾1g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，七水合硫酸亚铁0.02g/L，一水合硫酸锰0.02g/L，去离子水配置，pH 7.0。将上述发酵培养基用50％的氨水调节其pH至7.0，在121℃下高温灭菌30min。
发酵条件：将上述培养好的种子液按6％接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养，发酵温度为30℃，pH为7.0，搅拌转速为600r/min，发酵时间为96h。
发酵过程中，温度与搅拌转速由发酵罐自动控制，pH通过补加50％氨水维持稳定。从第24h起，每12h取样一次，采用分光光度仪在A562下测定细胞OD值，用生物传感分析仪测定(SBA-50，山东省科学院生物研究所)葡萄糖的含量,并采用HPLC测定L-精氨酸(安捷伦1100，美国)。结果表明，相比于出发菌株，重组菌生长的更好，糖耗更快，发酵至96h，重组菌Cc5-5/pXMJ19-amtB的L-精氨酸产量达到60.9±1.31g/L，较出发菌株C.crenatumSYPA5-5提高了30.56％，生产强度达到0.634g/L·h，并且糖酸转化率为0.36±0.018g/g，实现了L-精氨酸的高产。
实施例4：检测重组菌和野生型SYPA5-5发酵过程中胞内外NH4 +浓度
采用离子色谱法检测重组菌和野生型的胞内外NH4 +的浓度，取实施例3中发酵36h时的培养液，10000rpm离心10min，去除上清液，收集细胞；将细胞采用pH为7.2的PBS缓冲液洗涤三次，在超声细胞仪上破碎细胞，10000rpm离心20min，去除细胞残渣，将收集的细胞破碎液用去离子水稀释到小于0.1ppm，稀释后的细胞破碎液煮沸10-20min，离心去蛋白，再采用滤膜过滤，上机进行离子色谱检测。采用硫酸铵作为标样。
离子色谱检测条件：分析柱：IonPac CS12A分离柱(4×250mm)与IonPac CG12A保护柱(4×50mm)，流动相：甲基磺酸20mM，流速：1.00mL/min，时间:15min，柱箱温度：30℃，进样体积：25μL，检测方式：抑制型电导，CERS 500 4mm，仪器：Thermo ICS 5000+。
通过对比检测重组菌和野生型钝齿棒杆菌SYPA5-5发酵过程中胞内外NH4 +浓度的变化，明显发现重组菌增加了NH4 +的利用。在初始NH4 +的浓度均为300mM的条件下，发酵结束时野生型SYPA5-5胞外剩余的NH4 +浓度为101.2±0.3mM，而重组菌胞外剩余的NH4 +浓度为60.0±0.5mM。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种提高钝齿棒杆菌合成L-精氨酸产量的方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 669
<212> DNA
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<400> 1
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Claims (10)

1.一种重组钝齿棒杆菌，其特征在于，所述重组钝齿棒杆菌是通过敲除氮转录调控因子AmtR和过表达铵转运蛋白AmtB得到的。
2.根据权利要求1所述的重组钝齿棒杆菌，其特征在于，所述重组钝齿棒杆菌是以钝齿棒杆菌SYPA5-5为出发菌株，敲除了氮转录调控因子AmtR的基因amtR。
3.根据权利要求1或2所述的重组钝齿棒杆菌，其特征在于，所述氮转录调控因子AmtR的基因amtR的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求1所述的重组钝齿棒杆菌，其特征在于，编码所述铵转运蛋白AmtB的基因amtB的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.构建权利要求1-4任一所述重组钝齿棒杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)通过敲除钝齿棒杆菌中氮转录调控因子AmtR的基因amtR，成功构建了钝齿棒杆菌株Cc5-5；
(2)以钝齿棒杆菌SYPA5-5的基因组DNA为模板，将编码铵转运蛋白AmtB的基因amtB与穿梭型载体pXMJ19成功连接，获得重组质粒pXMJ19-amtB；
(3)将重组质粒pXMJ19-amtB电转入钝齿棒杆菌株Cc5-5，得到重组菌Cc5-5/pXMJ19-amtB。
6.应用权利要求1-4任一所述重组钝齿棒杆菌生产L-精氨酸的方法，其特征在于，是将种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养，发酵温度为28～31℃，搅拌转速为500～600r/min。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，是将种子液按5-10％接种于发酵培养基中进行发酵培养，发酵温度为28～31℃，搅拌转速为500～600r/min，发酵过程中，温度与搅拌转速由发酵罐自动控制，pH通过补加40～60％氨水维持稳定。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基成分：葡萄糖120～150g/L，硫酸铵30～50g/L，酵母提取物10～20g/L，七水合硫酸镁0.2～0.6g/L，氯化钾0.5～1.5g/L，磷酸二氢钾1～2g/L，七水合硫酸亚铁0.01～0.04g/L，一水合硫酸锰0.01～0.04g/L，去离子水配置，pH 7.0-7.2。
9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述种子液的制备方法是从活化平板上挑取单菌落接种于含卡那霉素的LBG培养基中，28～31℃振荡培养22～26h，然后全部转接于种子培养基中，28～31℃培养22～26h，种子培养基组成：葡萄糖40～60g/L，硫酸铵20～30g/L，酵母提取物10～20g/L，七水合硫酸镁0.3～0.7g/L，磷酸二氢钾1～2g/L，去离子水配置，pH 7.0-7.2。
10.权利要求1-4任一所述重组钝齿棒杆菌在生产L-精氨酸中的应用。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111172090A (zh) * 2020-02-17 2020-05-19 江南大学 一种用离子转运蛋白促进钝齿棒杆菌合成l-精氨酸的方法
CN111304139A (zh) * 2020-02-21 2020-06-19 江南大学 一种过表达pii信号转导蛋白的重组钝齿棒杆菌
CN111349640A (zh) * 2018-12-21 2020-06-30 中国科学院天津工业生物技术研究所 反式-4-羟基-l-脯氨酸的生产菌株及其构建方法和应用
CN111718883A (zh) * 2020-06-28 2020-09-29 江南大学 一株可生产胍基丁胺的重组钝齿棒杆菌及其应用
CN112877271A (zh) * 2021-02-05 2021-06-01 江西师范大学 一种提高钝齿棒杆菌厌氧发酵产l-精氨酸的方法
CN115044525A (zh) * 2022-06-30 2022-09-13 江南大学 一种利用Sigma因子提高棒杆菌抗氧化性的方法
WO2024077445A1 (zh) * 2022-10-10 2024-04-18 武汉远大弘元股份有限公司 一种5'utr元件及其在l-精氨酸生产中的应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1441055A (zh) * 2003-02-25 2003-09-10 江南大学 一种生产l－精氨酸的菌株及其诱变方法与利用该菌株生产l－精氨酸的方法
EP1460128A1 (en) * 2003-03-03 2004-09-22 Ajinmoto Co., Inc. Method for producing L-arginine or L-lysine by fermentation
CN101381698A (zh) * 2008-10-23 2009-03-11 江南大学 加强表达n-乙酰谷氨酸激酶的重组钝齿棒杆菌及该菌的应用
CN102747025A (zh) * 2012-06-20 2012-10-24 江南大学 加强表达转运蛋白LysE提高钝齿棒杆菌L-精氨酸的产量
CN104031934A (zh) * 2014-06-05 2014-09-10 江南大学 过量共表达磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶提高钝齿棒杆菌精氨酸产量
CN105441373A (zh) * 2015-12-04 2016-03-30 南京工业大学 一株小白链霉菌基因工程菌及其构建方法与应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1441055A (zh) * 2003-02-25 2003-09-10 江南大学 一种生产l－精氨酸的菌株及其诱变方法与利用该菌株生产l－精氨酸的方法
EP1460128A1 (en) * 2003-03-03 2004-09-22 Ajinmoto Co., Inc. Method for producing L-arginine or L-lysine by fermentation
CN1550546A (zh) * 2003-03-03 2004-12-01 ֮����ʽ���� 通过发酵生产l—精氨酸或l—赖氨酸的方法
CN101381698A (zh) * 2008-10-23 2009-03-11 江南大学 加强表达n-乙酰谷氨酸激酶的重组钝齿棒杆菌及该菌的应用
CN102747025A (zh) * 2012-06-20 2012-10-24 江南大学 加强表达转运蛋白LysE提高钝齿棒杆菌L-精氨酸的产量
CN104031934A (zh) * 2014-06-05 2014-09-10 江南大学 过量共表达磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶提高钝齿棒杆菌精氨酸产量
CN105441373A (zh) * 2015-12-04 2016-03-30 南京工业大学 一株小白链霉菌基因工程菌及其构建方法与应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JING GUO ET AL.,: "Improvement of the ammonia assimilation for enhancing l‑arginine production of Corynebacterium crenatum", 《J IND MICROBIOL BIOTECHNOL》 *
MEIJUAN XU ET AL.,: "Enhancement of L-arginine production by increasing ammonium uptake in an AmtR-deficient Corynebacterium crenatum mutant", 《JOURNAL OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY & BIOTECHNOLOGY》 *
张明明等: "生物铵转运蛋白对NH3/NH4+作用机理研究_张明明", 《化学进展》 *
陈雪岚等: "钝齿棒杆菌argR基因缺失株构建及其缺失对精氨酸生物合成途径相关基因转录水平的影响", 《微生物学报》 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111349640A (zh) * 2018-12-21 2020-06-30 中国科学院天津工业生物技术研究所 反式-4-羟基-l-脯氨酸的生产菌株及其构建方法和应用
CN111349640B (zh) * 2018-12-21 2022-03-01 中国科学院天津工业生物技术研究所 反式-4-羟基-l-脯氨酸的生产菌株及其构建方法和应用
CN111172090A (zh) * 2020-02-17 2020-05-19 江南大学 一种用离子转运蛋白促进钝齿棒杆菌合成l-精氨酸的方法
CN111172090B (zh) * 2020-02-17 2022-02-01 江南大学 一种用离子转运蛋白促进钝齿棒杆菌合成l-精氨酸的方法
CN111304139A (zh) * 2020-02-21 2020-06-19 江南大学 一种过表达pii信号转导蛋白的重组钝齿棒杆菌
CN111304139B (zh) * 2020-02-21 2022-04-15 江南大学 一种过表达pii信号转导蛋白的重组钝齿棒杆菌
CN111718883A (zh) * 2020-06-28 2020-09-29 江南大学 一株可生产胍基丁胺的重组钝齿棒杆菌及其应用
CN112877271A (zh) * 2021-02-05 2021-06-01 江西师范大学 一种提高钝齿棒杆菌厌氧发酵产l-精氨酸的方法
CN112877271B (zh) * 2021-02-05 2023-03-14 江西师范大学 一种提高钝齿棒杆菌厌氧发酵产l-精氨酸的方法
CN115044525A (zh) * 2022-06-30 2022-09-13 江南大学 一种利用Sigma因子提高棒杆菌抗氧化性的方法
CN115044525B (zh) * 2022-06-30 2023-07-25 江南大学 一种利用Sigma因子提高棒杆菌抗氧化性的方法
WO2024077445A1 (zh) * 2022-10-10 2024-04-18 武汉远大弘元股份有限公司 一种5'utr元件及其在l-精氨酸生产中的应用

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